RU2781014C1 - Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека - Google Patents
Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781014C1 RU2781014C1 RU2021135816A RU2021135816A RU2781014C1 RU 2781014 C1 RU2781014 C1 RU 2781014C1 RU 2021135816 A RU2021135816 A RU 2021135816A RU 2021135816 A RU2021135816 A RU 2021135816A RU 2781014 C1 RU2781014 C1 RU 2781014C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pneumonia
- pathogens
- analysis
- species
- bacterial
- Prior art date
Links
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 title abstract description 31
- 244000052769 pathogens Species 0.000 title abstract description 31
- 201000001178 bacterial pneumonia Diseases 0.000 title abstract description 13
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 23
- 229940031000 Streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 14
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 8
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 claims description 7
- 229940115932 Legionella pneumophila Drugs 0.000 claims description 7
- 229940055023 Pseudomonas aeruginosa Drugs 0.000 claims description 7
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 6
- 229940045505 Klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 claims description 6
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 6
- 229940047650 Haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 5
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 abstract description 6
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 5
- 229920001670 16S ribosomal RNA Polymers 0.000 abstract description 3
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 10
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 8
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 6
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 5
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 5
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 5
- 230000002485 urinary Effects 0.000 description 5
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 4
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 4
- 229940013390 Mycoplasma pneumoniae Drugs 0.000 description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 206010003997 Bacteraemia Diseases 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 3
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 2
- 201000003176 severe acute respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogens Species 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 Anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 Asthma Diseases 0.000 description 1
- 101710027503 Ava_3988 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010060945 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 206010008479 Chest pain Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710019325 GDI2185 Proteins 0.000 description 1
- 102100011343 GLB1 Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headache Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000000867 Larynx Anatomy 0.000 description 1
- 241000937819 Legionella pneumophila serogroup 1 Species 0.000 description 1
- 241000937817 Legionella pneumophila serogroup 3 Species 0.000 description 1
- 241000937801 Legionella pneumophila serogroup 6 Species 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 210000001989 Nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 101700036978 OMP Proteins 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004910 Pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000009362 Pneumococcal Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010061353 Pneumococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035728 Pneumonia pneumococcal Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 1
- 229940014598 TAC Drugs 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010046504 Type IV Secretion Systems Proteins 0.000 description 1
- 208000009421 Viral Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M Xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 101700063823 cpsB Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 101700064522 eaeA Proteins 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 108010064033 elastin-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 101700058047 fucK Proteins 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogens Species 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 200000000003 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 200000000013 influenza A (H1N1) Diseases 0.000 description 1
- 200000000004 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 101700017034 iphP Proteins 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 101700053671 manC Proteins 0.000 description 1
- 101700046798 manC1 Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 201000009906 meningitis Diseases 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 200000000016 middle east respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003405 preventing Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 101700063109 sidA Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N silicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 101700021125 sptP Proteins 0.000 description 1
- 230000002459 sustained Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 101710002666 yfdG Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине. В настоящем изобретении разработан способ, основанный на мультиплексной ПЦР, для видового определения шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. Заявляемое изобретение характеризуется тем, что в нем не используется анализ 16s рибосомальной РНК, а затрагиваются только исключительно видоспецифичные гены, что резко увеличивает специфичность анализа. В отличие от аналогов, в заявляемом изобретении применен метод мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять в одном анализе ДНК шесть наиболее значимых возбудителей бактериальной пневмонии. Отечественных и зарубежных аналогов не описано. Изобретение может быть использовано в клинических лабораториях, специализирующихся на проведении рутинных анализов образцов пациентов с предварительным диагнозом пневмония. Разработанный метод требует стандартной квалификации лаборанта, работающего с постановкой ПЦР. Система ориентирована на применение в клинической диагностике для определения этиологии заболевания благодаря возможности дифференцировать бактериальную от вирусной и грибковой пневмонии и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека.
