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Die
Erfindung betrifft einen Microarray, ein Verfahren und einen Kit
zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Herpesviren und gegebenenfalls
von Adenoviren in einer Probe.
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Infektionen
mit Herpesviren und Adenoviren sind insbesondere in Transplantationspatienten
eine häufige
Ursache von Krankheiten und Todesfällen. In diesen Patienten erfolgt
die Diagnose einer Virusinfektion in der Klinik bisher durch den
Nachweis einzelner Viruse oder das Auftreten klinischer Symptome.
Aus diesem Grunde bleiben bisher Mehrfachinfektionen (durch mehrere
Viren) und subklinische Infektionen meist undiagnostiziert. Die
Häufigkeit
derartiger Mehrfachinfektionen und subklinische Infektionen und
die damit verbundene Morbiditäts-
und Mortalitätsrate
ist aus diesem Grund bisher nicht bekannt.
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Der
Nachweis dieser Viren erfolgt bisher in einer einfachen oder multiplex
PCR und anschließendem Nachweis
der amplifizierten DNA mit Ethidiumbromid in einem Agarosegel oder
Hybridiserung einer Oligonukleotid-Sonde wie z. B in einem Microwell-ELISA
oder eine Real-Time-PCR mit einer Virus-spezifischen DNA-Sonde.
In diesem Fall erfolgt der Nachweis durch die Detektion eines Flurophores,
welches durch die 5'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase
freigesetzt wird.
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Der
Nachteil der genannten Methoden liegt darin, dass für jedes
Virus eine getrennte, spezifische PCR-Amplifizierung erfolgen muss,
wodurch Zeit und Kosten erhöht
werden. Die Detektion mit Ethidiumbromid kann zudem zu falsch-positiven
Ergebnissen führen,
da ein Nachweis nicht über
Hybridisierung erfolgt. Eine Real-Time-PCR für alle Viren einem Schritt
durchzuführen
ist kostenaufwendig und technisch schwierig. In Multiplex-Assays
sind die Cross-Reaktivität
der Primer untereinander und unspezifische Reaktionen mit der nachzuweisenden
DNA problematisch und führen
zu falsch-positiven Nachweisen. Wird die Sensivität der Primer
zu gering gewählt,
erhält
man falsch-negative Resultate. Das richtige Gleichgewicht zwischen
ausreichender Sensivität
und Spezifität
zu finden ist daher in einem Multiplex-Assay technisch sehr schwierig.
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Aufgabe
der Erfindung ist es einen Microarray, ein Verfahren und einen Kit
anzugeben, die es erlauben, mehrere Herpesviren und Adenoviren parallel
nachzuweisen.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch einen Microarray der in mehrere Felder unterteilt ist und
mehrere Virus-spezifische Nukleinsäureproben enthält, wobei
jede unterschiedliche Sequenz in einem anderen Feld des Microarrays
aufgetragen ist.
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Der
erfindungsgemäße Microarray
enthält
mindestens je ein Feld:
- a) mit mindestens einer
Nukleinsäuresequenz,
die fähig
ist Herpes simplex Virus (HSV), insbesondere die Typen 1 und 2 (HHV1
und HHV2) nachzuweisen, ausgewählt
aus SEQ ID No. 1 und 2;
- b) mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die fähig ist
Varizella zoster Virus (VZV, HHV3) nachzuweisen, ausgewählt aus
SEQ ID No. 3 und 4;
- c) mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die fähig ist
Epstein-Barr-Virus (EBV, HHV4) nachzuweisen, ausgewählt aus
SEQ ID No. 5 und 6;
- d) mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die fähig ist
Cytomegalievirus (CMV, HHV5) nachzuweisen, ausgewählt aus
SEQ ID No. 7 und 8;
- e) mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die fähig ist
das Humane Herpesvirus 6 (HHV6), insbesondere die Typen A und B,
nachzuweisen, ausgewählt
aus SEQ ID No. 9 und 10.
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Bevorzugt
enthält
der erfindungsgemäße Microarray
mindestens ein weiteres Feld des Typs f), mit einer Nukleinsäuresequenz,
die fähig
ist Adenoviren, insbesondere die Subtypen A bis F, nachzuweisen,
ausgewählt
aus SEQ ID No. 11 bis 17.
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Bevorzugt
enthält
der Microarray jeweils 5 bis 100 Felder, vorzugsweise 10 bis 30
Felder, der Typen a) bis e) zum Nachweis der unterschiedlichen Herpesviren
und gegebenenfalls des Typs f) zum Nachweis der Adenoviren.
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Bevorzugt
enthält
der Microarray mindestens je ein Feld mit einer Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID
No. 1 bis 10 und gegebenenfalls SEQ ID No. 11 bis 17, wobei jede
unterschiedliche Sequenz in einem anderen Feld des Microarrays aufgetragen
ist. Bevorzugt enthält
der Array jeweils 3 bis 10 Felder, bevorzugt 4 bis 6, Felder für jede der
genannten Sequenzen.
