CN106244529A - 一种快速高效分离软骨细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外组织细胞分离技术领域，具体涉及一种快速高效分离软骨细胞的方法，通过在消化前期添加人血白蛋白，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶不受损伤及具有较高的活性；在消化后期进一步添加氨磷汀溶液，对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。

Description

一种快速高效分离软骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及体外组织细胞分离技术领域，具体涉及一种快速高效分离软骨细胞的方法。
背景技术
软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌II型胶原(type II collagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持关节软骨的功能。在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡；而软骨细胞主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复一直以来都是医学界的难题之一。近来年随着组织工程技术和新型生物材料的出现，自体软骨细胞移植在治疗软骨损伤在国内外都有相关应用。临床上，软骨组织材料不足，软骨细胞量有限，且培养增值能力不足限制了其发展。
针对软骨组织材料的不足，从有限的软骨组织中提取足够量及活性高的软骨细胞成为后续软骨细胞培养的关键。目前，软骨细胞分离方法较为常见的是通过Ⅱ型胶原酶消化法来进行获取，但是该方法存在较多的缺点，主要包括：(1)Ⅱ型胶原酶虽然属于温性消化酶，但是依然存在对细胞的损伤作用，特别在消化过度的时候，对细胞的损伤十分明显；(2)Ⅱ型胶原酶易受温度、PH、其他蛋白酶等方面的影响而发生变性，所以Ⅱ型胶原酶在使用的过程中极易出现活性丧失，降低消化作用，严重的将导致无法实现对软骨细胞的消化分离。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种快速高效分离软骨细胞的方法，通过添加相关保护剂，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶活性，同时对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。
本发明通过以下技术方案实现该目的：
一种快速高效分离软骨细胞的方法，包括如下步骤：
a、获取软骨组织样本；
b、将获取的软骨组织样本用加入双抗的PBS清洗后转入容器中；
c、向软骨组织样本中加入少量的Ⅱ型胶原酶溶液，用手术剪将软骨组织样本剪碎；
d、向软骨组织样本中加入一定量Ⅱ型胶原酶溶液，同时加入人血白蛋白，置于37℃摇床上以100～200rpm的转速消化30-120min；
e、向软骨组织样本中添加氨磷汀溶液，继续置于37℃摇床上以100～200rpm的转速消化2-4h；
f、收集消化液，经筛网过滤后，滤液再经离心沉淀后得到软骨细胞。
其中，所述步骤a获取的软骨组织样本保存在入双抗的PBS中。
作为优选的，所述步骤b中对软骨组织样本清洗2～3遍后转入以50mL烧杯中。
其中，所述步骤c具体为：向软骨组织样本中加入1～2mL的Ⅱ型胶原酶溶液，用手术剪将软骨组织样本剪碎至1mm3。
作为优选的，所述步骤d中Ⅱ型胶原酶溶液的加入量为软骨组织样本体积的5～10倍，人血白蛋白的加入量为软骨组织样本和Ⅱ型胶原酶溶液体积之和的0.5～2％。
作为优选的，所述步骤e中氨磷汀溶液的加入量为软骨组织样本和Ⅱ型胶原酶溶液体积之和的2～5％。
作为优选的，所述步骤f具体为：将收集的消化液经200目的筛网过滤，滤液再经200～400g离心沉淀，得到软骨细胞。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的快速高效分离软骨细胞的方法，通过在消化前期添加人血白蛋白，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶不受损伤及具有较高的活性；在消化后期进一步添加氨磷汀溶液，对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。
附图说明
图1为对比例1的细胞形态图。
图2为对比例2的细胞形态图。
图3为实施例1的细胞形态图。
图4为实施例2的细胞形态图。
图5为实施例3的细胞形态图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1。
一种快速高效分离软骨细胞的方法，包括如下步骤：
获取10g软骨组织样本，向其中添加1mLⅡ型胶原酶，用加入双抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入软骨组织样本5倍体积的Ⅱ型胶原酶置于37℃摇床，同时添加0.5％人血白蛋白，以100rpm转速消化30min；
然后添加3％的氨磷汀溶液，继续以100rpm转速消化4h；消化后200目滤网过滤，离心沉淀，收集软骨细胞计数。
实施例2。
