CN116694743A - 一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域。本发明提供了一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法，包括：(1)针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物和报告探针；(2)设计通用荧光检测探针；(3)进行荧光PCR并依据熔解峰Tm来判别待测样品中存在待测靶基因数量与种类。本发明通过将报告序列与靶特异性序列连接并对其进行修饰，使得当待测靶基因序列存在时报告序列可以直接与检测探针结合而产生熔解峰，相比于现有技术，报告序列无需二次扩增，提高了靶标的灵敏性，降低了体系的复杂性，使得该方法对反应体系具有广泛适用性。

Description

一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法。
背景技术
随着人们在对短时间内检测多靶标的需求，比如多基因遗传位点检测、感染症侯群多感染靶标检测等，如何实现单管反应尽可能多地检测或识别不同靶序列或者同一靶序列的多位点组成信息，成为了核酸检测领域重点关注的问题。
分子生物学技术可快速、准确地识别病原体并及时诊断感染性疾病，与传统的分离培养、涂片检测和免疫学检测等方法学相比有着明显的优势。荧光定量PCR技术具有高敏感度、高特异度且操作快速简便等优点，在呼吸道病原体诊断中有广阔的应用前景。然而，传统的荧光定量PCR每次只能扩增一种病原体核酸，要准确检测致病病原体费时费力，多重实时荧光定量聚合酶链反应(multiplex real-time-PCR，MRTPCR)可以有效弥补这一缺陷，并且成本低廉。然而，基于荧光探针检测的多重实时PCR也存在一些问题。比如在多重实时PCR法中，多个荧光探针的共存会使反应体系的背景荧光增加，这进而可导致检测灵敏度的下降。因此，需要对多重实时PCR法进行改进，以期通过尽可能少的荧光探针来检测尽可能多的靶序列。
李庆阁等曾发明了一种同时检测多种靶核酸序列在样品中的存在方法，在CN108823287B专利中提供了一种探针组，设计了不同荧光标记的“检测探针”，每一个检测探针又对应较多媒介子，大大提升了检测通量。此方法应用到了多方面的检测，但此方法也存在一定的缺陷，该方法中，切下来的媒介子需要在通用探针上进行延伸，这使得体系变得复杂并且灵敏性依赖于媒介子的扩增效率，对体系的质量要求较高。
因此，亟需提供一种更简单、适应性更强、灵敏性更强的多重检测方法，来区分样品中的每一个靶标。基于此，本发明提出了一种反应更简单、适应性更强、灵敏性更强的多靶标检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法，针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物、报告探针以及通用荧光检测探针，通过将报告序列与靶特异性序列连接并对其进行修饰，使得当待测靶基因序列存在时报告序列可以直接与检测探针结合而产生熔解峰，相比于现有技术，报告序列无需二次扩增，提高了靶标的灵敏性，降低了体系的复杂性，使得该方法对反应体系具有广泛适用性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法，包括如下步骤：
(1)针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物和报告探针；
所述报告探针从5’至3’方向依次包含报告序列和靶特异性序列，3’端进行封闭，所述报告序列不与待测靶基因序列互补，所述报告序列与通用荧光检测探针5’端部分序列互补；所述靶特异性序列与待测靶基因序列互补，且在靶特异性序列5’端前1-5碱基范围内连接一个淬灭基团；
(2)设计通用荧光检测探针，所述通用荧光检测探针为茎环结构，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
(3)将待测样品的DNA、通用荧光检测探针和针对若干待测靶基因的上游引物、下游引物、报告探针混合进行荧光PCR，并依据Tm熔解峰来判别待测样品中存在待测靶基因数量与种类：当没有Tm熔解峰出现时，判断待测样品中不存在待测靶基因；当存在多个Tm熔解峰时，根据每个Tm熔解峰具体的值判断待测样品中存在的待测靶基因的种类。
作为优选，所述报告序列的长度为10-500nt。
作为优选，所述通用荧光检测探针的种类≥1；所述通用荧光检测探针上连接的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL FluorOrange560、TAMRA、CAL Fluor Red590、ROX、CALFluor Red 610、Cy5中的任一种；不同种类的通用荧光检测探针上连接的荧光基团各不相同。
作为优选，所述淬灭基团包括DABCYL、BHQ1、BHQ2、ECLIPSE、TAMRA中的任一种。
本发明还提供了一种同时检测样品中多个靶标基因的试剂盒，包括上述的针对不同靶标序列的特异性上游引物、下游引物、报告探针以及多种通用荧光检测探针。
作为优选，所述通用荧光检测探针包括：通用荧光检测探针1、通用荧光检测探针2、通用荧光检测探针3或通用荧光检测探针4。
作为优选，所述通用荧光检测探针1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述通用荧光检测探针2的序列如SEQ ID NO:16所示；所述通用荧光检测探针3的序列如SEQ ID NO:29所示；所述通用荧光检测探针4的序列如SEQ ID NO:42所示。
作为优选，所述靶标基因包括RNA病毒、DNA病毒、细菌、肺炎支原体以及肺炎衣原体的核酸。
作为优选，所述RNA病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、鼻病毒以及人偏肺病毒；所述DNA病毒包括腺病毒以及博卡病毒；所述细菌包括百日咳鲍特菌。
作为优选，所述鼻病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:2和序列SEQ ID NO:3，所述鼻病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:4所示；
