KR101736064B1 - 승마 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 승마 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공하며, 위와 같은 승마 추출물은 줄기세포 자체의 증식을 촉진시키는 효과가 있으므로, 특정 조직으로 분화되기 전의 줄기세포를 단기간 내에 충분한 양으로 준비 또는 공급할 필요가 있는 등의 경우에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 승마 추출물은 줄기세포가 배지 조성에 따라 특정한 계열의 세포로 분화되는 현상을 촉진하므로 줄기세포의 분화를 촉진시켜 조속히 분화된 세포를 얻고자 할 때 이용될 수 있다.

Description

승마 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물{Composition for Facilitating the Proliferation and the Differentiation of Stem Cells Comprising the Extract of Cimicifuga heracleifolia Komarov as an Effective Ingredient}

본 발명은 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 증식 또는 분화 촉진 방법에 관한 것이다.

최근 조직공학을 이용한 재생의학 분야에서 줄기세포의 이용 기술이 난치병 치료를 위한 새로운 분야로 제시되고 있다. 이에 줄기세포의 연구에 대한 관심이 높아지고, 증식과 분화를 통하여 조직을 형성할 수 있는 줄기세포가 대부분의 질병치료뿐만 아니라, 조직 훼손 등을 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있다.

줄기세포(stem cell)는 미분화 상태에서 자가 복제 능력을 가지면서 적당한 조건하에서 특정 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분이 될 수 있다. 인간의 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 얻어지기 때문에 세포 증식 및 분화 능력이 우수하나 생명윤리적인 문제점을 가지고 있다. 그에 반해, 성체 줄기세포는 배아 줄기세포에 비해 분화 능력이 한정되어 있으나, 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 채취하여 줄기세포로 발전시킨 것으로 윤리적인 문제가 적다. 성체 줄기세포로는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며, 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액 암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 존재하기도 한다.

즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화' 세포를 의미하는 것이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있어, 이를 이용한 질병의 치료 등의 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 배아 줄기세포의 윤리적인 문제가 대두되면서, 상대적으로 윤리적인 문제가 적은 성체 줄기세포를 이용하려는 연구가 주목 받고 있다.

조직으로부터 얻어지는 줄기세포는 적은 양이고, 이를 이용시에는 대량의 세포가 필요하므로 줄기세포의 수를 증식시키는 배양이 수행되는데, 예를 들면 특허문헌 1에는 생물반응기를 이용하여 줄기세포를 체외에서 증식하는 방법이 개시되어 있다. 하지만 줄기세포 증식을 위한 배양을 할 경우 줄기세포의 특성을 유지한 채 줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 배양 조성물에 대해서는 연구가 다소 부족한 실정이다.

또한, 미분화 상태의 줄기세포를 다양한 조직 세포로 분화시키고, 분화된 세포를 이용한 질병의 치료 등의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들면, 중간엽 줄기세포의 배양 조건을 조절함으로써, 중간엽 줄기세포는 조골세포(osteoblast), 연조골세포(chondroblast), 근육모세포(myoblast), 그리고 신경세포(nerve cell) 등으로 분화된다. 특허문헌 2에는 SMOC1(SPARC-related Modular Calcium-binding protein1) 단백질 또는 SMOC1 유전자를 이용하여 줄기세포를 조골세포로 분화시키는 기술이 개시되어 있다. 이외에도 천연물 유래 추출물 또는 화합물을 줄기세포 배양 배지에 첨가함으로써 특정한 세포로 분화시키려는 연구가 보고된 바 있다.

한편, 승마(Cimicifuga heracleifolia Komarov)는 미나리아재비과에 속하는 여러해살이풀로 끼멸가리라고도 불리며, 승마와 그 동속식물의 뿌리줄기는 약용으로 사용한다. 산지는 한국, 중국, 일본 등이 있다. 뿌리 줄기는 굵은 마디 모양으로 고르지 않으며 길이 6~8㎝, 지름 10~25㎝이다. 바깥면은 갈색 혹은 흑색으로 뿌리줄기의 위쪽에 몇 개의 큰 줄기자국이 있고, 많은 뿌리의 잔기가 붙어 있다. 승마의 생리활성 효과에 대해서는 승마 추출물이 인슐린 분비를 조절하는 것이 보고된 바 있고, 승마의 유효성분으로 알려진 비스나진이 혈압을 강화시키고 칼슘의 유입을 억제함으로써 혈관 평활근 수축을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포 특성을 유지하면서 증식을 증가시킬 수 있는 방법에 관하여 연구하였고, 승마 추출물을 치은 유래 줄기세포 배양시 처리함으로써 줄기세포의 특성이 유지되면서 증식 정도가 증가되고, 승마 추출물을 분화 유도 배지에 첨가할 경우에는 골분화 또는 지방분화를 촉진하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국 공개특허 10-2009-0021329 한국 등록특허 10-1176449

