CN1933811A - 改进赋形剂结晶作用的冷冻干燥方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了改进的冷冻干燥(冻干)有效成分如蛋白质、核酸和病毒的方法。与现有方法相比，本方法提高了冷冻干燥过程中赋形剂的结晶程度。赋形剂结晶的改善部分地基于在二次干燥前或者在二次干燥时进行的高温退火步骤。重要的是，高温退火步骤不破坏有效成分的稳定性。此外，在进行高温退火步骤之前不需要零度下退火步骤以便使赋形剂完全结晶。

Description

改进赋形剂结晶作用的冷冻干燥方法

该申请要求2004年6月15日提出的美国临时专利申请号60/580,140和2004年3月5日提出的美国临时专利申请号60/550,020的优先权，该两个专利申请在本文整体引用作为参考。

本文引用的所有的专利、专利申请和出版物因此整体引用作为参考。这些申请的公开引入本申请中作为参考，以便更全面描述在这里描述和要求专利保护的发明申请之时所属领域技术人员所已知的当前技术水平。

发明背景

由于有效成分如蛋白质、核酸和病毒(例如作为疫苗的组分)的潜在不稳定性和降解，所以经常必须将它们制成固体形式以达到作为药物产物的可接受的货架寿命。最通常使用的制备固体蛋白质药物的方法为冷冻干燥。冷冻干燥按传统由两个主要步骤组成：(1)冷冻蛋白质溶液并且(2)在真空条件下干燥冻结的固体。干燥步骤进一步分成两个阶段：一次干燥和二次干燥。一次干燥步骤试图去除冻结的水或溶剂(升华作用)且二次干燥步骤试图去除非冻结的“结合”水或溶剂(解吸)。冷冻干燥去除水或其他溶剂通过大大降低有效成分的降解速度而稳定药物制剂。这种方法通过去除制剂中的溶剂成分至不再支持化学反应或生物生长的水平来抑制降解过程。此外，溶剂的去除降低了分子流动性，同时降低了降解反应的可能性。溶剂的去除首先通过冷冻制剂以便使冷冻过程将一种或多种溶剂与溶质分离并将任何未冻结溶剂分子固定在冻结的溶剂晶体间的间隙区域实现。然后通过升华作用(一次干燥)和接下来的解吸(二次干燥)去除溶剂。

冷冻干燥前的溶液中的溶质包含目的蛋白质或药物(有效成分)和无活性成分(赋形剂)。当冷冻干燥时，赋形剂可保留在与蛋白质相同的相中或者它们可从含蛋白质(有效成分)的相中分相。含蛋白质的相一般为无定形相。当赋形剂从含蛋白质相中分相时它们可形成结晶相或无定形相。

此外，结晶赋形剂通常在冻干产物中用作膨胀剂并有时用作稳定剂。通常使用的结晶赋形剂包括氨基酸，如甘氨酸；多元醇，如甘露醇；以及盐，如氯化钠。通常需要在冷冻干燥后完全结晶的结晶赋形剂。如果结晶赋形剂在冷冻干燥后未完全结晶，它们可保留在与蛋白质相同的无定形相中。这可通过允许更大的分子流动性使蛋白质不稳定。完全的结晶作用增强干燥和成块，从而降低最终的残留水分水平。完全的结晶作用也阻止了在贮存后出现不必要的结晶。因为更高程度的结晶作用降低无定形物质的数量，所以获得了更高的玻璃化转变温度。一般地，这些种类的赋形剂的结晶作用通过在一次干燥前于零度下(摄氏度)温度进行的低温退火步骤实现。然而，此零度下退火过程是缓慢的并且往往不能充分结晶或完全结晶。特别地，甘氨酸和氯化钠的混合抑制任一赋形剂的结晶作用并且此种低温退火过程不能有效促进结晶作用，所以需要多个低温退火步骤以使赋形剂进一步结晶。

发明概述

本发明提供了改进的冷冻干燥(冻干)包括蛋白质、核酸和病毒在内的有效成分的方法。与现有方法相比，本方法提高了冷冻干燥过程中赋形剂结晶的程度。赋形剂结晶作用的改善部分地基于在二次干燥前引入了退火步骤。该退火步骤在高温度下(0℃以上)进行并且在其之前不需要多个零度以下的退火步骤。虽然诸如蛋白质、病毒和核酸的有效成分本身就是热不稳定的，以致于暴露于高温下造成降解，但是本发明意外发现高温退火不引起有效成分的降解或不稳定。此外，本发明提供了通过该冷冻干燥方法生产的冻干产物，其中在产物中包含甘氨酸和氯化钠，并且其中相对于不包括高温退火的现有方法而言甘氨酸基本上完全结晶或更大程度结晶(或更多结晶)。

在一个方面，本发明提供了冷冻干燥含水药物制剂的方法，此方法包括：(a)在低于-10℃的温度下将含水药物制剂冷冻；(b)在大约-35℃和大约20℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂干燥；(c)在高于大约25℃的温度下将步骤(b)的药物制剂退火；和(d)在低于步骤(c)所用温度的温度下将步骤(c)的药物制剂干燥。在本发明的一个方面，步骤(a)的温度低于-35℃且冷冻进行1个小时以上的持续时间。在另一方面，步骤(b)的温度为大约-30℃和大约20℃之间，或者大约-25℃和大约10℃之间，或者大约0℃。在另一方面，步骤(c)的温度为大约25℃和大约75℃之间，或者大约35℃和大约60℃之间，或者大约50℃。在另一方面，步骤(d)的温度为大约25℃和大约35℃之间；在一个方面，步骤(d)的温度为大约25℃。通过本方法冷冻干燥的含水药物制剂在本质上可含有任何有效成分，包括但不限于蛋白质、肽、核酸和病毒。

在另一方面，本发明提供了冷冻干燥含水药物制剂的方法，此方法包括：(a)在低于-10℃的温度下将含水药物制剂冷冻；(b)在大约-35℃和大约0℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂退火；(c)在大约-35℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂干燥；(d)在大约25℃和大约75℃之间的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；和(e)在低于步骤(d)所用温度的温度下将步骤(d)的药物制剂干燥。在另一方面，步骤(b)的温度为大约-25℃和-10℃之间，或者大约-20℃和-10℃之间，或者为大约-15℃。在另一方面，步骤(c)的温度为大约-30℃和5℃之间，或者大约-25℃和10℃之间，或者大约-20℃和0℃之间，或者大约-20℃和-10℃之间，或者为大约0℃。在另一方面，步骤(d)的温度为大约35℃和60℃之间，或者为大约50℃。在另一方面，步骤(e)的温度为大约25℃。还在另一方面，该方法还可包含在步骤(b)之后和步骤(c)之前进行的再冷冻步骤，其中再冷冻步骤包括在低于-35℃，或者在大约-40℃--50℃的温度下冷冻制剂。

在另一方面，本发明提供了冷冻干燥方法，其中含水药物制剂包含至少一种结晶赋形剂。结晶赋形剂选自氨基酸、盐和多元醇。在一个方面，氨基酸为甘氨酸或组氨酸。在另一方面，盐为氯化钠。在另一方面，多元醇为甘露醇。在一个方面，含水药物制剂包含结晶赋形剂的组合，其中组合为盐和氨基酸的组合。在一个方面，组合中的盐为氯化钠，其中氯化钠在制剂中以高于大约25mM的浓度存在，或者以大约25mM和200mM、30mM和100mM或者40mM和60mM之间的浓度存在，或者以大约50mM的浓度存在。在另一方面，组合中的氨基酸在制剂中以大约1％至大约10％、1.5％至5％、1.5％至3％的浓度存在，或者以大约2％的浓度存在。在另一方面，组合中的氨基酸为甘氨酸。

在一个方面，本发明提供了冷冻干燥含水药物制剂的方法，其中方法包括：(a)在低于-35℃的温度下将含水药物制剂冷冻；(b)任选地在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂退火；(c)在大约-10℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂干燥；(d)在大约35℃和大约60℃之间或者大约35℃和大约50℃之间的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；和(e)在低于步骤(d)所用温度的温度下将步骤(d)的药物制剂干燥。

在一个方面，本发明提供了冷冻干燥包含氯化钠和甘氨酸的含水药物制剂的方法，其中方法包括：(a)在低于-35℃的温度下将含水药物制剂冷冻；(b)任选地在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂退火；(c)在大约-10℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂干燥；(d)在大约35℃和大约50℃之间的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；和(e)在低于步骤(d)所用温度的温度下将步骤(d)的药物制剂干燥。

