WO2022255842A1 - 나노구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

나노구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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WO2022255842A1
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조윤경
델 리오 조나단사바테
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기초과학연구원
울산과학기술원
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    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the present invention relates to a nanostructured metal film, a manufacturing method and use thereof, and more particularly, to a nanostructured metal film having nanoporous properties, a manufacturing method thereof, and use as a biosensor.
  • Electrochemical biosensors can detect various substances, and most commercial biosensors belong to electrochemical biosensors.
  • An electrochemical biosensor detects the presence or concentration of a target substance by measuring a current generated by an oxidation/reduction reaction of a target substance on a working electrode.
  • Electrochemical biosensors are usually based on a three-electrode system of a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode equipped with a receptor that specifically binds to a target substance.
  • a sensor platform in the form of a nanochip in which nanoelectrodes are formed on a substrate enables miniaturization of the sensor and has portability, which is advantageous for rapid detection of biomarkers in the field.
  • a biological sample obtained from a living body such as blood or urine
  • An object of the present invention is to provide a metal film capable of suppressing biofouling by generating limited diffusion while having a large surface area, and a method for manufacturing the same.
  • Another object of the present invention is to provide an electrode having improved sensitivity and inhibiting biofouling, and a biosensor and kit including the electrode.
  • Another object of the present invention is to provide a biomarker detection method using a biosensor having improved sensitivity and suppressing biofouling.
  • the metal film according to the present invention is a nano-porous and nano-structured metal film, and the metal film is nano-structured in a form in which metal nano-grains are irregularly aggregated to include stems extending in the thickness direction of the film, and pores between the stems are formed. has nanoporosity by
  • the shape including the stem may be a coral reef shape.
  • the root-mean-square (RMS) roughness of the metal film may be 200 to 500 nm.
  • the thickness of the film may be 1 to 5 ⁇ m.
  • the average size of the metal nano grains may be 10 to 50 nm.
  • the metal of the metal film has a face centered cubic (FCC) crystal structure
  • the metal nanograins have a low index plane selected from one or more of ⁇ 111 ⁇ , ⁇ 110 ⁇ , and ⁇ 100 ⁇ . may have a facet of
  • the metal of the metal film may be one or more metals selected from copper (Cu), silver (Ag), palladium (Pd), platinum (Pt), rhodium (Rh), and gold (Au).
  • the present invention includes a biosensor including the above-described metal film as a working electrode.
  • the working electrode may have antifouling properties satisfying Equation 1 below.
  • Rct is the charge transfer resistance upon contact with a solution containing 1% bovine serum albumin (BSA)
  • BSA bovine serum albumin
  • Rct(0) is the charge transfer resistance immediately after contact
  • Rct(20) is It means the charge transfer resistance at the time of 20 hours after contact.
  • a solution containing ferrocyanide / ferricyanide redox pair in the same molar concentration range of 0 to 50 ⁇ M is used as a reference solution, and the oxidation peak current value ( ⁇ A mm) according to the concentration of the reference solution -2 ), the sensitivity may be greater than 10 ⁇ Amm - 2 mM -1 .
  • the target material may include cancer cell-derived extracellular vesicles.
  • the biological sample is blood, serum, plasma, tears, lavage fluid, urine, saliva, peritoneal lavage fluid, intrapelvic fluid fluid, cyst fluid, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, papillae It may contain aspirates, bronchial aspirates, synovial fluid or cerebrospinal fluid.
  • the present invention includes a detection kit including a substrate on which an electrode member including, as a working electrode, a metal film functionalized with a receptor for capture that specifically binds to a disease indicator contained in a biological sample is positioned.
  • the detection kit may further include a container in which a receptor for detection for forming a sandwich bond is stored.
  • the present invention includes a method for detecting a disease indicator using the biosensor described above.
  • the present invention includes a substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy including the above-described metal film.
  • the present invention includes a method for nanostructuring a metal film.
  • a method for nanostructuring a metal film according to the present invention includes contacting a base metal film with a seeding solution containing a cationic surfactant, a chlorine source, and a metal precursor containing the same type of metal as the metal of the base metal film; and nanostructuring and nanoporousizing the base metal film in contact with the seeding solution using step chronoamperometry under the following conditions.
  • V+ magnitude and V+ application time (t+) 1.0 to 1.5V and 0.5 to 3 msec
  • Number of unit cycle repetitions 10,000 to 30,000 times.
  • the cationic surfactant may be a quaternary ammonium salt.
  • the metal precursor may be a chlorine-containing compound.
  • the molar ratio of surfactant: chlorine source: metal precursor contained in the seeding solution may be 1: 1 to 3: 0.001 to 0.1.
  • a voltage of -1.0 to -1.5V may be applied for 5 to 30 sec after the step chronometry is performed under the above conditions or when the negative voltage of the last applied unit cycle is applied.
  • the metal film according to the present invention is nanostructured in a coral reef shape and has nanoporosity, so that contamination (biofouling) by biological substances such as proteins can be prevented while having a remarkably improved surface area.
  • the method for manufacturing a metal film according to the present invention has the advantage of being able to mass-produce a highly nanostructured and nanoporous metal film in a short time through an extremely simple, easy, and low-cost method of applying a seeding solution and performing a step-time current method. .
  • the electrochemical biosensor equipped with a metal film according to the present invention has the advantage of being able to detect disease indicators with high specificity and sensitivity from a very small amount of biological samples obtained from the human body, and is free from biofouling and obtained from the human body such as plasma or urine. It has the advantage of being able to directly analyze biological samples.
  • the disease indicator detection method using an electrochemical biosensor according to the present invention can detect disease indicators with a very small amount of biological sample, and can detect disease indicators from biological samples themselves without pretreatment, dilution, or concentration of disease indicators. It is possible and has the advantage of being able to detect disease indicators with high specificity and sensitivity.
  • 1 is a schematic diagram showing a Nyquist equivalent circuit used to calculate R ct .
  • FIG. 3 is a diagram showing the anode current measured in various solutions when nanostructuring a gold electrode using step-time amperometric method.
  • 5 is a scanning electron microscope observation image of the surface of the gold electrode according to the number of repetitions of the step voltage when the gold electrode is nanostructured using the step-time current method.
  • FIG. 6 is a scanning electron microscope observation image of a cross-section of a gold electrode according to the number of repetitions of a step voltage when nanostructuring a gold electrode using step-time current method.
  • FIG. 7 is a scanning electron microscope photograph of the surface of an NSG electrode prepared by applying a step voltage of 20,000 times (60 sec) at different magnifications.
  • AFM 8 is an atomic force microscopy (AFM) topography image of gold electrodes before (left)/after (right) nanostructuring.
  • NSG electrode 9 shows a flat gold electrode (Au) before nanostructuring, an NSG electrode (NSG), an NSG electrode modified with L-cysteine through electrode functionalization (NSG-Cys), and an NSG functionalized with L-cysteine and an antibody through electrode functionalization. It is a drawing showing the measurement of the contact angle of the electrodes (NSG-Cys-Ab).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a nanostructured mechanism of an electrode using a seeding solution and a step-time current method.
  • 11 is cyclic voltammograms in which a voltage is scanned at a constant rate at a working electrode and a change in current according to the voltage is measured.
  • FIG. 12 is a diagram showing cyclic voltammograms of a planar electrode (Au) and an NSG electrode (NSG) before nanostructured in an acidic medium.
  • FIG. 13 is a diagram showing cyclic voltammograms of planar electrodes (Au) and NSG electrodes (NSG) at different scan rates in 2.5 mM equimolar potassium ferrocyanide and potassium ferricyanide solutions.
  • 15 is a square-wave scan voltammogram of NSG electrodes and planar electrodes prepared by varying the oxidation potential at 1.2V, 1.25V, and 1.3V during electrode nanostructuring using step-time amperometry. It is an illustrated drawing.
  • 16 is a diagram showing grazing incidence X-ray diffraction spectrograms for an NSG electrode and a planar electrode as a reference.
  • FIG. 17 shows the Rct of the electrode as a function of time in BSA or human plasma media as a result of testing the biofouling behavior of NSG and planar electrodes.
  • FIG. 20 is a diagram showing oxidation peak current densities according to concentrations of IL6 spiked in PBS or human plasma in NSG electrode chips or planar electrode chips.
  • 21 is a graph showing oxidation peak current densities according to concentrations of EV particles spiked into human plasma using NSG electrode chips or planar electrode chips.
  • FIG. 22 shows electrochemical current density values for each detection assay by detecting the detection antibody CD9 + or EpCAM + for detecting CD9-captured EVs.
  • % means weight %
  • solution means an aqueous solution
  • the metal film according to the present invention is a nano-structured metal film having nano-porosity, and the metal nano-grains are irregularly aggregated to be nano-structured in a form including stems extending in the thickness direction of the film, and pores between the stems form a nanostructure. It has porosity.
  • the lower surface One of the two surfaces facing each other in the metal film is referred to as the lower surface, and the opposite surface of the lower surface is referred to as the upper surface, and the direction of the shortest distance from the lower surface to the upper surface is defined as the thickness direction.
  • the lower surface may correspond to a surface of the metal film in contact with (adjacent to) the substrate.
  • the nanograins are irregularly aggregated in the in-plane direction of the film, but directional aggregation is made at least in the plane normal direction of the film, and the nanograins are formed with stems extending from the lower surface to the upper surface. may be structured.
  • the metal film may be nanostructured in the form of corals in which fine branches are formed in which directional aggregation of nano grains (nano crystal grains) is made again in a direction different from the stem from the stem extending from the lower surface to the upper surface. That is, the metal film may have a coral reef shape.
  • the metal film may have nanoporosity between stems forming a coral shape, between stems and branches extending randomly from the stem, and by fine pores between branches.
  • the average size of the metal nano grains may be 10 to 50 nm, specifically 10 to 40 nm, and more specifically 10 to 30 nm.
  • the fine metal nano grains may form fine stems and fine branches, and thereby pores may be made more fine.
  • the average size of metal nano grains may mean the average size of metal crystals constituting the metal film.
  • the average size of the metal nano grains may be calculated through the Scherrer equation based on a grazing incident X-ray diffraction pattern of the metal film.
  • the thickness of the stem may decrease from the lower surface of the metal film to the upper surface, and the size of metal nano grains constituting the stem and branches may decrease.
  • the metal film may be a continuum in which metal grains are continuously connected in a lower region including a lower surface, and the size of micropores may decrease from the lower region to an upper region including an upper surface.
  • the lower region may refer to a region from the lower surface to a thickness of 0.05t0 to 0.30t0 based on the thickness t0 of the metal film.
  • the thickness t0 of the metal film may refer to a macroscopic thickness measured by observing a cross section of the film with a scanning electron microscope at a magnification of 1000 to 5000 times.
  • t0 is on the order of several micrometers, specifically 1 to 9 ⁇ m, more specifically 1 to 9 ⁇ m 5 ⁇ m, more specifically, it may be on the order of 1 to 4 ⁇ m.
  • the root-mean-square (RMS) roughness of the metal film may be 200 to 500 nm, specifically 250 nm to 450 nm.
  • the RMS surface roughness of a flat metal thin film manufactured by conventional metal deposition is on the order of 1 to 2 nm.
  • the remarkably high RMS roughness of the metal film is due to nanostructuring and nanoporosity.
  • the RMS roughness of the metal film may be measured through an atomic force microscope, and may be based on a measurement value measured for an area of at least 5 ⁇ m ⁇ 5 ⁇ m or more.
  • the metal may have an FCC crystal structure, and at this time, the metal nanograins forming the coral reef structure may have facets of a low water surface selected from one or more of ⁇ 111 ⁇ , ⁇ 110 ⁇ , and ⁇ 100 ⁇ .
  • the metal nanograins having an FCC crystal structure may have ⁇ 111 ⁇ facets, ⁇ 110 ⁇ facets, ⁇ 100 ⁇ facets, or a combination thereof.
  • the metal of the metal film is gold (Au)
  • the metal nanograins may have both ⁇ 111 ⁇ facets, ⁇ 110 ⁇ facets, and ⁇ 100 ⁇ facets, and ⁇ 110 ⁇ facets may be most abundant. .
  • the facet crystal plane of the metal nanograins can be determined through the center position of the oxidation current peak in voltammograms obtained by square wave voltammetry performed in an acidic medium, and each facet through the oxidation current peak value.
  • the degree of abundance of can be determined.
  • the electrochemical surface area of the metal film can be represented by a roughness coefficient, which is a ratio of an area calculated from a negative peak obtained using cyclic voltammetry in an acidic medium of the metal film by a geometric area.
  • the roughness coefficient of the metal film may be 150 or more, 180 or more, or 200 or more, and may be substantially 300 or less, or 250 or less.
  • the metal of the metal film or the metal of the metal nano grain may be a metal commonly used for the purpose of the metal film in consideration of the purpose of the metal film.
  • the metal when considering the use of an electrochemical bio-sensing platform, the metal may be a noble metal including Au, Pt, Pd, Rh, Ag, and the like.
  • the metal considering the use of a SERS sensing platform in which a metal film is used as a surface-enhanced Raman Scattering active structure (SERS active structure), the metal may be a plasmonic metal, for example, a noble metal such as Au, Ag, Pt or Pd. have.
  • the present invention includes an electrochemical biosensor including the above-described metal film as a working electrode.
  • the present invention includes a substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy including the above-described metal film as a SERS active structure.
  • a nanogap formed between metal grains by aggregation of metal grains and/or a nanogap between aggregates aggregated in the form of branches or stems may form a hot-spot.
  • an electrochemical biosensor having a metal film as a working electrode or a substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy having a metal film having a SERS active structure is urine, blood plasma, without pretreatment (extraction, concentration, dilution, etc.) of a biological sample obtained from a living body.
  • the presence and content of biochemical substances used as disease indicators can be detected by immediately analyzing the liquid biological sample itself, such as needles, needles, etc.
  • the surface of the metal film may be functionalized with a receptor by binding one or more receptors that specifically bind to a target substance, which is a biochemical substance used as a disease indicator, on its surface.
  • the receptor may be immobilized on the metal membrane through a linker having a plurality of functional groups.
  • the functional group of the linker may include a hydroxyl group, a carboxy group, an amine group, a thiol group, and the like, and the linker may bind to a metal film through a first functional group and bind to a receptor through a second functional group.
  • An example of the linker may include L-cysteine, but is not limited thereto.
  • the specific binding between the receptor and the target material may be by ionic bonding, covalent bonding, hydrogen bonding, coordination bonding, or non-covalent bonding, and specifically, enzyme-substrate bonding, antigen-antibody bonding, protein-protein bonding, and complementarity between DNAs. It may be a red bond or a biotin-avidin bond.
  • Specific substances of a receptor that specifically bind to a target substance for each target substance of interest are already well known in the field of biosensing.
  • the target material is a soluble protein inflammatory marker such as IL6
  • a known or commercially available anti-IL6 detection antibody may be used as a receptor
  • a known CD9 capture antibody may be used as a receptor.
  • the electrochemical biosensor includes an insulating substrate; and a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode including the above-described metal film provided on one surface of the insulating substrate.
  • the reference electrode and counter electrode other than the working electrode may be simple planar electrodes, or may be nano-patterned microelectrodes through a conventional deposition process and a lithography process.
  • Pads (connection terminals) for electrical connection with the outside may be provided for each electrode, and a plurality of working electrodes to which potential may be applied independently are provided, and a common single reference electrode and a common reference electrode for the plurality of working electrodes
  • a common single counter electrode may be provided.
  • the size of the working electrode may be 100 ⁇ m to 800 ⁇ m based on the diameter converted into a circle having the same area as the working electrode, but is not limited thereto.
  • the insulating substrate is sufficient if it is an amorphous material such as glass, an inorganic material such as silicon oxide or silicon, or an organic material such as polypropylene or polyethylene, which is commonly used to support an analysis platform in the field of biosensing.
  • the working electrode may have antifouling properties that satisfy Equation 1 below.
  • R ct is the charge transfer resistance upon contact with a solution containing 1% bovine serum albumin (BSA)
  • R ct (0) is the charge transfer resistance immediately after contact
  • R ct ( 20) means the charge transfer resistance at the time of 20 hours after contact.
  • the working electrode may be an electrode modified with L-cysteine.
  • R ct (20) and R ct (0) may be substantially the same.
  • substantially the same means that the ratio of the charge transfer resistance value at a point in time after a certain period of time to the initial charge transfer resistance value as a reference is 1.5 or less, 1.4 or less, 1.3 or less, 1.2 or less, 1.1 or less, or within a measurement error range. 1 in can mean a name.
  • Equation 1 means that the metal film serving as the working electrode is substantially free from biofouling.
  • the working electrode (the working electrode modified with L-cysteine) has a charge transfer resistance of 0.5 K ⁇ or less, 0.4 K ⁇ or less, or 0.3 K ⁇ or less after 20 hours of continuous contact with plasma. (R ct ).
  • the charge transfer resistance at 2 hours of contact with plasma may be substantially the same as the charge transfer resistance at 20 hours of contact with plasma.
  • the charge transfer resistance (R ct ) is determined by Faraday electrochemical reaction using a 1% BSA Bovine Serum Albumin solution or plasma containing an equimolar concentration of redox pairs of ferrocyanide and ferricyanide. It may be calculated using impedance spectroscopy.
  • the working electrode may have enhanced sensitivity. Specifically, using a solution containing ferrocyanide/ferricyanide redox pair in the same molar concentration range of 0 to 50 ⁇ M as a reference solution, the oxidation peak current value ( ⁇ A mm ⁇ 2 ) according to the concentration of the reference solution
  • the sensitivity which is the slope, can be greater than 10 ⁇ Amm - 2 mM - 1 , greater than 12 ⁇ Amm - 2 mM - 1 , or greater than 14 ⁇ Amm - 2 mM - 1 .
  • the oxidation peak current value may be obtained using squared wave voltammetry between 0V and 0.6V at a scan rate of 0.02Vs -1 .
  • the working electrode may be an electrode modified with L-cysteine.
  • the target substance may be cancer cell-derived extracellular vesicles, and in this case, the electrochemical biosensor may be an electrochemical biosensor for cancer detection.
