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Hintergrund der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der rekombinanten
Influenza-Impfstoffe.
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Epidemische
Influenza tritt jährlich
auf und ist eine Ursache für
signifikante Erkrankung und Sterblichkeit weltweit. Kinder weisen
die höchste
Anfälligkeitsrate
auf und sind wesentlich für Übertragung
von Influenzaviren in der Gemeinschaft verantwortlich. Für Ältere und
Personen mit bestehenden gesundheitlichen Problemen besteht ein
erhöhtes
Risiko für
Komplikationen und stationäre
Behandlung auf Grund einer Influenzainfektion. Allein in den USA
gab es während
jeder von sieben Influenza-Saisons zwischen 1956 und 1988 mehr als
10.000 Todesfälle
auf Grund von Pneumonie und Influenza, und mehr als 40.000 Todesfälle wurden
für jeweils
zwei Saisons verzeichnet (aktuelle Daten: Influenza Activity – United
States and Worldwide, und Composition of the 1992–1993 Influenza
Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report. U. S. Department
of Health and Human Services, Public Health Service, 41/Nr. 18:
315–323,
1992.) Influenzaviren sind hoch pleomorphe Partikel, bestehend aus
zwei Oberflächen-Glycoproteinen,
Hämagglutinin
(HA) und Neuraminidase (NA). Das HA vermittelt Anheftung des Virus
an die Wirtszelle und Fusion der Virus-Zellmembran während des Eindringens
des Virus in die Zelle. Das Genom des Influenzavirus umfasst acht
einzelsträngige
Negativstrang-RNA-Segmente, von denen das viertgrößte Segment
das HA-Gen codiert. Die Influenzaviren werden basierend auf Antigen-Unterschieden
in die Typen A, B und C eingeteilt. Influenza-A-Viren werden mit
einer Nomenklatur beschrieben, die den Subtyp oder Typ, geographischen
Ursprung, Nummer des Stamms und Jahr der Isolierung umfasst, zum
Beispiel A/Beijing/353/89. Es gibt mindestens 13 Subtypen des HA
(H1–H13) und
neun Subtypen der NA (N1–N9).
Alle Subtypen lassen sich in Vögeln
nachweisen, aber nur H1–H3
und N1–N2
lassen sich in Menschen, Schweinen und Pferden nachweisen (Murphy
und Webster, "Orthomyxoviruses", in Virology, Hrsg.
Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., 1091–1152 (Raven
Press, New York, (1990)).
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Antikörper gegen
HA neutralisieren das Virus und bilden die Basis für natürliche Immunität gegenüber Infektion
durch Influenza (Clements, "Influenza
Vaccines", in Vaccines:
New Approaches to Immunological Problems, Hrsg. Ronald W. Ellis,
S. 29–150
(Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). Antigen-Variation im
HA-Molekül ist für die häufigen Ausbrüche von
Influenza und für
begrenzte Kontrolle der Infektion durch Immunisierung verantwortlich.
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Die
dreidimensionale Struktur des HA und die Wechselwirkung mit seinem
zellulären
Rezeptor, Sialinsäure,
ist intensiv untersucht worden (Wilson, et al., "Structure of the hemagglutinin membrane
glycoprotein of influenza virus at 3A° resolution" Nature 289: 366–378 (1981); Weis, et al., "Structure of the
influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic
acid" Nature, 333:
426–431
(1988); Murphy und Webster, 1990). Das HA-Molekül liegt im Virion als ein Trimer
vor. Jedes Monomer besteht aus zwei Ketten, HA1 und HA2, die durch
eine einzelne Disulfid-Bindung verbunden sind. Infizierte Wirtszellen
produzieren ein glycosyliertes Vorläufer-Polypeptid (HAO) mit einem Molekulargewicht
von etwa 85.000, das nachfolgend in HA1 und HA2 gespalten wird.
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Die
Anwesenheit von Influenza-HA-spezifischem, neutralisierendem IgG-
und IgA-Antikörper ist
mit Resistenz gegen Infektion und Erkrankung verbunden (Clements,
1992). Influenza-Impfstoffe aus inaktiviertem ganzem oder teilgereinigtem
(gespaltene Untereinheit) Virus werden nach der Menge an HA aus
jedem Stamm standardisiert. Influenza-Impfstoffe umschließen gewöhnlich 7
bis 25 Mikrogramm HA aus jedem von drei Influenza-Stämmen.
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Die
Rolle des anderen größeren Oberflächen-Glycoproteins,
NA, für
schützende
Immunität
von Antikörper-
oder T-Zell-Antworten gegen Influenza ist nicht definiert worden.
Neuraminidase ist dem Prozess der Reinigung und Lagerung gegenüber sehr
unbeständig
(Murphy und Webster, 1990), und die Menge an NA in den gegenwärtigen Influenza-Impfstoffen
ist nicht standardisiert. Gereinigter HA-, nicht aber NA-Impfstoff
verhindert Erkrankung von Tieren, die Influenza ausgesetzt wurden
(Johansson, et al., "Purified
influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in
stimulation of antibody response but induce contrasting types of
immunity to infection" J.
Virology, 63: 1239–1246
(1989)). Ein experimenteller, auf Neuraminidase-Antigen basierender
Impfstoff erwies sich in einer Testreihe beim Menschen als nicht
schützend
(Orga et al., J. Infect. Dis. 135: 499–506 (1977)).
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Zugelassene
Influenza-Impfstoffe umfassen mit Formalin inaktivierte, ganze oder
chemisch gespaltene Präparate
von Untereinheiten aus zwei Influenzaviren des Subtyps A (H1N1 und
H3N2) und einem Influenzavirus des Subtyps B. Vor jeder Influenza-Saison
gibt das U. S. Food and Drug Administration's Vaccines and Related Biologicals Advisory
Committee eine Empfehlung für
die Zusammensetzung eines trivalenten Influenza-Impfstoffes für die bevorstehende
Saison heraus. Der Impfstoff für
1992–93
enthielt A/Texas/36/91-artige (H1N1), A/Beijing/353/89-artige (H3N2)
und B/Panama/45/90-Viren Die FDA hat empfohlen, dass der Influenza-Impfstoff für 1993–94 die
selben Texas- und Panama-Stämme
und einen neuen Influenza A-Beijing-Stamm (A/Beijing/32/92) beinhalten
soll.
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Jährliche
Impfung von Personen mit hohem Risiko vor der Influenza-Saison ist
die wirkungsvollste Weise, den Einfluss von Influenza zu reduzieren.
Einschränkungen
für die
gegenwärtig
verfügbaren
Impfstoffe umfassen geringe Anwendungsraten; geringe Wirksamkeit
bei älteren
Personen und bei kleinen Kindern; Produktion in Eiern; Antigen-Variation
und nachteilige Reaktionen.
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Das
Center for Disease Control (CDC) schätzt, dass jedes Jahr weniger
als 30% der Personen mit hohem Risiko für Influenza geimpft werden
(MMWR, 1992). Die gegenwärtigen
inaktivierten Impfstoffe erreichen bei normal gesunden Erwachsenen
eine hohe Schutzrate gegenüber
Erkrankung, wenn die Antigene des Impfstoffes und jene der zirkulierenden
Influenza-Viren eng verwandt sind. Bei älteren Personen ist die Schutzrate gegenüber einer
Erkrankung wesentlich geringer, besonders bei jenen, die in einem
Heim leben (Clements, 1992). In einer neuen Studie von Powers und
Belshe, J. Inf. Dis. 167: 584–592
(1993) wurden signifikante Antikörper-Antworten auf einen
trivalenten Influenza-Impfstoff mit Subvirionen bei weniger als
30 Prozent der 65-jährigen
oder älteren
Personen beobachtet.
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Zuchtviren
für Influenza-A-
und B-Impfstoffe sind natürlich
vorkommende Stämme,
die sich mit hohen Titern in der Allantoin-Höhle von Hühnereiern vermehren. Alternativ
ist der Stamm für
die Influenza-A-Variante ein neu kombiniertes Virus mit den richtigen
Genen für
die Oberflächen-Antigene.
Ein neu kombiniertes Virus ist eines, das auf Grund von Segmentierung
des viralen Genoms Merkmale jedes Elternstammes aufweist. Wenn mehr
als einer der viralen Influenza-Stämme eine Zelle infizieren,
vermischen sich diese viralen Segmente, um ein progenes Virion zu
bilden, das verschiedene Zusammenstellungen der Gene beider Elternteile enthält.
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Der
Schutz durch die gegenwärtigen
ganzen oder gespaltenen Influenza-Impfstoffe ist kurzlebig und wird
geringer, sobald Antigendrift in epidemischen Influenza-Stämmen auftritt.
Influenza-Viren unterliegen der Antigendrift als ein Ergebnis der
Immunselektion von Viren mit Änderungen
in der Aminosäuresequenz
des Hämagglutinin-Moleküls. Idealerweise
passen die Impfstoff-Stämme
zu den Stämmen
des Influenzavirus, die die Erkrankung verursachen. Der gegenwärtige Herstellungsprozess
für Influenza-Impfstoffe
ist jedoch durch die Vermehrung des Virus in embryonierten Hühnereiern
begrenzt. Nicht alle Influenza-Virusstämme vermehren sich gut in Eiern;
die Viren müssen
daher angepasst werden, oder es müssen virale Neukombinationen konstruiert
werden. Es besteht umfangreiche Heterogenität zwischen dem Hämagglutinin
von Influenzaviren, die in Eiern gezogen wurden, und Primärisolaten
aus infizierten Individuen, die in Säugerzellen gezüchtet wurden
(Wang, et al., Virol. 171: 275–279
(1989); Rajakumar, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4154–4158 (1990).
Die Änderungen
im HA während
der Auswahl und Herstellung von Influenza-Impfstoffen kann zu einem Gemisch
von antigen-distinkten Subpopulationen des Virus führen. Die
Viren im Impfstoff können
sich daher von den Varianten innerhalb des epidemischen Stammes
unterscheiden, was suboptimale Schutzniveaus zur Folge hat.
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Possee
(1986 Virus Research, Band 5, Seiten 43–59) offenbart die Zelloberflächenexpression
von Hämagglutinin
des Influenzavirus in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors.
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Matsuura
et al. (1987 J Gene Virol Bd. 68, Seiten 1233–1250) offenbart zahlreiche
Baculovirus-Expressionsvektoren und diskutiert die Erfordernisse
einer Expression von Proteinen wie etwa Glycoproteinen in hohem
Maße.
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Kuroda
et al. (1986 MBO Journal Bd. 5, Seiten 1359–1365) offenbart die Expression
von Hämagglutinin
des Influenzavirus in Insektenzellen durch einen Baculovirus-Vektor.
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EP0546787 offenbart die
Expression von spezifischen Immungenen unter Verwendung viraler
Antigene und beschreibt besonders chimäre DNA-Fragmente, die jenen ähnlich sind,
die das HA-Oberflächenprotein eines
Influenza-A-Virus codieren.
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Ayres
et al. (1994 Virology Bd. 202, Seiten 586–605) offenbart eine vollständige DNA-Sequenz
des Kern-Polyeder-Virus von Autographa californica, die 133.894
Basenpaare umfassen und etwa 154 putative offene Leserahmen von
150 oder mehr Nucleotiden codieren soll.
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Sofortige
hypersensitive Reaktionen können
auf Grund von Ei-Proteinresten im Impfstoff bei Personen mit schwerer
Ei-Allergie auftreten. Der Schweine-Influenza-Impfstoff von 1976 war mit einer ansteigenden Häufigkeit
des Guillain-Barré-Syndroms verbunden.
Bei nachfolgenden Impfstoffen, die aus anderen Influenza-Stämmen hergestellt
wurden, ist bisher kein Anstieg des Auftretens dieser seltenen Krankheit
beobachtet worden.
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffes, bei dem die
Vermehrung in Eiern nicht erforderlich ist, würde zu einem reineren Produkt
führen,
das weniger leicht eine unerwünschte
Immunreaktion hervorrufen würde.
Darüber
hinaus wurde ein reineres Impfstoffpräparat keine Inaktivierung des
Virus oder organische Extraktion von viralen Membranbestandteilen
erforderlich machen, wodurch Denaturierung der Antigen-Epitope und
Sicherheitsbelange auf Grund von Rest-Chemikalien im Impfstoff vermieden würden.
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Darüber hinaus
würde bei
einem Influenza-Impfstoff, der ohne Vermehrung im Ei hergestellt
würde, die
genetische Heterogenität
vermieden, die während
der Adaption und Passage durch Eier auftritt. Dies würde zu einem
Impfstoff führen,
der besser zu den epidemischen Influenza-Stämmen passt, was zu einer verbesserten
Wirksamkeit führt.
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Es
ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffes bereitzustellen, das
keine Vermehrung in Eiern erfordert.
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Es
ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
bereitzustellen, durch das ein Influenza-Impfstoff schnell, kostengünstig und
hochgereinigt hergestellt werden kann und das die Herstellung von
Impfstoffen aus Primärquellen
von Influenza erlaubt.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor
für die
Herstellung eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen
glycosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins,
welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten
Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu
95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen
ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als Impfstoff
verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein
weiterhin ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin
fusioniert ist, wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen umfasst:
einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die
die Nucleotide 19–72 von
SEQ ID NO: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid codieren,
oder eine Nucleinsäure,
die ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von
SEQ ID NO: 7 oder 9 codiert, die codierenden Sequenzen für reifes
Hämagglutinin
aus einem Stamm von Influenza, eine codierende Sequenz für das zweite
Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin RNA-Polyadenylierungssignal.
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Das
Signalpeptid ist bevorzugt aus dem Baculovirus-61K-Gen abgeleitet.
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Vorzugsweise
codiert die Sequenz, die das Signalpeptid und das Hämagglutinin
codiert, keine dazwischen liegenden Aminosäuren.
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Der
Vektor umfasst bevorzugt eine Sequenz, die ein zweites Protein codiert,
welches als ein Fusionsprotein mit dem Hämagglutinin exprimiert wird.
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Der
Vektor wird bevorzugt in kultivierte Insektenzellen transfiziert.
