CN105879013B - 一种保肝组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种保肝组合物及其制备方法与应用。所述保肝组合物的活性成分由胸腺肽和藻类多糖组成，优选为粉雾剂，所述粉雾剂的制备方法为：先将藻类多糖微粉与乳糖微粉和泊洛沙姆微粉充分混匀，再加入胸腺肽冻干微粉，混合均匀。本发明将天然藻类多糖的消炎、抗肿瘤作用与胸腺肽的免疫调节功能协同，可用于慢性乙型肝炎的预防和辅助治疗，并且对于调节机体免疫功能和自身防御力有很好的作用。该组合物稳定性好，在提高治疗指数的同时，对细胞无毒性作用，组合物稳定，对乙型肝炎的预防和治疗具有较好的应用价值。

Description

一种保肝组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地说，涉及一种保肝组合物及其制备方法与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatisis B virus，HBV)是具有独特结构的嗜肝DNA病毒，是导致急慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的主要原因。我国是乙型肝炎病毒感染的高发区，约占世界HBV感染人数的1/3。乙肝病毒的感染和传播严重危害人们的健康，已经成为日益严重的社会问题。

胸腺肽是胸腺组织上皮细胞分泌的对淋巴细胞的分化、成熟具有重要作用的多肽，具有免疫活性。目前胸腺肽大多从小牛或乳猪胸腺中提取纯化得到，其生物活性主要是诱导T细胞分化成熟和调控免疫平衡。临床主要用于自身免疫性疾病，也同时应用于恶性肿瘤、病毒性肝炎等感染性疾病的辅助治疗。多糖是生物有机体除蛋白质、核酸之外的第三类生物大分子，主要以糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖的形式存在，广泛参与机体的多种生理功能。其中，藻类多糖的抗乙肝活性得到广泛关注。大量的研究表明海藻多糖抗乙肝病毒的作用机制存在直接抗病毒作用，免疫调节及保护肝细胞等方面。体外HepG2人肝肿瘤细胞培养和体内嗜肝病毒模型的研究证明，海藻多糖通过直接抑制HBeAg和HBsAg的分泌和HBV-DNA的复制发挥抗病毒作用。抗HBV活性多糖可以激活机体免疫系统，通过增强机体非特异性免疫和特异性细胞免疫两个方面发挥对病毒的清除作用。除此之外，天然多糖还具有低毒副作用的特性，能够改善肝功能，改善肝脏脂肪变性，从而缓解HBV感染引起的肝损伤，促进肝细胞修复。目前，已经有多种多糖类活性物质用于抗乙肝病毒和治疗急慢性肝炎的报道，在临床治疗上取得明显效果。文献报道紫球藻胞外多糖对HepG2细胞分泌的HBeAg有不同程度的抑制作用，其治疗指数大于2，证明其在体外具有抗乙肝病毒作用，这些研究为寻求更有效、更稳定、更方便的抗乙肝药物提供了借鉴和参考。

然而，现有技术中未见有将藻类多糖和胸腺肽配合使用方面的报道。而且，我国目前乙肝携带者数量庞大，但对于慢性乙肝的治疗方面，至今未见比较好的方法，因此亟待一种有效且无毒的治疗方案。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种保肝组合物及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种保肝组合物，其活性成分由胸腺肽和藻类多糖组成。所述组合物中的藻类多糖具有抑制乙肝抗原活性的作用，胸腺肽具有提高免疫力、辅助治疗慢性肝炎的作用，两者组合后协同增效，提高了抗乙肝的作用。同时，所述组合物在提高治疗指数的同时，对细胞无毒性作用，组合物稳定，对乙型肝炎的预防和治疗具有较好的应用价值。

本发明选用的藻类多糖是螺旋藻多糖提取物，是通过现代生物技术从海藻生物螺旋藻(Spirulina platensis)中提取加工而成的生物制品，为一种酸性杂多糖，富含多种蛋白质、维生素、矿物质等生物活性物质，易于吸收。

进一步地，上述活性成分可与药学上可接受的赋形剂组合，制成的保健食品组合物或药物组合物。

慢性乙型肝炎的治疗是个长期的过程，为了便于患者按时、方便服用该组合物，本发明提供一种藻类多糖提取物和胸腺肽组合物的粉雾制剂，可直接喷雾入口中借助唾液很快溶解，便于长期在外的人员按时服用组合物。