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Der
Array enthält
vorzugsweise weitere Felder, die als negative und positive Kontrollen
dienen. Als positive Kontrolle wird bevorzugt der Marker, wie z.
B. Biotin, direkt aufgetragen. Alternativ verwendete Marker sind
Dioxygenin, radioaktive Marker oder Fluoreszenzfarbstoffe (wie z.
B. Fluorescein). Als negative Kontrolle (für den so genannten „Background") wird mindestens
ein Felder verwendet, das keine virusspezifische Nukleinsäure enthält. Darüber hinaus
ist eine Kontrolle vorgesehen, die eine mögliche Inhibierung, der für die Amplifizierung
verwendeten DNA-Polymerase (z. B. taq-Polymerase) durch Substanzen
in der Reaktionsmischung nachweist. Diese Kontrolle besteht aus
einer vorgegebenen Menge an DNA, die in die Reaktion vor Amplifikation
zugegeben wird. Diese zu amplifizierende Kontrollsequenz kann eukaryontischer
oder prokaryontischer Herkunft sein.
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Der
erfindungsgemäße Microarray
eignet sich vorteilhaft für
den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Herpesviren, insbesondere Humanem
Herpesvirus 6 (HHV6 Typen A und B), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr
virus (EBV), Varicella-Zoster-Virus (VZV, HHV3) und Herpes simplex
virus (Typen 1 und 2) und gegebenenfalls von Adenoviren, insbesondere
Adenovirus (Typen A bis F) in einer Probe.
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Der
Nachweis ist sehr sensitiv, so können
noch 10 Genomäquivalente
eines Viruses sicher nachgewiesen werden.
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Unter
Genomäquivalent
im Sinne der vorliegenden Erfindung wird dabei die zur gesamten
viralen Genom korrespondierende Menge an DNA, die in der Reaktion
amplifiziert wird, verstanden. Ein Beispiel dafür ist ein Fragment von 92 Nukleotiden,
das in der PCR-Reaktion amplifiziert wird. Dieses Fragment spiegelt
in der PCR Reaktion das gesamte Genom des Herpesvirus Typ 1 wieder.
Die Menge an Genomequivalenten wird durch das Molekulargewicht des
Fragments und die OD260/280 der Plasmid-Lösung ermittelt.
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Der
erfindungsgemäße Microarray
erlaubt vorteilhaft die frühzeitige
Erkennung und die Überwachung (monitoring)
mehrerer Virusinfektionen in hoher Effizienz und Wirtschaftlichkeit.
Eine direkte praktische Konsequenz ist das sich mit dem erfindungsgemäßen Microarray
die Diagnose und damit auch die Therapie von Viren in Transplantationspatienten
optimieren lässt.
Mit dem Microarray kann durch die frühe Viruserkennung und Behandlung
virus-assozierte Endorganerkrankungen vorgebeugt werden. Durch das
damit verbundene verbesserte Disease-Management werden auch Behandlungskosten
reduziert.
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Folgende
viralen Gensequenzen werden von dem erfindungsgemäßen Microarray
spezifisch erkannt:
| locusID
(Genbank No.) | geneSymbol | organisms | description |
| X04495 | UL30 | HSV1 | DNA-polvmerase |
| M16321 | UL30 | HSV2 | DNA-polvmerase |
| AB097933 | ORF62 | VZV | transactivator |
| M33515 | U56 | HHV6 | major
capsid protein |
| AY327256 | UL54 | CMV | DNA-polvmerase |
| AJ251097 | rpms1 | EBV | DNA-polvmerase |
| AJ854486 | | Adenovirus | hexon
protein |
| | | Adenovirus | hexon
protein |
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Auf
dem erfindungsgemäßen Array
sind bevorzugt folgende Nukleinsäuresequenzen
immobilisiert:
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Gegenstand
der Erfindung sind auch die Nukleinsäuresequenzen gemäß der SEQ
ID No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16 und 17.
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Der
Begriff Nukleinsäuren
im Sinne der Erfindung umfasst neben Desoyribonukleinsäuren (DNA)
und Ribonukleinsäuren
(RNA) auch alle anderen linearen Polymeren in denen die Basen Adenin
(A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) in entsprechender
Abfolge angeordnet sind, insbesondere Nukleinsäuren mit verändertem Rückgrat,
wie z. B. einem Phosphothioat, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten
Rückgrat,
Peptid-Nukleinsäuren
(PNA), und locked nucleic acids (LNA). Die Erfindung umfasst insbesondere
auch Microarrays bzw. Sequenzen, in denen mindestens ein T (Thymin)
einer der in den SEQ ID No. 1 bis 17 genannten Sequenzen durch Uracil
(U) ersetzt ist. In den Sequenzprotokollen und im Text sind alle Sequenzen,
wenn nicht anders angegeben in 5'->3' Richtung enthalten.
