CN109055565B - 一种蒙古裸腹溞的dna条形码及其应用 - Google Patents

一种蒙古裸腹溞的dna条形码及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蒙古裸腹溞DNA条形码、引物对及种质鉴定方法。该方法通过提取蒙古裸腹溞DNA，然后利用DNA条形码引物进行聚合酶链式反应扩增出Moi‑16s基因，所述基因序列Moi‑16s共407个碱基(不含引物序列)，最后对PCR产物进行测序和序列比对，如果待测样本序列与所述基因序列Moi‑16s的同源性在99％以上，即可判断所述待测样本为蒙古裸腹溞。该方法准确性高、可靠性强、操作简单，确保了蒙古裸腹溞引种的安全性。

Description

一种蒙古裸腹溞的DNA条形码及其应用
技术领域
本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种蒙古裸腹溞的DNA条形码及其应用。
背景技术
蒙古裸腹溞(Moina mongolica)隶属于双甲目(Diplostraca)、枝角亚目(Cladocera)、裸腹溞科(Moinidae)、裸腹溞属(Moina)，原产于内陆盐水水域，因其优良生长繁殖和人工培育特点，现已成为重要的水产经济动物饵料；因其对污染物敏感性较好，现已广泛应用于生态毒性测试，成为国家标准GB/T 18420.2-2009“海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法”的推荐测试生物。
由于蒙古裸腹溞所属的裸腹溞属(Moina)种类众多，个体较小，属内个体间相似度非常高，且受自然环境水体复杂性的影响，体色等常会发生改变，在利用形态学进行种类鉴别时，易发生误判，亟需寻找一种新的快速方法，以弥补传统形态鉴别方法对物种分类专业熟识度高度依赖的不足。由于16s rDNA基因序列中既包含进化饱受区域，同时也进化速率不同的区段，较适合用于物种鉴别。近年来的大量研究证实，以16s rDNA作为DNA条形码能快速有效的对物种进行鉴别，建立基于16s rDNA的蒙古裸腹溞DNA条形码检测技术，将会极大促进蒙古裸腹溞作为优良生物饵料和毒性测试生物的推广应用。
现有技术中，均没有蒙古裸腹溞DNA条形码检测方法及蒙古裸腹溞16s基因DNA条形码序列的记载和报道。
发明内容
为了解决现有基于形态学鉴定蒙古裸腹溞存在的难度大、流程繁琐、对物种分类专业背景严重依赖以及常存在误判等问题，本发明提供了蒙古裸腹溞的DNA条形码，以及一种蒙古裸腹溞种质的快速检测方法，以实现蒙古裸腹溞的快速、准确鉴别。
本发明的目的之一在于提供一种蒙古裸腹溞DNA条形码。
本发明的另一目的在于提供上述DNA条形码在蒙古裸腹溞鉴定中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种蒙古裸腹溞的鉴定方法和试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种蒙古裸腹溞DNA条形码，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述所述蒙古裸腹溞DNA条形码在蒙古裸腹溞鉴定中的应用。
一种蒙古裸腹溞的鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本DNA；
2)利用能够扩增出SEQ ID NO:1所示序列的引物对待测样本DNA进行PCR扩增；
3)将PCR扩增产物的序列与SEQ ID NO:1所示序列进行对比，二者同源性在99％以上，则待测样本为蒙古裸腹溞。
进一步的，步骤2)中，所述引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
进一步的，步骤2)中PCR扩增体系为：每25μL体系中含有10×PCR Buffer 2.5μL，Mg2+ 2.0mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，上下游引物各0.5μmol/L，模板200ng，余量为ddH2O。
进一步的，步骤2)中PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃预变性40s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
一种鉴定蒙古裸腹溞的试剂盒，该试剂盒含有检测SEQ ID NO:1所示序列的引物或/和探针。
进一步的，所述引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
进一步的，所述试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶、dNTP。
本发明的有益效果是：
(1)本发明是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用溞体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。
(2)本发明能够对蒙古裸腹溞近缘种进行区分，能够在更高分辨率的水平上稳定、准确的对蒙古裸腹溞近缘种实施鉴定。
(3)本发明方法可对于裸腹溞属物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用蒙古裸腹溞资源等方面都具有重要意义。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1蒙古裸腹溞的DNA条形码
本发明通过研究，确定了蒙古裸腹溞DNA条形码标准检测基因序列，其为线粒体16s rDNA(Moi-16s)，具体序列为：
5’-AAAGTAAATAGCCGCAGTATTTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCATTAGTCTTTTAATTGAAGGCTGGTATGAAGGGCAAGACGAGAAAGAAGCTGTCTCTACTTAAATTTTTTGAATTTCATTTTTTAGTGCAAAAGCTAAAATATTTTTAAAGGACGATCAGACCCTATGGAGTTTAAAATTTTAGTAATTACGAATTAACTTTATATAATTGTAACTAATAAAATTTTTTGTTGGGGCGACAGAAAGATAAAAATAACACTTTCTTAAACAAACTAAGATAAAAGAATAATTGATCCCTTAAGAAGGATTACAAGACTAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGTAATCTTTTTGGAGAGTTCATATCGATAAAAAGGTTTGCGACCTCGATGTTGGATTAAGAA-3’(SEQ ID NO:1)。
实施例2一种蒙古裸腹溞的鉴定方法
利用本发明的方法，对蒙古裸腹溞大亚湾群体进行鉴别。
(1)蒙古裸腹溞采集于广东省深圳市大亚湾地区，取单只提取DNA。
样品前处理：采集的样本用0.9％生理盐水冲洗。
采用天根生物公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，无菌水溶解DNA。紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，母液置于-20℃保存。
(2)合成线粒体16s rDNA(16s)引物；本实施例所用引物如下：
Moi-F：5’-TACTGCCTGCTCAATGCTTA-3’(SEQ ID NO:2)；
Moi-R：5’-GAACTGCTACACCCCATCAAG-3’(SEQ ID NO:3)。
(3)PCR扩增，本实施例的PCR反应体系如下：
