CN106834543A

CN106834543A - 人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN106834543A
Application number: CN201710118846.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡启良; 丁玲; 朱青; 朱彩霞
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-03-01
Also published as: CN106834543B

Abstract

本发明公开一种人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，包括特异性扩增HSV‑1 RL2，HSV‑2 UL28，VZV ORF26，EBV EBNA1，HCMV IE，HHV‑6A或HHV‑6B U22，HHV‑6A或HHV‑6B IE，HHV‑7 U95和KSHV ORF72的正反向引物和相应内参标品；还公开了一种包括上述检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂盒；还公开了一种包括上述检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速定量试剂以及检测与定量试剂盒。本发明可针对不用来源的感染早期临床样本进行快速、有效的各亚型鉴别与诊断，还可方便、准确地进行病毒拷贝数定量计算，具有很高的临床诊断使用价值。

Description

人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及检测试剂和试剂盒，具体涉及一种用于人疱疹病毒各亚型的快速检测与定量的试剂和试剂盒。

背景技术

人疱疹病毒(HHV)是一类双链DNA病毒，根据其保守结构蛋白序列可分为α、β、γ三个亚科，根据其基因组特性可分为8种亚型，即单纯疱疹病毒1，2型(HSV-1/2)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，疱疹病毒6，7(HHV-6A/6B/7)和卡波氏肉瘤病毒(KSHV)。已知人疱疹病毒在人群中感染率高，可入侵人体多种组织细胞，进而引起皮肤、粘膜、淋巴、肝、肺、生殖或神经系统等脏器感染，其特点为潜伏性强，常形成隐性或急慢性局部或全身感染。HHV初次感染后持续存在于宿主体内，形成潜伏感染，当受到各种非特异性刺激、抵抗力减弱、免疫功能下降时，易发生病毒的再激活，从而导致多种疾病。1型单纯疱疹主要通过性病感染，当感染皮肤及粘膜表面时会形成丘疹、脓疱和溃疡等；2型疱疹病毒与1型类似，是性传染病的病原体，最近的研究还发现，HSV-1主要造成口腔损伤而HSV-2主要引起生殖道感染；水痘-带状疱疹病毒是水痘的病原体，传染力极强，容易造成皮肤损伤；EB病毒与肿瘤发生相关，主要通过感染免疫细胞导致一些恶性疾，比如鼻咽癌，霍奇金淋巴瘤，伯基特淋巴瘤等；巨细胞病毒不仅可以感染生殖道、尿道，还可造成神经系统的损伤，尤其在新生儿人群中，存在一个较高的感染率；6型疱疹病毒在幼儿急诊普遍存在，感染后可导致肺炎、心肌炎，自身免疫系统疾病；HHV7也是一种嗜神经性病毒，在人群中存在较高的感染率；8型疱疹病毒即KSHV作为卡波氏肉瘤的病原体，与原发性渗透性淋巴瘤及等多种肿瘤发生相关，KSHV可以感染免疫细胞和上皮细胞，并通过母婴传播感染下一代。

近年来，鉴于HHV在肿瘤发生发展中的作用引起了科学家们的广泛关注，因此对于HHV相关肿瘤的病毒学监测显得尤为重要。发明专利CN 103773898 A公开一种人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒；发明专利CN 103820573 A公开一种同时检测四种常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的实时荧光定量PCR试剂盒；发明专利CN 103820574B公开一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒；发明专利CN 103866046 A公开一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒。但截止目前，临床上尚无高效、特异地可用于HHV各亚型病毒的快速检测和定量标准方案，大大影响了HHV的流行病学调查和早期临床诊断需求。

发明内容

针对现有HHV检测与定量技术存在的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，所述各亚型包括HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，HCMV，HHV-6A，HHV-6B，HHV-7，HSHV，所述检测试剂包括：

用于扩增所述HSV-1RL2靶基因片段的如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HSV-2UL28靶基因片段的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的正反向引物；

用于扩增所述VZV ORF26靶基因片段的如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的正反向引物；