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Die
Nukleinsäuren
liegen auf dem erfindungsgemäßen Microarray
vorzugsweise als Einzelstrang vor und sind bevorzugt nur mit dem
3' oder 5'-Ende auf der Array-Oberfläche fixiert.
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Unter
einem Microarray wird im Sinne der Erfindung eine Anordnung von
molekularen Sonden, hier virus-spezifische Nukleinsäuren, auf
einem Träger
verstanden. Die einzelnen Sonden sind in definierten Feldern in
einem vorher festgelegten Muster aufgetragen, wobei jedes Feld üblicherweise
nur eine definierte Sonde, hier Nukleinsäuresequenz enthält. Die
Anordnung der Nukleinsäuren
bzw. Sonden auf dem Träger
wird dabei durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen
erzeugt. Ein Feld innerhalb der Anordnung, d. h. des Arrays, wird üblicherweise
als Spot bezeichnet. Der Array bildet somit die Detektionsfläche. Derartige Nukleinsäure-Microarrays
(häufig
auch DNA-Chips genannt) werden beispielsweise von den Firmen Affymetrix (Santa
Clara, Kalifornien, USA) und Clondiag (Jena, Deutschland) hergestellt,
wobei die Sequenzen der Nukleinsäuren,
die als Sonden auf dem Array aufgetragen werden, durch den Auftraggeber
bestimmt werden können.
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Der
Array hat bevorzugt eine rechteckige Grundfläche mit vorzugsweise einer
Gesamtfläche
von 1 mm bis 4 mm × 1
mm bis 4 mm, vorzugsweise von 2 mm × 2 mm, und ist vorzugsweise
in 50 bis 200 Felder gleicher Größe aufgeteilt.
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Die
Herstellung von Nukleinsäure-Microarrays
(mit anderen Sequenzen), der Aufbau des Trägermaterials und die Methoden
zur Fixierung der Nukleinsäure-Proben
auf der Oberfläche
des Trägermaterials
(Array-Oberfläche)
sind grundsätzlich
bekannt und ist beispielsweise in
WO
01/02094 und
WO 03/031063 beschrieben.
Auf die in diesen Dokumenten enthaltene Offenbarung bezüglich der
den Aufbau eines Microarrays und die Anordnung des Microarrays in
einer Vorrichtung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
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Bevorzugt
ist der erfindungsgemäße Microarray
in den Boden eines Laborreaktionsgefäss eingefügt. Unter Laborreaktionsgefäßen mit
einer typischen Form und Grösse
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere Reaktionsgefäße aus Kunststoff
(wie z. B. Polyethylen oder Polypropylen oder Polycarbonat) verstanden.
Derartige Reaktionsgefäße sind
bevorzugt Einweg-Reaktionsgefässe
mit 0,5 ml bis 2 ml Volumen, auch Tubes oder "Eppis" genannt, wie sie insbesondere in biologischen
bzw. molekularbiologischen Laboratorien üblicherweise verwendet werden
und fassen
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Besonders
bevorzugt ist der erfindungsgemäße Microarray
in einer Vorrichtung angeordnet, wie sie in der internationalen
Patentanmeldung
WO 03/059516 beschrieben
ist. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich einer
Vorrichtung zur Durchführung
von Array-Verfahren wird hiermit ebenfalls ausdrücklich Bezug genommen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die unterschiedlichen SEQ ID No. 1 bis 17, auf
einem Array mit 11 × 10
Feldern, wie folgt, angeordnet:
| 19 | 17 | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 19 |
| | 15 | 15 | 15 | 16 | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | |
| 19 | 13 | 13 | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 15 | 15 | 19 |
| 19 | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 13 | 13 | 13 | 19 |
| | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 11 | 11 | 11 | 11 | 19 |
| | 8 | 8 | 8 | 8 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 19 |
| | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 8 | 19 |
| | 4 | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 6 | 6 | 19 |
| | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | |
| 19 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 19 |
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Die
Felder 19 enthalten den Marker, bevorzugt Biotin als positive Kontrolle.
Die Felder ohne Zahlen und die Felder 18 (Spottingpuffer) dienen
als negative Kontrolle für
den Background.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum parallelen Nachweis der
oben genannten Viren mit dem erfindungsgemäßen MIcroarray.
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Das
Verfahren umfasst bevorzugt folgende Schritte:
- a)
Extraktion viraler DNA aus einer isolierten Probe,
- b) Amplifizierung der extrahierten viralen DNA mit Einbau eines
Markers in die amplifizierte DNA,
- c) Hybridisierung der amplifizierten DNA mit einem Microarray
nach einem der Ansprüche
1 bis 5,
- d) Detektion des Markers.
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In
den Schritten a) und b) des Verfahrens wird aus einer Probe, wie
z. B. Liquor, Blut, Serum, Speichel, Urin, Stuhl, in bekannter weise
virale DNA isoliert und amplifiziert.