在另一方面，本发明提供了冷冻含水药物制剂的方法，其中所述的含水药物制剂包含高于35mM的氯化钠和大约250mM和大约300mM之间的甘氨酸或者大约250mM和大约270mM之间的甘氨酸，其中该方法包括：(a)在低于-35℃的温度下将含水药物制剂冷冻；(b)在大约-15℃下将步骤(a)的药物制剂退火；(c)在大约0℃下将步骤(b)的药物制剂干燥；(d)在大约50℃下将步骤(c)的药物制剂退火；和(e)在大约25℃下将步骤(d)的药物制剂干燥。此方法还可在步骤(b)之后和步骤(c)之前包括再冷冻步骤，其中再冷冻步骤包括在大约-40℃至大约-50℃下将步骤(b)的药物制剂冷冻。

在一个方面，本发明提供了在冷冻干燥过程中增强赋形剂结晶作用的方法，其包括：(a)提供包含氯化钠和另一种膨胀剂，如甘氨酸的含水药物制剂；(b)将含水药物制剂冷冻；(c)任选地在大约-35℃和大约0℃之间或者大约20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂退火；(d)在大约-35℃和大约10℃之间或者大约-5℃和大约5℃之间的温度下将步骤(b)或步骤(c)的药物制剂干燥；(e)在大约25℃和大约75℃之间的温度下将步骤(d)的药物制剂退火，以致于使膨胀剂和/或氯化钠在步骤(e)之后比步骤(e)之前更大程度的结晶；和(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的药物制剂干燥，从而增强赋形剂结晶作用。在该方法中，膨胀剂可包含例如甘氨酸、丙氨酸或甘露醇(除氯化钠外)。在一个方面，膨胀剂为甘氨酸。在另一方面，这种在冷冻干燥过程中增强赋形剂结晶作用的方法还包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前进行的再冷冻步骤，其中再冷冻步骤包括在大约-40℃和-50℃之间的温度下或者在大约-50℃的温度下将来自步骤(c)的制剂冷冻。

在另一方面，本发明提供了通过如下方法生产的冻干产物，该方法包括：(a)提供包含甘氨酸和氯化钠的制剂；(b)冷冻制剂；(c)任选地在大约-35℃和大约0℃之间的温度下将步骤(b)的制剂退火；(d)在大约-35℃和大约10℃之间的温度下将步骤(c)的制剂干燥；(e)在大约25℃和大约70℃之间的温度下将步骤(d)的制剂退火；和(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的制剂干燥，从而提供冻干产物。通过该方法冷冻干燥的制剂中的有效成分可包含蛋白质、核酸或病毒。此外，步骤(f)之后的冻干产物中的甘氨酸可比步骤(e)之前更大程度结晶。

在一个方面，本发明提供了通过如下方法生产的冻干产物，该方法包括：(a)提供包含甘氨酸和氯化钠的制剂；(b)冷冻制剂；(c)任选地在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(b)的制剂退火；(d)在大约-5℃和大约5℃之间的温度下将步骤(c)的制剂干燥；(e)在大约35℃和大约60℃之间或者大约35℃和大约50℃之间的温度下将步骤(d)的制剂退火；和(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的制剂干燥，从而提供冻干产物。在另一方面，步骤(f)之后的冻干产物中的甘氨酸基本为完全结晶的或者比无步骤(e)的冻干产物中的甘氨酸更大程度地结晶(或者相对于在二次干燥前不包括高温退火步骤的冷冻干燥方法而言更大程度地结晶)。在另一方面，冻干产物在高贮存温度和加速温度下的长时间阶段内基本稳定。长时间阶段可为例如至少1个月、3个月、6个月、1年或更长。高贮存温度和加速温度可为例如大约25℃和大约50℃之间。稳定性可通过例如冻干产物中存在的HMW实体的百分比、有效成分的浓度和有效成分的活性检测。

图例简述

图1描述了根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂1的固体块的代表性的差示扫描量热法(DSC)第一次扫描(图1A)和第二次扫描(图1B)(制剂1、2和3的成分见表2；Lyo G、H和I循环步骤见表3、4和5；实验描述见实施例1)。在根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂1的固体块的第一次扫描中观察到结晶现象，这表明在固体块中没有完全结晶或充分结晶。如其中所述，当DSC第一次扫描中表明存在结晶作用时，这表明冻干块中没有发生完全结晶或充分结晶。因此第一次扫描显示发生了结晶现象，并且第二次扫描证实放热现象为再结晶作用。

图2描述了根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂2的固体块的代表性的DSC第一次扫描(图2A)和第二次扫描(图2B)(制剂1、2和3的成分见表2；Lyo G、H和I循环步骤见表3、4和5；实验描述见实施例1)。在根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂2的固体块的第一次扫描中观察到结晶现象，这表明在固体块中没有完全结晶或充分结晶。第二次扫描证实第一次扫描中观察到的放热现象为结晶作用。此外，第二次扫描显示未出现转变温度Tg。

图3描述了根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂3的固体块的代表性的DSC第一次扫描(图3A)和第二次扫描(图3B)(制剂1、2和3的成分见表2；Lyo G、H和I循环步骤见表3、4和5；实验描述见实施例1)。在根据循环Lyo G、H或I冷冻干燥的制剂3的固体块的第一次扫描中观察到结晶现象，这表明在固体块中没有完全结晶或充分结晶。第二次扫描证实第一次扫描中观察到的放热现象为结晶作用。此外，第二次扫描显示未出现转变温度 Tg。

图4描述了根据循环Lyo J冷冻干燥的制剂4(“fix927lyoJ.001”；长虚点线)、制剂5(“fix50250lyoja.001”；非虚线)和制剂6(“fix50270lyoja.001”；虚线)固体块的DSC第一次扫描(图4A)和第二次扫描(图4B)(制剂4、5和6的成分见表7；Lyo J、K和L循环步骤见表8、9和10；实验描述见实施例2)。表11概括了实施例2中的DSC第一次和第二次扫描资料，其中根据Lyo J冷冻干燥的制剂5和6在第一次扫描中显示出现结晶现象，第二次扫描显示未出现转变温度Tg。

图5描述了根据循环Lyo K冷冻干燥的制剂4(“fix927yoK.001”；长虚点线)、制剂5(“fix50250yok.001”；非虚线)和制剂6(“fix50270yok.001”；虚线)固体块的DSC第一次扫描(图5A)和第二次扫描(图5B)(制剂4、5和6的成分见表7；Lyo J、K和L循环步骤见表8、9和10；实验描述见实施例2)。图5C提供了关于通过Lyo K循环冷冻干燥的制剂4(“fix 927lyoK”)的固体块的另一个第二次扫描资料。表11概括了实施例2中的DSC第一次和第二次扫描资料，其中根据Lyo K冷冻干燥的制剂4、5和6在第一次扫描中显示未出现结晶，在第二次扫描中显示出现转变温度Tg。

图6描述了根据循环Lyo L冷冻干燥的制剂4(“fix927lyol.001”；长虚点线)、制剂5(“fix50250lyoL.001”；非虚线)和制剂6(“fix50270lyoL.001”；虚线)固体块的DSC第一次扫描(图6A)和第二次扫描(图6B)(制剂4、5和6的成分见表7；Lyo J、K和L循环步骤见表8、9和10；实验描述见实施例2)。图6C提供了关于通过Lyo L循环冷冻干燥的制剂4(“fix 927lyoL”)的固体块的另一个第二次扫描资料。表11概括了实施例2中的DSC第一次和第二次扫描资料，其中根据Lyo L冷冻干燥的制剂4、5和6在第一次扫描中显示未出现结晶，在第二次扫描中显示出现转变温度Tg。

图7提供了制剂4、5和6的冷冻干燥前制剂和根据Lyo J、K和L冷冻干燥后固体块中存在的高分子量种类的百分比。(见实施例2)。对每一种制剂，一式三份检测和测定10个小瓶。“PCTRL”指冷冻干燥前的制剂4；“CTRL”指冷冻干燥后的制剂4。“P50/250”指冷冻干燥前的制剂5；“50/250”指冷冻干燥后的制剂5。“P50/270”指冷冻干燥前的制剂6；“50/270”指冷冻干燥后的制剂6。

图8提供了制剂4、5和6的冷冻干燥前制剂和根据Lyo J、K和L冷冻干燥后固体块中因子IX蛋白质的凝固活性(图8A)和凝固活性恢复百分比(图8B)。(见实施例2)。对每一种制剂，每一种冷冻干燥后制剂检测8个小瓶。由于填充4mL而重构稀释成5mL，所以图8B中的预期最高恢复值为80％恢复。

图9提供了制剂4、5和6的冷冻干燥前制剂和根据Lyo J、K和L冷冻干燥后固体块中因子IX蛋白质的比活性恢复百分比(见实施例2)。

图10提供了根据Lyo G冷冻干燥的制剂2的固体块(图10A)和根据Lyo L冷冻干燥的制剂6的固体块(图10B)的X射线衍射(XRD)模式图。XRD模式图表明冻干样品中存在结晶甘氨酸。此外XRD模式图显示了通过Lyo L冷冻干燥的甘氨酸/氯化钠制剂比通过Lyo G冷冻干燥的甘氨酸/氯化钠制剂具有更多结晶物质的定性模式。XRD峰高与结晶度相关，其中更高的峰反应了更多结晶物质的存在。