用于扩增所述EBV EBNA1靶基因片段的如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HCMVIE靶基因片段的如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HHV-6A或HHV-6B U22靶基因片段的如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HHV-6A或HHV-6B IE靶基因片段的如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HHV-7U95靶基因片段的如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HSHV ORF72靶基因片段的如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示序列的正反向引物；

以及所述各亚型标准品，包括：

所述HSV-1RL2标准品，所述HSV-2UL28标准品，所述VZV ORF26标准品，所述EBVEBNA1标准品，所述HCMV IE标准品，所述HHV-6A或HHV-6B U22标准品，所述HHV-6A或HHV-6BIE标准品，所述HHV-7U95标准品，所述HSHV ORF72标准品。

优选地，

所述HSV-1 RL2标准品序列如SEQ ID NO.19所示；

所述HSV-2 UL28标准品序列如SEQ ID NO.20所示；

所述VZV ORF26标准品序列如SEQ ID NO.21所示；

所述EBV EBNA1标准品序列如SEQ ID NO.22所示；

所述HCMV IE标准品序列如SEQ ID NO.23所示；

所述HHV-6A或HHV-6B U22标准品序列如SEQ ID NO.24所示；

所述HHV-6A IE标准品序列如SEQ ID NO.25所示；

所述HHV-7U95标准品序列如SEQ ID NO.26所示；

所述HSHV ORF72标准品序列如SEQ ID NO.27所示。

本发明的又一目的在于提供一种包括上述检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂盒，该检测试剂盒还包括：用于进行各所述靶基因片段PCR扩增的反应试剂，如PCR反应液，ddH₂O等。

优选地，所述PCR扩增反应体系为12ul，其中每对所述检测试剂中的引物对(20uM)0.2ul，DNA模板50ng，PCR mix(2×)6ul，其余为ddH₂O；所述PCR扩增反应条件为：34个循环，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

优选地，该检测试剂盒还包括用于提取样本DNA的试剂，如蛋白酶K，Buffer等，还可包括DNA吸附柱。

本发明的第三个目的在于提供一种包括上述检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速定量试剂，所述定量试剂还包括：用于进行SYBRGreen荧光定量PCR扩增的试剂；所述SYBRGreen荧光定量PCR扩增反应体系为20ul，其中每对所述检测试剂中的引物对(10uM)0.5ul，DNA模板5u1；所述SYBRGreen荧光定量PCR扩增反应条件为：40个循环，95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s；各亚型病毒拷贝数定量标准曲线分别如下：

HSV-1： y＝-4.182x+43.865

HSV-2： y＝-3.4055x+41.128

VZV： y＝-2.874x+39.438

EBV： y＝-3.776x+46.351

HCMV： y＝-3.3564x+40.906

HHV-6A：y＝-3.5445x+43.155

HHV-6B：v＝-3.1004x+38.194

HHV-7：y＝-3.1009x+37.438

其中，y为Ct值，x为Log(拷贝数)。

本发明的第四个目的在于提供一种包括上述定量试剂的人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂盒，该定量试剂盒还包括用于进行各所述靶基因片段PCR扩增的反应试剂，如PCR反应液，ddH₂O等。该试剂盒不仅可通过普通PCR进行人疱疹病毒各亚型的快速鉴别与诊断，还可结合荧光定量PCR进行各亚型病毒拷贝数的快速定量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明分别选择人疱疹病毒各亚型编码潜伏期基因作为靶标序列，研制并开发出一套高效、快速、准确的人疱疹病毒各亚型检测和病毒拷贝数定量试剂，以及配套检测和定量试剂盒。针对不同来源的感染早期临床样本检测实践证明，本发明快速检测定量试剂及试剂盒以及配套检测和定量方案具有高特异性、准确性和可重复性，可同步高效区分人疱疹病毒各亚型并进一步进行拷贝数精确定量，填补了目前尚无人疱疹病毒全亚型检测与定量的技术空白，可作为标准化检测工具广泛应用人疱疹病毒感染早期快速确诊，流行病学调查，并辅助临床治疗用药，具有很高的临床诊断使用价值。