PCR扩增反应体系为25μL，含ddH2O 9.5μL，Premix Taq 12.5μL，正向引物/反相引物(2.5μmol)各1μL，DNA模板(200ng/μL)1μL。Premix Taq包含了Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、Buffer、色素Marker、比重增加剂、稳定剂。
扩增程序为：94℃预变性4min，94℃预变性40s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
(4)PCR扩增产物检测：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，EB替代物染色，于凝胶成像系统下观察PCR扩增情况，条带清晰无其他杂带，可直接送生物公司进行测序。
(5)测序结果拼接和比对：将测序结果导入软件Vector NTI 11.0进行序列拼接，然后分别与Moi-16s(SEQ ID NO:1)进行比对。从比对结果中可以看出，蒙古裸腹溞大亚湾群体样本与Moi-16s同源率为100％，可准确判断大亚湾群体样品为蒙古裸腹溞。本发明方法稳定可靠地对蒙古裸腹溞进行种类鉴定。
实施例3一种蒙古裸腹溞的鉴定方法
利用本发明的方法，对蒙古裸腹溞上海海洋大学引进群体进行鉴别。
(1)蒙古裸腹溞采引种于上海海洋大学，取单只提取DNA。
样品前处理：采集的样本用0.9％生理盐水冲洗。
采用天根生物公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，无菌水溶解DNA。紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，母液置于-20℃保存。
(2)合成线粒体16s rDNA(16s)引物；本实施例所用引物如下：
Moi-F：5’-TACTGCCTGCTCAATGCTTA-3’(SEQ ID NO:2)；
Moi-R：5’-GAACTGCTACACCCCATCAAG-3’(SEQ ID NO:3)。
(3)PCR扩增，本实施例的PCR反应体系如下：
PCR扩增反应体系为25μL，含ddH2O 9.5μL,Premix Taq 12.5μL，正向引物/反相引物(2.5μmol)各1μL，DNA模板(200ng/μL)1μL。Premix Taq包含了Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、Buffer、色素Marker、比重增加剂、稳定剂。
扩增程序为：94℃预变性4min，94℃预变性40s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
(4)PCR扩增产物检测：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，EB替代物染色，于凝胶成像系统下观察PCR扩增情况，条带清晰无其他杂带，可直接送生物公司进行测序。
(5)测序结果拼接和比对：将测序结果导入软件Vector NTI 11.0进行序列拼接，然后分别与Moi-16s(SEQ ID NO:1)进行比对。从比对结果中可以看出，上海海洋大学群体16s基因与Moi-16s同源率为100％，可准确判断上海海洋大学引进群体为蒙古裸腹溞。本发明方法稳定可靠地对蒙古裸腹溞进行种类鉴定。
综上所述，首先，本发明是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用溞体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。其次，本发明能够对蒙古裸腹溞近缘种进行区分，能够在更高分辨率的水平上稳定、准确的对蒙古裸腹溞近缘种实施鉴定。最后，本发明方法可对于裸腹溞属物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用蒙古裸腹溞资源等方面都具有重要意义。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 一种蒙古裸腹溞的DNA条形码及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 407
<212> DNA
<213> 蒙古裸腹溞
<400> 1
aaagtaaata gccgcagtat tttgactgtg ctaaggtagc ataatcatta gtcttttaat 60
tgaaggctgg tatgaagggc aagacgagaa agaagctgtc tctacttaaa ttttttgaat 120
ttcatttttt agtgcaaaag ctaaaatatt tttaaaggac gatcagaccc tatggagttt 180
aaaattttag taattacgaa ttaactttat ataattgtaa ctaataaaat tttttgttgg 240
ggcgacagaa agataaaaat aacactttct taaacaaact aagataaaag aataattgat 300
cccttaagaa ggattacaag actaagttac cctagggata acagcgtaat ctttttggag 360
agttcatatc gataaaaagg tttgcgacct cgatgttgga ttaagaa 407
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tactgcctgc tcaatgctta 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaactgctac accccatcaa g 21

Claims (6)

1.一种蒙古裸腹溞的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测样本DNA；
2）利用能够扩增出蒙古裸腹溞DNA条形码的核酸序列的引物对待测样本DNA进行PCR扩增；
3）将PCR扩增产物的序列与蒙古裸腹溞DNA条形码的核酸序列进行对比，二者同源性在99%以上，则待测样本为蒙古裸腹溞；
所述蒙古裸腹溞DNA条形码的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述引物如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR扩增体系为：每25μL体系中含有10×PCR Buffer 2.5μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，上下游引物各0.5μmol/L，模板200ng，余量为ddH2O。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃预变性40s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
5.一种鉴定蒙古裸腹溞的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有检测蒙古裸腹溞DNA条形码的核酸序列的引物或/和探针；
所述引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
所述蒙古裸腹溞DNA条形码的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶、dNTP。
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