CN113462754B - 一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术 - Google Patents

一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术 Download PDF

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Abstract

本发明用肽核酸(PNA)替代传统单链DNA(ssDNA)固定到微梁金表面上的方法，可以提高表面探针密度，提升对目标核酸的捕获效率，在基于光杠杆的检测模式下，这样带来了极大的表面应力增强；控制肽核酸的链长，有效的提高应力增强的效果。本方法已成功应用与新冠病毒核酸和肺癌临床标记物检测，与基于ssDNA的微悬臂梁核酸检测技术相比灵敏度提高高达7个数量级，该技术有望普及于多领域的核酸检测。

Description

一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术
技术领域
本发明涉及一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术，已证明可应用于新冠病毒和癌症诊断等多领域的核酸检测。
背景技术
目前，生物传感器常用的核酸检测探针是单链DNA(ssDNA)。然而，ssDNA在固定时表现出不可控的方向和塌陷的构象。同时，ssDNA带负电荷的糖-磷酸盐骨架导致ssDNA彼此之间的排斥，限制了ssDNA在传感器表面修饰时的间距。所有这些因素都会导致每个ssDNA占据更大的空间面积，从而限制了ssDNA在有限的传感器表面上的修饰密度。此外，当与目标核酸(带负电)杂交时，ssDNA和目标核酸结合时彼此间的静电排斥也会影响ssDNA的亲和力，无法高效的对目标核酸进行捕获。在实际检测中，ssDNA也可能会被样品中的核酸酶或蛋白酶降解，其活性也会受到离子浓度、温度和pH的影响。由于上述限制，基于ssDNA的生物传感器对核酸的直接检测极限都在nM量级。为了提高检测灵敏度，研究者尝试用其他材料辅助的方式或对目标核酸扩增的方式以优化检测能力。检测限虽都得到了一定程度的降低，但检测过程却被大大复杂化了。这些方法显然是不符合现实检测的需求的，不易于普及。
其他生物传感器的灵敏度取决于探针分子的亲和力。高亲和力的探针分子可以实现高效的分析物捕获，从而提高检测灵敏度。微梁传感器的工作原理是探针和分析物的结合引起的微梁表面的应力变化会引起微梁的实时偏转。由于微梁的刚性系数非常小，以及光学杠杆对偏转的放大作用，可以实现对分析物的高灵敏度测定，而不需要复杂的标记过程。而微梁表面的应力变化大小则与探针分子的亲和力，探针分子的空间构象和形成的复合物(探针-靶分子)的紧密程度息息相关，这使得微梁传感器对于探针的需求是独特的。理想情况下，如果有一种高亲和力的探针分子在微梁表面可以形成密集和定向的分子层，那么就可以实现对靶分子高效率的捕获。之后紧密排布的复合物彼此间就会产生较大的排斥力，最终产生巨大的总排斥力引起微梁的显著的偏转，从而可以大大提高微梁传感器的灵敏度。
一种核酸类似物，肽核酸(PNA)，是通过用中性聚酰胺骨架取代DNA的带负电荷的磷酸糖骨架而合成的。PNA保留了碱基特异性杂交的特性，在识别互补目标方面仍然有效。但由于中性聚酰胺骨架的灵活性，PNA在核酸杂交中展现出超高的亲和力，并可以在空间上定向的垂直伸展，充分的暴露碱基。这使得PNA在微梁表面可以形成高密度且定向的探针分子层，从而高效的捕获目标核酸，最终形成大量且密集排布的探针-目标核酸双链体。双链体彼此间很小的间距大大增加了排斥力，给微梁表面带来了显著的应力增强。此外，PNA表现出抗酶水解的能力，并且不受进行杂交的溶液环境(离子浓度、温度、pH值等)的影响，这使得PNA在复杂条件下也可以进行稳定的核酸检测。