附图说明

图1为实施例1中273例皮肤组织疱疹病毒各亚型感染情况的检测结果示意图(琼脂糖凝胶电泳)。

图2为实施例2中1例水痘患者疱疹病毒感染情况的检测结果示意图(琼脂糖凝胶电泳)。

图3为实施例3中10例样品疱疹病毒感染情况的检测结果示意图(琼脂糖凝胶电泳)。

图4为HSV-1(RL2标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图5为HSV-2(UL28标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图6为VZV(ORF26标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图7为EBV(EBNA1标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图8为HCMV(IE标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图9为HHV-6A或HHV-6B(U22标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图10为HHV-6B(IE标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图11为HHV-7(U95标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

图12为KSHV(ORF72标准品)的病毒拷贝数定量标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图，详细说明本发明的具体实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。

以下实施例所采用实验材料和试剂如无特殊说明，均为市售通用商品。

实施例1 273例皮肤组织疱疹病毒各亚型感染情况的检测

样本：273例皮肤组织来源于上海市皮肤病医院患者，年龄在5～93岁之间，男女不限，收集每名患者不同器官或者组织(选择具有典型特征的病变部位，如上肢，右足，右面等，切取皮肤全层，包括表皮，真皮)，主要病理诊断为皮肤肿瘤，痣细胞痣，脂溢性皮炎或角化，湿疹等。

1.DNA提取

收集上述皮肤组织样本置于试管中，-80℃保存。使用DNA提取试剂盒(TissuegDNA kit，Biomiga)提取DNA，并初步检测DNA提取质量(OD260/280)和浓度。

具体操作如下：

(1)样品取出后先用PBS溶液冲洗，放在灭菌的吸水纸上将其揩干，于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块，样品先用经液氮研磨，研磨时待液氮蒸发，转移组织粉末至一干净的1.5mL离心管，加入500ul PBS缓冲液，12000g离心1分钟，小心弃上清，保留沉淀，加入200ul Buffer TL重悬沉淀；

(2)加入25ul蛋白酶K，涡漩以混匀，置于50℃水浴振荡培养以利于组织完全裂解，每20～30分钟，涡漩样品，一般情况下不超过3个小时；

(3)＞13000g离心5分钟，沉淀组织碎片。小心吸取上清，转移至离心管中；

(4)加入220ul Buffer BL，涡漩混匀，70℃中静置10分钟；

(5)加入220u1无水乙醇(室温)，涡漩混匀；

(6)将一个ezBind^TM DNA吸附柱插入2mL收集管，将步骤6中得到的所有溶液包括少量沉淀至吸附柱中，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中；

(7)向吸附柱中加入500ul Buffer KB，10000g离心1分钟，弃收集管与废液；

(8)将吸附柱放入一个新的收集管中，加入650ul DNA Wash Buffer，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中；

(9)加入450ul DNA Wash Buffer，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中；

(10)≥13000g开盖离心2分钟，彻底去除残留乙醇；

(11)将DNA吸附柱插入1.5mL离心管，向吸附柱中加入100-200ul预热(70℃)Elution Buffer(10mM Tris，pH 8.5)，室温静置1～3分钟，≥13000g离心1分钟，获得DNA样品。

2.PCR检测

PCR反应体系(12ul)：

采用的引物序列如表1所示：

表1 分型检测引物序列

PCR反应条件：共进行34个循环，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并用EB染色。

其中：2×Taq PCR Master Mix购买自易欣生物公司，引物由上海桑尼公司合成。

3.检测结果与分析

部分检测结果如图1所示(M：标准DNA分子量；+：各亚型标准品，1～8：待测DNA样品)。

如图1所示，8例样品中单纯疱疹病毒1、2型，水痘-带状疱疹，巨细胞病毒及卡波氏肉瘤病毒检测为阴性，其中，6号样品EB病毒检测为阳性，3～8号样品感染HHV-6，且3，4号样品为HHV-6A和HHV-6B阳性，其余为HHV-6B阳性；8例样品均未检测HHV-7。

