CN106987639B

CN106987639B - 检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN106987639B
Application number: CN201710289172.9A
Authority: CN
Inventors: 梅世月; 孔祥东; 白楠; 孟静静
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN106987639A

Abstract

本发明涉及基因缺失检测领域，具体涉及一种检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用。所述多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物。本发明通过一套新型的稳定的通用引物‑多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。

Description

检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及基因缺失检测领域，更具体地，涉及一种检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组、包括多重PCR引物组的该试剂盒和所述多重PCR引物组及试剂盒作为检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失试剂的应用。

背景技术

世界卫生组织(WHO)的研究调查表明，全世界约有10-15％的育龄夫妇存在不孕不育，其中男性因素约占50％。Y染色体微缺失，是除了克氏综合征以外导致男性不育的第二大遗传学病因。Y染色体长臂的无精子因子(AZF)是被证实为控制精子生成的关键基因簇；在男性不育领域，Y染色体微缺失特指AZF区微缺失。AZF区分为AZFa、AZFb和AZFc三个亚区，任何一个亚区的微缺失都可能导致生精障碍。

AZFa区长度约为1100kb，该区候选功能基因有USP9Y、DBY、TB4Y和UTY，主导精母细胞的增生。AZFa区缺失将导致严重的生精障碍、睾丸发育不良，表现为唯支持细胞综合征，为绝对的无精子症。AZFa区完全缺失患者，即使通过睾丸穿刺手术无法获得精子，因此不建议做单精子胞浆内注射辅助生殖。有报道表明在AZFa区部分缺失(sY83、sY86、sY84缺失)患者仍能自然生育男性后代，且子代与父代AZFa缺失一致。

AZFb区长度约为4.73Mb，该区候选功能基因有SMCY、EIF1AY、RMBY1A、CDY和XKRY。AZFb区缺失患者通常表现为生精阻滞，精子生成被阻滞在精母细胞或精子细胞阶段，患者睾丸内仍可见精原细胞和初级精母细胞，但没有成熟精子生成。因此，AZFb区完全缺失患者通过睾丸穿刺手术也无法获得精子，也不能采用单精子胞浆内注射辅助生殖。AZFb区部分缺失患者临床表现多样，其睾丸组织内尚存在一定的生精功能，可通过睾丸穿刺获得精子进行卵胞浆内注射获得后代。

AZFc区域缺失是临床上最常见的AZF缺失类型，是引起生精障碍的一个重要原因。AZFc缺失患者临床表现多样化，一般来说，患者尚存精子生成能力，因此可以通过辅助生殖技术获得后代。

鉴于AZFa区和AZFb区部分缺失后生精能力的多样性以及完全缺失导致的生精障碍的严重性，有必要对AZFa区和AZFb区缺患者的缺失程度及断点位置进行精确定位，确定其缺失类型是部分缺失或全部缺失，以正确评估患者睾丸生精障碍程度以及是否能够获得精子的可能性，为后续治疗方案提供遗传学依据。

AZF微缺失的检测主要是针对Y染色体特定的序列标签位点(STS)检测，2013年欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传质控网(EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失的最佳实践操作指南》推荐检测6个STS位点，即AZFa(sY84，sY86)；AZFb(sY127，sY134)；AZFc(sY254，sY255)作为AZF微缺失常规筛查位点。检测这6个STS位点能够诊断超过95％的AZF缺失情形。然而，根据近几年的基因型–临床表型相关性数据，对于AZFa(sY84，sY86)或者AZFb(sY127，sY134)缺失，EAA/EMQN指南推荐进一步扩大检测位点以明确Y染色体微缺失区域及类型：利用靠近着丝粒端的sY82、sY83/sY1064和靠近远端的sY1065/sY1182、sY88判断AZFa区域是否发生片段的完全缺失；利用靠近着丝粒端的sY105、sY121/sY1224和靠近远端的sY143/sY1192，sY153判断AZFb区域是否发生片段的完全缺失。

目前检测AZF区微缺失的方法包括多重PCR-凝胶电泳法、多重荧光PCR法、芯片杂交法、多重连接探针扩增(MLPA)等多种方法。最常用的是针对序列标签位点(STS)，采用多重PCR扩增-凝胶电泳检测，根据条带的有无对AZF各区的缺失情况做出定性分析。目前该方法已成为检测AZF微缺失的行业“金标准”；但是该方法的检测敏感性不高，凝胶电泳易造成PCR产物污染导致假阳性；操作繁琐，其检测通量小，不适用于对大样本量的检测。多重荧光PCR方法具有简便、快速、准确的特点，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。目前，根据上述这两种检测方法，已有多种的Y染色体微缺失检测试剂盒面世。芯片杂交技术也有报道用于检测AZF区微缺失，该方法具有极高的准确度和灵敏度；但是该方法需要设计大量的探针，成本较高，并且其检测、分析也较为复杂，不适合临床医生判读。