  • Cancer which is a disease to be detected, may include prostate cancer.
  • the disease detectable by the electrochemical biosensor in the present invention cannot be limited to cancer or prostate cancer, and a substance known as a disease indicator of the disease is set as a target substance and specifically binds to the target substance.
  • the present invention includes a detection kit including a substrate on which an electrode member including the above-described metal film as a working electrode is positioned.
  • a substrate on which an electrode member including a working electrode is positioned may correspond to the above-described electrochemical biosensor, and thus, the detection kit includes all of the above-described contents of the metal film and all of the above-described contents of the electrochemical biosensor.
  • the detection kit according to the present invention includes, as a working electrode, the metal film functionalized with a receptor for capture that specifically binds to a disease indicator contained in a biological sample, and an electrode member including the working electrode is positioned. It may contain a substrate.
  • a plurality of working electrodes may be spaced apart from each other to form an array of working electrodes, and pads (connection terminals) for electrical connection to the outside may be provided for each working electrode constituting the array.
  • a single (common) counter electrode and a single (common) reference electrode may be provided. That is, the plurality of working electrodes may share a counter electrode and a reference electrode spaced apart from the working electrode.
  • the detection kit may further include a substrate in which an electrode member including a pad is formed and a container for storing a receptor for forming a sandwich bond.
  • the container may be in the form of a bottle, barrel, bag, tube, ampoule, and the like, and may be formed in part or wholly from plastic, glass, paper, foil, wax, or the like.
  • the container may include a stopper attached to the container by mechanical, adhesive, or other means and completely or partially detachable by external force when necessary.
  • the detection kit includes a connection line electrically connected to the working electrode (each working electrode when forming an array) and electrically connected to each of the reference electrode and the counter electrode; A processor that applies a predetermined electrical signal through the connection line, detects an electrical response (ex. current) according to the electrical signal, and processes the detected electrical response to calculate the presence or concentration of a disease indicator or whether or not a disease is possessed (possibility). ; and a power source providing power for electrical signal generation; and an output unit outputting the result calculated by the processing unit.
  • the electrical signal applied to the electrode by the processing unit is an electrical signal for performing voltammetry, specifically, cyclic voltammetry, and may be an electrical signal that scans a set voltage range at a set scan speed.
  • the processing unit detects the electrochemical oxidation current generated at the working electrode together with the application of the electrical signal, calculates the maximum value of the oxidation current density peak or the peak area value (integral value) at the oxidation current density peak, and calculates the oxidation current density peak. Based on the density value (maximum value or area value), the presence or absence of a disease or the probability of having a disease may be calculated and transmitted to an output unit.
  • the calculation unit may already store a disease index value (oxidation current density value) of a healthy person who does not have the disease and a disease index value (oxidation current density value) of a patient with the disease, and the measured value
  • the presence or absence of a disease or the possibility of having a disease can be calculated through (oxidation current density value) and pre-stored reference values.
  • the electric signal applied to the electrode by the processing unit may be an electric signal for performing cyclic voltammetry, and for details, refer to a detection method to be described later.
  • the output unit may receive the result transmitted from the calculation unit and output it to be visually recognized through a display member such as an LED panel.
  • the power source may provide power to the output unit and the processing unit, as well as power for generating an electrical signal applied to the electrode member through the output unit.
  • the processing unit may include a conventional signal generation circuit capable of generating a predetermined electrical signal using the voltage (or current) supplied from the power source, if necessary.
  • the present invention includes a method for detecting a disease indicator (corresponding to the target substance described above in the biosensor) using the above-described biosensor.
  • the method of detecting a disease indicator is a step of contacting a biological sample that may contain a disease indicator with a working electrode of a biosensor functionalized with a capture receptor (corresponding to the receptor described above in the biosensor) that specifically binds to the disease indicator. ; contacting a receptor for detection with a working electrode in contact with the biological sample; and measuring the electrochemical oxidation current density using voltammetry.
  • a biological sample may mean any material, biological fluid, tissue, or cell derived from or obtained from a living body.
  • An example of a biological sample is blood (whole blood), plasma, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, serum, sputum ), tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, abdominal lavage ( peritoneal washings), pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid , pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cell, cell and cell extract or cerebrospinal fluid.
  • Biological samples obtained from living organisms include blood, serum, plasma, tears, nasal fluid, urine, saliva, peritoneal lavage fluid, pelvic fluid, cyst fluid, cerebrospinal membrane fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial fluid.
  • a liquid such as aspirate, synovial fluid, or cerebrospinal fluid
  • the biological sample may be in a state in which pretreatment such as extraction, concentration, or dilution has not been performed.
  • a very small amount of several (1 to 8) ⁇ L of the biological sample in contact with the working electrode is sufficient, and this is also possible due to the high detection sensitivity of the working electrode.
  • a well capable of containing a very small amount of a biological sample in the level of several ⁇ L may be coupled on or along the circumference of the working electrode.
  • the detection receptor may be a receptor for capture coupled to a disease indicator or a receptor specifically binding to a disease indicator coupled to the capture receptor.
  • the receptor for detection may be an enzyme-linked receptor, and may include a receptor for primary detection that specifically binds to a disease indicator and a receptor for secondary detection that specifically binds to the receptor for primary detection.
  • the receptor for detection it is sufficient to use a receptor commonly used for detecting the disease indicator in consideration of a specific disease indicator.
  • EpCAM epithelial cell adhesion molecule
  • the detection receptor or capture receptor may be in a functionalized state.
  • functionalization biotinylation or avidinization may be used.
  • a receptor for capture or a receptor for detection may be a conventional enzyme used to easily generate electrochemical oxidation or reduction in the electrochemical biosensor field.
  • a criterion for determining whether or not a person has a disease may be provided using an electrochemical oxidation current density value according to the obtained disease indicator concentration.
  • cyclic voltammetry can be performed by scanning the voltage with a constant voltage window.
  • cyclic voltammetry may be performed at a scan rate of 0.05 to 0.5Vs -1 in the range of -0.5 to 0.5V versus open circuit potential, but is not limited thereto.
  • the electrochemical oxidation current density may mean a maximum value of an oxidation current density peak or a peak area value (integral value) at an oxidation current density peak.
  • the working electrode does not necessarily have to be functionalized with a receptor that specifically binds to a disease indicator (target substance).
  • a disease indicator target substance
  • a receptor binds to the disease indicator coupled to the working electrode
  • indirect detection through sandwich binding between livers is also possible.
  • Those skilled in the art can easily apply and apply the binding and detection method (direct detection, non-direct detection, etc.) between a target substance and a receptor known through ELISA to the electrochemical biosensor, detection kit, or detection method of the present invention.
  • the electrochemical biosensor, detection kit, or detection method described above may be used for cancer detection.
  • the disease indicator may be cancer cell-derived extracellular vesicles
  • the capture receptor may be CD9
  • the detection receptor may be EpCAM
  • the biological sample may be urine or plasma.
  • the receiver operating characteristic value (AUC) may be 0.90 or more.
  • cancer may include prostate cancer.
  • the present invention includes the method for manufacturing the metal film described above.
  • a seeding solution containing a base metal film which is a planar metal film, and a cationic surfactant, a chlorine source, and a metal precursor containing the same metal as the metal of the base metal film are brought into contact, and the following conditions and nanostructuring and nanoporousizing the base metal film using step chronoamperometry.
  • step voltage Sequential application of positive voltage (V+) and negative voltage (V-)
  • V+ magnitude and V+ application time (t+) 1.0 to 1.5V and 0.5 to 3 msec
  • Number of unit cycle repetitions 10,000 to 30,000 times, specifically 15,000 to 25,000 times
  • step voltage When performing the step-time amperometric method, in a unit cycle (step voltage), adsorption of chlorine ions - anisotropic metal etching (oxidation) of the metal film - reduction of anisotropic metal ions occur, and the unit cycle is repeated, and the anisotropic Etching and anisotropic reduction of metal ions are repeatedly performed to finally produce the above-described coral reef-shaped metal film.
  • a passivation layer may be formed on the base metal layer by a cationic surfactant in the seeding solution.
  • the pavation layer helps the chloride ions to adsorb primarily to the preferential adsorption sites and helps to provide heterogeneous nucleation sites upon reduction of the metal ions.
  • chlorine ions provided from a chlorine source are adsorbed to preferential adsorption sites (surface defect sites such as kinks and vacancies) of the metal membrane on which a passivation layer of cationic surfactant is formed, and mainly to the preferential adsorption sites.
  • preferential adsorption sites surface defect sites such as kinks and vacancies
  • the surface of the base metal film is electro-oxidized and etched anisotropically. Thereafter, the polarity of the applied potential is changed, the metal ion of the metal precursor is reduced to the metal, and crevasses formed on the surface of the metal film by electro-oxidation act as a preferential nucleation site and anisotropic nucleation occurs.
  • the nano-porous and nano-structured metal film has a stem shape extending in the thickness direction of the film, specifically, a coral reef shape.
  • the cationic surfactant may be a quaternary ammonium salt
  • the quaternary ammonium salt may include an ester-containing quaternary ammonium salt (EQ) or a quaternary ammonium salt containing an amide group and ester group in Quaternary Ammonium salts).
  • the quaternary ammonium salt may be an aliphatic ammonium salt having a C12 or higher hydrocarbon chain, such as cetyltrimethylammonium chloride (CTAC), dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB), and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • CTAC cetyltrimethylammonium chloride
  • DTAB dodecyltrimethylammonium bromide
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • the metal precursor may be a chlorine-containing compound containing the same metal as the metal film.
  • the metal precursor may be a gold precursor, potassium chloride aurate (KAuCl 4 ), sodium chloride aurate (NaAuCl 4 ), chloroauric acid (HAuCl 4 ), gold chloride (AuCl), gold chloride (III) ( It may be a gold precursor containing chlorine such as AuCl 3 ).
  • the metal precursor may be a compound containing etching products produced upon electro-oxidation.
  • the etching product may be AuCl 4 -
  • the gold precursor may be a compound containing AuCl 4 - such as potassium chlorate, sodium chloraurate, or chloroauric acid (HAuCl 4 ).
  • the molar ratio of cationic surfactant: chlorine source: metal precursor contained in the seeding solution is such that step voltage is repeatedly applied and smooth nanostructure occurs and nanoporosity that suppresses biofouling can occur homogeneously throughout the metal film. It may be 1: 1 to 3: 0.001 to 0.1 level, but is not necessarily limited thereto.
  • a voltage of -1.0 to -1.5V is applied to the metal film for 5 to 30 sec, and electrical reduction is performed. It can be.
  • the nanostructured and nanoporous metal film may stably provide a metal surface by such electric reduction.
  • the metal has a standard reduction potential within a range in which electrolysis of water containing chlorine ions does not occur, nanostructuring and nanoporosity can be achieved using the above-described seeding solution and the step-time current method.
  • Practical examples of such metals include copper (Cu), silver (Ag), palladium (Pd), platinum (Pt), rhodium (Rh), gold (Au), and the like.
  • examples of nanoporosity and nanostructuring of gold thin films are provided for gold, which is harmless to the human body, has excellent electrocatalytic properties, is attracting attention in the field of electrochemical sensing, and is a representative metal having plasmonic properties.
  • the material of the metal film cannot be limited to only gold.
  • Planar electrodes were fabricated in a clean room using a standard lithography process on a 4-inch soda-lime glass wafer, and 44 chips (1.5 x 0.9 mm) containing 4 working electrodes were fabricated.
  • a photoresist (SU-8 2002, K1 Solution) having a thickness of 2 ⁇ m was spin-coated (3000 rpm, 500 rpms -1 , 1 min) on the wafer.
  • a mask aligner i-line 365 nm, 120 mJ cm -2
  • developed SU-8 developer, K1 solution.
  • a rapid post-baking 1.5 min at 65°C and 1.5 min at 95°C was performed to open the electrical contact and limit the sensing area of the electrode.
  • the chip was washed with isopropyl alcohol and the negative photoresist was hard-baked (3 hours at 180° C.) to further cure.
  • a protective layer of positive photoresist was spin coated to protect the chip during dicing and to keep the chip clean during storage.
  • the chip was rinsed in acetone and 2 min in an O 2 plasma (Cute, Femto Science) at 0.5 mbar and 50 mW. cleaned while
  • CTAC TCI, cat# H0082, lot# 4LL50-MN
  • 222 mM sodium chloride stock solution 36 mg CTAC (TCI, cat# H0082, lot# 4LL50-MN) was dissolved per milliliter of 222 mM sodium chloride stock solution.
  • the prepared solution was mixed with 10 mM chloroauric acid solution (the stock was stored in the dark at 4° C.) to prepare a seeding solution having a final concentration of 100 mM CTAC, 200 mM NaCl, and 1 mM HAuCl 4 .
  • the prepared solution was stored in the dark at room temperature.
  • NSG electrode a nanostructured electrode
  • the electrode was scanned by cyclic voltammetry (CV) from 0 V to 1.6-1.8 V in an acidic solution of 0.5 M H 2 SO 4 at a scan rate of 0.1 Vs -1 , and below the reduction curve at about 0.9 V.
  • the area (charge) of was integrated.
  • the cathodic peak was proportional to the amount of reduced gold and thus proportional to the surface area of the electrode. According to the literature, the electrode area was calculated assuming a specific charge transfer of 400 ⁇ Ccm -2 , and a roughness factor was calculated by comparing it with the geometric area.
  • Topographic characterization of the electrode surface was performed using SEM (S-4800, Hitachi High-Technologies) and AFM (DI-3100, Veeco). Before SEM observation, a 5 nm gold layer was coated on the sample using sputter coating. Imaging was performed at an accelerating voltage of 7 kV and a working distance of 3–4 mm. NSG electrode roughness and morphology were performed using an atomic force microscope (AFM) in non-contact tapping mode using a silicon AFM tip with a radius curvature of less than 10 nm and an aluminum reflective coating (300AL-G-10, Woomyoung Inc.) .
  • AFM atomic force microscope
  • Samples were analyzed by grazing incidence X-ray diffraction (ruker D8 Discovery) using a Cu K ⁇ (1+2) source, with an incident angle ⁇ of 1° and a 2 ⁇ range of 30° to 80°. was
  • the crystallite size was calculated using the full width at half maximum (FWHM) of the Au (220) peak and the Scherrer equation.
  • the electrode chip was immersed in a 10 mM solution of L-cysteine for 24 hours and rinsed with ultrapure water.
  • a 2.5% glutaraldehyde solution in phosphate buffered saline (PBS pH 8) was drop-cast on the chip surface and incubated for 30 minutes, followed by rinsing and drying the chip.
  • R S is the resistance of the solution
  • the constant phase element non-ideal capacitance, constant phase element, CPE
  • Cdl double layer capacitance
  • R ct and Warburg connected in parallel
  • Z W was used to model the diffusion of electroactive species in solution.
  • ferrocyanide K 4 Fe(CN) 6 and ferricyanide K 3 Fe(CN) 6 were used as redox pairs at the same molar concentration. was used. Electrochemical detection of ferrocyanide/ferricyanide with different concentrations (50, 25, 5, 2.5, 0.5, 0.25, 0.05, 0.025, 0.005, 0.0025 and 0 mM) was performed at 0.6 at 0 V with a scan rate of 0.02 Vs ⁇ 1 . It was performed using squared wave voltammetry between V.
  • the pulse height was 30 mV
  • the pulse width was 100 ms
  • the step height was 4 mV.
  • a flat gold electrode an electrode manufactured by a photolithography process before nanostructuring was used as a control for the NSG electrode.
  • LNCaP cells were obtained from ATCC and cultured in Roswell Park 673 Memorial Institute medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific) supplemented with 5% Exo-Free FBS (Systems Biosciences, Inc.) and 1% antibiotics/antimycotics, at 37°C temperature and 5 Incubated for 48 hours at % CO 2 .
  • the cell culture supernatant was collected and centrifuged at 300xg for 10 minutes and centrifuged at 2000xg for 15 minutes to completely remove dead cells and cell debris. The supernatant was filtered through a 450 nm filter.
  • EV standards were prepared using isolated and concentrated EVs. EVs were reconstituted in PBS to determine particle number by nanoparticle tracking assay (Nanosight NS500, Malvern Instruments) and spiked into PBS or human plasma samples at various dilutions to prepare a calibration curve.
  • nanoparticle tracking assay Nanosight NS500, Malvern Instruments
  • Blood samples of 3 mL each were collected into vacuum EDTA collection tubes and processed within 2 hours of collection. Blood samples were centrifuged at 300xg for 10 min and 2000xg for 10 min at 4°C to remove cells and debris, and stored at -80°C until use.
  • Reagents, dilutions and washing steps used in the IL6 detection assay were all performed in assay buffer (1% BSA and 0.05% Tween 20 in PBS).
  • IL6 (Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263) was spiked into PBS and human plasma at various concentrations, and 20 ⁇ L was incubated on an electrode chip for 2 hours.
  • a biotinylated anti-IL6 detection antibody (Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263) was diluted to 1 ⁇ g mL ⁇ 1 and incubated on the electrode chip for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Streptavidin (Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263) was diluted 1:400 in assay buffer and incubated for 30 minutes.
  • the electrode chip uses a counter electrode and a reference electrode (pseudo reference electrode) provided inside the chip at a scan rate of 0.1Vs -1 in the voltage range of -0.5 and 0.5V vs. open circuit potential. individually investigated by cyclic voltammetry. Another calibration curve was obtained by spiking IL6 in PBS instead of plasma and using flat lithographic gold electrode chips (also referred to as non-nanostructured electrode chips, planar electrodes collectively) for comparison.
  • CD9 capture antibody and biotinylated CD9 (Abcam, monoclonal, clone# MEM-61, cat# ab28094, lot# GR280437-1), biotinylated with detection antibody CD81 (LSBio, cat# LS-C134650, clone# 1.3.3.22) 1 ⁇ gmL ⁇ 1 or biotinylated EpCAM (R&D Systems, cat# DY960, lot#1336382) 1 ⁇ gmL ⁇ 1 were used to detect EVs in the same assay. Tween 20 was completely removed from the assay to prevent disruption of the lipid membrane of EVs during the assay. Standards were prepared by diluting concentrated EV samples extracted from LNCaP cell culture supernatants or by spiking human plasma at various dilutions.