本发明的组合物粉雾剂中还包括载体乳糖和生理可接受的抗静电剂泊洛沙姆。作为优选，所述组合物粉雾剂包括以下重量份的组分：胸腺肽40-60份、藻类多糖40-60份、乳糖2-4份和泊洛沙姆1-3份。更为优选，胸腺肽45份、藻类多糖45份、乳糖3份和泊洛沙姆2份。

其中，粉雾剂中的胸腺肽是指胸腺肽冻干粉。

第二方面，本发明针对粉雾剂提供一种具体的制备方法，包括如下步骤：

S1、将藻类多糖和胸腺肽冻干粉分别粉碎至粒径为2μm～10μm，得到藻类多糖微粉和胸腺肽冻干微粉；

S2、将乳糖和泊洛沙姆粉碎至粒径50μm～200μm(优选60-90μm)，得到乳糖微粉和泊洛沙姆微粉；

S3、先将藻类多糖微粉与乳糖微粉和泊洛沙姆微粉充分混匀，再加入胸腺肽冻干微粉，充分混合均匀，即得。

进一步地，所述胸腺肽冻干粉的制备方法包括以下步骤：

(1)取动物胸腺，摘除脂肪和杂质洗净，按1:0.5-1.5的质量比加纯化水进行匀浆得到匀浆液；

(2)将匀浆液灭毒、灭菌；

(3)经离心、过滤后，收集滤液得到胸腺肽溶液；

(4)向胸腺肽溶液中加入相对胸腺肽溶液体积5-10％的甘露醇和1-2％的右旋糖酐40；

(5)低温干燥，得到胸腺肽冻干粉。

本发明将具有免疫活性的胸腺肽粉最后加入，既避免了由于胸腺肽微粉具有引湿性容易粘结影响混匀，又有利于胸腺肽活性的保持和发挥。

本发明的组合物中，胸腺肽粉是从新鲜或保鲜的小牛或乳猪胸腺中提取，藻类多糖、甘露醇、右旋糖酐40、乳糖及泊洛沙姆均购于药用原辅料供应商。例如，藻类多糖(螺旋藻多糖提取物)可购自青岛海普生物技术有限公司；甘露醇、右旋糖酐40、乳糖及泊洛沙姆购自青岛明月海藻集团有限公司等化工厂。

更为具体地，所述胸腺肽冻干粉的制备方法优选以下步骤：

(1)取小牛胸腺，摘除脂肪和杂质，先后用饮用水和纯化水洗净，按1:1的质量比加纯化水，用胶体磨进行匀浆得到匀浆液；

(2)将匀浆液灭毒、灭菌；

(3)离心取上清后，0.5μm过滤，收集滤液得到胸腺肽溶液；

(4)向胸腺肽溶液中加入相对胸腺肽溶液体积8％的甘露醇和2％的右旋糖酐40；

(5)在-40℃～-60℃低温0.03-0.08mbar真空干燥，冻干得到胸腺肽冻干粉。

前述方法中，所述步骤(2)中的灭毒、灭菌为：将匀浆液在60℃条件下加热4小时。在该加热条件下，能起到良好的灭毒灭菌作用。

其中，所述步骤(3)中的离心条件为4～10℃、4000rpm离心30min。在离心条件不仅能得到均一的胸腺肽溶液，还能保证其活性不受破坏。

第三方面，本发明还提供了前述组合物在制备预防或辅助治疗慢性乙型肝炎、急慢性肝损伤和肿瘤的药物或功能食品方面的应用。

为了考察藻类多糖与胸腺肽组合物抗乙肝病毒的协同作用，本发明选用HepG2人肝肿瘤细胞株为试验靶点，胰酶消化后，用含有15％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，加到96孔细胞培养板内，分别加入藻类多糖微粉溶液、胸腺肽冻干微粉溶液及二者组合物溶液，每组设4-8个复孔，并设有空白对照组，5％CO₂温箱37℃培养48小时后，测定乙肝抗原的分泌，考察组合物抗乙肝的协同作用。结果表明藻类多糖与胸腺肽单独给药与组合在一起给药均有抑制乙肝抗原活性的作用，且组合的效果明显高于单独给药组。为了考察安全性，利用MTT试验测定藻类多糖与胸腺肽对细胞的毒性作用。结果表明分别给药与组合给药对正常生长的HepG2细胞没有影响。同时，进行了组合物配比摸索试验，寻找到最佳组合物组合。