所述乙型流感病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:5和序列SEQ ID NO:6，所述乙型流感病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:7所示；
所述甲型流感病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:8和序列SEQ ID NO:9，所述甲型流感病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:10所示；
所述呼吸道合胞病毒A型的引物序列包括序列SEQ ID NO:11和序列SEQ ID NO:12；
所述呼吸道合胞病毒B型的引物序列包括序列SEQ ID NO:13和序列SEQ ID NO:14；
所述呼吸道合胞病毒A型和呼吸道合胞病毒B型的报告探针序列如SEQ ID NO:15所示；
所述人偏肺病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:17和序列SEQ ID NO:18，所述人偏肺病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:19所示；
所述肺炎衣原体的引物序列包括序列SEQ ID NO:20和序列SEQ ID NO:21，所述肺炎衣原体的报告探针序列如SEQ ID NO:22所示；
所述肺炎支原体的引物序列包括序列SEQ ID NO:23和序列SEQ ID NO:24，所述肺炎支原体的报告探针序列如SEQ ID NO:25所示；
所述百日咳鲍特菌的引物序列包括序列SEQ ID NO:26和序列SEQ ID NO:27，所述百日咳鲍特菌的报告探针序列如SEQ ID NO:28所示；
所述新型冠状病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:33和序列SEQ ID NO:34，所述新型冠状病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:35所示；
所述副流感病毒1型的引物序列包括序列SEQ ID NO:36和序列SEQ ID NO:37，所述副流感病毒1型的报告探针序列如SEQ ID NO:38所示；
所述副流感病毒2型的引物序列包括序列SEQ ID NO:39和序列SEQ ID NO:40，所述副流感病毒2型的报告探针序列如SEQ ID NO:41所示；
所述副流感病毒3型的引物序列包括序列SEQ ID NO:43和序列SEQ ID NO:44，所述副流感病毒3型的报告探针序列如SEQ ID NO:45所示；
所述副流感病毒4型的引物序列包括序列SEQ ID NO:46和序列SEQ ID NO:47，所述副流感病毒4型的报告探针序列如SEQ ID NO:48所示；
所述博卡病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:49和序列SEQ ID NO:50，所述博卡病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:51所示；
所述腺病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:52和序列SEQ ID NO:53，所述腺病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:54所示。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明采用针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物、报告探针以及通用荧光检测探针，通过将报告序列与靶特异性序列连接并对其进行修饰，使得当待测靶基因序列存在时报告序列可以直接与检测探针结合而产生熔解峰，相比于现有技术，报告序列无需二次扩增，背景荧光较低，提高了检测准确性和灵敏度，降低了体系的复杂性，使得该方法对反应体系具有广泛适用性。实施例中也表明了本发明仅用4种荧光检测探针即实现了十五种呼吸道病原体的检测，且15种呼吸道病原体的质粒样品均能检测到2.5拷贝/反应。
附图说明
图1为本发明利用荧光探针检测多靶标基因序列方法原理示意图；
图2为鼻病毒、肺炎支原体、百日咳鲍特菌、呼吸道合胞病毒检测的熔解曲线图；
图3为新型冠状病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒检测的熔解曲线图；
图4为HEX通道和Cy5通道中不同温度下病原体的熔解峰情况；
图5为FAM通道和ROX通道中不同温度下病原体的熔解峰情况；
图6为15种呼吸道病原体检测的灵敏度测试结果；
图7为分子信标探针体系中乙型流感病毒的溶解峰与原始熔解曲线图(图7中的A为乙型流感病毒的溶解峰图，图7中的B为原始熔解曲线图)；
图8为本发明体系中乙型流感病毒的溶解峰与原始熔解曲线图(图8中的A为乙型流感病毒的溶解峰图，图8中的B为原始熔解曲线图)。
具体实施方式
本发明提供了一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法，包括如下步骤：
(1)针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物和报告探针；
所述报告探针从5’至3’方向依次包含报告序列和靶特异性序列，3’端进行封闭，所述报告序列不与待测靶基因序列互补，所述报告序列与通用荧光检测探针5’端部分序列互补；所述靶特异性序列与待测靶基因序列互补，且在靶特异性序列5’端前1-5碱基范围内连接一个淬灭基团；
(2)设计通用荧光检测探针，所述通用荧光检测探针为茎环结构，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
(3)将待测样品的DNA、通用荧光检测探针和针对若干待测靶基因的上游引物、下游引物、报告探针混合进行荧光PCR，并依据Tm熔解峰来判别待测样品中存在待测靶基因数量与种类：当没有Tm熔解峰出现时，判断待测样品中不存在待测靶基因；当存在多个Tm熔解峰时，根据每个Tm熔解峰具体的值判断待测样品中存在的待测靶基因的种类。
