RU2784653C1 - Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной, и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления - Google Patents
Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной, и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784653C1 RU2784653C1 RU2021135817A RU2021135817A RU2784653C1 RU 2784653 C1 RU2784653 C1 RU 2784653C1 RU 2021135817 A RU2021135817 A RU 2021135817A RU 2021135817 A RU2021135817 A RU 2021135817A RU 2784653 C1 RU2784653 C1 RU 2784653C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pneumonia
- bacterial
- seq
- biological
- immobilized
- Prior art date
Links
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003612 virological Effects 0.000 title abstract description 7
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 18
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 18
- 244000052613 viral pathogens Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 7
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 abstract description 48
- 244000052769 pathogens Species 0.000 abstract description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 19
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 abstract description 13
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 abstract description 11
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 abstract description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 11
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 abstract description 10
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 abstract description 10
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 abstract description 10
- 229940115932 Legionella pneumophila Drugs 0.000 abstract description 9
- 229940055023 Pseudomonas aeruginosa Drugs 0.000 abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 200000000003 influenza A Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 abstract 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 abstract 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 12
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 11
- 229940031000 Streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 229940045505 Klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 9
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 8
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 8
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 7
- 229940047650 Haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 7
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 7
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 4
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 3
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 3
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 3
- 208000009421 Viral Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 3
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920001670 16S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M CHEMBL593252 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 2
- 206010024971 Lower respiratory tract infection Diseases 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- -1 deoxyuridine triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 206010060945 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241000606069 Chlamydiaceae Species 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004436 Chromosomes, Artificial, Bacterial Anatomy 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 208000008745 Healthcare-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 229920002424 Internal transcribed spacer Polymers 0.000 description 1
- 210000000867 Larynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 229940013390 Mycoplasma pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 210000001989 Nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 229920002049 Ribosomal DNA Polymers 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 206010040550 Shigella infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229940014598 TAC Drugs 0.000 description 1
- DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-N Thioacetic acid Chemical compound CC(S)=O DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009470 Ventilator-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M Xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- WCDYMMVGBZNUGB-ORPFKJIMSA-N [(2R,3R,4S,5R,6R)-6-[[(1R,3R,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2,7-dioxabicyclo[4.2.0]octan-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl 3-hydroxy-2-tetradecyloctadecanoate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2OC[C@H]2O1 WCDYMMVGBZNUGB-ORPFKJIMSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000024126 agglutination involved in conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 1
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007728 cost analysis Methods 0.000 description 1
- 101710003619 cpsA1 Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101700013200 gyrB1 Proteins 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003116 impacting Effects 0.000 description 1
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 200000000004 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 200000000005 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 200000000016 middle east respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004784 molecular pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101700072042 parE Proteins 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 1
- 201000003176 severe acute respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N silicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии. Описан способ идентификации генов возбудителей пневмонии человека, шести бактериальных: Staphilococcus aureus, Steptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa и двух вирусных: SARS-CoV-2, Грипп А, включающий: а) амплификацию фрагментов видоспецифичных генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека путем проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с набором неиммобилизованных специфических олигонуклеотидных праймеров в реакционном объеме биологического микрочипа, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-16, и иммобилизованных на том же биологическом микрочипе, представленных последовательностями SEQ ID NO: 17-31; б) отмывку биологического микрочипа; в) анализ картины ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе с помощью Чип-детектора; г) визуальную интерпретацию результатов анализа. Представлен биологический микрочип, используемый в способе идентификации генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека по п.1, с гидрогелевыми ячейками с иммобилизованными в них высокоспецифичными праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17-31. Способ обладает высокой скоростью проведения анализа при одновременном обнаружении ряда патогенных агентов, устойчив к перекрестной контаминации благодаря закрытой реакционной камере на биологическом микрочипе, совместим со стандартными in situ амплификаторами, а также с детекторами флуоресцентного сигнала, разработанными для биологических микрочипов (чип-детекторы). 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека.
Уровень техники
Инфекционная пневмония является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний и важной причиной смерти, особенно у детей до 5 лет и взрослых старше 65 лет. Основной причиной пневмонии являются вирусные и бактериальные агенты (Musherand D.M., Thorner A.R. Community-acquired pneumonia, The New England Journal of Medicine, 2014; 371 (7): 619-1628). В случае вирусного поражения легочной ткани пневмония может развиться не только как результат первичной вирусной инфекции, но также вследствие присоединения вторичной инфекции бактериальной природы. В ряде случаев наблюдают смешанную инфекцию вирусно-бактериальной этиологии (Aliberti S., Kауе K.S. The changing microbiologic epidemiology of community-acquired pneumonia. Postgrad. Med. 2013; 125 (6): 31-42; Зайцев A.A., Щеголев A.B. Диагностика и лечение тяжелых поражений легких при гриппе A(H1N1/09): практические рекомендации Военно-медицинский журнал. 2016; 337 (3): 39-46; Tarsia P., Aliberti S., Pappalettera М., Blasi F. Mixed community-acquired lower respiratory tract infections. Current Infectious Disease Reports. 2007; 9(1): 14-20). Ряд бактериальных патогенов, способных вызывать воспаление легких достаточно широк (Musherand D.M., Thorner A.R. Community-acquired pneumonia, The New England Journal of Medicine, 2014; 371 (7): 619-1628). Чаще всего в качестве инфекционных агентов выступают внеклеточные бактерии такие, как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и Staphylococcus aureus. От 1 до 7% тяжелых случаев пневмонии вызывают другие бактерии, например Legionella pneumophila (Cilloniz С., Torres A., Niederman М. et al. Community acquired pneumonia related to intracellular pathogens. Intensive Care Medicine. 2016; 42(9): 1374-1386).