为了考察本发明所述组合物(粉雾剂)的稳定性，参照《保健食品稳定性试验指导原则》将所述组合物置于阴凉避光处(温度为20±2℃，相对湿度为60％±10％)，进行12个月的稳定性考察。分别于第0，3，6，9和12个月取样检测样品性状、颜色、酸碱度、澄清度、多糖多肽含量等主要项目。结果与0月比较，各项指标无明显变化。

本发明的有益效果在于：

本发明组合物以天然产物和蛋白为基础，根据慢性肝炎的治疗精心配制而成。本发明所述组合物中的海藻多糖具有抑制乙肝抗原活性作用，胸腺肽具有提高免疫力，辅助治疗慢性肝炎的作用，两者组合其抗乙肝作用叠加。本发明将天然藻类多糖的消炎、抗肿瘤作用与胸腺肽的免疫调节功能协同，可用于慢性乙型肝炎的预防和辅助治疗，并且对于调节机体免疫功能和自身防御力有很好的作用。该组合物稳定性好，在提高治疗指数的同时，对细胞无毒性作用，组合物稳定，对乙型肝炎的预防和治疗具有较好的应用价值。

本发明提供的组合物粉雾剂，利于吸收，方便使用，价格低廉，适于工业化生产和患者长期服用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1组合物粉雾剂的制作

1、胸腺肽冻干微粉的制备

(1)取保鲜的小牛胸腺80kg，摘除脂肪和杂质，分别用饮用水和纯化水洗净，按1:1加纯化水用胶体磨匀浆制成匀浆液；

(2)匀浆液60℃加热4小时病毒灭活和灭菌；

(3)4～10℃、4000rpm离心30min，0.5μm过滤，收集滤液于洁净容器获得胸腺肽溶液；

(4)按胸腺肽溶液体积加入8％的甘露醇，2％的右旋糖酐40；

(5)在-40℃～-60℃低温0.03-0.08mbar真空干燥，冻干成胸腺肽冻干粉；

(6)取胸腺肽冻干粉经超微粉碎机粉碎成2～10μm的胸腺肽冻干微粉。

2、藻类多糖微粉的制备

取藻类多糖(螺旋藻多糖提取物)60kg，用超微粉碎机粉碎成粒径为2～10μm的藻类多糖微粉。

3、载体乳糖和抗静电剂泊洛沙姆的处理

分别将乳糖4.0kg，泊洛沙姆3.0kg，用高速研磨粉碎机高速粉碎，得到粒径为60～90μm微粉。

4、组合物的制备

称取藻类多糖微粉45kg、乳糖微粉3.0kg、泊洛沙姆微粉2.0kg，充分混匀，最后加入胸腺肽冻干微粉45kg再次充分混合均匀，即得。

之后可按服用剂量将组合物分装于粉雾喷射器内。

实施例2组合物的抗乙肝活性及对细胞毒性作用

1、供试品

组合物：实施例1的组合物，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液；

螺旋藻多糖微粉：实施例1中所用的藻类多糖微粉，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液；

胸腺肽微粉：实施例1中所用的胸腺肽冻干微粉，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液。

2、细胞培养

细胞株：选用HepG2人肝肿瘤细胞株；

培养基：含15％胎牛血清的DMEM培养基。

3、实验方法

复苏后的HepG2细胞长满培养瓶时，加入0.25％的胰酶消化液，37℃孵育2min，倒出消化液，加入15％胎牛血清的DMEM培养液反复吹打，将细胞吹打均匀，传代培养48小时。

单层细胞长满培养瓶，再次加入0.25％的胰酶，消化后加入细胞计数板计数，用15％胎牛血清DMEM培养液调节细胞浓度为1×104个/cm²的细胞悬液，按以下步骤操作：

(1)用加样器吸取200μL 15％胎牛血清DMEM培养基加到平底96孔细胞培养板第1列的8个孔中，作为读板仪的空白对照；

(2)培养板第2-12列的各孔中加入200μL细胞悬液；

(3)将培养板放至5％CO₂温箱，37℃湿润环境中培养1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物；