Уровень техники
Инфекционная пневмония представляет собой спектр различающихся по этиологии и патогенезу заболеваний, поражающих органы дыхательной системы (Nair GB, Niederman MS. Community-acquired pneumonia: an unfinished battle. Med Clin North Am. 2011 Nov; 95(6):1143-61). Острый воспалительный процесс легочной ткани может быть вызван широким рядом возбудителей бактериальной, вирусной и грибковой природы. Вспышки инфекционных пневмоний, вызванных коронавирусами SARS-CoV (2002-2003 г), MERS-CoV (2012-2013 г), SARS-CoV-2 (2019-?), вирусами гриппа А и В, а также бактериальных пневмоний, становятся реальной социальной угрозой. Бактериальные пневмонии характеризуются летальностью около 15%, при этом летальность в случаях тяжелого течения внебольничной пневмонии (ТВП) может достигать 21-58% (Sligl W.I., Marrie T.J.//Crit. Care. Clin. 2013. V. 29. P. 563-601. doi: 10.1016/j.ccc.2013.03.009), что сравнимо с таковыми показателями SARS (т.н. атипичная пневмония, ТОРС), MERS (Song Z., Хи Y, Bao L., Zhang L., Yu P., Qu Y., Zhu H., Zhao W., Han Y., Qin C. // Viruses. 2019. V. 11. E59. doi: 10.3390/v11010059) и превышает этот показатель для CoViD-19 и гриппа.
Несмотря на весомые достижения в противомикробной терапии, а также в совершенствовании диагностических тестов и профилактических мер в борьбе с ее распространением, пневмония продолжает оставаться серьезной проблемой мирового здравоохранения, являясь одной из главных инфекционных болезней с высоким процентом летальных исходов (Рачина, С.А. Особенности микробиологической диагностики при внебольничной пневмонии у взрослых / С.А. Рачина, Н.В. Иванчик, Р.С. Козлов // Практическая пульмонология. - 2016. - №. 4,; GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death. 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet 2015, 385, 117-171).
Специализированные лечебные учреждения, в которые поступают пациенты с клиническим диагнозом "пневмония", сталкиваются с проблемой установления этиологии заболевания и быстрой идентификации возбудителя, поскольку часто вирусные и бактериальные пневмонии характеризуются сходной клинической картиной. Ситуация резко обострилась с возникновением пандемии CoViD-19, для которого необходима своевременная дифференциальная диагностика вторичной бактериальной инфекции, часто возникающей как одно из осложнений при течении болезни.
Точное и своевременное определение возбудителя, вызвавшего поражения, имеет важное значение в разработке успешных схем лечения (Harris М, Clark J, Coote N, Fletcher P, Harnden A, McKean M, Thomson A; British Thoracic Society Standards of Care Committee. British Thoracic Society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 2011; Suppl 2:ii1-23), а также контроля зараженных, что является актуальной проблемой в условиях пандемии COVID-19, когда помимо вирусного заболевания поступающие в медицинские учреждения пациенты сталкиваются со вторичными внутрибольничными инфекциями (Бруснигина, Н.Ф. и др. Этиологическая структура внебольничной пневмонии // Медицинский альманах. - 2009. - №. 2).
Возбудителями пневмонии могут выступать представители различных групп патогенных микроорганизмов, однако зачастую этиологический агент остается неизвестным, что может быть объяснено сложностью в определении природы патогенов или недостаточной точностью и чувствительностью существующих методов их идентификации. Отдельную важность представляет собой выявление возбудителя на ранних стадиях болезни, что позволяет избежать применения эмпирической антимикробной терапии, за счет чего возможно предотвращение чрезмерного использование антибиотиков и, как следствие, появления резистентности к действующим препаратам на их основе.
В связи с этим совершенствование, а также упрощение и снижение стоимости уже существующих методов определения возбудителей пневмонии на начальных стадиях заболевания представляет собой актуальную практическую задачу.
Из бактериальных возбудителей инфекционной пневмонии одними из наиболее важных являются следующие: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza. Legionella pneumophila. Klebsiella pneumoniae. Pseudomonas aeruginosa (Ustianowski, A. (2012). Diagnostics for community-acquired and atypical pneumonia. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 18(3), 259-263. doi:10.1097/mcp.0b013e328351f94).
Для видоспецифичной идентификации возбудителей бактериальной пневмонии предложены методы, описанные ниже.
В настоящее время до сих пор широко используется постановка диагноза по клиническим проявлениям заболевания, к которым относятся: лихорадка, кашель, одышка, хрипы, боль в груди или животе, вялость, рвота и головная боль (Rodrigues CMC, Groves Н. Community-Acquired Pneumonia in Children: the Challenges of Microbiological Diagnosis. J Clin Microbiol. 2018 Feb 22;56(3):e01318-17. doi: 10.1128/JCM.01318-17). Однако, очень серьезным недостатком такого подхода является схожесть признаков патологического процесса с другими заболеваниями: сепсис, глубокая анемия, малярия, острая астма и др.