图11显示了根据Lyo Q冷冻干燥的制剂7的固体块的XRD模式图(见实施例3)。将根据Lyo Q冷冻干燥的制剂的XRD模式图与根据Lyo G冷冻干燥的制剂的XRD模式图比较。使用根据Lyo G冷冻干燥的制剂进行比较是因为Lyo G冷冻干燥除了不具有50℃的热处理以外，其余冷冻干燥循环参数与与Lyo Q冷冻干燥相同。如可通过17.5°峰强度所观察到，XRD模式图比较显示通过Lyo Q的冷冻干燥造成甘氨酸结晶作用的增强。

发明详述

本发明涉及改进的冷冻干燥药物制剂的方法。冷冻干燥至关重要，这是部分因为冷冻干燥通过延缓或阻止降解来帮助稳定有效成分(如蛋白质、核酸和病毒)。本方法提供了冷冻干燥步骤中改进的赋形剂结晶作用，从而提高了冻干产物的稳定性和效果。因为如果结晶赋形剂留在含蛋白质或药物的无定形相中，那么赋形剂降低那一相的玻璃化转变温度(T_g)，所以通常需要结晶赋形剂在冷冻干燥后完全结晶。具有降低的T_g的无定形相具有增强的分子流动性。增强的分子流动性可使降解反应速度增加。因此，对预期存在于无定形相中的药物而言，提高那一相的玻璃化转变温度会造成提高的稳定性。相反地，较差的冷冻干燥方法因未结晶赋形剂仍留在无定形相中导致产生具有降低玻璃化转变温度的制剂，该制剂预期具有较差的稳定性。

现有方法通过在一次干燥前于低于零摄氏度的温度下进行退火步骤使赋形剂结晶。然而，这种零度下退火方法是缓慢的且往往不能充分结晶或完全结晶。特别地，甘氨酸和氯化钠的混合抑制了任一赋形剂的结晶并且此种低温退火过程不能有效增强赋形剂的结晶，所以需要更长的循环。相反，本发明提供了在二次干燥前引入高温退火步骤的方法，这样不需要多个零度下退火步骤来增强赋形剂的结晶。此外，虽然诸如蛋白质、病毒和核酸的有效成分本来就是热不稳定的以致于暴露于高温会造成降解，但是本发明意外发现高温退火不引起有效成分的降解或不稳定。因此，本发明提供了增强冷冻干燥过程中赋形剂结晶作用、包括增强包含甘氨酸和氯化钠的制剂的赋形剂结晶作用的有效方法。

如此处所使用，术语“冷冻干燥”、“冷冻干燥的”和“冻干的”涉及像“冷冻”溶液然后“干燥”的方法。通常，本发明的冷冻干燥方法包括下列步骤：(1)冷冻，(2)一次干燥，(3)在高于大约25℃的温度下高温退火和(4)在与高温退火步骤相同或更低的温度下二次干燥。可在一次干燥之前开展一个或多个任选的低温退火步骤，并在低温退火步骤之后开展任选的再冷冻步骤。

本发明意外发现，在二次干燥之前的高温退火不会使有效成分不稳定，因此本方法能在提供更有效、实用和高效的冷冻干燥方案的同时增强了赋形剂结晶作用。与现有方法相比，本发明的冷冻干燥方法在保持有效成分的稳定性和活性的同时允许增加结晶膨胀剂。本发明有时提到赋形剂完全结晶的目标，并且因为目前的技术灵敏度不能完全确定地告知赋形剂100％的结晶，所以本领域的技术人员会理解“完全结晶”是难以验证的。因此，实际上本发明提供了相对现有方法而言增强赋形剂结晶作用的冷冻干燥方法。因此，如此处所使用，可通过例如差示扫描量热法(DSC)评价冷冻干燥产物的“完全结晶”，其中本领域的技术人员会认识到，第一次扫描中的不可逆放热现象代表着结晶，其表明结晶赋形剂在冷冻干燥过程中没有完全结晶(见实施例)。

冷冻干燥过程

冷冻干燥循环在传统上包括三个阶段：冷冻(热处理)、一次干燥(升华作用)和二次干燥(解吸)。在多个实施方案中，本发明通过在二次干燥前引入一个或多个退火阶段改进了传统的冷冻干燥过程，其中退火和干燥阶段在特定的温度范围进行。在本发明中，除非另外指出，冷冻干燥过程的特定温度和温度范围指冷冻干燥器装置的架子温度。架子温度指冷却剂流经冷冻干燥器架子的控制温度，其为人们在冷冻干燥过程中根据温度所要控制的。样品的温度(产物温度)取决于架子温度、室内压强和一次干燥过程中的蒸发/升华作用的速度(蒸发冷却使产物温度低于架子温度)。本发明提供了改进的冷冻干燥方法，以便提供例如更一致、稳定和美观的产物。

在本发明中，对于固体百分比为重量/重量比而对于液体百分比为重量/体积比。

程式术语：

冷却药物制剂过程中冰(溶剂晶体)的形成使所有溶质浓缩。溶质浓缩最终将溶液从液态变成玻璃态。这种冷冻浓缩溶液的可逆转变称为最大限度冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度，T_g’。该温度也称为玻璃状转换温度。T_g’用于将这种转变与纯的聚合物的真正玻璃化转变的软化点T_g区别开来。崩溃温度T_col为冻结基质中的空隙间水显著地变为可流动的温度。为进行参考，表1列出了一些通常使用的赋形剂和缓冲液和蛋白质(其中这些蛋白质不是制剂的有效成分，而是制剂的附加成分)。

表1：缓冲液、赋形剂和蛋白质列表

化合物
	缓冲剂：柠檬酸；Hepes；组氨酸；醋酸钾；柠檬酸钾；磷酸钾；醋酸钠；碳酸氢钠；柠檬酸钠；Tris(三羟甲基氨基甲烷)碱；Tris-HCl
赋形剂，低分子量：β-丙氨酸；阿拉伯糖；精氨酸；纤维二糖；果糖；岩藻糖；半乳糖；葡萄糖；谷氨酸；甘油；甘氨酸；组氨酸；乳糖；赖氨酸；麦芽糖；麦芽三糖；甘露醇；甘露糖；蜜二糖；辛酮糖；棉子糖；核糖；氯化钠；山梨糖醇(葡萄糖醇)；蔗糖；海藻糖；水；木糖醇；木糖。(本领域的技术人员会理解，这些赋形剂中的一些为结晶赋形剂，如甘氨酸、甘露醇和氯化钠，并且这些赋形剂中的一些形成无定形相)。
	赋形剂，高分子量：纤维素；β-环糊精；葡聚糖；菲可；明胶；羟丙基甲基纤维素；羟乙基淀粉；麦芽糖糊精860；甲基纤维素；PEG；聚葡萄糖；PVP；交联葡聚糖；淀粉
蛋白质：BSA；α-酪蛋白；球蛋白；HAS；α-乳白蛋白；LDH，溶菌酶；肌红蛋白；卵白蛋白；RNA酶A。

当含水制剂的温度降到0℃以下时水首先结晶出来。然后取决于冷冻的速度，制剂中具有最小溶解度的可结晶成分接着结晶出来。这个温度(制剂中可结晶成分结晶的温度)命名为结晶温度。当在最小溶解度成分结晶之后含水制剂的温度进一步降低时，可结晶成分和水以混合物同时结晶出来。这个温度命名为共晶结晶/熔解温度，T_eut。由于赋形剂的相互作用一些多组分制剂不表现出T_eut。

冷冻：

冷冻干燥中的第一步是冷冻步骤。将制剂或样品冷冻成固体，其将物质中的水分转变成冰。在一个实施方案中，可在低于-10℃的温度下进行含水药物制剂的冷冻。在另一个实施方案中，可在-35或-50℃或者低于-35或-50℃进行冷冻。在本发明中，一旦冷冻温度(如在架子温度中)达到大约-35℃到大约-50℃之间的目标温度时，然后将冷冻温度保持(“冷冻保持”步骤)到样品冻结，或者保持大约1小时到大约24小时、大约3小时到大约12小时、大约5小时到大约10小时、或者大约5小时。冷冻的时间取决于诸如每瓶溶液体积等因素，而与制剂组成无关。

低温退火(任选的步骤)：

在本发明中，低温退火步骤是任选的。因为可结晶成分可能不完全结晶或不充分结晶，所以现有方法在干燥前使用一个或多个低温退火步骤。然而因为低温退火步骤需要长时间的和多个循环，所以这些现有方法效率低，并且这些现有方法不足以促进充分结晶或完全结晶。

制剂成分的完全结晶可提供必需的块结构或者由于完全结晶有效成分在制剂中可更稳定。将可结晶成分如甘氨酸从无定形相中去除可增加无定形相的T_g’。增加的T_g’使得可在较高温度下进行更有效的一次干燥。此外，赋形剂的更完全结晶也可提高冷冻干燥后的T_g，这对有效成分的稳定性是至关重要的。

