CN109619090A - 一种保存细胞因子活力的冻干方法 - Google Patents

一种保存细胞因子活力的冻干方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种保存细胞因子活力的冻干方法，包括以下步骤：选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1‑10wt.％甘露醇、1‑3wt.%海藻糖、1‑5wt.%右旋糖酐、1‑3wt.%人血白蛋白、1‑4wt.%壳聚糖、0.1‑0.3wt.%甘氨酸、3‑4wt.%氨基乙酸和0.1‑0.3wt.%抗坏血酸；利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。相对现有技术，本发明细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性；培养基不含致敏成分，适合各种人群使用；冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。

Description

一种保存细胞因子活力的冻干方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种保存细胞因子活力的冻干方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞即为起源细胞。干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。
同时研究表明干细胞生长因子可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。生长因子多为广义的肽激素，有表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源增殖因子等。
但在现有技术下，干细胞生长因子的活性保存时间很短，这大大限制了干细胞活性因子的应用，所以有必要对这些问题进行解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存细胞因子活力的冻干方法，所要解决的技术问题是：干细胞生长因子的活性保存时间很短，这大大限制了干细胞活性因子的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种保存细胞因子活力的冻干方法，包括以下步骤：
选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1-10wt.％甘露醇、1-3wt.%海藻糖、1-5wt.%右旋糖酐、1-3wt.%人血白蛋白、1-4wt.%壳聚糖、0.1-0.3wt.%甘氨酸、3-4wt.%氨基乙酸和0.1-0.3wt.%抗坏血酸；
利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。
进一步，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：10wt.％甘露醇、1wt.%海藻糖、1wt.%右旋糖酐、1wt.%人血白蛋白、1wt.%壳聚糖、0.1wt.%甘氨酸、3wt.%氨基乙酸和0.1wt.%抗坏血酸。
进一步，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1wt.％甘露醇、3wt.%海藻糖、5wt.%右旋糖酐、3wt.%人血白蛋白、4wt.%壳聚糖、0.3wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.3wt.%抗坏血酸。
进一步，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：6wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3wt.%右旋糖酐、2wt.%人血白蛋白、3wt.%壳聚糖、0.2wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.2wt.%抗坏血酸。
进一步，选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子包括以下步骤：
获取脐带源间充质干细胞，对脐带源间充质干细胞进行培养扩增；
将一部分脐带源间充质干细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌，得第一上清液；
用生理盐水清洗2-3次培养瓶，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养另一部分脐带源间充质干细胞12-24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得第二上清液；
将第一上清液和第二上清液混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统对混合后的第一上清液和第二上清液进行浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
进一步，利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉的具体步骤：
将纯度大于等于99%的干细胞活性因子浓缩液用生理盐水稀释，用注射器抽取稀释后的浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌；调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到保存细胞因子活力的冻干粉。
本发明的有益效果是：细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性；培养基不含致敏成分，如抗生素，胎牛血清，适合各种人群使用(尤其对青链霉素过敏人群)；冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。
附图说明
图1为本发明一种保存细胞因子活力的冻干方法的流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
如图1所示，一种保存细胞因子活力的冻干方法，包括以下步骤：
选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：10wt.％甘露醇、1wt.%海藻糖、1wt.%右旋糖酐、1wt.%人血白蛋白、1wt.%壳聚糖、0.1wt.%甘氨酸、3wt.%氨基乙酸和0.1wt.%抗坏血酸；
利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。
上述实施例中，选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子包括以下步骤：
获取脐带源间充质干细胞，对脐带源间充质干细胞进行培养扩增；
将一部分脐带源间充质干细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌，得第一上清液；
用生理盐水清洗3次培养瓶，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养另一部分脐带源间充质干细胞24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得第二上清液；
将第一上清液和第二上清液混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统对混合后的第一上清液和第二上清液进行浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
上述实施例中，利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉的具体步骤：
将纯度大于等于99%的干细胞活性因子浓缩液用生理盐水稀释，用注射器抽取稀释后的浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌；调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到保存细胞因子活力的冻干粉。
细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性；培养基不含致敏成分，如抗生素，胎牛血清，适合各种人群使用(尤其对青链霉素过敏人群)；冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。