Из лабораторных методов выявления бактериальной патологии наиболее распространенными в настоящее время являются следующие.
1. Прямая визуализация является распространенным методом определения бактериальной патологии. Однако, в случае обнаружения респираторных патогенных агентов не было достигнуто значительных успехов в прямой визуализации. Единственным возможным применением этого метода на сегодняшний день остается способность лаборатории предоставить предварительные данные по бактериальной нагрузке (Rodrigues CMC, Groves Н. Community-Acquired Pneumonia in Children: the Challenges of Microbiological Diagnosis. J Clin Microbiol. 2018 Feb 22;56(3):e01318-17. doi: 10.1128/JCM.01318-17).
2. Культуральный метод используется в основном для определения антибиотикорезистентности, в т.ч. минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков в пневмококке (Grohs Р, Janoir С, Grondin S, et al. Accuracy of MIC determination for Streptococcus pneumoniae using the Sirscan2000automatic MIC determination system. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:399-403.). Обычное культивирование для атипичных патогенов остается проблематичным и, как правило, имеет ограниченную клиническую значимость (She RC, Thurber A, Hymas WC, et al. Limited utility of culture for Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae for diagnosis of respiratory tract infections. J Clin Microbiol 2010; 48:3380-3382). Метод остается медленным и трудоемким, часто обладает низкой чувствительностью, характеризуется низкой дискриминирующей способностью (при этиологической диагностике), особенно под влиянием предшествующей антибиотикотерапии.
3. Обнаружение антигенов возбудителя. Диагностика определения антигенов по-прежнему в значительной степени основана на обнаружении антигенов пневмококка и легионеллы в моче, хотя также были установлены тесты на предмет оказания медицинской помощи при гриппе (Ginocchio СС, Zhang F, Manji R, et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. J Clin Virol 2009; 45:191-195). Установленные в настоящее время анализы имеют проблемы с чувствительностью: около 82% для диагностики пневмококкового (Streptococcus pneumoniae) антигена мочи у пациентов с бактериемией (со специфичностью 97%), но более низкая чувствительность для пациентов, не страдающих бактериемией (Dominguez J, Blanco S, Rodrigo С, et al. Usefulness of urinary antigen detection by an immunochromatographic test for diagnosis of pneumococcal pneumonia in children. J Clin Microbiol 2003; 41:2161-2163; Smith MD, Derrington P, Evans R, et al. Rapid diagnosis of bacteremic pneumococcal infections in adults by using the Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test: a prospective, controlled clinical evaluation. J Clin Microbiol 2003; 41:2810-2813.), и наиболее часто доступные анализы на антиген легионеллы в моче имеют чувствительность около 80% (на которые приходится около 85% инфекций в Соединенных Штатах и Европе). Существуют проблемы с ложноположительными анализами антигена стрептококка в моче из-за колонизации носа, давно известной у детей, но все чаще признаваемой и у взрослых, и в течение 48 часов после пневмококковой (Streptococcus pneumoniae) вакцинации (Binax. Streptococcus pneumoniae urinary antigen test package insert. http://www.binax.com. [Accessed November 2011]). Существует также весьма существенный недостаток, заключающийся в невозможности определить чувствительность к противомикробным препаратам, и, как следствие, могут возникнуть проблемы с длительным «позитивным» периодом, что может привести к получению ложноположительных результатов через несколько недель после заражения.
На сегодняшний день нет значительного или полезного с клинической точки зрения развития такой диагностики для других респираторных патогенов (Ustianowski, А. (2012). Diagnostics for community-acquired and atypical pneumonia. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 18(3), 259-263. doi:10.1097/mcp.0b013e328351f94).
4. Серология. Серологические анализы имеют ряд недостатков - особенно чувствительность, специфичность и задержки с определяемым серологическим ответом, - которые, как правило, препятствуют их полезности при непосредственном ведении пациентов (в отличие от эпидемиологических и других исследований). Предпринимаются усилия по улучшению серологии легионеллы, чтобы помочь в более быстрой диагностике, однако они по-прежнему позволяют диагностировать менее 50% пациентов в первые 2 недели болезни (Elverdal PL, Svarrer CW, Jorgensen CS, et al. Development and validation of ELISA for detection of antibodies to Legionella pneumophila serogroup 1, 3 and 6 in human sera. J Microbiol Methods 2011; 86:298-303).