在本发明中，低温退火步骤可在大约-35℃到大约0℃的温度进行，或者在大约-25℃和-10℃之间的温度下进行，或者在大约-20℃和-10℃之间的温度下进行。在一个实施方案中，低温退火步骤在大约-15℃的温度下进行。

通过从冷冻步骤(也称为“冷冻保持”)提高温度达到低温退火步骤温度。将调节温度从冷冻温度提高到低温退火温度的过程称为“退火坡度”步骤，其在本发明中是任选的。退火坡度步骤可以不同速度进行，例如以每分钟大约0.1℃到大约5℃的速度进行。

再冷冻(任选步骤)：

本发明的冷冻干燥方法还包括对在低温退火步骤之后包括再冷冻步骤的选择。再冷冻步骤可在大约-35℃到-50℃间的冷冻温度(冷冻保持温度)进行大约1-10小时、3-7小时或5小时。冷冻坡度步骤可以例如每分钟大约-0.5℃到-5℃的速度进行。

真空起始：

在马上进行一次干燥之前，将制剂于马上进行一次干燥之前的步骤的温度下放于真空下。这个步骤称为“真空起始”。这样，如果再冷冻步骤在一次干燥之前，那么真空起始在再冷冻步骤温度下进行。真空可为大约20到大约300微米之间的水平。一旦启动真空，就要在其余冷冻干燥过程保持真空，虽然真空水平可以改变。

一次干燥：

干燥分成两个阶段：一次干燥和二次干燥。一次干燥去除冻结的水(冰的升华作用)且二次干燥去除非冻结的“结合”水(水的解吸)。在一次干燥中，目的是从样品中去除未结合的或易去除的冰。一次干燥步骤开始时的未结合水应为游离冰的形式，这通过将其由固体直接转变成蒸气去除，该转变过程称为升华作用。

在本发明中，一次干燥步骤可在大约-35℃和大约20℃之间的温度下进行，或者在大约-25℃和10℃之间的温度下进行，或者在大约-20℃和0℃之间的温度下进行。在一个实施方案中，一次干燥步骤在0℃下进行。

调节温度从一次干燥前步骤的温度提高到一次干燥温度称为“一次干燥坡度”步骤，其为任选步骤。一次干燥坡度步骤可以每分钟大约0.1℃到大约5℃的速度进行。

可开展一次干燥步骤达到足够时间以确保全部冻结水基本从样品中去除。本领域的技术人员会理解，一次干燥时间可随构型变化，因为一次干燥的持续时间取决于填充量和几何形状(块的表面积-阻力/流动)。在一个实施方案中，一次干燥的持续时间大于10小时，在另一个实施方案中，一次干燥的持续时间为大约10到大约100小时。在另一个实施方案中，一次干燥的持续时间为大约30-50小时。在另一个实施方案中，一次干燥的持续时间为38小时。

可使用多种方法监测一次干燥步骤的完成。一种方法是在冷冻干燥过程中观察产物温度的变化。另一种方法是观察室内压力的变化，其中当升华作用结束时，室内不再有引起压力变化的水。当产物(样品)温度接近架子温度时一次干燥步骤结束，这可通过因升华速度降低使得产物温度轨迹的斜率显著改变而得到证明；当升华作用结束时蒸发冷却结束。为防止过早结束，可使一次干燥持续时间额外增加2-3小时。另一种监测一次干燥完成的方法是压力上升检测。通过断开真空源，室内压力可以取决于产物中水分数量的速度上升。可在压力上升的速度低于特定值时确定一次干燥过程的结束。另一种确定一次干燥步骤结束的方法为测量传热速度(Jennings，T.A.，Duan，N.(1995)，J.Parent.Sci.Technol.，49，272-282)。

高温退火：

本发明的方法包括在二次干燥前进行一个或多个高温退火(或热处理)步骤。在现有方法中，当二次干燥在高温度下进行时，在一次干燥之前必需进行零度下退火步骤。然而，本发明公开了不需要零度下退火步骤而进行高温二次干燥的方法。本发明已经确定，如果在二次干燥过程中或即将进行二次干燥之前进行高温退火步骤，则高温干燥前的零度下退火步骤不是必需的。本发明已经确定，高温退火步骤在保持有效成分稳定性的同时提高了赋形剂结晶作用，这包括甘氨酸结晶作用。

因此，本发明提供了在二次干燥之前的高温退火步骤，其中高温退火步骤在高于大约25℃的温度下进行。在一个实施方案中，高温退火步骤温度为大约25℃到大约75℃或者大约35℃到大约60℃。在另一个实施方案中，高温退火步骤在大约50℃的温度下进行。在另一个实施方案中，高温退火步骤在大约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃的温度下进行。在另一个实施方案中，退火步骤的温度为通过示差扫描量热法所观察到的对应结晶开始的温度或高于其的温度。一旦本领域的技术人员认识到结晶动力学可以更慢且步骤持续时间可以更长，则可考虑使用稍微低于结晶开始温度的温度。高于结晶开始温度的温度是优选的，因为结晶的动力学更快且步骤持续时间可更短。

调节温度从一次干燥提高到高温退火称为“高温退火坡度”(坡度步骤在本发明中是暗示的，因为从一个保持温度到另一个保持温度的变化本来就包括某种坡度)并且可以每分钟大约0.1到大约20℃的速度进行。

高温退火步骤的持续时间取决于许多因素，其中包括填充体积。高温退火步骤可例如进行1小时到大约24小时。在一个实施方案中，高温退火步骤进行大约1小时到大约15小时。在另一个实施方案中，高温步骤进行大约10小时。令人惊讶的是，本发明的高温退火步骤不负面影响蛋白质稳定性或活性(见实施例2)。这是未预料到的，因为已知蛋白质为热不稳定的。此外，实施例2表明高温退火步骤引起赋形剂(在这个实施例中为甘氨酸)结晶的增加。

二次干燥：

即使通过前面提到的升华过程去除所有的游离冰，样品还可能含有足够的限制其结构完整性和货架寿命的结合水。在二次干燥过程中，将产物中与固体结合的水转变成蒸气。因为在相同温度下剩下的结合水与游离液体相比具有更低的压力，这是一个缓慢过程。虽然在前面的干燥和退火方法中去除了一些结合水，但是在去除游离冰之后需要二次干燥，以获得足够低的残余水分水平，所述的残余水分水平提供给最终产物所需生物学特性和结构特性。

取决于冷冻干燥过程，甘露醇可结晶为甘露醇水合物。当储藏时，甘露醇水合物可转变成结晶甘露醇，从而释放出水。然后，释放的水可(1)参与化学反应和(2)降低无定形相的T_g，以允许更大的分子流动性和降解反应。高温退火步骤可用于将结晶甘露醇水合物转变成结晶甘露醇，以便在二次干燥过程中可去除剩余的水。

在本发明中，可在与高温步骤所用温度相同或更低温度下进行二次干燥步骤。在一个实施方案中，二次干燥步骤在大约0℃到低于35℃或者大约15℃到大约35℃的温度下进行。在另一个实施方案中，二次干燥步骤在大约25℃下进行。

调节温度从高温退火步骤降低到二次干燥步骤温度的步骤称为“二次干燥坡度”，其在本发明中为任选步骤。二次干燥坡度步骤可以每分钟大约0.1℃到大约10℃的温度降低速度进行。

开展二次干燥步骤达到足够时间以将冻干产物中的残余水分水平降低到所期望水平。在本发明中，所期望残余水分水平低于2％。在一个实施方案中，通过本方法生产的冻干产物的残余水分水平为低于1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.10％。可使用卡尔·费歇尔测定法测定样品中的残余水分水平。此外，也可使用压力上升检测和测量热转移速率确定二次干燥步骤的结束。备选地，可使用电子湿度计或残余气体分析器(Nail.S.L.，Johnson，W.，(1992)Dev.Biol.Stand.74，137-150)。同样地，可通过使用架子温度(其中二次干燥步骤的架子温度与高温步骤中所用温度相同或更低)与持续时间的不同组合系统测定二次干燥的最低持续时间。可通过数种方法包括干燥失重、卡尔·费歇尔滴定法、热重分析(TGA)、气相色谱法(GC)或红外光谱法测定冻干制剂中的残余水分含量。

冷冻干燥制剂

待冷冻干燥的制剂包含三种主要成分：(1)一种或多种有效成分、(2)一种或多种赋形剂和(3)一种或多种溶剂。赋形剂包括可药用试剂，其在储存过程中提供良好的冻干块性质(膨胀剂)以及提供蛋白质的冷冻干燥保护和/或超低温保护(“稳定剂”)、pH值的维持(缓冲剂)和蛋白质的正确构象从而保证生物活性(包括有效成分稳定性，如蛋白质稳定性)的基本保留。因此，就赋形剂而言，制剂实例可包括缓冲剂、膨胀剂、蛋白质稳定剂和抗菌剂的一种或多种。有效成分指例如试剂或治疗药物。当有效成分指药物时，药物的活性与其效果有关。当有效成分指试剂时，试剂的活性指其反应性。