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Die
Amplifizierung der DNA erfolgt bevorzugt per PCR (polymerase chain
reaction). Während
der Amplifikation wird durch die Verwendung eines entsprechend markierten
Primers bevorzugt ein Marker in die DNA eingebaut. Ein bevorzugter
Marker ist Biotin. Alternativ verwendete Marker sind Dioxygenin,
radioaktive Marker oder Fluoreszenzfarbstoffe (wie z. B. Fluorescein).
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Die
so erhaltene amplifizierte DNA wird in einem geeigneten Hybridisierungspuffer
aufgenommen und mit dem Microarray kontaktiert und zur Hybridisierung
inkubiert.
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Nach
2 bis 3 Waschschritten erfolgt die Detektion des Markers.
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Im
Falle des Biotins erfolgt die Detektion mit einem Biotin-binden
Protein, welches spezifisch und hoch affin Biotin erkennt, bevorzugt
Steptavidin oder Avidin, und an ein Enzym, wie z. B. Horsh radish
Peroxidase oder Alkalische Phosphatase, gekoppelt ist und einem
Substrat, welches durch das Enzym in einer Farbreaktion umgesetzt
wird.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Microarray
und Verfahren wird vorteilhaft der parallele qualitative Nachweis
des Adenovirus und den wichtigsten Herpesviren möglich.
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Der
erfindungemäße Microarray
und das zugehörige
Nachweisverfahren kombinieren vorteilhaft die leistungsfähige Vervielfältigung
von viraler DNA aus Patientenproben durch PCR mit einem preiswerten DNA-Microarray-Nachweissystem,
welches den gleichzeitigen Nachweis von bis zu 10 Virusen mit hoher
Sensivität
und hoher Spezifität
in einer Probe erlaubt. Durch die Erfindung wird es möglich die
Häufigkeit
von Mehrfachinfektionen und subklinischen viralen Infektionen zu
bestimmen. Darüber
hinaus lässt
sich die Relevanz von viralen Mehrfachinfektionen (Co-Infektionen
mit mehreren Viren) für
das Auftreten von Organschädigungen
(end-organ diseases) bestimmen.
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Soll
neben einem qualitativen Nachweis ein quantitativer Nachweis der
Virusmenge eines oder mehrerer Viren erfolgen, wird dazu bevorzugt
eine quantitative PCR durchgeführt,
in der die gleichen Virus-spezifischen Sequenzen, wie im Microarray,
als Sonden zur Anwendung kommen.
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Die
Erfindung umfasst daher auch ein Verfahren in der nach der Analyse
von viraler DNA mit dem erfindungsgemäßen Microarray anschließend die
in Schritt a) extrahierte virale DNA in eine quantitativen PCR analysiert
wird, in der die gleichen Reagenzien verwendet werden wie im Schritt
b) und mindestens eine der Sequenzen ausgewählt aus SEQ ID No. 1 bis 17
als Sonde eingesetzt wird. Die SEQ ID No. 1 bis 17 werden dazu bevorzugt
als so genannte FRET-Sonden (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)
eingesetzt und sind an ihrem 3' bzw.
5'-Ende entsprechend
modifiziert. Derartige modifizierte DNA-Sonden sind als TaqManTM oder Light-CyclerTM-Sonden
bekannt.
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Da
die quantitative PCR, wenn überhaupt,
nur für
die im Microarray als positive getesteten Viren durchgeführt werden
braucht, werden Kosten gespart.
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Ein
Problem der molekularen Diagnostik von viralen Erregern ist die
mangelnde Standardisierung und Vergleichbarkeit unterschiedlicher
Nachweismethoden. Verursacht wird dies vorwiegend durch eine fehlende Standardisierung
der Schritte der DNA-Extraktion, DNA-Amplifizierung und der Detektion.
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In
der vorliegende Erfindung werden für eine nachfolgende quantitative
Real-Time PCR, die gleichen Reagenzien, DNA-Sonden und Prozessbedingungen
für die
Schritte der DNA-Extraktion
und DNA-Amplifizierung verwendet. Die Resultate der Microarray-Analyse
und der gegebenenfalls ergänzend
durchgeführten quantitativen
Real-Time PCR lassen sich daher sehr zuverlässig vergleichen.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch ein Kit zum Nachweis von Viren, welches den
erfindungsgemäßen Microarray
enthält.
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Der
Kit enthält
bevorzugt mindestens einen der weiteren Bestandteile:
- – Reagenzien
für die
Extraktion viraler DNA, wie z. B. Zell-Lyse-Puffer, chromatographische
Säulen
und Elutionspuffer,
- – Reagenzien
für die
Amplifizierung viraler DNA, wie z. B. Primer (Oligonukleotide, teilweise
biotinyliert), dNTPS, DNA-Polymerase, Puffer, Hybridisierungssonden
- – Waschpuffer
und Hybridisierungspuffer,
- – Reagentien
für die
Detektion, wie biotin-bindende enzymkunjugierte Proteine (z. B.
Streptavidin-Peroxidase oder Avidin-Alkalische Phoshatase) und entsprehende
Substrate (wie z. B. Tetramethylbenzidin),
- – Reaktionsgefäße (z. B.