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In
einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlich reinen, rekombinanten,
reifen glycosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins, welches
durch ein Baculovirus-Expressionssystem
in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein
bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen
ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als ein Impfstoff
verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein weiterhin
ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin fusioniert ist,
wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen umfasst: einen Polyhedrin-Promotor
aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die die Nucleotide 19–72 von
SEQ ID NO: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid
codieren, oder eine Nucleinsäure,
die ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von
SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die codierenden Sequenzen für Hämagglutinin
aus einem Stamm von Influenza, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus Influenza-A-Stämmen
und Influenza-B-Stämmen,
eine codierende Sequenz für
das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylisierungssignal,
wobei man Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale
RNA, für
Influenza-A-Stämme
oder mRNA für
Influenza-B-Stämme
isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen
Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1))
für die
virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder
Random-Primer für
die mRNA aus Influenza B-Stämmen
synthetisiert, wobei die 5'-
und 3'-Primer Restriktionsenzymstellen
an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene
zu finden sind, die Influenza-A-
oder -B-Primer und die Influenza-cDNA mit den Hämagglutinin-Gensegmenten vermischt
amplifiziert, um doppelsträngige
DNA-Fragmente zu erzeugen, die die vollständigen, reifen Hämagglutinin-codierenden
Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert
und dann die Hämagglutinin-Gene
abzüglich
des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des
Signalpeptids in einen Vektor cloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor
enthält.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten,
reifen, glycosylierten Influenza-Hämagglutinins, welches durch
ein Baculovirus-Expressionssystem
in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein
bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen
ist und eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als Impfstoff
verwendet wird, wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen enthält: einen
Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die
die Nucleotide 19–72
von SEQ ID NO: 6 oder 8, die das Baculovirus-Signalpeptid codieren,
umfasst, oder eine Nucleinsäure, die
ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von
SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die codierenden Sequenzen für Hämagglutinin
aus einem Stamm von Influenza, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Influenza-A-Stämmen
und Influenza-B-Stämmen,
die codierende Sequenz für
das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylierungssignal,
bei dem man: Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale
RNA für
Influenza-A-Stämme
oder mRNA für
Influenza-B-Stämme
isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen
Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1))
für die
virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder Random-Primer für die mRNA
aus Influenza-B-Stämmen synthetisiert,
wobei die 5'- und
3'-Primer Restriktionsenzymstellen
an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene
zu finden sind, die Influenza-A- oder -B-Primer und die Influenza-cDNA
mit dem Hämagglutinin-Gensegmenten vermischt
amplifiziert, um doppelsträngige DNA-Fragemente
zu erzeugen, die die vollständigen,
reifen Hämagglutinin-codierenden
Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert
und dann die Hämagglutinin-Gene
abzüglich
des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids in
einen Vektor cloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält.
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Vorzugsweise
werden die Hämagglutinin-Gene
mittels PCR in den (die) Vektor(en) cloniert, so dass der Vektor
das Signalpeptid, das unmittelbar mit dem Hämagglutinin ohne dazwischenliegende
Aminosäuren verknüpft ist,
codiert.
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Vorzugsweise
umfasst das oben beschriebene Verfahren weiterhin die Transfektion
des Vektors in Insektenzellen und das Selektieren von Zellen für die Hämagglutininexpression.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Vektor, der nach dem/den beschriebenen
Verfahren hergestellt ist. Vorzugsweise exprimiert dieser Vektor
im Wesentlichen reines, rekombinantes, reifes glycolysiertes Influenza-Hämagglutinin.
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Vorzugweise
codiert der Vektor ein Signalpeptid und Hämagglutinin, die gemeinsam
die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 7 aufweisen.
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Vorzugsweise
ist das Signalpeptid vom Baculovirus-61K-Gen abgeleitet.
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Influenza-Hämagglutininproteins
durch Expression in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems
wird bereit gestellt. Das resultierende Protein ist zur Herstellung
eines multivalenten Influenza-Impfstoffes nützlich, der auf einem Gemisch aus
rekombinanten Hämagglutinin-Antigenen
basiert, die aus Influenzaviren mit epidemischem Potential cloniert
wurden. Die rekombinanten Hämagglutininproteine
sind ungespaltene (HAO) Glycoproteine in vollständiger Länge, die die beiden Untereinheiten
HA1 und HA2 umschließen
(HAO) und unter nicht denaturierenden Bedingungen auf 95% oder höhere Reinheit,
bevorzugt 99% gereinigt sind.
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Ein
Verfahren zur Clonierung von Influenza-Hämagglutinin-Genen aus Influenza-A- und -B-Viren unter Verwendung
speziell entworfener Oligonucleotid-Sonden und des Polymerase-Kettenreaktion-Verfahrens (PCR)
wird ebenfalls offenbart. In der bevorzugten Ausführungsform
werden die clonierten HA-Gene durch Deletion der Nucleotide, die
die natürlichen
hydrophoben Signalpeptid-Sequenzen codieren, und Ersatz durch ein neues
Baculovirus-Signalpeptid verändert,
um eine Sequenz zu erhalten, die das Signalpeptid direkt angrenzend
an das Hämagglutinin
codiert. Diese chimären
Gene werden in Baculovirus-Expressionsvektoren eingeführt, so
dass der Polyhedrin-Promotor des Baculovirus die Expression von
rekombinanten HA-Proteinen in infizierten Insektenzellen steuert.
Das 18 Aminosäuren
umfassende Signalpeptid des Baculovirus steuert die Translation
von rHA in den Glycosylierungsstoffwechselweg der Insektenzelle
und ist auf dem reifen rHA-Glycoprotein
nicht anwesend. In der bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor
entworfen, der keine zwischen dem Signalpeptid und dem Hämagglutininprotein
liegenden Aminosäuren
codiert.
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Diese
Vorgehensweise kann auf alle Typen von Influenzaviren ausgeweitet
werden, einschließlich, aber
nicht hierauf begrenzt, des prävalenten
A-(H1N1)Subtyps, des A-(H3N2)Subtyps und des B-Subtyps, die Menschen
infizieren, sowie auch auf die Influenzaviren, die andere Säuger- und
Vogelarten infizieren.
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Ein
allgemeiner Ansatz zur wirksamen Extraktion und Reinigung von rekombinantem
HA-Protein, das in Insektenzellen produziert wurde, wird für die Reinigung
von rHA-Proteinen
von Influenzaviren der A-Subtypen und des B-Typs offenbart. Der
rekombinante Impfstoff kann aus Primärquellen von Influenza, zum
Beispiel Nasensekretionen infizierter Individuen, eher als aus dem
adaptierten und in Hühnereiern
kultivierten Virus entwickelt werden. Dies erlaubt schnelle Entwicklung
von Impfstoff direkt aus epidemischen Influenzastämmen und
vermeidet sowohl die Probleme, die aus der Adaption des Virus zur
Kultivierung in Eiern erwachsen, als auch Patientenreaktion auf
Verunreinigung aus dem Ei in dem resultierenden Impfstoff.
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Beispiele
zeigen die Formulierung und klinische Wirksamkeit des Impfstoffes
in einer immunisierenden Dosierungsform, die gereinigte rHA-Antigene
aus drei Stämmen
des Influenzavirus umschließen,
die von der FDA für
die Influenzaepidemie-Saisons 1993/1994 und 1994/1995 empfohlen
worden waren. Funktionale Immunität wurde unter Verwendung von
Untersuchungen bestimmt, die Antikörper quantifizieren, die das
Influenza-Hämagglutinin
binden, wodurch die Fähigkeit
des Influenzavirus rote Blutzellen zu verklumpen blockiert wird
oder wodurch das Influenzavirus neutralisiert wird. Schützende Immunantworten
mit rHA-Impfstoffen wurden in Tieren, die für Influenza-Infektion anfällig waren,
oder in Infektionsstudien mit Menschen ermittelt.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 ist
eine schematische Darstellung der Clonierung von HA-Genen von Influenza-A-Stämmen aus gereinigten
viralen RNA-Präparationen,
Reinigung des exprimierten rHA und biologische Charakterisierung von
rHA. Abkürzungen:
FDA, Food and Drug Administration; MDCK, Niere des Madin Darby Hundes;
TPCK, Tosylphenylalanyl-Chlormethylketon; RNA, Ribonucleinsäure; cDNA,
komplementäre
Desoxyribonucleinsäure;
HA, Hämagglutinin;
FBS, fötales
Rinderserum; PCR, Polymerase-Kettenreaktion und BV, Baculovirus.
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2 ist
eine genauere schematische Darstellung des Verfahrens aus 1,
angewandt auf die Clonierung und Expression des HA-Gens vom Influenzastamm
A/Texas/36/91. Das Influenza-HA-Gen wurde aus RNA erhalten, die
aus mit Influenza A/Texas/36/91 infizierten MDCK-Zellen gereinigt
wurde, indem reverse Transkriptase und Universal-Primer (SEQ ID
NO: 1) verwendet wurden, gefolgt von zwei Durchläufen der PCR-Amplifizierung
und Clonierung. Wie dargestellt, wurden im ersten Durchlauf der
PCR-Reaktionen die 3'-End-Primer
SEQ ID NO: 2 und 3'-End-Primer SEQ ID
NO: 3 verwendet. Im zweiten Durchlauf der PCR-Reaktionen wurden
die 5'-End-Primer
SEQ ID NO: 4 und 3'-End-Primer
SEQ ID NO: 5 verwendet. Ein Baculovirus-Rekombinationsvektor wurde
konstruiert, der den Polyhedrin-Promotor
und eine Signalpeptid-Sequenz vom Baculovirus-61K-Gen (ein Baculovirus-Gen,
das ein Signalpeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 61.000
codiert) umfasste, gefolgt von einer vollständigen Codierungssequenz für das reife
HA-Protein. Dieser Rekombinationsvektor wurde dann verwendet, um
einen Baculovirus-Expressionsvektor herzustellen, der HA von diesem
Virusstamm produzierte.
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3 ist
eine grafische Darstellung der anti-HA-Immunantwort von Mäusen, Tag
42, n = 5, die den Antikörper-Titer
für reines
rHA0; den Impfstoff Fluzone® und rHA0-Alaun in Dosierungen
von 0,5 μg
(schraffierte Balken), 0,1 μg
(senkrecht gestreifte Balken), 0,02 μg (gepunktete Balken) und 0,004 μg (weiße Balken)
darstellt.
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4a, 4b und 4c sind
grafische Darstellungen der anti-HA-Immunantwort von Mäusen, die mit
rHA oder zugelassenem trivalenten Impfstoff, Formulierung 1994–1995, immunisiert
worden waren; Wochen nach Impfung gegen HIA-Titer, für HAI A/Texas/36/91
(4a), HAI A/Shangdong/9/93 (4b), und HAI
B/Panama/45/90 (4c); rHA (Rauten) und abgeschwächten, in
Eiern kultivierten FLUVIRON® Impfstoff (Quadrate).
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Influenza-Impfstoffes
wird beschrieben. Ein ungespaltenes (HAO) Hämagglutinin-Antigen voller
Länge von
einem Influenzavirus wird mit Baculovirus-Expressionsvektoren in
kultivierten Insektenzellen hergestellt und unter nicht denaturierenden
Bedingungen gereinigt. Zwei oder mehr gereinigte Hämagglutinin-Antigene
von Influenza A- und/oder Influenza B-Stämmen werden zusammengemischt,
um einen multivalenten Influenza-Impfstoff herzustellen. Die rekombinanten
Antigene können
mit einem Adjuvans-Transportmittel zur erhöhten Wirksamkeit kombiniert
werden.
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Die
Verwendung von rekombinanter DNA-Technik zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen bietet mehrere
Vorteile: ein rekombinanter DNA-Influenza-Impfstoff kann unter sichereren
und strenger kontrollierten Bedingungen hergestellt werden; Vermehrung
von infektiöser
Influenza in Eiern ist nicht erforderlich; rekombinantes HA-Protein
kann höher
gereinigt werden, was Nebenwirkungen auf Grund von verunreinigenden
Proteinen praktisch beseitigt; Reinigungsverfahren für rekombinantes
HA müssen
keine Virusinaktivierung oder organische Extraktion von viralen
Membranbestandteilen beinhalten, wodurch Denaturierung von Antigenen und
zusätzliche
Sicherheitsbelange auf Grund von Restchemikalien im Impfstoff vermieden
werden; Herstellung von HA mittels rekombinanter DNA-Technik liefert
eine Möglichkeit,
die genetische Heterogenität
zu vermeiden, die während
der Adaptation und Passage durch Eier auftritt, wodurch es möglich sein
sollte, Impfstämme
besser an die epidemischen Influenzastämme anzupassen, was verbesserte
Wirksamkeit nach sich ziehen würde;
und ein rekombinanter Ansatz kann auch eine Stammselektion später im Jahr
erlauben, wodurch Zeit für
Selektionen gewonnen würde,
die auf verlässlicheren
epidemiologischen Daten basieren.
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Das Baculovirus-Expressionssystem
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Baculoviren
sind DNA-Viren in der Familie der Baculoviridae. Von diesen Viren
ist bekannt, dass sie einen engen Wirtsbereich haben, der primär auf Insektenarten
der Lepidoptera (Schmetterlinge und Motten) begrenzt ist. Das Baculovirus
von Autographa californica, Kernpolyeder-Virus (AcNPV), das das
Prototyp-Baculovirus geworden ist, repliziert sich wirksam in empfänglichen
kultivierten Insektenzellen. AcNPV hat ein doppelsträngiges,
geschlossenes, ringförmiges
DNA-Genom von etwa 130.000 Basenpaaren und ist im Hinblick auf Wirtsbereich,
Molekularbiologie und Genetik gut beschrieben.
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Viele
Baculoviren, einschließlich
AcNPV, bilden große
kristalline Proteinocclusionen innerhalb des Zellkerns der infizierten
Zellen. Ein einzelnes Polypeptid, als ein Polyhedrin bezeichnet,
ist für
etwa 95% der Proteinmasse dieser Occlusionskörper verantwortlich. Das Gen
für Polyhedrin
liegt als eine einzelne Kopie im viralen AcNPV-Genom vor. Weil das
Polyhedrin-Gen für
die Replikation des Virus in kultivierten Zellen nicht essentiell
ist, kann es leicht modifiziert werden, um fremde Gene zu exprimieren.
Die fremde Gensequenz wird in das AcNPV-Gen direkt 3' der Polyhedrin-Promotorsequenz
inseriert, sodass sie unter der transkriptionalen Kontrolle des
Polyhedrin-Promotors steht.
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Rekombinante
Baculoviren, die fremde Gene exprimieren, werden durch homologe
Rekombination zwischen Baculovirus-DNA und chimären Plasmiden, die die Gensequenz
von Interesse enthalten, hergestellt. Rekombinante Viren können durch
ihre klar abgegrenzte Plaque-Morphologie nachgewiesen und auf Homogenität plaquegereinigt
werden.