糖/多元醇：

许多糖或多元醇在溶液中以及冻融和冷冻干燥过程中用作非特异性蛋白质稳定剂。糖或多元醇所提供的稳定水平通常取决于其浓度。在一个实施方案中，本发明考虑在待通过公开方法冷冻干燥的制剂中使用二糖。二糖可包括但不限于海藻糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。可使用的其他糖或多元醇包括但不限于甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、肌醇、棉子糖和麦芽三糖。甘露醇是也可用作膨胀剂的结晶多元醇。

聚合物：

聚合物可在溶液中以及冻融和冷冻干燥过程中用于稳定蛋白质。一种常用的聚合物为血清白蛋白，其已用作冷冻保护剂和冷冻干燥保护剂。然而，由于对血液会带来病原体的忧虑限制了血清白蛋白在治疗产品和治疗相关产品中的应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过所公开方法冷冻干燥的不含白蛋白的制剂。其他聚合物包括但不限于葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、明胶、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。因为聚合物形成无定形相，所以其不是结晶赋形剂。

非水溶剂：

非水溶剂一般使溶液中的蛋白质不稳定。在低浓度下某些非水溶剂可具有稳定作用。这些稳定的非水溶剂包括多羟基醇，如PEG、1，2-亚乙基二醇、甘油和一些极性和非质子溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。然而，非水溶剂对本发明而言不是优选使用的。

表面活性剂：

冷冻过程中冰-水界面的形成可引起蛋白质的表面变性。表面活性剂可降低蛋白质溶液的表面张力并降低这些界面的蛋白质吸附和/或聚集的推动力。同样地，表面活性剂可在冷冻干燥过程中与有效成分竞争冰/水界面。表面活性剂可包括，例如Tween 80^TM(聚山梨酯80；也可考虑其他聚山梨酯)、Brij^35、Brij 30^、Lubrol-px^TM、Triton X-10^TM、Pluronic^F127和十二烷基硫酸钠(SDS)。

作为膨胀剂的盐：

多种盐可用作膨胀剂。代表性的盐膨胀剂包括例如NaCl、MgCl₂和CaCl₂。

氨基酸：

某些氨基酸可用作冷冻保护剂和/或冷冻干燥保护剂和/或膨胀剂。可使用的氨基酸包括但不限于甘氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸氢氯化物。也可使用短链氨基酸，如二氨基酸或三氨基酸，这包括二赖氨酸。因为大多数氨基酸一般容易结晶出来，所以其为有效的膨胀剂。然而，酸盐的形成降低了它们结晶的趋势。此外，蛋白质制剂中的无定形赋形剂可抑制膨胀剂的结晶作用，从而影响蛋白质稳定性。因此在现有方法中，因为NaCl具有低的共晶温度和玻璃化转变温度，所以甘氨酸和NaCl的组合不是优选的。在本发明中，本方法提供了高温退火步骤和高温二次干燥步骤而没有先前的零度下退火步骤，这增加了甘氨酸结晶程度，甚至在氯化钠存在条件下制备时亦如此。

缓冲剂：

可在制剂中选择使用许多涵盖宽pH范围的缓冲剂。缓冲剂包括例如醋酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、磷酸(钠或钾)、二乙醇胺和Tris。缓冲剂包括在冷冻干燥前维持溶液pH值在可接受范围内的那些试剂。

“填充”蛋白质的浓度上限通常高于“剂量”蛋白质形式的浓度上限。例如，缓冲液浓度可从几个毫摩尔到其溶解度的上限，例如组氨酸可高达200mM，本领域的技术人员可考虑达到/维持适当的生理适宜浓度。

有效成分：

通过本方法冷冻干燥的制剂可基本包括任何有效成分，如蛋白质、核酸、病毒和其组合。蛋白质可包括，例如凝血因子、生长因子、细胞因子、抗体和嵌合构建体。对于蛋白质而言，存在于制剂中的有效成分可为重组蛋白质或从生物体中分离的蛋白质。

甘氨酸/NaCl制剂：

就现有的冷冻干燥方法而言，在甘氨酸存在条件下(一般地大约2％，或者大约250mM)包含大约20mM或更多氯化钠的制剂中，甘氨酸的结晶作用被氯化钠抑制。在使用现有冷冻干燥方法时，在包含高于30mMNaCl的制剂中，甘氨酸结晶显著减少。相反，本发明提供了其中盐基本不抑制氨基酸赋形剂(例如氯化钠和甘氨酸)结晶的冷冻干燥方法。

因子IX制剂：

在一个实施方案中，本发明提供了通过所公开方法制备的冷冻干燥的因子IX产物。可通过本方法冷冻干燥的适宜因子IX制剂包括美国专利号6,372,716、美国专利号5,770,700和美国专利申请公布号US2001/0031721中公开的因子IX制剂。

例如，可冷冻干燥的因子IX制剂包含因子IX、膨胀剂和冷冻保护剂。因子IX浓度可为例如大约0.1mg/mL到大约20mg/mL(相当于大约20到至少4000U/mL)或者大约0.4mg/mL到大约20mg/mL。用于因子IX制剂的膨胀剂可包括，例如甘氨酸和/或镁盐、钙盐、钠盐或氯化物盐，其中膨胀剂的浓度为大约0.5mM到大约400mM。在一个实施方案中，膨胀剂为甘氨酸，其中甘氨酸浓度为大约0.1M到大约0.3M、大约0.2M到大约0.3M或者大约0.25M到大约0.27M。在另一个实施方案中，膨胀剂为浓度为大约0.25M到大约0.27M的甘氨酸和浓度为大约50mM的氯化钠。用于因子IX制剂的适宜冷冻保护剂包括例如，多元醇，如浓度为大约0.5％到大约2％的甘露醇和蔗糖。因子IX制剂还可包含表面活性剂和/或去垢剂，如聚山梨酯(例如Tween-80)或聚乙二醇(PEG)，其也可在冷冻步骤中用作冷冻保护剂。表面活性剂范围可为大约0.005％到大约0.05％。赋形剂的浓度可具有例如大约250mOsM到大约350mOsM、或者大约300mOsM±50mOsM的组合重量摩尔渗透压浓度，并且赋形剂还可含有适当缓冲剂以保持生理适宜的pH值，例如大约6.0-8.0范围的pH值。缓冲剂可包括，例如组氨酸、磷酸钠或磷酸钾，在大约5mM到大约50mM时全部具有大约6.5到7.5的目标pH值。在一个实施方案中，因子IX制剂包含因子IX、10mM组氨酸、1％蔗糖、50mM氯化钠、0.005％聚山梨酯80和250-270mM的甘氨酸。重构的冷冻干燥因子IX制剂中的最终NaCl浓度应≥40mM以便在施用因子IX制剂时减少血红细胞凝集/聚集。因此，在一个实施方案中，通过本方法冷冻干燥的因子IX制剂包含至少40mM的氯化钠。

可以理解和预计，本领域的技术人员可根据此处所公开本发明的原理对代表性实施方案进行更改并且此种修饰、改变和替代旨在包括于本发明的范围之内。

下面所述实施例举例说明本发明的几个实施方案。这些实施例仅为举例说明的目的，并不意味着对本发明的限制。

实施例

实施例1：不具有高温退火的冷冻干燥方法

进行三个不同的冷冻干燥循环以便鉴定增强甘氨酸结晶作用和保持蛋白质稳定性的冷冻干燥方法。另一个检测的优势包括冷冻干燥产物是否具有低于1％的残余水分含量。在这个实施例中进行的冷冻干燥循环分别表示为如表3、4和5所述的“Lyo G”、“Lyo H”和“Lyo I”。这些循环不包括高温退火步骤，结果甘氨酸结晶不完全或者与包括高温退火步骤的方法相比较不完全。此外，不具有高温退火步骤的循环产生残余水分含量低于2％的冷冻干燥产物。

表2显示了这个实施例使用的三种制剂。每一种制剂含有在pH 6.8条件下为250IU/mL的因子IX。

表2：制剂

制剂	NaCl(mM)	甘氨酸(mM)
			1	50	250
2	50	270
			3	50	300

表3、4和5显示了Lyo G、H和I的冷冻干燥步骤。所有小瓶在真空下塞住瓶口。

       表3：冷冻干燥循环“Lyo G”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			二次干燥	25℃	9.5小时

          表4：冷冻干燥循环“Lyo H”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-10℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			二次干燥	25℃	9.5小时

        表5：冷冻干燥循环“Lyo I”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			二次干燥	35℃	9.5小时

将制剂1、2和3的每一个一式两份根据Lyo G、Lyo H和Lyo I的方案冷冻干燥。然后使用卡尔·费歇尔法评价每一种冷冻干燥产物的残余水分含量。如可从表6所见，使用Lyo G、Lyo H和Lyo I冷冻干燥的制剂的水分含量均不低于1％。