Kapillaren, Tubes) und ggf. Vorrichtungen, wie Pipettierroboter,
PCR-Cycler und Array-Reader (wie z. B. den Array-Tube-Reader).
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Gegebenfalls
enthält
der Kit als weitere Bestandteil die Reagenzien für eine quantitative Real-Time PCR, wie z.
B. die SEQ ID No. 1 bis 17 als FREI Sonden (z. B. LightCyclerTM oder TaqmanTM-Sonden)
und unbiotinylierte Primer.
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Ausführungsbeispiele:
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Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispiele
näher erläutert, ohne die
Erfindung auf diese zu beschränken:
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1 zeigt
den Aufbau des erfindungsgemäßen Microarrays,
der wie oben links zu sehen in den Boden eines Mikroreagenzgefäß integriert
ist. Die Sequenzen spezifisch für
Adenovirus (Typen A bis F), Humanes Herpesvirus 6 (HHV6 Typen A
und B), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), Varicella-Zoster-Virus
(VZV) und Herpes simplex virus (Typen 1 und 2) sind in verschiedenen
Bereichen des Arrays mit jeweils einem Ende an der Oberfläche fixiert,
so dass die Sequenzen für
Hybridisierungsreaktionen frei zugänglich sind. Näheres siehe
Ausführungsbeispiel
1.
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2 und 3 veranschaulichen
schematisch den Ablauf des Nachweises von Viren mit dem erfindungsgemäßen Microarray.
Nach der Extraktion von viraler DNA erfolgt ein Amplifizierungsschritt
in einer PCR mit zwei Primer, wobei einer der Primer an seinem 5'-Ende biotinyliert ist. Die so amplifizierte
DNA wird denaturiert und zur Hybridiserung auf die Oberfläche des
Microarrays gegeben. Im letzten Schritt erfolgt die Detektion gebundener
DNA mittels Avidin-Peroxidase (HRP) und Tetramethylbenzidin (TMB)
als Substrat. Näheres siehe
Ausführungsbeispiel
2.
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4 zeigt
den ersten Schritt – die
Amplifizierung viraler DNA – in
einer Multiplex-PCR mit der LightCyclerTM-Technology.
Die Amplifizierung erfolgt in zwei Kapillaren mit den gleichen Reagenzien
(Primer, Mastermix), wie in einer gewöhnlichen quantitativen Realtime
PCR. Die Amplifizierung erfolgt jedoch für die anschließende Hybridisierung
auf dem Microarray ohne Zusatz einer speziellen FRET-Oligonukleotid-Sonde (LightCyclerTM oder TaqManTM-Sonde).
Der Inhalt der beiden Kapillaren wir dann gemischt und zur Hybridisierung
auf den Microarray gegeben. Näheres
siehe Ausführungsbeispiel
2.
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5 fast
die Vorteile des Virus-Nachweises per Microarray zusammen.
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6 veranschaulicht
die Sensivität
des Nachweises von Viren mit dem erfindungsgemäßen Microarray. Die oberste
Zeile ist der Nachweis von Herpes simplex virus (HSV – Typen
1 und 2), gefolgt von Varicella-Zoster-Virus (VZV) in Zeile 2, Epstein-Barr
virus (EBV) in Zeile 3, Cytomegalovirus (CMV) in Zeile 4, und Humanem
Herpesvirus 6 (HHV6 – Typen
A und B) in der untersten Zeile. Die Ziffern unter den Spalten stehen für die Anzahl
Genomäquivalente
(GE). Der Aufbau des Microarrays entspricht der aus 1 und
Ausführungsbeispiel
1. Der Nachweis erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
Die Ergebnisse aus 6 zeigen, dass jedes Virus mit
einer Sensivität
von 10 Genomäquivalenten
nachgewiesen werden kann.
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7 zeigt
die analytische Spezifität
des Microarrays. In einer Probe, die jeweils 10,000 Genomäquivalente
von HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV und HHV-6 enthielt, ist jeweils
nur ein Signal auf den Feldern, welche die virus-spezifischen Sequenzen
enthalten zu beobachten. Der Aufbau des Microarrays entspricht der aus 1 und
Ausführungsbeispiel
1. Der Nachweis erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
Trotz der hohen DNA-Menge
(10,000 GE) der einzelnen Viruse, ist vorteilhaft keine Kreuzreaktivität zu beobachten.
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8 zeigt
den gleichzeitigen Nachweis von 3 Viren mit dem erfindungsgemäßen Microarray
der möglich
wird. Der Aufbau des Microarrays entspricht der aus 1 und
Ausführungsbeispiel
1. Der Nachweis erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
Mit dem Microarray ist vorteilhaft ein simultaner Nachweis von bis
zu 10,000 Genomäquivalenten
jedes Virus möglich.