实施例2 1例水痘患者(血浆)疱疹病毒感染情况的检测

样本：来源于复旦大学华山医院，样本取自女性水痘患者。

1.采用HMW法提取病人血浆DNA

(1)加入400ul HMW buffer重悬血浆(180ul)，同时加入40ul 10％SDS，20ul10mg/ul蛋白酶K，60℃水浴孵育5h；

HMW buffer配制如下(充分混匀后4℃保存)：

(2)加入等体积苯酚氯仿(1∶1)，4℃12000rpm/5min，收集上清，重复操作一次；

(3)加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的冰乙醇，-80℃1h，4℃12000rpm/5min；

(4)70冰乙醇洗一次，4℃12000rpm/5min；

(5)晾干(20min)，用ddH2O(20ul)溶解，放-20℃保存。

2.PCR检测

PCR反应体系(12ul)：

采用的引物同实施例1。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并用EB染色。

3.检测结果与分析

检测结果如图2所示(M：标准DNA分子量；+：各亚型标准品；-：无DNA模板阴性对照；T：待测DNA样品)。

如图2所示，该患者除VZV检测为阳性外，其余各亚型(HHV-7未检测)检测均为阴性，推测为水痘带状疱疹病毒感染。

实施例3 10例样品疱疹病毒感染情况的检测

样本：来源于上海市疾控中心，每例样本来源患者均疑似感染麻疹病毒。

1.DNA提取

于-80℃取出样品适量，使用DNA提取试剂盒(Tissue gDNA kit，Biomiga)提取DNA，并初步检测DNA提取质量和浓度，方法同实施例1。

2.PCR检测

反应体系和反应条件同实施例1。

3.检测结果与分析

检测结果如图3所示，对HSV-1：5例单纯感染麻疹病毒的样本均为阴性，5例混合感染的样本均为阳性；对于HSV-2：5例单纯感染麻疹病毒的样本均为阴性，5例混合感染的样本均为阳性；对于VZV：10例样品均为阳性。其余EBV、HCMV、HHV-6A/B、KSHV在单纯麻疹病毒感染及混合感染样本中均为阴性。

实施例4各亚型人疱疹病毒定量标准曲线的制定

1.构建标样质粒

构建各亚型人疱疹病毒标样质粒的引物序列如表2所示：

表2 标样质粒构建引物序列

各亚型人疱疹病毒标样质粒构建过程如下：

(1)HSV-1基因组自KOS菌株(购自ATCC，Cat：VR-1493D)提取获得，通过PCR得到RL2，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+148bp(RL2)＝5517bp酶切位点：NdeI/BamHI

(2)HSV-2基因组自G菌株(购自ATCC，Cat：VR-734D)提取获得，通过PCR得到UL28部分片段，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+228bp(UL28)＝5597bp酶切位点：NdeI/BamHI

(3)VZV基因组自Ellen菌株(购自ATCC，Cat：VR-1367D)提取获得，通过PCR得到ORF26部分片段，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+506bp(ORF26)＝5875bp酶切位点：NdeI/BamHI

(4)EBV基因组自B95.8菌株(购自ATCC，Cat：VR-1492)提取获得，通过PCR得到EBNA1部分片段，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+387bp(EBNA1)＝5759bp酶切位点：NdeI/BamHI

(5)HCMV基因组自AD169株(购自ATCC，Cat：VR-538D)提取获得，通过PCR得到IE部分片段，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+395bp(IE)＝5764bp酶切位点：NdeI/BamHI

(6)HHV-6B基因组自Z-29株(购自ATCC，Cat：VR-1467)提取获得，通过PCR得到U22，IE部分片段，插入到pET-28a载体上，重组质粒大小：

A/B通用：5369bp(pET-28a)+190bp(U22)＝5559bp酶切位点：NdeI/BamHI

A/B分型：5369bp(pET-28a)+340bp(IE)＝5709bp酶切位点：NdeI/BamHI

(7)HHV-7基因组U95基因片段由上海金唯智公司基因合成，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+290bp(U95)＝5659bp酶切位点：NdeI/BamHI

