CN112126717A

CN112126717A - 一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光pcr引物、探针、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN112126717A
Application number: CN202011062645.XA
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 娄亚坤; 吕殿红; 翟颀; 温肖会; 杨楠; 杨丹芳
Original assignee: Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co ltd; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co ltd; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: AU2021102363A4; CN112126717B

Abstract

本发明公开了一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒，包括两对特异性引物CaPV‑130‑F2、CaPV‑130‑R2和LSD‑132‑F5、LSD‑132‑R6，以及TaqMan‑MGB探针CaPV‑130‑P2和LSD‑132‑LP5探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为MGB。本发明提供的试剂盒，可以用于绵羊、山羊、牛的痂皮、丘疹、水泡、血液等样品中的山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒的检测，可为山羊痘病毒属病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

Description

一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种鉴别羊痘病毒(山羊痘病毒属)和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒。

背景技术

山羊痘病毒属(Capripoxvirus)属于痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科，该属包括山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛结节性皮肤病病毒(LSDV)，该属病毒为DNA病毒，基因组全长约150kb，编码147个开放阅读框。

山羊痘病毒引发的疾病症状主要是皮肤丘疹-脓疱型痘疹。山羊痘可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率达100％。主要通过接触破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播从而感染其它山羊，同群间传播迅速。山羊痘病毒对干燥有较高的抵抗力，干燥痂皮内的病毒可以存活3～6个月，在温度达100℃时，仍可存活5min左右。山羊痘病毒在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，并产生痘斑和结节性病灶。绵羊痘，又名绵羊天花，是由绵羊痘病毒引起的一种接触性传染病，其它的特征是在全身皮和粘膜上发生特异的痘疹。不同品种、性别、年龄的的绵羊均易感，病羊发热并有较高的死亡率。广泛流行于大多绵羊生产国。

牛结节性皮肤病是由牛结节性皮肤病病毒引起的以患牛发热，皮肤黏膜、器官表面广泛性结节为特征的急性、亚急性或慢性传染病。病牛体表淋巴结肿大，泌乳牛可发生乳房炎，公牛睾丸炎等，严重时导致动物死亡。该病是《中华人民共和国进境动物疫病检疫目录》规定的一类动物疫病。

自2019年8月12日，我国新疆伊犁地区首次确诊牛结节性皮肤病以来，福建、江西、浙江、安徽、广东、广西等省市也陆续报道该病。这给我国的奶牛和肉牛养殖造成了严重的经济损失。

山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒间存在一定的交叉保护性，有研究显示山羊痘疫苗可以预防牛结节性皮肤病，但是暂时无疫苗可预防牛结节性皮肤病暂。2020年7月，农业农村部组织制定并印发了《牛结节性皮肤病防治技术规范》，预防牛结节性皮肤病主要通过接种山羊痘疫苗。山羊痘病毒属成员间基因组序列差异较小，增加了鉴别诊断的难度。目前，还没有批准上市的用于鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒诊断的诊断试剂，OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册中也仅给出针对山羊痘病毒属的鉴别方法，不能区分羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒。因此，尚无有效区分山羊痘疫苗毒株和牛结节性皮肤病病毒野毒株的方法，无法及时确诊，也是造成疫病扩散的一个重要原因。

研发一种羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的鉴别诊断方法，且可区分山羊痘疫苗毒株和牛结节性皮肤病病毒野毒株的方法，成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针。

本发明的目的在于提供一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR检测方法。

本发明的目的在于提供一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR试剂盒。

本发明通过分子生物学、生物信息学等方法进行序列比对、引物和探针设计及反应体系优化，组建用于检测羊痘、牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR试剂盒。同时针对山羊痘疫苗毒株均为CVCC AV41毒株ORF132基因，与牛结节性皮肤病病毒ORF132基因比较，发现存在18个碱基的缺失，发明人针对缺失的位点，增加了特异性更强的Taqman-MGB探针的设计，从而实现牛结节性皮肤病病毒野毒株和山羊痘疫苗株的鉴别诊断，提高了检测准确性和精确度。可为山羊痘病毒属病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

本发明一方面提供了一种用于检测山羊痘病毒属的荧光PCR扩增引物组，所述引物组的核苷酸序列为：

CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；

CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。

本发明又一方面提供了一种用于检测山羊痘病毒属的探针CaPV-130-P2，所述探针的核苷酸序列为：

5’-TCATCAAAAGGAAACGGATC-3’。

根据本发明的实施例，所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

本发明又一方面提供了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光PCR扩增引物组，所述引物组的核苷酸序列为：

CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；

CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。

本发明又一方面提供了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSD-132-LP5，所述探针的核苷酸序列为：