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9 zeigt
den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Viren auf dem erfindungsgemäßen Microarray
in klinischen Proben. Die Viren werden in der Figur genannt. Der
Aufbau des Microarrays entspricht der aus 1 und Ausführungsbeispiel
1. Der Nachweis erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
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10 bis 12 zeigen
die klinische Validierung des erfindungsgemäßen Microarrays. 615 Proben (Plasma)
von 35 Patienten mit Stammzelltransplantationen wurden mit dem in 1 und
Ausführungsbeispiel 1
beschriebenen Microarrays wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben
untersucht.
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In 10 wird
die Anzahl der Proben, in denen 1, 2 und 3 verschiedene Viruse nachgewiesen
wurden gezeigt.
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In 11 wird
die Anzahl der Proben, in denen 2 verschiedene Viruse nachgewiesen
wurden und deren Kombination gezeigt.
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In 12 wird
die Anzahl der Proben, in denen 3 verschiedene Viruse nachgewiesen
wurden und deren Kombination gezeigt.
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In 13 werden
die Ergebnsisse des Virus-Nachweises mit dem erfindungsgemäßen Microarray (gemäß 1 und
Ausführungsbeispiel
1) mit denen einer quantitativen Realtime PCR verglichen. Der Nachweis
mit dem Microarray erfolgte in 144 Proben wie in Ausführungsbeispiel
2 beschrieben. Zum Vergleich wurden dieselben Proben mittels Realtime
PCR wie in Vergleichsversuch 1 beschrieben untersucht.
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Die
Ergebnisse zeigen eine 100%ige Übereinstimmung
in den Ergebnissen. Der Nachweis mit dem Microarray führt daher
vorteilhaft zu den gleichen Ergebnissen, wie die Real-time PCR,
ist jedoch deutlich einfacher, preiswerter und schneller durchzuführen.
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Ausführungsbeispiel
1:
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In
dem beispielhaften Array sind die unterschiedliche Viren erkennenden
Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 17 auf einem Array mit 11 × 10 Feldern
und die Kontrollfelder 18 und 19, wie folgt, angeordnet:
| 19 | 17 | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 19 |
| | 15 | 15 | 15 | 16 | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | |
| 19 | 13 | 13 | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 15 | 15 | 19 |
| 19 | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 13 | 13 | 13 | 19 |
| | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 11 | 11 | 11 | 11 | 19 |
| | 8 | 8 | 8 | 8 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 19 |
| | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 8 | 19 |
| | 4 | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 6 | 6 | 19 |
| | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | |
| 19 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 19 |
- 11 × 10
0,20 mm Spot-Abstand
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Die
Bedeutung der Feldnummern sind in der folgenden Tabelle erläutert:
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Der
Array mit dieser Anordnung wurde von der Firma CLONDIAG chip technologies
(Jena, Germany) hergestellt. Die Herstellung des Arrays durch Spotten
der oben genannten Nukleinsäuren
in der oben aufgelisteten Anordnung, wie zuvor beschrieben (
WO 03/059516 A1 )
auf der „ArrayTube"-Platform. Die Bindung
der Nukleinsäureproben
an die Arrayoberfläche
erfolgt über
die Aminogruppe am 3'-Ende.
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Jede
spezifische Nukleinsäuresequenz
wurde in fünf
verschiedenen Feldern aufgetragen.
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Der
Array ist, wie in oben genannter Publikation näher beschrieben und wie in 1 oben
links dargestellt, in den Boden eines 1,5 ml Laborreaktionsgefäß („Tube") aus Kunststoff
integriert.
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Ausführungsbeispiel
2:
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Zum
Nachweis viraler DNA mit dem, wie in Ausführungsbeispiel 1 aufgebauten
Microarray wird beispielsweise, wie folgt Verfahren:
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Extraktion viraler DNA:
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Virale
DNA wurde aus 250 μl
plasma mit dem EZ1 virus DNA tissue Kit (Qiagen, Hilden, DE) gemäß Herstellervorschrift
extrahiert. Die extrahierte virale DNA wurde in 50 μl RNAse-DNAse-freiem
Wasser aufgenommen und bei –20°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert.
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Amplifizierung viraler DNA durch multiplex
PCR für
Microarray Hybridisierung:
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Die
Amplifizierung von viraler DNA erfolgte mittels multiplex PCR mit
folgendem Reaktionsansatz:
20 μl Gesamtvolumen mit:
- – 2,2 μl H2O,
- – 4,8 μl MgCl2 (25 mMol/L)
- – 2 μl von jedem
Primer (5 pmol/μl),
- – 2 μl Roche HotStart
reaction mix.
- – 5 μl wie oben
beschrieben extrahierte virale DNA.