在全球肆虐的新冠病毒感染的主要诊断方法目前是新冠病毒核糖核酸(RNA)的分子检测和免疫学抗体检测。核酸检测是通过处理人类血液、粪便或呼吸道的样本后，提取病毒RNA进行逆转录酶实时聚合酶链反应(RT-PCR)。虽然RT-PCR表现出良好的检测限(500copies/mL)，但其产生结果的周期较长(数小时至数天)，主要是由于核酸纯化和扩增等繁琐步骤造成的。最重要的是，RT-PCR需要专门的操作人员和昂贵的设备(>10000美元)，且只能在拥有大型固定设备和试剂的实验室操作，这大大限制了资源匮乏地区的检测能力。免疫学抗体检测易于操作，对设备的依赖性较小，但受限于人类免疫系统可能需要14至21天才能产生待检测的抗体，并可能受到交叉反应的干扰。此外，癌症的诊断越早，治愈率就越高，而现有对癌症临床标记物(microRNA)的检测方法的灵敏度仅在纳摩尔量级。考虑到病毒检测和癌症诊断现有检测方法的缺陷及为了验证本发明技术的实用性，我们将发明技术用于SARS-CoV-2的RNA的检测和肺癌临床标记物miRNA-155的检测。
目前尚未有使用PNA作为探针分子在基于光杠杆原理的微梁传感平台上进行核酸检测的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术，以期实现无扩增且超灵敏的核酸检测。受益于PNA对微梁带来的应力增强和光杠杆的放大作用，在阵列的原位比较下，本方法可在一小时内完成对目标核酸的超灵敏和无扩增检测。已将此技术应用于临床人体血清中SARS-CoV-2和肺癌标记物miRNA-155的检测，检测限皆低于现有方法的临床阈值，满足国家的临床检测标准。
本发明基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测技术，包括如下步骤：
步骤1：微悬臂梁阵列的差异化修饰
当PNA和目标核酸在微梁表面发生碱基互补配对时，导致的应力变化会引起微梁的弯曲。为了达到检测的目的，需要将PNA修饰固定在微悬臂梁阵列中部分梁的镀金表面。具体包括如下步骤：
1a清洗：将未使用的微悬臂梁(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中。取50mL30％过氧化氢和150mL98％浓硫酸混合并搅拌均匀配置成洗涤溶液，微梁置于洗涤溶液中浸泡15分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干。
1b固定肽核酸：将清洗干燥后的微悬臂梁阵列固定在毛细管差异化修饰平台的微型反应室中，通过位移平台将四条毛细管与阵列的悬臂1、3、5、7缓慢对接，最终使悬臂1、3、5、7的三分之二分别进入相应的毛细管中；此时，在毛细管的另一端注入在1×SSC(含3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)中稀释的5μM的PNA溶液，由于PNA固有的硫醇基团，在室温下孵化4小时，阵列被部分功能化；最后，取出阵列，用1×SSC清洗三次并干燥，PNA部分功能化的微悬臂阵列就制备完成。
1c封闭：将步骤1b修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇(MCH，1mM)的酒精溶液中，培育1小时；然后以1×SSC清洗，氮气吹干，得到修饰好的微悬臂梁阵列。使用6-巯基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol，MCH)对阵列的8个微梁的镀金表面同时进行封闭，MCH带有巯基，也可以与金表面发生反应，填充微梁金层未修饰PNA的位置。
步骤2：核酸检测
以步骤1获得的差异化修饰的微悬臂梁阵列作为传感器对目标核酸进行检测，具体包括如下步骤：
将步骤1差异化修饰的微悬臂梁阵列固定在反应池中，流入1×SSC缓冲液，以30μL/min的固定流速流动；激光照射在微悬臂梁的尖端，微悬臂梁尖端的弯曲会导致反射光的偏转，反射光斑位置信号由光电位置敏感器(PSD)接收，当微悬臂梁阵列在缓冲液中达到平稳状态后，将目标核酸溶液加入反应池中，阵列的8个微悬臂梁分别产生的偏转情况被实时监测并记录，根据微悬臂梁的尖端位移即可获得待检测样品的浓度信息。基于光杠杆原理的微梁阵列检测仪器示意图见图2。
步骤1中，所述PNA对N基因的特异性序列是特异性的，比如：当检测对象为SARS-CoV-2时，与SARS-CoV-2的N基因互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-ATTTCCTTGGGTTTGTTCTG-C；当检测对象为肺癌标记物miRNA-155时，与miRNA-155互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-ACCCCTATCACGATTAGCATTAA-C；当检测对象为肺癌标记物miRNA-141时，与miRNA-141互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-C；当检测对象为乳头瘤病毒(HPV-16)时，与HPV-16的核酸互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-AAATCATATTCCTCCCCATG-C。在合成过程中对PNA的N端修饰巯基，PNA即可与微梁的金层发生化学反应生成AU-S键从而被固定在微梁表面。