  • ELISA was performed in 96 well plates (cat# 3364, Corning). All volumes were washed twice with 200 ⁇ L of 0.1% BSA in PBS after each step. First, 50 ⁇ L of 4 ⁇ g mL ⁇ 1 anti-CD9 antibody (BD Biosciences, cat# 555370, clone M-L13) was incubated overnight at 4° C. After blocking with 200 ⁇ L of 1% BSA for 3 hours, 50 ⁇ L of samples were incubated for 2 hours. Then, 500 ngmL ⁇ 1 of 50 ⁇ L of biotinylated anti-CD9 (Abcam, cat# ab28094) or anti-EpCAM (R&D Systems, cat# DY960) was incubated for 1 hour.
  • biotinylated anti-CD9 Abcam, cat# ab28094
  • anti-EpCAM R&D Systems, cat# DY960
  • HRP-streptavidin diluted 1:500 in 0.1% BSA
  • absorbance was measured at 450 nm (Infinite 200 PRO NanoQuant Microplate Readers from Tecan, Tecan).
  • FIG. 2 is an optical photograph of the manufactured electrode chip observed, in the case where four working electrodes (W) are provided on the sensor chip.
  • the inset in the upper right corner is an enlarged observation of a portion marked with a square in the optical photograph.
  • the example of FIG. 2 shows a circular working electrode (W), a ring-shaped reference electrode (R) spaced apart from the circular working electrode (W) at a predetermined distance and wrapping around the working electrode (W), and a predetermined distance from the reference electrode (R).
  • the counter electrode (C) spaced apart and surrounding the circumference of the reference electrode (R) forms a concentric structure.
  • each of the working electrodes (W) is connected to a pad for electrical connection with the outside
  • each reference electrode (R) is electrically connected to each other and connected to a single pad
  • the counter electrodes (C) are also electrically connected to each other. connected to a single pad.
  • FIG. 3 is a diagram showing the anodic current (only) measured in various solutions when nanostructuring a gold electrode using step-time amperometric method.
  • 'NaCl+CTA+HAuCl 4 ' is an example using the prepared seeding solution
  • 'NaCl+CTA' is an example using a solution excluding chloroauric acid from the seeding solution
  • 'NaCl+HAuCl 4 ' is the seeding solution.
  • 'CTA+HAuCl 4 ' is an example using a solution excluding sodium chloride from the seeding solution
  • '1-component' is an example using a solution containing NaCl alone, CTA alone, or HAuCl 4 alone.
  • Sodium chloride containing chlorine was used to electro-oxidize and etch gold on a flat electrode, and gold precursors and surfactants were used to promote gold nucleation and growth during electro-reduction, but to control the preferential growth direction. .
  • Step-time amperometry was performed, and anodic and cathodic currents were generated by electro-oxidation and electro-reduction of gold.
  • the current due to oxidation and reduction increases with time, but reaches a stable current within 1 minute.
  • the anodic current is related to the available electroactive area, and the increase in current with time represents the growth of the nanostructure.
  • electro-oxidation and reduction of gold were repeated, and nanostructures were actively developed. This was a process not observed in solutions containing only one or two.
  • FIG. 4 is a photograph of the working electrode before (left)/after (right) nanostructuring, and the size of the scale bar is 250 ⁇ m.
  • the prepared NSG electrode exhibited a uniformly dark color due to the nanostructure and nanoporosity.
  • 7 is a scanning electron microscope photograph of the surface of an NSG electrode manufactured by applying a step voltage of 20,000 times (60 sec) at different magnifications, and the number x displayed at the top of each photograph means the magnification of the corresponding photograph.
  • the scale bars are 300 nm, 500 nm, 1 ⁇ m, 5 ⁇ m, 10 ⁇ m and 50 ⁇ m in order from high magnification photo (x150,000) to low magnification photo (x1000).
  • the gold electrode in the form of a flat film formed by deposition before nanostructuring was a polycrystal composed of gold grains.
  • the grain boundary of these polycrystals acts as a preferential etching site, forming large crevasses during etching by electro-oxidation of the gold electrode, and these large crevasses are preferential nucleation sites during electro-reduction of the gold electrode.
  • AFM atomic force microscopy
  • the electrode having a contact angle of 72 ° in the flat gold film state increases the hydrophobicity to 105 ° due to the increased surface roughness, and then functionalizes with L-cysteine or antibody and becomes hydrophilic (39 °, 43 °). .
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the nanostructuring mechanism of an electrode using a seeding solution and a step-time current method
  • FIG. 11 is a diagram showing the nanostructuring mechanism by scanning a voltage at a constant rate at a working electrode and measuring the resultant change in current to examine the nanostructuring mechanism.
  • These are cyclic voltammograms.
  • the bilayer formation step (1), the layer formation step by chlorine adsorption (2), the electrode etching step (3), and the gold reduction step (4) are shown in a schematic diagram
  • FIG. 11 the number of cycle repetitions ( 1 to 20 times), each step is shown together on the voltage-current density graph.
  • the cationic surfactant is adsorbed on the surface of the gold thin film and forms a dense and homogeneous bilayer that electrically passivates the electrode surface (1).
  • the cationic surfactant in the solution can form micelles that coordinate with the auric acid.
  • an adlayer of chloride is formed by electrochemically induced adsorption (2).
  • chlorine may be adsorbed to preferential adsorption sites such as step edges, kinks, and vacancies on the surface of the electrode to form an adsorption layer.
  • the etching process is anisotropic as the chlorine adsorption sites are formed by the preferential chlorine adsorption sites, and this anisotropic etching creates nucleation sites that grow into nanostructures.
  • the freshly dissolved chloroauric acid rapidly coordinates with the micellar cationic surfactant in solution, preventing the chloroauric acid from diffusing away from the electrode surface.
  • micellar type cationic surfactant-AuCl 4 is reduced and deposited on the electrode surface at a potential of about 0.6V (4).
  • Overpotential is required by the surfactant bi-layer formed on the surface of the electrode, and the reverse reaction of the reaction occurring during etching is performed.
  • Reduction of the cationic surfactant-AuCl 4 also occurs preferentially and anisotropically in the gold facet, where the surfactant layer is less dense and the surface energy is lower, and the curvature of the edges of the crystal facets increases. This increases the ease of access to micelles, increases the rate of reduction of gold species, and promotes more efficient growth.
  • the cathodic current greatly increases as each cycle is repeated (see 1 st cycle and 20 th cycle in region 4 of FIG. 10).
  • FIG. 12 is a diagram showing cyclic voltammograms of a planar electrode (Au) and an NSG electrode (NSG) before nanostructured in an acidic medium.
  • the surface area of the electrode can be calculated by integrating the cathode peak during electroreduction.
  • the roughness factor of the NSG electrode calculated through the area of the cathode peak (cathode current peak centered at about 0.87 V) of FIG. 12 was 200 or more.
  • FIG. 13 is a diagram showing cyclic voltammograms of planar electrodes (Au) and NSG electrodes (NSG) at different scan rates in 2.5 mM equimolar potassium ferrocyanide and potassium ferricyanide solutions.
  • the right drawing of FIG. 13 is an enlarged view of the CV result of the planar electrode.
  • FIG. 15 is a square-wave scan voltage-current diagram of NSG electrodes and planar electrodes (Au in FIG. 2) prepared by varying the oxidation potential to 1.2V, 1.25V, and 1.3V during electrode nanostructuring using step-time amperometry. It is a diagram showing a scan voltammogram).
  • * means an electrode that has not undergone a reduction process, as described above in 'electrochemical observation of gold crystal plane'.
  • the formation of an oxide adlayer on the surface of the gold electrode indicates the selectivity of the crystal plane. That is, the oxidation peaks in the voltammetry have different energies depending on the direction of each crystalline facet, and as is known, the oxidation energy of the Au ⁇ 111 ⁇ facet is greater than the oxidation energy of the Au ⁇ 110 ⁇ facet, The oxidation energy of the Au ⁇ 110 ⁇ facet is greater than that of the Au ⁇ 100 ⁇ facet (Au ⁇ 100 ⁇ ⁇ Au ⁇ 110 ⁇ ⁇ Au ⁇ 111 ⁇ ).
  • the NSG electrode prepared under the oxidation potential condition of 1.2 V it can be seen that all of the Au ⁇ 100 ⁇ , Au ⁇ 111 ⁇ facets, and Au ⁇ 110 ⁇ facets increased significantly compared to the planar electrode presented as a reference. Further, the NSG electrode had Au It can be seen that a large amount of Au ⁇ 110 ⁇ facets exist compared to ⁇ 100 ⁇ and Au ⁇ 111 ⁇ facets.
  • FIG. 16 is a diagram showing grazing incidence X-ray diffraction spectrograms for an NSG electrode (NSG in FIG.) and a planar electrode (Au in FIG.) as a reference. It was confirmed that the NSG electrode had a face centered cubic (fcc) structure of metallic gold (JCPDS, card number 04-0784). The NSG electrode showed increased peak intensity compared to the planar electrode. This can be interpreted as being due to the increase in the thickness of the NSG electrode.
  • the average size of the crystalline domains was 21 ⁇ 4 nm, which was similar to the grain size observed by scanning electron microscopy (SEM).
  • the Au ⁇ 110 ⁇ crystallographic direction was the most abundant in both the planar electrode and the NSG electrode, which is consistent with the observation result of the electrochemical crystallographic surface of Salpin through FIG. 15 .
  • Au ⁇ 100 ⁇ and Au ⁇ 111 ⁇ were relatively more abundant in the NSG electrode than in the planar electrode.
  • the abundances of Au ⁇ 111 ⁇ and Au ⁇ 100 ⁇ were smaller than those of the relative Au ⁇ 110 ⁇ peaks, indicating that the gold interatomic distances of these facets were large enough to accommodate the cation heads of cationic surfactants. This can be interpreted as providing a cavity.
  • FIG. 17 is a result of testing the biofouling behavior of an NSG electrode (NSG in the figure) and a planar electrode (Au in the figure) as a function of time in a BSA 1% medium (BSA in the figure) or a human plasma medium (Plasma in the figure).
  • R ct of Looking at FIG. 17, which shows the resistance to charge transfer between the electrode and the diffusive redox molecule in different media
  • R ct increases by more than 4000% compared to the initial value due to the adsorption of BSA, while the NSG electrode In the case of , it can be seen that even after 20 hours of exposure, R ct is hardly deteriorated and maintains the initial value.
  • NSG electrodes exhibiting a 10-fold lower Rct than planar electrodes.
  • the anti-biological fouling function of the NSG electrode is due to the restriction of the diffusion of the biological contaminating protein by the nanopores throughout the electrode, which limits the diffusion of the biological contaminating protein and prevents the absorption of the biological contaminating protein and the blocking of the electroactive site. .
  • FIG. 18 is a graph showing peak current density versus ferrocyanide concentration in electrochemical detection of ferrocyanide using a planar electrode (Au in FIG.) and an NSG electrode (NSG in FIG.).
  • the detection of ferrocyanide using voltammetry induces a redox reaction with rapid electron movement compared to diffusion toward the surface.
  • the diffusion profile for this reaction in planar electrodes is planar.
  • the sensitivity is increased from 6 ⁇ Amm - 2 mM -1 of the planar electrode to 14 ⁇ Amm - 2 mM -1 due to the radial contribution from the irregular surface.
  • LOD limit of detection
  • An immunoaffinity biosensor was fabricated by functionalizing the surface of an NSG electrode with an appropriate bioreceptor for the detection of IL6, a soluble protein inflammatory marker commonly found in plasma.
  • an antibody-functionalized NSG electrode chip was used for IL6 detection, and protein detection was performed using electroactive precipitates at the end of the assay. was performed with an ELISA that generated a large current output proportional to the IL6 concentration.
  • FIG. 20 is a diagram showing oxidation peak current densities according to concentrations of IL6 spiked in PBS or human plasma in NSG electrode chips or planar electrode chips.
  • NSG is the result of using PBS spiked with IL6 and the NSG electrode chip
  • Au is the result of using PBS with IL6 spiked and the flat electrode chip
  • NSG (plasma) is the result of human plasma spiked with IL6 and the NSG electrode chip.
  • Au (plasma) means the result of spiked IL6 in human plasma and using a flat electrode chip.
  • the error bar in FIG. 20 means the standard deviation
  • the drawing on the right of FIG. 20 is an enlarged view of the result of the planar electrode chip.
  • the LOD of the planar electrode chip was 31 pgmL -1
  • the LOD of the NSG electrode chip was 1 pgmL -1 , indicating that the NSG electrode had 17 times higher sensitivity than the planar electrode.
  • An electrode surface in contact with a biological sample such as plasma adsorbs proteins very quickly forming passivating multilayers. Furthermore, protein adsorption is further promoted on nanostructured surfaces with larger surface areas. For this reason, an electrode whose surface area is increased only by nanostructuring exhibits unexpectedly low sensitivity when analyzing biological samples. However, when the electrode is nanoporous with nanostructure and has a large amount of nanoporosity below the surface, such as the NSG electrode, diffusion and passivation of such contaminant proteins to the sensing region can be prevented.
  • tEV tumor-derived EV
  • LNCaP prostate lymph node carcinoma
  • NSG CD9/CD9 indicates the case where an NSG electrode is used and CD9 is used as a specific detection antibody
  • NSG CD9/CD81 indicates a case where an NSG electrode is used and CD81 is used as a specific detection antibody
  • NSG CD9/EpCAM indicates the case where an NSG electrode is used and CD81 is used as a specific detection antibody.
  • EpCAM is used as a specific detection antibody
  • Au CD9/CD9 means a case where a flat electrode is used and CD9 is used as a specific detection antibody.
  • the NSG biosensor showed an LOD of 60 follicles ⁇ L -1 for total EVs (CD9 + EV) and 250 follicles ⁇ L -1 for tEV (EpCAM + EV) when detecting EVs in plasma samples as small as 5 ⁇ L. Shows LOD.
  • the electrode was electrically passivated during analysis of the plasma sample, requiring 50 ⁇ L of sample when using ELISA, had an LOD of 700 vesicle ⁇ L for total EV in PBS medium, and Case 8000 vesicles had an LOD of ⁇ L ⁇ 1 .
  • tEV EpCAM + EV
  • tEV EpCAM + EV
  • FIG. 23 shows detection antibody EpCAM + for detecting CD9-captured EVs and shows electrochemical current density values for each plasma sample.
  • EpCAM + EV levels were significantly and significantly higher in prostate cancer patients than in healthy subjects ( p ⁇ 0.0001).
  • urine CD9/CD9 indicates that the clinical sample is urine and CD9 is used as a specific detection antibody
  • urine CD9/EpCAM indicates that the clinical sample is urine and EpCAM is used as a specific detection antibody
  • plasma CD9/EpCAM indicates that the clinical sample is plasma and It means the case of using EpCAM as a specific detection antibody.
  • the value (AUC) of the receiver manipulation characteristic graph of urine CD9/CD9 was only 0.5450, but the AUC of urine CD9/EpCAM was 0.9100 and the AUC of plasma CD9/EpCAM was 0.9005, confirming that they have extremely excellent detection specificity and sensitivity. have.
  • ELISA detection of CD9 + EV or EpCAM + EV in the same clinical sample could not distinguish between healthy and cancer patients.
  • the EpCAM + EV level (current density) in plasma measured by the NSG biosensor was nearly 10 times greater than the EpCAM + EV level in urine, but the AUCs in urine and plasma were 0.91 and 0.90, respectively, in both cases had similar detection specificity and sensitivity.

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Abstract

본 발명은 나노 다공성을 가지며 나노 구조화된 금속 막 및 이의 용도에 관한 것으로, 나노 다공성을 가지며 나노 구조화된 금속 막은 금속 나노 그레인(grain)이 불규칙적으로 응집되어 막의 두께 방향으로 뻗어나가는 줄기를 포함하는 형태로 나노 구조화되고, 줄기 간의 공극에 의해 나노 다공성을 갖는다. 본 발명에 따른 금속막은 나노구조화됨과 동시에 나노다공성을 가져, 현저하게 향상된 표면적을 가지면서도 단백질등과 같은 생물학적 물질에 의한 오염(바이오파울링)이 방지될 수 있다.

Description

나노구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 나노구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 상세하게, 나노 다공성을 가지며 나노 구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 바이오 센서로의 용도에 관한 것이다.
전기화학적 바이오센서는 다양한 물질을 검출할 수 있으며, 대부분의 상용 바이오센서는 전기화학적 바이오센서에 속한다.
전기화학적 바이오센서는 작업 전극 상에서 목적하는 물질의 산화/환원 반응에 의해 발생하는 전류를 측정하여, 목적하는 물질의 존재 여부나 농도를 검출한다.
전기화학적 바이오센서는 통상 목적하는 물질과 특이적으로 결합하는 수용체가 구비되는 작업 전극(working electrode), 기준 전극(reference electrode) 및 상대 전극(counter electrode)의 3전극 시스템에 기반한다. 기판에 나노 전극을 형성한 나노칩 형태의 센서 플랫폼은 센서의 소형화를 가능하게 하고 휴대성을 가져 현장에서 신속하게 바이오 마커를 검출하는데 유리하다.
그러나, 피, 소변등과 같이 생체에서 수득되는 생체 샘플은 바이오 마커 이외에도 다량의 다양한 생체 물질들을 함유하고 있다. 이에, 채취된 생체 샘플을 바로 이용하기 보다는, 분리, 농축 및 정제등의 과정을 거치는 것이 통상적이며, 이에 복잡한 전처리 공정과 함께 다량의 생체 샘플이 필요한 문제점이 있다.
분리, 농축 및 정제를 거치지 않고 미량의 채취된 생체 샘플로부터 바이오 마커를 바로 검출하기 위해서는 민감도가 향상됨과 동시에 단백질이나 분자등의 비특이적 흡착에 의한 바이오파울링(biofouling)이 억제된 작업 전극의 개발되어야 한다.