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Die
Amplifizierung von HSV1 and 2, VZV (HHV3) und EBV (HHV4) erfolgte
parallel in einem Ansatz (Ansatz 1) mit folgenden Primern:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 18 | HSV1/2-forward | CAT
CAC CGA CCC GGA GAG GGA C |
| 19 | HSV1/2-reverse | GGG
CCA GGC GCT TGT TGG TGT A |
| 20 | VZV-forward | TCT
TGT CGA GGA GGC TTC TG |
| 21 | VZV-reverse | TGT
GTG TCC ACC GGA TGA T |
| 22 | EBV-forward-50 | CGGAAGCCCTCTGGACTTC |
| 23 | EBV-reverse-51 | CCCTGTTTATCCGATGGAATG |
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Die
Amplifizierung von viraler DNA von CMV (HHV-5), HHV-6 und Adenovirus
erfolgte parallel in einem zweiten Ansatz (Ansatz 2) mit folgenden
Primern:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 24 | HHV5-forward | GGCCGTTACTGTCTGCAGGA |
| 25 | HHV5-reverse | GGCCTCGTAGTGAAAATTAATGGT |
| 26 | HHV6AB56
forward | AAAGACCTAAATTGCCGCTACCT |
| 27 | HHV6AB56
reverse | GCAAGCTCATGAACATCGTCA |
| 28 | Adeno
forward | GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT |
| 29 | Adeno
reverse | GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC |
-
Alle
eingesetzten Reverse-Primer sind am 5'-Ende biotinyliert. Die Zugabe einer
FRET-Sonde (TaqManTM oder Light-CyclerTM)
ist hier nicht notwendig.
-
Beide
Ansätze
wurden jeweils in einer LightCycler-Kapillare in einem Roche LightCycler
1.5 (Roche diagnostics) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
- • 10
Minuten Preinkubation bei 95°C,
- • 55
Cyclen mit je
– Annealing
für 5 Sek.
bei 61°C,
– Extension
für 5 Sek.
bei 72°C,
- • Kühlen bei
40°C für 10 min.
-
Die
beiden Reaktionsmischungen wurden aus den LightCycler-Kapillaren
bei 1000 rpm herauszentrifugiert und gemischt und anschließend für die Hybridisierung
auf dem Microarray verwendet.
-
Hybridisierung auf dem Microarray:
-
Die
Array-Tubes, welche den Microarray enthalten (s. Ausführungsbeispiel
1) wurden in einem Thermomixer (Eppendorf AG, Hamburg, DE) erst
mit 500 μl
deionisiertem Wasser bei 35°C
und 550 rpm und dann mit 500 μl
Hybridisierungspuffer A (1 mMol/L EDTA, 250 mMol/L NaH2PO4, 2 % SSC (v/v), 4.5 % SDS (w/v)) bei 30°C und 550
rpm gewaschen.
-
Jeweils
10 μl der
wie oben beschrieben amplifizierten DNA-Proben werden in 90 μl Hybridisierungspuffer
A verdünnt
und bei 95°C
für 5 Minuten
denaturiert, 1 Minute auf Eis gekühlt und in ein wie oben vorbereitetes
Array-Tube gegeben. Die Hybridisierung erfolgt für 1 Stunde bei 35°C und 550
rpm. Die Array-Tubes werden dann in einem Thermomixer (Eppendorf
AG, Hamburg, DE) mit 500 μl
Lösung
B (2 % SSC-Puffer (v/v), 0,01 % (v/v) Triton X100) 5 Minuten bei
Raumtemperatur und 550 rpm, dann mit 500 μl Lösung C (2 % SSC-Puffer (v/v)),
und abschließend
mit 500 μl
Lösung
D (0,2 % SSC-Puffer (v/v)) gewaschen. Danach wurden die Array-Tubes
mit einer Blockierungslösung
(2 % Milchpulver in 6X SSPE (w/v), 0,005 % Triton X100) für 15 Minuten
bei 30°C
und 550 rpm inkubiert.
-
Ein
Poly-Horseradish Peroxidase-Streptavidin-Konjugat (100 μg/ml) wurde
in 100 μl
of 6X SSPE und 0,005 % -Triton verdünnt und zu dem Array-Tube gegeben
und dieser für
15 Minuten bei 30°C
und 550 rpm inkubiert. Die Array-Tubes wurden 2 Minuten bei 30°C mit Lösung B,
2 Minuten bei 20°C
mit Lösung
C und abschließend
2 Minuten bei 20°C
mit Lösung
D gewaschen. Während
aller Wachschritte wurden die Tubes bei 550 rpm geschüttelt.
-
Durch
Zugabe von 100 μl
des Peroxidase-Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) wurde die Farbreaktion
ausgelöst.
Nach 10 Minuten Inkubation bei 25°C
erfolgte die Detektion der Färbung
in einem Array-Tube-Reader (ATR01, CLONDIAG Chip Technologies, Jena,
DE).
-
Die
Analyse der Ergebnisse erfolgte mit der IconoClust software (CLONDIAG)
nach Herstellerangaben. Die Signal-Intensität und der lokale Hintergund
jedes Feldes wurden mittels Messung der Transmission bestimmt.
-
Der
Wert NI = 1 – (M/BG)mit
- NI
- = normalisierte Intensität;
- M
- = Durchschnittliche
Intensität
des Feldes (Spots) und
- BG
- = Background (Hintergund)
wurde für
jedes Feld (Spot) berechnet. Dies gibt Werte für NI zwischen 0,0 (schwaches
Signal/negativ) und 1,0 (starkes Signal/postiv).
