CN101235377A - 铁皮石斛试管苗的特征dna序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及铁皮石斛试管苗的特征DNA序列及其应用。本发明公开了一种铁皮石斛试管苗的特征DNA序列，它是SEQ ID NO：1的DNA序列或其互补序列。本发明还公开了将铁皮石斛试管苗的特异性探针用于铁皮石斛试管苗的鉴定的用途及鉴定的方法。使用本发明对铁皮石斛试管苗及铁皮石斛进行鉴定，准确度高，特异性好，鉴别技术易掌握。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，进一步的本发明涉及铁皮石斛试管苗的特征DNA序列及其应用。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)，为多年生附生草本，是我国传统名贵中药之一，列为上品，具有润喉消毒、生津益胃、清热养阴等功效。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力，扩张血管及抗血小板凝集等作用。
铁皮石斛生长环境特殊，加之长期的采挖，已成为稀有、濒危的药用植物。为拯救这一珍贵药源，近年来通过无性繁殖试管苗以及试管苗栽培的成功，实现了铁皮石斛资源的可持续开发和利用。
石斛属(Dendrobium Sw.)全世界约有1000种，我国有74种2变种，其中可做药用的种类繁多，中国药典(2000年以前版本)收载石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)铁皮石斛Dendrobium offcinale、金钗石斛D.nobile、黄草石斛D.chrysanthum、环草石斛D.loddigesii、马鞭石斛D.fimbriatum的新鲜或干燥茎。因铁皮石斛的珍贵、稀有、来源有限等，其混淆品也就屡见不鲜；另外，通过无性繁殖培植的试管苗，因植株较小，在外形上无法判断其来源的种类；还有，试管苗在繁殖和栽培的过程中，由于生态环境的改变和人们生产活动的影响，是否会发生变异等，这些现象如果依靠传统的方法进行鉴定非常困难。
随着分子生物技术的迅速发展，DNA分子标记技术在中药鉴定方面的应用已取得了许多进展(曹晖等，DNA分子指纹图谱与测序技术在中药品质研究中的现状与展望，中国中药杂志，1998，23(11)；姜玉新，石思信，张志娥等.人参、西洋参的基因组DNA的RAPD分析.特产研究，1998，(1)：5；Kitanaka S，Kunishi M，Taira T，et al.Ginsenosideproduction，tissue culture and induction of regeneration of interspecific hybridginseng(Panax ginseng×P.quinquefolium).Natural Med，1997，51：1；Ngan FN，Wang J，But PPH，et al.Application of arbitrarily primed polymerase chainreaction(AP-PCR)in commercial ginseng products.5 th International Congress ofPlant Molecular Biology，Singapore，1997)。本实验通过随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)方法，对铁皮石斛试管苗及石斛属中其它一些种类进行了研究，获得了RAPD图谱，从中筛选出铁皮石斛试管苗特异性条带，通过克隆、测序等，设计了特异性探针，应用于组培铁皮石斛及野生铁皮石斛鉴定，得到了满意的结果，为铁皮石斛的鉴定和可持续开发及利用等提供了分子生物学方面的依据。
发明内容
本发明的目的是公开铁皮石斛试管苗的特征DNA序列及其应用。
本发明一方面公开了一种铁皮石斛试管苗的特征DNA序列，它是SEQ ID NO：1的DNA序列或其互补序列。
本发明另一方面公开了上述铁皮石斛试管苗的特征DNA序列在铁皮石斛试管苗鉴定中的应用。
较佳的，利用针对上述铁皮石斛试管苗特征DNA序列的特异性探针鉴定铁皮石斛试管苗或铁皮石斛。
本发明第三方面公开了一种检测样品中是否含有铁皮石斛试管苗特征DNA序列的方法，包括下列步骤：
(1)使用针对铁皮石斛试管苗特征DNA序列的特异性探针对样品的基因进行扩增；
(2)检测是否获得相应的扩增产物。
较优的，上述铁皮石斛试管苗的特异性探针序列选自下组中的一组或多组：
(1)5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′(SEQ ID NO：8)
和5′TCGGTCGTCCCGTCGTAT 3′(SEQ ID NO：9)；
(2)5′AAGTGCCAAATGTTGAGTC 3′(SEQ ID NO：10)