5’-AGTTCAGTTTTAACATCA-3’。

根据本发明的实施例，所述探针的5’端标记的荧光基团为VIC，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

本发明又一方面提供了一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的引物组、前面所述的探针。

根据本发明的实施例，还包括FastFire qPCR PreMix、阳性对照和阴性对照。

本发明又一方面提供了一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用前面所述的引物组、前面所述探针进行双重荧光PCR扩增，获得扩增曲线；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有羊痘病毒和/或牛结节性皮肤病病毒；

该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增体系为：

CaPV-130-P2	0.31μL
		CaPV-130-F2	0.375μL
CaPV-130-R2	0.375μL
		LSD-132-LP5	0.50μL
LSD-132-F5	0.625μL
		LSD-132-R6	0.625μL
FastFire qPCR PreMix	12.5μL
		DNA模板	5μL
ddH<sub>2</sub>O	补足25μL。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增程序为：50℃，3min；95-96℃预变性5-6min；95-96℃变性15-20s，58-59℃退火延伸30-34s，循环40-45次。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增程序为：50℃，3min；95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火延伸30s，循环40次。

根据本发明的实施例，步骤(3)中所述的结果判定方法：

1)若待检样品仅FAM通道出现扩增曲线且Ct值≤38，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40判定为可疑，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性；所述山羊痘病毒属病毒为绵羊痘病毒、山羊痘病毒或牛结节性皮肤病病毒；

2)待检样品VIC通道出现典型扩增曲线且Ct值≤38，判定为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40判定为可疑，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性。

本发明又一方面提供了前面所述的引物、前面所述的探针在制备检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒中的应用。

比对大量绵羊痘病毒、山羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒基因序列，在山羊痘病毒属成员间开放型阅读框ORF130基因序列的保守性较高，使用该基因片段设计针对山羊痘病毒属的引物探针序列，用于山羊痘病毒属的检测。批准上市的山羊痘疫苗毒株均为CVCCAV41毒株，使用基因分析软件比较大量牛结节性皮肤病病毒序列与疫苗株的差异。发现在ORF132基因片段上，相对牛结节性皮肤病病毒基因序列，山羊痘疫苗株缺失18个碱基，最终选取该基因片段作为牛结节性皮肤病病毒引物探针的靶基因序列，设计并筛选出仅针对牛结节性皮肤病病毒的引物探针，如图1。

本发明的有益效果是：

本发明的用于检测羊痘、牛结节性皮肤病病毒双重荧光PCR引物、探针和试剂盒，不仅仅用于山羊痘病毒、绵羊痘病毒的检测，还可以应用于牛结节性病病毒的检测。本发明所制备的羊痘、牛结节性皮肤病病毒双重荧光PCR检测试剂盒，具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，可为山羊痘病毒属病毒的诊断提供了一种快速检测方法，为山羊痘病毒属病毒、牛结节性皮肤病病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

附图说明

图1是牛结节性皮肤病毒特异性探针分析。

图2是试剂盒灵敏度试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

本组引物探针是针对山羊痘病毒属所有成员设计的，比对GenBank上收录大量绵羊痘病毒、山羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒基因序列，发现该病毒属序列中开放型阅读框ORF130基因序列保守性较高，通过序列比对确定ORF130基因序列中的保守区域，针对该区域设计引物探针，用于检测山羊痘病毒属中的病毒。经过大量设计并筛选出CaPV-130-F2和CaPV-130-R2为上下游引物，CaPV-130-P2为探针，所述引物组和探针的核苷酸序列为：

CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’(SEQ ID NO:1)；

CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’(SEQ ID NO:2)；

CaPV-130-P2:5’-TCATCAAAAGGAAACGGATC-3’(SEQ ID NO:3)。

CaPV-130-P2的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

本组引物探针是针对牛结节性皮肤病病毒设计的，使用基因分析软件比较山羊痘疫苗毒株CVCC AV41和牛结节性皮肤病病毒序列之间的差异。发现在ORF132基因片段上，相对牛结节性皮肤病病毒基因序列，山羊痘疫苗株缺失18个碱基，缺失碱基的位置为第210个核苷酸～第227个核苷酸。根据比对结果，选取疫苗株碱基缺失的位置为LSD鉴别诊断的靶基因区域，设计了针对牛结节性皮肤病病毒的探针序列。设计并筛选出LSD-132-F5和LSD-132-R6为上下游引物，LSD-132-LP5为探针，所述引物组和探针的核苷酸序列为：