在本发明中，所述报告探针从5’至3’方向依次包含报告序列和靶特异性序列。本发明所述报告序列的长度优选为10-500nt，进一步的优选为15-450nt，更进一步的优选为20-400nt；所述报告序列不与待测靶基因序列互补；所述报告序列最后一个碱基T上修饰NH2或其他封闭修饰基团，且报告序列与通用荧光检测探针5’端部分序列互补。本发明所述靶特异性序列的长度优选为1-900nt，进一步的优选为5-850nt，更进一步的优选10-800nt；所述靶特异性序列与待测靶基因序列互补，且靶特异性序列与靶核酸序列杂交时，其位于待测靶基因特异上游引物的下游。本发明所述靶特异性序列5’端前1-5碱基范围内连接一个淬灭基团。本发明所述报告探针3’端进行封闭。
在本发明中，所述通用荧光检测探针优选为茎环结构，序列长度优选为15-1000nt，进一步的优选为20-950nt，更进一步的优选为30-900nt。本发明通用荧光检测探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告序列发出的信号。本发明所述通用荧光检测探针上连接的荧光基团优选为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange560、TAMRA、CAL Fluor Red590、ROX、CALFluor Red 610、Cy5中的任一种，进一步优选为FAM、HEX、Cy5、ROX中的任一种。本发明所述淬灭基团优选为DABCYL、BHQ1、BHQ2、ECLIPSE、TAMRA中的任一种，进一步优选为BHQ1、BHQ2中的任一种。本发明中，通用荧光检测探针的种类≥1，不同种类的通用荧光检测探针上连接的荧光基团各不相同。
在本发明中，当体系中存在待测靶基因时，在进行PCR反应退火时，报告探针上的靶特异性序列与待测靶基因结合，上游引物和下游引物与待测靶标基因结合；延伸时，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物开始延伸，但是所述报告探针中的报告序列处于游离状态，而不与该待测靶基因序列杂交，在这种情况下，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解报告探针上的靶特异性序列，使报告探针上的报告序列被释放；所述报告序列能够与通用荧光检测探针结合，产生特定Tm的熔解峰。
在本发明中，当体系中不存在待测靶基因时，所述报告探针包含的报告序列也能够与通用荧光检测探针结合，但其5’端荧光基团可以被报告探针所包含的靶特异性序列5’端附近的淬灭基团所淬灭，不会发出荧光，也不会产生荧光探针背景，从而不会影响多重PCR中其它靶序列的检测，因此当不存在靶基因时不会产生溶解峰。
在本发明中，当存在多个靶基因时，根据多个不同的待测靶基因序列设计特异性的上、下游引物和报告探针，并设计通用荧光检测探针，本发明同一条荧光检测探针可与多条报告探针中包含的报告序列杂交，其中所述报告序列长度不同；游离下来的不同长度报告序列与通用荧光检测探针结合，在熔解段产生不同Tm的熔解峰，进而能够区分不同的待测靶基因(如图1)。
本发明还提供了一种同时检测样品中多个靶标基因的试剂盒，包括上述的针对不同靶标序列的特异性上游引物、下游引物、报告探针以及多种通用荧光检测探针。
在本发明中，所述通用荧光检测探针包括：通用荧光检测探针1、通用荧光检测探针2、通用荧光检测探针3或通用荧光检测探针4。本发明所述通用荧光检测探针1的序列名称为MB-P1，具体序列如SEQ ID NO:1所示，为5’-ACGCTTCCCCCACAACAGTTTCCTCTCGTACGAGCGT-3’，5’端优选的连接有FAM，3’端优选的连接有BHQ1。本发明所述通用荧光检测探针2的序列名称为MB-P2，具体序列如SEQ ID NO:16所示，为5’-AGCGATTAAATGAGATAGGAATGGAAGAGTCGATCGCT-3’，5’端优选的连接有HEX，3’端优选的连接有BHQ1。本发明所述通用荧光检测探针3的序列名称为MB-P3，具体序列如SEQ ID NO:29所示，为5’-AGGCCATGCAGTGACAACACGTACTTCGGCCT-3’，5’端优选的连接有Cy5，3’端优选的连接有BHQ2。本发明所述通用荧光检测探针4的序列名称为MB-P4，具体序列如SEQ ID NO:42所示，为5’-AACGGGTTCATAGTAACGCCTAGCCTTTTGAGTGCTTCCCGTT-3’，5’端优选的连接有ROX，3’端优选的连接有BHQ2。
在本发明中，所述靶标基因包括RNA病毒、DNA病毒、细菌、肺炎支原体以及肺炎衣原体的核酸。本发明所述RNA病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、鼻病毒以及人偏肺病毒；所述DNA病毒包括腺病毒以及博卡病毒；所述细菌包括百日咳鲍特菌。
在本发明中，所述鼻病毒为A型、B型或C型，所述鼻病毒的引物序列包括RHV-F序列和RHV-R序列，所述RHV-F序列如SEQ ID NO:2所示，为AGCCTGCGTGGCKGC；所述RHV-R序列如SEQ ID NO:3所示，为CACGGACACCCAAAGTAGT。本发明所述鼻病毒的报告探针序列名称为RHV-P，序列如SEQ ID NO:4所示，为5’-GTGGGGGAAGCGTTCCTCCGGCCCCTGAATG-3’，优选的在第13位碱基T的C6上连接一个NH2，在第17位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述乙型流感病毒为victoria型或Yamgata型，所述乙型流感病毒的引物序列包括InfluB-F序列和InfluB-R序列，所述InfluB-F序列如SEQ ID NO:5所示，为ATGGCCATCGGATCCTCA；所述InfluB-R序列如SEQ ID NO:6所示，为GTGCTCTTGACCAAATTGGG。