Способность быстро выявлять и идентифицировать различных инфекционных возбудителей является важной задачей при точной постановке диагноза, в первую очередь при сезонных и спорадических вспышках заболевания, но также и в случае появления новых инфекционных агентов или биотерроризме (Yin Y1, Wunderink RG2. MERS, SARS and other coronaviruses as causes of pneumonia. Respirology. 2018; 23(2): 130-137. doi: 10.1111/resp.13196; Zhang Z.W., Zhou Y.M., Zhang Y., Guo Y., Tao S.C., et al. Sensitive detection of SARS coronavirus RNA by a novel asymmetric multiplex nested RT-PCR amplification coupled with oligonucleotide microarray hybridization. Methods Mol Med. 2005; 114: 59-78; Petric M., Comanor L, Petti C.A. Role of the laboratory in diagnosis of influenza during seasonal epidemics and potential pandemics. J Infect Dis. 2006; 194 Suppl 2: S98-110; Lessa F.C., Gould P.L., Pascoe N.. Erdman D.D., Lu X., et al. Health care transmission of a newly emergent adenovirus serotype in health care personnel at a military hospital in Texas, 2007. J Infect Dis 2009; 200: 1759-1765). Правильная идентификация патогена позволяет определить необходимость дополнительных диагностических исследований, выбрать антивирусную или антибактериальную терапию, выбрать методы контроля за течением инфекционного процесса (Mahony J.B., Blackhouse G., Babwah J., Smieja M., Buracond S., et al. Cost Analysis of Multiplex PCR Testing for Diagnosing Respiratory Virus Infections. J Clin Microbiol. 2009; 47(9):2812-7; Falsey A.R., Murata Y., Walsh E.E. Impact of rapid diagnosis on management of adults hospitalized with influenza. Arch Intern Med. 2007; 167: 354-360). Стандартное микробиологическое тестирование требует нескольких дней для первичной идентификации патогенного возбудителя, а некоторые агенты не могут быть выявлены только микробиологическими методами (Hatchette TF, Bastien N, Berry J, Booth TF, Chernesky M, et al. The limitations of point of care testing for pandemic influenza: what clinicians and public health professionals need to know. Can J Public Health. 2009; 100: 204-207).
Микробная этиология инфекционной пневмонии. Являясь инфекционной патологией, пневмония связана с внедрением в респираторный тракт и развитием внутриальвеолярных экссудаций (Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., и соавт. Внебольничная пневмония у взрослых. Практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике (пособие для врачей). Клин микробиол антимикроб химиотер 2010; 12: 186-225) под воздействием жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, среди которых представлены бактерии, вирусы, грибки и простейшие. Внутри большого перечня описанных возбудителей пневмонии можно выделить ряд патогенов, которые наиболее часто являются причиной заболевания.
Лидером среди «типичных» возбудителей (Mccracken, G. Н. (2000). Etiology and treatment of pneumonia) являются бактерии вила Streptococcus pneumoniae. Во всем мире стрептококк признан наиболее распространенным патогеном, который вызывает внебольничную пневмонию, и обычно проявляется острыми симптомами инфекции нижних дыхательных путей. На долю S. pneumoniae приходится 30-50% всех случаев выявления пневмонии установленной этиологии (Welte Т., Torres A., Nathwani D. Clinical and economic burden of community-acquired pneumonia among adults in Europe. Thorax 2010). Пневмококк (S. pneumoniae) имеет несколько факторов вирулентности, наиболее важным из которых является полисахаридная капсула (Mitchell, А. М., & Mitchell, Т. J. (2010). Streptococcus pneumoniae: virulence factors and variation. Clinical Microbiology and Infection, 16(5), 411-418). Различия в составе капсулы S. pneumoniae приводят к существованию различных типов или серотипов (Geno KА, Gilbert GL, Song JY, Skovsted IС, Klugman KP, Jones C, Konradsen HB, Nahm MH. 17 June 2015. Pneumococcal capsules and their types: past, present, and future. Clin Microbiol Rev), часть из которых вовлечены в большинство инвазивных инфекций.
К числу актуальных бактериальных возбудителей также причисляют энтеробактерию Klebsiella pneumoniae, она же клебсиелла пневмонии или палочка Фриндлендера - грамотрицательная, заключенная в капсулу и неподвижная бактерия. Согласно статистике, ее патогенность обуславливается наличием ряда факторов, способных привести к развитию вирулентности и устойчивости к антибиотикам. В качестве основного фактора здесь выделяют полисахаридную капсулу, позволяющую бактериям избегать механизмов защиты против инфекций и ликвидации организмом-носителем (Li, В., Zhao, Y., Liu, С, Chen, Z., & Zhou, D. (2014). Molecular pathogenesis of Klebsiella pneumoniae. Future Microbiology, 9(9), 1071-1081).
Другими нередкими возбудителями пневмонии выступают золотистый стафилококк Staphylococcus aureus и гемофильная палочка Haemophilus influenzae.
Стафилококки, часто колонизирующие кожу и слизистые оболочки людей и животных, обладают способностью быстро приобретать детерминанты устойчивости к противомикробным препаратам. Среди многих видов стафилококков S. aureus демонстрирует самый высокий патогенный потенциал. Особенно важны MRSA штаммы, поскольку во всем мире они являются ведущей причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (Teruyo Ito (2009). Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53(12), 4961-4967).
Штаммы H. influenzae можно разделить на инкапсулированные (с шестью различными серотипами a-f на основе капсулярных полисахаридов) и неинкапсулированные (или нетипируемые с помощью традиционной реакции агглютинации со специальной сывороткой, они же NTHi штаммы). NTHi вызывают широкий спектр внебольничных инфекций слизистой оболочки, включая ВП, у пожилых пациентов, пациентов с сопутствующими респираторными заболеваниями или пациентов с рецидивирующей пневмонией (Forstner, С, Rohde, G., Rupp, J., Schuette, H., Ott, S. R., Hagel, S., … Suttorp, N. (2016). Community-acquired Haemophilus influenzae pneumonia - New insights from the CAPNETZ study. Journal of Infection, 72(5), 554-563).
Среди «атипичных» возбудителей наиболее часто выделяют подвижные палочковидные бактерии вида Legionella pneumophila. Среди многих агентов, обычно вызывающих бактериальную пневмонию у людей, легионеллы не являются частью нормальной человеческой флоры, а приобретаются из источников окружающей среды. Легионеллезная пневмония составляет от 2% до 15% всех внебольничных пневмоний, требующих госпитализации в Европе и Северной Америке (Muder RR, Yu VL, Fang GD. Community-acquired Legionnaires' disease. Semin Respir Infect. 1989 Mar;4(1):32-9).
Проблемой в лечении пневмонии выступает вид Pseudomonas aeruginosa вследствие своей высокой вирулентности и наличия множественных механизмов устойчивости к различным антимикробным средствам (О.Л. Палковский, Л.И. Новогран, А.В. Шершнев проблемы терапии нозокомиальной пневмонии, вызванной P. aeruginosa (обзор литературы) // Проблемы здоровья и экологии. 2010. №3 (25)). Чаще всего развитие устойчивости к противомикробным препаратам у P. aeruginosa объясняется мутациями хромосомных генов, однако описывается также приобретение факторов устойчивости (например, генов, кодирующих β-лактамазы и ферменты, модифицирующие аминогликозиды) посредством горизонтального переноса генов (Rossolini, G. М., and Mantengoli, Е. (2005). Treatment and control of severe infections caused by multiresistant Pseudomonas aeruginosa. Clin. Microbiol. Infect. 11(Suppl. 4), 17-32).