一种快速高效分离软骨细胞的方法，包括如下步骤：
获取10g软骨组织样本，向其中添加1.5mLⅡ型胶原酶，用加入双抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入软骨组织样本8倍体积的Ⅱ型胶原酶置于37℃摇床，同时添加2％人血白蛋白，以150rpm转速消化100min；
然后添加2％的氨磷汀溶液，继续以100rpm转速消化2h；消化后200目滤网过滤，离心沉淀，收集软骨细胞计数。
实施例3。
一种快速高效分离软骨细胞的方法，包括如下步骤：
获取10g软骨组织样本，向其中添加2mLⅡ型胶原酶，用加入双抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入软骨组织样本10倍体积的Ⅱ型胶原酶置于37℃摇床，同时添加1％人血白蛋白，以200rpm转速消化80min；
然后添加5％的氨磷汀溶液，继续以100rpm转速消化3h；消化后200目滤网过滤，离心沉淀，收集软骨细胞计数。
对比例1。
获取10g软骨组织样本，向其中添加1mLⅡ型胶原酶，用加入双抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入Ⅱ型胶原酶后置于4℃环境下消化12h，消化后200目滤网过滤，离心沉淀，收集软骨细胞计数。
对比例2。
获取10g软骨组织样本，向其中添加1mLⅡ型胶原酶，用加入双抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入Ⅱ型胶原酶后置于37℃摇床，以150rpm转速消化4h，消化后200目滤网过滤，离心沉淀，收集软骨细胞计数。
实施例1～3及对比例1～2的软骨细胞计数及活率统计结果如表1所示：
表1细胞计数及活率统计
结果分析：由表1的数据可知，与采用常规分离方法的对比例1、2相比，采用本发明分离方法的实施例1～3获得的原代软骨细胞的数量及活率均明显高于常规分离方法，说明本发明的快速高效分离软骨细胞的方法，通过添加相关保护剂，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶活性，同时对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。
分别对实施例1～3以及对比例1～2获得的软骨细胞的增殖能力进行试验验证：
对以上5组分离的原代软骨细胞，各取1*106个细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基接种于培养皿，接种密度1*105/mL；
接种后每3天换液一次，长满80％进行传代培养，分别观察第10天(P2代)细胞形态及计数总细胞量。
实施例1～3及对比例1～2培养后的软骨细胞计数统计结果如表2所示，各组的培养后的细胞形态如图1～5所示：
表2培养后细胞计数统计
组别 细胞量(106)
对比例1 6.228
对比例2 6.437
实施例1 10.672
实施例2 11.028
实施例3 10.825
结果分析：由表2的数据可知，实施例1～3的细胞增殖速度明显快于对比例1、2，且由细胞形态图1～5所示，实施例1～3的细胞形态良好，说明采用本发明的方法分离获得的原代软骨细胞增殖能力和增殖后细胞状态明显优于现有方法。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、获取软骨组织样本；
b、将获取的软骨组织样本用加入双抗的PBS清洗后转入容器中；
c、向软骨组织样本中加入少量的Ⅱ型胶原酶溶液，用手术剪将软骨组织样本剪碎；
d、向软骨组织样本中加入一定量Ⅱ型胶原酶溶液，同时加入人血白蛋白，置于37℃摇床上以100～200rpm的转速消化30-120min；
e、向软骨组织样本中添加氨磷汀溶液，继续置于37℃摇床上以100～200rpm的转速消化2-4h；
f、收集消化液，经筛网过滤后，滤液再经离心沉淀后得到软骨细胞。
2.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤a获取的软骨组织样本保存在入双抗的PBS中。
3.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤b中对软骨组织样本清洗2～3遍后转入以50mL烧杯中。
4.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤c具体为：向软骨组织样本中加入1～2mL的Ⅱ型胶原酶溶液，用手术剪将软骨组织样本剪碎至1mm3。
5.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤d中Ⅱ型胶原酶溶液的加入量为软骨组织样本体积的5～10倍，人血白蛋白的加入量为软骨组织样本和Ⅱ型胶原酶溶液体积之和的0.5～2％。
6.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤e中氨磷汀溶液的加入量为软骨组织样本和Ⅱ型胶原酶溶液体积之和的2～5％。
7.根据权利要求1所述的快速高效分离软骨细胞的方法，其特征在于，所述步骤f具体为：将收集的消化液经200目的筛网过滤，滤液再经200～400g离心沉淀，得到软骨细胞。
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