(8)KSHV基因组自BC3细胞系(购自ATCC，Cat：CRL-227)提取获得，通过PCR得到ORF72部分片段，插入到PET-28a载体上，重组质粒大小：5369bp(pET-28a)+609bp(ORF72)＝5978bp酶切位点：BamHI/EcoRI

2.计算标样质粒拷贝数(以EBV为例)

(1)用Nanodrop检测得EBV标样质粒浓度(ng/ul)：149.9ng/ul

(2)计算单个质粒的分子量，公式如下：m＝(n)(1.096e-21g/bp)其中，n＝质粒大小(bp)，e-21＝×10^-21，则m＝6.31e-18。

将构建所得上述标样质粒储存液按照表3所示进行稀释：

表3 标样质粒稀释过程

3.定量PCR反应(以EBV为例)

定量PCR反应体系(20ul)：

采用的引物序列为：

F：CCTGTAGGGGAAGCCGAT

R：CAATGGTGTAAGACGACATT

定量PCR反应条件：共进行40个循环，95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s。

其中：SYGB 2×Mix购买自Takara生物公司，引物由上海桑尼公司合成。

4.绘制标准曲线(以EBV为例)

EBV病毒拷贝数定量标准曲线如图7所示，y＝-3.776x+46.351当Ct值在12.02-27.405之间时可有效进行EBV拷贝数定量。

5.HHV其他分型病毒拷贝数定量标准曲线构建策略同EBV，HSV-1、HSV-2、VZV、HCMV、HHV-6A、HHV-6B、HHV-7、KSHV的病毒拷贝数定量标准曲线分别如图4、图5、图6、图8、图9、图10、图11、图12所示。

实施例5 4型疱疹病毒(EBV)拷贝数定量检测

样本：来自复旦大学华医院

1.DNA提取

于-20℃取出样品适量，使用HMW法提取血浆DNA，并初步检测DNA提取质量和浓度，方法同实施例1。

2.PCR及RT-PCR检测

反应体系和反应条件同实施例1，实施例4。

3.检测结果与分析

样本荧光定量PCR检测结果如表4所示：

表4 样本荧光定量PCR检测结果

根据EBV的病毒拷贝数定量标准曲线计算病毒拷贝数，结果为：该患者样本Ct值平均值大于27.405，EBV拷贝数约为10⁴个。

综上所述，通过临床样本检测实践证明，本发明检测和定量试剂及配套检测定量方案可针对不用来源的感染早期临床样本进行快速、有效的人疱疹病毒各亚型鉴别与诊断，还可方便、准确地进行病毒拷贝数定量计算。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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tatttttggt atccgcaatg tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cctgtagggg aagccgat 18

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gctgcggcat agaatcaagg agca 24

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgctcggaaa ggaaacatta 20

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<212> DNA

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aagtggaact gcttggtggc 20

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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tatttgggac ctttcaacaa tctctt 26

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<212> DNA

<213> 人疱疹病毒1型（Simplex)

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gccgaccccc tggcggtctt ccagccggcc cttagataag ggggcagttg gtggtcggac 120

gggtaagtaa cagagtctga ctaagggt 148

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<212> DNA

<213> 人疱疹病毒2型（Simplex)

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gtacagacct tcggaggtcg ggcggctgca gtcggggcgg cgcaactcaa gctccccgca 60

ccggtagacc gacgcaaaga gtgtggtggc gataatgagc tcgcgaatat atcgccaggc 120

ggcgcgctgg gtgggcgtga ttccggaaac accgtcaaaa cagtagaact tttgaaactc 180

gctgacggcc caatcagcgc ccgaaccccc cgcgcccatg atgaagcg 228

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<211> 506

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒3型（Varicello)