5. Обнаружение нуклеиновых кислот. Наиболее значительные достижения в последние годы были связаны с точным и своевременным обнаружением нуклеиновых кислот патогенов (Johansson N, Kalin М, Tiveljung-Lindell A, et al. Etiology of community acquired pneumonia: increased microbiological yield with new diagnostic methods. Clin Infect Dis 2010, 50:202-209; Kerdsin A, Uchida R, Verathamjamrus C, et al. Development of triplex SYBR green real-time PCR for detecting Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, and Legionella spp. without extraction of DNA. Jpn J Infect Dis 2010; 63:173-180; Lieberman D, Shimoni A, Shemer-Avni Y, et al. Respiratory viruses in adults with community-acquired pneumonia. Chest 2010; 138:811-816; Nolte FS. Molecular diagnostics for detection of bacterial and viral pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2008; 47 (Suppl 3):S123-S126; Pabbaraju K, Tokaryk KL, Wong S, Fox JD. Comparison of the Luminex xTAG respiratory viral panel with in-house nucleic acid amplification tests for diagnosis of respiratory virus infections. J Clin Microbiol 2008; 46:3056-3062; Smith MD, Sheppard CL, Hogan A, et al. Diagnosis of Streptococcus pneumoniae infections in adults with bacteremia and community-acquired pneumonia: clinical comparison of pneumococcal PCR and urinary antigen detection. J Clin Microbiol 2009; 47:1046-1049.). Многие предыдущие анализы имели проблемы со стандартизацией и контролем качества (Dowell SF, Peeling RW, Boman J, et al. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis 2001; 33:492-503.), а новые анализы по-прежнему требуют строгой проспективной оценки. Результаты гораздо менее подвержены влиянию предшествующей антибактериальной терапии, чем более традиционные бактериологические методы. В последнее время наблюдается интерес к обнаружению 16s рДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) либо для выявления специфических патогенов, либо для широкой диагностики множества потенциальных патогенов. Примеры на выявление патогенов включают 16 анализов рДНК на микоплазму, которые, к сожалению, показали длительную положительную реакцию после заражения (средняя продолжительность 5 недель), что может ограничить клиническую полезность для отдельных пациентов (Han X, Li S, Lu S, et al. Amplification of 16S rDNA by nested PCR for measurement of Mycoplasma pneumoniae DNA over time: clinical application. J Med Microbiol 2011. doi:10.1099/jmm.0.030098-0. [Epub ahead of print]). Примеры анализов 16s рДНК, предназначенных для выявления множества патогенов, включают широкий спектр ПЦР для множественных бактерий в плевральной жидкости, однако это не позволило значительно улучшить специфическую диагностику у детей (Gollomp K, Rankin SC, White С, et al. Broad-range bacterial polymerase chain reaction in the microbiologic diagnosis of complicated pneumonia. J Hosp Med 2012; 7:8-13). Другие мультиплексные ПЦР-анализы, которые обладают потенциальными преимуществами (Abdeldaim GM, Stralin К, Korsgaard J, et al. Multiplex quantitative PCR for detection of lower respiratory tract infection and meningitis caused by Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis. BMC Microbiol 2010; 10:310; Thurman KA, Warner AK, Cowart КС, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, and Legionella spp in clinical specimens using a single-tube multiplex real-time PCR assay. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:1-9), имеют проблемы с чувствительностью и перекрестной контаминацией (Prere MF, Fayet OA. A specific polymerase chain reaction test for the identification of Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis 2011; 70:45-53; Josefson P, Stralin K, Ohlin A, et al. Evaluation of a commercial multiplex PCR test (SeptiFast) in the etiological diagnosis of community-onset bloodstream infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011; 30:1127-1134). Перекрестная контаминация является серьезной проблемой всех тест-систем, основанных на ПЦР-анализе 16s рДНК, т.к. прослеживается высокий уровень гомологии между различными бактериальными таксонами, в т.ч. в норме населяющими слизистые и кожные покровы человека.
Заявляемое изобретение отличается от вышеописанных аналогов тем, что в нем не используется анализ 16s рибосомальной РНК, а затрагиваются только исключительно видоспецифичные гены, что резко увеличивает специфичность анализа. В отличие от аналогов, в заявляемом изобретении применен метод мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять в одном анализе ДНК шести наиболее значимых возбудителей бактериальной пневмонии. Отечественных и зарубежных аналогов не описано.