본 발명의 목적은 넓은 표면적을 가지면서도 제한된 확산이 발생하여 바이오파울링이 억제될 수 있는 금속 막 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 향상된 민감도를 가지며 바이오파울링이 억제된 전극 및 이러한 전극을 포함하는 바이오센서 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 향상된 민감도를 가지며 바이오파울링이 억제된 바이오센서를 이용한 바이오 마커의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 금속 막은 나노 다공성을 가지며 나노 구조화된 금속 막이며, 금속 막은 금속 나노 그레인(grain)이 불규칙적으로 응집되어 막의 두께 방향으로 뻗어나가는 줄기를 포함하는 형태로 나노 구조화되고, 상기 줄기 간의 공극에 의해 나노 다공성을 갖는다.
일 구체예에 있어, 상기 줄기를 포함하는 형태는 산호초 형상일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 금속 막의 RMS(root-mean-square) 거칠기는 200 내지 500nm일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 막의 두께는 1 내지 5μm일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 금속 나노 그레인의 평균 크기는 10 내지 50nm일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 금속 막의 금속은 FCC(Face Centered Cubic) 결정 구조를 가지며, 상기 금속 나노 그레인은 {111}, {110} 및 {100}에서 하나 이상 선택되는 저지수면(low index plane)의 파셋(facet)을 가질 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 금속 막의 금속은 구리(Cu), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh) 및 금(Au)에서 하나 이상 선택되는 금속일 수 있다.
본 발명은 상술한 금속 막을 작동 전극(working electrode)으로 포함하는 바이오센서를 포함한다.
일 구체예에 있어, 상기 작동 전극은 하기 식 1을 만족하는 방오특성을 가질 수 있다.
(식 1)
Rct(20)/Rct(0) ≤ 1.5
식 1에서, Rct는 1%의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 용액과의 접촉시 전하 이동 저항(charge transfer Resistance)이며, Rct(0)는 접촉 직후의 전하 이동 저항, Rct(20)은 접촉 후 20시간이 흐른 시점에서의 전하 이동 저항을 의미한다.
일 구체예에 있어, 0 내지 50μM의 동일 몰 농도 범위로 페로시안화물/페리시안화물 레독스 페어를 함유하는 용액을 기준 용액으로 하여, 상기 기준 용액의 농도에 따른 산화 피크 전류값(μA·mm-2)의 기울기인 민감도는 10 μAmm- 2mM-1 이상일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 표적 물질은 암세포 유래 세포외 소포체를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 눈물, 세비액, 소변, 침, 복강 세척액, 골반 내 유체액, 낭종액, 뇌척수막 액, 양수, 선액, 췌장액, 림프액, 흉수, 유두 흡인물, 기관지 흡인물, 활액 또는 뇌척수액을 포함할 수 있다.
본 발명은 생물학적 샘플에 함유된 질병 지표와 특이적으로 결합하는 캡쳐용 수용체로 기능화된 상술한 금속 막을 작동 전극(working electrode)으로 포함하는 전극 부재가 위치하는 기판을 포함하는 검출 키트를 포함한다.
일 구체예에 있어, 상기 검출 키트는, 샌드위치 결합을 형성하기 위한 검출용 수용체가 보관된 용기를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상술한 바이오센서를 이용한 질병 지표의 검출 방법을 포함한다.
본 발명은 상술한 금속 막을 포함하는 표면증강 라만 분광용 기판을 포함한다.
본 발명은 금속막의 나노구조화 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 금속막의 나노구조화 방법은 베이스 금속막에 양이온성 계면활성제, 염소 소스 및 상기 베이스 금속막의 금속과 동종의 금속을 함유하는 금속전구체를 포함하는 시딩 용액을 접촉시키는 단계; 및 하기 조건의 스텝 시간대전류법(step chronoamperometry)을 이용하여 상기 시딩 용액과 접촉하는 상기 베이스 금속막을 나노구조화 및 나노다공화하는 단계;를 포함한다.
(조건)
전압 인가시 단위 사이클 : 양의 전압(V+)과 음의 전압(V-)의 순차적 인가
V+ 크기 및 V+ 인가 시간(t+): 1.0 내지 1.5V 및 0.5 내지 3msec
V- 크기 및 V- 인가 시간(t-) : -1.0 내지 -1.5V 및 0.8t+ 내지 3t+
단위 사이클 반복 횟수 : 10,000 내지 30,000회.
일 구체예에 있어, 상기 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄염일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 금속전구체는 함염소화합물일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 시딩 용액에 함유된 계면활성제 : 염소 소스 : 금속전구체의 몰비는 1 : 1 내지 3 : 0.001 내지 0.1일 수 있다.
일 구체예에 있어, 상기 조건으로 스텝 시간대전류법이 수행된 후, 또는 마지막으로 인가되는 단위 사이클의 음의 전압 인가시, -1.0 내지 -1.5V의 전압이 5 내지 30sec 동안 인가될 수 있다.
본 발명에 따른 금속막은 산호초 형상으로 나노구조화됨과 동시에 나노다공성을 가져, 현저하게 향상된 표면적을 가지면서도 단백질등과 같은 생물학적 물질에 의한 오염(바이오파울링)이 방지될 수 있다.
본 발명에 따른 금속막의 제조방법은 시딩 용액의 도포 및 스텝 시간대전류법의 수행이라는 극히 간단하고 용이하며 저가의 방법을 통해 고도로 나노구조화되고 나노 다공화된 금속막을 단시간에 대량생산할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 금속막이 구비된 전기화학적 바이오센서는 인체에서 얻어진 극미량의 생물학적 샘플로부터 질병 지표를 높은 특이성과 민감도로 검출할 수 있는 장점이 있으며, 바이오 파울링으로부터 자유로워 혈장이나 소변등 인체로부터 얻어진 생물학적 샘플을 직접적으로 분석할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서를 이용한 질병 지표 검출 방법은 극미량의 생물학적 샘플로 질병 지표의 검출이 가능하며, 생물학적 샘플의 전처리나 희석, 질병 지표의 농축 없이 생물학적 샘플 그 자체로부터 질병 지표의 검출이 가능하고, 높은 특이성과 민감도로 질병 지표의 검출이 가능한 장점이 있다.
도 1은 Rct를 산출하기 위해 사용된 나이퀴스트(Nyquist) 등가 회로를 도시한 모식도이다.
도 2는 제조된 NSG 전극 칩을 관찰한 광학 사진이다.
도 3은 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 다양한 용액 하 측정된 양극 전류를 도시한 도면이다.
도 4는 나노구조화 전(왼쪽)/후(오른쪽)의 작동 전극을 관찰한 사진이다.
도 5는 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 스텝 전압의 반복 횟수에 따른 금 전극 표면을 관찰한 주사전자현미경 관찰 사진이다.
도 6은 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 스텝 전압의 반복 횟수에 따른 금 전극의 단면을 관찰한 주사전자현미경 관찰 사진이다.
도 7은 20,000회(60sec)의 스텝 전압이 인가되어 제조된 NSG 전극 표면을 배율을 달리하며 관찰한 주사전자현미경 사진이다.
도 8은 금 전극의 나노 구조화 전(왼쪽)/ 후(오른쪽) 원자력 현미경(AFM) 토포그래피 이미지이다
도 9는 나노구조화 전 편평한 금 전극(Au), NSG 전극(NSG), 전극 기능화를 통해 L-시스테인으로 개질된 NSG 전극(NSG-Cys), 전극 기능화를 통해 L-시스테인 및 항체로 기능화된 NSG 전극(NSG-Cys-Ab)의 접촉각을 측정 도시한 도면이다.
도 10은 시딩 용액과 스텝 시간대전류법을 이용한 전극의 나노구조화 기작을 나타낸 모식도이다.
도 11은 작업전극에 전압을 일정 속도로 주사하며 이에 따른 전류의 변화를 측정한 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)이다.
도 12는 산성 매질 하 나노구조화 전 평면 전극(Au) 및 NSG 전극(NSG)의 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)를 도시한 도면이다.
도 13은 2.5mM의 등몰 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨 용액 내 스캔 속도에 다른 평면 전극(Au), NSG 전극(NSG)의 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)를 도시한 도면이다.
도 14는 스캔 속도의 제곱근 대비 산화 및 환원 피크 전류(정점 전류 밀도)를 도시한 랜들-세빅 플롯(Randles-Sevcik plot)이다.
도 15는 스텝 시간대전류법을 이용한 전극 나노구조화시 산화 전위를 1.2V, 1.25V, 1.3V로 달리하여 제조된 NSG 전극 및 평면 전극의 네모파 스캔 전압-전류도(square-wave scan voltammogram)를 도시한 도면이다.
도 16은 NSG 전극 및 레퍼런스인 평면 전극에 대한 스침 입사 X선 회절 결과(Grazing incidence X-ray diffraction spectrogram)를 도시한 도면이다.
도 17은 NSG 전극 및 평면 전극의 생물학적 오염(biofouling) 거동을 테스트한 결과로, BSA 또는 인간 혈장 매질에서 시간에 따른 전극의 Rct를 도시한 도면이다.
도 18은 평면 전극 및 NSG 전극)을 이용한 페로시안화물의 전기화학적 검출시, 피크 전류 밀도 대 페로시안화물 농도를 도시한 도면이다
도 19는 전기활성 침전물의 전형적인 전압전류 산화 피크(voltammetric oxidation peaks)를 도시한 도면이다.
도 20은 NSG 전극 칩 또는 평면 전극 칩에서 PBS나 인간 혈장에 스파이크된 IL6 농도에 따른 산화 피크 전류 밀도를 도시한 도면이다.
도 21은 NSG 전극 칩 또는 평면 전극 칩을 사용하여 인간 혈장에 스파이크된 EV 입자 농도에 따른 산화 피크 전류 밀도를 도시한 도면이다.
도 22는 CD9-캡춰된 EV를 검출하기 위한 검출 항체 CD9+ 또는 EpCAM+를 검출한 것으로, 검출 에세이 별 전기화학적 전류 밀도 값을 도시한 것이다.
도 23은 CD9-캡춰된 EV를 검출하기 위한 검출 항체 EpCAM+를 검출한 것으로, 혈장 샘플 별 전기화학적 전류 밀도 값을 도시한 것이다.
도 24는 NSG 바이오센서의 수신자 조작 특성 그래프이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 나노구조화된 금속 막, 이의 제조방법 및 이의 용도를 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 특별히 한정하지 않는 한, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 막(층), 영역, 구성 요소 등의 부분이 다른 부분 위에 또는 상에 있다고 할 때, 다른 부분과 접하여 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막(층), 다른 영역, 다른 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 특별히 한정되지 않는 한 %는 중량%를 의미하고, 용액은 수용액을 의미한다.
본 발명에 따른 금속 막은 나노 구조화되고 나노 다공성을 갖는 금속 막이며, 금속 나노 그레인(grain)이 불규칙적으로 응집되어 막의 두께 방향으로 뻗어나가는 줄기를 포함하는 형태로 나노 구조화되고, 줄기 간의 공극에 의해 나노 다공성을 갖는다.
금속 막에서 서로 대향하는 두 면 중 일 면을 하부면으로, 하부면의 대향면을 상부면으로 하고, 하부면에서 상부면으로의 최단 거리 방향을 두께 방향으로 한다. 금속 막이 기재 상에 위치하는 경우, 하부면은 금속 막에서 기재와 접하는(인접하는) 면에 해당할 수 있다.
나노 그레인들이 막의 면내 방향(in-plane direction)으로는 불규칙적으로 응집되되, 적어도 막의 법선 방향(plane normal direction)으로 방향성 있는 응집이 이루어져, 하부면에서 상부면으로 뻗어나가는 줄기를 포함하는 형태로 나노 구조화된 것일 수 있다.
상세하게, 금속막은 하부면에서 상부면으로 뻗어나가는 줄기로부터 줄기와 상이한 방향으로 다시 나노 그레인(나노 결정립)들의 방향성 있는 응집이 이루어지며 미세 가지들이 형성된 산호 형태로 나노구조화된 것일 수 있다. 즉, 금속막은 산호초 형상일 수 있다.
금속 막은 산호 형태를 이루는 줄기간, 줄기와 줄기로부터 랜덤하게 뻗어나간 가지들 간, 가지와 가지간의 미세 공극에 의해 나노 다공성을 가질 수 있다.
금속 나노 그레인의 평균 크기는 10 내지 50nm, 구체적으로 10 내지 40nm, 보다 구체적으로 10 내지 30nm 수준일 수 있다. 미세한 금속 나노 그레인은 미세 줄기와 미세 가지를 형성할 수 있으며, 이에 의해 공극 또한 보다 미세화될 수 있다.
금속 나노 그레인의 평균 크기는 금속 막을 이루는 평균 금속 결정 크기를 의미할 수 있다. 금속 나노 그레인의 평균 크기는 금속 막의 스침 입사 X선 회절 패턴에 기반하여 쉐러 방정식을 통해 산출된 것일 수 있다.
이때, 금속 막의 하부면에서 상부면으로 갈수록 줄기의 굵기가 가늘어질 수 있으며, 줄기와 가지를 이루는 금속 나노 그레인들의 크기가 작아질 수 있다.
금속 막은 하부면을 포함하는 하부 영역에서 금속 그레인들이 연속적으로 이어져 있는 연속체일 수 있으며, 하부 영역에서 상부면을 포함하는 상부 영역으로 갈수록 미세 공극의 크기가 작아질 수 있다. 이때, 하부 영역은 금속막의 두께 t0를 기준으로 하부면에서 0.05t0 내지 0.30t0 두께까지의 영역을 의미할 수 있다.
나노 다공성과 나노 구조화에 의해 거친 표면을 가짐에 따라, 금속 막의 두께 t0는, 막의 단면을 1000배 내지 5000배의 저배율 주사전자현미경으로 관찰하여 측정된 거시적 두께를 의미할 수 있다.
나노 구조화에 의해 증진된 표면적을 가질 수 있으며, 이와 동시에 하부 영역에도 용이한 확산에 의해 목적하는 물질이 원활히 유입될 수 있도록, t0는 수 마이크로미터 오더, 구체적으로 1 내지 9μm, 보다 구체적으로 1 내지 5μm, 보다 더 구체적으로 1 내지 4μm 수준일 수 있다.
금속 막의 RMS(root-mean-square) 거칠기는 200 내지 500nm, 구체적으로 250nm 내지 450nm일 수 있다. 통상적 금속 증착에 의해 제조되는 평탄한 금속 박막이 갖는 RMS 표면 거칠기는 1~2nm 수준이다. 금속막의 현저하게 높은 RMS 거칠기는 나노 구조화와 나노 다공성에 의한 것이다. 금속 막의 RMS 거칠기는 원자력 현미경을 통해 측정된 것일 수 있으며, 적어도 5μmx5μm 이상의 영역에 대해 측정된 측정값에 기반한 것일 수 있다.
금속 막에서, 금속은 FCC 결정 구조를 가질 수 있으며, 이때, 산호초 구조를 형성하는 금속 나노 그레인은 {111}, {110} 및 {100}에서 하나 이상 선택되는 저지수면의 파셋을 가질 수 있다. 구체적으로 FCC 결정 구조를 갖는 금속 나노 그레인은 {111} 파셋, {110} 파셋, {100} 파셋 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 구체예로, 금속 막의 금속이 금(Au)인 경우, 금속 나노 그레인은 {111} 파셋, {110} 파셋 및 {100} 파셋을 모두 가질 수 있으며, 이중 {110} 파셋이 가장 풍부할 수 있다.
이때, 금속 나노 그레인의 파셋 결정면은 산성 매질 하 수행되는 네모파 전압전류법에 의해 얻어지는 전압-전류도(voltammograms)에서 산화 전류 피크의 중심 위치를 통해 결정될 수 있으며, 산화 전류 피크 값을 통해 각 파셋의 풍부함 정도가 결정될 수 있다.
금속 막의 전기화학적 표면적은, 금속막의 산성 매질 하 순환전류전압법을 이용하여 얻어진 음의 피크로부터 산출된 면적을 기하학적 면적으로 나눈 비인 거칠기 계수로 대표될 수 있다. 금속 막의 거칠기 계수는 150 이상, 180 이상 또는 200 이상일 수 있으며, 실질적으로 300 이하, 또는 250이하일 수 있다.
금속 막의 금속, 또는 금속 나노 그레인의 금속은 금속 막의 용도를 고려하여, 해당 용도에 통상적으로 사용되는 금속일 수 있다. 일 예로, 전기화학적 바이오 센싱 플랫폼의 용도를 고려할 때, 금속은 Au, Pt, Pd, Rh, Ag등을 포함하는 귀금속일 수 있다. 일 예로, 금속 막이 SERS 활성 구조(Surface-Enhanced Raman Scattering active structure)로 사용되는 SERS 센싱 플랫폼의 용도를 고려할 때, 금속은 플라즈모닉 금속, 일 예로, Au, Ag, Pt 또는 Pd등과 같은 귀금속일 수 있다.
본 발명은 상술한 금속 막을 작업 전극으로 포함하는 전기화학적 바이오센서를 포함한다.
이와 독립적으로, 본 발명은 상술한 금속 막을 SERS 활성 구조로 포함하는 표면 증강 라만 분광용 기판(substrate)을 포함한다. 금속 그레인의 응집에 의한 금속 그레인간 형성되는 나노갭 및/또는 가지나 줄기 형태로 응집된 응집체 간의 나노갭은 핫 스팟(hot-spot)을 형성할 수 있다.
상술한 금속 막은 나노구조화에 의해 증대된 표면적을 가짐과 동시에 나노 다공성에 의해 바이오 파울링이 방지된다. 이에, 금속 막이 작업 전극으로 구비되는 전기화학적 바이오센서나 금속 막이 SERS 활성 구조로 구비된 표면 증강 라만 분광용 기판은, 생체에서 얻어진 생물학적 샘플의 전처리(추출, 농축, 희석등) 없이, 소변, 혈장, 침등과 같은 액상의 생물학적 샘플 그 자체를 바로 분석하여, 질병 지표로 사용되는 생화학 물질의 존재 및 함량을 검출할 수 있다.