Меньшую актуальность в этиологии пневмонии представляют Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae.
M. pneumoniae является важным патогеном дыхательных путей человека и во время эпидемической активности уступает только S. pneumoniae как наиболее частый этиологический агент ВП. Дети и молодые люди наиболее часто поражаются М. pneumoniae, однако никакая возрастная группа не является защищенной, а также нередко описываются и повторные инфекции. С. pneumoniae является генетически, морфологически и антигенно типичным членом семейства Chlamydiaceae, и представляет собой облигатный внутриклеточный патоген, клеточная стенка которого содержит липополисахариды, похожие на грамотрицательные бактерии. В последние годы данный вид все чаще встречается респираторным патогеном как у детей, гак и у взрослых (L. Barry Seltz MD, …Leslie L. Barton MD, in Kendig & Chernick's Disorders of the Respiratory Tract in Children (Eighth Edition), 2012. Pages 493-505).
Несмотря на распространенность бактериальных инфекций, все большее эпидемиологическое значение приобретают на сегодняшний день исследования, касающиеся пневмонии, вызванной вирусными агентами (Galvan, J. М., Rajas, О., & Aspa, J. (2015). Review of Non-Bacterial Infections in Respiratory Medicine: Viral Pneumonia. Archivos de bronconeumologia, 51(11), 590-597). По оценкам, ежегодно в мире происходит порядка 100 миллионов случаев заражения вирусной пневмонией (Ruuskanen, О.; Lahti, Е.; Jennings, L.C.; Murdoch, D.R. Viral pneumonia. Lancet 2011, 377, 1264-1275).
К вирусам, связанным с внебольничной пневмонией у детей и взрослых, относятся респираторно-синцитиальный вирус человека, риновирусы, гриппы А, В и С, парагрипп, а также коронавирусы разных типов. В условиях пандемии, вызванной SARS-CoV-2, важную роль в сдерживании темпов распространения и развития болезни имеет детекция возбудителя на ранних стадиях и его дифференциация от бактериальных патогенов в сходной клинической картине.
Ниже рассмотрены основные современные подходы к идентификации возбудителей пневмонии.
Этиологическая диагностика пневмонии
Хотя микробиологическая диагностика пневмонии имеет фундаментальное значение для обеспечения надлежащей антибактериальной терапии, позволяя тем самым снизить количество летальных исходов, микробная диагностика пневмонии достигается менее чем в 50% случаев. По этой причине большинству пациентов, поступающих в медицинские учреждения с диагнозом пневмонии, на первом этапе назначается эмпирическая антибактериальная терапия, чтобы избежать задержки в лечении и повышение летальности (Garau, J.; Baquero, F.; Perez-Trallero, E.; Perez, J.L.; Martin-Sanchez, A.M.; Garcia-Rey, C.; Martin-Herrero, J.E.; Dal-Re, R. Factors impacting on length of stay and mortality of community-acquired pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 2008. 14, 322-329).
Текущая диагностика патогенов на сегодняшний день в первую очередь основана на анализе культур респираторных образцов, собранных с использованием таких подходов как аспирация трахеи и бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). После забора материала проводится количественная оценка колониеобразующих единиц и определение чувствительности к антибиотикам для выявления патогенных профилей изолятов (Torres, А., & El-Ebiary, М. (2000). Bronchoscope BAL in the diagnosis of ventilator-associated pneumonia. Chest, 117(4 Suppl 2), 198S-202S). Основным недостатком таких методов является задержка в получении результатов, связанная с необходимостью культивирования, в том числе на средах, содержащих антибиотики.
Другие стратегии для обнаружения микробных агентов, особенно атипичных, связаны с применением молекулярно-биологических методов, обладающих большей чувствительностью, точностью и специфичностью. К таким, прежде всего, относится полимеразная цепная реакция и различные ее модификации, а также серологические тесты и тестирование на антигены в биологических образцах.
Прямое исследование респираторных образцов
Для оказания своевременной помощи и последовательного ведения пациента с пневмонией большое значение имеет микроскопическое исследование респираторных образцов. Идентификация патогенов в высококачественных пробах, собранных непосредственно с места инфекции или из обычно асептического места (например, крови), обеспечивает надежное выявление вероятных возбудителей болезни.
Микроскопическое исследование можно легко применить к жидкостям БАЛ для исследования внеклеточных и внутриклеточных бактерий после окрашивания красителями Май-Грюнвальда Гимза и Грама. Идентификация грибков также может быть получена микроскопически после окрашивания реактивом Шиффа (Bousbia, S., Raoult, D., & La Scola, В. (2013). Pneumonia pathogen detection and microbial interactions in polymicrobial episodes. Future Microbiology, 8(5), 633-660). Другие красители, такие как окраска Циля-Нильсена для микобактерий, используются для идентификации конкретных микроорганизмов. Также микроскопия позволяет провести количественную оценку бактериальной нагрузки путем прямого подсчета, что, принимая во внимания пороговые значения патогенной нагрузки, дает возможность отличить простую колонизацию от легочной инфекции.
К преимуществам данного подхода в определении возбудителя относится его быстрота, позволяющая определять начальные этапы терапии с применением антимикробных препаратов. Среди недостатков - низкие чувствительность и точность.
Культуральный метод исследования
Культуральное исследование, предполагающее посев клинических образцов на селективные и дифференциально-диагностические среды и их последующую идентификацию с помощью различных методов (биохимические тесты, время-пролетная масс-спектрометрия) до настоящего времени остается основным методом диагностики пневмонии, вызванной S. pneumoniae, Н. influenzae, энтеробактериями, S. aureus и P. aeruginosa, и обладает высокой специфичностью (МУК 4.2.189004. Методические указания. Определение чувствительности микоорганизмов к антибактериальным препаратам. Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер. 2004; 6 (4): 306-359).
Культуральное исследование респираторных образцов с целью выявления Legionella spp., несмотря на специфичность метода, в рутинной практике не рекомендуется, так как является дорогостоящим и трудоемким, а чувствительность его существенно варьирует в зависимости от исследуемого материала (низкая при исследовании мокроты) и квалификации персонала.
Несмотря на тот факт, что культуральный метод является золотым стандартом в определении возбудителей пневмонии, к его слабым сторонам относятся сложность в осуществлении необходимых для выращивания колоний операций и длительность в получении результатов (от 48 часов), вследствие чего затруднено его применение в случаях заболеваний с высоким темпом развития патологического процесса.
Времяпролетная масс-спектрометрия
В последние десятилетия в качестве сильного современного инструмента микробиологической диагностики выделяется матричная времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией.