<400> 21

tcagctggct tttctaagaa ttcgcaaatg ctgtgtaccg gcttttttaa ttctttttgg 60

tattctcacc cttactgctg tcgtggtcgc cattgttgcc gtttttcccg aggaacctcc 120

caactcaact acatgaaact actgtccgga aggggaaggt atttattctc gcttgcagct 180

tgtcgcgcgt gtatgcacaa caaaagctat atatgtcacc aaagccaacg tcgccatctg 240

gagtactaca cccagtacgt tgcataacct gtccatttgc attttcagtt gcgcggacgc 300

ctttctccgg gatcgtggcc ttgggacatc aaccagtgga ataagaaccg ccggtggtct 360

tgtttgaacg acgagtggcg acgcgttgtt ctgcataagc tctgtatgct gatacataaa 420

cacagagtct gtatcgctat cagattcccg aacaccttcc ggtaccccat actccgatac 480

cctggacatt gcggatccca aaaata 506

<210> 22

<211> 387

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒4型（Lymphocrypto)

<400> 22

cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct 60

gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc 120

actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag 180

catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct 240

ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg 300

ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct 360

attccacaat gtcgtcttac accattg 387

<210> 23

<211> 395

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒5型（Cytomegalo)

<400> 23

gctgcggcat agaatcaagg agcacatgct gaaaaaatat acccagacgg aagagaaatt 60

cactggcgcc tttaatatga tgggaggatg tttgcagaat gccttagata tcttagataa 120

ggttcatgag cctttcgagg agatgaagtg tattgggcta actatgcaga gcatgtatga 180

gaactacatt gtacctgagg ataagcggga gatgtggatg gcttgtatta aggagctgca 240

tgatgtgagc aagggcgccg ctaacaagtt ggggggtgca ctgcaggcta aggcccgtgc 300

taaaaaggat gaacttagga gaaagatgat gtatatgtgc tacaggaata tagagttctt 360

taccaagaac tcagccttcc ctaagaccac caacc 395

<210> 24

<211> 190

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒6型（Roseolo)

<400> 24

cgctcggaaa ggaaacatta cacttagtat cattgtccac gaacacaaca ccaatatttt 60

tattgtatcg acataatatc ttagacccca tggcggtctc gataacgcat cgagggttaa 120

acaaaaaggc tatatctctt tcgaaataag cattaatagg cacactagcc atccgccacc 180

aagcagttcc 190

<210> 25

<211> 340

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒6型（Roseolo)

<400> 25

catatgttct ccagatgtgc cagggaaatc caaatatgta ggaacattca ctgaaaacag 60

cagacagtca ggggacgaac aaacaaaccc taactgtgta ggtacagcct cagtgacaga 120

tctgggcggc cctgataact tgaattccat cagcggcctc cagagttgta aaaacatgtt 180

gctagaaaga ctacttgaca ctcaatgtga ttcagtagtt gaagggacag aacaagatgg 240

ttccaatggc aaccctttaa tatcagaaat gttgatgttt ggttatgaaa ctgatcactc 300

ggcaccctat gagagtgaaa gcgataacaa tgtgggatcc 340

<210> 26

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

catatgacga tgtgcgtttc ggagaagtgg attatcaaac ctcttcggct cagacaaaaa 60

tttccaacca ccagttagcg ttgttgccaa caaattatca gcacatgata gggcaggaaa 120

cagacatttc atcgcgggat tatcacaatg acagtgctca aattatttac aattgctcat 180

ttcaacgaca gggaaaaagg cttcttgctg atattccata tagaccttgg ttaaaagaaa 240

atgttcccac aggggaatat ggaaaaagat ttgtcaaaac agtccctaga 290

<210> 27

<211> 609

<212> DNA

<213> 人疱疹病毒8型(Rhadino)