本发明所述乙型流感病毒的报告探针序列名称为InfluB-P，序列如SEQ ID NO:7所示，为5’-GTTGTGGGGGAAGCGTACATTCAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCG-3’，优选的在第16位碱基T的C6上连接一个NH2，在第20位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述甲型流感病毒为H1N1、H5N1、H7N9或H3N2，所述甲型流感病毒的引物序列包括InfluA-F序列和InfluA-R序列，所述InfluA-F序列如SEQ ID NO:8所示，为ATGAAACGRAAACGGGACTC；所述InfluA-R序列如SEQ ID NO:9所示，为TAATTGATGGCCATCCGAAT。本发明所述甲型流感病毒的报告探针序列名称为InfluA-P，序列如SEQ ID NO:10所示，为5’-AACTGTTGTGGGGGAAGCGTACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAAAAG-3’，优选的在第20位碱基T的C6上连接一个NH2，在第23位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述呼吸道合胞病毒为A型或B型。本发明所述呼吸道合胞病毒A型的引物序列包括RSVA-F序列和RSVA-R序列，所述RSVA-F序列如SEQ ID NO:11所示，为TAAAGAGTGTTGTTAGTGGAGATATAC，所述RSVA-R序列如SEQ ID NO:12所示，为GAACCACTTTAAGATGTTCATATGC。本发明所述呼吸道合胞病毒B型的引物序列包括RSVB-F序列和RSVB-R序列，所述RSVB-F序列如SEQ ID NO:13所示，为TGAAGAGTGTAGTTAATGGAGATATAT；所述RSVB-R序列如SEQ ID NO:14所示，为ATTCATATGCTTGTGGTTTATAAGC。本发明所述呼吸道合胞病毒A型和呼吸道合胞病毒B型的报告探针序列名称为RSV-P，序列如SEQ ID NO:15所示，为5’-TACGAGGAAACTGTTGTGGGGGAAGCGTTATCATATTCTATAGCTGGACGTAATGAAGTWTTCAGCAA-3’，优选的在第28位碱基T的C6上连接一个NH2，在第31位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述人偏肺病毒包括A型和B型，所述人偏肺病毒的引物序列包括HMPV-F序列和HMPV-R序列，所述HMPV-F序列如SEQ ID NO:17所示，为GACARTCAARATGATTATGAGTAATTAAAAAA；所述HMPV-R序列如SEQ ID NO:18所示，为GCTGCTTCATTACCCATGAA。本发明所述人偏肺病毒的报告探针序列名称为HMPV-P，序列如SEQ ID NO:19所示，为5’-CTATCTCATTTAATCGCTCTGTTTATAACAGACAAATTCTCTCAAA-3’，优选的在第18位碱基T的C6上连接一个NH2，在第22位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述肺炎衣原体的引物序列包括CP-F序列和CP-R序列，所述CP-F序列如SEQ ID NO:20所示，为GTATACGCGGTAGGAGAGT；所述CP-R序列如SEQ ID NO:21所示，为CGTTACTTATGCCATGGATCTTT。本发明所述肺炎衣原体的报告探针序列名称为CP-P，序列如SEQ ID NO:22所示，为5’-ATTCCTATCTCATTTAATCGCTAGTGAAGGTATACCGAAAGGAGTGC-3’，优选的在第22位碱基T的C6上连接一个NH2，在第25位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述肺炎支原体的引物序列包括Mp-F序列和Mp-R序列，所述Mp-F序列如SEQ ID NO:23所示，为GGAAACAGCTATCATTAATTGATGAATAA；所述Mp-R序列如SEQ ID NO:24所示，为CCCTACAACCCCTATCTAATGATAA。本发明所述肺炎支原体的报告探针序列名称为Mp-P，序列如SEQ ID NO:25所示，为5’-CTTCCATTCCTATCTCATTTAATCGCTGGTGAAGTGAAACATCTCAGTAGCCACAGGAAAAGA AAAC-3’，优选的在第27位碱基T的C6上连接一个NH2，在第30位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述百日咳鲍特菌的引物序列包括BP-F序列和BP-R序列，所述BP-F序列如SEQ ID NO:26所示，为GTCTTAATTATTACCGCTGGACAGTA；所述BP-R序列如SEQ ID NO:27所示，为GGAAGAAGCACAGCGTGC。本发明所述百日咳鲍特菌的报告探针序列名称为BP-P，序列如SEQ ID NO:28所示，为5’-GATCGACTCTTCCATTCCTATCTCATTTAATCGCTCATACCAACACAACATACACACGCAACCC GCGTCGCTGCCAGTC-3’，优选的在第35位碱基T上连接一个HEX，在第38位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ1，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述新型冠状病毒的引物序列包括nCoV-F序列和nCoV-R序列，所述nCoV-F序列如SEQ ID NO:33所示，为CCCTGTGGGTTTTACACTT；所述nCoV-R序列如SEQ ID NO:34所示，为ACGATTGTGCATCAGCTGA。本发明所述新型冠状病毒的报告探针序列名称为nCoV-P，序列如SEQ ID NO:35所示，为5’-GTTGTCACTGCATGGCCTGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATC-3’，优选的在第18位碱基T的C6上连接一个NH2，在第22位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述副流感病毒1型的引物序列包括HPIV1-F序列和HPIV1-R序列，所述HPIV1-F序列如SEQ ID NO:36所示，为GGACTATAGGAGAAAAAAGTCTTA；所述HPIV1-R序列如SEQ ID NO:37所示，为TAAATGATGTCATATATATCTGATTTATC。