MALDI-TOF MS широко используется в качестве мощного метода анализа для быстрой и высокоточной идентификации микроорганизмов в лабораториях. Данная технология может предоставить альтернативный метод диагностики патогенов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, грибки и другие микроорганизмы, идентификация которых с помощью классических инструментов порой затруднена. MALDI-TOF MS с минимальными затратами на расходные материалы способен дать воспроизводимые, видоспецифичные паттерны, которые в основном не зависят от культуры, условий роста или выбора среды, что выгодно отличает его от стандартного культурального метода.
Микробные образцы, нанесенные на пластину-мишень, покрываются матричным раствором, который кристаллизуется с образцом и лизирует вегетативные организмы. Трудными для лизиса являются некоторые грамположительные бактерии, микобактерии, дрожжи и плесень, и часто требуют предварительной обработки сильной органической кислотой или механического лизиса. После помещения в прибор образцы ионизируются короткими лазерными импульсами, образуя ионы газовой фазы с минимальной фрагментацией (то есть проводится «мягкой ионизацией») с последующим ускорением частиц в вакууме посредством электрического поля. Время, необходимое каждой частице для достижения детектора зависит от ее массы и заряда. После того, как все обильные белки в образце обнаружены масс-спектрометром, создается спектр, уникальный для анализируемого организма (Dingle, Т.С, & Butler-Wu, S.М. (2013). MALDI-TOF Mass Spectrometry for Microorganism Identification. Clinics in Laboratory Medicine, 33(3), 589-609).
Одним из основных недостатков MALDI-TOF MS является то, что преимущества в отношении быстрой идентификации микроорганизмов ограничены необходимостью выделения чистых культур. Показано также, что подготовка образца и тип используемой среды могут влиять на его воспроизводимость анализа (Seng Р, Rolain JM, Fournier РЕ, La Scola В, Drancourt М, Raoult D. MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical microbiology. Future Microbiol. 5(11), 1733-1754 (2010)). Серьезным недостатком также является сложность и дороговизна используемого оборудования (Williams TL, Andrzejewski D, Lay JO, Musser SM. Experimental factors affecting the quality Pneumonia pathogen detection & microbial interactions Review 656 Future Microbiol. (2013) 8(5) future science group and reproducibility of MALDI TOF mass spectra obtained from whole bacteria cells. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14(4), 342-351 (2003)).
Молекулярно-биологические методы
Применение молекулярной биологии в лабораториях в качестве рутинного инструмента сильно изменило лабораторные диагностические процедуры. На сегодняшний день молекулярные тесты широко применяются в качестве инструмента для повседневной идентификации микроорганизмов, поскольку дают много преимуществ в микробной диагностике.
Прежде всего с применением данных методов достигается более чувствительное обнаружение патогенов, даже когда те присутствуют в малых количествах, что отличительно выделяет высокоточную идентификация по сравнению с обычным выделением культуры. Во-вторых, молекулярные методы особенно полезны для идентификации некультивируемых или трудно растущих микроорганизмов, к которым относятся представители родов Chlamydia, Legionella, Mycobaterium и Mycoplasma, или тех, что являются строго внутриклеточными (к примеру, респираторные вирусы). Наконец, использование молекулярных подходов в обнаружении патогенов не сопряжено с жизнеспособностью микроорганизмов или атмосферными условиями. Так, с их помощью анаэробные бактерии при респираторных инфекциях удобнее обнаруживать с использованием молекулярно-биологических методов, а не с помощью анализа культур.
В рутинной микробной диагностике особенно широкое применение находят методы, основанные на полимеразной цепной реакции и ее модификациях, часто дополненные последующим секвенированием. Другие методы на основе ПЦР, такие как количественная ПЦР и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), значительно улучшают диагностику пневмонии, поскольку они являются быстрыми, специфическими и более чувствительными системами обнаружения патогенов.
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов и флуоресцентная гибридизация in situ (или метод FISH) также используются для идентификации бактерий.
Другие молекулярные технологии, такие как биологические чипы и мультиплексная ПЦР, значительно повышают способность этих молекулярных методов одновременно воздействовать на большое количество патогенов, облегчая чувствительное обнаружение и точную идентификацию множества возбудителей при полимикробных инфекциях.
ПЦР как инструмент диагностики
К преимуществам ПЦР как диагностического инструмента, основанного на амплификации определенных фрагментов генома возбудителей, относятся высокая чувствительность, скорость и специфичность. ПЦР-анализ позволяет выявить патологические агенты в различных биологических субстратах как при хронических, так и при острых формах заболевания. Помимо этого, постановка ПЦР позволяет идентифицировать не только типичных возбудителей пневмонии, но и атипичных, а также обладающих резистентностью к антимикробным препаратам, что способствует выбору антибактериальной терапии.
Наиболее частой мишенью амплификации в данном случае выступает последовательность 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Гены, кодирующие данную последовательность, содержат гипервариабельные области, уникальные для различных видов бактерий, по которым последние могут быть идентифицированы.
Тем не менее, для некоторых бактерий последовательность 16S рДНК недостаточно точно определяет видовой уровень. Фактически, некоторые бактерии, различающиеся по фенотипу и морфологии, могут иметь сходные последовательности в рибосомных генах (к примеру, Escherichia и Shigella или некоторые стрептококки). Вследствие этого проводится анализ генотипа на видоспецифичные сегменты: ген gyrB для L. pneumophila, cpsA для S. pneumoniae, SCCmec для метициллинрезистентных стафилококков или внутренние транскрибируемые спейсеры. Благодаря такому уточненному анализу можно успешно отнести патоген к нужным уровням вида, штамма или линии, а также дифференцировать вирулентные патогены от авирулентных.
ДНК-биочипы
Биочипы являются комплексной платформой для одновременного определения нескольких генов и находят применение в научной, клинической и экологической областях благодаря своей способности размещать на весьма компактной поверхности до сотен или тысяч биологических зондов в относительно небольшом пространстве и объеме реакции.
Технология биочипов восходит к традиционным твердофазным анализам вроде дот-блот-гибридизации или иммуноферментных анализов, которые десятилетиями использовались в лабораториях. В твердофазном анализе молекулы прикреплены к твердой подложке и представляют собой так называемые зонды, - с их помощью в образце определяется наличие целевых молекул, вступая во взаимодействие с которыми зонд должен демонстрировать как можно более высокую специфичность и сродство. Зонды могут быть продуктами ПЦР, олигонуклеотидами, плазмидами или бактериальными искусственными хромосомами для анализа геномов и транскриптомов, а также белками, антителами, аптамерами ДНК/РНК или углеводами (Dufva, М. (Ed.). (2009). DNA Microarrays for Biomedical Research. Methods in Molecular Biology).