-
Die
durchschnittliche NI für
die Biotin-Kontrollfelder (Feld Nr. 19) wurde als Detektionskontrolle
berechnet, um die Resultate zu validieren. Falls der durchschnittliche
Wert für
die Kontrollfelder unter einem vordefinierten Wert von NI = 0,4
lag, wurde der Test als ungültig
erklärt.
-
Vergleichsbeispiel 1:
-
Der
Nachweis viraler DNA in der Real-Time-PCR erfolgt in den gleich
Proben extrahierter viraler DNA, wie der Nachweis mittels Microarray
(vgl. Ausführungsbeispiel
2 – DNA-Extraktion siehe
dort).
-
Die
Amplifizierung von viraler DNA erfolgt prinzipiell, wie in Ausführungsbeispiel
2 beschrieben, wobei jedoch für
jeden Virus ein gesonderte Reaktion (Ansatz) durchgeführt wird
und die Ansätze
zusätzlich
je 2 μl der
folgenden Light-CyclerTM-Sonden (2 pmol/μl) enthalten
und die Reverse-Primer nicht biotyliniert sind. Die Light-CyclerTM-Sonden sind jeweils am 5'-Ende FAM (6'-Carboxy-Fluorescein)
und am 3'-Ende TAMRA
(5-Carboxytetramethylrhodamin)
markiert.
-
Ansatz 1
-
- HSV1 und HSV2 (Bereich: UL 30, DNA-Polymerase; HSV1 Pos.
65866-65957 Genbank Nr. X14112; HSV2 Pos. 66339-66430 Genbank Nr.
Z86099)
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 18 | HSV1/2-forward | CAT
CAC CGA CCC GGA GAG GGA C |
| 19 | HSV1/2-reverse | GGG
CCA GGC GCT TGT TGG TGT A |
| 1 | Sonde
HSV1/2-TM | CCG
CCG AAC TGA GCA GAC ACC CGC GC |
-
Ansatz 2
-
- VZV (HHV3, ORF 62, Genbereich ID wie für den Array
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 20 | VZV-forward | TCT
TGT CGA GGA GGC TTC TG |
| 21 | VZV-reverse | TGT
GTG TCC ACC GGA TGA T |
| 3 | Sonde
VZV-TM | TOT
CGA CTG GCT GGG ACT TGC G |
-
Ansatz 3
-
- EBV (HHV4, Genbereich ID wie für den Array)
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 22 | EBV-forward-50 | CGGAAGCCCTCTGGACTTC |
| 23 | EBV-reverse-51 | CCCTGTTTATCCGATGGAATG |
| 5 | Sonde
EBV-TM | TGTACACGCACGAGAAATGCGCC |
-
Ansatz 4
-
- CMV (HHV5, Polymerase-Gen, Genbereich ID wie für den Array)
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 24 | HHV5-forward | GGC
CGT TAC TGT CTG CAG GA |
| 25 | HHV5-reverse | GGC
CTC GTA GTG AAA ATT AAT GGT |
| 7 | Sonde
HHV5-PR | CCG
TAT TGG TGC GCG ATC TGT TCA A |
-
Ansatz 5
-
- HHV6 (U56, 91162-90275, Capsid Protein, Genbereich ID wie
für den
Array)
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 26 | HHV6AB56
forward | AAAGACCTAAATTGCCGCTACCT |
| 27 | HHV6AB56
reverse | GCAAGCTCATGAACATCGTCA |
| 9 | Sonde
HHV6AB56-TM | TTAGATGGTGGTGAGCTGGGATCGGT |
-
Ansatz 6
-
- Adenovirus (Bereich: konservierte Region des Hexon-Gens;
Genbereich ID wie für
den Array, Quelle: Heim A, Ebnet C, Rarste G, Pring-Akerblom
P.; J. Med. Virol. 2003 Jun; 70(2):228-39)
-
Primer und Sonde:
| SEQ
ID No. | Name | Sequenz |
| 28 | Adeno-forward | GCGACGGTGGGGTTTCTAAACTT |
| 29 | Adeno-reverse | GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC |
| 11 | Sonde
Adeno-TM | TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA |
-
Am
Ende jedes Extensionsschrittes wurde für jeden Ansatz die Floureszenz-Intensität bei 560
und 640 nm (F1/F2) gemessen. Für
die Quantifizierung der viralen DNA (viral load) in den klinischen
Proben wurde als Standardreihe eine 10-fache Verdünnung von
den jeweiligen Plasmid DNA von 1012 bis
101 Genomäquivalenten (GE) hergestellt,
wie in Sassenscheidt et al. (J Virol Methods, Dec;138(1-2):40-8) beschrieben.
Eine Standardkurve wurde erstellt, in dem jeder „crossing-point" des Standards gegen
seine Konzentration aufgetragen wurde.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