LSD-132-F5:5’-TTATCAGATGATTGYGTA-3’(SEQ ID NO:4)；

LSD-132-R6:5’-TATAAGAATTGTCGAGAGA-3’(SEQ ID NO:5)；

LSD-132-LP5:5’-AGTTCAGTTTTAACATCA-3’(SEQ ID NO:6)。

LSD-132-LP5的5’端标记的荧光基团为VIC，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

实施例2

(1)人工合成羊痘病毒属病毒靶基因序列(Genbank登录号：KX576657)和牛结节性皮肤病病毒靶基因序列(Genbank登录号：MN072619)，两端基因均连接至载体上，将重组的载体DNA作为阳性质粒，进行PCR扩增。

(2)以制备的阳性质粒，用实施例1引物组CaPV-130-F2、CaPV-130-R2和LSD-132-F5、LSD-132-R6，探针CaPV-130-P2和LSD-132-LP5在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光PCR扩增，扩增体系为：

扩增程序为：50℃，3min；95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火延伸30s，共计40个循环，采集荧光信号，选择山羊痘病毒属选择FAM通道和牛结节性皮肤病选择VIC通道，获得扩增曲线。

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，确定样本中是否有山羊痘病毒属病毒，确定样本中的病毒是否是牛结节性皮肤病病毒。

结果判定方法为：

①试验有效性判定

阳性对照在FAM和VIC通道均有典型扩增曲线且Ct值≤30，且阴性对照在FAM和VIC通道均无Ct值、无扩增曲线，则判试验结果有效；否则，此次试验视为无效。

②样品判定

1)待检样品仅FAM通道出现典型扩增曲线且Ct值≤38，判定为山羊痘病毒属病毒(绵羊痘病毒或山羊痘病毒或牛结节性皮肤病病毒)核酸阳性；若38＜Ct值≤40判定为可疑，建议重复检测，检测结果仍然为Ct值≤40则判为阳性。无扩增曲线且无Ct值，判为阴性；

2)待检样品VIC通道出现典型扩增曲线且Ct值≤38，判定为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40判定为可疑，建议重复检测，检测结果仍然为Ct值≤40则判为阳性。无扩增曲线且无Ct值，判为阴性。

下面对本发明的方法进一步检测灵敏性和特异性。

灵敏性试验

用紫外吸收法测重组质粒的浓度，先调整重组质粒的浓度至10⁴copies/μl，用ddH₂O对阳性质粒进行10倍倍比稀释，稀释范围为10^-1～10^-4，分别作为模板进行PCR检测。按试剂盒的反应体系配制试剂和设置反应程序。

结果显示，本试剂盒的最低检出限为10copies/μl，表明本试剂盒有较高的灵敏度，如图2。

特异性试验

提取羊链球菌DNA基因组、羊丝状支原体DNA基因组、牛多杀性巴氏杆菌DNA基因组、传染性牛鼻气管炎病毒DNA基因组、牛羊健康组织DNA基因组

(血液、皮肤组织)作为特异性质控品，分别为模板进行荧光PCR检测，按试剂盒体系配制试剂和设置反应程序。

结果显示，检测结果均为阴性，本试剂盒特异性良好。

综上所述，本发明的试剂盒灵敏性较高以及具有良好的特异性，因此本发明的试剂盒可以用于山羊痘病毒属病毒和牛结节性皮肤病病毒感染的检测和预防。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所、郑州中道生物技术有限公司

<120> 一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方

法及试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

tggaagcaag tgrtaacgk 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ctattctatc ccatcattat acgta 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

tcatcaaaag gaaacggatc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ttatcagatg attgygta 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

tataagaatt gtcgagaga 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

agttcagttt taacatca 18

Claims

1.一种用于检测山羊痘病毒属的荧光PCR扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：

CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；

CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。

2.一种用于检测山羊痘病毒属的探针CaPV-130-P2，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：5’-TCATCAAAAGGAAACGGATC-3’；

其中，所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

3.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光PCR扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：

CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；

CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。

4.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSD-132-LP5，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

5’-AGTTCAGTTTTAACATCA-3’；

其中，所述探针的5’端标记的荧光基团为VIC，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。

5.一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1和3所述的引物组、权利要求2和4所述的探针。

6.一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1、3所述的引物组、权利要求2、4所述探针进行双重荧光PCR扩增，获得扩增曲线；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有山羊痘病毒和/或牛结节性皮肤病病毒；

该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增体系为：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增程序为：50℃，3min；95-96℃预变性5-6min；95-96℃变性15-20s，58-59℃退火延伸30-34s，循环40-45次。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的结果判定步骤如下：

1)若待检样品仅FAM通道出现扩增曲线且Ct值≤38，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性；所述山羊痘病毒属病毒为绵羊痘病毒、山羊痘病毒或牛结节性皮肤病病毒；

2)待检样品VIC通道出现典型扩增曲线且Ct值≤38，判定为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性。

10.权利要求1或3所述的引物、权利要求2或4所述的探针在制备检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒中的应用。