Молекулярные зонды иммобилизуются на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла, В гелевых биочипах зонды иммобилизуются или в слое полиакриламидного геля толщиной порядка 20 микрон, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла, или в полусферических гидрогелевых ячейках с диаметром около 100 микрон (как в чипах, разработанных в Институте молекулярной биологии РАН). Иммобилизация осуществляется за счет образования ковалентных связей при облучении ультрафиолетовым излучением или с помощью химических реагентов. Иммобилизуемые зонды наносятся на поверхность с помощью игольчатых растворов механического робота или с помощью технологи струйного принтера (Биочипы для медицинской диагностики. В.Р. Чечеткин, Д.В. Прокопенко, А.А. Макаров, А.С. Заседателев. Российские нанотехнологии 1 (1-2), 13-28, 2006).
Анализируемые молекулы в растворе метятся с помощью флуоресцентной или радиоактивной метки до или после гибридизации, в следствие чего их можно впоследствии обнаружить по определенному сигналу. Свойства флуоресцентного красителя не должны сильно зависеть от состава анализируемых молекул (А/Т или G/C для ДНК) и температуры раствора. В настоящее время наиболее типичными красителями, использующимися в технологии биочипов, являются флуорофоры Су3 и Су5.
В настоящем изобретении предлагается способ, основанный на мультиплексном ПЦР-анализе с предварительным использованием обратной транскрипции (ОТ) с проведением ферментативных реакций непосредственно на биологическом микрочипе. Способ предназначен для одновременного выявления в исследуемом образце шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии по их ДНК/РНК. Способ в представленном виде не имеет отечественных и зарубежных аналогов и описывается впервые.
Раскрытие сущности изобретения
Целью изобретения является создание способа быстрого выявления в образце возбудителей инфекционной пневмонии человека на биологических микрочипах. В качестве образцов могут быть использованы: клинический материал, лизат клеточной культуры, различные физиологические жидкости (мокрота при откашливании, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), аспираты из трахеи), соскобы из гортани и носоглотки.
Важным этапом разработки изобретения явился выбор видоспепифичных генетических мишеней и конструирования соответствующих специфичных праймеров.
Изобретение предлагает использование способа мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией (мультиплексная ОТ-ПЦР) для быстрого выявления шести социально значимых бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека на биологических микрочипах. Сконструированные праймеры для мультиплексной ОТ-ПЦР обладают видовой специфичностью к возбудителям. Для каждой пары видоспецифичых праймеров применяется также один или два вложенных праймера, иммобилизованных на твердой подложке (биологическом микрочипе). Именно по удлинению этих праймеров, благодаря ковалентному введению метки, производится детекция результата обнаружения патогена. Введение метки осуществляется путем применения флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксинуклеозидов непосредственно в процессе проведения ферментативных реакций. Таким образом, после проведения ОТ-ПЦР множество меченых молекул оказываются ковалентно связанными с иммобилизованным праймером. Это позволяет проводить «жесткую» отмывку биочипа после проведения реакции, удаляя все непрореагировавшие компоненты, включая не вступившие в реакцию свободные меченые дезоксинуклеозиды. Такой способ существенно повышает чувствительность анализа на биочипах, поскольку избавляет от фонового сигнала при детекции результата.
Чувствительность способа, определенная раститровкой ДНК каждого из анализируемых возбудителей, составляет от 102 до 103 копий геномной ДНК на реакционную пробирку, в том числе при одновременном введении в смесь нескольких матриц.
Данное изобретение обеспечивает способ идентификации шести социально значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, а также двух вирусных: SARS-CoV-2 и Грипп А.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Схема анализа с применением иммобилизованных праймеров. Литерами f и r обозначены прямой и обратный фланкирующие праймеры, литерами r1 и r2 - вложенные иммобилизованные праймеры (содержат аминогруппы на 5'-конце), dU* - меченный цианиновым красителем дезоксиуридин, встраиваемый в процессе удлинения праймера.
Фигура 2. Варианты ПЦР на чипе (схема): а) стандартный вариант ПЦР с использованием свободного (не иммобилизованного) флуоресцентно-меченного праймера в смеси, б) предлагаемый изобретением вариант ПЦР с использованием флуоресцентно-меченного трифосфата дезоксиуридина.
Фигура 3. Специализированный биологический микрочип для видового определения возбудителей пневмонии методом мультиплексной ОТ-ПЦР. а - Схема: М - флуоресцентный маркер для автоматического наложения сетки при программном обеспечении расчета интенсивности сигнала ячеек; Gel - ячейка пустого геля; Sta - Staphylococcus aureus (здесь и во всех последующих случаях цифры "1" и "2" обозначают использование двух различных праймеров внутри последовательности, фланкируемой краевыми праймерами, литера "а" обозначает использование праймера в концентрации, в 2 раза меньшей, чем в ячейке чипа без литеры - это необходимо для повышения надежности автоматического анализа); Str - Streptococcus pneumoniae, Leg - Legionella pneumophila, Hae - Haemophilus influenzae, Pse - Pseudomonas aeruginosa, Kle - Klebsiella pneumoniae, Cov - SARS-CoV-2, Inf - вирус гриппа A; Conl -внутренний контроль обратной транскрипции (резервный; в настоящее время не используется), Соn2 - внутренний контроль ПЦР. б-и - результаты определения вида (примеры) соответственно: St. aureus, S. pneumoniae, H. influenzae, SARS-CoV-2, вирус гриппа А, K. Pneumoniae, L. Pneumophila, Ps. aeruginosa. Для удобства приведены фото с инвертированными сигналами (негативы).
Осуществление изобретения
Изобретение нацелено на идентификацию шести социально значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека: Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, а также двух вирусных: SARS-CoV-2 и Грипп А, в различных биологических материалах.
Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения ДНК из биологических образцов, например - фенол-хлороформным методом (Molecular Cloning, Volume 3, 3rd edition, by Joseph Sambrook and David W. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001) или методом с использованием силикатных сорбентов (Cady N.C., Stelick S., Batt C.A. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosens Bioelectron. 2003 Oct 30:19(1):59-66). но не ограничивается ими.