(4)用培养基将3个供试品分别稀释成20mg/ml、60mg/ml、和100mg/ml(低中高)三种浓度的溶液；

(5)去除第2-12列各孔的培养基；

(6)在第2列和第12列的各孔中加入200μL新配制的培养基作为正常细胞培养对照；

(7)在第3-11列的各孔中分别加入三种不同浓度的供试品溶液，每个浓度加1列(8孔)，每孔200μL；

(8)将培养板放入5％CO₂温箱，37℃湿润环境中培养72小时；

(9)去除各孔中的培养基，换以相同浓度样品的培养基继续培养，每天换液，连续培养9天。

4、试验结果

(1)细胞抑制率(HBeAg分泌抑制率)检测：

在连续9天的培养期内，在培养1、3、5、7、9天换液前，吸取培养基上清液50μL，用ELISA法测定HBeAg滴度，按照试剂盒说明书操作，显色反应完成后用全自动酶标仪在450nm处测定吸光度值A。按下式计算细胞抑制率(HBeAg乙肝抗原分泌抑制率％)，结果见表1。

细胞抑制率＝(对照组A-实验组A)/对照组A。

表1组合物对乙肝抗原HBeAg分泌抑制率(％)

注：表中A为螺旋藻多糖微粉，B为胸腺肽微粉，AB为组合物；数字1代表给药剂量20mg/ml，数字2代表给药剂量60mg/ml，数字3代表给药剂量100mg/ml。

由表1可知，海藻多糖与胸腺肽无论是组合还是单独给药，均对HepG2细胞分泌的HBeAg有抑制作用，呈明显量效关系，并且随着培养时间的延长抑制率增加。三组的组间数据比较，组合物的抑制作用好于单独给药组。

(2)细胞毒性检测：

培养第九天吸取培养基上清液50μL检测抗乙肝后，在96孔细胞培养板中加入5mg/ml MTT(四唑盐)溶液，50μL/孔，混匀；用铝箔包裹培养板，于5％CO₂温箱37℃湿润环境中温育4h；弃去各孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO(二甲亚砜)和25μL甘氨酸缓冲液；混匀；立即在全自动酶标仪550nm处记录吸光值，读板仪用第1列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。结果见表2。

表2组合物对细胞的毒性作用

给药种类	MTT(A550)
		对照	0.652
组合物	0.628
		海藻多糖	0.639
胸腺肽	0.640

由表2可知，给药组和空白组的MTT值对比可以看出，HepG2细胞的活性无明显变化，说明组合物对HepG2细胞无明显毒性。本实验提示该组合物具有一定的抗乙肝临床应用价值而且对细胞没有毒性作用。

实施例3组合物稳定性考察

试验条件：参照《保健食品稳定性试验指导原则》的考察方法，将组合物置于阴凉避光处(温度为20±2℃)，对其进行12个月的稳定性考察。

一、考察指标与方法：

1、色泽

肉眼观察样品外观性状，样品均为微黄色冻干品，符合标准规定。

2、澄清度

取样品，分别加水制成每1ml中含多肽1mg的溶液，依照《中华人民共和国药典》2015年版四部方法测定。

3、pH值

取样品，分别加水制成每1ml中含多肽1mg的溶液，依照《中华人民共和国药典》2015年版四部方法测定。

4、含量

多肽：取供试品，加水制成每1ml中含多肽0.15mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚测定法测定，从回归方程中求出多肽含量。

多糖：

(1)参比溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖约0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备：精密量取本品3g，置200ml量瓶中，加水稀释至刻度。

(2)标准曲线的制备：精密量取参比溶液1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml，分别置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述5个浓度的参比溶液各1.0ml，另取水1.0ml作空白。

(3)精密量取供试品溶液1.0ml，置具塞试管中，置于冰水浴中，分别精密加入蒽酮溶液5.0ml，摇匀，置水浴中准确反应10分钟，取出，用冷水冷却至室温，照分光光度法(《中国药典》2015年版四部)，在620nm的波长处测定吸收度，以测得吸收度与其对应的浓度进行回归方程计算。

考察结果见表3：

表3组合物12个月长期试验结果

本发明的组合物在阴凉避光(温度为20±2℃，相对湿度为60％±10％)条件下保存，分别于3个月、6个月、9个月和12个月取样检测，结果与0月比较，各项指标均无明显变化，表明组合物在12个月内稳定。