本发明所述副流感病毒1型的报告探针序列名称为HPIV1-P，序列如SEQ ID NO:38所示，为5’-ACGTGTTGTCACTGCATGGCCTCATTATCATCTCTCTACTCTGCTAATATAACAG-3’，优选的在第22为碱基T的C6上连接一个NH2，在第25位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述副流感病毒2型的引物序列包括HPIV2-F序列和HPIV2-R序列，所述HPIV2-F序列如SEQ ID NO:39所示，为TCTCCTCAGCTGGATCCG；所述HPIV2-R序列如SEQ IDNO:40所示，为CCGACCCATGCAATACTCC。本发明所述副流感病毒2型的报告探针序列名称为HPIV2-P，序列如SEQ ID NO:41所示，为5’-CCGAAGTACGTGTTGTCACTGCATGGCCTAATAGAGAAAGAGCAAGAGGCAACCA-3’，优选的在第29为碱基T的C6上连接一个NH2，在第32位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述副流感病毒3型的引物序列包括HPIV3-F序列和HPIV3-R序列，所述HPIV3-F序列如SEQ ID NO:43所示，为AGCACCGACCCCCAAGA；所述HPIV3-R序列如SEQ IDNO:44所示，为AGATGGTGGCACTGAGTTG。本发明所述所述副流感病毒3型的报告探针序列名称为HPIV3-P，序列如SEQ ID NO:45所示，为5’-CGTTACTATGAACCCGTTTATCGGAAAACGACACAATCAACACAAGAACCCA-3’，优选的在第18位碱基T的C6上连接一个NH2，在第21位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述副流感病毒4型的引物序列包括HPIV4-F序列和HPIV4-R序列，所述HPIV4-F序列如SEQ ID NO:46所示，为AGATCAGCTCAGAGTACTAACTC；所述HPIV4-R序列如SEQ ID NO:47所示，为TTTCATCTGAGTTACTCCRTCATC。本发明所述副流感病毒4型的报告探针序列名称为HPIV4-P，序列如SEQ ID NO:48所示，为5’-GGCGTTACTATGAACCCGTTCCTACTTCAGCAAATTTGACCCATCGATTAGATG-3’，优选的在第20位碱基T的C6上连接一个NH2，在第23位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述博卡病毒的引物序列包括HBOV-F序列和HBOV-R序列，所述HBOV-F序列如SEQ ID NO:49所示，为ACAAGTCTTGGGCATGCACCATATTA；所述HBOV-R序列如SEQ IDNO:50所示，为GCTTTATTGTCTGAGTCAAGCGAAGT。本发明中，所述博卡病毒的报告探针序列名称为HBOV-P，序列如SEQ ID NO:51所示，为5’-GCTAGGCGTTACTATGAACCCGTTCTTTACAGCTCTCACATATCTTTTTCATCTACATCCTG-3’，优选的在第24位碱基T的C6上连接一个NH2，在第27位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
在本发明中，所述腺病毒为1型、2型、3型、4型、5型、7型或55型。所述腺病毒的引物序列包括ADV-F序列和ADV-R序列，所述ADV-F序列如SEQ ID NO:52所示，为GTGCGAGGATGMGAGCCRAT；所述ADV-R序列如SEQ ID NO:53所示，为CTACTTYCAYCACATCAACAGCCA。本发明所述腺病毒的报告探针序列名称为ADV-P，序列如SEQID NO:54所示：5’-AAAGGCTAGGCGTTACTATGAACCCGTTACTGGATCTCCTGCCACCAGTTGGAGGA-3’，优选的在第28位碱基T的C6上连接一个NH2，在第31位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以检测十五种呼吸道病原体的方法为例来说明本发明的实施方案，同时来验证本方法的检测性能，但本发明不仅限于呼吸道病原体，其他病毒、细菌、真菌等病原体的检测均适用。
十五种呼吸道病原体包括10种RNA病毒(新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒3型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)、1种细菌(百日咳鲍特菌)以及肺炎支原体、肺炎衣原体。此外，还包括人核糖核酸酶P(人RNase P)，作为对照。
所述人核糖核酸酶P的引物序列包括MRP-F序列和MRP-R序列，所述MRP-F序列如SEQ ID NO:30所示，为GATACTGTTCAGAGGTGGTG；所述MRP-R序列如SEQ ID NO:31所示，为CATTTCGCCACGGATACTTCAT。所述人核糖核酸酶P的报告探针序列名称为MRP-P，序列如SEQID NO:32所示，为5’-TCACTGCATGGCCTAATGACAACCACTTCTTGGCAAAGTGAATCA-3’，优选的在第14位碱基T的C6上连接一个NH2，在第17位碱基T上连接一个淬灭基团BHQ2，在3’端连接有一个NH2。
(一)临床样本采集
检测样品由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，鼻拭子、咽拭子。采集方法如下：
(1)请病人先用生理盐水漱口。
(2)拭子放入生理盐水中湿润。