Подбор олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-31 (Перечень последовательностей) выполняется на основе систематизации последовательностей, кодирующих видоспецифичные гены возбудителей. Конструирование высокоспецифичных праймеров осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, Silva). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей генов-мишеней. Каждому выравниванию присваивается консенсусная последовательность. Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW, консенсусная последовательность присваивалась со значением параметра «threshold frequency» равным 100%. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v.6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), проводится расчет температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, Silva) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
Включение флуоресцентной метки осуществляется в удлиняющиеся в процессе ферментативных реакций иммобилизованные на биологических микрочипах праймеры, представленные последовательностями SEQ ID NO: 17-31 (Перечень последовательностей). Для этого используются флуоресцентно-меченные трифосфаты дезоксиуридина. Принципиальная схема ферментативного удлинения иммобилизованного праймера с одновременным включением метки представлена на Фигуре 1. Видно, что используются праймеры, фланкирующие регион для идентификации возбудителя, при этом на чипе находятся иммобилизованные «вложенные» праймеры, содержащие аминогруппу. Детекция осуществляется с помощью специализированных флуоресцентных микроскопов для биочипов (чип-детекторов), производимых коммерчески и не составляющих предмет настоящего изобретения. При этом производится полное удаление реакционной смеси после прохождения ОТ-ПЦР и отмывка биологического микрочипа. После этого получаемый флуоресцентный сигнал обусловлен лишь теми флуоресцентными метками, которые встроились в процессе ОТ-ПЦР в последовательности иммобилизованных праймеров (для ферментативного введения метки используется трифосфат дезоксиуридина, в С5-положение пиримидинового цикла которого включен краситель Су5). Преимущество такого метода перед классическим, где используется меченый праймер, заключается в том, что отмывку можно производить «жестко», удаляя все компоненты реакционной смеси. В классическом случае, когда детекция производится путем гибридизации флуоресцентно-меченного праймера, такая отмывка привела бы к полной потере сигнала по причине разрушения водородных связей между флуоресцентно-меченным праймером и иммобилизованным удлиненным праймером (Фигура 2а). Невозможность применения «жесткой» отмывки (кипячения в присутствии детергента, ПАВ) приводит к повышенному нецелевому (фоновому) сигналу из-за оставшихся несовершенных дуплексов флуоресцентно-меченных праймеров и неспецифично сорбировавшихся в гидрогеле флуоресцентно-меченных праймеров. В случае предлагаемого способа производится полное удаление всех компонентов смеси после проведения ферментативных реакций, при этом удаляются и непрореагировавшие флуоресцентно-меченные трифосфаты дезоксиуридина. Таким образом, фоновый сигнал уменьшается вплоть до базового фонового сигнала чип-детектора, тем самым резко увеличивая чувствительность способа (фирура 2б).
Идентификация возбудителя в образце осуществляется с помощью проведения мультиплексной ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе. В изобретении применяются биочипы, изготовленные по технологии и ИМБ РАН (Москва, Россия) с иммобилизованными на них оригинальными праймерами для проведения обратной транскрипции и последующей амплификациии ДНК (методом ПЦР) для РНК-содержащих вирусов, либо только амплификации ДНК - для бактериальных возбудителей пневмонии.
Принципиальная схема чипа приведена на Фигуре 3а. Из Фигуры 3а видно, что каждый специфический иммобилизованный праймер имеет четко заданные координаты на биочипе, что позволяет при интерпретации результата точно сопоставлять праймеры, дающие флуоресцентный сигнал, с соответствующими им патогенными агентами. Из той же фигуры видно, что на чипе применен положительный контроль прохождения реакции (ячейки Соn2 и Соn2а), отсутствие сигнала с ячеек которого говорит о том, что идентификация проведена некорректно и определение возбудителя необходимо произвести повторно. На чипе присутствуют резервные ячейки Con1 и Con1а, сигнал с которых в норме отсутствует.
Примеры обнаружения в образце различных возбудителей инфекционной пневмонии представлены на Фигуре 3б-и. Идентификация возбудителя производится визуально в соответствии со схемой расположения специфичных к различным возбудителям иммобилизованных праймеров на биологическом микрочипе (Фигура 3а).
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Набор специфических олигонуклеотидных праймеров, используемых в способе обнаружения видоспецифичных генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека.
Праймеры для проведения полимеразной цепной реакции синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США). Список праймеров приведен в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-16).
Пример 2. Выделение ДНК из клинических образцов.
1. В пробирки добавляют 20 мкл универсального сорбента (набор "ДНК-сорб-АМ", ЦНИИ Эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора, Россия), после чего вносят по 300 мкл лизирующего раствора.
2. В пробирки с добавленным сорбентом и лизирующим раствором вносят по 100 мкл клинического образца.
3. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе и инкубируют в течении 5 мин при температуре 65°С в термостате. После окончания инкубации пробирки повторно перемешивают на вортексе и оставляют при комнатной температуре на 2 мин.
4. Сорбент осаждают в пробирках с помощью центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 секунд. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость.
5. К осадку добавляют по 1 мл отмывочного раствора и перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
6. Повторяют пункт 5.
7. Пробирки с открытой крышкой помещают в термостат с температурой 65°С на 5-10 мин для подсущивания сорбента.
8. В пробирки добавляют по 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-НСl, 1 мМ ЭДТА), рН 8,0 для элюции суммарной ДНК и РНК. Перемешивают пробирки на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
9. Центрифугируют пробирки при 12000 об/мин в течении 1 мин. Надосадочную жидкость используют для проведения обратной транскрипции и ПЦР.
Пример 3. Проведение обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагментов видоспецифичных генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека.
К 29 мкл реакционной смеси вносят 1 мкл образца, полученного в Примере 2.
Мультиплексная ОТ-ПЦР в иммобилизованной фазе. Для проведения ОТ-ПЦР используют обратную транскриптазу MMLV и другие компонентов набора "PEBEPTA-L" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) и Hot Start Taq-полимеразу ("Thermo Scientific") в буфере, соответствующем набору для Hot Start Taq-полимеразы с добавлением дитиотрейтола.
1. К аликвоте смеси, содержащей природные dNTP (по 400 мкМ каждого) и праймеры (5-10 мкМ прямого и 0.5-1.0 мкМ обратного для каждого из возбудителей (различались для разных пар праймеров в результате проведенной оптимизации)) добавляют в качестве флуоресцентного субстрата полимеразы Cy5-dUTP в концентрации 8 мкМ (Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov Т.О., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Comparative study of novel fluorescent cyanine nucleotides: hybridization analysis of labeled PCR products using a biochip.J. Fluoresc. 27, 2001-2016), а также специальную ДНК-матрицу-положительный контроль прохождения реакции.
2. Смесь помещают на чип и герметизируют с помощью Frame-Seal 25 mkl ("Bio-Rad", США).