본 발명의 목적은 승마속 식물에서 유래한 유효성분을 이용한 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 승마 추출물을 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 줄기세포에 승마 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 증식 촉진용 조성물은 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채 줄기세포 자체의 증식을 촉진시키는 효과가 있는 바, 특정 조직으로 분화되기 전의 줄기세포를 단기간 내에 충분한 양으로 준비 또는 공급할 필요가 있는 등의 경우에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포 분화 촉진용 조성물은 줄기세포가 배지 조성에 따라 특정한 계열의 세포로 분화되는 현상을 촉진하므로 줄기세포의 분화를 촉진시켜 조속히 분화된 세포를 얻고자 할 때 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1 내지 도 4는 승마 추출물을 치은 유래의 성체 줄기세포에 처리한 후 각각 1일, 3일, 5일 및 7일자에 세포의 형태 변화를 관찰한 사진이다;
A: 대조군, B: 0.001㎍/㎖, C: 0.01㎍/㎖, D: 0.1㎍/㎖, E: 1㎍/㎖, F: 10㎍/㎖, G: 100㎍/㎖ 및 H: 1,000㎍/㎖.
도 5 및 도 6은 승마 추출물을 치은 유래의 성체 줄기세포에 처리한 후 각각 3일 및 5일자에 세포의 증식 정도를 측정한 결과의 그래프이다.
도 7은 승마 추출물 처리 후 15일자의 세포 생존도를 나타낸 그래프이다;
*는 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 8은 승마 추출물 처리 후 21일자의 골분화 정도를 나타낸 이미지이다;
A: 대조군, B: 승마 추출물 0.1㎍/㎖, C: 승마 추출물 1㎍/㎖ 및 D: 승마 추출물 10㎍/㎖.
도 9는 승마 추출물 처리 후 상대적인 골분화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 승마 추출물 처리 후 21일자의 지방분화 정도를 나타낸 이미지이다;
A: 대조군, B: 승마 추출물 0.1㎍/㎖, C: 승마 추출물 1㎍/㎖, D: 승마 추출물 10㎍/㎖.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 '줄기세포'는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

상기 용어 '배아 줄기세포'는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성 (多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다.

상기 용어 '유도 다능성 줄기세포'는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.

상기 용어 '성체 줄기세포'는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 줄기세포의 '증식'은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '분화'란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사 활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '추출물'은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '배지'는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명에서 일컫는 '계대 배양'이란, 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 승마(Cimicifuga heracleifolia Komarov) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로서 상기 승마를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 승마가 속하는 승마속(Cimicifugae genus) 식물로서 상기 승마와 유전적 유연관계가 높은 다른 종의 식물들 역시 그 뿌리를 본 발명의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물의 유효성분의 원료로 이용할 수 있다. 상기 승마 또는 승마속 식물로서 상기 승마(Cimicifuga heracleifolia Komarov)와 유연관계가 높은 식물은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 승마는 승마의 세근, 주근, 줄기, 잎, 화경 꽃 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세근 및 주근 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물은 상기 승마로부터 수득한 추출물을 유효성분으로 포함한다. 상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용하여 수득될 수 있다.

상기와 같은 추출에는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물이 추출용매로 이용될 수 있고, 바람직하게는 물이 이용될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 유기용매는 C₁-C₄의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정하지 아니하고, 상기 C₁-C₄의 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 추출은 상기 추출용매를 상기 승마의 총 중량에 대해 1배 내지 20배 첨가하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 2배 내지 10배, 더욱 바람직하게는 3배 내지 5배 첨가하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 추출용매의 첨가량이 상기 범위를 벗어나는 경우, 추출 자체가 제대로 이루어지지 않거나 또는 추출되더라도 활성성분이 충분히 확보되지 못하는 문제점이 있다.