因此，建立一种简单快速、准确度高且低成本的分子遗传学检测方法对临床具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种操作简单、高效、通过一次性扩增多个基因片断用于检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的方法。本发明克服了传统多重PCR灵敏度低、非特异性扩增等缺点，通过一套新型的稳定的通用引物-多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。毛细管的方法具有较高的分辨度和灵敏度，可以检测单个核苷酸的差异，毛细管电泳图清晰直观，易于判读，减少假阴性和假阳性结果率，提高了Y染色体微却缺诊断的准确性。

为了实现上述目的，本发明提供一种检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，

所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：

正向Dye-Universal P-Forward(FAM-UP-F)：5’-GGTGACCAAGTTCATGCTCT-3’(SEQID NO：1)

反向Universal P-Reverse(UP-R)：5’-GGTCCAGGTCACGAGATCTT-3’(SEQ ID NO：2)

其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团Dye；

所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物。具体如表1所示。

所述引物组包括了4个AZFa和AZFb区常规筛查位点和8个拓展分析位点(AZFa：sY82、sY83、sY84、sY86、sY1065、sY88；AZFb：sY105、sY121、sY127、sY134、sY1192、sY153)的特异性引物序列和一对通用引物序列。

通用引物中正向引物的5’端标记有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5或CY5.5。

根据本发明，多重PCR引物组中，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28的摩尔比优选为(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述优选比例的各个引物，能够获得更好的检测效果。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的试剂盒，该试剂盒包括：

如上所述的多重PCR引物组；

多重PCR反应试剂。

其中，所述多重PCR反应试剂包括但不限于：MgCl₂、甜菜碱、热启动Taq酶、dNTPs和PCR反应缓冲液。

上述PCR反应试剂，可根据本领域常规方式进行自行配制或通过普通市售获得。

根据本发明，试剂盒中，所述MgCl₂的浓度为50-200mmol/L；所述甜菜碱的浓度为5-20mol/L；所述dNTPs的浓度为5-20mmol/L。

使用时，所述MgCl₂的终浓度为1.0～5.0mmol/L；所述甜菜碱的终浓度为0.5～2.5mol/L；所述dNTPs的终浓度为50～1000μmol/L。

根据本发明，优选地，该试剂盒包括：对照DNA标本。进一步优选地，所述DNA标本为正常男性对照标本、AZFa区缺失对照标本和AZFb区缺失对照标本中的至少一种。优选地，包括上述全部对照DNA标本。

根据本发明的第三方面，本发明还提供上述的多重PCR引物组或上述的试剂盒作为检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失试剂的应用。

应用本发明的多重PCR引物组或试剂盒可用于男性Y染色体AZFa和AZFb微缺失通用引物-多重PCR检测，检测方法包括以下步骤：

1)从待测人外周血、口腔黏膜上皮细胞、干血片或者组织切片提取人基因组DNA；

2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增引物组进行PCR扩增；

3)多重PCR产物经毛细管电泳分析。

本发明的12对引物分别特异性扩增AZFa和AZFb亚区，1对内对照引物扩增男性特有基因。每条引物的正反向引物的5’端含有一段20bp的共同序列。设计的通用引物序列与这一段序列完全一致，并在正向通用引物5’端连接荧光基团。本发明利用一管PCR反应体系实现13对引物的特异性扩增，同时利用带荧光的通用引物对所有特异性扩增的目的片段二次扩增并带上荧光，扩增产物片段长度呈梯度分布，结果通过毛细管电泳分析，以达到简单、快速、高通量和经济的目的。

与现有检测试剂盒及方法相比，本发明具有以下突出优点：

1)检测体系里只需要一个单末端荧光标记的引物，不需要多个Taqman等荧光探针，大大降低了成本。

2)单管PCR即可完成所有位点的检测，节省了成本又简化了操作，既适用于小样本的检测，也适用于大样本的通量检测。

3)涵盖了AZFa和AZFb亚区的12个缺失热点的检测，同时引入SRY基因作为内对照保证了结果的准确性。

4)通过优化的引物设计及反应条件，本检测具有稳定的、高效的PCR反应体系。不仅可以应用于外周血样本，同样适用于极其微量的样品，如口腔黏膜脱落细胞、干血片、组织切片等。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1示出了AZFa和AZFb亚区微缺失拓展分析的13个检测位点(12个STS位点+1个对照位点)在Y染色体分布的模式图。