3. Проводят реакции обратной транскрипции и амплификации (ОТ-ПЦР) на ДНК-амплификаторе для in situ ПЦР TGradient Thermocycler ("Biometra", США). При этом ОТ проводят в течение 30 мин при 42°С, после чего проводят ПЦР в следующих условиях: 95°С в течение 3 мин (начальная денатурация); 36 циклов по 20 с при 95°С, 30 с при 64°С и 40 с при 72°С; завершающая инкубация в течение 5 мин при 72°С.
4. Определяют чувствительность ОТ-ПЦР на чипе раститровкой ДНК/РНК анализируемых образцов в интервале 101-105 копий на реакционный объем (25 мкл). Данный пункт осуществляют только на стадии оптимизации способа.
5. 10 мкл реакционной смеси, полученной после проведения ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе, используют для электрофоретического контроля образовавшихся продуктов для каждого из возбудителей.
Пример 4. Проведение электрофоретического разделения продуктов амплификации (только на стадии оптимизации способа).
1. Готовят 1 × ТАЕ-буфер путем пятидесятикратного разведения 50 × ТАЕ буфера (2 М Трис, 1 М уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА, рН 8,4) в объеме, достаточном для заполнения электрофорезной камеры и приготовления геля (1000 мл).
2. Добавляют к 1 × ТАЕ буферу агарозу в количестве, необходимом для получения 2% раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.
3. Охлаждают смесь до 50°С.
4. Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают.
5. Полученный раствор выливают в кювету для геля и равномерно распределяют по объему кюветы.
6. В кювету вставляют гребенку в вертикальном положении так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.
7. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин при комнатной температуре для застывания геля. Далее, аккуратно удаляют гребенку и помещают кювету с гелем в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 × ТАЕ буфера.
8. По 10 мкл образов, полученных в Примере 3, смешивают с 2 мкл буфера для нанесения (10 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 40% глицерин, 40 мМ ЭДТА, 0,01% бромфеноловый синий, 0,01% ксиленцианол) и аккуратно вносили в лунки геля.
9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1,5 В на 1 см геля в течение 30 мин.
10. Извлекают гель из электрофорезной камеры и просматривают в УФ-свете на транс-иллюминаторе. Результаты документируют путем фотографирования геля и сохранения полученных изображений.
Пример 5. Интерпретация результатов электрофоретического разделения продуктов амплификации.
1. Изображения, полученные в Примере 4 интерпретируют следующим образом. По наличию полосы оптической плотности с длиной в диапазоне 200-400 п.н. в дорожке на агаразном геле делается вывод о наличии соответствующего гена в исследуемом образце, соответствующем конкретному возбудителю.
Пример 6. Интерпретация результатов идентификации шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии методом ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе.
1. Считывание флуоресцентного сигнала с чипа после удлинения иммобилизованных праймеров осуществляют с применением анализатора "Чип-детектор" (ИМБ, Россия). Интенсивность полученных сигналов определяют с помощью программного обеспечения "ImaGeWare" ver. 3.50 (ИМБ, Россия).
2. Интерпретацию наличия в образце того или иного возбудителя осуществляют визуально, согласно схеме, представленной на Фигуре 3а.
--->
Перечень последовательностей
<210> 1
<211> 23
<212> cpsB-f1
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<223> праймер прямой
<400> 1
TTGATGTAGATGACGGTCCCAAG (SEQIDNO: 1)
<210> 2
<211> 23
<212> cpsB-r1
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<223> праймер обратный
<400> 2
TATATCTCTG CGCCATAAGC AAT (SEQ ID NO: 2)
<210> 3
<211> 23
<212> ebpS-f1
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<223> праймер прямой
<400> 3
ACTCGACTGA GGATAAAGCG TCT (SEQ ID NO: 3)
<210> 4
<211> 23
<212> ebpS-r1
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<223> праймер обратный
<400> 4
CCTCCAAATA TCGCTAATGC ACC (SEQ ID NO: 4)
<210> 5
<211> 23
<212> fucK-f1
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<223> праймер прямой
<400> 5
TGCTCACTCA ACGCTTAACT GGT (SEQ ID NO: 5)
<210> 6
<211> 23
<212> fucK-r1
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<223> праймер обратный
<400> 6
TTCTGGGCTA ATGGTGTACG TAA (SEQ ID NO: 6)
<210> 7
<211> 23
<212> oprL-f1
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<223> праймер прямой
<400> 7
GCGTGCGATC ACCACCTTCT ACT (SEQ ID NO: 7)
<210> 8
<211> 23
<212> oprL-r1
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Pseudomonas aeruginosa
<400> 8
TTCTTCAGCT CGACGCGACG GTT (SEQ ID NO: 8)
<210> 9
<211> 22
<212> sidA-f1
<213> Legionella pneumophila
<220>
<223> праймер прямой
<400> 9
TTCCACTGGT GGGTGGGTTT TG (SEQ ID NO: 9)
<210> 10
<211> 23
<212> sidA-r1
<213> Legionella pneumophila
<220>
<223> праймер обратный
<400> 10
TCATGTTGGA GTTCTATGGC ACG (SEQ ID NO: 10)
<210> 11
<211> 23
<212> rmpA-f2
<213> Klebsiella pneumoniae
<220>
<223> праймер прямой
<400> 11
GGACTACCTC TGTTTCATAT TAC (SEQ ID NO: 11)
<210> 12
<211> 20
<212> rmpA-r2
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Klebsiellapneumoniae
<400> 12
CCCCATTTTT CAGTAGGCAT (SEQ ID NO: 12)
<210> 13
<211> 23
<212> E-forw
<213> SARS-CoV-2
<220>
<223> праймер прямой
<400> 13
TCGTTTCGGA AGAGACAGGT ACG (SEQ ID NO: 13)
<210> 14
<211> 23
<212> E-rev
<213> SARS-CoV-2
<220>
<223> праймер обратный
<400> 14
AAGACTCACG TTAACAATAT TGC (SEQ ID NO: 14)
<210> 15
<211> 24
<212> М2-forw
<213> Influenza A
<220>
<223> праймер прямой
<400> 15
CACGCTCACC GTGCCCAGTG AGCG (SEQ ID NO: 15)
<210> 16
<211> 24
<212> М2-rev
<213> Influenza A
<220>
<223> праймер обратный
<400> 16
TATATGAGGC CCATGCAACT GGCA (SEQ ID NO: 16)
<210> 17
<211> 23
<212> R3
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 17
NH2-TATATCTCTG CGCCATAAGC AAT (SEQ ID NO: 17)
<210> 18
<211> 23
<212> R5
<213> Streptococcus pneumoniae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 18
NH2-GCAATGACTAAATCATCTGCCAC (SEQ ID NO: 18)
<210> 19
<211> 23
<212> R1
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 19
NH2-CCTCCAAATA TCGCTAATGC ACC (SEQ ID NO: 19)
<210> 20
<211> 26
<212> R2
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 20
NH2-GGTAACAATA CTTTGGCCAT GCCACC (SEQ ID NO: 20)
<210> 21
<211> 23
<212> R8
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 21
NH2-TTCACCTGCA TAACGCATAG GAG (SEQ ID NO: 21)
<210> 22
<211> 23
<212> R9
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 22