所述目标核酸包括但不限于SARS-CoV-2、miRNA-155、miRNA-141、HPV-16等。
鉴于微梁传感技术中探针的亲和力以及在微梁表面固定时密度和构象的对应力产生的重要性，本发明提出在微梁镀金表面上修饰PNA的方法来实现核酸检测。结果表明，本发明的方法与现有的微梁免疫方法相比较具有以下优点：
1、本发明用PNA探针替代传统的ssDNA探针固定到微梁金表面上的方法，来给微梁带来了显著的应力增强以提升检测灵敏度。与基于ssDNA的微梁传感方法相比，PNA更具刚度的骨架可使其在微梁表面已接近垂直的角度进行伸展，从而大大提高了微梁表面的修饰密度；同时PNA本身的亲和力远远高于ssDNA，从而可以大大提高对目标核酸的捕获效率。本发明已应用与对SARS-CoV-2核酸的检测，对N基因特异性序列的检测限低至100aM，对N基因的检测限更是低至100copies/mL(1aM)，比ssDNA功能化的微梁的检测极限降低了7个数量级，也远低于RT-PCR的临床检测极限。
2、本发明也已应用于肺癌早期临床标记物miRNA-155的检测，检测极限低至0.1fM，远远低于肺癌临床诊断的阈值。这表明了基于PNA的微梁传感方法在核酸杂交检测的优越性和普适性。
3、同时由于PNA的可编辑性，可通过基因工程在远离碱基结合位点的N端加上一个巯基，从而可以通过S-Au共价键一步固定到微梁金表面，在实现定向固定，碱基结合位点暴露更充分的同时，大大简化了实验的准备过程，减少了时间，降低了技术培训的门槛。
4、PNA的链长对于微梁表面的应力传递是有影响的，在PNA的长度为20bp时，给微梁表面带来了最佳的应力增强效果。
5、PNA可以通过基因工程大量生产，然后一步固定在微梁上，再一步直接完成对目标核酸的超灵敏检测。由于无需扩增60分钟内即可出具检测报告，检测极限更是低至aM量级，兼具超灵敏和快速的优势。
6、PNA对外界环境的变化展现出很好的稳定性，具有抗酶水解的能力，这样提高了在现场环境下微梁检测结果的稳定性和重现性。
附图说明
图1是本发明实施例中基于PNA的微梁传感方法的原理示意图。
图2是本发明实施例中基于光杠杆原理的微梁阵列检测仪器示意图。
图3(a-d)是本发明测试例中评价微梁金表面的PNA的成功固定的光电子能谱图；(e、f)是本发明测试例中PNA与传统ssDNA探针的亲和力SPR对比。
图4(a)本发明测试例中PNA差异化修饰的微梁阵列对1nMN基因特异性序列实时检测的偏转曲线图；(b)本发明测试例中PNA功能化微梁阵列对N基因特异性序列检测的实时偏转曲线图；(c)本发明测试例中ssDNA功能化微梁阵列对N基因特异性序列检测的实时偏转曲线图。(d)本发明测试例中基于PNA的微梁传感方法和ssDNA的微梁传感方法检测极限比较。
图5(a)本发明测试例中PNA功能化微梁检测临床血清样本中SARS-CoV-2的N基因；(b)本发明测试例中PNA功能化微梁检测临床肺癌早期标记物miRNA-155；(c)本发明测试例中PNA功能化微梁对SARS-CoV-2的N基因的特异性。
具体实施方式
以下通过具体实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步阐述说明。需要注意的是，下述的具体实施例仅是作为举例说明，本发明的保护范围并不限于此。
下述实施例中使用的化学药品和原料均为市售所得或通过公知的制备方法自制得到。
实施例1：微悬臂梁表面PNA的固定
1)清洗：将未使用的微悬臂梁(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip(食人鱼溶液)溶液(V(H2O2)：V(H2SO4)＝1:3)中浸泡15分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；