实施例2：
如图1所示，一种保存细胞因子活力的冻干方法，包括以下步骤：
选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1wt.％甘露醇、3wt.%海藻糖、5wt.%右旋糖酐、3wt.%人血白蛋白、4wt.%壳聚糖、0.3wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.3wt.%抗坏血酸；
利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。
上述实施例中，选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子包括以下步骤：
获取脐带源间充质干细胞，对脐带源间充质干细胞进行培养扩增；
将一部分脐带源间充质干细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌，得第一上清液；
用生理盐水清洗2次培养瓶，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养另一部分脐带源间充质干细胞12小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得第二上清液；
将第一上清液和第二上清液混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统对混合后的第一上清液和第二上清液进行浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
上述实施例中，利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉的具体步骤：
将纯度大于等于99%的干细胞活性因子浓缩液用生理盐水稀释，用注射器抽取稀释后的浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌；调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到保存细胞因子活力的冻干粉。
细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性；培养基不含致敏成分，如抗生素，胎牛血清，适合各种人群使用(尤其对青链霉素过敏人群)；冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。
实施例3：
如图1所示，一种保存细胞因子活力的冻干方法，包括以下步骤：
选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：6wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3wt.%右旋糖酐、2wt.%人血白蛋白、3wt.%壳聚糖、0.2wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.2wt.%抗坏血酸；
利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。
上述实施例中，选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子包括以下步骤：
获取脐带源间充质干细胞，对脐带源间充质干细胞进行培养扩增；
将一部分脐带源间充质干细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌，得第一上清液；
用生理盐水清洗2次培养瓶，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养另一部分脐带源间充质干细胞18小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得第二上清液；
将第一上清液和第二上清液混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统对混合后的第一上清液和第二上清液进行浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
上述实施例中，利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉的具体步骤：
将纯度大于等于99%的干细胞活性因子浓缩液用生理盐水稀释，用注射器抽取稀释后的浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌；调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到保存细胞因子活力的冻干粉。
细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性；培养基不含致敏成分，如抗生素，胎牛血清，适合各种人群使用(尤其对青链霉素过敏人群)；冻干粉制剂便于长途运输和长期保存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子和冻存保护剂，其中冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1-10wt.％甘露醇、1-3wt.%海藻糖、1-5wt.%右旋糖酐、1-3wt.%人血白蛋白、1-4wt.%壳聚糖、0.1-0.3wt.%甘氨酸、3-4wt.%氨基乙酸和0.1-0.3wt.%抗坏血酸；
利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉。
2.根据权利要求1所述一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：10wt.％甘露醇、1wt.%海藻糖、1wt.%右旋糖酐、1wt.%人血白蛋白、1wt.%壳聚糖、0.1wt.%甘氨酸、3wt.%氨基乙酸和0.1wt.%抗坏血酸。
3.根据权利要求1所述一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：1wt.％甘露醇、3wt.%海藻糖、5wt.%右旋糖酐、3wt.%人血白蛋白、4wt.%壳聚糖、0.3wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.3wt.%抗坏血酸。
4.根据权利要求1所述一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，冻存保护剂由以下浓度的原料组成：6wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3wt.%右旋糖酐、2wt.%人血白蛋白、3wt.%壳聚糖、0.2wt.%甘氨酸、4wt.%氨基乙酸和0.2wt.%抗坏血酸。
5.根据权利要求1所述一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子包括以下步骤：
获取脐带源间充质干细胞，对脐带源间充质干细胞进行培养扩增；
将一部分脐带源间充质干细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌，得第一上清液；
用生理盐水清洗2-3次培养瓶，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养另一部分脐带源间充质干细胞12-24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌，得第二上清液；
将第一上清液和第二上清液混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统对混合后的第一上清液和第二上清液进行浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。
6.根据权利要求1所述一种保存细胞因子活力的冻干方法，其特征在于，利用干细胞活性因子和冻存保护剂制备细胞因子冻干粉的具体步骤：
将纯度大于等于99%的干细胞活性因子浓缩液用生理盐水稀释，用注射器抽取稀释后的浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌；调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到保存细胞因子活力的冻干粉。
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