                表6：残余水分含量

样品	Lyo G	Lyo H	Lyo I
				制剂1(1)	2.08％	3.09％	1.58％
制剂1(2)	2.02％	2.54％	1.63％
				制剂2(1)	2.08％	3.22％	1.44％
制剂2(2)	2.10％	2.59％	1.48％
				制剂3(1)	2.03％	2.25％	1.17％
制剂3(2)	1.93％	2.93％	1.13％

此外，评价通过Lyo G、H和I方案产生的制剂1、2和3的冻干块的完全结晶情况。通过DSC评价完全结晶情况。在第一次扫描(图1A、2A和3A)中观察到不可逆的放热现象。在第二次扫描中没有放热现象证实其为不可逆的。本领域的技术人员认识到这个不可逆的放热现象代表着结晶。这表明结晶赋形剂在冷冻干燥过程中不完全结晶。图1A显示了对冻干制剂1的第一次扫描，图1B显示了对冻干制剂1的第二次扫描，其中扫描对于用Lyo G、H和I冷冻干燥的制剂而言是有代表性的。图2A显示了对冻干制剂2的第一次扫描，图2B显示了对冻干制剂2的第二次扫描，其中扫描对于用Lyo G、H和I冷冻干燥的制剂而言是有代表性的。图3A显示了对冻干制剂3的第一次扫描，图3B显示了对冻干制剂3的第二次扫描，其中扫描对于用Lyo G、H和I冷冻干燥的制剂而言是有代表性的。如在图1、2和3中所见，所有通过Lyo G、H和I方案制备的冻干样品在第一次扫描过程中显示有结晶现象(并且在第二次扫描过程中没有玻璃化转变)，这表明甘氨酸在冷冻干燥过程中不完全结晶。

实施例2：具有高温退火的冷冻干燥方法

为了提供块结构中赋形剂完全结晶或者改善结晶的方法，检测了包含高温退火步骤的冷冻干燥方法。一个附加目标是改善最终残余水分百分比到1％以下。

表7显示了实施例2中所用的制剂。每一种制剂含有在pH 6.8条件下为250IU/mL的因子IX。

       表7：实施例2中所用的制剂

制剂#	NaCl(mM)	甘氨酸(mM)
			4(对照)	0	260
5	50	250
			6	50	270

表8、9和10显示了Lyo J、K和L的冷冻干燥步骤。所有的小瓶在真空下塞住瓶口。

       表8：冷冻干燥循环“Lyo J”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			退火保持	50℃	3小时
二次干燥	25℃	0分钟

        表9：冷冻干燥循环“Lyo K”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时

一次干燥	0℃	38小时
			退火保持	50℃	3小时
二次干燥	25℃	9.5小时

      表10：冷冻干燥循环“Lyo L”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			退火保持	50℃	10小时
二次干燥	25℃	9.5小时

将制剂4、5和6每一个一式两份根据Lyo J、Lyo K和Lyo L的方案冷冻干燥。然后使用卡尔·费歇尔法评价每一种冻干产物的水分含量(见表11)。

然后评价通过Lyo J、K和L循环产生的制剂4-6的冻干块的完全结晶情况。通过DSC评价完全结晶情况。

同样，如果在第一次扫描中观察到结晶现象，那么样品在冷冻干燥过程中没有完全结晶。图4A显示了对冻干制剂4(“fix927lyoJ.001”)、冻干制剂5(“fix50250lyoja.001”)和冻干制剂6(“fix50270lyoja.001”)的第一次扫描，图4B显示了对它们的第二次扫描，其中制剂通过LyoJ冷冻干燥。图5A显示了对冻干制剂4(“fix927yoK.002”)、冻干制剂5(“fix50250yok.001”)和冻干制剂6(“fix50270yok.001”)的第一次扫描，图5B显示了对它们的第二次扫描，其中制剂根据LyoK冷冻干燥。图5C给出了通过LyoK循环冷干燥的制剂4(“fix 927lyo K”)的另一个第二次扫描。图6A显示了对冻干制剂4(“fix927lyol.001”)、冻干制剂5(“fix50250lyoL.001”)和冻干制剂6(“fix50270lyoL.001”)的第一次扫描，图6B显示了对它们的第二次扫描，其中制剂根据LyoL冷冻干燥。图6C显示了根据LyoL冷冻干燥的制剂4(“fix 927Lyo L”)的另一个第二次扫描。

表11给出了根据Lyo J、K或L冷冻干燥的制剂4、5和6的DSC第一和第二次扫描资料总结。

表11：来自实施例2的水分百分比和DSC第一次扫描

            和第二次扫描的资料总结

循环	制剂	％水分	第一次扫描中的结晶现象
				Lyo J	456	0.41.21.2	无有有
Lyo K	456	0.61.21.1	无无无
				Lyo L	456	0.30.70.7	无无无

对于制剂5和6，由于在第一次扫描中观察到了结晶现象，所以Lyo J不能使赋形剂完全结晶。不希望被理论束缚，这可能是由于Lyo J中二次干燥步骤持续时间为零且高温退火步骤只有3小时的事实。Lyo J能使制剂4中的赋形剂完全结晶，但是制剂4不含有氯化钠和甘氨酸组合，而制剂5和6确实具有氯化钠和甘氨酸的组合。Lyo K能使赋形剂完全结晶且最终块结构中的残余水分低于1.2％。Lyo L具有更优的结果，因为发生了完全结晶且最终块结构中的残余水分低于1％。

此外，对根据Lyo L循环冷冻干燥的块结构的三个月稳定性研究表明水分含量保持低于1％。另外，经X射线衍射分析显示，与不经高温(高于35℃)退火步骤冷冻干燥的样品相比，用高温退火步骤冷冻干燥的样品的甘氨酸结晶作用增强(见图10A和图10B)。

还通过测定(1)最终块结构中存在的高分子量(HMW)种类的百分比、(2)因子IX凝固活性的恢复百分比和(3)因子IX比活性的恢复百分比来检测了冻干产物的稳定性。通过大小排阻层析(SEC-HPLC)测定高分子量的百分比。使用一步活化的部分促凝血酶原激酶时间测定法测定凝固活性。通过将凝固活性除以蛋白质浓度计算比活性，且蛋白质浓度通过使用SEC-HPLC确定。图7显示了通过Lyo J、K和L冷冻干燥的制剂4-6的HMW百分比。图8A和8B显示了冷冻干燥前和冷冻干燥后因子IX的凝固活性资料(由于填充4mL而重构稀释成5mL，所以图8B中的预期最高恢复值为80％恢复)。图9显示了比活性恢复百分比。如通过HMW百分比和效果测定法所示，这些结果表明通过具有高温退火和干燥步骤的方法冷冻干燥的因子IX没有负面影响。

实施例3：具有高温退火的冷冻干燥方法提供长期的稳定性

实施例2的结果表明制剂不受50℃热处理(或者“退火保持”，见表9和表10)步骤的负面影响。实际上，这个热处理步骤导致包含氯化钠和甘氨酸的制剂的残余水分值百分比(％)较低。该种水分百分比的降低与甘氨酸结晶作用的增强相关。为了进一步证明具有高温热处理步骤的冷冻干燥循环不负面影响有效成分的稳定性，开展下列实验。

表12显示了该实施例中填充和冷冻干燥的制剂。制剂含有在pH 6.8条件下为69IU/mL或者在pH 6.8条件下为550IU/mL的重组因子IX。

       表12：实施例3中所用的制剂

制剂#	NaCl(mM)	甘氨酸(mM)
			7	50	260

开展两种冷冻干燥循环(Lyo P和Lyo Q)，其唯一区别是一个在完全真空下塞住瓶口而另一个为在小瓶中的顶部空间为氮气。表13和表14列出了Lyo P和Lyo Q的冷冻干燥循环。对Lyo P而言，所有小瓶在真空下塞住瓶口。对Lyo Q而言，所有小瓶的顶部空间为氮气。

       表13：冷冻干燥循环“Lyo P”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			热处理	50℃	10小时
二次干燥	25℃	9.5小时

          表14：冷冻干燥循环“Lyo Q”

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	5小时
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	38小时
			热处理	50℃	10小时
二次干燥	25℃	9.5小时

通过Lyo P和Lyo Q产生多个块结构(所有块结构外观良好)以检测在不同温度、不同时间储存过程中块结构的残余水分水平。在所检测的所有时间和温度条件下，块结构具有低于1.5％的残余水分水平(残余水分水平低于2％通常是可接受的)。即使在50℃储存9个月和12个月之后，块结构的残余水分水平仍然低于1％。结果列于下面表15中：

                     表15：残余水分水平

样品	开始	40℃下3个月	50℃下9个月	40℃下12个月
					Lyo P69IU/mL	0.67	1.17	0.79	0.79
Lyo P550IU/mL	0.54	1.12	0.84	0.83
					Lyo Q69IU/mL	0.59	1.29	0.83	0.89