2)固定肽核酸：将清洗干燥后的阵列固定在毛细管差异化修饰平台的微型反应室中，通过位移平台将四条毛细管与阵列的悬臂1、3、5、7缓慢对接，最终使悬臂1、3、5、7的三分之二分别进入相应的毛细管中；此时，在毛细管的另一端注入在1×SSC(含3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)中稀释的5μM的PNA溶液，由于PNA固有的硫醇基团，在室温下孵化4小时，阵列被部分功能化；最后，取出阵列，用1×SSC清洗三次并干燥，PNA部分功能化的微悬臂阵列就制备完成。
3)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇(MCH，1mM)的酒精溶液中，培育1小时，然后以1×SSC清洗，氮气吹干，得到修饰好的微悬臂梁。
测试例：
1、SPR评价PNA对SARS-CoV-2N基因的亲和力
为了评估PNA在金表面形成的分子层的活性以及PNA对SARS-CoV-2的N基因的亲和力，在BiacoreT200(GEHealthcare,NewJersey,USA)上使用多循环动力学模式记录了表面等离子体共振(SPR)测量。在PNA以5μM的浓度固定在芯片的黄金表面并被MCH阻断后，多梯度浓度的N-基因特异性序列样品均以30μL/min的流速分别流过BiacoreT200。在每组浓度测量结束时，芯片的金表面用氢氧化钠再生30秒，然后进行下一个循环。最后的测量结果用BIA评估方法进行拟合，应用1:1的结合模型。
2、光电子能谱(XPS)评价微悬臂梁金表面PNA的固定
用ESCALAB250Xi(购自美国ThermoScientific)测量PNA固定前后微梁的XPS谱图，使用单色AlKαX射线源。从图3可以看出，与裸梁相比，当PNA固定后，观察到Au4f、N1s、O1s的结合能分别从84.09、0、532.7变为83.36、400.1、531.9eV。结合能的变化是由于化学键和化学环境的变化，表明微梁金表面成功固定了PNA。
实施例2：
PNA微梁传感方法效果监测
1)清洗：无水乙醇、丙酮和1×SSC分别流经微梁传感系统，流速0.5mL/min；
2)固定微悬臂梁：将实施例1中修饰有PNA的微梁阵列固定到微梁传感系统的反应池中，流动1×SSC通过反应池。排除反应池中的气泡后以0.1mL/min流动1×SSC。
3)调节光路：调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微悬臂梁的尖端并被PSD接收。
4)样品测定：当PSD接收的微悬臂梁偏转信号稳定后，加入2mL含有SARS-CoV-2N基因的人血清样品。通过PSD实时记录微梁尖端位移信息。
如图3(a)所示，展示了不同浓度N基因特异性序列和微梁上PNA反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，在注入不同浓度的样品后，功能化的微悬臂都发生了偏转。样品的浓度越高，微悬臂的反应就越快，发生的偏转差异也越大。在样品注入50分钟后，由不同浓度的样品引起的微悬臂偏转已经很容易区分了。更重要的是，在50pM的N基因特异性序列存在的情况下，微悬臂的偏转差值高达73nm，而即使N基因特异性序列的浓度低至0.1fM时，微悬臂的偏转差值仍为9nm。在超低浓度下的可观信号表明，我们的方法可以实现N基因特异性序列的超灵敏检测。完全在纯SSC溶液中完成的对照实验中，微悬臂的差偏转接近水平线，这进一步表明微悬臂的差偏转代表了PNA和N基因特异性序列的特定结合信号。另外，为了直观地评估我们的方法在检测能力方面的优势，我们探索了ssDNA功能化微悬臂在N基因特异性序列存在下的敏感性。正如预期的那样，样品的注入确实引起了功能化微悬臂的特定偏转。然而，当N基因特异性序列的浓度为10nM时，微悬臂也只显示出67nm的不同偏转。在N基因特异性序列浓度稀释到0.1nM时，没有观察到微悬臂的差偏，表明DNA功能化微悬臂的检测极限大于0.1M。显然，基于DNA的微梁和基于PNA的微梁在检测极限方面有很大差距。
如图4(c)所示，验证了本发明实施例的特异性。对于SARS-CoV-2的N基因特异性的PNA固定的微梁，分别检测SARS-CoV-2的N基因和MERS-CoV的N基因，展示了不同种类标准样品加入后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，发现只有SARS-CoV-2的N基因加入时才有特异性响应，从而验证了方法的特异性。