Наиболее перспективными областями применения изобретения является использование тест-системы в клинических лабораториях, специализирующихся на проведении рутинных анализах образцов пациентов с предварительным диагнозом пневмония. Разработанный метод требует стандартной квалификации лаборанта, работающего с постановкой ПНР.
Раскрытие сущности изобретения
Целью изобретения является создание способа мультиплексной ПЦР для быстрого выявления шести основных возбудителей бактериальной пневмонии. Способ использует оригинальные видоспецифичные праймеры для шести социально значимых возбудителей пневмонии человека.
Для каждого праймера проводили процедуру BLAST-анализа, определяли его физико-химические характеристики, включая тестирование на наличие как внутри - так и межмолекулярных вторичных структур. Проводили оптимизацию температурно-временного профиля ПЦР с применением градиентной ПЦР, а также состава компонентов буфера и концентрации каждого из праймеров в смеси. Экспериментально определяли специфичность праймеров к целевым и нецелевым мишеням (используя тотальную геномную ДНК каждого из тестируемых бактериальных штаммов), как в режиме применения индивидуальных ДНК-матриц, так и в режиме смесей ДНК нескольких возбудителей в одной пробирке. Установили, что праймеры обладают высокой специфичностью в смеси, содержащей ДНК различных микроорганизмов и способны выявлять исключительно свои специфичные мишени, не давая ложноположительный результат при наличии в смеси неспецифичной ДНК.
Чувствительность способа, определенная раститровкой ДНК каждого из анализируемых возбудителей, составляет от 102 до 103 копий геномной ДНК на реакционную пробирку, в том числе при одновременном введении в смесь нескольких матриц.
Данные, полученные с помощью способа, могут быть использованы при выборе лекарственного препарата, режима лечения и эпидемиологического контроля.
Способ выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью идентификации непосредственно в клиническом материале после деконтаминации, а также низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью способа, могут быть использованы при выборе лекарственного препарата, режима лечения и эпидемиологического контроля.
Данное изобретение обеспечивает способ идентификации шести социально значимых возбудителей пневмонии человека: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.
Способ основан на проведении полимеразной цепной реакции с оригинальным набором специфических олигонуклеотидных праймеров и последующем разделении продуктов реакции путем электрофореза в агарозном геле, анализе электрофоретической картины разделения продуктов амплификации и интерпретации результатов.
Данное изобретение обеспечивает также оригинальный набор специфичных праймеров для осуществления экспресс-способа идентификации генов шести социально значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека. Праймеры, сконструированные и применяемые в способе, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом идентифицировать гены шести наиболее значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура. 1. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР для идентификации бактериальных возбудителей пневмонии человека. L-молекулярный маркер длин продуктов ДНК GeneRuler 50bp (Thermo, США), 1 - Streptococcus pneumoniae, 2 - Staphylococcus aureus, 3 - Legionella pneumophila, 4 - Staphylococcus aureus + Legionella pneumophila, 5 - Haemophilus influenzae, 6 - Pseudomonas aeruginosa, 7 - Haemophilus influenzae+Pseudomonas aeruginosa, 8 - Klebsiella pneumoniae. Видно, что все шесть определяемых патогенов характеризуются разной длиной ПЦР-продуктов для удобства их идентификации. Показана возможность определения нескольких патогенов в одном клиническом образце (не более двух из соображений реально возможных, встречающихся в клинической практике, ситуаций).
Таблица 1. Длины ПЦР-продуктов
Осуществление изобретения
Изобретение предлагает использование способа мультиплексной ПЦР для быстрого выявления шести основных возбудителей бактериальной пневмонии. При конструировании праймеров руководствовались требованием видовой специфичности и внутривидовой консервативности выбранных участков генетических мишеней, необходимым для надежной дифференциальной диагностики, учитывали необходимость получения различных длин ПЦР-продуктов для удобства идентификации возбудителя при электрофоретическом разделении.