和5′CCTGGAATCTGTCGTGCT 3′(SEQ ID NO：11)
(3)5′CGAGACACCGTCCATTCA 3′(SEQ ID NO：12)
和5′TTCCGACATTGGGCTTTA 3′(SEQ ID NO：13)
(4)5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′(SEQ ID NO：14)
和5′GTCGTGGTGACGGGGACCTA 3′(SEQ ID NO：15)
优选的，上述铁皮石斛试管苗的特异性探针序列为5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′和5′TCGGTCGTCCCGTCGTAT 3′。
本发明通过随机扩增多态性DNA(RAPD)方法，对铁皮石斛试管苗及石斛属中其它种类进行了研究，经大量实验及比对工作，分离并获得了铁皮石斛试管苗的特征DNA序列(SEQ ID NO：1)，针对该特征DNA序列，设计了4对特异性引物，并将所设计的特异性探针用于扩增检验铁皮石斛试管苗及铁皮石斛。
有益效果：
中药材来源的真伪鉴定一直是中药研究的重要课题之一，因为它直接关系到治病疗效和用药安全。以往的鉴定主要采用性状、显微、理化等方法，对中药材的鉴定起到十分重要的作用。然而，上述方法对分类系统中同属但外形非常接近的不同种的鉴定等还存在着一定困难。而使用本发明提供的铁皮石斛试管苗特征DNA序列及针对其设计的特异性探针进行鉴定，准确度高，特异性好，鉴别技术较易掌握，具有很大的实用价值。这一技术路线和方法的建立，为我国珍贵、稀有、濒危的地道药材的鉴定提供了一个可借鉴的鉴定平台。
而使用本发明对组织培养产生的试管苗进行鉴定，可以很好地鉴定出试管苗的真实种类来源。这为通过组织培养方式进行大规模生产珍贵、稀有、濒危的野生药用植物，并使这些药用植物资源的可持续开发和利用提供了科学的保证。
而本发明中对铁皮石斛组织培养一定代数后产生的试管苗的PCR扩增研究结果，从一个侧面说明，在一定代数范围内，尽管铁皮石斛试管苗与野生药材相比生长环境等发生了改变，可以说其药效和遗传特性等方面并没有发生本质的变化，组培铁皮石斛在一定代数范围可以替代野生铁皮石斛使用。这为扩大药源和保证用药安全提供了一定的科学证据。
附图说明
图1：引物H-20的扩增结果图
M：100bp DNALadder(北京天为时代科技有限公司)
Primer：引物H-20
A1-A3：为不同浓度的铁皮石斛试管苗材料；131、132：为不同浓度的兜唇石斛材料；1、3、15、16、20-22、24、25：分别为实施例表1中相同编号对应的材料
图2：铁皮石斛试管苗及铁皮石斛的高特异性探针扩增图
M：100bp DNA Ladder
Primer：引物AS1
样品分别为实施例表1中相同编号对应的材料
图3：铁皮石斛试管苗及铁皮石斛的高特异性探针扩增图
M：100bp DNA Ladder
Primer：引物AS1
样品分别为实施例表1中相同编号对应的材料
图4：不同代铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛AS1引物PCR扩增图
M：100bp DNA Ladder
Primer：引物AS1
1、2、4、6、8、10：分别代表铁皮石斛组培试管苗的代数
An：传代数超过10代以上的铁皮石斛试管苗样品
标号说明：
A：officinale铁皮石斛组培试管苗
B：采自云南的野生officinale铁皮石斛
C：采自浙江的野生officinale铁皮石斛
D：采自江西的野生officinale铁皮石斛
E：采自福建的野生officinale铁皮石斛
F：采自广东的野生officinale铁皮石斛
G：采自广西的野生officinale铁皮石斛
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1铁皮石斛试管苗特征DNA序列的获得
1材料与方法
1.1材料
实验材料的名称和来源具体见表1，其中野生铁皮石斛分别采自云南、广西等产区，铁皮石斛试管苗由上海市中药研究所提供。
表1、材料名称和来源
| 编号 | 材料名称 | 编号 | 材料名称 | 编号 | 材料名称 |
| 1 | D.devonianum齿瓣石斛I | 12 | D.sp好竹签 | 23 | D.trigonopus翅梗石斛 |
| 2 | D.devonianum齿瓣石斛II | 13 | D.aphyllum兜唇石斛 | 24 | D.fimbriatum马鞭石斛 |
| 3 | D.strongylanthum梳唇石斛 | 14 | D.chrysanthum束花石斛 | 25 | D.thyrsiflorum球花石斛 |
| 4 | D.crystallinum冒晶石斛I | 15 | D.crepidatum玫瑰石斛 | 26 | D officinale铁皮石斛A |