如图4(b)所示，最后为了验证方法的普适性，本申请用为miRNA-155设计的PNA对微梁进行功能化后，注入的miRNA-155迅速引起了微梁的偏转。在60分钟时，不同浓度的miRNA-155所引起的微悬臂的不同偏转可以明显区分出来。发现miRNA-155样品溶液浓度为0.1fM时，微梁仍有可以区分的偏转(达8.3nm)。这说明PNA功能化微梁对miRNA-155的检测限低至0.1fM，这低于现在临床上对肺癌早期诊断时使用的miRNA-155浓度阈值。结果证明了方法的普适性和在核酸检测中广阔的应用前景。
实施例3：
在微梁上修饰PNA；其中PNA对N基因的特异性序列是特异性的；
在修饰有PNA的微梁中加入缓冲液和待检测样品；其中，修饰有PNA的微梁中PNA的浓度为5μM；
分别注入不同浓度的待检测样品，并分别记录与修饰有PNA的微梁反应后微梁的尖端位移，确定待检测样品浓度与微梁偏转的关系，建立标准曲线。待检测样品为N基因的特异性序列溶液，浓度分别为1nM，500pM，50pM，1pM，100fM，10fM，1fM，0.1fM；
最终即可根据测试所得的微梁尖端的偏转获得待检测样品的浓度。
实施例4～8：
实施例4～8与实施例3的区别仅在于PNA的浓度分别为0.1μM、1μM、10μM同样测得了待检测样品的浓度。
实施例9～12：
实施例9～12与实施例3的区别仅在于待检测样品的浓度分别为0.1fM、1fM、10fM、100fM、1pM、50pM同样测得了待检测样品的浓度。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断目的的基于光杠杆原理和肽核酸的微悬臂梁核酸检测方法，其特征在于：
在微梁镀金表面上修饰PNA作为探针，通过PNA对微梁带来的应力增强和光杠杆的放大作用来实现对目标核酸的检测；具体包括如下步骤：
步骤1：微悬臂梁阵列的差异化修饰
当PNA和目标核酸在微梁表面发生碱基互补配对时，导致的应力变化会引起微梁的弯曲，为了达到检测的目的，需要将PNA修饰固定在微悬臂梁阵列中部分梁的镀金表面，获得差异化修饰的微悬臂梁阵列；
1a清洗：将未使用的微悬臂梁置入酶标孔板中，取50 mL 30%过氧化氢和150 mL 98%浓硫酸混合并搅拌均匀配置成洗涤溶液，微悬臂梁置于洗涤溶液中浸泡15分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；
1b固定肽核酸：将清洗干燥后的微悬臂梁固定在毛细管差异化修饰平台的微型反应室中，通过位移平台将四条毛细管与阵列的第1、3、5、7悬臂缓慢对接，最终使第1、3、5、7悬臂的三分之二分别进入相应的毛细管中；此时，在毛细管的另一端注入在1×SSC中稀释的5 μM的PNA溶液，由于PNA固有的硫醇基团，在室温下孵化4小时，阵列被部分功能化；最后，取出阵列，用1×SSC清洗三次并干燥，PNA部分功能化的微悬臂阵列就制备完成；
1c封闭：将步骤1b修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇的酒精溶液中，培育1小时；然后以1×SSC清洗，氮气吹干，得到修饰好的微悬臂梁阵列；
步骤2：核酸检测
以步骤1获得的差异化修饰的微悬臂梁阵列作为传感器对目标核酸进行检测；
具体是将步骤1差异化修饰的微悬臂梁阵列固定在反应池中，流入1×SSC缓冲液；激光照射在微悬臂梁的尖端，微悬臂梁尖端的弯曲会导致反射光的偏转，反射光斑位置信号由光电位置敏感器接收，当微悬臂梁阵列在缓冲液中达到平稳状态后，将目标核酸溶液加入反应池中，阵列的8个微悬臂梁分别产生的偏转情况被实时监测并记录，根据微悬臂梁的尖端位移即可获得待检测样品的浓度信息；
所述目标核酸为SARS-CoV-2或miRNA-155；
当目标核酸为SARS-CoV-2时，与SARS-CoV-2的N基因互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-ATTTCCTTGGGTTTGTTCTG-C；
当目标核酸为肺癌标记物miRNA-155时，与miRNA-155互补配对的PNA探针序列为N-SH-C6-ACCCCTATCACGATTAGCATTAA-C。
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