(3)鼻拭子采集：以拭子测量鼻孔到耳根的距离并以手指做标记，将拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻孔，直至手指触及鼻子，使拭子在鼻内停留15-30秒，然后轻轻旋转3次。咽拭子采集：由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔黏膜等处。
(4)将拭子投入病毒运送培养基中，折断拭杆，使其完全置于管中。
(5)旋紧管盖，做好标记，放入塑料袋密封好。
(6)保存于4℃或冰上(短期保存)。
(二)临床样本核酸提取
采用市售的核酸提取试剂盒(磁珠法、柱提法或其他方法)，按照其说明书要求进行核酸提取，提取DNA/RNA后可立刻进行检测或储存于-80℃冰箱用于后续检测。
(三)多重PCR反应检测呼吸道病原体
对提取得到的样本核酸进行多重PCR反应。使用的反应液Mix包括1×buffer(55mMTris-HCl，20mM(NH4)2SO4，60mM TMAC和5％DMSO，3.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs)以及2.0U的5×Onestep U(购自于诺唯赞)。多重PCR反应体系共20μL，包括反应液Mix 3.2μL，引物、探针共1.3μL，样品模板5μL，Rnase free water 10.5μL。检测方法的扩增程序为：逆转录55℃10min，预变性95℃5min，50个循环扩增步骤(变性95℃20s，退火60℃30s，延伸72℃30s)，之后95℃变性2min，30℃保温3min，从30℃-80℃进行熔解曲线分析，实验在SLAN96P实时荧光PCR仪上进行每次检测都要设置阳性对照组和阴性对照组，所述阳性对照组为仅将样品模板替换为阳性质粒(10copies/μL)；所述阴性对照组为仅将样品模板去掉。本试验采用的引物、探针序列见表1，引物、探针浓度见表2。
表1十五种呼吸道病原体及人核糖核酸酶P引物、探针序列
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注：序列中Y＝C/T，W＝A/T，B＝G/T/C，N＝A/T/C/G，R＝A/G，K＝G/T。
表2各引物、探针的浓度
(四)结果判读
根据熔解曲线峰图和内标扩增情况，确定样本中是否存在待检的呼吸道病原体，根据荧光通道的类型和熔解温度，来判断感染的病毒类型，各型别病毒对应的熔解温度如表3所示。
表3十五种呼吸道病原体及人核糖核酸酶P检测结果的判读标准
实验结果与分析：
(1)鼻病毒、肺炎支原体、百日咳鲍特菌、呼吸道合胞病毒检测
采用上述所描述的引物、探针、反应体系及实验方案对含有副流感4、博卡病毒及对照DNA(人RNase P基因)的样本进行检测。
图2结果显示在Cy5通道52.9℃处有明显熔解峰，对应人核糖核酸酶P；ROX通道中，在57.1、63.1℃处有明显熔解峰，分别对应副流感4及博卡病毒，且阴性孔中无熔解峰。
(2)新型冠状病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒检测
采用上述所描述的引物、探针、反应体系及实验方案对含有新型冠状病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒及对照DNA(人RNase P基因)的样本进行检测。
图3结果显示在Cy5通道中，52.7、58.6℃处有两个明显熔解峰，分别对应内标与新型冠状病毒；在FAM通道中，52.6、57.4、65.1、73.0℃处有四个明显熔解峰，分别对应鼻病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒及呼吸道合胞病毒，且阴性孔中无熔解峰。
(3)十五重检测
采用上述所描述的引物、探针、反应体系及实验方案对所述15种呼吸道病原体(新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒3型、鼻病毒和人偏肺病毒、腺病毒、博卡病毒、百日咳鲍特菌、肺炎支原体、肺炎衣原体)及对照DNA(人RNase P基因)本进行检测。
图4显示在HEX通道中，48.6、55.1、61.8、68.5℃处有4个明显熔解峰，分别对应人偏肺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳鲍特菌；在Cy5通道中，52.4、58.9、66.2、71.5℃处有4个明显熔解峰，分别对应人RNase P、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型；图5显示在FAM通道中，52.5、57.0、66.1、71.2℃处有4个明显熔解峰，分别对应鼻病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒及呼吸道合胞病毒；在ROX通道中，52.2、58.1、63.7、69.9℃处有4个明显熔解峰，分别对应副流感病毒3型、副流感病毒4型、博卡病毒、腺病毒；且阴性孔中无熔解峰。
综上实验结果表明利用本发明方法设计引物、探针能够实现十六重(15种呼吸道病原体及1种人核糖核酸酶)检测，并且能够很好的对每一种病原检测。
实施例2灵敏度实验验证
以所述15种呼吸道病毒构建质粒为模板，浓度为100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL、0.5copies/μL，取5μL作为模板，每种浓度做3个平行反应，同时设置无模板对照(NTC)。
实验结果：本发明体系的灵敏度测试结果如图6，图中实线由高到低分别为100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL、虚线代表0.5copies/μL，15种呼吸道病原体的质粒样品均能检测到2.5拷贝/反应。本发明熔解曲线方法检测灵敏度高，对于低含量病原体样本的敏感度更高。
对比例1
分子信标探针体系：使用乙型流感病毒引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，根据引物之间的靶特异序列设计颈环分子信标探针，其探针序列为InfluB-MB：5’-CAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGGCTTG-3’，下划线的碱基为分子信标探针的茎序列。其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。