| 5 | D.crystallinum冒晶石斛II | 16 | D.hercoglossum重唇石斛 | 27 | D.officinale铁皮石斛B |
| 6 | D.aduncum钩状石斛 | 17 | D.monticola藏南石斛 | 28 | D.officinale铁皮石斛C |
| 7 | D.moniliforme细茎石斛I | 18 | D.linawianum短唇石斛 | 29 | D.officinale铁皮石斛.D |
| 8 | D.primulinum报春石斛 | 19 | D.bicolor二色金石斛 | 30 | D.officinale铁皮石斛E |
| 9 | D.henryi疏花石斛 | 20 | D.gratiosissimum杯鞘石斛 | 31 | D.officinale铁皮石斛F |
| 10 | D.moniliforme细茎石斛II | 21 | D.pendulum肿节石斛 | 32 | D.officinale铁皮石斛G |
| 11 | D.falconeri串珠石斛 | 22 | D.chrysotoxum鼓槌石斛 |
注：铁皮石斛A为组培试管苗；B、C、D、E、F、G分别采自云南、浙江、江西、福建、广东、广西，
1.2方法
1.2.1DNA抽提
选择表1样品(1-26)适宜叶片和茎0.1g左右，剪碎后液氮研磨，加入800μlCTAB-free[100mmol/L Tris/HCl(pH＝7.5)，5mmol/L EDTA，0.35mmol/L山梨醇，1％PVP]，12000r离心6分钟。弃上清，加入600μl左右65℃预热的2×CTAB抽提缓冲液[100mmol/LTris/HCl(pH＝8)，1.4mol/L NaCl，2％PVP，20mmol/LEDTA，2％CTAB(w/v)，0.34％巯基乙醇(v/v)]，65℃保温60分钟，不时摇晃。取出后冷却到室温，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，抽提10分钟，7000r离心10分钟。将上清液吸入另一1.5ml离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，抽提10分钟，10000r离心10分钟。将上清液吸入另一1.5ml离心管，加入1/10体积的NaAc，2/3体积的异丙醇(-20℃预冷)，混匀之后放入-20℃冰箱保存30分钟左右，然后12000r离心10分钟。弃上清，每0.1g材料加入200μl 76％乙醇-0.2M NaAc(PH5.2)，冰上20min。弃上清，用70％乙醇洗涤2次，37℃烘箱烘干乙醇，加入50μl TE溶解。4℃保存备用。
1.2.2引物的筛选
用表1样品(1-26)DNA对上海生物工程有限公司(Sangon)的S序列和上海申能博采生物技术有限公司的H、A等序列的引物如S185’CCACAGCAGT 3’(SEQ ID NO：2)、S225’TGCCGAGCTG 3’(SEQ ID NO：3)、S1155’AATGGCGCAG 3’(SEQ ID NO：4)、H-20 5’GGGAGACATC 3’(SEQ ID NO：5)、A-025’TGCCGAGCTG 3’(SEQ ID NO：6)、A-06 5’GGTCCCTGAC 3’(SEQ ID NO：7)等进行筛选。
1.2.3PCR扩增和电泳检测
PCR反应总体积为25μl。其中含有3μl 100ng左右的DNA模板，0.4μmol/L引物(引物如1.2.2中所述)，2.5μl 10×buffer，3.0mmol/L MgCl2，1单位Taq酶，0.2mmol/L dNTP。PCR扩增仪型号为PTC-200(MJ Research，Inc.公司产)。
反应参数为：94℃预变性3min，36℃复性1min，72℃延伸2min，94℃变性1min，36℃复性1min，72℃延伸2min，循环40次，最后72℃延伸10min。扩增完毕，以1.5％琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg·ml-1)进行电泳，凝胶成像系统照相记录。
1.2.4铁皮石斛试管苗特异性条带的筛选
根据不同引物PCR扩增所得的电泳图谱，从中挑选出铁皮石斛试管苗具有特征性条带的引物，重复RAPD反应，筛选出特征性强且能稳定扩增的引物H-20(5’GGGAGACATC 3’)(SEQ ID NO：5)，分离并纯化所需的特征性片段，然后进行克隆和测序。
1.2.5铁皮石斛试管苗特异性条带的克隆和测序
以北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的B Type：Mini-DNA RapidPurification Kit进行凝胶回收纯化。PCR产物约1.3kb，纯化产物以pGEM-T easy vector连接，再转化大肠杆菌DH5α，在含有IPTG、X-gal和AMP的培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养后，抽质粒，用酶切法(EcoR I)鉴定阳性菌，取阳性菌落测序。