또한, 상기 추출은 20~200℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 50~150℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 80~120℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 온도 범위를 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 효과적일 수 있다.

또한, 상기 추출은 0.5~20시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 1~15시간, 더욱 바람직하게는 2~10시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 추출 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우, 추출 자체가 제대로 이루어지지 않거나 또는 추출되더라도 활성 성분이 충분히 확보되지 못하는 문제점이 있다.

또한, 상기 추출은 수 회 반복될 수 있고, 바람직하게는 1회 또는 2~5회, 더욱 바람직하게는 2~3회 반복될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기와 같은 추출 과정 이후에, 상기 추출물은 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 상기 농축은 감압농축될 수 있고, 진공회전농축기를 이용하여 농축되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 농축은 20~100℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 50~70℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 건조는 동결건조될 수 있고, 진공동결건조기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 동결건조는 -50~-100℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 -60~-80℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기와 같은 과정을 거쳐 수득된 승마 추출물은 배지에 첨가되어 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진하는 효과를 나타낸다. 다시 말해서, 상기 승마 추출물이 줄기세포 자체의 고유 증식 속도를 더욱 빠르게 촉진시키거나, 줄기세포가 특정 유형의 세포로 분화되는 속도를 더욱 빠르게 촉진시키는 효과가 있다는 것이다. 상기 분화는 골분화 또는 지방분화일 수 있고, 상기 골분화는 줄기세포가 조골세포로 분화되는 것일 수 있으며, 상기 지방분화는 줄기세포가 지방세포로 분화되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

승마 추출물의 상기와 같은 효과는 상기 승마 추출물이 첨가되는 배지의 종류에 따라 달라지게 된다. 예를 들어, 상기 승마 추출물을 일반 배양 배지에 첨가하여 줄기세포를 배양하면, 상기 줄기세포는 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 줄기세포의 세포 수만이 증가하게 되는데, 이러한 줄기세포의 세포 수가 증가하는 속도가 단순히 일반 배양 배지만을 이용한 경우에 비해 훨씬 빨라지는 효과가 있다. 또한, 상기 승마 추출물을 분화 유도 배지에 첨가하여 줄기세포를 배양하면, 줄기세포의 분화 속도가 일반 분화 유도 배지만을 이용한 경우에 비해 훨씬 빨라지는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 줄기세포 증식 촉진용 조성물에는 상기 승마 추출물이 0.0001 내지 50㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 40㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 10㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 승마 추출물이 상기 함량 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포 증식 촉진 효과가 저해될 수 있다. 특히, 승마 추출물이 50㎍/㎖을 초과하여 포함될 경우 줄기세포의 모양이 방추형에서 둥근 모양으로 바뀔 수 있고, 사멸하는 세포가 증가할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 승마 500g를 2,000 ㎖의 물에 2 시간 동안 침지하고 2.5시간 동안 환류(reflux) 하에 가열하여 수득한 승마 물 추출물을 0.001 내지 10㎍/㎖의 농도로 일반 배양 배지(15% 소태아혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민 및 10mM 아스코르브산 2-인산염을 포함하는 α-MEM 배지)에 첨가하고 이를 이용하여 치은 유래 성체 줄기세포를 배양하였을 때, 상기 줄기세포가 그 특성을 그대로 유지한 채(도 1 내지 도 4 참고), 증식이 촉진되는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참고).

또한, 본 발명의 줄기세포 분화 촉진용 조성물에는 상기 승마 추출물이 0.001 내지 50㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.005 내지 40㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10㎍/㎖의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 승마 추출물이 상기 함량 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포 분화 효과가 저해될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 승마 500g를 2,000 ㎖의 물에 2 시간 동안 침지하고 2.5시간 동안 환류(reflux) 하에 가열하여 수득한 승마 물 추출물을 골분화 유도배지에 0.1 내지 10㎍/㎖의 농도로 분화 유도 배지((15% 소태아혈청, 100 μM 덱사메타손, 10mM 아스코르브산 2-인산염, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM 배지))에 첨가하고, 이를 이용하여 치은 유래 성체 줄기세포를 배양하였을 때, 골분화가 유도되고(도 8 및 도 9 참조), 상기 승마 물 추출물을 지방분화 유도배지에 0.1 내지 10㎍/㎖의 농도로 포함되도록 하여 치은 유래 성체 줄기세포에 처리하였을 때, 지방분화가 유도됨을 확인하였다(도 10 참조).