Lyo Q550IU/mL

0.55

1.22

0.95

0.80

通过测定块结构中存在的HMW种类百分比检测通过Lyo P和Lyo Q产生的块结构的稳定性。对储存于2-8℃和更高储存温度情况下的块结构进行稳定性检测。低于3％HMW是可接受的。对于每个时间点用一个小瓶进行实验，而对每一时间点的样品一式三份用SEC-HPLC测定。结果在下面表16A-D中给出：

表16A：对于Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的HMW百分比结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	0.51	0.35	0.55	0.57
2-8℃	1.27	0.57	-	0.94
					25℃	1.27	0.65	-	1.03
30℃	1.27	0.63	-	0.78
					40℃	1.27	0.77	0.71	1.09
50℃	1.27	0.84	0.82	0.81

表16B：对于Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的HMW百分比结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	0.36	0.38	0.51	0.47
2-8℃	0.54	0.41	-	0.53
					25℃	0.54	0.46	-	0.59
30℃	0.54	0.46	-	0.60
					40℃	0.54	0.51	0.61	0.74
50℃	0.54	0.55	0.63	0.75

表16C：对于Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的HMW百分比结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	0.43	0.41	0.41	0.49

2-8℃	1.76	0.62	-	0.95
					25℃	1.76	0.59	-	0.92
30℃	1.76	0.69	-	0.91
					40℃	1.76	0.79	0.91	1.08
50℃	1.76	0.90	0.92	1.16

表16D：对于Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的HMW百分比结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	0.41	0.42	0.38	0.49
2-8℃	0.65	0.41	-	0.51
					25℃	0.65	0.46	-	0.62
30℃	0.65	0.47	-	0.58
					40℃	0.65	0.55	0.64	0.48
50℃	0.65	0.63	0.73	0.79

还通过测定因子IX的浓度来检测通过Lyo P和Lyo Q冷冻干燥的药物产物的稳定性。在储存于2-8℃和加速温度下的块结构进行稳定性检测。对于每个时间点用一个小瓶进行实验，并且对于每一时间点的样品一式三份测定。结果(单位为μg/mL)在下面表17A-D中给出。注意*：表17A-D中的-80℃时间点为对照，其中检测了冷冻干燥前填充药物产物(BDP)对照。将4毫升BDP填充到每一小瓶中并冷冻干燥。将冷冻干燥后的小瓶用5mL注射用水(WFI)重构。这导致药物产物浓度比BDP对照浓度低20％。通过SEC-HPLC测定重构小瓶中的因子IX的浓度。

表17A：对于Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX蛋白质浓度结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	247	240	223	231
2-8℃	186	190	-	179
					25℃	186	191	-	179
30℃	186	187	-	161
					40℃	186	188	171	173

50℃

186

175

169

160

表17B：对于Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX蛋白质浓度结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	2,524	2,593	2,323	2,322
2-8℃	2,032	2,091	-	1,788
					25℃	2,032	2,132	-	1,845
30℃	2,032	2,135	-	1,842
					40℃	2,032	2,120	1,817	1,845
50℃	2,032	2,109	1,770	1,825

表17C：对于Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX蛋白质浓度结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	245	239	227	220
2-8℃	178	187	-	173
					25℃	178	185	-	176
30℃	178	185	-	175
					40℃	178	181	165	169
50℃	178	183	161	168

表17D：对于Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)因子IX蛋白质浓度结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	2,572	2,665	2,301	2,409
2-8℃	1,983	2,094	-	1,810
					25℃	1,983	2,094	-	1,821
30℃	1,983	2,107	-	1,819
					40℃	1,983	2,098	1,734	1,701
50℃	1,983	2,100	1,735	1,830

还通过测定因子IX凝固活性的效果检测通过Lyo P和Lyo Q产生的块结构的稳定性。对储存于2-8℃和加速温度下的块结构进行这些测定。对于每一时间点用一个小瓶进行实验，并且下面表18A-D中提供的结果以IU/mL为单位。此外，在表18A-D中，-80℃资料点为使用冷冻干燥前填充药物产物对照(BDP)的对照。将4毫升BDP填充到每一小瓶中并冷冻干燥。将得到的小瓶用5mL WFI重构。这导致药物产物效果比BDP对照效果低20％。因此对表18A而言，44IU/mL相当于重构BDP的100％活性(在12个月时效果比BDP-80℃对照低20％)。类似地，对表18B而言，593IU/mL相当于重构BDP的100％活性；对表18C而言，49IU/mL相当于重构BDP的100％活性；对表18D而言，697IU/mL相当于重构BDP的100％活性。使用一步活化的部分促凝血酶原激酶时间测定法通过测定凝固活性来确定因子IX的效果。

表18A：对于Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX效果结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	48	69	64	55
2-8℃	37	54	-	54
					25℃	37	52	-	54
30℃	37	48	-	51
					40℃	37	52	45	46
50℃	37	43	44	48

表18B：对于Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX效果结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	505	739	735	741
2-8℃	380	507	-	564
					25℃	380	426	-	587
30℃	380	459	-	640
					40℃	380	486	511	585
50℃	380	495	578	577

表18C：对于Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX效果结果

储存温度

0个月

3个月

9个月

12个月

-80℃*	44	54	66	61
					2-8℃	40	40	-	57
25℃	40	41	-	52
					30℃	40	41	-	(样品操作失误)
40℃	40	37	38	45
					50℃	40	38	39	40

表18D：对于Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX效果结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃*	642	747	759	871
2-8℃	472	437	-	612
					25℃	472	450	-	609
30℃	472	459	-	624
					40℃	472	427	353	595
50℃	472	451	549	521

还通过测定因子IX的比活性确定通过Lyo P和Lyo Q产生的块结构的稳定性。通过将凝固活性除以蛋白质浓度来计算因子IX比活性。下面的数据单位为IU/mg。

表19A：对于Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX比活性结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	193	287	287	238
2-8℃	200	284	-	302
					25℃	200	273	-	304
30℃	200	256	-	315
					40℃	200	276	263	265
50℃	200	246	260	300

表19B：对于Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX比活性结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	200	285	316	319
2-8℃	187	242	-	316

25℃	187	200	-	318
					30℃	187	215	-	347
40℃	187	229	281	317
					50℃	187	235	327	316

表19C：对于Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX比活性结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	179	226	291	277
2-8℃	222	214	-	328
					25℃	222	221	-	294
30℃	222	222	-	(样品操作失误)
					40℃	222	204	230	267
50℃	222	207	242	235

表19D：对于Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX比活性结果

储存温度	0个月	3个月	9个月	12个月
					-80℃	250	280	330	362
2-8℃	238	209	-	338
					25℃	238	215	-	334
30℃	238	218	-	343
					40℃	238	204	204	350
50℃	238	215	316	285

还对冻干块结构进行X射线衍射(XRD)以观察高温热处理步骤是否提高了甘氨酸结晶作用(见图11)。XRD用于鉴定冻干块结构中存在的结晶结构。Lyo G用于比较，因为其除了在二次干燥前不具有50℃热处理步骤之外其他冷冻干燥循环参数与Lyo Q的相同。图11显示Lyo Q不能增强甘氨酸的结晶。

总之，实施例3的结果表明：(1)如通过％HMW、效果和比活性所测量，高温热处理步骤不影响有效成分因子IX的稳定性和活性；(2)稳定性资料显示因子IX在热处理过程是稳定的并且在加速温度下长期储存中是稳定的；(3)高温热处理步骤增加了结晶甘氨酸的数量。作为额外的优势，高温热处理步骤降低了样品的最终残余水分值。因此实施例3的结果还提供了进一步的证据证明，二次干燥前的高温退火或热处理步骤不导致有效成分不稳定但是却提高了赋形剂结晶作用和整体结晶效率。

实施例4：低温退火步骤是任选的

在具有和不具有-15℃和50℃退火步骤条件下进行矩阵排列的冷冻干燥循环以确定低温退火步骤是否为提高甘氨酸结晶所必需。由10mM组氨酸、1％蔗糖、260mM甘氨酸、50mM NaCl和0.005％聚山梨酯80，pH 6.8组成的制剂缓冲液用于所有的循环。对冻干块结构的分析包括DSC、XRD和残余水分％。表20显示了所开展的冷冻干燥循环。

               表20：冷冻干燥循环

步骤	架子温度	持续时间
			冷冻保持	-50℃	5小时
退火保持	-15℃	0或5小时(见表21)
			再冷冻保持	-50℃	5小时
一次干燥	0℃	20小时
			退火保持	50℃	0或10小时(见表21)
二次干燥	25℃	9.5小时

下面的表21显示了实验的分析结果：

                             表21：结果

退火(小时)		DSC		XRD17.5°强度	％水分*
						-15℃	50℃	第一次扫描中观察到结晶现象	第二次扫描的Tg起始(℃)
0	0	是	31	500	2.3