图2的a行示出了正常男性经多重PCR在13个检测位点的扩增峰；b行示出了AZFa区完全缺失样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；c行示出了AZFb区完全缺失样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；d行和e行分别示出了AZFb区不完全缺失样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施例1外周血样本检测AZF区微缺失

1、材料：

1例正常已育男性样本、4例已经确诊的AZF微缺失型少精或无精症男性患者样本：1例AZFa区完全缺失[sY82(+)、sY83(-)、sY84(-)、sY86(-)、sY1065(-)、sY88(+)]，1例AZFb区完全缺失[sY105(+)、sY121(-)、sY127(-)、sY134(-)、sY1192(-)、sY153(+)]，2例AZFb区部分缺失：[sY105(+)、sY121(-)、sY127(-)、sY134(-)、sY1192(+)、sY153(+)]和[sY105(+)、sY121(+)、sY127(-)、sY134(-)、sY1192(+)、sY153(+)]。所有样本均已通过EAA/EMQN(2013版)的Y染色体微缺失检测指南推荐的多重PCR-凝胶电泳方法验证。

2、基因组DNA的提取

使用OMEGA公司“基因组DNA抽提试剂盒”从EDTA抗凝全血中提取人基因组DNA。

3、多重PCR扩增与检测

所有引物在公司合成，其中通用引物的正向引物5’端选用FAM修饰，其余引物无需特殊修饰，所有引物经高效液相色谱(HPLC)纯化。。

多重引物组合：每对正、反向引物按照1：1混合，终浓度10μmol/L，然后将各组引物sY82：sY83：sY84：sY86：sY1065：sY88：sY105：sY121：sY127：sY134：sY1192：sY153：SRY：FAM-UP-F：UP-R按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：4：4的比例配置成多重PCR引物组合存储液。

PCR实验选择Kapa Biosystems公司的KAPA2G Multiplex PCR试剂盒(KK5802)。为了简少人为误差，简化操作流程，本实施例中首先将PCR扩增试剂配置成Mix(包括Buffer、dNTPs、H₂O、引物组、HotStart DNA Polymerase)，分装至每个反应管；最后加入不同样本DNA(各反应组分如表2所示)。

表2.多重PCR反应体系

PCR反应在ABI PCR仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：

第一阶段：95℃3min；

第二阶段：95℃15sec，62℃30sec，72℃45sec，10个循环；

第三阶段：95℃15sec，58℃30sec，72℃45sec，15个循环。

第四阶段：72℃15min。

4、毛细管电泳分析

多重PCR产物采用ABI Applied Biosytems公司的3130XL分析仪。取1μL多重PCR产物与8.5μL甲酰胺、0.5uL分子量内标LIZ500Size混合，95℃加热3min，-20℃快速降温并放置3min，上机检测，结果经Gene-Mapper软件分析。检测位点与相应的电泳坐标位置如下：SRY(510±1)、sY82(304±1)、sY322(371±1)、sY84(366±1)、sY86(358±1)、sY1065(379±1)、sY88(165±1)、sY105(332±1)、sY121(230±1)、sY127(314±1)、sY134(342±1)、sY1192(295±1)、sY153(177±1)。

阳性对照：以正常男性基因组DNA作为模板的多重PCR，在上述13个坐标位置均有明确的扩增峰。

内对照：以待测男性基因组DNA作为模板的反应管内，SRY(509±1)位置应该有明确的扩增峰。

结果分析

(1)毛细管电泳结果的横坐标显示为扩增片段的大小，纵坐标显示为扩增片段的荧光强度，间接反应片段扩增的量。每一个单一扩增峰代表一个扩增片段，没有扩增峰则表示该片段没有扩增，该STS位点为缺失。

(2)阳性对照组在12个STS位点(sY82、sY83、sY84、sY86、sY1065、sY88、sY105、sY121、sY127、sY134、sY1192、sY153)和内对照(SRY)具有单一、清楚的扩增峰(如图2的a行示)。