利用上述分子信标探针进行PCR反应，该PCR反应体系共计20μL，包括：引物探针0.2μL，10copies/μL Influ B模板5μL，Mix反应液3.2μL以及Rnase free water11.6μL。PCR反应程序条件同上。
实验结果如图7-8所示，图7为分子信标探针体系中乙型流感病毒的溶解峰与原始荧光曲线，图8为本发明体系中乙型流感病毒的溶解峰与原始熔解曲线，可以看出，普通分子信标体系中，其原始荧光曲线中初始荧光较高，高达3711.00，其溶解峰较小；本发明体系中，初始荧光较低，为1254.44，其溶解峰较高，由此可看出本发明背景荧光较低，进而提高检测准确性和灵敏度。
由以上实施例和试验例可知，采用本发明检测方法，针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物、报告探针以及通用荧光检测探针，通过将报告序列与靶特异性序列连接并对其进行修饰，使得当待测靶基因序列存在时报告序列可以直接与检测探针结合而产生熔解峰，相比于现有技术，报告序列无需二次扩增，提高了靶标的灵敏性，降低了体系的复杂性，使得该方法对反应体系具有广泛适用性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用荧光探针检测多靶标基因序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)针对待测靶基因序列设计特异的上游引物、下游引物和报告探针；
所述报告探针从5’至3’方向依次包含报告序列和靶特异性序列，3’端进行封闭，所述报告序列不与待测靶基因序列互补，所述报告序列与通用荧光检测探针5’端部分序列互补；所述靶特异性序列与待测靶基因序列互补，且在靶特异性序列5’端前1-5碱基范围内连接一个淬灭基团；
(2)设计通用荧光检测探针，所述通用荧光检测探针为茎环结构，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
(3)将待测样品的DNA、通用荧光检测探针和针对若干待测靶基因的上游引物、下游引物、报告探针混合进行荧光PCR，并依据Tm熔解峰来判别待测样品中存在待测靶基因数量与种类：当没有Tm熔解峰出现时，判断待测样品中不存在待测靶基因；当存在多个Tm熔解峰时，根据每个熔解峰的Tm值来判断待测样品中存在的待测靶基因的种类。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述报告序列最后一个碱基T上修饰封闭基团。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述报告序列的长度为10-500nt。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述通用荧光检测探针的种类≥1；所述通用荧光检测探针上连接的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange560、TAMRA、CAL Fluor Red590、ROX、CALFluor Red 610、Cy5中的任一种；所述淬灭基团包括DABCYL、BHQ1、BHQ2、ECLIPSE、TAMRA中的任一种；
不同种类的通用荧光检测探针上连接的荧光基团各不相同。
5.一种同时检测样品中多个靶标基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的针对不同靶标序列的特异性上游引物、下游引物、报告探针以及多种通用荧光检测探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述通用荧光检测探针包括：通用荧光检测探针1、通用荧光检测探针2、通用荧光检测探针3或通用荧光检测探针4；
所述通用荧光检测探针1的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述通用荧光检测探针2的序列如SEQ ID NO:16所示；
所述通用荧光检测探针3的序列如SEQ ID NO:29所示；
所述通用荧光检测探针4的序列如SEQ ID NO:42所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述靶标基因包括RNA病毒、DNA病毒、细菌、肺炎支原体以及肺炎衣原体的核酸。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、鼻病毒以及人偏肺病毒；
所述DNA病毒包括腺病毒以及博卡病毒；
所述细菌包括百日咳鲍特菌。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述鼻病毒的引物序列包括序列SEQ IDNO:2和序列SEQ ID NO:3，所述鼻病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:4所示；
所述乙型流感病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:5和序列SEQ ID NO:6，所述乙型流感病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:7所示；
所述甲型流感病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:8和序列SEQ ID NO:9，所述甲型流感病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:10所示；
所述呼吸道合胞病毒A型的引物序列包括序列SEQ ID NO:11和序列SEQ ID NO:12；
所述呼吸道合胞病毒B型的引物序列包括序列SEQ ID NO:13和序列SEQ ID NO:14；
所述呼吸道合胞病毒A型和呼吸道合胞病毒B型的报告探针序列如SEQ ID NO:15所示；
所述人偏肺病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:17和序列SEQ ID NO:18，所述人偏肺病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:19所示；