实施例4组合物配比考察

1、供试品

组合物主要配比：

组合物1：藻类多糖微粉30kg+胸腺肽微粉60kg，按照实施例1比例添加辅料，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液；

组合物2：藻类多糖微粉60kg+胸腺肽微粉30kg，按照实施例1比例添加辅料，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液；

组合物3：藻类多糖微粉45kg+胸腺肽微粉45kg，按照实施例1比例添加辅料，用DMEM培养基配制成100mg/ml的溶液；

2、细胞培养

细胞株：选用HepG2人肝肿瘤细胞株；

培养基：含15％胎牛血清的DMEM培养基。

3、实验方法

复苏后的HepG2细胞长满培养瓶时，加入0.25％的胰酶消化液，37℃孵育2min，倒出消化液，加入15％胎牛血清的DMEM培养液反复吹打，将细胞吹打均匀，传代培养48小时。

单层细胞长满培养瓶，再次加入0.25％的胰酶，消化后加入细胞计数板计数，用15％胎牛血清DMEM培养液调节细胞浓度为1×104个/cm²的细胞悬液，按以下步骤操作：

(1)用加样器吸取200μL 15％胎牛血清DMEM培养基加到平底96孔细胞培养板第1列的8个孔中，作为读板仪的空白对照；

(2)培养板第2-12列的各孔中加入200μL细胞悬液；

(3)将培养板放至5％CO₂温箱，37℃湿润环境中培养1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物；

(4)去除第3-10列各孔的培养基；

(5)在第3列和第10列的各孔中加入200μL新配制的培养基作为正常细胞培养对照；

(6)在第4-9列的各孔中分别加入三种不同配比的供试品溶液，每个配比加2列(8孔)，每孔200μL；

(7)将培养板放入5％CO₂温箱，37℃湿润环境中培养72小时；

(8)去除各孔中的培养基，换以相同浓度样品的培养基继续培养，每天换液，连续培养9天。

4、试验结果

(1)细胞抑制率(HBeAg分泌抑制率)检测：

具体测试方法参照实施例2.实验结果参见表4。

表4组合物对乙肝抗原HBeAg分泌抑制率(％)

由表4可知，海藻多糖与胸腺肽无论是何种配比，均对HepG2细胞分泌的HBeAg有抑制作用，并且发现在海藻多糖和胸腺肽多糖按照1:1比例加入时，抑制率最高，进而寻找到组合物的最佳配比。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种保肝组合物，其特征在于，所述组合物为粉雾剂；

包括以下重量份的组分：胸腺肽40-60份、藻类多糖40-60份、乳糖2-4份和泊洛沙姆1-3份。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其包括以下重量份的组分：胸腺肽45份、藻类多糖45份、乳糖3份和泊洛沙姆2份。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述胸腺肽为胸腺肽冻干粉。

4.权利要求3所述组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将藻类多糖和胸腺肽冻干粉分别粉碎至粒径为2μm～10μm，得到藻类多糖微粉和胸腺肽冻干微粉；

S2、将乳糖和泊洛沙姆粉碎至粒径50μm～200μm，得到乳糖微粉和泊洛沙姆微粉；

S3、先将藻类多糖微粉与乳糖微粉和泊洛沙姆微粉充分混匀，再加入胸腺肽冻干微粉，充分混合均匀，即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胸腺肽冻干粉的制备方法包括以下步骤：

(1)取动物胸腺，摘除脂肪和杂质洗净，按1:0.5-1.5的质量比加纯化水进行匀浆得到匀浆液；

(2)将匀浆液灭毒、灭菌；

(3)经离心、过滤后，收集滤液得到胸腺肽溶液；

(4)向胸腺肽溶液中加入相对胸腺肽溶液体积5-10％的甘露醇和1-2％的右旋糖酐40；

(5)低温干燥，得到胸腺肽冻干粉。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为将匀浆液在60℃条件下加热4小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离心条件为4～10℃、4000rpm离心30min，超滤指通过0.5μm膜。

8.权利要求1-3任一项所述的组合物在制备预防或辅助治疗慢性乙型肝炎、急慢性肝损伤和肿瘤的药物或功能食品方面的应用。