금속 막은 그 표면에 질병 지표로 사용되는 생화학 물질인 표적 물질과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 수용체가 결합되어, 그 표면이 수용체로 기능화된 것일 수 있다. 수용체는 복수의 관능기를 갖는 링커를 통해 금속 막에 고정될 수 있다. 링커의 관능기로 히드록시기, 카르복시, 아민기, 티올기등을 들 수 있으며, 링커는 제1관능기를 통해 금속 막과 결합하고, 제2관능기를 통해 수용체와 결합할 수 있다. 링커의 일 예로, L-시스테인등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
수용체와 표적 물질간의 특이적 결합은 이온 결합, 공유 결합, 수소 결합, 배위 결합 또는 비공유 결합에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로, 효소-기질 결합, 항원-항체 결합, 단백질-단백질 결합, DNA간의 상보적 결합, 또는 비오틴(biotin)-아비딘(avidin) 결합일 수 있다. 목적하는 표적 물질 별 표적 물질과 특이적으로 결합하는 수용체의 구체 물질들은 바이오 센싱 분야에서 이미 주지된 것이다. 일 예로, 표적 물질이 IL6등과 같은 가용성 단백질 염증 마커인 경우 기 알려지거나 시판되는 항-IL6 검출 항체등을 수용체로 사용할 수 있고, 표적 물질이 암세포 유래 세포외 소포체인 경우 기 알려진 CD9 캡처 항체등를 수용체로 사용할 수 있다.
전기화학적 바이오센서는 절연성 기재; 및 절연성 기재의 일 면에 구비된 상술한 금속 막을 포함하는 작동전극, 기준전극 및 상대전극을 포함할 수 있다. 작동전극 이외의 기준전극 및 상대전극은 단순 평면 전극일 수 있으며, 통상의 증착 공정과 리소그래피 공정으로 나노 패턴화된 미세 전극일 수 있다. 각 전극별로 외부와의 전기적 접속을 위한 패드(접속 단자)가 구비될 수 있으며, 독립적으로 전위가 인가될 수 있는 다수개의 작동전극이 구비되고, 다수개의 작동전극에 대해 공통의 단일한 기준전극과 공통의 단일한 상대전극이 구비될 수 있다. 작동전극의 크기는 작동전극과 동일한 면적을 갖는 원으로 환산한 직경 기준 100μm 내지 800μm 수준일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 절연성 기재는 유리등과 같은 비정질, 실리콘산화물이나 실리콘등과 같은 무기물, 폴리프로필렌이나 폴리에틸렌등과 같은 유기물등, 바이오센싱 분야에서 분석 플랫폼을 지지하기 위해 통상적으로 사용하는 물질이면 족하다.
작동 전극은 하기 식 1을 만족하는 방오 특성을 가질 수 있다.
(식 1)
Rct(20)/Rct(0) ≤ 1.5
식 1에서, Rct는 1%의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 용액과의 접촉시 전하 이동 저항(charge transfer Resistance)이며, Rct(0)는 접촉 직후의 전하 이동 저항, Rct(20)은 접촉 후 20시간이 흐른 시점에서의 전하 이동 저항을 의미한다. 이때, 작동 전극은 L-시스테인으로 개질된 전극일 수 있다
Rct(20)과 Rct(0)는 실질적으로 동일할 수 있다. 이때, 실질적으로 동일하다 함은 일정 시간이 지난 시점에서의 전하 이동 저항값을 기준이 되는 초기 전하 이동 저항 값으로 나눈 비가 1.5 이하, 1.4 이하, 1.3 이하, 1.2 이하, 1.1 이하 또는 측정 오차 범위 내에서 1에 이름을 의미할 수 있다.
식 1의 결과는 작동 전극으로 작용하는 금속 막이 바이오 파울링으로부터 실질적으로 자유로움을 의미한다.
이와 함께 또는 이와 독립적으로, 작동 전극(L-시스테인으로 개질된 작동 전극)은 혈장(plasma)과의 접촉이 20시간 지속된 시점에서 0.5 KΩ이하, 0.4 KΩ이하, 또는 0.3KΩ이하의 전하 이동 저항(Rct)을 가질 수 있다. 또한, 혈장과의 접촉 2시간 시점에서의 전하 이동 저항은 혈장과의 접촉 20시간 시점에서의 전하 이동 저항과 실질적으로 동일할 수 있다.
이때, 전하 이동 저항(Rct)는 페로시안화물 및 페리시안화물의 레독스 페어를 등몰 농도를 함유하는, 1%의 소 혈정 알부민(BSA Bovine Serum Albumin) 용액 또는 혈장을 매질로, 패러데이 전기화학적 임피던스 분광법을 이용하여 산출된 것일 수 있다.
작동 전극은 향상된 민감도를 가질 수 있다. 상세하게, 0 내지 50μM의 동일 몰 농도 범위로 페로시안화물/페리시안화물 레독스 페어를 함유하는 용액을 기준 용액으로 하여, 기준 용액의 농도에 따른 산화 피크 전류값(μA·mm-2)의 기울기인 민감도는 10 μAmm- 2mM- 1이상, 12 μAmm- 2mM- 1이상, 또는 14 μAmm- 2mM- 1이상일 수 있다. 산화 피크 전류값은 0.02Vs-1의 스캔 속도로 0V에서 0.6V 사이의 네모파 전압전류법(squared wave voltammetry)을 사용하여 얻어진 것일 수 있다. 이때, 작동 전극은 L-시스테인으로 개질된 전극일 수 있다
표적 물질은 암세포 유래 세포외 소포체일 수 있으며, 이때, 전기화학적 바이오센서는 암 검출을 위한 전기화학적 바이오센서일 수 있다. 검출하고자 하는 질병인 암은 전립선암을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 전기화학적 바이오센서에서 검출 가능한 질병이 암이나 전립선암으로 한정될 수 없음은 자명하며, 해당 질병의 질병 지표로 알려진 물질을 표적 물질로 설정하고, 해당 표적 물질과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 수용체를 이용하여 작동 전극을 기능화하여 해당 표적물질 검출함으로써, 해당 질병의 보유 유무를 판별할 수 있는 기초 자료를 제공할 수 있다.
본 발명은 상술한 금속 막을 작동 전극으로 포함하는 전극 부재가 위치하는 기판을 포함하는 검출 키트를 포함한다. 작동 전극을 포함하는 전극 부재가 위치하는 기판은 상술한 전기화학적 바이오센서에 대응할 수 있으며, 이에, 검출 키트는 앞서 금속 막에서 상술한 모든 내용 및 전기화학적 바이오센서에서 상술한 모든 내용을 포함한다.
본 발명에 따른 검출 키트는 생물학적 샘플에 함유된 질병 지표와 특이적으로 결합하는 캡쳐용 수용체로 기능화된 상술한 금속 막을 작동 전극(working electrode)으로 포함하며, 작동 전극을 포함하는 전극 부재가 위치하는 기판을 포함할 수 있다.
기판상, 다수개의 작동 전극이 서로 이격 배열되어 작동 전극의 어레이를 이룰 수 있으며, 어레이를 이루는 작동 전극 별로 외부와의 전기적 연결을 위한 패드(접속 단자)가 구비될 수 있다. 다수개의 작동 전극이 구비된 경우, 단일한(공통의) 상대전극과 단일한(공통의) 기준전극이 구비될 수 있다. 즉, 다수개의 작동 전극은 작동 전극과 이격 위치하는 상대전극과 기준전극을 공유할 수 있다.
필요시, 검출 키트는 패드를 포함한 전극 부재가 형성된 기판과 함께, 샌드위치 결합을 형성하기 위한 검출용 수용체가 보관된 용기를 더 포함할 수 있다. 용기는 병, 통, 봉지, 튜브, 앰플등과 같은 형태일 수 있으며, 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 기계적, 접착성, 또는 기타수단에 의해 용기에 부착되고, 필요시 외력에 의해 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 포함할 수 있다.
필요시, 검출 키트는 작동 전극(어레이를 이루는 경우, 작동 전극 각각)과 전기적으로 연결되고, 기준전극 및 상대전극 각각과 전기적으로 연결되는 연결선; 상기 연결선을 통해 기 설정된 전기 신호를 인가하고 전기 신호에 따른 전기적 반응(ex. 전류)를 검출하고, 검출된 전기적 반응을 처리하여 질병 지표의 유무나 농도 또는 질병 보유 (가능성) 여부를 산출하는 처리부; 및 전기 신호 발생을 위한 전력을 제공하는 전력원; 및 처리부에서 산출된 결과를 출력하는 출력부;등을 포함할 수 있다.
처리부에 의해 전극에 인가되는 전기 신호는 전압전류법, 구체적으로 순환 전압전류법을 수행하기 위한 전기 신호로, 설정된 전압 범위를 설정된 스캔 속도로 스캔하는 전기 신호일 수 있다. 처리부는 전기 신호의 인가와 함께, 작동 전극에서 발생하는 전기화학적 산화 전류를 검출하여, 산화 전류밀도 피크의 최대값 또는 산화 전류밀도 피크에서 피크 면적값(적분값)을 산출하고, 산출된 산화전류밀도 값(최대값이나 면적값)을 기준으로 질병 보유 유무나 질병 보유 가능성을 산출하여, 출력부에 송신할 수 있다. 이때, 산출부에는 해당 질병을 보유하지 않은 건강한 사람의 질병 지표 값(산화전류밀도 값)와 해당 질병을 보유한 환자의 질병 지표 값(산화전류밀도 값)이 기 저장되어 있을 수 있으며, 측정된 값(산화전류밀도 값)과 기 저장된 기준값들을 통해 질병 보유 유무나 질병 보유 가능성이 산출될 수 있다. 처리부에 의해 전극에 인가되는 전기 신호는 순환전압전류법을 수행하기 위한 전기 신호일 수 있으며, 상세한 내용은 후술하는 검출 방법을 참고한다. 출력부는 산출부에서 송신한 결과를 수신하여 이를 LED 패널등과 같은 디스플레이 부재등을 통해 시각적 인지 가능하도록 출력할 수 있다. 전력원은 출력부, 처리부등에 전력을 제공함과 동시에, 출력부를 통해 전극 부재에 인가되는 전기 신호의 생성을 위한 전력 또한 제공할 수 있다. 이때, 필요시 처리부는 전력원으로부터 제공된 전압(또는 전류)를 이용하여 기 설정된 전기신호로 생성할 수 있는 통상의 신호 생성 회로를 포함할 수 있음은 물론이다.
본 발명은 상술한 바이오센서를 이용한 질병 지표(바이오센서에서 상술한 표적 물질에 상응)의 검출 방법을 포함한다.
*질병 지표의 검출 방법은 질병 지표와 특이적으로 결합하는 캡쳐용 수용체(바이오센서에서 상술한 수용체에 상응)로 기능화된 바이오센서의 작동 전극에 질병 지표를 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 생물학적 샘플과 접촉한 작동전극에 검출용 수용체를 접촉시키는 단계; 및 전압전류법을 이용하여 전기화학적 산화 전류 밀도를 측정하는 단계;를 포함한다.
생물학적 샘플은 생체에서 얻어지거나 생체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미할 수 있다. 생물학적 샘플의 일 예로, 혈액(개전혈whole blood), 혈장(plasma), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)등을 들 수 있다.
생체에서 얻어진 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 눈물, 세비액, 소변, 침, 복강 세척액, 골반 내 유체액, 낭종액, 뇌척수막 액, 양수, 선액, 췌장액, 림프액, 흉수, 유두 흡인물, 기관지 흡인물, 활액, 또는 뇌척수액등과 같은 액상인 경우, 생물학적 샘플은 추출, 농축, 희석등과 같은 전처리가 수행되지 않은 상태일 수 있다.
그러나, 생체에서 얻어져 별도의 전처리가 수행되지 않은 상태로 분석될 수 있는 것은, 작동 전극이 갖는 높은 검출 민감도 및 바이오 파울링 능력에 의해 갖는 특징적 장점으로, 본 발명이 전기화학적 바이오센싱 분야에서 통상적으로 행해지는 전처리가 수행된 샘플의 분석을 배제하는 것은 아니다.
작동 전극과 접촉하는 생물학적 샘플의 양은 수(1~8) μL 수준의 극미량이면 족하며, 이 또한, 작동 전극이 갖는 높은 검출 민감도에 의해 가능한 것이다. 이때, 작동 전극 상 또는 작동 전극의 둘레를 따라 수 μL 수준의 극미량의 생물학적 샘플이 담길 수 있는 웰이 결합될 수 있음은 물론이다.
검출용 수용체는 질병 지표와 결합된 캡쳐용 수용체 또는 캡쳐용 수용체에 결합된 질병 지표와 특이적으로 결합하는 수용체일 수 있다. 검출용 수용체는 효소가 결합된 수용체일 수 있으며, 질병 지표와 특이적으로 결합하는 1차 검출용 수용체 및 1차 검출용 수용체와 특이적으로 결합하는 2차 검출용 수용체를 포함할 수 있다. 검출용 수용체는 구체 질병 지표를 고려하여, 해당 질병 지표의 검출을 위해 통상적으로 사용하는 수용체를 사용하면 족하다. 일 예로, 질병 지표가 암세포 유래 세포외 소포체인 경우 검출용 수용체로 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)등을 들 수 있다. 구체 질병 지표, 구체 검출용 수용체, 구체 캡처용 수용체에 따른 특이적 결합 종류를 고려하여, 검출용 수용체나 캡처용 수용체는 기능화된 상태일 수 있다. 기능화의 일 예로, 비오틴화나 아비딘화등을 등을 들 수 있다. 필요시, 캡쳐용 수용체나 검출용 수용체는, 전기화학적 바이오센서 분야에서 전기화학적 산화 또는 환원을 용이하게 발생시키기 위해 사용되는 통상의 효소가 결합된 것일 수 있다.
전압전류법, 구체적으로 순환 전압전류법을 이용하여 작동 전극에서 발생하는 전기화학적 산화 전류밀도를 측정함으로써, 목적하는 질병 지표를 검출할 수 있으며, 기 확보된 질병 보유자의 질병 지표 검출 값이나, 기 확보된 질병 지표 농도에 따른 전기화학적 산화 전류 밀도값을 이용하여, 질병 보유 여부를 판별할 수 있는 판별 기준이 제공될 수 있다.
상세하게, 순환 전압전류법은 일정 전압 윈도우로 전압을 스캔하여 수행될 수 있다. 일 예로, 순환 전압전류법은 개방회로 전위 대비 -0.5~0.5V 범위에서 0.05 내지 0.5Vs-1의 스캔 속도로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전기화학적 산화 전류 밀도는 산화 전류밀도 피크의 최대값 또는 산화 전류밀도 피크에서 피크 면적값(적분값)을 의미할 수 있다.
본 발명의 전기화학적 바이오센서, 검출 키트 또는 검출 방법에서, 작동 전극이 반드시 질병 지표(표적 물질)과 특이적으로 결합하는 수용체로 기능화되어야만 하는 것은 아니다. 알려진 바와 같이, 작동 전극에 질병 지표(표적 물질)이 결합하고 작동 전극에 결합된 질병 지표에 수용체가 결합하는 직접적(direct) 검출 또한 가능하며, 상술한 바와 같이, 수용체와 질병 지표(표적 물질)간의 샌드위치 결합을 통한 비직접적(indirect) 검출 또한 가능함은 물론이다. 당업자라면 ELISA를 통해 알려진 표적 물질과 수용체간의 결합과 검출 방식(직접적 검출, 비직접적 검출등)을 본 발명의 전기화학적 바이오센서, 검출 키트 또는 검출 방법에 용이하게 응용 및 적용할 수 있다.
상술한 전기화학적 바이오센서, 검출 키트 또는 검출 방법은 암 검출용일 수 있다. 암 검출용 전기화학적 바이오센서, 검출 키트 또는 검출 방법에서, 질병 지표는 암세포 유래 세포외 소포체일 수 있고, 캡처용 수용체는 CD9, 검출용 수용체는 EpCAM일 수 있으며, 생물학적 샘플은 소변 또는 혈장일 수 있다. 암 검출용 전기화학적 바이오센서, 검출 키트 또는 검출 방법에서, 수신자 조작 특성값(AUC)은 0.90 이상일 수 있다. 이때, 암은 전립선 암을 포함할 수 있다.
본 발명은 상술한 금속 막의 제조방법을 포함한다.
본 발명에 따른 금속 막의 제조방법은 평면 금속막인 베이스 금속막과 양이온성 계면활성제, 염소 소스 및 베이스 금속막의 금속과 동종의 금속을 함유하는 금속전구체를 포함하는 시딩 용액을 접촉시키고, 하기 조건의 스텝 시간대전류법(step chronoamperometry)을 이용하여 베이스 금속막을 나노구조화 및 나노다공화하는 단계;를 포함한다.
(조건)
전압 인가시 단위 사이클(스텝 전압) : 양의 전압(V+)과 음의 전압(V-)의 순차적 인가
V+ 크기 및 V+ 인가 시간(t+): 1.0 내지 1.5V 및 0.5 내지 3msec
V- 크기 및 V- 인가 시간(t-) : -1.0 내지 -1.5V 및 0.8t+ 내지 3t+
단위 사이클 반복 횟수 : 10,000 내지 30,000회, 구체적으로 15,000 내지 25,000회
스텝 시간대전류법 수행시, 단위 사이클(스텝 전압)에서는 염소 이온의 흡착-금속 막의 비 등방적 금속 에칭(산화)-비 등방적 금속 이온의 환원이 발생하며, 단위 사이클이 반복되며, 비 등방적 에칭과 비 등방적 금속 이온의 환원이 반복적으로 이루어져 최종적으로 상술한 산호초 형태의 금속막이 제조될 수 있다.
상세하게, 시딩 용액 내 양이온성 계면활성제에 의해 베이스 금속막에는 패시베이션 층이 형성될 수 있다. 페이베이션 층은 염소 이온이 주로 우선적 흡착 장소에 흡착되는 것을 돕고 금속 이온의 환원시 불균질한 핵생성 장소 제공을 돕는다.