NH2-CATAACGCAT AGGAGGGAAA TGG (SEQ ID NO: 22)
<210> 23
<211> 22
<212> R10
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 23
NH2-GTAGCGACCG GACGCTCTTT AС (SEQ ID NO: 23)
<210> 24
<211> 22
<212> R11
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 24
NH2-GCTCTTTACC ATAGGAAACC AG (SEQ ID NO: 24)
<210> 25
<211> 26
<212> R6
<213> Legionella pneumophila
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 25
NH2-TCATTATATT TATCATTGTT TGGCTC (SEQ ID NO: 25)
<210> 26
<211> 23
<212> R7
<213> Legionella pneumophila
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 26
NH2-ACGTTTCGCT ACAAGATCTA TAA (SEQ ID NO: 26)
<210> 27
<211> 21
<212> R13
<213> Klebsiella pneumoniae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 27
NH2-GGCGTCAGAT ACAGGACGGC T (SEQ ID NO: 27)
<210> 28
<211> 22
<212> R14
<213> Klebsiella pneumoniae
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 28
NH2-CCACTCCACC GGCAGTGCTCAC (SEQ ID NO: 28)
<210> 29
<211> 23
<212> E-f-n
<213> SARS-CoV-2
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 29
NH2-CTTGCTTTCG TGGTATTCTT GCT (SEQ ID NO: 29)
<210> 30
<211> 23
<212> E-r-n
<213> SARS-CoV-2
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 30
NH2-CACACAATCG AAGCGCAGTA AGG (SEQ ID NO: 30)
<210> 31
<211> 23
<212> INF-F1
<213> InfluenzaA
<220>
<223> праймер иммобилизованный вложенный обратный
<400> 31
NH2-CTCACCGTGC CCAGTGAGCG AGG (SEQ ID NO: 31)
<---
Claims (6)
1. Способ идентификации генов шести социально значимых бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека, включающий:
а) амплификацию фрагментов видоспецифичных генов шести социально значимых бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека путем проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с оригинальным набором специфических олигонуклеотидных праймеров на одном биологическом микрочипе, представленным последовательностями SEQ ID NO: 1-16;
б) отмывку биологического микрочипа;
в) анализ картины ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе с помощью Чип-детектора;
г) визуальную интерпретацию результатов анализа.
2. Биочип, используемый в способе идентификации генов шести социально значимых бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека, с гидрогелевыми ячейками с иммобилизованными в них высокоспецифичными праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17-31.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2784653C1 true RU2784653C1 (ru) | 2022-11-29 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012157750A1 (ja) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | 持田製薬株式会社 | 血液検体を用いた呼吸器感染症の診断 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012157750A1 (ja) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | 持田製薬株式会社 | 血液検体を用いた呼吸器感染症の診断 |
RU2660352C2 (ru) * | 2011-05-19 | 2018-07-05 | Мотида Фармасьютикал Ко., Лтд. | Диагностика инфекционного заболевания дыхательных путей с использованием образцов крови |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Е.А. КОЛОСКОВА, Б.А. РАМАЗАНОВА, Современная эпидемиологическая и микробиологическая характеристика пневмококковой инфекции, Вестник КазНМУ, 2016, номер 2, стр.49-56. ПАВЛОВА, Т. А. СМИРНЫХ. Пневмонии: диагностика, лечение, профилактика, информационное письмо для терапевтов, врачей общей практики Курган 2010, стр.4, 5. * |
С. А. ЛАПА, Е. С. КЛОЧИХИНА и др. МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННОЙ ПНЕВМОНИИ, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2020, том 46, номер 5, стр.550-552. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Klouche et al. | Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections | |
US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
Supaprom et al. | Development of real-time PCR assays and evaluation of their potential use for rapid detection of Burkholderia pseudomallei in clinical blood specimens | |
Gosiewski et al. | Comparison of methods for isolation of bacterial and fungal DNA from human blood | |
WO2009049007A2 (en) | Compositions, methods and systems for rapid identification of pathogenic nucleic acids | |
Saukkoriipi et al. | Real-time quantitative PCR for the detection of Streptococcus pneumoniae in the middle ear fluid of children with acute otitis media | |
JP2011512789A (ja) | クロストリジウム・ディフィシレの検出 | |
Seidel et al. | Development of a nucleic acid lateral flow immunoassay (NALFIA) for reliable, simple and rapid detection of the methicillin resistance genes mecA and mecC | |
JP2013520186A (ja) | 緑膿菌の血清型決定のためのアッセイ法およびキット、ならびにそのような方法およびキットにおいて有用なオリゴヌクレオチド配列 | |
JP5076894B2 (ja) | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 | |
Splettstoesser et al. | Rapid differentiation of Francisella species and subspecies by fluorescent in situ hybridization targeting the 23S rRNA | |
Jannes et al. | A review of current and future molecular diagnostic tests for use in the microbiology laboratory | |
US7960106B2 (en) | Diagnostic method and products useful therein | |
JP5958498B2 (ja) | マイコバクテリウム・イントラセルラー検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出方法 | |
Post et al. | Development and validation of a multiplex PCR-based assay for the upper respiratory tract bacterial pathogens Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, and Moraxella catarrhalis | |
Bandyopadhyay et al. | Adenosine deaminase estimation and multiplex polymerase chain reaction in diagnosis of extra-pulmonary tuberculosis | |
RU2784653C1 (ru) | Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной, и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления | |
Schlachter et al. | Detection and differentiation of Lyme spirochetes and other tick-borne pathogens from blood using real-time PCR with molecular beacons | |
RU2551208C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei | |
Nour et al. | Amplification of P1 and 16S rRNA genes by nested PCR for detection of Mycoplasma pneumoniae in paediatric patients | |
Reischl et al. | Rapid detection of Panton–Valentine leukocidin-positive Staphylococcus aureus by real-time PCR targeting the luk S-PV gene | |
Haddad-Boubaker et al. | Molecular diagnosis of bacterial meningitis by multiplex real time PCR in Tunisian children | |
Goldenberg | Molecular-based diagnostics, including future trends | |
RU2542395C1 (ru) | Набор реагентов и способ для выявления днк возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов | |
Plongla et al. | Molecular testing for diseases associated with bacterial infections |