상기 줄기세포는 인간을 포함하는 포유동물에서 유래한 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치은에서 유래한 성체 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 승마 추출물을 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화 촉진용 배지를 제공한다.

상기 승마 추출물은 줄기세포 배양 또는 분화 촉진용 배지에 일 성분으로 포함될 수 있다.

상기 줄기세포 배양 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 줄기세포 분화 촉진용 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포 분화 촉진용 배지는 분화를 유도할 수 있는 성분을 포함할 수 있고, 예를 들면 골 분화 유도시에는 분화 촉진용 배지에 덱사메타손, 아스코르브산 2-인산염, 디히드록시비타민 및 글리세로포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 성분이 포함될 수 있고, 지방 분화 유도시에는 분화 촉진용 배지에 이소부틸-메틸크산틴, 덱사메타손, 인슐린 및 인도메타신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 성분이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 줄기세포에 상기 승마 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 증식 촉진 방법은 줄기세포에 상기 승마 추출물을 처리하는 단계 및 상기 승마 추출물이 처리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.

상기 증식 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 상기 승마 추출물은 상기 줄기세포 배양용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다.

상기 배양은 인 비트로 상태 또는 인 비보 상태에서 수행될 수 있고, 특히 인 비트로 상태에서 수행되는 경우에는 CO₂ 배양기 내에서 수행될 수 있다.

상기 CO₂ 배양기 내에서의 배양은 CO₂ 농도가 5 내지 15%인 환경에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10%, 더욱 바람직하게는 5 내지 8%인 환경에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한 상기 CO₂ 배양기 내부는 상기 CO₂ 외에 O₂로 채워질 수 있다.

상기 배양은 25 내지 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 34 내지 37℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 배양 온도가 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포의 증식이 효율적으로 촉진되지 않고, 사멸되는 줄기세포가 많아지는 문제점이 있다.

상기 배양은 1 내지 25일 동안 지속하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 15일, 더욱 바람직하게는 1 내지 10일 동안 지속하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 배양 기간이 25일을 초과하여 배양할 경우 배양 용기 내에 세포의 밀도가 높아짐에 따라 영양 성분이 빠르게 고갈되고, 세포의 특성이 변하게 된다. 또한, 상기 배양 기간 동안 계대 배양을 실시하여 세포군을 나누어 배양할 수 있다. 상기 계대 배양은 배양 시작일로부터 2 내지 10일자에 실시될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 7일자에 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 4 내지 5일자에 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

본 발명의 또 다른 측면은 줄기세포에 상기 승마 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 분화 촉진 방법은 상기 승마 추출물을 처리하는 단계 및 상기 승마 추출물이 처리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.

상기 분화 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 상기 승마 추출물은 상기 줄기세포 분화 촉진용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다. 상기 줄기세포 분화 촉진용 배지는 줄기세포를 특정한 계열로 유도할 수 있는 사이토카인, 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않으며 세포의 분화에 영향을 줄 수 있는 것이면 제한없이 사용할 수 있다.

상기 배양은 인 비트로 상태 또는 인 비보 상태에서 수행될 수 있고, 특히 인 비트로 상태에서 수행되는 경우에는 CO₂ 배양기 내에서 수행될 수 있다.

상기 CO₂ 배양기 내에서의 배양은 CO₂ 농도가 5 내지 15%인 환경에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10%, 더욱 바람직하게는 5 내지 8%인 환경에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한 상기 CO₂ 배양기 내부는 상기 CO₂ 외에 O₂로 채워질 수 있다.

상기 배양은 25 내지 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 34 내지 37℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 배양 온도가 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 줄기세포의 증식이 효율적으로 촉진되지 않고, 사멸되는 줄기세포가 많아지는 문제점이 있다.

상기 배양은 1 내지 27일 동안 지속하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 25일, 더욱 바람직하게는 1 내지 23일 동안 지속하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 배양 기간이 27일을 초과하여 배양할 경우 배양 용기 내에 세포의 밀도가 높아짐에 따라 영양 성분이 빠르게 고갈되고, 세포의 특성이 변하여 원하는 방향으로 분화를 유도할 수 없다. 또한, 상기 배양 기간 동안 계대 배양을 실시하여 세포군을 나누어 배양할 수 있다. 상기 계대 배양은 배양 시작일로부터 2 내지 10일자에 실시될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 7일자에 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 4 내지 5일자에 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 및 실험예 ]

승마 추출물의 제조

Cimicifuga heracleifolia Komarov의 건조된 뿌리 500g에 2,000 ㎖의 증류수에 2 시간 동안 침지한 후, 2.5 시간 동안 환류 하에서 100 ℃로 가열하여, 승마 물 추출물을 수득하였다.