시간대전류법 수행시, 양이온성 계면활성제의 패시베이션 층이 형성된 금속 막에 염소 소스로부터 제공되는 염소 이온이 금속 막의 우선적 흡착 사이트(킹크, 공공등의 표면 결함 사이트)에 흡착되고, 우선적 흡착 사이트에 주로 흡착된 염소 도움으로 베이스 금속막의 표면이 전기 산화되어, 비 등방적으로 에칭된다. 이후 인가되는 전위의 극성이 달라지며 금속전구체의 금속 이온이 금속으로 환원되고, 전기 산화에 의해 금속 막 표면에 형성된 크레바스(crevasses)가 우선적 핵 생성 장소로 작용하며 비 등방적 핵생성이 발생한다. 전압 스텝의 인가가 반복될수록 비 등방적 전기 산화와 비 등방적 전기 환원에 의한 비균질성이 커지며 베이스 금속막의 나노 구조화와 나노 다공화가 동시에 이루어지게 된다. 또한, 전기 산화와 전기 환원은 금속 막 표면에서 발생하는 표면 반응이며, 반응에 요구되는 물질 확산이 전제되어야 하고, 전압 스텝의 인가가 반복되며 표면 금속 입자들의 응집체가 시딩 용액 쪽으로 성장해 나가는 형태를 가진다. 이에 따라 나노 다공화 및 나노 구조화된 금속 막은 막의 두께 방향으로 뻗어나가는 줄기 형태, 구체적으로 산호초 형태를 갖게 된다.
양이온성 계면활성제는 4급 암모늄염일 수 있으며, 4급 암모늄염은 에스테르를 포함하는 4급 암모늄염(EQ; ester-containing quaternary ammonium salt)이나 아미드 및 에스테르를 포함하는 4급 암모늄염(amide group and ester group in Quaternary Ammonium salts)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 4급 암모늄염은 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride, CTAC), 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide, DTAB), 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)등과 같은 C12 이상의 탄화수소 체인을 갖는 지방족 암모늄 염일 수 있다. 이때, 4급 암모늄염의 음이온이 CTAC와 같이 염소인 경우 계면활성제에 의해서도 염소가 공급될 수 있어 유리하다.
금속전구체는 금속 막과 동종의 금속을 함유하는 함염소화합물일 수 있다. 일 예로, 금속 막이 금 막인 경우 금속 전구체는 금 전구체일 수 있고, 염화금산칼륨(KAuCl4), 염화금산나트륨(NaAuCl4), 염화금산(HAuCl4), 염화금(AuCl), 염화금(Ⅲ)(AuCl3)등과 같은 염소를 함유하는 금 전구체일 수 있다. 실질적으로, 금속전구체는 전기 산화시 생성되는 에칭 산물을 함유하는 화합물일 수 있다. 일 예로, 금속 막이 금 막인 경우, 에칭 산물은 AuCl4 - 수 있고, 금 전구체는 염화금산칼륨, 염화금산나트륨, 염화금산(HAuCl4)등과 같이 AuCl4 -를 함유하는 화합물일 수 있다.
스텝 전압이 반복적으로 인가되며 원활한 나노 구조화가 발생하고 바이오 파울링이 억제되는 나노 다공화가 금속막 전체적으로 균질하게 발생할 수 있도록, 시딩 용액에 함유된 양이온성 계면활성제 : 염소 소스 : 금속전구체의 몰비는 1 : 1 내지 3 : 0.001 내지 0.1 수준일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상술한 조건으로 스텝 시간대전류법이 수행된 후, 또는 마지막으로 인가되는 단위 사이클의 음의 전압 인가시, 금속막에 -1.0 내지 -1.5V의 전압이 5 내지 30sec 동안 인가되며, 전기 환원이 수행될 수 있다. 이러한 전기 환원에 의해 나노 구조화되고 나노 다공화된 금속막이 안정적으로 금속 표면을 제공할 수 있다.
염소 이온종을 함유하는 물의 전기분해가 발생하지 않는 범위에, 표준환원전위가 위치하는 금속이라면, 상술한 시딩 용액과 스텝 시간대전류법을 이용한 나노 구조화 및 나노 다공화가 이루어질 수 있다. 이러한 금속의 실질적인 예로, 구리(Cu), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh), 금(Au)등을 들 수 있다.
이하, 인체에 무해하고, 우수한 전기촉매 특성을 가져 전기화학적 센싱 분야에서 주목받고 있으며, 플라즈모닉 특성을 갖는 대표적 금속인 금을 대상으로, 금 박막의 나노 다공화 및 나노 구조화의 예를 제공하나, 금속 막의 물질이 대상이 단지 금으로 한정될 수 없음은 물론이다.
평면 전극이 구비된 칩 제조
평면(planar) 전극을 4인치 소다-라임 유리 웨이퍼 상에 표준 리소그래피 공정을 사용하여 클린룸에서 제작하였으며, 4개의 작업 전극을 포함하는 44개의 칩(1.5 x 0.9mm)을 제조하였다.
먼저, 전자빔 증착법(FC-2000, Temescal)으로 20nm의 티타늄과 400nm의 금을 증착하였다. 스핀 코팅(4000rpm, 500rpms-1, 1분)을 통해 1.3μm 두께의 포토레지스트(AZㄾ 5214 E, MicroChemicals GmbH)를 도포하고, 핫 플레이트(105℃에서 90초)로 용매를 증발시켰다. 이후 블랭크 유리에 부착된 Mylar 마스크(Advance Reproductions, USA)를 사용하여 마스크 얼라이너(MA/BA6, SUSS MicroTec Korea Co. Ltd.)(h-line 405 nm, 90 mJcm- 2)에서 노광하고, 포토레지스트를 현상(AZㄾ MIF 326, MicroChemicals GmbH)하여 패턴을 전사하였다. 이후 노출된 금층을 금 에천트(cat# 651818-500ML, Sigma-Aldrich)로 1분간 식각하고, 완충 산화물 에칭제(BOE 7:1, MicroChemicals GmbH)로 40초 동안 처리하여 티타늄층을 벗겨냈다. 이후, 잔류하는 포지티브 포토레지스트를 이소프로필알코올로 제거하고, 웨이퍼에 2μm 두께의 포토레지스트(SU-8 2002, K1 Solution)를 스핀코팅(3000rpm, 500rpms-1, 1min)하였다. 네거티브 포토레지스트의 프리-베이킹(65℃에서 1.5분 및 95℃에서 3분) 후, 웨이퍼를 마스크 정렬기(i-라인 365nm, 120mJcm-2)에 노출시키고, 현상(SU-8 현상액, K1 솔루션) 전, 전기 접점을 열고 전극의 감지 영역을 제한하기 위해, 신속하게 포스트-베이킹(65℃에서 1.5분 및 95℃에서 1.5분)을 수행하였다. 마지막으로 칩을 이소프로필 알코올로 세척하고 네거티브 포토레지스트를 하드-베이크(180℃에서 3시간)하여 추가로 경화시켰다. 다이싱 동안 칩을 보호하고 보관 중에 칩을 깨끗하게 유지하기 위해 포지티브 포토레지스트 보호 층을 스핀 코팅하였으며, 사용 전, 칩을 아세톤으로 헹구고 0.5mbar 및 50mW의 O2 플라즈마(Cute, Femto Science)에서 2분 동안 클리닝하였다.
작동 전극의 나노구조화
시딩 용액을 제조하기 위해, 222mM 염화나트륨 스톡 용액 밀리리터당 36mg의 CTAC(TCI, cat# H0082, lot# 4LL50-MN)를 용해시켰다. 이후 제조된 용액을 염화금산 10mM 액(스톡은 4℃에서 암소에 보관)과 혼합하여, 최종적으로 CTAC 100mM, NaCl 200mM 및 HAuCl4 1mM의 농도를 갖는 시딩 용액을 제조하였다. 제조된 용액은 실온의 암실에 보관되었다.
포토리소그래피를 이용하여 제조된 금 작동 전극에 10 μL의 시딩 용액을 부가하고, 스텝 전압(step voltage)의 20,000 사이클 및 1ms 동안 1.2V 인가 후 2ms 동안 -1.2V 인가의 스텝 전압으로 구성된 스텝 시간대전류법(step chronoamperometry)을 수행한 후, 마지막으로, -1.2V에서 10초 동안 시간대전류법 단계를 인가하여, 나노구조화된 전극(이하, NSG 전극)을 제조하였다.
전기화학적 설정 및 측정
모든 전기화학적 프로세스 및 측정은, 외부 백금 와이어를 상대 전극으로 사용하고 누출이 방지된 소형 Ag/AgCl 전극(cat# 544 ET072-1, Qrins)을 기준전극으로 사용한 3-전극 구성을 이용하여, potentiostat-galvanostat EC-Lab(저전류 옵션이 있는 VSP 모델, BioLogic, France)에서 수행되었다. 작동전극으로 포토리소그래피를 이용하여 제조된 원형 금 전극(Φ = 0.45mm, 도 2 왼쪽) 또는 시딩 용액을 이용하여 나노구조화된 원형 금 전극(도 2 오른쪽)을 사용하였다.
포토리소그래피를 이용하여 제조된 원형 금 전극의 경우, 레이저 절단된 양면 접착 테이프(DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95, FLEXcon)를 이용하여, 전극에서 샘플 배양을 위한 5-10μL의 리저버를 형성하였다.
전기화학적 표면적
전극은 0.1Vs-1의 스캔 속도로 H2SO4 0.5M의 산성 용액에서 0V에서 1.6-1.8V까지 순환전류전압법(CV, Cyclic voltammetry)에 의해 스캔되었으며, 약 0.9V에서의 환원 곡선 아래의 면적(전하)을 누적(integration)하였다. 음극 피크(cathodic peak)는 환원된 금의 양에 비례하였으며, 이에 따라 전극의 표면적에 비례하였다. 문헌에 따라, 400 μCcm-2의 비 전하 이동(specific charge transfer)을 가정하여 전극 면적을 산출하고, 이를 기하학적 영역과 비교하여 거칠기 계수(roughness factor)를 산출하였다.
표면 및 토포그래피(topography) 특성
전극 표면의 토포그래픽 특성은 SEM(S-4800, Hitachi High-Technologies) 및 AFM(DI-3100, Veeco)을 사용하여 수행되었다. SEM 관찰 전, 스퍼터 코팅을 이용하여 샘플에 5nm 금층을 코팅하였다. 이미징은 7kV의 가속 전압 및 3-4mm 작동 거리에서 수행되었다. NSG 전극 거칠기 및 형태는 반경 곡률이 10 nm 미만이고 알루미늄 반사 코팅(300AL-G-10, Woomyoung Inc.)을 갖는 실리콘 AFM 팁을 사용하여 비접촉 탭핑 모드의 AFM(atomic force microscope)을 이용하여 수행되었다.
접촉각 측정
표면 에너지 분석은 수 접촉각 측정을 통해 수행되었다. 샘플 표면에 1μL의 물방울을 떨어뜨리고 이미지를 즉시 기록하였다. 이미지는 ImageJ 1.53e로 분석되었으며, 7점 수동 선택 절차를 사용하여 액적의 모양을 구로 근사하였다. 접촉각은 다음 공식:
Figure PCTKR2022007937-appb-img-000001
을 사용하여 계산되었다. θ=접촉각(rad), h=액적의 높이, l=액적 베이스의 길이
X-선 회절을 이용한 결정 크기 측정
'평면 전극이 구비된 칩 제조' 공정과 유사하게, 유리 웨이퍼상 Ti/Au(20/400 nm)를 증착한 후, 다이싱하여 칩(1cm x 1.5cm)을 제조하고, 4mm 정사각형의 측면 개구부가 있는 접착 테이프를 표면에 부착하여 작업 전극 영역을 규정하였다. '작동 전극의 나노구조화'와 동일한 공정을 이용하여 X-선 회절용 NSG 전극을 제조하였다.
Cu Kα(1+2) 소스를 사용한 스침각 X-선 회절(grazing incidence X-ray diffraction, ruker D8 Discovery)을 통해 샘플을 분석하였으며, 입사각 ω는 1°°, 2θ 범위는 30°- 80°였다.
결정 크기(crystallite size)는 Au(220) 피크의 FWHM(full width at half maximum)과 쉐러 방정식을 사용하여 산출되었다. 쉐러 방정식 :
Figure PCTKR2022007937-appb-img-000002
, 이때, τ=결정 도메인의 평균 크기, K= 무차원 형상 계수(0.94), λ=X-선 파장(1.5418Å), β=라인 브로드닝(rad), θ=브래그 각도(°)
금 결정면의 전기화학적 관찰
'작동 전극의 나노구조화'에서 수행된 공정과 동일하되, 산화 전압으로 1.20V, 1.25V 또는 1.3V를 사용하고, 필요시 마지막에 수행되는 -1.2V에서 10초 동안의 환원 단계를 생략(환원 단계가 생략된 샘플은 *로 표시)하여 NSG 전극의 금 결정면을 분석하기 위한 추가 NSG 전극을 제조하였다.
NSG 전극에서 금 결정면(crystalline gold faces) 형성의 관찰은 0.02 Vs-1의 스캔 속도로 0 V에서 1.3 V까지 스캔하는 네모파 전압전류법(squared wave voltammetry)(펄스 높이 30 mV, 펄스 너비 100ms, 스텝 높이 4mV)를 이용하여 H2SO4 0.5 M의 산성 매질에서 수행되었다.
전극 기능화
일정한 진탕 하, 전극 칩을 L-시스테인(L-cysteine) 10mM의 용액에 24시간 동안 담그고, 초순수로 린싱하였다. 인산완충생리식염수(PBS pH=8) 내 2.5% 글루타르알데히드 용액을 칩 표면에 드롭-캐스팅하고 30분 동안 인큐베이션한 후 칩을 린싱 및 건조하였다.
PBS 중 20 μgmL-1의 항-IL6(Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263, lot# 172402) 또는 항-CD9(BD Pharmingen, cat# 555370, lot# 9014503) 용액을 준비하고, 속 빈 세라믹 바늘을 이용하여 전극에 도포하고, 4 ℃의 물-포화 분위기에서 밤새 배양하였다. 인큐베이션 후, 전극을 30분 동안 쉐이커에서 PBS Tween 20 0.05%로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다.
이후, HCl을 사용하여 pH 7.4로 조정된 PBS 중 1M 에탄올아민(Sigma-Aldrich, cat# E9508) 10μL를 각 전극에 드롭 캐스트하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 미반응 모이어티를 중화시켰다. 마지막으로, 칩을 사용하기 전, 칩은 실온에서 1% BSA로 1시간 동안 인큐베이션되었다.
NSG 전극의 생물학적 오염(biofouling) 거동
NSG 전극(L-시스테인으로 개질된 전극) 표면의 생물학적 오염 거동은 패러데이 전기화학적 임피던스 분광법을 이용하여 분석되었다. 패러데이 전기화학적 임피던스 분광시, 페로시안화물 K4Fe(CN)6 및 페리시안화물 K3Fe(CN)6을 2.5mM의 등몰 농도를 함유하는, 1%의 소 혈정 알부민(BSA Bovine Serum Albumin) 또는 인간 혈장(human plasma)의 서로 다른 두 종류의 매질(media)을 사용하였다. 측정은 개방 회로 전위에 대해(vs. open circuit potential) 5mV의 진폭으로 0.1MHz에서 0.1Hz까지 수행되었다. NSG 전극의 Rct는 도 1에 도시된 나이퀴스트(Nyquist) 등가 회로를 이용하여 산출되었다. 도 1의 등가회로에서, RS는 용액의 저항을, 정위상 요소(비-이상적 커패시턴스, constant phase element, CPE)는 이중층 커패시턴스(Cdl)를 모델링하는 데 사용되었으며, 병렬 로 연결된 Rct 및 Warburg 요소(ZW)는 용액에서 전기 활성 종의 확산을 모델링하는데 사용되었다.
레독스 분자(redox molecules)의 전기화학적 검출
NSG 전극(L-시스테인으로 개질된 전극)의 전기화학적 산화환원 특성을 살피기 위해, 레독스 페어로 동일 몰 농도의 페로시안화물 K4Fe(CN)6 및 페리시안화물 K3Fe(CN)6을 사용하였다. 상이한 농도(50, 25, 5, 2.5, 0.5, 0.25, 0.05, 0.025, 0.005, 0.0025 및 0mM)를 갖는 페로시안화물/페리시안화물의 전기화학적 검출은 0.02Vs-1의 스캔 속도로 0V에서 0.6V 사이의 네모파 전압전류법(squared wave voltammetry)을 사용하여 수행되었다. 네모파 전압전류법에서, 펄스 높이는 30mV, 펄스 폭은 100ms, 스텝 높이는 4mV였으며, NSG 전극의 대조군으로 평면 금 전극(나노 구조화 전 포토리소그래피 공정으로 제조된 전극)을 사용하였다.
LNCaP 암세포의 세포 배양, 세포외 소포체(EV; Extracellular Vesicles) 분리/농축, 및 EV 표준
표준용 EV는 LNCaP 세포 상층액에서 추출되었고, 20nm 양극 산화 알루미늄 멤브레인 필터를 포함하는 디스크 내부의 원심력 여과에 의해 농축되었다. LNCaP 세포는 ATCC에서 얻었고 5% Exo-Free FBS(Systems Biosciences, Inc.) 및 1% 항생제/항진균제가 보충된 Roswell Park 673 Memorial Institute 배지(Gibco, Thermo Fisher Scientific)에서 배양되었고, 37℃ 온도 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션되었다. 세포 배양 상층액을 채취하여 300xg에서 10분간 원심분리하고, 2000xg에서 15분간 원심분리하여 죽은 세포와 세포 잔해물을 완전히 제거하였다. 상층액은 450 nm 필터를 통해 여과되었다.
분리 및 농축된 EV를 사용하여 EV 표준을 준비했다. EV는 나노입자 추적 분석(Nanosight NS500, Malvern Instruments)에 의해 입자 수를 측정하기 위해 PBS에서 재구성되었고, 보정 곡선을 준비하기 위해, 다양한 희석율로 PBS 또는 인간 혈장 샘플에 스파이킹되었다.