В случае каждого из анализируемых патогенов были сконструированы видоспецифичные праймеры, мишенями для которых являлись гены, характерные именно для данного возбудителя, часто - несущие дополнительную функциональную клинически значимую нагрузку, связанную с факторами патогенности:
- Staphylococcus aureus - ген связывания эластина ebpS (elastin-binding protein S);
- Streptococcus pneumoniae - стрептококковый ген cpsB (tyrosine-protein phosphatase B);
- Haemophilus influenza - кодирующий энзим ген fucK (fuculokinase gene);
- Legionella pneumophila - ген sidA, отвечающий за синтез белка, участвующего в системе секреции типа IV;
- Pseudomonas aeruginosa - ген белка внешней мембраны oprL;
- Klebsiella pneumoniae - ген-регулятор синтеза экстракапсулярного полисахарида гтрА (regulator of the mucoid phenorype).
В заявленном способе предложено использование полимеразной цепной реакции для амплификации последовательностей фрагментов генов, указанных выше, различающихся по длине для удобства последующего определения электрофоретическим методом. При этом в качестве исходного образца может быть использован клинический материал, лизат клеточной культуры, различные физиологические жидкости (мокрота при откашливании, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), аспираты из трахеи), соскобы из гортани и носоглотки. Заявленный способ предусматривает использование оригинального набора специфических олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-12, представленных в Перечне последовательностей.
Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения ДНК из биологических образцов, например - фенол-хлороформным методом (Molecular Cloning. Volume 3. 3rd edition, by Joseph Sambrook and David W. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001) или методом с использованием силикатных сорбентов (Cady N.C., Stelick S., Batt С.A. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosens Bioelectron. 2003 Oct 30;19(l):59-66), но не ограничивается ими.
Подбор олигонуклеотидных праймеров выполняется на основе систематизации последовательностей, кодирующих видоспецифичные гены возбудителей. Конструирование высокоспецифичных праймеров осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, Silva). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей генов-мишеней. Каждому выравниванию присваивается консенсусная последовательность. Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW, консенсусная последовательность присваивалась со значением параметра «threshold frequency» равным 100%. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v.6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), проводится расчет температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, Silva) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
Продукты амплификации, полученные с помощью полимеразной цепной реакции с использованием данного набора праймеров, подвергаются разделению путем проведения электрофореза в агарозном геле. Далее, проводится анализ полученных изображений электрофореграмм. По расположению специфических полос для продуктов амплификации проводится интерпретация электрофореграммы и делается вывод о наличии у анализируемых образцов идентифицируемых генов, соответствующих конкретным возбудителям.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Набор специфических олигонуклеотидных праймеров, используемых в способе обнаружения видоспецифичных генов шести бактериальных возбудителей пневмонии человека.
Праймеры SEQ ID NO: 1-12 (Перечень последовательностей) для проведения полимеразной цепной реакции синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США.
Пример 2. Выделение ДНК из клинических образцов.
1. В пробирки добавляют 20 мкл универсального сорбента (набор "ДНК-сорб-АМ", ЦНИИ Эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора, Россия), после чего вносят по 300 мкл лизирующего раствора.
2. В пробирки с добавленным сорбентом и лизирующим раствором вносят по 100 мкл клинического образца.
3. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе и инкубируют в течении 5 мин при температуре 65°С в термостате. После окончания инкубации пробирки повторно перемешивают на вортексе и оставляют при комнатной температуре на 2 мин.
4. Осаждают сорбент в пробирках с помощью центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 секунд. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость.
5. К осадку добавляют по 1 мл отмывочного раствора и перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
6. Повторяют пункт 5.
7. Помещаютс пробирки с открытой крышкой в термостат с температурой 65°С на 5-10 мин для подсущивания сорбента.
8. В пробирки добавляют по 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА), рН 8,0 для элюции ДНК. Перемешивают пробирки на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
9. Центрифугируют пробирки при 12000 об/мин в течении 1 мин. Надосадочную жидкость использовуют для проведения ПЦР.
Пример 3. Проведение полимеразной цепной реакции для амплификации фрагментов вилоспенифичных генов шести возбудителей бактериальной пневмонии человека.
К 29 мкл ПЦР-смеси вносят 1 мкл образца, полученного в Примере 2.
Состав ПЦР-смеси:
1. ПЦР-буфер: 10 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3) (Силекс, Россия);
2. 2.0 мМ MgCl2
3. 200 мкМ dATP, dCTP, dGTP, dUTP каждого (Силекс, Россия)
4. Смесь праймеров (последовательности представлены в Таблице 1.) в концентрации 80 нМ каждого
5. 5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Силекс, Россия)
Амплификацию проводят на термоциклере «Dyad» (MJ Research, США) со следующим режимом: 95°С - 30 с, 65°С - 30 с, 72°С - 30 с; 35 циклов (в первом цикле время денатурации увеличивали до 5 мин, в последнем - время достройки до 5 мин).