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Baculoviren
sind besonders gut zur Verwendung als eukaryontische Clonierungs- und Expressionsvektoren
geeignet. Sie sind allgemein sicher aufgrund ihres engen Wirtsbereiches,
der auf Arthropoden begrenzt ist. Die Environmental Protection Agency
(EPA) der USA hat die Anwendung von drei Baculovirus-Arten zur Kontrolle
von Insektenschädlingen
genehmigt. AcNPV wird seit vielen Jahren gemäß der EPA-Genehmigung (Experimental Use Permits)
bei Feldfrüchten
verwendet.
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Der
AcNPV-Wildtyp und rekombinante Viren vermehren sich in einer Reihe
von Insektenzellen, einschließlich
kontinuierlicher Zelllinien, die vom Herbst-Heerwurm Spodoptera
frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae) abstammen. Zellen von S. frugiperda
haben eine Populationsverdopplungszeit von 18 bis 24 Stunden und können in
Kulturen aus einzelliger Schicht oder in freier Suspension gezüchtet werden.
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Die
Herstellung von rekombinanten HA-Proteinen kann in Zellen erfolgen,
die von der Lepodoptera-Art Spodoptera frugiperda abstammen, ist
aber nicht darauf begrenzt. Andere Insektenzellen, die vom Baculovirus infiziert
werden können,
wie etwa jene von den Arten Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia
ni oder Lamanthria dispar, können
gleichfalls als ein geeignetes Substrat verwendet werden, um rekombinante
HA-Proteine herzustellen.
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Die
am meisten bevorzugte Wirtszelllinie zur Proteinproduktion von rekombinanten
Baculoviren ist Sf900+. Eine andere bevorzugte Wirtszelllinie zur
Proteinproduktion von rekombinanten Baculoviren ist Sf9. Sf900+
und Sf9 sind nicht transformierte, nicht tumorigene kontinuierliche
Zelllinien, die vom Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera;
Noctuidae) abstammen. Sf900+- und Sf9-Zellen werden bei 28 ± 2°C ohne Kohlendioixd-Ergänzung gezüchtet. Das
für Sf9-Zellen
verwendete Kulturmedium ist TNMFH, ein einfaches Gemisch aus Salzen,
Vitaminen, Zuckern und Aminosäuren,
ergänzt
mit 10% fötalem
Rinderserum. Abgesehen vom fötalen
Rinderserum werden keine anderen von Tieren stammenden Produkte
(z. B. Trypsin etc.) zur Zellvermehrung verwendet. Serumfreies Kulturmedium
(erhältlich
als Sf900-Kulturmedien,
Gibco BRL, Gaithersburg, MD) kann ebenfalls zum Züchten von
Sf9-Zellen verwendet
werden und wird für
die Vermehrung von Sf900+-Zellen bevorzugt.
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Sf9-Zellen
haben eine Populationsverdopplungszeit von 18–24 Stunden und können in
Kulturen aus einzelliger Schicht oder in freier Suspension vermehrt
werden. Es ist nicht berichtet worden, dass Zellen von S. frugiperda
die Replikation eines der bekannten Säugerviren unterstützt.
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Fachleute
auf diesem Gebiet werden erkennen, dass der Expressionsvektor nicht
auf ein Baculovirus-Expressionssystem begrenzt ist. Die rekombinanten
HA-Proteine können
auch in anderen Expressionsvektoren exprimiert werden, wie etwa
Entomopockenviren (die Pockenviren der Insekten), cytoplasmatischen Polyederviren
(CPV) und Transformation von Insektenzellen mit konstitutiver Expression
des rekombinanten HA-Gens oder der rekombinanten HA-Gene.
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Isolierung von Influenza-Stämmen
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Ein
oder mehrere Influenza-Stämme
werden von Individuen isoliert, die mit der Krankheit infiziert
sind. Bevorzugt sind die Influenza-Stämme jene, die von der Food
and Drug Administration (FDA) oder CDC identifiziert sind, dass
sie epidemisches Potential für
die kommende Influenza-Saison haben. Ein Vorteil des hierin beschriebenen
Verfahrens ist, dass klinische Proben wie etwa Nasensekret von Patienten,
die mit Influenza infiziert sind, als direkte Quelle für das Virus
verwendet werden können.
Alternativ können
sie von der FDA oder CDC erhalten werden.
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Vermehrung von Influenza-Stämmen
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Die
Stämme
werden dann in Zellen vermehrt, die hohe Virus-Titer erzeugen, wie
etwa Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen (erhältlich bei
der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC
CCL34). Zum Beispiel werden MDCK-Zellen in Anwesenheit von Konzentrationen
von Trypsin, das mit Tosylphenylalanyl-chloromethylketon (TPCK)
teilweise inaktiviert wurde, und fötalem Rinderserum, die so optimiert
sind, dass sie die höchsten
Titer für
die erste Passage des Virus erzeugen, infiziert. Die MDCK-Zellen werden
mit den Influenza-Stämmen
mit einer niedrigen Multiplizität
der Infektion (0,1 bis 0,5) infiziert, was durch einen standardisierten
HA-Test bestimmt wird (Rosen, "Hemagglutination
with Animal Virusses" in
Fundamental Techniques in Virology, Hrsg. K. Nabel und N. P. Salzmann,
S. 276–28
(Academic Press, New York 1969)). Die infizierten Zellen werden
bei 33°C über 48 Stunden
inkubiert, und die Kulturmedien werden unter Verwendung des Hämagglutinierung-Aktivitätstest auf
Virusproduktion untersucht. Die Bedingungen, die die höchste HA-Aktivität ergeben,
werden dann verwendet, um große
Mengen an Stammlösung
des Influenzavirus zu erzeugen.
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Reinigung des Virus
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Viruspartikel,
die bei der ersten Passage erzeugt wurden, werden von den Kulturmedien
gereinigt, indem bekannte Reinigungsverfahren wie etwa Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
verwendet werden. Zum Beispiel wird das Virus 24–48 Stunden nach der Infektion
durch Zentrifugieren der Kulturmedien der mit Influenza infizierten
MDCK-Zellen gewonnen. Der resultierende Virus-Niederschlag wird
in Pufferlösung
resuspendiert und durch einen gepufferten Saccharose-Gradienten zentrifugiert.
Die Bande mit dem Influenzavirus wird aus der 40–45%igen Saccharose-Region
gewonnen, mit Pufferlösung
verdünnt
und durch Zentrifugation mit 100.000 × g ausgefällt. Der gereinigte Virus-Niederschlag
wird in Pufferlösung
resuspendiert und bei –70°C gelagert.
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Clonierung von Influenza-Hämagglutinin-Genen.
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Ein Überblick über die
Verfahren zur Clonierung von HA-Genen wird in 1 gegeben.
Grundsätzlich werden
die Zellen mit dem Influenza-Stamm infiziert, der cloniert werden
soll. Das Virus wird aus den Zellkulturmedien gewonnen, und entweder
wird virale RNA bei Influenza-A-Stämmen oder mRNA bei Influenza-B-Stämmen isoliert.
Virale RNA (-RNA) wird aus gereinigten Virionen extrahiert und unter
Verwendung von Standardverfahren auf Formaldehyd-Agarosegelen analysiert.
cDNA wird synthetisiert, indem entweder ein universelles Primer-System
für die
virale RNA der Influenza-A-Stämme
oder zufällige
Primer für
die mRNA der Influenza-B-Stämme
verwendet werden. Komplementäre
Plus-Strang-DNA (cDNA) wird unter Verwendung eines universellen
Oligonucleotid-Primers (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1))
hergestellt, die homolog zu allen Hämagglutinin-RNA-Segmenten in
Influenza-A- und -B-Viren ist (Davis et al., "Construction and characterization of
a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain
(H0N1) of influenza virus" Gene,
10: 205–218
(1980). Primer werden entworfen, die homolog zu den konservierten
Regionen an den 5'- und
3'-Enden der Influenza-Hämagglutinin-Gene
sind. Sowohl 5'-
als auch 3'-Primer
weisen auch Stellen für Restriktionsenzyme
an den Enden auf, die innerhalb der Hämagglutinin-Gene nicht gefunden
werden.
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Die
geeigneten Primer für
Influenza A oder B und die Influenza-cDNA werden gemischt und die
Hämagglutinin-Gensegmente
unter Verwendung von PCR-Standardverfahren
amplifiziert. Die resultierenden doppelsträngigen DNA-Fragmente enthalten
die gesamten Codierungssequenzen für reifes Hämagglutinin. Die Polymerase-Kettenreaktion
("PCR") wird verwendet,
um das gesamte HA-Gen zu amplifizieren, welches dann in eine geeignete
bakterielle Wirtszelle wie etwa E. coli cloniert wird. Die 5'-Enden werden sequenziert,
um das Signalpeptid der HA-Gene zu identifizieren, dann wird die
PCR verwendet, um die HA-Gene minus des Signalpeptids zu amplifizieren.
Dieses wird dann in einen Plasmid-Transfervektor subcloniert, der
den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält. Die resultierenden Transfervektoren
enthalten die folgenden 5'→3'-Sequenzen: Polyhedrin-Promotor
vom Baculovirus A. californica-NPV, ein ATG-Translationsstartcodon,
ein 61 K großes
Baculovirus-Signalpeptid, die Codierungssequenzen für reifes
Hämagglutinin, das
natürliche
Translationsterminierungscodon von Hämagglutinin, das Polyadenylierungssignal
für Polyhedrin-RNA
und flankierende Baculovirus-DNA.
-
Eine
gereinigte chimäre
Transferplasmid-DNA, die ein cloniertes Hämagglutinin-Gen enthält, wird dann
mit AcNPV-DNA des Wildtyps vermischt, zusammen mit Calcium ausgefällt und
in Zellen von S. frugiperda transfiziert. Rekombinante Baculoviren
werden auf der Basis von Plaque-Morphologie selektiert und durch zusätzliche
Runden der Plaque-Reinigung weiter gereinigt. Clonierte rekombinante
Baculoviren werden auf Expression von Hämagglutinin durchmustert, und
ein einzelner Baculovirus-Expressionsvektor wird ausgewählt, um
eine Master-Virusbank zu erstellen.
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Influenza A-Stämme:
-
HA-Gene
aus Influenza A-Stämmen
werden aus gereinigten RNA-Präparaten
cloniert. Virale RNA wird aus 100–200 Mikrolitern gereinigter
Influenza A-Virionen, die 1.000–2.000
Influenza-Hämagglutinin-Einheiten
(HAU) enthalten, extrahiert. Eine HAU ist die Virusmenge, die 50%
der roten Blutzellen im Standard-Agglutinationstest (Rosen 1961)
agglutiniert. Die Virionen werden mit Proteinase K behandelt, um
Protein zu spalten, dann wird die virale RNA mit gleichen Volumina
von Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol in Anwesenheit
eines tRNA-Trägers
ausgefällt.
Die virale RNA wird in Pufferlösung
resuspendiert und mit RNAse-freier DNAse gespalten, um jede verunreinigende
DNA zu entfernen, dann werden die Extraktions- und Fällungsschritte wiederholt.
Virale RNA (vRNA) wird dann mit Hilfe von Formaldehyd-Agarosegelen
analysiert, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. S. 86–96
und 366–367
(Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N. Y. 1982) beschrieben.
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Influenza B-Stämme:
-
HA-Gene
von Influenza B-Stämmen
werden aus vollständiger
Boten-RNA (mRNA) cloniert, die aus mit dem Influenza B-Stamm infizierten
Zellen extrahiert wird. Vollständige
RNA wird dann aus den infizierten Zellen extrahiert. Die gewonnenen
Zellen werden in Anwesenheit von Guanidiniumthiocyanat lysiert,
und die vollständige
Zell-RNA wird zum Beispiel unter Verwendung des RNA-Extraktionskit
von Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ) gereinigt. Die vollständige mRNA
wird aus zellulärer
RNA unter Verwendung von Oligo-(dT)-Cellulose- Zentrifugationssäulen mit Hilfe zum Beispiel
des mRNA Purification Kit von Pharmacia Biotech Inc. extrahiert.
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Expression und Prozessierung
von rekombinantem Hämagglutinin
in Insektenzellen
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Rekombinante
Hämagglutinin-Antigene
werden in großen
Mengen in Zellen von S. frugiperda, die mit AcNPV-Hämagglutinin-Vektoren
infiziert sind, exprimiert. Das primäre Genprodukt ist nicht prozessiertes
Hämagglutinin
in vollständiger
Länge (rHA0)
und wird nicht sekretiert, sondern bleibt mit den peripheren Membranen
der infizierten Zellen verbunden. Dieses rekombinante HAO ist ein
Protein mit einem Molekulargewicht von 68.000, das mit N-verbundenen
Glycanen des Hoch-Mannose-Typs
glycosyliert ist, die sich von den durch Expression der viralen
Proteine in Säuger-
oder Vogelzellen produzierten Glycanen unterscheiden. Es hat den Anschein,
dass rHA0 posttranslational Trimere bildet, die in cytoplasmatischen
Membranen akkumulieren.
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Vektoren zur Expression von
HAO und anderen Proteinen
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HAO
ist auf Grund seiner besseren Stabilität im Vergleich mit dem HA1/HA2-Komplex ein besserer Impfstoff
und behält
die korrekte Faltung während
der Reinigung und Lagerung bei. Die bessere Stabilität tritt zum
Teil auch bei den B-Stämmen auf
und resultiert in Titern, die etwa fünffach höher als die, die mit käuflich zu
erwerbenden abgeschwächten
B-Stämmen
zu erreichen sind.
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Wie
nachstehend in den Beispielen beschrieben wird, wurde bei der Clonierung
der HA-Gene in pMGS12 über
Restriktionsstellen das reife HA-Signalpeptid entfernt und durch
das Chitinase-Signalpeptid des Baculovirus, als das 61-kD-Signalpeptid
bezeichnet, ersetzt. Da das HA-Gen mit dem Chitinase-Signalpeptid durch
eine Spaltstelle verbunden ist, befinden sich, abhängig von
der ausgewählten
Restriktionsstelle, zwischen drei und fünf Aminosäuren zwischen dem reifen HAO-Protein und dem 61-kD-Signalpeptid.
Während dies
kein Problem bei den A-Stämmen der
Influenza darstellt, faltet sich das HAO vom B-Stamm nicht richtig, wenn
es zusammen mit den zusätzlichen
Aminosäuren
exprimiert wird.