2结果与分析
2.1DNA多态性图谱分析
对120多个随机引物进行筛选，选择扩增效果、重复性均较好的引物进行拍照。从扩增结果看，不同的种之间存在着明显的多态性，初步证明运用RAPD方法可以区分不同种的石斛类植物。
2.2铁皮石斛试管苗特异性条带筛选
经过筛选，发现引物H-20在1300bp左右处出现的条带可以作为铁皮石斛试管苗特异性标记。反复试验，该条带能被稳定扩增。其扩增结果如图1所示。
2.3引物H-20扩增出的特异性条带测序结果显示，片段长度约为1324bp，序列为SEQ IDNO：1：
AATTCACTAGTGATTGGGAGACATCCTCAATCACAACAGGAAGATGAACTTGCCGATACAGCGAGT
TCAACACATCCTCGCATTTTTTCCGAACCCCCAGAAGGCTCTCCCCAACCACACATTGCGGGACTCC
CTCACAATGTCCTACGTTGCGAACTGCGAAAATTGGTACGGGAAGAGTTCCCCCGAGGAGATGTGA
GGCATGCTCTCCGACAGAAGAACTTCGAGAAGTCATCACCTCTAACTGAAGCTATTCTTCAGCACC
CCATTCCGGCCAGATTCAAAGTGCCAAATGTTGAGTCATACGACGGGACGACCGACCCATATGAGC
ATATCGACTACTACAGAACCATCATGCATATTCAACGAGCATCAGACGCGCTCCTCTGCCAGGTCTTT
CCCGCCACCCTTAAAGGACAGGCCCGAACATGGTTCTACTCGCTTCCACCTGGAACGATCCCCTCTT
TTGTCAAATTGGCCAAAGTATTCGTCGAACAATTTGTGGCCAATAGAAGAATTGCAAAGGATTCTTC
CCACCTCTCCGGGATTCGCCAAAATGAGGGAGAATCGTTGAAGGAGTATTTTCAACGATTTTCCACT
GAAGCACGACAGATTCCAGGAGTAGACCCTGAATTACTCAGAGGGGTCTTTCTTGGAGGTCTTCGT
CCTAGCCCCTTCTATTCGTCCCTTATGCGAGACACCGTCCATTCATACGCTGACTTGATCCATCGCGT
GGAGGCACAAATCTCTGCGGATGAAGCTATAAATGCTCACAGGAAACAGTTTGAGCAATTCAGCGG
GAAGCGCAAAGGTGCAGCTGGGATGGATAATTCTTTCTCACAGCAGAAAAAATATGGGAAGAATAA
CTTACCTCATAGGTCCCCGTCACCACGACGAGAGCCTCGCCAAAAAAAGGAGTACACACCACTTAA
TACATCCCAAGCAAATGTATTAATGGCCATCCGGGATCAGGAGGATGTGAAATGGCTACACCCTTTA
AAGCCCAATGTCGGAAACCAGGAGCAATATTGTCACTTCCACCGTAGCCGTGGACACACTACTGAA
GCATGTTGGCAGCTCAAGGAAGAAGTTGAGAGACTGATCCGACAGGGATATCTCCGACAATTCATC
AAGAATACACCAACCCGAGATGAAGTTGGTCCGACTGGGGGGCAGAATCAACAACAAAGACGACC
ATTGAATACTGTTCAAATGGTTGGAGAGATTGAATGATCACGCACTTTGTGTATTTG TATTAGCAAAT
ATTACTTGTCTTGTTGTCGCTTTTATGTTGAGTTGAGTGTTACTGTGATGTCTCCCAATC
实施例2铁皮石斛试管苗特异性探针的获得及鉴定
1方法
1.1铁皮石斛试管苗特异性探针的设计
针对实施例1获得的铁皮石斛试管苗特征DNA序列，用Primer Premier 5.0(PREMIERBiosoft International开发)软件设计进行引物序列设计，设计了四对引物，进行合成：
(1)AS1组：S1 5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′(SEQ ID NO：8)
A1 5′TCGGTCGTCCCGTCGTAT 3′(SEQ ID NO：9)
(2)AS2组：S2 5′AAGTGCCAAATGTTGAGTC 3′(SEQ ID NO：10)
A2 5′CCTGGAATCTGTCGTGCT 3′(SEQ ID NO：11)
(3)AS3组：S3 5′CGAGACACCGTCCATTCA 3′(SEQ ID NO：12)
A3 5′TTCCGACATTGGGCTTTA 3′(SEQ ID NO：13)