10 мкл реакционной смеси, полученной после проведения ПЦР, используют для электрофоретического разделения.
Пример 4. Проведение электрофоретического разделения продуктов амплификации.
1. Готовят 1 х ТАЕ-буфер путем пятидесятикратного разведения 50 х ТАЕ буфера (2 М Трис, 1 М уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА, рН 8,4) в объеме, достаточном для заполнения электрофорезной камеры и приготовления геля (1000 мл).
2. Добавляют к 1 х ТАЕ буферу агарозу в количестве, необходимом для получения 2% раствора, и нагревют в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.
3. Охлаждают смесь до 50°С.
4. Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают.
5. Полученный раствор выливают в кювету для геля и равномерно распределяют по объему кюветы.
6. В кювету вставляют гребенку в вертикальном положении так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.
7. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин при комнатной температуре для застывания геля. Далее, аккуратно удаляют гребенку и помещают кювету с гелем в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТАЕ буфера.
8. По 10 мкл образов, полученных в Примере 3, смешивают с 2 мкл буфера для нанесения (10 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 40% глицерин, 40 мМ ЭДТА, 0,01% бромфеноловый синий, 0,01% ксиленцианол) и аккуратно вносят в лунки геля.
9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1,5 В на 1 см геля в течение 30 мин.
10. Извлекают гель из электрофорезной камеры и просматривают в УФ-свете на транс-иллюминаторе. Результаты документируют путем фотографирования геля и сохранения полученных изображений.
Пример 5. Интерпретация результатов электрофоретического разделения продуктов амплификации.
Изображения, полученные в Примере 4 интерпретируют следующим образом. По наличию полосы оптической плотности с длиной в диапазоне 200-400 п. н. в дорожке на агаразном геле делают вывод о наличии соответствующего гена в исследуемом образце, соответствующем конкретному возбудителю (Фигура 1.).
--->
Перечень последовательностей
<210> 1
<211> 23
<212> cpsB-f1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 1
TTGATGTAGA TGACGGTCCC AAG (SEQ ID NO: 1)
<210> 2
<211> 23
<212> cpsB-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 2
TATATCTCTG CGCCATAAGC AAT (SEQ ID NO: 2)
<210> 3
<211> 23
<212> ebpS-f1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 3
ACTCGACTGA GGATAAAGCG TCT (SEQ ID NO: 3)
<210> 4
<211> 23
<212> ebpS-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 4
CCTCCAAATA TCGCTAATGC ACC (SEQ ID NO: 4)
<210> 5
<211> 23
<212> fucK-f1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 5
TGCTCACTCA ACGCTTAACT GGT (SEQ ID NO: 5)
<210> 6
<211> 23
<212> fucK-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 6
TTCTGGGCTA ATGGTGTACG TAA (SEQ ID NO: 6)
<210> 7
<211> 23
<212> oprL-f1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 7
GCGTGCGATC ACCACCTTCT ACT (SEQ ID NO: 7)
<210> 8
<211> 23
<212> oprL-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 8
TTCTTCAGCT CGACGCGACG GTT (SEQ ID NO: 8)
<210> 9
<211> 22
<212> sidA-f1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 9
TTCCACTGGT GGGTGGGTTT TG (SEQ ID NO: 9)
<210> 10
<211> 23
<212> sidA-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 10
TCATGTTGGA GTTCTATGGC ACG (SEQ ID NO: 10)
<210> 11
<211> 23
<212> rmpA-f2
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер прямой
<400> 11
GGACTACCTC TGTTTCATAT TAC (SEQ ID NO: 11)
<210> 12
<211> 20
<212> rmpA-r2
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер обратный
<400> 12
CCCCATTTTT CAGTAGGCAT (SEQ ID NO: 12)
<---
Claims (2)
1. Способ идентификации генов бактериальных возбудителей пневмонии человека, включающий: а) - амплификацию фрагментов видоспецифичных генов Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila и Klebsiella pneumoniae путем проведения полимеразной цепной реакции с набором специфических олигонуклеотидных праймеров, представленным последовательностями SEQ ID NO: 1-12; б) - разделение продуктов реакции путем электрофореза в агарозном геле; в) - анализ электрофоретической картины разделения продуктов амплификации; г) - интерпретацию результатов анализа.