-
Zwei
Wege zur Überwindung
dieses Problems wurden entwickelt. Der erste besteht darin, einen
neuen Vektor, pMGS3, zu verwenden, der das 61-kD-Signalpeptid nicht
codiert. HAO mit seinem natürlichen
Signalpeptid wird in den Vektor cloniert und exprimiert. Bei der
Charakterisierung durch SDS-PAGE zeigt das in diesem Vektor exprimierte
HAO des B-Stammes bessere Glycosylierung und Prozessierung als bei
Expression in pMGS12. Das HAO faltete sich so gut, dass es quantitativ
in HA1/HA2 umgewandelt werden kann. Unglücklicherweise ist die Ausbeute
nicht so hoch, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Das
zweite Verfahren erhöht
die Ausbeute durch Verwendung des 61-kD-Signalpeptids in pMGS12
zur Steuerung der Expression, wobei das HAO-Gen ohne die Verwendung
von Restriktionsenzymen inseriert worden war. Der neue Vektor, der
das 61-kD-Signalpeptid und das HAO-Gen ohne eine Sequenz, die fremde, dazwischen
liegende Aminosäuren
codiert, umfasst, wird als pMGS27 bezeichnet.
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pMGS27
kann zur Clonierung und Expression jedes Genes in einem Baculovirus-Expressionssystem verwendet
werden. Das Ziel-Gen wird, anstatt durch Restriktion und Ligierung
in den Vektor cloniert zu werden, durch Anellierung in den Vektor
cloniert. Reagenzien sind von Clontech in deren PCR-direct-Cloning
System erhältlich.
pMGS27 wurde so konstruiert, dass es am Ende der Codierungsregion
für das
Chitinase-Signalpeptid linearisiert werden kann und durch Behandlung
des linearisierten pMGS27 mit T4-DNA-Polymerase plus dATP zwei lange,
einzelsträngige
Schwänze
erzeugt werden können.
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Das
Ziel-Gen wird mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") oder der PCR mit
reverser Transkriptase ("RT-PCR") mit einem Paar
Oligonucleotiden amplifiziert, die entworfen wurden, um einzelsträngige Schwänze zu erzeugen,
die komplementär
zu den Schwänzen
des behandelten pMGS27 sind, nachdem das PCR-Fragment mit T4-DNA-Polymerase
und dTTP behandelt worden ist. Ein einfaches Anellieren kann dann die
beiden Moleküle
zu einem kreisförmigen
Plasmid kombinieren, das die Wirtszelle transformieren kann. Neben
der Tatsache, dass es schneller und einfacher als das herkömmliche
Restriktions-Ligierungssverfahren zur Clonierung eines HA-Gens in
pMGS12 ist, hat pMGS27 den entscheidenden Vorteil, dass es keine
zusätzlichen
Aminosäuren,
codiert durch die Restriktionsstellen, die zwischen dem Chitinase-Signalpeptid
und dem reifen HA-Protein erzeugt wurden, ergibt. Diese zusätzlichen
Aminosäuren
können
gelegentlich zu Schwierigkeiten führen, etwa dass Signalpeptidase
das Signal nicht abspalten kann oder dass das codierte Protein sich nicht
korrekt falten kann, wie im Fall des HA vom B-Stamm.
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Reinigung von rekombinantem
HAO
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Einige
Tage nach der Infektion kann rHA0 selektiv aus den peripheren Membranen
der mit AcNPV-Hämagglutinin
infizierten Zellen mit einem nicht denaturierenden nichtionischen
Detergenz oder anderen Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet
der Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Insektenzellen bekannt sind,
einschließlich,
aber nicht darauf begrenzt, der Affinitäts- oder Gelchromatographie
und Antikörperbindung,
extrahiert werden. Das im Detergenz lösliche rHA0 kann unter Verwendung
von DEAE-Ionenaustausch- und Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie oder anderer äquivalenter
Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, weiter
gereinigt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das rHA0 unter Verwendung eines Verfahrens gereinigt, das sanfter
ist und eine höhere
Ausbeute an dem rHA0 aus B-Stämmen von
Influenza zur Folge hat. Dieses Verfahren verläuft allgemein wie nachstehend
beschrieben:
Das HAO-Protein, das einen integralen Bestandteil
der Membran von Insektenzellen bildet, wird von den löslichen
Proteinen, den peripheren Membranproteinen und der Mehrzahl der
DNA und RNA durch Extraktion der Zellen in einer relativ viskosen
alkalischen Lösung,
für die
ein alkalischer pH-Wert als zwischen 9,5 und 10,5 liegend definiert
ist, getrennt. Die Viskosität
wird durch den Einschluss von Saccharose in einer Konzentration von
etwa 250 mM erhöht.
Ein Disulfid-reduzierendes
Agens, zum Beispiel β-Mercaptoethanol,
wird in einer Konzentration eingeschlossen, die Disulfid-Bindung
von Proteinen in dem Gemisch wirksam verhindert. Die Zellen werden
in der Extraktionspufferlösung
suspendiert, homogenisiert und dann zentrifugiert. Der Niederschlag
wird durch Homogenisierung in einer Pufferlösung mit niedriger Ionenstärke, die
ein Disulfid-reduzierendes Agens enthält, bei einem alkalischen pH-Wert
(Leitfähigkeit
im Allgemeinen geringer als 1 mS, pH-Wert 10,5) gewaschen, und der
Niederschlag wird zentrifugiert. Das HAO wird dann in einer Pufferlösung aus
dem Niederschlag, die zwischen 0,3 und 1,5% Detergenz wie etwa Triton,
eine Menge an Disaggregationsagens, die Komplexbildung auf Grund
von Ladungswechselwirkungen wirksam verhindert, wie etwa zwischen
0,3 und 1,0 M Betain oder Paurin enthält, bei einem alkalischen pH-Wert (9,5 ist bevorzugt)
extrahiert. Das HAO im Überstand
wird dann durch Anionenaustausch-Chromatographie, gefolgt von Kationenaustausch-Chromatographie
gereinigt. Das HAO wird auf die Anionenaustauschsäule, zum
Beispiel DEAE oder Q-Sepharose® (eine Säule mit
Agarose-Perlen mit quartären
Aminogruppen), in der selben Pufferlösung, in der es extrahiert wurde,
aber mindestens 1:2 mit zusätzlicher
Pufferlösung
verdünnt,
aufgetragen, nachdem die Säule
in Pufferlösung äquilibriert
wurde, die etwa 1/10 der Konzentration des Detergenz und Disulfid-reduzierenden
Agens enthält.
Das HAO wird dann durch Senken des pH-Wertes auf etwa 8,5 eluiert.
Das eluierte HAO wird auf eine Kationenaustauschsäule in der
im Wesentlichen gleichen Pufferlösung
aufgetragen. Verunreinigungen werden durch Senken des pH-Wertes
auf etwa 7,4 eluiert, dann wird das HAO durch Erhöhung der
Salzkonzentration auf 0,15 M NaCl eluiert.
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Dieses
bevorzugte Verfahren zur Reinigung wird nachstehend genau beschrieben.
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Präparation
der Membranfraktion, die das rekombinante HA enthält. Zellen,
die rekombinantes HA exprimieren (6,2 g Zellen aus 0,34 l Kulturansatz),
werden in 100 mg/ml eisgekühltem
Natriumpyrophosphat, 100 mM Natriumchlorid, 250 mM Saccharose, 0,1% β-Mercaptoethanol,
pH-Wert 10,5 suspendiert. Die Zellen werden unter Verwendung eines
Polytron®-Homogenisators
(Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY) bei Stufe 4 über 2 min
aufgebrochen. Der alkalische pH-Wert des Homogenisierungsmediums
wird benötigt,
um die Löslichkeit
der verunreinigenden Proteine zu erhöhen und um die Reinheit der
Membranpräparation
zu erhöhen. Das
Homogenat wird über
30 min bei 9.200 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wird verworfen und der Niederschlag gesammelt. Der Präparation
der Membranfraktion folgt ein Waschschritt bei niedriger Ionenstärke. Der Niederschlag
wird auf das Ausgangsvolumen in eisgekühltem 0,1% β-Mercaptoethanol, 10,5, resuspendiert und
unter Verwendung eines Polytron®-Homogenisators
bei Stufe 4 über
2 min homogenisiert. Das Homogenat wird über 30 min bei 9.200 × g zentrifugiert.
Der Überstand
wird verworfen und der Niederschlag gesammelt. Diese Waschung bei
niedriger Ionenstärke
entfernt einen zusätzlichen
Teil der peripheren Membranproteine. Die Präparation der Membranfraktion
führt zu
der beachtlichen Anreicherung des rekombinanten HA und zur Entfernung
von verunreinigenden Nucleinsäuren.
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Extraktion
des rekombinanten HA. Das rekombinante HA wird dann unter Bedingungen,
die das Antigen nicht denaturieren, selektiv aus dem Membran-Niederschlag extrahiert.
Der Membran-Niederschlag wird in 41 ml eisgekühltem 10 mM Ethanolamin, pH-Wert
9,5, 1% Triton N 101, 0,1% β-Mercaptoethanol,
25 mM NaCl, 400 mM Betain unter Verwendung eines Polytron®-Homogenisators
bei Stufe 4 über
2 min homogenisiert. Nach Inkubation über 40 min bei 23°C wird das
Gemisch über
30 min bei 9.200 × g
zentrifugiert. Der Überstand,
der das rekombinante HA enthält,
wird abgegossen und zweifach mit der gleichen Pufferlösung verdünnt.
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Die
Proteine werden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Die Proben werden in einem kochenden Wasserbad über 10 min in Anwesenheit von
2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5% β-Mercaptoethanol aufgebrochen,
dann wird eine Elektrophorese auf einem 11% Polyacrylamid-Gel in
Anwesenheit von 0,1% SDS durchgeführt, dann wird mit Coomassie-Blau
angefärbt.
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Chromatographische
Reinigung. Chromatographische Reinigung des rekombinanten HA wurde
vereinfacht, und die teure Affinitätschromatographie auf Lentil-Lectin-Sepharose
wurde aus dem Prozess eliminiert und durch einen chromatographischen
Reinigungsprozess in zwei Stufen ersetzt, was zu einem hoch gereinigten
rekombinanten HA-Antigen führt,
das nicht denaturiert ist und als ein Bestandteil eines Influenza-Impfstoffes
zur Anwendung beim Menschen geeignet ist. Die verwendeten Chromatographie-Gelmatrices sind
Pharmacia Q-Sepharose® Fast Flow und CM-Sepharose
Fast Flow®.
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Anionenaustausch-Chromatographie.
Alle Chromatographien werden bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der
rekombinantes HA enthaltende Extrakt, der wie vorstehend präpariert
wurde, wird mit 1 ml/min auf Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow® aufgetragen
(5 ml in einer C10/10-Pharmacia Säule), die mit 10 mM Ethanolamin,
pH 9,5, 0,1% Triton® N101, 0,01% β-Mercaptoethanol,
25 mM NaCl, 400 mM Betain äquilibriert
worden war. Die Säule
wird dann mit der Pufferlösung
zur Äquilibrierung
gewaschen, bis die UV-Absorption des Effluens zur Grundline zurückkehrt.
Unter diesen Bedingungen bindet rekombinantes HA an die Säule, während Teile
der Verunreinigungen durchfließen.
Zum Teil gereinigtes rekombinantes HA wird dann mit 30 mM Diethanolamin,
pH 8,5, 0,1% Triton® N101, 0,01% β-Mercaptoethanol,
25 mM NaCl, 400 mM Betain eluiert.
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Kationenaustausch-Chromatographie.
Das Q-Sepharose-Eluat (23 ml) wird zweifach mit 30 mM Diethanolamin,
pH 8,5, 0,1% Triton® N 101, 0,01% β-Mercaptoethanol,
10 mM NaCl, 400 mM Betain verdünnt.
Die Säule
wird dann mit 35 ml 10 mM-Natriumphosphat, pH 7,4, 0,1% Triton® N
101, 0,01% β-Mercaptoethanol, 10
mM NaCl, 400 mM Betain gewaschen. Diese Behandlung eluiert die Verunreinigungen
aus der Säule,
während
rekombinantes HA an die CM-Sepharose
gebunden bleibt. Das Detergenz wird dann durch Waschen der Säule mit
10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 10 mM NaCl entfernt, bis die UV-Absorption
des Effluens zur Grundlinie zurückkehrt.
Gereinigtes rekombinantes HA wird mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, pH
7,5 (PBS) eluiert.
-
Gereinigtes
rHA0 wird in einer isotonischen, gepufferten Lösung resuspendiert. Nach der
Entfernung des Detergenz wird gereinigtes rHA0 rote Blutzellen wirksam
agglutinieren.
-
Strukturelle und biologische Eigenschaften
von rekombinantem HAO
-
rHA0
wird auf mindestens 95% Reinheit, stärker bevorzugt 99% gereinigt.
Dieses wandert vorwiegend als ein einzelnes Haupt-Polypeptid mit
einem Molekulargewicht von 68.000 auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel. Die
Quartärstruktur
von gereinigtem, rekombinantem HAO-Antigen wurde mittels Elektronenmikroskopie, Trypsin-Resistenz, Dichtesedimentationsanalyse
und der Fähigkeit,
rote Blutzellen zu agglutinieren untersucht. Diese Daten zeigen,
dass rekombinantes HAO Trimere bildet, die sich in Rosetten anordnen.
-
Gereinigtes
rHA0 agglutiniert Zellen nicht vor der Entfernung des Detergenz,
was nahelegt, dass das Antigen Komplexe (Rosetten) bilden muss,
um Kreuzbindung mit roten Blutzellen von Küken einzugehen. Die quantitative
Fähigkeit
von gereinigtem rHA0, Zellen zu agglutinieren, wird als ein Maß für die Übereinstimmung des
Antigens von Charge zu Charge verwendet. Eine Hämagglutinin-Einheit ist als
die Menge an Antigen definiert, die notwendig ist, um 50% Agglutinierung
in einem standardisierten Hämagglutinin-Test
mit roten Blutzellen von Küken
zu bewirken. Vergleichende Daten zeigen, dass gereinigte rHA0-Antigene
rote Blutzellen mit einer Wirksamkeit agglutinieren, die jener vergleichbar
ist, die mit den vollständigen
Influenza-Virionen beobachtet wird.