(4)AS4组：S4 5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′(SEQ ID NO：14)
A45′GTCGTGGTGACGGGGACCTA 3′(SEQ ID NO：15)
经过一系列的筛选，发现AS1组引物最佳，一条引物的Tm57.9℃，另一条引物Tm59.0℃。
1.2铁皮石斛试管苗特异性探针的验证
取表1中样品为模板，加入合成的特异性探针进行扩增，反应体系和反应参数主要参照实施例1的1.2.3，复性温度为52℃。
2结果与分析
用特异性探针对组培铁皮石斛和广西、江西、广东、福建、浙江、云南野生铁皮石斛及石斛类样品进行扩增如图2-3所示。从图2-3中可以看出，铁皮石斛试管苗和野生铁皮石斛目的条带全部扩出，其余石斛无任何扩增产物，说明此特异性探针设计成功，可用于鉴定铁皮石斛。
实施例3不同代数铁皮石斛试管苗的遗传分析
通过建立特殊的铁皮石斛试管苗培养系，纵向比较同系中不同代数株植株的遗传状况。
取不同代1、2、4、6、8、10、An(传代数超过10代以上的铁皮石斛试管苗样品)的铁皮石斛组培试管苗与野生铁皮石斛，进行DNA抽提，用特异性探针进行PCR扩增，结果如图4所示。用铁皮石斛试管苗特异性探针扩增结果表明，各代数没有发生变化，全部扩出相同的条带。
序列表
<110>上海雷允上科技发展有限公司上海市中药研究所
<120>铁皮石斛试管苗的特征DNA序列及其应用
<130>PCNZY061209
<160>15
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1324
<212>DNA
<213>Dendrobium officinale Kimura et Migo
<400>1
aattcactag tgattgggag acatcctcaa tcacaacagg aagatgaact tgccgataca 60
gcgagttcaa cacatcctcg cattttttcc gaacccccag aaggctctcc ccaaccacac 120
attgcgggac tccctcacaa tgtcctacgt tgcgaactgc gaaaattggt acgggaagag 180
ttcccccgag gagatgtgag gcatgctctc cgacagaaga acttcgagaa gtcatcacct 240
ctaactgaag ctattcttca gcaccccatt ccggccagat tcaaagtgcc aaatgttgag 300
tcatacgacg ggacgaccga cccatatgag catatcgact actacagaac catcatgcat 360
attcaacgag catcagacgc gctcctctgc caggtctttc ccgccaccct taaaggacag 420
gcccgaacat ggttctactc gcttccacct ggaacgatcc cctcttttgt caaattggcc 480
aaagtattcg tcgaacaatt tgtggccaat agaagaattg caaaggattc ttcccacctc 540
tccgggattc gccaaaatga gggagaatcg ttgaaggagt attttcaacg attttccact 600
gaagcacgac agattccagg agtagaccct gaattactca gaggggtctt tcttggaggt 660
cttcgtccta gccccttcta ttcgtccctt atgcgagaca ccgtccattc atacgctgac 720
ttgatccatc gcgtggaggc acaaatctct gcggatgaag ctataaatgc tcacaggaaa 780
cagtttgagc aattcagcgg gaagcgcaaa ggtgcagctg ggatggataa ttctttctca 840
cagcagaaaa aatatgggaa gaataactta cctcataggt ccccgtcacc acgacgagag 900
cctcgccaaa aaaaggagta cacaccactt aatacatccc aagcaaatgt attaatggcc 960
atccgggatc aggaggatgt gaaatggcta caccctttaa agcccaatgt cggaaaccag 1020
gagcaatatt gtcacttcca ccgtagccgt ggacacacta ctgaagcatg ttggcagctc 1080
aaggaagaag ttgagagact gatccgacag ggatatctcc gacaattcat caagaataca 1140
ccaacccgag atgaagttgg tccgactggg gggcagaatc aacaacaaag acgaccattg 1200