所述肺炎衣原体的引物序列包括序列SEQ ID NO:20和序列SEQ ID NO:21，所述肺炎衣原体的报告探针序列如SEQ ID NO:22所示；
所述肺炎支原体的引物序列包括序列SEQ ID NO:23和序列SEQ ID NO:24，所述肺炎支原体的报告探针序列如SEQ ID NO:25所示；
所述百日咳鲍特菌的引物序列包括序列SEQ ID NO:26和序列SEQ ID NO:27，所述百日咳鲍特菌的报告探针序列如SEQ ID NO:28所示；
所述新型冠状病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:33和序列SEQ ID NO:34，所述新型冠状病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:35所示；
所述副流感病毒1型的引物序列包括序列SEQ ID NO:36和序列SEQ ID NO:37，所述副流感病毒1型的报告探针序列如SEQ ID NO:38所示；
所述副流感病毒2型的引物序列包括序列SEQ ID NO:39和序列SEQ ID NO:40，所述副流感病毒2型的报告探针序列如SEQ ID NO:41所示；
所述副流感病毒3型的引物序列包括序列SEQ ID NO:43和序列SEQ ID NO:44，所述副流感病毒3型的报告探针序列如SEQ ID NO:45所示；
所述副流感病毒4型的引物序列包括序列SEQ ID NO:46和序列SEQ ID NO:47，所述副流感病毒4型的报告探针序列如SEQ ID NO:48所示；
所述博卡病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:49和序列SEQ ID NO:50，所述博卡病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:51所示；
所述腺病毒的引物序列包括序列SEQ ID NO:52和序列SEQ ID NO:53，所述腺病毒的报告探针序列如SEQ ID NO:54所示。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363767A (zh) * 2023-12-07 2024-01-09 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293659A (zh) * 2013-07-19 2015-01-21 厦门万泰沧海生物技术有限公司 一种全封闭一体式核酸扩增与检测管
CN109988865A (zh) * 2018-01-03 2019-07-09 厦门大学 一种检测呼吸道病毒的方法
KR20200144498A (ko) * 2019-06-17 2020-12-29 강릉원주대학교산학협력단 핵산 검출 방법
CN114622000A (zh) * 2020-12-14 2022-06-14 厦门大学 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法
WO2023109032A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293659A (zh) * 2013-07-19 2015-01-21 厦门万泰沧海生物技术有限公司 一种全封闭一体式核酸扩增与检测管
CN109988865A (zh) * 2018-01-03 2019-07-09 厦门大学 一种检测呼吸道病毒的方法
KR20200144498A (ko) * 2019-06-17 2020-12-29 강릉원주대학교산학협력단 핵산 검출 방법
CN114622000A (zh) * 2020-12-14 2022-06-14 厦门大学 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法
WO2022126721A1 (zh) * 2020-12-14 2022-06-23 厦门大学 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法
WO2023109032A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERND FALTIN 等: "Mediator Probe PCR A Novel Approach for Detection of Real-Time PCR Based on Label-Free Primary Probes and Standardized Secondary Universal Fluorogenic Reporters", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 58, no. 11, pages 1546 - 1556, XP002694250, DOI: 10.1373/clinchem.2012.186734 *
MICHAEL LEHNERT 等: "Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides", ANAL. METHODS,, vol. 10, pages 3444 - 3454, XP055931738, DOI: 10.1039/C8AY00812D *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363767A (zh) * 2023-12-07 2024-01-09 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用
CN117363767B (zh) * 2023-12-07 2024-04-05 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用

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