상기 추출물을 5,000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 감압 하에서 회전식 증류기(Eyela NE-1001, Tokya Rikakikai Co. Ltd., 일본)를 이용하여 300㎖로 농축하였다. 그리고 상기 농축물을 동결건조기(Labconco, 미국)를 이용하여 동결건조하여 92.8g의 고체 잔사를 수득하였다(수율: 18.6%(w/w)).

치은 유래 줄기세포의 분리 및 배양

가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 의학연구윤리심의위원회에서 승인 받아, 치관 확장술 진행 중인 4명의 건강한 환자로부터 정상적인 치은(gingiva) 조직을 얻었다.

상기 치은 조직은 즉시 100U/㎖ 페니실린(시그마 알드리치, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국)이 포함된 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)에 넣어 4℃에 두었다. 상기 치은 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)하여 분쇄하였고, 콜라게나아제 Ⅳ(시그마 알드리치)로 소화시킨 후, 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 24시간 후, 부착되지 않은 세포는 씻어내고, α-MEM 배지를 기본으로 하는 배지로 교체하였다. 상기 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)를 포함한다. 그 이후, 2-3일 마다 배지를 갈아줌으로써, 인간 치은 유래의 성체 줄기세포를 확립하였다.

상기 세포는 콜로니-형성 능력, 부착능(plastic adherence) 및 다양한 계통으로 분화능(골형성, 지방형성, 연골형성)과 같은 줄기세포 특성을 나타내었고, 또한 상기세포는 유동 세포 분석법에 의해 CD44, CD73, CD90 및 CD105는 발현하지만, CD14, CD45, CD34 및 CD19는 발현하지 않는 것이 확인되었다.

승마 추출물 처리 후, 줄기세포의 분화 여부 확인

실시예 2에서 확립된 줄기세포를 96웰 플레이트에 2.0×10³ 세포/웰의 밀도로 배치하고, 상기 줄기세포를 상기 실시예 1에서 수득한 승마 추출물을 첨가한 α-MEM 배지(Gibco, 미국)로 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 상기 α-MEM 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)로 구성되며, 상기 α-MEM 배지 내에 상기 승마 추출물을 최종 농도 0(대조군), 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 및 1,000㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 상기 세포의 형태는 1일, 3일, 5일 및 7일에 도립 현미경(Leica DM IRM, 독일)으로 확인하여 이미지를 얻었다.

그 결과, 승마 추출물을 0.001 내지 10㎍/㎖로 포함하는 배지로 배양된 줄기세포의 경우 세포 형태가 배양 후 1일 내지 7일 기간 동안 승마 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 동일한 방추형(spindle-shaped)의 형상으로, 섬유아세포 유사 형태를 가지는 것이 확인되었다(도 1 내지 도 4 참고). 반면에, 승마 추출물을 100 내지 1,000㎍/㎖으로 포함하는 배지로 배양된 줄기세포의 경우 세포 형태가 대조군이 방추형 형태인 것과는 다르게 둥근 형태였으며, 적은 수의 세포가 남아있는 것이 확인되었다(도 1 내지 도 4 참고).

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 승마 추출물을 일반적인 줄기세포 배양 배지에 첨가하여 배양하면 줄기세포에서는 특별히 분화가 진행되지 않음을 알 수 있고, 줄기세포 배양시에 승마 추출물을 이용할 때에는 고함량으로 넣을 경우 세포 특성 변화 또는 사멸을 촉진할 수 있으므로 0.001 내지 10㎍/㎖과 같은 낮은 함량으로 첨가하여야 하는 것을 알 수 있었다.