aatactgttc aaatggttgg agagattgaa tgatcacgca ctttgtgtat ttgtattagc 1260
aaatattact tgtcttgttg tcgcttttat gttgagttga gtgttactgt gatgtctccc 1320
aatc 1324
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>2
ccacagcagt 10
<210>3
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>3
tgccgagctg 10
<210>4
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>4
aatggcgcag 10
<210>5
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>5
gggagacatc 10
<210>6
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>6
tgccgagctg 10
<210>7
<211>10
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>7
ggtccctgac 10
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>8
aggaagatga acttgccgat ac 22
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>9
tcggtcgtcc cgtcgtat 18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>10
aagtgccaaa tgttgagtc 19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>11
cctggaatct gtcgtgct 18
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>12
cgagacaccg tccattca 18
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>13
ttccgacatt gggcttta 18
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>14
aggaagatga acttgccgat ac 22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>15
gtcgtggtga cggggaccta 20
Claims (6)
1. 一种铁皮石斛试管苗的特征DNA序列，其特征在于，它是SEQ ID NO：1的DNA序列或其互补序列。
2. 如权利要求1所述的铁皮石斛试管苗特征DNA序列在铁皮石斛试管苗鉴定中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，利用针对所述铁皮石斛试管苗特征DNA序列的特异性探针鉴定铁皮石斛试管苗或铁皮石斛。
4. 一种检测样品中是否含有权利要求1所述铁皮石斛试管苗特征DNA序列的方法，包括下列步骤：
(1)使用针对铁皮石斛试管苗特征DNA序列的特异性探针对样品的基因进行扩增；
(2)检测是否获得相应的扩增产物。
5. 如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述铁皮石斛试管苗的特异性探针序列选自下组中的一组或多组：
(1)5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′和5′TCGGTCGTCCCGTCGTAT 3′；
(2)5′AAGTGCCAAATGTTGAGTC 3′和5′CCTGGAATCTGTCGTGCT 3′；
(3)5′CGAGACACCGTCCATTCA 3′和5′TTCCGACATTGGGCTTTA 3′；
(4)5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′和5′GTCGTGGTGACGGGGACCTA 3′。
6. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述铁皮石斛试管苗的特异性探针序列为5′AGGAAGATGAACTTGCCGATAC 3′和5′TCGGTCGTCCCGTCGTAT 3′。
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