-
Das
rekombinante HAO kann an der Disulfidbrücke gespalten werden, was eine
Konformationsänderung
bedingt, die in der Bildung von zwei Ketten, HA1 und HA2, mündet, wie
von Carr, C. M. und Kim, P. S., "A
Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza
Hemagglutinin",
Cell 73: 823–832 (1993)
beschrieben wurde. Spaltung von rekombinantem HAO wird nachstehend
in Beispiel 6 genauer beschrieben. Man nimmt an, dass die Ketten
durch die Spaltung von natürlichem
HAO in HA1 und HA2 infektiös werden,
indem sie dadurch die Fähigkeit
erwerben, mit einer Zelle zu fusionieren, womit sie eine verstärkte Immunantwort
hervorrufen. Die Prozessierung von Antigenen wie etwa Influenza-Hämagglutinin
geschieht durch die Bindung von Antigen-Peptiden an Haupthistokompatibilitäts-Moleküle (MHC).
Der Antigen/MHC-Komplex wird von T-Zellen erkannt und leitet eine
Immunantwort ein, wie in dem Überblick
von Harding und Geuze, Current Opinion in Cell Biology 5: 596–605 (1993)
beschrieben. Das in einem Baculovirus produzierte rHA0 ist jedoch
hochstabil und immunogen wie das intakte Molekül.
-
Vergleich
der Zuckermoleküle
auf dem HAO, das in Insektenzellen exprimiert wird, zeigt, dass
die Glycane sich von denen unterscheiden, die auf dem HAO in Säuger- oder Vogelzellen
exprimiert werden.
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Herstellung von Fusionsproteinen
-
Fusionsproteine,
die aus dem HAO fusioniert mit einem zweiten, antigen wirkenden
Protein bestehen, können
hergestellt werden, wobei die antigene Aktivität des zweiten Proteins gering
ist oder es Vorteile gibt, eine Immunantwort auf multiple Antigene
hervorzurufen. Ein Beispiel für
ein bevorzugtes zweites Antigen ist die Neuraminidase, produziert
durch Influenza. Das Antigen kann aus einem zellulären, viralen
oder bakteriellen Protein oder dem antigen wirkenden Teil hiervon
bestehen, der mindestens fünf
bis acht Aminosäuren
umschließt.
Andere Antigene schließen
das Hepatitis B-Antigen, HIV-Antigene und carcinoembryonisches Antigen
ein. Eine „Immunantwort" betrifft, wie hierin
verwendet, entweder eine humorale Antwort, gemessen an der Produktion
von Antkörpern
gegen das Antigen, oder eine zelluläre Antwort, gemessen am Hervorrufen
einer T-Zell-vermittelten Antwort auf das Antigen. In einigen Fällen kann
ein "Linker" aus nicht antigen
wirkenden Aminosäuren
zwischen das HA und das Antigen geschoben sein, um die Antigenität des Antigens
im Vergleich zum HA weiter zu verstärken. Der Prozess beinhaltet
die Konstruktion eines DNA-Plasmids, um Ziel-Antigengene mit dem
Vollängen-
oder mit Fragmenten des HA-Gens des Influenzavirus zu fusionieren,
wobei die Verfahren der Oligonucleotid-Sonden und der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) verwendet werden.
-
Die
HA-Zielantigen-Fusionsgene werden für eine ordnungsgemäße Expression
in Insektenzellen verändert,
indem die natürlichen
hydrophoben Signalpeptid-Sequenzen
deletiert und durch ein neues Baculovirus-Signalpeptid ersetzt werden.
Das Fusionsgen wird in den Baculovirus-Expressionsvektor eingebracht,
so dass der Polyhedron-Promotor des Baculovirus die Transkription
des Fusionsproteins in infizierten Insektenzellen steuert. Das Baculovirus-Signalpeptid
mit einer Länge
von 18 Aminosäuren
steuert die Translation des HA-Zielantigen-Fusionspolypeptids in
den Glycosylierungsstoffwechselweg der Insektenzelle und ist bei
dem reifen Fusionsprotein nicht anwesend.
-
Zum
Beispiel wurde Plasmid pA9440, der das HA-Gen des Stammes A/Beijing/32/92
in dem nachstehend beschriebenen pMGS12-BaculovirusTransferplasmid
enthält,
als eine Matrize für
die Amplifizierung des HA-Gens durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung
des vom Hersteller empfohlenen Protokolls (Gene Amp PCR-Clonierungskit,
Perkin Elmer Cetus) verwendet. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt
20 pMol an Primern, die zur Anheftung an Teile der HA-Gene entworfen
worden waren. Die 5'-
und 3'-Primer enthielten
Stellen für
Restriktionsendonucleasen an den Enden, die nicht innerhalb des
HA-Gens gefunden wurden. Der 5'-PCR-Primer
(O-567) für
die HAO- und HA1-Fragmente beginnt 52 Basenpaare stromabwärts vom
5'-Ende der natürlichen
Codierungssequenz des HA-Gens, wobei die natürliche Signalpeptid-Sequenz
deletiert wird, und fügt
eine SmaI-Stelle direkt 5' an
die HA-Codierungssequenzen an. Der 5'-PCR-Primer (O-651) für das HA2-Fragment
beginnt am Nucleotid 1108 des natürlichen HA-Gens, direkt auf
das Codon folgend, das den Arginin-Rest codiert, der während der
Spaltung von HAO in HA1 und HA2 entfernt wird. Der 3'-PCR-Primer (O-680) für die HAO- und HA2-Fragmente
wurde entworfen, um eine KpnI-Stelle direkt nach den HA-Codierungssequenzen
hinzuzufügen,
was das natürliche
Stoppcodon entfernt. Der 3'-PCR-Primer
für HA1
(O-679) verkürzt
das Gen direkt vor dem Arginin-Rest, der während der HAO-Spaltung entfernt
wird. Amplifizierung des HA-Genfragmentes wurde über 30 Zyklen durchgeführt, jeder
bestehend aus 1 min bei 94°C zur
Denaturierung, 2 min bei 55°C
zur Anheftung der Primer und 2 min bei 72°C zur Extension. Die entstandenen
amplifizierten HA-Genfragmente
wurden der Elektrophorese auf Agarosegelen unterworfen, unter Verwendung
eines GeneClean-Kits (Bio 101, Inc.) vom Gel gereinigt und in ein
zur Aufnahme von PCR-erzeugten Fragmenten entworfenes Plasmid (pCRII;
Invitrogen) ligiert. Auf diese Weise wurden die Plasmide pB142, pB144
und pB330 erhalten, die die HAO-, HA1- bzw. HA2-Genfragmente enthielten.
-
Die
HA-Genfragmente wurden aus den Plasmiden pB142, pB144 und pB330
mit SmaI- und KpnI-Restriktionsenzymen entfernt und dann mit Standardtechniken
für rekombinante
DNA (Sambrook et al., 1989) in das AcNPV-Transferplasmid pMGS12
subcloniert. Das pMGS12-Plasmid umfasst, vom 5'- zum 3'-Ende, den AcNPV-Polyhedron-Promotor, ein ATG-Initiationscodon,
die Sequenz für
ein abspaltbares Signalpeptid von einem Baculovirus-Glycoprotein
mit einem Molekulargewicht von 61.000 (61K), SmaI- und KpnI-Restriktionsenzym-Clonierungsstellen
und eine universelle TAA-Stoppcodon-Sequenz. Diese Regulationsregionen
werden von DNA aus dem EcoRII-Fragment aus dem AcNVP-Genom flankiert
(Summers und Smith, "A
manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture
procedures". Texas
Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987)). Die
clonierten HA-PCR-Fragmente
wurden mit SmaI und KpnI aus dem pCRII-Clonierungsvektor ausgeschnitten,
mit Agarosegel-Elektrophorese und dem GeneClean-Kit gereinigt und
in pMGS12 ligiert, das gleichfalls mit SmaI und KpnI gespalten worden
war. Die entstandenen AcNPV-Transferplasmide, pB879, pB1201 und
pB1205 enthielten die Codierungsregionen für HAO, HA1 bzw. HA2, im Rahmen
verbunden mit dem abspaltbaren Baculovirus-Signalpeptid vom 61K-Gen
und dem Polyhedron-Promotor.
Die AcNPV-Transferplasmide pB879, pB1201 und pB1205 können verwendet
werden, um HAO, HA1 oder HA2 mit jedem Gen von Interesse zu fusionieren.
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Der
zweite Schritt bei der Konstruktion von Transferplasmiden für HA-CEA-Fusionsgene bestand
darin, die CEA-Codierungssequenz in die HA-codierenden Konstruktionen
zu inserieren. Stellen für
Erkennung/Abspaltung von Restriktions-Endonucleasen für SmaI und KpnI wurden durch
PCR-Amplifizierung des Plasmids pA9080 an beiden Enden des CEA-Gens
platziert. Der 5'-Primer,
O-649, beginnt 82 Basenpaare vom 5'-Ende des Gens entfernt und deletiert
die natürliche
CEA-Signalpeptid-Sequenz.
Der 3'-PCR-Primer,
O-650, wurde entworfen, um die letzten 72 Basenpaare am 3'-Ende des Gens, das
die Sequenz der hydrophoben C-terminalen
Region codiert, zu deletieren. Amplifizierung des CEA-Genfragmentes
wurde in 30 Zyklen durchgeführt,
von denen jeder 1 min bei 94°C
zur Denaturierung, 2 min bei 55°C
zur Wiederanheftung und 2 min bei 72°C zur Extension umfasste. Das
entstandene amplifizierte CEA-Genfragment wurde der Elektrophorese
auf einem Agarose-Gel unterworfen, mit dem GeneClean-Verfahren gereinigt
und nach Angaben des Herstellers in pCRII (Invitrogen) ligiert.
Das entstandene Plasmid, pB806, enthält das CEA-Gen ohne sein natürliches
Signalpeptid, eine C-terminale hydrophobe Domäne oder ein Stoppcodon, aber
sowohl mit SmaI- als auch KpnI-Stellen
an beiden Enden des Gens.
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Eine
Plasmid-Herstellung in großem
Umfang wurde mit dem pB806-Plasmid durchgeführt, und die DNA wurde entweder
mit SmaI oder KpnI gespalten. Die CEA-codierenden Fragmente wurden
durch Agarose-Gelelektrophorese und den GeneClean-Kit gereinigt,
und die gereinigten Fragmente wurden in jedes der drei HA-codierenden
Konstruktionen (pB879, pB1201 oder entsprechend pB1205), die mit
dem selben Restriktionsenzym gespalten worden waren, ligiert. Zum
Beispiel wurden CEA-codierende Fragmente mit SmaI-gespaltenen Enden
in die HAO-, HA1- und
HA2-codierenden Konstruktionen (pB879, pB1201 bzw. pB1205) ligiert,
die mit SmaI geschnitten worden waren, um die Plasmide pB1250, pB1555
bzw. pB1584 zu erzeugen. CEA-codierende Fragmente mit KpnI-geschnittenen
Enden wurden in die HAO-, HA1- und HA2-codierenden Konstruktionen,
die mit KpnI geschnitten worden waren, ligiert, um pB1264, pB1564
bzw. pB1593 zu erzeugen. Insertion des CEA- Gens an der SmaI-Stelle platzierte die
CEA-codierende Sequenz stromabwärts
der HA-codierenden Sequenz. Für
alle Konstruktionen wurden die PCR-Primer so entworfen, dass das
EA-Gen im Rahmen mit HA inseriert war und die Translation des Fusionsgens
am universellen Signal zur Translationsterminierung (TAATTAATTAA)
(Sequenz ID NO: 4) in den pMGS12-Vektorsequenzen stromabwärts der
KpnI-Stelle beendet werden würde.
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Diese
Konstruktion kann durch Deletion der dazwischen liegenden Aminosäuren, entweder
zwischen dem Signalpeptid und HAO, wie nachstehend beschrieben,
oder zwischen dem HAO und dem Fusionsgen, verbessert werden, um
Faltung und Immunogenität
zu verstärken.
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Formulierung und Verpackung
von Impfstoffen
-
Das
rHA kann unter Verwendung von Verfahren und Materialien, die dem
Fachmann auf dem Gebiet der Influenza-Impfstoffe bekannt sind, allein
oder in Kombination mit anderen Influenza-Antigenen formuliert und
verpackt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden HA-Proteine
von zwei A-Stämmen
und einem B-Stamm kombiniert, um einen multivalenten Impfstoff zu
erhalten.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden die HAs mit einem Adjuvans in einer Menge kombiniert, die
die immunogene Antwort gegen die HA-Proteine wirksam erhöht. Zur Zeit ist das einzige
Adjuvans, das weithin beim Menschen verwendet wird, Alaun (Aluminiumphosphat
oder Aluminiumhydroxid). Saponin und sein gereinigter Bestandteil
Quil A, vollständiges
Freundsches Adjuvans und andere Adjuvanzien, die in Forschungs-
und veterinären
Anwendungen verwendet werden, weisen Toxizitäten auf, die ihre möglichen
Verwendungen in menschlichen Impfstoffen begrenzen. Neue chemisch
definierte Präparate
jedoch, wie etwa Muramyldipeptid, Monophosphoryllipid A, Phospholipid-Konjugate wie etwa
jene, die von Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147: 410–415 (1991)
beschrieben werden, Einkapselung des Proteins in einem Proteoliposom,
wie von Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739–1744 (1992) beschreiben, und
Einkapselung des Proteins in Lipidvesikel wie etwa NovasomeTM-Lipidvesikel (Mikro Vascular Systems,
Inc., Nashua, NH) sollten ebenfalls nützlich sein.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
ist der Impfstoff in einer einzelnen Dosierungseinheit zur Immunisierung
durch parenterale (d. h. intramuskuläre, intradermale oder subkutane)
Verabreichung oder nasopharyngeale (d. h. intranasale) Verabreichung
verpackt. Die wirksame Dosis wird, wie in den nachstehenden Beispielen
beschrieben, bestimmt. Der Trägerstoff
ist gewöhnlich
Wasser oder eine gepufferte Kochsalzlösung, mit oder ohne Zusatz
eines Konservierungsmittels. Das Antigen kann zur Resuspension zum
Zeitpunkt der Verabreichung oder in Lösung lyophilisiert sein.
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Der
Trägerstoff
kann auch ein Polymersystem zur verzögerten Freisetzung sein. Synthetische
Polymere sind besonders zur Formulierung eines Impfstoffes geeignet,
um die kontrollierte Freisetzung des Antigens zu bewirken. Ein frühes Beispiel
hierfür
war die Polymerisation von Methylmethacrylat in Kugeln mit Durchmessern
von weniger als einem Mikron, um so genannte Nanopartikel zu bilden,
berichtet von Kreuter, J. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine
and Pharmacology, M. Donbrow (Hrsg.) CRC Press, S. 125–148. Sowohl
die Antikörperantwort
als auch der Schutz gegen Infektion mit dem Influenzavirus war signifikant
besser als bei Verabreichung des Antigens in Kombination mit Aluminiumhydroxid.