(3)AZFa区微缺失判定：sY84、sY86位置不存在扩增峰，表明AZFa亚区缺失；sY82和sY88位于AZFa亚区两端边缘位置，存在扩增峰；sY83和sY1065分别位于sY84、sY86的两侧位置，sY83和sY1065位置不存在扩增峰，则可以判定为AZFa亚区完全缺失(如图2的b行示)；sY83和sY1065位置均存在或者其中之一存在扩增峰，则可以判定为AZFa亚区不完全缺失。

(4)AZFb区微缺失判定：sY127、sY134位置不存在扩增峰，表明AZFb亚区缺失；sY105和sY153位于AZFb亚区两端边缘位置，存在扩增峰；sY121和sY1192分别位于sY84、sY86的两侧位置，sY121和sY1192位置不存在扩增峰，则可以判定为AZFb亚区完全缺失(如图2的c行示)；sY121和sY1192位置均存在或者其中之一存在扩增峰，则可以判定为AZFb亚区不完全缺失(如图2的d行和e行所示)。

上述实验结果证实，本发明的多重PCR引物和试剂盒用于检测Y染色体微缺失的方法可靠、灵敏度高，成本低，并且可以实现大样本量的高效检测。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用

<130> 1700052

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgaccaag ttcatgctct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtccaggtc acgagatctt 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgaccaag ttcatgctct cggaatattc ccgctctccg ga 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtccaggtc acgagatctt cggctggtgc tccattcttg ag 42

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgaccaag ttcatgctct atcctgccct tctgaatctc 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtccaggtc acgagatctt cagtgtccac tgatggatga 40

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtgaccaag ttcatgctct tagcttgaat caaagaaggc cct 43

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtccaggtc acgagatctt cttacaattt ggtttggctg acat 44

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtgaccaag ttcatgctct agaagggtct gaaagcaggt 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtccaggtc acgagatctt gcctactacc tggaggcttc 40

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtgaccaag ttcatgctct gtgacacaca gactatgctt c 41

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtccaggtc acgagatctt acacacagag ggacaaccct 40

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtgaccaag ttcatgctct tcaggtactg tgatgccgtt 40

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtccaggtc acgagatctt tgaagaggac acaaagggaa a 41

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtgaccaag ttcatgctct cttgtaatcc aaatacatgg gc 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtccaggtc acgagatctt ccacccagcc atttgtttta c 41

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggtgaccaag ttcatgctct aagggcttct tctcttgctt 40

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtccaggtc acgagatctt aaactcaccg tctgaactca gt 42

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggtgaccaag ttcatgctct agttcacaga atggagcctg 40

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggtccaggtc acgagatctt cctgtgactc cagtttggtc 40

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggtgaccaag ttcatgctct ggctcacaaa cgaaaagaaa 40

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggtccaggtc acgagatctt ctgcaggcag taataaggga 40

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggtgaccaag ttcatgctct tgtctgcctc accataaaac g 41

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggtccaggtc acgagatctt accactgcca aaactttcaa 40

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggtgaccaag ttcatgctct actaccattt ctggaagccg 40

<210> 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtccaggtc acgagatctt ctcccttggt tcatgccatt 40

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtgaccaag ttcatgctct gcatcctcat tttatgtcca 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggtccaggtc acgagatctt caacccaaaa gcactgagta 40

Claims

1.一种检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的多重PCR引物组，其特征在于，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，

所述通用引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示碱基序列的引物：

正向：5’-GGTGACCAAGTTCATGCTCT-3’(SEQ ID NO：1)

反向：5’-GGTCCAGGTCACGAGATCTT-3’(SEQ ID NO：2)

其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；

所述特异性引物为SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物。

2.根据权利要求1所述的多重PCR引物组，其中，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5或CY5.5。

3.根据权利要求2所述的多重PCR引物组，其中，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：28的摩尔比为(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。

4.一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

如权利要求1-3中任意一项所述的多重PCR引物组；

多重PCR反应试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述多重PCR反应试剂包括：MgCl₂、甜菜碱、热启动Taq酶、dNTPs和PCR反应缓冲液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述MgCl₂的浓度为50-200mmol/L；所述甜菜碱的浓度为5-20mol/L；所述dNTPs的浓度为5-20mmol/L。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，该试剂盒包括：对照DNA标本。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述DNA标本为正常男性对照标本、AZFa区缺失对照标本和AZFb区缺失对照标本中的至少一种。

9.权利要求1-3中任意一项所述的多重PCR引物组或权利要求4-8中任意一项所述的试剂盒在制备检测Y染色体AZFa和AZFb微缺失的试剂中的应用。