승마 추출물 처리 후, 줄기세포의 증식 및 생존도 확인

4-1. 배양 3일, 5일자에 줄기세포 증식 촉진 효과 확인

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 일반적인 줄기세포 배양 배지에 승마 추출물을 첨가하여 줄기세포를 배양하였고, 배양 3일 및 5일자에 cell counting kit.8(CCK.8, 일본)를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였다. cell counting kit는 세포 생존도를 확인하기 위한 분석 방법으로, 수용성 테트라졸륨염이 배양 배지 내에 있는 세포의 디히드로게나제에 의해 환원되어 포르마잔이 되는 원리를 이용한 것이며, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하므로, 상기 포르마잔의 생성량을 비색 분석(colorimetric assays)으로 확인함으로써 세포의 생존도를 확인할 수 있다. 배양 3일 및 5일자의 세포를 배양용기에서 분리하여 세포 현탁액을 만들고, 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 웰당 100㎕ 넣은 후, CCK-8 용액 10㎕를 각 웰에 더하였다. 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃로 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더(BioTek, 미국)를 이용하여 분광 광학적 흡광도를 측정함으로써, 줄기세포의 증식 정도를 확인하였다. 상기 분석은 3회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 배양 3일자에는 대조군의 줄기세포 밀도를 100%(100.0±1.8)로 하였을 때, 승마 추출물 0.001㎍/㎖은 120.2±24.6%를 나타냈고, 승마 추출물 0.01, 0.1 및 1㎍/㎖ 농도에서도 120% 이상의 세포 증가가 확인되었다(도 5 참고). 또한 배양 5일자에는 승마 추출물 0.001, 0.01, 0.1 및 1㎍/㎖의 농도에서 줄기세포 밀도가 각각 133.3±10.0, 132.7±4.2%, 131.2±5.8%, 131.2±7.3% 및 115.5±4.0%로 증가되었다(도 6 참고).

상기와 같은 결과로부터, 승마 추출물의 처리에 의해 줄기세포의 증식이 촉진됨을 알 수 있고, 특히 승마 추출물이 0.001 내지 1㎍/㎖의 함량으로 포함된 경우에 가장 우수한 증식 촉진 효과가 나타남을 알 수 있다.

4-2. 배양 15일자에 줄기세포 생존도 확인

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 일반적인 줄기세포 배양 배지에 승마 추출물을 첨가하여 줄기세포를 배양하였고, 배양 15일자에 cell counting kit.8(CCK.8, 일본)를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2에서 확립된 줄기세포를 96웰 플레이트에 2.0×10³ 세포/웰의 밀도로 배치하고, 상기 줄기세포를 상기 실시예 1에서 수득한 승마 추출물을 첨가한 α-MEM 배지로 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 상기 α-MEM 배지는 15% 소태아혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민 및 10mM 아스코르브산 2-인산염으로 구성되며, α-MEM 배지 내에 상기 승마 추출물을 최종 농도 0(대조군), 0.1, 1 및 10㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 세포 생존도 분석은 15일자에 확인하였다. 실시예 4-1에서와 같이 Cell Counting Kit의 메뉴얼에 따라 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 승마 추출물을 처리하지 않은 대조군을 100%(100.0% ± 5.3%)로 하였을 때, 21일 자에 승마 추출물을 0.1, 1 및 10㎍/㎖로 포함하는 처리군은 각각 112.5% ± 6.3%, 111.3% ± 5.7% 및 105.8% ± 10.0%의 상대값을 나타내었다. 0.1㎍/㎖의 승마 추출물의 CCK-8 분석의 상대값은 대조군에 비하여 유의한 차이를 나타내었다(P < 0.05).

이와 같은 결과로부터, 승마 추출물을 일반적인 줄기세포 배양 배지에 포함시키고, 장기간 배양할 경우(15일) 줄기세포의 생존도에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.