Experimente mit anderen Partikeln haben gezeigt, dass die Adjuvans-Wirkung
dieser Polymere von Partikelgröße und Hydrophobie
abhängig
ist.
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Mikroverkapselung
wurde bei der Injektion von mikroverkapselten pharmazeutischen Stoffen
angewendet, um eine kontrollierte Freisetzung zu erreichen. Eine
Reihe von Faktoren trägt
zur Auswahl eines bestimmten Polymers zur Mikroverkapselung bei.
Die Reproduzierbarkeit der Polymersynthese und der Prozess der Mikroverkapselung,
die Kosten der Mikroverkapselung, Materialien und Verfahren, das
toxikologische Profil, die Erfordernisse für variable Freisetzungskinetik
und die physikochemische Verträglichkeit
des Polymers und der Antigene sind alles Faktoren, die berücksichtigt
werden müssen.
Beispiele für
nützliche
Polymere sind Polycarbonate, Polyester, Polyurethane, Polyorthoester
und Polyamide, besonders solche, die biologisch abbaubar sind.
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Häufig wird
als Trägerstoffes
für pharmazeutische
Stoffe und seit einiger Zeit für
Antigene Poly(d,1-lactid-co-glycolid) (PLGA) gewählt. Dies ist ein biologisch
abbaubarer Polyester, der eine lange Tradition medizinischer Verwendung
bei abbaubaren Nähten,
Knochenplatten und anderen zeitlich begrenzten Prothesen aufweist,
bei denen er keinerlei Toxizität
zeigte. Eine Vielzahl von pharmazeutischen Stoffen, einschließlich Peptiden
und Antigenen, sind in PLGA-Mikrokapseln formuliert worden. Datensammlungen
zur Adaptation von PLGA für
die kontrollierte Freisetzung von Antigen liegen vor, zum Beispiel
im Überblick
von Eldridge, J. H., et al., Current Topics in Microbiology and
Immunology, 146: 59–66
(1989). Es hat sich herausgestellt, dass der Einschluss von Antigenen
in PLGA-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 10 Mikron eine
bemerkenswerte Adjuvans-Wirkung hat, wenn sie oral verabreicht werden.
Das Verfahren zur PLGA-Mikroverkapselung verwendet eine Phasentrennung
einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
Die Verbindung von Interesse wird als eine wässrige Lösung hergestellt, und der PLGA
wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie etwa Methylenchlorid
und Ethylacetat gelöst.
Diese beiden nicht vermischbaren Lösungen werden durch Rühren mit hoher
Geschwindigkeit co-emulgiert. Ein Nicht-Lösungsmittel für das Polymer
wird dann zugegeben, was die Fällung
des Polymers rund um die wässrigen
Tropfen zur Folge hat, um die embryonischen Mikrokapseln zu bilden.
Die Mikrokapseln werden gesammelt und mit einem Agens aus einer
Reihe von Agenzien (Polyvinylalkohol (PVA), Gelatine, Alginate,
Polyvinylpyrrolidon (PVP), Methylcellulose) stabilisiert, und das
Lösungsmittel wird
entweder durch Trocknung im Vakuum oder Lösungsmittelextraktion entfernt.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden den Schutzumfang
nicht einschränkenden Beispiele
weiter verdeutlicht.
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Beispiel 1: Vermehrung und Reinigung von
Influenzaviren.
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Die
nachstehenden Influenza-Impfstoffstämme wurden von der FDA in Allantoinflüssigkeit
von Hühnereiern
erhalten.
A/Beijing/353/89-artig (H3N2)
A/Beijing/32/92-artig
(H3N2)
A/Texas/36/91-artig (H1N1)
B/Panama/45/90
-
Um
die von der FDA erhaltene ursprüngliche
Stammlösung
an Influenzaviren zu vermehren, wurden MDCK-Zellen in Anwesenheit
von TPCK-behandeltem Trypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
infiziert und die Konzentration an fötalem Rinderserum optimiert,
um die höchsten
Titer für
Viren der ersten Passage zu erhalten. Die MDCK-Zellen wurden mit
den Influenza-Stämmen
bei einer niedrigen Multiplizität
der Infektion (0,1 bis 0,5) infiziert, wie durch einen Standard-HA-Test
(Rosen, "Hemagglutination
with Animal Viruses" in Fundamental
Techniques in Virology, Hrsg. K. Nabel und N. P. Salzmann, S. 276–28 (Academic
Press, New York 1969)) nachgewiesen wurde. Die infizierten Zellen
wurden bei 33°C über 48 h
inkubiert, und das Kulturmedium wurde unter Verwendung des Tests
zur Aktivität
der Hämagglutinierung
auf Virusproduktion untersucht. Die Bedingungen, die die höchste HA-Aktivität ergaben,
wurden verwendet, um eine große
Menge an Stammlösung
des Influenzavirus herzustellen. Die optimalen Konzentrationen an
TPCK-Trypsin und fötalem Rinderserum
für die
vorstehend genannten Influenzaviren sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle
1. Optimale Konzentration von TPCK-Trypsin und fötalem Rinderserum.
| A/Beijing/353/89 | A/Beijing/32/92 | A/Texas/36/91 | B/Panama/45/90 |
% fötales Rinderserum | 0.25% | 0.25% | 0.25% | 5.0% |
Menge
an TPCK-behandeltem Trypsin | 45 μ/ml | 45 μg/ml | 45 μ/ml | 3 μ/ml |
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Reinigung
des Influenzavirus: Das Virus wurde 24–48 Stunden nach Infektion
aus 10 T175-Gewebekulturflaschen durch Klärung des Kulturmediums (1.000 × g über 10 Minuten)
aus mit Influenza infizierten MDCK-Zellen gewonnen. Das Virus wurde
bei 100.000 × g über 1 Stunde
aus dem Kulturmedium ausgefällt. Der
erhaltene Virus-Niederschlag
wurde in 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, resuspendiert
und durch einen 20 ml 20–60%
(Gew./Vol.) Saccharosegradienten in PBS zentrifugiert. Die Influenzavirus-Bande
wurde aus der 40–45%-Saccharose-Region des Gradienten
gewonnen, mit PBS verdünnt
und mit 100.000 × g
gefällt.
Der gereinigte Virus-Niederschlag wurde in 0,5 ml PBS resuspendiert
und bei –70°C gelagert.
-
Beispiel 2: Clonierung des HA-Gens von
Influenza A/Texas/36/91.
-
Ein
spezifisches Beispiel für
den Clonierungsschritt für
eines der Influenza-HA-Gene wird in 2 dargestellt.
Virale RNA wurde, wie vorstehend beschrieben, aus Influenza A/Texas/36/91
extrahiert, das vom CDC bezogen worden war. Der universelle Primer,
komplementär
zum 3'-Ende der
Influenza-RNA-Segmente 5'- AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1) wurde
mit der reversen Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus
(M-MuLV) verwendet, um Influenza-cDNAs zu erzeugen. Gereinigte virale
RNA oder mRNA (5 μg)
wurde als eine Matrize verwendet, um cDNA unter Verwendung von reverser
Transkriptase von M-MuLV, die mit dem First-Strand cDNA Synthesis
Kit von Pharmacia Inc. geliefert wird, herzustellen. Der Primer,
der für
cDNA von viraler RNA von Influenza A-Stämmen verwendet wurde, war ein
synthetischer Oligonucleotid-Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID NO: 1),
der mit dem 3'-Ende
aller Virion-HA-Gensegmente
homolog ist.
-
Amplifizierung
der HA-Gene von der cDNA wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion
unter Verwendung von Standard-Reaktionsbedingungen (Gene-Amp-Kits;
Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt. Das PCR-Reaktionsgemisch
(100 μl)
enthielt 20 pMol Primer, die für
5'- und 3'-Enden des HA-Gens
von Influenza A (H3) oder A (H1) oder Influenza B-Stämmen spezifisch
waren, was durch Konsensus-Sequenzen aus DNA-Datensätzen der
GenBank bestimmt wurde, wie in Tabelle 2 dargestellt. Amplifizierung
wurde in 30 Durchgängen
durchgeführt,
wobei jeder Durchgang aus 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 2 Minuten
bei 55°C zur
erneuten Anheftung und 3 Minuten bei 72°C zur Extension bestand. Die
PCR-Produkte wurden
vor der Clonierung auf 0,8% Agarosegelen auf die richtige Größe untersucht.
-
PCR-Primer
vom 5'-Ende des
HA-Gens:
-
(SEQ
ID NO: 2) und vom 3'-Ende
des HA-Gens:
-
(SEQ
ID NO: 3) wurden bei der PCR verwendet, um das HA-Gen in voller
Länge zu
erhalten.
-
Ein
neuer 5'-PCR-Primer
wurde vom 5'-Ende
des Gens entworfen: 5'-Ende
minus Signalsequenz:
-
(SEQ ID NO: 4) und das 3'-Ende des Gens:
-
(SEQ
ID NO: 5). Diese wurden in der PCR verwendet, um das HA-Gen minus
der Signalpeptid-Sequenz zu erhalten. Dies wurde dann in den mit
KpnI geschnittenen TA-Vektor inseriert. Das 61K-Signalpeptid zur
Baculovirus-Expression und der Polyhedrin-Promotor wurden in den
TA-Vektor inseriert, der das HA-Gen minus der Influenza-Signalpeptid-Sequenz
umfasste. Der resultierende Baculovirus-Rekombinationsvektor umfasst den Polyhedrin-Promotor,
das 61K-Baculovirus-Signalpeptid
und das HA-Gen für
Influenza A/Texas/36/91.
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HA-Gene
von Influenza B-Stämmen
wurden aus vollständiger
Boten-RNA (mRNA) extrahiert, aus MDCK-Zellen cloniert, die mit dem
Influenza B-Stamm B/Panama/45/90 infiziert worden waren. Vollständige RNA
wurde aus 5 T175-Flaschen
mit infizierten Zellen gewonnen. Die geernteten Zellen wurden in
Anwesenheit von Guanidiniumthiocyanat lysiert, und vollständige Zell-RNA
wurde, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Vollständige mRNA
wurde unter Verwendung von Oligo-(dT)-Cellulose-Zentrifugationssäulen extrahiert, wie
vorstehend beschrieben.
-
Der
für mRNA
aus Influenza B-Stämmen
verwendete Primer war ein zufälliger
Oligonucleotid-DNA-Primer (Pharmacia, Inc.).
-
Tabelle
2. Primer, die bei der PCR-Amplifizierung verwendet wurden.
-
-
Ein
Beispiel für
cDNA-Syntheseprodukte verwendete die virale RNA von Influenzavirus
A/Texas/3691 als eine Matrize. Die Lokalisierung der cDNA-Segmente, die die
Influenza-Proteine codieren, konnte in nachstehender Weise bestimmt
werden. Gereinigte virale RNA wurde im Reaktionsgemisch mit dem
universellen einzelsträngigen
DNA-Primer 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1) kombiniert.
Dieser Primer ist zum 3'-Ende
der Segmente des Influenza-Virions komplementär, wie vorstehend beschrieben.
Die Reaktion enthielt auch den Zusatz von [α-32P]dCTP,
um die cDNA-Produkte sichtbar zu machen, die auf 1,5% alkalischem
Hydrolyse-Gel (Maniatis, et al., (1982)) aufgetrennt und X-OMAT-AR-Filmmaterial ausgesetzt
worden waren.
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Beispiel 3: Clonierung von HA-Genen in
bakterielle Plasmide.
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Die
mittels PCR amplifizierten rHA-Gene wurden unter Verwendung des
TA-Cloningsystem
(Invitrogen, Inc.) in einen pUC-ähnlichen
Plasmid-Vektor cloniert. Die Anwesenheit der HA-Gene wurde durch
Analyse der Plasmid-DNA, die mit Standardverfahren gereinigt worden
war (Maniatis et al., 1982), durch Spaltung mit Restriktionsenzymen
bestätigt.
Die 5'-Enden der
rHA-Gene wurden dann durch DNA-Sequenzierung analysiert, und neue
Primer wurden entworfen, um die Sequenzen zu entfernen, die die
hydrophoben Signalpeptide am N-terminalen Ende der HA-Proteine codieren.
Die in Tabelle 2 angeführten,
spezifischen 5'-
und 3'-Oligonucleotid-Primer
wurden dann verwendet, um cDNA-Produkte mittels PCR zu amplifizieren,
und wurden mit Hilfe von Standard-Clonierungsverfahren in TA-Plasmid-Vektoren
von E. coli (Invitrogen, Inc.) cloniert. Die resultierenden DNA-Clone enthielten
Codierungssequenzen für
die reifen HAs.
-
Die
rHA-Gene von A/Texas/36/91, A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 und
B/Panama/45/90 wurden mit Standardverfahren (Maniatis et al., 1982)
in Baculovirus-Expressionsvektoren subcloniert. Die HA-Gene wurden
aus den TA-Clonierungsplasmiden
mit den geeigneten Restriktionsenzymen entfernt, und das gereinigte HA-DNA-Fragment
wurde in ein Baculovirus-Rekombinationsplasmid inseriert. Die erhaltenen
Bakterienclone wurden auf Ampicillin-Resistenz durchmustert und
dann mit Restriktionsenzymen geschnitten, um das inserierte HA-Gen freizusetzen,
um seine Anwesenheit nachzuweisen. Die Rekombinationsplasmide, die
die HA-Gene enthielten, wurden auf Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt
(Maniatis et al., 1982). Das 5'-Ende
der Plasmide wurde sequenziert, um die Anwesenheit der richtigen
Baculovirus-Signale (AcNPV-Polyhedrin-Promotor,
ATG-Translationsstartsignal und Baculovirus-Signalpeptid sequenz)
und der vollständigen
HA-Codierungssequenz im richtigen Leserahmen nachzuweisen. Die DNA-Sequenzen
am 5'-Ende der HA-Gene
und der flankierende AcNPV-Polyhedrin-Promotor und das Baculovirus-Signalpeptid
(die ersten 18 Aminosäuren
von jeder Aminosäuresequenz)
sind im SEQUENZPROTOKOLL angegeben.