5	0	是	29	1450	1.9
						0	10	否	49	525	0.63
5	10	否	52	994	0.59

^*2个小瓶的平均值。

基于DSC资料，很明显，包括低温退火步骤(在此为-15℃)对是否在第一次扫描检测到结晶现象没有影响。高温退火步骤(在此为50℃)足以消除在DSC第一次扫描中所观察到的再结晶现象。虽然低温退火步骤是任选的，但是包括该步骤是有利的，因为来自XRD资料的17.5°峰暗示-15℃退火步骤进一步提高了甘氨酸的结晶作用。

Claims (57)

1.冷冻干燥含水药物制剂的方法，该方法包括：

(a)将含水药物制剂冷冻；

(b)将步骤(b)的药物制剂干燥；

(c)在高于大约25℃的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；和

(d)在低于步骤(c)所用温度的温度下将步骤(c)的药物制剂干燥。

2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的冷冻在低于-10℃的温度下进行。

3.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的冷冻在低于-35℃的温度下进行。

4.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的干燥在大约-35℃和大约20℃之间的温度下进行。

5.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的干燥在大约-25℃和大约10℃之间的温度下进行。

6.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的干燥在大约-20℃和大约0℃之间的温度下进行。

7.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的干燥在大约0℃的温度下进行。

8.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的退火在大约25℃和大约75℃之间的温度下进行。

9.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的退火在大约35℃和大约60℃之间的温度下进行。

10.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的退火在大约50℃的温度下进行。

11.权利要求1的方法，其中步骤(d)中的干燥在大约25℃的温度下进行。

12.冷冻干燥含水药物制剂的方法，该方法包括：

(a)将含水药物制剂冷冻；

(b)在大约-35℃和大约0℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂退火；

(c)在大约-35℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂干燥；

(d)在大约25℃和大约75℃之间的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；

(e)在低于步骤(d)所用温度的温度下将步骤(c)的药物制剂干燥。

13.权利要求12的方法，其中步骤(a)中的冷冻在低于-10℃的温度下进行。

14.权利要求12的方法，其中步骤(a)中的冷冻在低于-35℃的温度下进行。

15.权利要求12的方法，其中步骤(b)中的退火在大约-25℃和大约10℃之间的温度下进行。

16.权利要求12的方法，其中步骤(b)中的退火在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下进行。

17.权利要求12的方法，其中步骤(b)中的退火在大约-15℃的温度下进行。

18.权利要求12的方法，其中步骤(c)中的干燥在大约-25℃和大约-10℃之间的温度下进行。

19.权利要求12的方法，其中步骤(c)中的干燥在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下进行。

20.权利要求12的方法，其中步骤(c)中的干燥在大约0℃的温度下进行。

21.权利要求12的方法，其中步骤(d)中的退火在大约35℃和大约60℃之间的温度下进行。

22.权利要求12的方法，其中步骤(d)中的退火在大约50℃的温度下进行。

23.权利要求12的方法，其中步骤(e)中的干燥在大约25℃的温度下进行。

24.权利要求12的方法，其还包括在步骤(b)之后和步骤(c)之前进行的一个再冷冻步骤，其中再冷冻步骤在低于-35℃的温度下进行。

25.权利要求24的方法，其中再冷冻步骤在大约-40℃和大约-50℃之间的温度下进行。

26.权利要求1或12的方法，其中含水药物制剂包含至少一种结晶赋形剂。

27.权利要求26的方法，其中结晶赋形剂选自氨基酸、盐和多元醇。

28.权利要求27的方法，其中氨基酸为甘氨酸或组氨酸。

29.权利要求27的方法，其中盐为氯化钠。

30.权利要求27的方法，其中多元醇为甘露醇。

31.权利要求1或12的方法，其中含水药物制剂包含结晶赋形剂组合，其中该组合为盐和氨基酸。

32.权利要求31的方法，其中盐为氯化钠。

33.权利要求32的方法，其中氯化钠在制剂中以高于大约25mM的浓度存在。

34.权利要求32的方法，其中氯化钠在制剂中以大约25mM和200mM之间的浓度存在。

35.权利要求32的方法，其中氯化钠在制剂中以大约30mM和100mM之间的浓度存在。

36.权利要求32的方法，其中氯化钠在制剂中以大约40mM和60mM之间的浓度存在。

37.权利要求32的方法，其中氯化钠在制剂中以大约50mM的浓度存在。

38.权利要求31的方法，其中氨基酸在制剂中以大约1％至大约10％之间的浓度存在。

39.权利要求31的方法，其中氨基酸在制剂中以大约1.5％至大约5％之间的浓度存在。

40.权利要求31的方法，其中氨基酸在制剂中以大约1.5％至大约3％之间的浓度存在。

41.权利要求31的方法，其中氨基酸在制剂中以大约2％的浓度存在。

42.权利要求38、39、40、41或42的方法，其中氨基酸为甘氨酸。

43.冷冻干燥包含氯化钠和甘氨酸的含水药物制剂的方法，其中该方法包括：

(a)在低于-35℃的温度下将含水药物制剂冷冻；

(b)任选地在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(a)的药物制剂退火；

(c)在大约-10℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂干燥；

(d)在大约35℃和大约50℃之间的温度下将步骤(c)的药物制剂退火；和

(e)在低于步骤(d)所用温度的温度下将步骤(d)的药物制剂干燥。

44.权利要求43的方法，其中步骤(e)中的温度为大约25℃。

45.冷冻干燥包含高于35mM氯化钠和大约250mM至大约300mM甘氨酸的含水药物制剂的方法，其中方法包括：

(a)在低于-35℃的温度下将含水药物制剂冷冻；

(b)在大约-15℃下将步骤(a)的药物制剂退火；

(c)在大约0℃下将步骤(b)的药物制剂干燥；

(d)在大约50℃下将步骤(c)的药物制剂退火；和

(e)在大约25℃下将步骤(d)的药物制剂干燥。

46.权利要求45的方法，其还包括在步骤(b)之后和步骤(c)之前的再冷冻步骤，其中再冷冻步骤包括在大约-50℃下再冷冻步骤(b)的药物制剂。

47.权利要求46的方法，其中步骤(a)进行大约5小时；步骤(b)进行大约5小时；步骤(c)进行大约38小时；步骤(d)进行大约5小时；以及步骤(e)进行大约9.5小时。

48.增强冷冻干燥过程中赋形剂结晶的方法，其包括：

(a)提供包含甘氨酸和氯化钠的含水药物制剂；

(b)将含水药物制剂冷冻；

(c)任选地在大约-35℃和大约0℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂退火；

(d)在大约-35℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)或步骤(c)的药物制剂干燥；

(e)在大约25℃和大约75℃之间的温度下将步骤(d)的药物制剂退火，以便甘氨酸在步骤(e)之后比步骤(e)之前更大程度结晶；和

(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的药物制剂干燥，从而增强赋形剂的结晶。

49.通过以下过程产生的冻干产物，其中所述过程包括：

(a)提供包含甘氨酸和氯化钠的制剂；

(b)冷冻制剂；

(c)任选地在大约-35℃和大约0℃之间的温度下将步骤(b)的药物制剂退火；

(d)在大约-35℃和大约10℃之间的温度下将步骤(b)或步骤(c)的药物制剂干燥；

(e)在大约25℃和大约75℃之间的温度下将步骤(d)的药物制剂退火；和

(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的药物制剂干燥，从而提供冻干产物。

50.权利要求49的冻干产物，其中制剂还包含有效成分。

51.权利要求50的冻干产物，其中有效成分为蛋白质、核酸或病毒。

52.权利要求50的冻干产物，其中有效成分为因子IX。

53.权利要求49的冻干产物，其中步骤(f)之后的冻干产物中的甘氨酸比通过二次干燥前没有高温退火步骤的过程制备的冻干产物中的甘氨酸更大程度结晶。

54.通过以下过程产生的冻干产物，其中所述过程包括：

(a)提供包含甘氨酸和氯化钠的制剂；

(b)冷冻制剂；

(c)任选地在大约-20℃和大约-10℃之间的温度下将步骤(b)的制剂退火；

(d)在大约0℃和大约5℃之间的温度下将步骤(c)的制剂干燥；

(e)在大约35℃和大约50℃之间的温度下将步骤(d)的制剂退火；和

(f)在与步骤(e)所用温度相同或更低的温度下将步骤(e)的制剂干燥，从而提供冻干产物。

55.权利要求54的冻干产物，其中步骤(f)之后的冻干产物中的甘氨酸比通过二次干燥前没有高温退火步骤的过程制备的冻干产物中的甘氨酸更大程度结晶。

56.权利要求54的冻干产物，其中冻干产物在长时间高储存温度下基本稳定。

57.权利要求56的冻干产物，其中长时间包括大约3个月和大约1年之间，并且其中加速的温度包括大约25℃和大约50℃之间。

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