승마 추출물의 골분화 촉진 효과 확인

실시예 2에서 얻은 줄기세포를 8-챔버 슬라이드에 1.6×10⁴ 세포/챔버의 농도로 두었고, 첨가한 α-MEM 배지로 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 상기 α-MEM 배지는 15% 소태아혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민 및 10mM 아스코르브산 2-인산염으로 구성되며, 상기 α-MEM 배지 내에 상기 승마 추출물을 최종 농도 0(대조군), 0.1, 1, 10㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 배지는 새로운 골분화 유도 배지로 3일마다 교체하였다. 상기 골분화 유도 배지의 조성은 α-MEM 배지에 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100 μM 덱사메타손(시그마 알드리치, 미국), 1 mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국), 10 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate)(시그마 알드리치, 미국), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함시킨 것이며, 승마 추출물을 최종 농도 0(대조군), 0.1, 1, 10㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 21일 자에, 세포를 4% 파라포름알데히드(시그마 알드리치)로 고정하였고, 세포를 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)로 3회 세정하였다. 그 후, 상기 세포를 1% Triton X-100으로 5분 동안 처리하였고, 처리한 세포를 살균된 인산완충식염수로 3회 세정하였다. 세정된 세포를 인산완충식염수에 희석된 1% 소혈청 알부민 용액으로 블로킹하였다. 오스테오칼신의 1차 항체(Santa Cruz)를 1시간 동안 처리한 후, 2차 항체를 암실에서 1시간 동안 처리하였다. 커버슬립을 4′,6-디아미딘-2′-페닐인돌 디히드로클로라이드(4′,6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride, DAPI)를 함유하는 마운팅 미디어로 마운팅하였다. 상대적인 골분화를 이미지 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다(ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda MD).

그 결과, 도 8에서 알 수 있듯이 승마 추출물을 최종 농도로 0.1, 1 및 10㎍/㎖로 포함하는 경우, 21일자에 오스테오칼신의 발현이 확인되었다. 승마 추출물을 처리하지 않은 대조군을 100%로 하였을 때, 21일 자에 승마 추출물을 0.1, 1 및 10㎍/㎖로 포함하는 처리군은 각각 171.5% ± 13.7%, 125.6% ± 28.7% 및 150.5% ± 9.0%의 발현율을 나타내었다(도 9).

상기와 같은 결과로부터, 승마 추출물을 골분화 유도 배지에 포함하는 경우, 0.1 내지 10㎍/㎖의 범위에서 골분화를 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

승마 추출물의 지방분화 촉진 효과 확인

실시예 2에서 얻은 줄기세포를 8-챔버 슬라이드에 1.6×10⁴ 세포/챔버의 농도로 두었고, 승마 추출물을 최종 농도 0(대조군), 0.1, 1, 10㎍/㎖이 되도록 첨가한 지방분화 유도 배지(STEMPRO® Adipogenesis Differentiation Kit; Gibco)로 5% CO₂ 및 95% O₂의 습윤 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 배지는 새로운 유도 배지로 3-4일마다 교체하였다. 14일 자에, 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 상기 세포를 1% Triton X-100으로 5분 동안 처리하여 투과화(permeabilize)하였다. 투과화된 세포를 지방세포 지방산 결합 단백질(Santa Cruz Biotechnology Inc)로 1시간 동안 염색하였고, 암실에서 1시간 동안 2차 항체를 처리하였다. 염색된 세포를 DAPI(Vector laboratories)가 포함된 마운팅 미디어로 마운팅하였다. 형광 현미경(Axiovert 200) 하에서 세포를 관찰하였다. 상대적인 지방분화를 이미지 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다(ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda MD).

그 결과, 도 10에서 알 수 있듯이 승마 추출물을 최종 농도로 0.1, 1 및 10㎍/㎖로 포함하는 경우, 21일자에 지방세포 지방산 결합 단백질의 발현이 확인되었다.

상기와 같은 결과로부터, 승마 추출물을 골분화 유도 배지에 포함하는 경우, 0.1 내지 10㎍/㎖의 범위에서 지방분화를 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (14)

1. 승마 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물로서,
   상기 분화는 골분화 또는 지방분화인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 승마 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 유기용매는 C₁-C₄의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
4. 청구항 2에 있어서,
   상기 추출용매는 물인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 승마 추출물은 0.0001 내지 50㎍/㎖의 함량으로 포함되는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 성체 줄기세포는 치은(gingiva) 유래인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 골분화는 줄기세포가 조골세포로 분화하는 것인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 지방분화는 줄기세포가 지방세포로 분화하는 것인 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물.
11. 승마 추출물을 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화 촉진용 배지로서,
    상기 분화는 골분화 또는 지방분화인 줄기세포 배양 또는 분화 촉진용 배지.
12. 인 비트로(in vitro) 상의 줄기세포에 승마 추출물을 처리하는 단계;를 포함하는 인 비트로 상에서의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진 방법으로서,
    상기 분화는 골분화 또는 지방분화인 인 비트로 상에서의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진 방법.
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 승마 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 인 비트로 상에서의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진 방법.
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 추출 용매는 물인 인 비트로 상에서의 줄기세포 증식 또는 분화 촉진 방법.

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