-
SEQ
ID NO: 6 codiert die 5'-Endsequenz
des HA-Gens für
A/Beijing/32/92 (Sequenzbereich 1–481). SEQ ID NO: 7 ist die
dazu gehörige
Aminosäuresequenz
(beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 19] der SEQ
ID NO: 6). Die Aminosäuresequenz
des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 7 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
-
SEQ
ID NO: 8 codiert die 5'-Endsequenz
des HA-Gens für
A/Texas/36/91 (Sequenzbereich 1–481). SEQ
ID NO: 9 ist die dazu gehörige
Aminosäuresequenz
(beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 19] der SEQ
ID NO: 8). Die Aminosäuresequenz
des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 9 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
-
SEQ
ID NO: 10 codiert die 5'-Endsequenz
des HA-Gens für
B/Panama/45/90 (Sequenzbereich 1–434). SEQ ID NO: 11 ist die
dazu gehörige
Aminosäuresequenz
(beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 21] der
SEQ ID NO: 10). Die Aminosäuresequenz
des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 11 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
-
In
den SEQ ID NO: 6, 8 und 10 stellen die Nucleotide 1–20 das
3'-Ende des Polyhedrin-Promotors
dar, die Nucleotide 21–74
codieren das 61K-Signalpeptid und die Nucleotide 75 bis zum Ende
codieren das 5'-Ende des
HA-Gens.
-
Beispiel 4: Expression von rekombinantem
HA in Insektenzellen.
-
Die
chimären
Rekombinationsplasmide, die clonierte HA-Gene enthalten, wurden
gereinigt, und 2 μg wurden
mit 1 μg
der AcNPV-DNA des Wildtyps vermischt. Die DNAs wurden zusammen mit
Calcium ausgefällt und
unter Verwendung von Standardverfahren (Smith, Summers und Fraser,
Mol. and Cell. Biol. 3: 2156–2165 (1983))
in Zellen von S. frugiperda transfiziert. Rekombinante Baculoviren
wurden auf Grund von Plaque-Morphologie identifiziert und dann durch
zusätzliche
Runden der Plaque-Reinigung weiter gereinigt. Plaque-gereinigte
rekombinante Baculoviren wurden auf Expression von rHA durchmustert,
und ein einzelner Baculovirus-Expressionsvektor
wurde zur weiteren Entwicklung ausgewählt.
-
Zellen
von S. frugiperda wurden mit einem Baculovirus-Vektor infiziert,
der das HA-Gen vom
Influenza-Stamm B/Panama/45/90 enthielt. 24, 48 und 72 Stunden nach
der Infektion wurden 1 × 106 Zellen mit 25 μCi [35S]Methionin über 15 Minuten
gepulst, um die gerade synthetisierten Proteine zu markieren. Die
Zellen wurden gesammelt, und die Proteine wurden auf einem 11%-Polyacrylamid-Gel
in Anwesenheit von 0,1% SDS getrennt. Die radiomarkierten Proteine
wurden durch Belichtung von X-OMAT-AR-Filmmaterial nachgewiesen. Die
Lage von Proteinstandards und ihre Größe in Kilodalton (kd) zeigten
an, dass das rekombinante HA-Protein mit einer Größe von 85
kd eines der Hauptproteine ist, die in den Zellen 48 Stunden und
72 Stunden nach der Infektion synthetisiert werden.
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Beispiel 5: Herstellung und Reinigung
von rekombinantem HA.
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Der
Baculovirus-Expressionsvektor A8611, der das Gen für Influenza
A/Beijing/353/89 enthält
und im Wesentlichen, wie vorstehend für A/Beijing/32/92 Hämagglutinin
unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors beschrieben, hergestellt
worden war, wurde verwendet, um Zellen von S. frugiperda zu infizieren.
Die Zellen wurden bei 27°C
bis zu einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in TNMFH-Kulturmedium (Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) gezüchtet,
das mit 10% fötalem
Rinderserum angereichert war, und wurden mit einer Multiplizität der Infektion
(MOI) von 1 mit dem rekombinanten Baculovirus A8611 infiziert. Während der
Infektion wird das Hämagglutinin
von Influenza A/Beijing/353/89 unter der Transkriptionskontrolle
des Polyhedrin-Promotors vom Baculovirus produziert. Die Zellen
werden 72 Stunden nach Infektion durch Zentrifugation über 15 Minuten
bei 3.400 × g
geerntet und durch Resuspension in serumfreiem TNMFH-Kulturmedium
gewaschen und anschließend über 30 Minuten
bei 10.400 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wird abgegossen, und die Niederschläge der infizierten Zellen werden
bei –70°C gelagert.
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Ein
Verfahren wurde entwickelt, mit dem das rekombinante HA selektiv
aus den infizierten Zellen unter Bedingungen extrahiert wird, die
das Antigen nicht denaturieren. Soweit nicht anders angegeben, werden
alle Extraktionsschritte bei 4°C
durchgeführt.
Der Zellniederschlag aus 0,5 l der Kultur (etwa 5 × 108 Zellen) wurde über 2 Minuten in 40 ml eisgekühltem 30
mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 1% (Vol./Vol.) Tween-20, 1 mg/ml Leupeptin
unter Verwendung eines PolytronTM-Homogenisators (Brinkmann
Instruments Inc. Westbury, NY) aufgebrochen. Das Homogenat wurde über 30 Minuten
bei 9.200 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und der Niederschlag gesammelt. Dieser Schritt entfernt
lösliche
und periphere Membranproteine aus den Insektenzellen, ohne die integralen
Membranproteine wie rHA zu extrahieren. Um das rHA zu extrahieren, wurde
der Niederschlag über
2 Minuten auf Stufe 4 in 40 ml eisgekühltem 30 mM Tris, 10 mM Ethanolamin, pH
11, 25 mM LiCl, 2% Tween-20 homogenisiert. Nach einer Inkubation
von 60 Minuten auf Eis wurde der pH-Wert des Homogenats mit 1 N
HCl auf 8,4 eingestellt, und unlösliches
Material wurde durch Zentrifugation über 30 Minuten bei 9.200 × g entfernt.
Der das lösliche
rHA enthaltende Überstand
wurde abgegossen, und der pH wurde überprüft und, falls notwendig, auf
8,4 bei Zimmertemperatur eingestellt. Das unlösliche Material wurde zur Analyse
in 40 ml Wasser resuspendiert. Das integrale Membranprotein HA wurde
unter den Bedingungen von hohem pH-Wert und Tween-20-Detergenzbedingungen
solubilisiert, und bleibt in Lösung,
nachdem der pH-Wert gesenkt wurde.
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Die
Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Die Proben wurden in einem 10-minütigen Bad mit kochendem Wasser
in Anwesenheit von 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5% beta-Mercaptoethanol
aufgebrochen, dann der Elektrophorese auf einem 11% Polyacrylamidgel
in Anwesenheit von 0,1% SDS unterworfen, dann mit Coomassie-Blau
angefärbt.
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Ein
chromatographisches Verfahren zur Reinigung wurde entwickelt, um
rekombinantes HA zu reinigen, das zu einem hoch gereinigten rekombinanten
HA-Antigen führt, das
nicht denaturiert ist und als ein Bestandteil eines influenza-Impfstoffes für die Verwendung
beim Menschen geeignet ist. Das nachstehend beschriebene Verfahren
wurde verwendet, um das HA von A/Beijing/353/89 aus Zellen von S.
frugiperda, die mit dem rekombinanten Virus A8611 infiziert waren,
zu reinigen.
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Die
Chromatographiegel-Matrices, die zur Reinigung von HA aus 0,5 l
an infizierten Zellen von S. frugiperda verwendet wurden, waren
30 ml DEAE-Sepharose Fast Flow von Pharmacia (in einer C16/20-Säule von
Pharmacia) und 4 ml Lentil-Lectin-Sepharose 4B von Pharmacia (in einer
C10/10-Säule
von Pharmacia). Der Auslass der DEAE-Säule ist mit dem Einlass der
Lentil-Lectin-Säule
verbunden, und der, wie vorstehend beschrieben, hergestellte S/N
2-Zellextrakt wurde mit einer Flussrate von 1 ml/Minute auf die
verbundenen Säulen
aufgetragen. Die Säulen
wurden mit 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20 gewaschen, bis
die UV-Absorption bei 280 nm des Lentil-Lectin-Ausflusses zur Grundlinie
zurückkehrte.
Unter diesen Bedingungen binden die meisten der verunreinigenden
Proteine an DEAE, rekombinantes HA aber fließt durch die Säule. Die
verbleibenden Verunreinigungen fließen durch die Lectin-Säule, und
glycosyliertes rHA bindet an die Lentil-Lectin-Affinitätsmatrix. Die DEAE-Säule wird
abgekoppelt, und die Lectin-Säule
wird mit weiteren 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5%
Tween-20 gewaschen. Als nächstes
wird die Lectin-Säule mit
40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (Vol./Vol.) Natriumdesoxycholat
(DOC) gewaschen. Dieser Schritt ersetzt das Detergenz Tween-20 durch
ein Detergenz wie DOC, das durch Dialyse vom Protein entfernt werden
kann. Rekombinantes HA wird dann aus der Lectin-Säule mit
etwa 20 ml aus 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (Vol./Vol.)
Natriumdesoxycholat, die 0,3 M a-D-Methylmannosid enthalten, eluiert.
Die Ergebnisse werden mit Hilfe von 11% PAGE analysiert.
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Auf
Grund der genetischen Variabilität
der Influenza-HA-Proteine können
die Details des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens mit
jedem einzigartigen rekombinanten HA-Protein variieren. Zum Beispiel
kann das rHA an die DEAE-Ionenaustauschsäule binden,
anstatt hindurch zu fließen.
Sollte dies auftreten, würde
das rHA von der DEAE-Säule
durch Waschen der Säule
mit Pufferlösung,
die eine höhere
Konzentration an LiCl, NaCl oder anderen Salzen enthält, entfernt
werden.
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Um
das DOC-Detergenz und andere Bestandteile der Pufferlösung zu
entfernen, wurde das Eluat aus der Lectin-Säule, das das gereinigte rHA
enthielt, gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5 (PBS) dialysiert.
Das gereinigte rekombinante HA hatte eine Reinheit von mindestens
95%, was durch Analyse auf SDS-Polyacrylamidgelen bestimmt wurde.
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Beispiel 6: Analyse von rHA-Resistenz
gegenüber
Protease
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Reifes
HA ordnet sich in trimeren Strukturen an, die gegen eine Reihe von
Proteasen, einschließlich Trypsin,
die HA-Monomere abbauen, resistent sind (Murphy und Webster, 1990).
Resistenz gegenüber
Behandlung mit Trypsin kann daher als ein Test für die funktionale Trimerbildung
verwendet werden. Das nachstehende Verfahren wurde verwendet, um
die Resistenz von rHA gegenüber
Behandlung mit Protease zu untersuchen.
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Zwei
Aliquots an gereinigtem rHA (A/Beijing/353/89) zu 60 μg/ml wurden
auf Eis über
30 Minuten in 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 150 mM NaCl mit und ohne 50 μg/ml TPCK- behandeltem Trypsin
inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 57,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
in Isopropanol zu einer Endkonzentration von 1 mM gestoppt. Aliquots
von jeder Probe wurden durch Kochen in 3% SDS unter reduzierenden Bedingungen
denaturiert, der Elektrophorese auf 11,5% Polyacrylamidgelen unterzogen
und unter Verwendung von Standardverfahren der Western-Blot-Analyse
auf Nitrocellulosefilter übertragen.
Die HA-Polypeptide wurden unter Verwendung von Anti-HA-Serum vom
Meerschweinchen, das gegen gereinigtes HA hergestellt worden war,
und einem Konjugat aus Anti-Meerschweinchen-IgG
der Ziege und alkalischer Phosphatase nachgewiesen.
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Unbehandeltes
rHA wandert bei der Größe des HA-Vorläufers (HA0).
Behandlung mit Protease führt zu
zwei Hauptbanden, die bei den Größen wandern,
die für
Influenza-Hämagglutinin
HA1 und HA2 vorausgesagt worden waren. Die Ergebnisse zeigen, dass
Trypsin das rHA-Protein einmal spaltet, um zwei Polypeptide zu erzeugen,
die die Größen aufweisen,
die für
HA1 und HA2 vorausgesagt worden waren. Ein weiterer proteolytischer
Vorgang tritt nicht ein. Diese Ergebnisse zeigen, dass rHA, das
durch den vorstehend beschriebenen Prozess gereinigt wird, resistent
gegenüber
Abbau durch Protease ist. Diese Eigenschaft stimmt damit überein,
dass gereinigtes rHA in der Form von Trimeren vorliegt.
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Beispiel 7: Immunogenität von rHA
unter Verwendung des standardisierten Maus-Potenz-Test.
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Ein
Ansatz, die Immunogenität
eines Antigens zu messen, ist die Bestimmung der Menge, die notwendig
ist, eine nachweisbare Antikörperantwort
in Mäusen
hervorzurufen (Maus-Potenz-Test). Ein standardisierter Maus-Potenz-Test
wird verwendet, um die Immunogenität von rHA0-Impfstoff zu messen.
Gruppen aus 5–10
Mäusen
werden einmal mit Impfstoff immunisiert, der serielle Verdünnungen
von rHA enthält,
d. h. 0,500 μg,
0,1 μg,
0,02 μg
und 0,004 μg
gereinigtes rHA. Seren werden 28 Tage nach der Immunisierung gewonnen, und
Antikörper
gegen das rHA-Antigen werden in einer standardisierten enzymverbundenen
immunologischen Festphasen-Untersuchung
(ELISA) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemessen. Eine
Maus ist serumkonvertiert, wenn die OD450 bei einer Verdünnung von
1:100 der 28-Tage-Antiseren
größer ist
als drei Standardabweichungen vom Mittelwert der OD450 der Prä-Immunseren
der Mäuse.
Die wirksame Dosis des Impfstoffes, die benötigt wird, um Serumkonversion
von 50% der Mäuse
zu erreichen (ED50), ist ein Maß für die Immunogenität des Antigens.
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Zum
Beispiel werden vier Gruppen zu 10 Mäusen einmal mit entweder 0,1 μg, 0,02 μg, 0,004 μg oder 0,0008 μg (5-fache
Verdünnungen)
des rHA0-Impfstoffes immunisiert. Seren werden 28 Tage nach Immunisierung
gewonnen, und gegen jedes rHA0-Antigen im Impfstoff mit einem ELISA-Test
auf Serumkonversion untersucht. Die Dosis, die notwendig ist, um
bei 50% der Mäuse
eine Serumkonversion auszulösen
(ED50), wird berechnet, und eine Minimum-ED50 wird für
jedes rHA0-Antigen festgesetzt.