임상 샘플
암환자의 생체시료 및 데이터는 한국바이오뱅크네트워크 회원인 부산대학교병원 바이오뱅크에서 제공받았다. 연구 프로토콜은 부산대학교병원 IRB(IRB 1802-004-063)의 검토 및 승인을 받았다. 건강한 기증자의 혈장 샘플은 영남대학교 의료원의 자원 봉사자로부터 얻었다(IRB 2018-04-011). 모든 피험자로부터 서면 동의를 받은 후 생체 표본을 수집했다. 샘플 수집 2시간 이내에, 소변을 4℃에서 10분 동안 500xg로 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 분석시 소변 샘플을 해동하고 4℃에서 15분 동안 2500xg에서 원심분리하고 침전된 펠렛을 제거했다. 각각 3mL의 혈액 샘플은 진공 EDTA 수집 튜브로 수집되었고, 수집 2시간 이내에 처리되었다. 혈액 샘플은 300xg에서 10분 동안 및 2000xg에서 10분 동안, 4℃에서 원심분리하여 세포와 파편을 제거하고, 사용전까지 -80℃에서 보관하였다.
NSG 전극을 사용한 전기화학적 효소 샌드위치 검출
IL6 검출 에세이에 사용된 시약, 희석액 및 세척 단계는 모두 에세이 완충액(PBS 중 1% BSA 및 0.05% Tween 20)에서 수행되었다.
IL6(Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263)을 PBS 및 인간 혈장에 다양한 농도로 스파이킹하고, 20 μL을 전극 칩에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 비오틴화된 항-IL6 검출 항체(Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263)를 1μg mL-1로 희석하고 전극 칩에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 에세이를 완료하기 위해, 겨자무과산화효소(HRP; horseradish peroxidase)-스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific, cat# CHC1263)을 에세이 완충액으로 1:400으로 희석하고 30분 동안 인큐베이션했다. HRP 멤브레인 서브스트레이트(Enhanced One-Component HRP Membrane Substrate, Sigma-Aldrich, cat# T9455)(침전된 전기활성 시약, Precipitating TMB)를 칩에서 1분 동안 인큐베이션했다. 상술한 각 단계에서 단계가 수행된 후, 전극 칩을 에세이 완충액이 있는 쉐이킹 페트리 접시에서 15분 동안 세척하였다.
전극 칩은 칩의 내부에 구비된 상대 전극 및 기준 전극(의사 기준전극)을 사용하여 개방 회로 전위 대(vs. open circuit potential) -0.5와 0.5V의 전압 범위에서 0.1Vs-1의 스캔 속도로 순환 전압 전류법에 의해 개별적으로 조사되었다. 다른 보정 곡선은 혈장 대신 PBS에서 IL6을 스파이크하고 비교를 위해 편평한 리소그래피 금 전극 칩(나노구조화되지 않은 전극 칩, 평면 전극으로도 통칭)을 사용하여 얻어졌다.
세포 배양 배지 및 혈장에서 EV를 검출하기 위해, CD9 캡처 항체 및 비오틴화된 CD9(Abcam, monoclonal, clone# MEM-61, cat# ab28094, lot# GR280437-1) 1μgmL-1, 검출 항체로 비오틴화 CD81(LSBio, cat# LS-C134650, clone# 1.3.3.22) 1μgmL-1 또는 비오틴화된 EpCAM(R&D Systems, cat# DY960, lot#1336382) 1μgmL- 1를 사용하여 동일한 에세이로 EV를 검출하였다. Tween 20은 분석 중 EV의 지질막이 파괴되는 것을 방지하기 위해 에세이에서 완전히 제거되었다. 표준은 LNCaP 세포 배양 상청액에서 추출한 농축 EV 샘플을 희석하거나 다양한 희석액으로 인간 혈장에 스파이킹하여 준비하였다.
건강한 기증자 및 전립선암 환자의 임상 소변 및 혈장 샘플은 어떠한 전처리 없이, 샘플을 칩에서 직접 배양하여 동일한 방식으로 분석하였다.
효소 면역 분석법(ELISA)
ELISA는 96웰 플레이트(cat# 3364, Corning)에서 수행되었다. 모든 볼륨은 각 단계 후에 PBS 내 0.1% BSA 200 μL로 두 번 세척되었다. 먼저, 4μgmL-1의 항-CD9 항체(BD Biosciences, cat# 555370, 클론 M-L13) 50μL를 4℃에서 밤새 배양하였다. 200 μL의 1% BSA로 3시간 동안 블록킹한 후, 50 μL의 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 500ngmL-1의 비오틴화된 항-CD9(Abcam, cat# ab28094) 50μL 또는 항-EpCAM(R&D 시스템, cat# DY960)을 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 50 μL의 HRP-스트렙타비딘(0.1% BSA에 1:500으로 희석)을 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 정지 용액을 첨가한 후, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다(Infinite 200 PRO NanoQuant Microplate Readers from Tecan, Tecan).
통계 분석
통계 분석은 Prism 9.1.0(GraphPad)으로 수행되었다. 각각 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001의 p-값과 함께, α = 0.05(신뢰 수준 95%)는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 도 22 및 도 23에 표시된 데이터는 양측 언페어드 모수 웰치 t 테스트(two-tailed unpaired parametric Welch's t-test)로 분석되었다. confidence interval을 계산하기 위해 Wilson/Brown 방법을 사용하여 ROC 곡선(도 24)을 구성하였다.
도 2는 제조된 전극 칩을 관찰한 광학 사진으로, 센서 칩에 4개의 작업 전극(W)이 구비되는 경우이다. 도 2의 광학사진에서 오른쪽 상부에 삽입된 도면은 광학사진에서 사각으로 표시된 부분을 확대 관찰한 사진이다. 도 2의 예는 원형의 작업전극(W), 원형의 작업전극(W)과 일정거리 이격되어 작업전극(W) 둘레를 감싸는 링 형태의 기준전극(R), 기준전극(R)과 일정거리 이격되어 기준전극(R)의 둘레를 감싸는 상대전극(C)이 동심 구조를 이루는 형태이다. 이때, 작업전극(W) 각각은 외부와의 전기적 연결을 위한 패드와 연결되었으며, 각 기준전극(R)들은 서로 전기적으로 연결되어 단일한 패드와 연결되었고, 상대전극(C)들 또한 서로 전기적으로 연결되어 단일한 패드와 연결되었다.
도 3은 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 다양한 용액 하 측정된 양극(anodic) 전류(만)을 도시한 도면이다. 상세하게, 'NaCl+CTA+HAuCl4'는 제조된 시딩 용액을 이용한 예이며, 'NaCl+CTA'는 시딩 용액에서 염화금산을 제외한 용액을 이용한 예이고, 'NaCl+HAuCl4'는 시딩 용액에서 계면활성제를 제외한 용액을 이용한 예이며, 'CTA+HAuCl4'는 시딩 용액에서 염화나트륨을 제외한 용액을 이용한 예이고, '1-component'는 NaCl 단독, CTA 단독 또는 HAuCl4 단독을 함유하는 용액을 이용한 예이다.
편평한 전극에서 금을 전기 산화하고 에칭하기 위해 염소를 함유하는 염화나트륨을 사용하였으며, 전기 환원 동안 금의 핵생성 및 성장을 도모하되, 우선적인 성장 방향을 통제하기 위해, 금 전구체와 계면활성제를 사용하였다.
스텝 시간대전류법이 수행되며 금의 전기 산화와 전기 환원에 의한 양극 전류와 음극 전류가 발생하였다. 시딩 용액을 사용한 경우, 산화 및 환원에 의한 전류가 시간에 따라 증가하되, 1분 이내에 안정적인 전류에 도달함을 알 수 있다. 양극 전류는 사용 가능한 전기 활성 영역과 관련이 있으며, 시간에 따른 전류의 증가는 나노구조의 성장을 나타낸다. 금전구체와 계면활성제 및 염화물염 모두를 함유하는 시딩 용액에서 금의 전기 산화와 전기 환원이 반복되며 나노 구조가 활발히 발달함을 알 수 있으며, 이는 금전구체와 계면활성제 및 염화물염의 세 가지 구성 요소 중 하나 또는 두 개만 포함하는 용액에서는 관찰되지 않는 과정이었다.
도 4는 나노구조화 전(왼쪽)/후(오른쪽)의 작동 전극을 관찰한 사진으로, 스케일 바의 크기는 250μm이다. 도 4를 통해 알 수 있듯이, 제조된 NSG 전극은 나노구조와 및 나노다공화에 의해 균질하게 어두운 착색을 나타내었다.
도 5는 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 스텝 전압의 반복 횟수에 따른 금 전극 표면을 관찰한 주사전자현미경 관찰 사진(스케일 바 = 1μm)이다. 도 6은 스텝 시간대전류법을 이용한 금 전극의 나노구조화시, 스텝 전압의 반복 횟수에 따른 금 전극의 단면을 관찰한 주사전자현미경 관찰 사진(스케일 바 = 2μm)이다. 도 7은 20,000회(60sec)의 스텝 전압이 인가되어 제조된 NSG 전극 표면을 배율을 달리하며 관찰한 주사전자현미경 사진으로, 각 사진 상부에 표시된 x숫자는 해당 사진의 배율을 의미한다. 고배율 사진(x150,000)에서 저배율 사진(x1000) 순으로 스케일 바는 300nm, 500nm, 1μm, 5μm, 10μm 및 50μm이다.
미세구조를 살피면, 나노구조화전 증착에 의해 형성된 편평한 막 형태의 금 전극은 금 그레인들로 이루어진 다결정체였다. 이러한 다결정체의 입계(grain boundary)는 우선적인 에칭 사이트로 작용하여 금 전극의 전기 산화에 의한 에칭시 큰 크레바스(crevasses)가 형성되며, 이러한 큰 크레바스는 금 전극의 전기 환원시 우선적인 핵생성 장소로 작용한다.
이러한 전기 산화 및 전기 환원이 매우 빠르게 반복되며, 도 5 내지 6에 도시한 바와 같이 금 나노전극의 나노 구조화 및 나노 다공화가 진행됨을 알 수 있다.
또한, 도 5 내지 도 7을 통해, 스텝 시간대전류법이 완료되었을 때, 최종적으로 금 그레인들이 랜덤하게 응집되되 전극의 두께 방향으로 줄기가 뻗어진 산호초 형태로 나노구조화되고 산호초 형태의 금 그레인 응집체들간의 빈 공간에 의해 나노다공화된 금 전극(NSG 전극)이 제조됨을 알 수 있다. 또한 도 7의 저배율-고배율 SEM 관찰을 통해 이러한 나노 구조화 및 나노 다공화가 전극 표면 전체에서 균질하게 발생함을 확인하였다.
NSG 전극 표면에 대한 주사전자현미경 관찰 사진을 통해, 산호초 형태의 응집을 이루는 금 그레인들(금 결정들)의 평균 크기가 약 20nm 수준임을 확인하였다. 또한, 금의 전기 산화 및 전기 환원은 전극의 표면 반응임에 따라, 기재와 접하는 전극의 바닥면을 포함한 하부 영역은 나노구조화 및 나노다공화 후에도 연속적인 막 형태를 유지함을 알 수 있다.
도 8은 금 전극의 나노 구조화 전(왼쪽)/ 후(오른쪽) 원자력 현미경(AFM) 토포그래피 이미지이다(스케일 바 = 1μm). AFM을 이용하여 측정된 rms(root-mean-square) 거칠기는, 나노구조화 전 편평한 금 전극의 경우 1.2±0.3nm였으며, NSG 전극의 경우 340±90nm로, 나노구조화에 의해 표면 거칠기가 극도로 크게 증가함을 확인하였다. 극도로 증가된 표면 거칠기에 의해 NSG 전극은 소수성 특성을 나타내었다.
도 9는 나노구조화 전 편평한 금 전극(Au), NSG 전극(NSG), 전극 기능화를 통해 L-시스테인으로 개질된 NSG 전극(NSG-Cys), 전극 기능화를 통해 L-시스테인 및 항체로 기능화된 NSG 전극(NSG-Cys-Ab)의 접촉각을 측정 도시한 도면이다. Au, NSG, NSG-Cys, NSG-Cys-Ab의 접촉각은 순차적으로 72°°, 105°, 39°, 43°였다. 편평한 금 박막 상태에서 72°의 접촉각을 갖던 전극이, 증가된 표면 거칠기에 의해 105°로 소수성이 증가하고, 다시 L-시스테인이나 항체로 기능화되며 친수화(39°, 43°)됨을 알 수 있다.
도 10은 시딩 용액과 스텝 시간대전류법을 이용한 전극의 나노구조화 기작을 나타낸 모식도이며, 도 11은 나노구조화 기작을 살피기 위해, 작업전극에 전압을 일정 속도로 주사하며 이에 따른 전류의 변화를 측정한 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)이다. 도 10에서, 바이레이어 형성 단계(①), 염소 흡착에 의한 에드레이어 형성 단계(②), 전극 에칭 단계(③) 및 금 환원 단계(④)를 모식도로 나타내었으며, 도 11에서 사이클 반복 횟수(1~20회)에 따른 전압-전류밀도 그래프에 각 단계를 같이 도시하였다.
도 10에 도시한 바와 같이, 양이온성 계면활성제는 금 박막의 표면에 흡착되며, 전극 표면을 전기적으로 부동태화(passivation)하는 조밀하고 균질한 바이레이어(bilayer)를 형성한다(①). 이와 함께, 용액 내 양이온성 계면활성제는 염화금산과 배위하는 미셀을 형성할 수 있다. 이후 양 전위 인가시 전기화학적으로 유도된 흡착에 의해 염소(chloride) 에드레이어(adlayer)가 형성된다(②). 이때 염소는 전극 표면에서의 스텝 에지(step edges)이나 킹크(kink), 공공(vacancies)등과 같이 우선적 흡착 장소에 흡착되어 에드레이어를 형성할 수 있다. 양이온성 계면활성제와 염소가 공-흡착된 전극이 산화를 위한 온셋 전위에 도달하는 경우, 전극은 염소에 의해 에칭(③)되고, 반응
Figure PCTKR2022007937-appb-img-000003
(E0=1.002V)에 의해 에칭 산물로 염화금산이 생성된다. 우선적 염소 흡착 장소에 의해 염소 에드레이어가 형성됨에 따라 에칭 프로세스는 비등방적이며, 이러한 비등방적 에칭에 의해 나노구조로 성장하는 핵생성 장소들이 생성된다. 새로이 용해된 염화금산은 용액내 미셀형 양이온성 계면활성제과 빠르게 배위하여, 염화금산이 전극 표면으로부터 멀리 확산되는 것을 방지한다. 스캔율의 극성이 바뀌며 미셀형 양이온성 계면활성제-AuCl4가 환원되고, 약 0.6V 전위에서 전극 표면에 증착된다(④). 전극 표면에 형성된 계면활성제 바이레이어에 의해 과전위(overpotential)가 요구되며, 에칭시 발생하는 반응의 역 반응이 이루어진다. 양이온성 계면활성제-AuCl4의 환원 또한, 계면활성제 층이 덜 치밀하고 표면 에너지가 보다 낮은 금 파셋(facet)에서 우선적으로 및 비등방적으로 발생하고, 결정면의 모서리들의 곡률이 증가한다. 이는 미셀에 대한 접근 용이성을 증가시키고, 금 종(species)의 환원 속도를 증가시키며, 보다 효율적인 성장을 촉진한다. 이 과정이 반복되며 점점 더 큰 표면이 형성됨에 따라, 음극 전류(cathodic current)는 각 사이클이 반복되며 크게 증가한다(도 10의 ④ 영역에서 1st cycle과 20th cycle 참고).
도 12는 산성 매질 하 나노구조화 전 평면 전극(Au) 및 NSG 전극(NSG)의 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)를 도시한 도면이다. 전극의 전기화학적 산화 후, 전기 환원 동안 음극 피크를 적분함으로써, 전극의 표면적을 산출할 수 있다. 도 12의 음극 피크(약 0.87V에 피크 중심이 위치하는 음극 전류 피크)의 면적을 통해 산출된 NSG 전극의 거칠기 계수(roughness factor)는 200 이상이었다.
도 13은 2.5mM의 등몰 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨 용액 내 스캔 속도에 다른 평면 전극(Au), NSG 전극(NSG)의 순환 전압-전류도(cyclic voltammograms)를 도시한 도면이다. 이때, 도 13의 우측 도면은 평면 전극의 CV 결과를 확대 도시한 도면이다. 도 14는, 도 13의 순환 전압-전류도로부터, 스캔 속도의 제곱근 대비 산화 및 환원 피크 전류(정점 전류 밀도)를 도시한 랜들-세빅 플롯(Randles-Sevcik plot)이다(도에서 Au=평면 전극, NSG=NSG 전극).
레독스 페어인 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 산화/환원은 두 전극 모두에서 동적 확산 제한(diffusion-limited kinetic)으로 가역적인 산화환원 반응을 나타내나, 평면 전극보다 NSG 전극에서 보다 증가된 전류밀도를 가졌다. 이는 전극 키네틱을 향상시키는 거칠기와 다공성을 모두 갖는 전극 표면의 형태로 인해 발생하며, 누적 기공 부피 및 크기에 따라 달라질 수 있다. 느린 스캔 속도와 더 긴 시간 스케일 실험에서, 전극 키네틱은 더 큰 확산층에 의해 지배되었다. 이를 통해 공정이 확산 제한적이며, 대부분의 전극이 평면 전극과 유사한 반무한(semi infinite) 평면 확산층을 나타냈다. 반면, 확산층이 더 작아지며 전극의 나노구조 및 나노포어 크기와 비슷해지는 빠른 스캔 속도에서, 향상된 전극 키네틱은 전극의 형상으로부터 기인한 것이다.
도 15는 스텝 시간대전류법을 이용한 전극 나노구조화시 산화 전위를 1.2V, 1.25V, 1.3V로 달리하여 제조된 NSG 전극 및 평면 전극(도의 Au)의 네모파 스캔 전압-전류도(square-wave scan voltammogram)를 도시한 도면이다. 이때, *는 '금 결정면의 전기화학적 관찰'에서 상술한 바와 같이, 환원 과정을 거치지 않은 전극을 의미한다.