<400> 27

gttccactgc cgcctgtaga acggaaacat cgcatcccaa tatgcttgcc agctgaggaa 60

ctaccccacc cgagtgggta tcctgcggaa tgacgttggc aggaaccaac agcgcacagc 120

ctgcagcgct gataatagag gcgggcaatg agccagtctt tgggtcaact aaggcttttg 180

taatcagggt gttgacctcg tggtgccaaa agtccaggtg ttgggagccc cccagcaatt 240

taagtaacaa gaaggaagtg acgtccgtcg ctaagactgc ctctgttcgc cacgccaact 300

tctcaaggag ttctttctcc tggtctataa gttcttggcg ggaaaaggag tctgccgcgg 360

catagcaaag tgaactggta gaaataggcg tgaggcttct gagcttactg gccactaaca 420

ggcaggcgct ccctgtcttt tgaaagtgtt ctttggacac ctgctttata agtaggagtc 480

tgtccaaaag attaagggcc aacgcgacca cgttaggttc taggttgtat tcctggcaaa 540

ctgaaaacat ccatgtgccc agtaacttac gcatatgcga agtaagagat tgttgaaagg 600

tcccaaata 609

Claims

1.一种人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，所述各亚型包括HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，HCMV，HHV-6A，HHV-6B，HHV-7，KSHV，其特征在于：所述检测试剂包括：

用于扩增所述HSV-1 RL2靶基因片段的如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HSV-2 UL28靶基因片段的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HCMV IE靶基因片段的如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HHV-6A或HHV-6B U22靶基因片段的如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的正反向引物；

用于扩增所述HHV-7 U95靶基因片段的如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列的正反向引物；

用于扩增所述KSHV ORF72靶基因片段的如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示序列的正反向引物；

以及所述各亚型标准品，包括：

所述HSV-1 RL2标准品，所述HSV-2 UL28标准品，所述VZV ORF26标准品，所述EBVEBNA1标准品，所述HCMV IE标准品，所述HHV-6A或HHV-6B U22标准品，所述HHV-6A或HHV-6BIE标准品，所述HHV-7 U95标准品，所述HSHV ORF72标准品。

2.根据权利要求1所述的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，其特征在于：

所述HSV-1 RL2标准品序列如SEQ ID NO.19所示；

所述HSV-2 UL28标准品序列如SEQ ID NO.20所示；

所述VZV ORF26标准品序列如SEQ ID NO.21所示；

所述EBV EBNA1标准品序列如SEQ ID NO.22所示；

所述HCMV IE标准品序列如SEQ ID NO.23所示；

所述HHV-6A或HHV-6B U22标准品序列如SEQ ID NO.24所示；

所述HHV-6A IE标准品序列如SEQ ID NO.25所示；

所述HHV-7 U95标准品序列如SEQ ID NO.26所示；

所述KSHV ORF72标准品序列如SEQ ID NO.27所示。

3.一种包括权利要求1～2任一项所述的检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂盒，其特征在于还包括：用于进行各所述靶基因片段PCR扩增的反应试剂。

4.根据权利要求3所述的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为12ul，其中每对所述检测试剂中的引物对(20uM)0.2ul，DNA模板50ng，PCRmix(2×)6ul，其余为ddH₂O；所述PCR扩增反应条件为：34个循环，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s。

5.根据权利要求3所述的人疱疹病毒各亚型快速检测试剂盒，其特征在于还包括：用于提取样本DNA的试剂和DNA吸附柱。

6.一种包括权利要求1～2任一项所述的检测试剂的人疱疹病毒各亚型快速定量试剂，其特征在于所述定量试剂还包括：用于进行SYBRGreen荧光定量PCR扩增的试剂；所述SYBRGreen荧光定量PCR扩增反应体系为20ul，其中每对所述检测试剂中的引物对(10uM)0.5ul，DNA模板5ul；所述SYBRGreen荧光定量PCR扩增反应条件为：40个循环，95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s；各亚型病毒拷贝数定量标准曲线分别如下：

HSV-1：y＝-4.182x+43.865

HSV-2：y＝-3.4055x+41.128

VZV：y＝-2.874x+39.438

EBV：y＝-3.776x+46.351

HCMV：y＝-3.3564x+40.906

HHV-6A：y＝-3.5445x+43.155

HHV-6B：y＝-3.1004x+38.194

HHV-7：y＝-3.1009x+37.438

其中，y为Ct值，x为Log(拷贝数)。

7.一种包括权利要求6所述的定量试剂的人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂盒，其特征在于还包括：用于进行各所述靶基因片段PCR扩增的反应试剂。