2. Набор специфичных олигонуклеотидных праймеров, представленный последовательностями SEQ ID NO: 1-12, для осуществления идентификации бактериальных возбудителей пневмонии человека, таких как Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila и Klebsiella pneumoniae, способом по п. 1.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2781014C1 true RU2781014C1 (ru) | 2022-10-04 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813995C1 (ru) * | 2023-08-30 | 2024-02-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012157750A1 (ja) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | 持田製薬株式会社 | 血液検体を用いた呼吸器感染症の診断 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012157750A1 (ja) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | 持田製薬株式会社 | 血液検体を用いた呼吸器感染症の診断 |
RU2660352C2 (ru) * | 2011-05-19 | 2018-07-05 | Мотида Фармасьютикал Ко., Лтд. | Диагностика инфекционного заболевания дыхательных путей с использованием образцов крови |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
А. ЛАПА, Е. С. КЛОЧИХИНА и др. МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННОЙ ПНЕВМОНИИ, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2020, том 46, номер 5, стр.550-552. Е.А. КОЛОСКОВА, Б.А. РАМАЗАНОВА, Современная эпидемиологическая и микробиологическая характеристика пневмококковой инфекции, Вестник КазНМУ, 2016, номер 2, стр.49-56. ПАВЛОВА, Т. А. СМИРНЫХ, Пневмонии: диагностика, лечение, профилактика, информационное письмо для терапевтов, врачей общей практики, Курган 2010, стр.4,5. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813995C1 (ru) * | 2023-08-30 | 2024-02-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cho et al. | Comparison of sputum and nasopharyngeal swab specimens for molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, and Legionella pneumophila | |
EP1895015B1 (en) | Method and kit for the detection of bacterial species by means of dna analysis | |
Ikryannikova et al. | Misidentification of alpha-hemolytic streptococci by routine tests in clinical practice | |
Dharakul et al. | Detection of Burkholderia pseudomallei DNA in patients with septicemic melioidosis | |
CN109628644A (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用 | |
van Haeften et al. | A quantitative LightCycler PCR to detect Streptococcus pneumoniae in blood and CSF | |
Elfaki et al. | Detection of Brucella DNA in sera from patients with brucellosis by polymerase chain reaction | |
Helbig et al. | Diagnostic relevance of the detection of Legionella DNA in urine samples by the polymerase chain reaction | |
Zhou et al. | Comparison of P1 and 16S rRNA genes for detection of Mycoplasma pneumoniae by nested PCR in adults in Zhejiang, China | |
Mahony et al. | Detection of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma genitalium in first-void urine specimens by multiplex polymerase chain reaction | |
Dash et al. | Clinical spectrum and diagnostic yields of Mycoplasma pneumoniae as a causative agent of community-acquired pneumonia | |
Gaydos et al. | Gene typing of Chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction and restriction endonuclease digestion | |
KR100238337B1 (ko) | 감염증 진단용 프로브 | |
CN110468223B (zh) | 基于dUTP/UNG法的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法 | |
RU2781014C1 (ru) | Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека | |
Nour et al. | Amplification of P1 and 16S rRNA genes by nested PCR for detection of Mycoplasma pneumoniae in paediatric patients | |
Angrup et al. | Application of real-time quantitative polymerase chain reaction assay to detect Legionella pneumophila in patients of community-acquired pneumonia in a tertiary care hospital | |
Toptan et al. | Rapid Molecular Diagnosis of Group A Streptococcus with a Novel Loop Mediated Isothermal Amplification Method. | |
US9487832B2 (en) | Selective detection of neisseria meningitidis | |
KR20200048082A (ko) | 쯔쯔가무시균 감염 질환 진단용 키트 | |
RU2784653C1 (ru) | Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной, и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления | |
Bernander et al. | A nested polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in clinical specimens | |
Khazaei et al. | Different methods for diagnosis of Brucella and Legionella spp. in various samples | |
Doosti et al. | The First Prevalence Report of Direct Identification and Differentiation of B. abortus and B. melitensis using Real Time PCR in House Mouse of Iran | |
Setiawaty et al. | Detection of causative agents of bacterial pneumonia in hospitalized hajj and umrah cases by multiplex real-time polymerase chain reaction |