금 전극 표면에서의 산화물 애드레이어 형성은 결정 면의 선택성을 나타낸다. 즉, 전압전류법에서의 산화 피크는 각 결정 파셋(crystalline facet) 방향에 따라 서로 다른 에너지를 가지며, 알려진 바와 같이, Au{111} 파셋의 산화 에너지가 Au{110} 파셋의 산화 에너지보다 크고, Au{110} 파셋의 산화 에너지가 Au{100} 파셋의 산화 에너지보다 크다(Au{100} < Au{110} < Au{111}).
1.2V의 산화 전위 조건에서 제조된 NSG 전극을 살피면, 레퍼런스로 제시된 평면 전극 대비 Au{100}, Au{111} 파셋 및 Au{110} 파셋 모두 크게 증가한 것을 알 수 있으며, 나아가, NSG 전극은 Au{100} 및 Au{111} 파셋 대비 Au{110} 파셋이 다량 존재함을 알 수 있다.
도 16은 NSG 전극(도의 NSG) 및 레퍼런스인 평면 전극(도의 Au)에 대한 스침 입사 X선 회절 결과(Grazing incidence X-ray diffraction spectrogram)를 도시한 도면이다. NSG 전극이 면심입방체(fcc) 구조의 금속성 금의 구조(JCPDS, 카드 번호 04-0784)를 가짐을 확인하였다. NSG 전극은 평면 전극에 비해 증가된 피크 강도를 나타냈다. 이는 NSG 전극의 두께 증가에 기인한 것으로 해석할 수 있다.
NSG 전극에서, 결정질 도메인(crystalline domain)의 평균 크기는 21 ± 4 nm로, 주사전자현미경(SEM)으로 관찰된 그레인 크기와 비슷했다.
X-선 회절 패턴에서, 평면 전극과 NSG 전극 모두 Au{110}의 결정 방향이 가장 풍부했으며, 이는 도 15를 통해 살핀 전기화학적 결정면 관찰 결과와 부합한다. 그러나, NSG 전극에서 평면 전극보다 상대적으로 Au{100} 및 Au{111}이 더 풍부했다. 또한, Au{111} 및 Au{100}의 풍부함은 상대적 Au{110} 피크의 풍부함보다는 작았는데, 이는 이 파셋의 금 원자간 거리가 양이온성 계면활성제의 양이온 헤드를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 동공(cavity)을 제공하기 때문인 것으로 해석할 수 있다.
도 17은 NSG 전극(도의 NSG) 및 평면 전극(도의 Au)의 생물학적 오염(biofouling) 거동을 테스트한 결과로, BSA 1% 매질(도의 BSA) 또는 인간 혈장 매질(도의 Plasma)에서 시간에 따른 전극의 Rct를 도시한 도면이다. 서로 상이한 매질 내에서 전극과 확산성 레독스 분자간의 전하 이동에 대한 저항을 도시한 도 17을 살피면, 평면 전극의 경우 BSA의 흡착에 의해 Rct가 초기값 대비 4000% 이상 증가하는 반면, NSG 전극의 경우 노출 20 시간이 흐른 시점에서도 Rct가 거의 열화되지 않고 초기값을 유지하는 것을 알 수 있다.
혈장 매질에서도 동일한 경향이 관찰되었으며, NSG 전극은 평면 전극 보다 10배 낮은 Rct를 나타냈다. NSG 전극의 생물학적 오염 방지 기능은 전극 전체에 걸친 나노 기공에 의해 생물학적 오염 단백질의 확산이 제한됨에 따른 것으로, 생물학적 오염 단백질의 확산이 제한되며 생물학적 오염 단백질의 흡수와 전기 활성 부위의 차단이 방지된 것이다.
도 18은 평면 전극(도의 Au) 및 NSG 전극(도의 NSG)을 이용한 페로시안화물의 전기화학적 검출시, 피크 전류 밀도 대 페로시안화물 농도를 도시한 도면이다. 전압전류법을 이용한 페로시안화물의 검출은 표면쪽으로의 확산 대비 빠른 전자 이동으로 산화 환원 반응을 유도한다. 평면 전극에서 이 반응에 대한 확산 프로파일은 평면이다. 반면 NSG 전극의 경우 불규칙한 표면에서의 방사상 기여에 의해, 민감도(sensitivity)가 평면 전극의 6μAmm- 2mM-1에서 14μAmm- 2mM-1로 증가된다. 그러나 낮은 농도에서, 반응이 발생하기 전에 활성 종(active species)이 다공 구조 전체로 확산할 시간이 충분하지 않아, 검출 한계(LOD, limit of detection)는 0.3mM(평면 전극)에서 0.1mM(NSG 전극)로 약간 향상되었다.
혈장에서 일반적으로 발견되는 가용성 단백질 염증 마커인 IL6 검출을 위해 적절한 생체 수용체로 NSG 전극의 표면을 기능화하여 면역친화성 바이오센서를 제조하였다. 상세하게, '전극 기능화' 및 'NSG 전극을 사용한 전기화학적 효소 샌드위치 검출'에서 상술한 바에 따라, IL6 검출을 위한 항체-기능화된 NSG 전극 칩을 이용하였으며, 단백질 검출은 분석 말기에 전기 활성 침전물을 생성하여 IL6 농도에 비례하는 큰 전류 출력을 생성하는 ELISA로 수행되었다.
도 19는 전기활성 침전물의 전형적인 전압전류 산화 피크(voltammetric oxidation peaks)를 도시한 도면이다.
도 20은 NSG 전극 칩 또는 평면 전극 칩에서 PBS나 인간 혈장에 스파이크된 IL6 농도에 따른 산화 피크 전류 밀도를 도시한 도면이다. 도 20에서 NSG는 PBS에 IL6이 스파이크되고 NSG 전극 칩을 사용한 결과이며, Au는 PBS에 IL6이 스파이크되고 평면 전극 칩을 사용한 결과이고, NSG(plasma)는 인간혈장에 IL6이 스파이크되고 NSG 전극 칩을 사용한 결과이며, Au(plasma)는 인간혈장에 IL6이 스파이크되고 평면 전극 칩을 사용한 결과를 의미한다. 도 20에서 에러 바는 표준 편차를 의미하며, 도 20의 우측 도면은 평면 전극 칩 결과를 확대 도시한 것이다.
평면 전극 칩의 LOD는 31pgmL-1였으며, NSG 전극 칩의 LOD는 1pgmL-1로 NSG 전극이 평면 전극보다 17배 더 높은 감도를 가짐을 알 수 있다.
주목할 부분은 인간 혈장에서 동일한 측정을 수행되었을 때 NSG 전극이 구비된 칩이 갖는 견고성이다. 평면 전극 칩의 경우 인간 혈장 매질에서 완전히 부동태화되었고 도 20의 오른쪽 확대도와 같이 IL6의 검출이 실질적으로 불가능했다. 그러나, NSG 전극은 1에서 10 pgmL-1로 LOD만이 약간 증가되었을 뿐, 인간 혈장 매질에서도 안정적이고 선형적으로 IL6가 검출됨을 확인할 수 있다.
혈장과 같은 생물학적 샘플과 접촉하는 전극 표면은 부동태화 다층을 형성하는 단백질을 매우 빠르게 흡착한다. 나아가, 단백질 흡착은 더 큰 표면적을 갖는 나노구조화된 표면에서 더욱 촉진된다. 이러한 이유로, 단지 나노구조화로 표면적을 증가시킨 전극에서 생물학적 샘플을 이용한 분석시 예상치 않은 낮은 감도가 나타난다. 그러나, NSG 전극과 같이 나노구조화와 함께 나노다공화되어 표면 아래로 다량의 나노 다공성을 갖는 경우, 이러한 오염 단백질의 센싱 영역으로의 확산 및 부동태화를 방지할 수 있다.
NSG 전극의 생물학적 오염 방지 특성과 초고감도 감지능을 이용하여, 최소 침습적 암 진단을 위한 유망한 바이오마커 후보인 tEV(tumour-derived EV)를 희석되지 않은 혈장에서 검출하였다. 상세하게, 전립선 림프절 암종(LNCaP) 세포 배양 상청액 스파이크 인간 혈장을 샘플로 사용하고, EV 관련 바이오마커인 항-CD9로 NSG 전극을 기능화하여 표면에서 EV를 캡처한 다음 특정 검출 항체를 사용하여 EV에서 특정 바이오마커의 존재를 조사하였다.
도 21은 NSG 전극 칩 또는 평면 전극 칩을 사용하여 인간 혈장에 스파이크된 EV 입자 농도에 따른 산화 피크 전류 밀도를 도시한 도면이다. 에러 바는 표준 편차를 의미한다. EV 정량화를 위해 CD9 및 CD81을 검출하고, tEV 정량화를 위해 종양 관련 항원인 EpCAM을 검출했다. 도 21에서 NSG CD9/CD9은 NSG 전극을 사용하고 특정 검출 항체로 CD9을 사용한 경우를, NSG CD9/CD81은 NSG 전극을 사용하고 특정 검출 항체로 CD81을 사용한 경우를, NSG CD9/EpCAM은 NSG 전극을 사용하고 특정 검출 항체로 EpCAM을 사용한 경우를, Au CD9/CD9은 평면 전극을 사용하고 특정 검출 항체로 CD9을 사용한 경우를 의미한다.
NSG 바이오센서는 5μL에 불과한 극소량의 혈장 샘플에서 EV를 검출할 때, 총 EV(CD9+EV) 관련 60 소포μL-1의 LOD를 나타냈으며, tEV(EpCAM+EV) 관련 250 소포μL-1의 LOD를 나타냈다.
평면 전극의 경우 혈장 샘플을 분석하는 동안 전극은 전기적으로 부동태화되었으며, ELISA를 이용하는 경우 50μL의 샘플이 필요하하고, PBS 매질에서 총 EV의 경우 700 소포μL-1의 LOD를 가졌으며, tEV의 경우 8000 소포μL-1의 LOD를 가졌다.
NSG 바이오센서를 이용하여 임상 샘플에서의 tEV 검출 여부를 테스트하기 위해, 54-82세의 전립선암(II, III 및 IV기) 환자를 포함하는 소규모 코호트(n = 10)의 소변을 이용하여, 소변 샘플 내 총 EV(CD9+EV)와 tEV(EpCAM+EV)를 검출하고 이를 도 22에 도시하였다. 도 22는 CD9-캡춰된 EV를 검출하기 위한 검출 항체 CD9+ 또는 EpCAM+를 검출한 것으로, 검출 에세이 별 전기화학적 전류 밀도 값을 도시한 것이다. 5개의 생물학적 샘플 및 샘플별 4개의 작동 전극 각각을 이용한 측정을 통해 20개의 측정 결과를 확보하였다(n=20). 25th에서 75th까지 박스가 확장되었으며, 중간선은 중앙값(median)을 나타내며 수염(whisker)은 최소값에서 최대값까지 확장되었다.
도 22의 소변내 CD9+EV 검출 결과에서, 총 EV 레벨은 전립선암 환자와 건강한 사람 간 유의미한 차이가 없었다. 반면, EpCAM+EV 검출 결과에서, 전립선암 환자의 소변에서 tEV 레벨이 유의미하게 높았다(p < 0.0001).
NSG 바이오센서를 이용하여, 66-82세의 전립선암(II, III, IV기) 환자를 포함하는 더 큰 코호트(n = 18)의 혈장으로부터 tEV(EpCAM+EV)를 검출하고 이를 도 23에 도시하였다. 도 23은 CD9-캡춰된 EV를 검출하기 위한 검출 항체 EpCAM+를 검출한 것으로, 혈장 샘플 별 전기화학적 전류 밀도 값을 도시한 것이다. 9개의 생물학적 샘플 및 샘플별 4개의 작동 전극 각각을 이용한 측정을 통해 36개의 측정 결과를 확보하였다(n=36). 25th에서 75th까지 박스가 확장되었으며, 중간선은 중앙값을 나타내며 수염은 최소값에서 최대값까지 확장되었다.
혈장을 이용한 검출시에도, 건강한 사람보다 전립선암 환자에서 EpCAM+EV 수준이 유의미하고 크게 높았다(p < 0.0001).
도 24는 NSG 바이오센서의 건강한 사람과 암환자간의 분류 능력을 보이는 수신자 조작 특성 그래프이다. urine CD9/CD9은 임상 샘플이 소변이고 특정 검출 항체로 CD9을 이용한 경우를, urine CD9/EpCAM은 임상 샘플이 소변이고 특정 검출 항체로 EpCAM을 이용한 경우를, plasma CD9/EpCAM은 임상 샘플이 혈장이고 특정 검출 항체로 EpCAM을 이용한 경우를 의미한다. urine CD9/CD9의 수신자 조작 특성 그래프의 값(AUC)은 0.5450에 불과하였으나, urine CD9/EpCAM의 AUC는 0.9100, plasma CD9/EpCAM의 AUC는 0.9005로, 극히 우수한 검출 특이도와 민감도를 가짐을 확인할 수 있다. 나아가, 동일한 임상 샘플에서 CD9+EV 또는 EpCAM+EV의 ELISA 검출로는 건강한 사람과 암환자를 구별할 수 없었다.
도 22 내지 24를 통해, NSG 바이오센서로 측정한 혈장 내 EpCAM+EV 레벨(전류밀도)이 소변 내 EpCAM+EV 레벨보다 10배 가까이 컸으나, 소변과 혈장에서의 AUC는 0.91과 0.90으로, 두 경우가 유사한 검출 특이도와 민감도를 가졌다.
특히 이러한 결과는 임상 샘플(소변, 혈장)의 희석이나 전처리 단계 없이 NSG 전극으로 직접 분석되었으며, 이는 복잡한 매트릭스에서 마커를 초고감도로 검출할 수 있는 바이오센싱 플랫폼으로의 유용성을 시사한다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 나노 다공성을 가지며 나노 구조화된 금속 막이며,
    상기 금속 막은 금속 나노 그레인(grain)이 불규칙적으로 응집되어 막의 두께 방향으로 뻗어나가는 줄기를 포함하는 형태로 나노 구조화되고, 상기 줄기 간의 공극에 의해 나노 다공성을 갖는, 금속 막.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 줄기를 포함하는 형태는 산호초 형상인 금속 막.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 막의 RMS(root-mean-square) 거칠기는 200 내지 500nm인 금속 막.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 막의 두께는 1 내지 5μm인 금속 막.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노 그레인의 평균 크기는 10 내지 50nm인 금속 막.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 막의 금속은 FCC(Face Centered Cubic) 결정 구조를 가지며, 상기 금속 나노 그레인은 {111}, {110} 및 {100}에서 하나 이상 선택되는 저지수면의 파셋(facet)을 갖는 금속 막.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 막의 금속은 구리(Cu), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh) 및 금(Au)에서 하나 이상 선택되는 금속인, 금속 막.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 금속 막을 작동 전극(working electrode)으로 포함하는 전기화학적 바이오센서.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 작동 전극은 하기 식 1을 만족하는 방오특성을 갖는 전기화학적 바이오센서.
    (식 1)
    Rct(20)/Rct(0) ≤ 1.5
    (식 1에서, Rct는 1%의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 용액과의 접촉시 전하 이동 저항(charge transfer Resistance)이며, Rct(0)는 접촉 직후의 전하 이동 저항, Rct(20)은 접촉 후 20시간이 흐른 시점에서의 전하 이동 저항을 의미한다)
  10. 제 8항에 있어서,
    0 내지 50μM의 동일 몰 농도 범위로 페로시안화물/페리시안화물 레독스 페어를 함유하는 용액을 기준 용액으로 하여, 상기 기준 용액의 농도에 따른 산화 피크 전류값(μA·mm-2)의 기울기인 민감도는 10 μAmm- 2mM-1 이상인 전기화학적 바이오센서.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 표적 물질은 암세포 유래 세포외 소포체를 포함하는 전기화학적 바이오센서.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 눈물, 세비액, 소변, 침, 복강 세척액, 골반 내 유체액, 낭종액, 뇌척수막 액, 양수, 선액, 췌장액, 림프액, 흉수, 유두 흡인물, 기관지 흡인물, 활액 또는 뇌척수액인 전기화학적 바이오센서.
  13. 생물학적 샘플에 함유된 질병 지표와 특이적으로 결합하는 캡쳐용 수용체로 기능화된 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 금속 막을 작동 전극(working electrode)으로 포함하는 전극 부재가 위치하는 기판을 포함하는 검출 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 검출 키트는, 샌드위치 결합을 형성하기 위한 검출용 수용체가 보관된 용기를 더 포함하는 검출 키트.
  15. 제 8항에 따른 바이오센서를 이용한 질병 지표의 검출 방법.
  16. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 금속 막을 포함하는 표면증강 라만 분광용 기판.
  17. 베이스 금속막에 양이온성 계면활성제, 염소 소스 및 상기 베이스 금속막의 금속과 동종의 금속을 함유하는 금속전구체를 포함하는 시딩 용액을 접촉시키는 단계; 및
    하기 조건의 스텝 시간대전류법(step chronoamperometry)을 이용하여 상기 시딩 용액과 접촉하는 상기 베이스 금속막을 나노구조화 및 나노다공화하는 단계;를 포함하는 금속막의 나노구조화 방법:
    (조건)
    전압 인가시 단위 사이클 : 양의 전압(V+)과 음의 전압(V-)의 순차적 인가
    V+ 크기 및 V+ 인가 시간(t+): 1.0 내지 1.5V 및 0.5 내지 3msec
    V- 크기 및 V- 인가 시간(t-) : -1.0 내지 -1.5V 및 0.8t+ 내지 3t+
    단위 사이클 반복 횟수 : 10,000 내지 30,000회.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄염인 금속막의 나노구조화 방법.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 금속전구체는 함염소화합물(chlorine-containing compound)인 금속막의 나노구조화 방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 조건으로 스텝 시간대전류법이 수행된 후, 또는 마지막으로 인가되는 단위 사이클의 음의 전압 인가시, -1.0 내지 -1.5V의 전압이 5 내지 30sec 동안 인가되는 금속막의 나노구조화 방법.
PCT/KR2022/007937 2021-06-04 2022-06-03 나노구조화된 금속막, 이의 제조방법 및 용도 WO2022255842A1 (ko)

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