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Vorausgehende
Daten zeigen, dass eine einzelne Dosis von 0,004 μg rHA0 zu
einer Serumkonversion bei mindestens 50% der Mäuse führt.
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Beispiel 8: Verabreichung von rHA in Kombination
mit einem Adjuvans und Vergleich mit verfügbaren Influenza-Impfstoffen.
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Die
Wirksamkeit von gereinigtem rHA vom Influenza-Stamm A/Beijing/353/89
in der Maus wurde mit Alaun und ohne Alaun (rein) untersucht und
mit einem kommerziellen Influenza-Impfstoff, FLUZONE® (Connaught
Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) verglichen, der den Influenza-Stamm
A/Beijing/353/89 enthält.
Der Impfstoff wurde in einer Dosierung von 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg und 0,04 μg verabreicht. Die Mäuse erhielten an
Tag 28 mit der vorstehend beschriebenen Dosis an gereinigtem rHA
eine Auffrischungsimpfung. An Tag 42 wurden die Seren gewonnen und
in einem ELISA-Test wurde der Titer für Anti-HA-IgG-Antikörper bestimmt.
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Die
Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Bei Fehlen eines
Adjuvans induzierte nur eine Dosis von 0,5 μg die Erzeugung eines signifikanten
Antikörper-Titers
(200.000). Bei Anwesenheit eines Adjuvans erzeugte schon die geringe
Dosis von 0,004 μg
rHA0 signifikante Antikörpermengen.
Die Tiere, die mit rHA (rein) immunisiert worden waren, erzeugten
etwa die gleichen Spiegel an Anti-HA-Antikörpern wie der kommerzielle Impfstoff.
Alaun erhöhte
die Immunogenität
von rHA, und es wurden Anti-HA-Titer erzeugt, die 10-fach oder höher als
ohne Adjuvans waren.
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Zusammenfassend
zeigt der Vergleich der Immunogenität von gereinigten rHA0s mit
einem Influenza-Impfstoff aus dem ganzen Virion (FLUZONE® (Connaught
Laboratories, Inc. Swiftwater, PA), dass rHA0 eine ähnliche
Immunantwort in Mäusen über einen
Zeitraum von 42 Tagen hervorruft. Adsorption des rHA0 an Alaun erhöht die Immunogenität des gereinigten
rHA0 in Mäusen
signifikant, wie durch die in Beispiel 7 beschriebene Untersuchung
gemessen wurde. Die Kombination mit Alaun ruft eine höhere Anzahl
an IgG-Hämagglutinin-Antikörpern hervor
als die Influenza-Impfstoffe FLUZONE®.
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Beispiel 9: Studien zur Hemmung von Hämagglutinierung.
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Antikörper zur
Hemmung von Hämagglutinierung
(HAI) binden an drei von vier bekannten Epitopen auf dem Hämagglutinin
und blockieren die Fähigkeit
von Influenza, rote Blutzellen zu agglutinieren (Wilson et al., "Structure of the
hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A° resolution". Nature, 289: 366–378 (1981)).
Diese antigenen Determinanten sind rund um die Bindungsstelle des
Sialinsäurerezeptors auf
Hämagglutinin-Trimeren
gruppiert. Antikörper
gegen diese Stellen werden die Infektiosität des Virus neutralisieren
(Weis, et al., "Structure
of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor,
sialic acid", Nature
333: 426–431
(1988)). Der Titer und die Spezifität von HAI-Antikörpern sind
ein wichtiges Maß für das Potential
eines Influenza-Impfstoffes, gegen Infektion mit ähnlichen
und verwandten Influenza-Stämmen
zu schützen.
-
Studien
an Mäusen
wurden durchgeführt,
in denen die Fähigkeit
von gereinigtem rHA0 von A/Beijing/353/89 und FLUZONE® (Connaught
Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) HAI-Antikörper hervorzurufen verglichen
wurden. Gruppen von 5 Mäusen
wurden an den Tagen 0 und 28 mit 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg und 0,004 μg rHA0 oder mit dem Dreifachen
dieser Mengen an FLUZONE®-Hämagglutinin geimpft, so dass
gleiche Mengen an rekombinantem oder viralem Hämagglutinin von A/Beijing/353/89
verabreicht wurden. Zum Beispiel wurden Mäuse in der Gruppe der höchsten Dosierung
mit 1,5 μg
FLUZONE®-Hämagglutinin
(0,5 μg
Hämagglutinin
von jedem Stamm) und 0,5 μg
rHA0 immunisiert. Die Anwesenheit von zusätzlichem Hämgglutinin-Antigen von zwei
anderen Influenza-Stämmen
in FLUZONE® kann
für einige
kreuzreaktive Antikörper
verantwortlich sein.
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Anti-Hämagglutinin-Antikörper (Hämagglutinin-IgG)
wurden in einem standardisierten Verdünnungs-ELISA-Test gegen gereinigtes
rHA0 gemessen. HAI-Antikörper
wurden gegen 4 Hämagglutinin-Einheiten
der nachstehenden Antigene gemessen: vollständiges Influenzavirus A/Beijing/353/89
(A/Bei), gereinigtes rHA0-A/Beijing/353/89-Antigen
und FLUZONE®.
Der HAI-Titer ist reziprok zur höchsten
Verdünnung
der Antiseren, die die Agglutinierung von roten Blutzellen von Küken um 50%
hemmt.
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Tabelle
3 fasst die Titer von Hämagglutinin-IgG
aus dem Serum und HAI-Titer der Mäuse am Tag 42 zusammen. Hohe
Spiegel an anti-Hämagglutinin-Antikörper wurden
mit dem rekombinanten rHA0-Impfstoff erzeugt. Die Titer waren etwa
10-fach höher als
für FLUZONE®.
Am signifikantesten ist, dass der rHA0-Impfstoff gute Titer an Antikörpern erzeugte,
die die Agglutinierung von roten Blutzellen durch das A/Beijing/353/89-Virus
und rHA0-Antigene blockieren. Auf diese Weise erzeugte der rHA0-Impfstoff
HAI-Antikörper,
die das Immunogen und das A/Beijing-Influenzavirus gleich gut erkannten.
Die niedrigeren HAI-Titer gegen FLUZONE® können auf
die Unfähigkeit
der Antiseren zurückgeführt werden,
Agglutinierung durch die anderen beiden Hämagglutininarten im FLUZONE®-Impfstoff
zu blockieren. Dagegen erzeugten mit FLUZONE® immunisierte Mäuse hohe
HAI-Antikörper-Titer,
wenn nur gegen sie selbst gemessen wurde. Die HAI-Titer gegen das
Influenzavirus A/Beijing/353/89 und das rHA0-Antigen waren beachtlich
reduziert. Ähnliche
Muster wurden bei Mäusen
aus den Gruppen mit niedrigerer Dosierung beobachtet.
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Tabelle
3. HAI-Titer gegen rHA0 und FLUZONE
®
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Diese
Daten legen auch nahe, dass zwischen dem Influenza-Stamm A/Beijing/353/89
in FLUZONE® und
diesem gleichen Influenza-Stamm, der von der FDA bezogen wurde und
vor der Verwendung des HAI-Tests einmal die Passage durch Eier durchlaufen
hat, genetische Unterschiede bestehen. Die Tatsache, dass Antikörper, die
als Antwort auf das aus Influenza A/Beijing/353/89 clonierte rekombinante
HAO erzeugt wurden, Agglutinierung von roten Blutzellen durch diesen
Influenza-Stamm ebenso wie diesen selbst blockieren, ist ein guter
Beweis dafür,
dass es während
des Clonierungsprozesses keine genetischen Veränderungen gab, die die Bindungsstelle
für den
Sialinsäure-Rezeptor
auf dem gereinigten rHA0-Antigen
betreffen.
-
Beispiel 10: Formulierung und klinische
Wirksamkeit eines Influenza-Impfstoffes
von 1993/1994.
-
Eine
Serie von klinischen Tests am Menschen wurde durchgeführt, um
die Sicherheit und Immunogenität
eines experimentellen Influenza-Impfstoffes, der rekombinantes HA
enthielt, zu charakterisieren und vorbereitende Daten zu sammeln,
die die Schutzwirkung eines solchen Impfstoffes gegen natürliche Infektion während einer
epidemischen Saison betreffen. Die Ergebnisse zeigen, dass Impfstoffe,
die das rekombinante Influenza-Hämagglutinin
(rHA0) enthalten und gemäß den hierin
beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zu einem
kommerziell verfügbaren,
zugelassenen abgeschwächten
Influenza-Impfstoff, der in Eiern produziert worden war, überraschend
weniger lokale nachteilige Reaktionen hervorriefen und eine gleichwertige
oder bessere, schützende
Immunantwort lieferten.
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MATERIAL UND METHODEN
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Impfstoffe.
Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten HA-Impfstoffe enthielten
ungespaltenes HA (HAO)-Glycoprotein in voller Länge vom Influenzavirus A/Beijing/32/92
(H3N2). Rekombinantes HA0 (rHA0) wurde in Kulturen von Lepidoptera-(Insekten-)Zellen
produziert, nachdem sie einem Baculovirus-Vektor ausgesetzt waren,
der die HA-Gene codierende cDNA-Insertionen enthielt. Das exprimierte
Protein wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen auf > 95% gereinigt, wie
durch quantitative Scan-Densitometrie des Haupt-Antigens, das der
Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen unterzogen
worden war, gemessen wurde. Die Identität des Peptids wurde durch Aminosäure-Analyse,
N-terminale Sequenzierung und Western-Blot-Analyse mit Anti-Influenza A/Beijing32/92-Seren
bestätigt.
Die rHA0-Impfstoffe enthielten eine spezifizierte Menge an dem synthetischen
HA-Antigen, entweder in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung gelöst oder
in Form einer Gelsuspension an das Adjuvans Aluminiumphosphat (Alaun)
adsorbiert. Der in dieser Studie verwendete zugelassene trivalente
Subvirion-Impfstoff enthielt 15 μg/Dosis
von jedem der HAs der Influenzaviren A/Texas/36/91 (N1N1), A/Beijing/32/92
(H3N2) und B/Panama/45/90 (in Eiern hergestellter abgeschwächter Influenza-Impfstoff
FLUZONETM, Connaught Laboratories, Swiftwater,
PA).
-
Klinische
Studien. Identische Untersuchungsprotokolle wurden durch die Institutional
Review Boards der Saint Louis-Universität und die Universität von Rochester
genehmigt. An beiden Instituten wurden gesunde Erwachsene im Alter
von 18 bis 45 Jahren untersucht. Die Testpersonen wurden nach dem
Zufallsprinzip für eine
der nachstehenden fünf
Impfstoffpräparate
in einem Doppelblindverfahren ausgewählt: (1) 15 μg rHA0, (2) μg rHA0 plus
Alaun, (3) 90 μg
rHA0, (4) zugelassener, trivalenter, inaktivierter Influenza-Impfstoff
oder (5) Placebo aus Kochsalzlösung.
Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion mit einem Volumen
von 0,5 ml verabreicht. Um eine anfängliche Untersuchung zur Sicherheit
der drei Impfstoffpräparate,
die rHA0 enthielten, zu gewährleisten,
wurden die ersten 25 Testpersonen nach dem Zufallsprinzip (d. h.
fünf Personen
pro Teilstudie) unabhängig
von den anderen Testpersonen ausgewählt und über 48 Stunden nach Impfung
eng mittels Telefonkontakt überwacht,
bevor mit den übrigen
Impfungen fortgefahren wurde. Alle Testpersonen waren angewiesen,
während
der ersten sechs Tage nach der Impfung einen täglichen Berichtsbogen über nachteilige
Reaktionen einschließlich
sowohl lokaler als auch systemischer Symptome auszufüllen. Die
Symptome wurden selbst ihrem Wesen nach als mild, mittel oder schwer
eingestuft. Orale Temperatur wurde von den Teilnehmern gemessen
und aufgezeichnet, wenn sie sich fiebrig fühlten. Falls auftretend, wurden
lokale Schwellungen oder Erytheme an der Injektionsstelle danach
eingestuft, ob der Bereich kleiner oder größer als eine Vierteldollarmünze im Durchmesser
war. Alle Impfungen wurden in der letzten Woche im November und
ersten Woche im Dezember 1993 durchgeführt. Serumproben wurden von
den Testpersonen zum Zeitpunkt der Impfung, 3 Wochen nach Impfung
und noch einmal im späten
März oder
April 1994 genommen, mindestens 2 bis 3 Wochen nachdem die Influenzaviren
nicht mehr in den lokalen Gemeinschaften zirkulierten. Die Freiwilligen jedes
Instituts wurden angewiesen, mit dem Studienzentrum Kontakt aufzunehmen,
sobald sie eine Influenza-ähnliche
Erkrankung während
der winterlichen Influenza-Epidemiesaison erlitten. Eine Influenza-ähnliche Erkrankung
wurde als das Auftreten aller respiratorischen Symptome von zwei
Tagen oder längerer
Dauer, begleitet von Fieber und/oder systemischen Symptomen von
Myalgie oder Schüttelfrost
definiert. Bei Testpersonen, die von Influenza-ähnlichen Symptomen berichteten,
wurden nasale und pharyngeale Abstriche zur Viruskultur und Identifikation
gemacht. Klinische Teilnehmer erhielten codierte Identifikationsnummern
und wurden im Blindversuch behandelt.
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Serologie.
Für jeden
Typ serologischer Untersuchung wurden alle Proben aus beiden Instituten
in einer Gruppe durch ein einzelnes Labor untersucht. Antikörper gegen
das Influenzavirus-Antigen A/Beijing/32/93 zur Hämagglutinationshemmung (HAI)
wurden in Seren durch einen standardisierten Mikrotiter-Test gemessen,
nachdem nicht spezifische Inhibitoren mit einem Rezeptor zerstörenden Enzym
und kalte Agglutinine durch Hämadsorption
bei 4°C
entfernt worden waren. Der Titer wurde als die höchste Serumverdünnung definiert,
die Hämagglutinierung
durch 4 Antigen-Einheiten des Virus vollständig verhinderte, wobei 1:4
als die Startverdünnung
verwendet wurde. HA-spezifische Immunglobulin G (IgG)-Antikörper im
Serum wurden durch enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA)
gemessen, wobei gereinigtes rHA0 von Influenza A/Beijing/32/92 (H3N2)
als Hüll-Antigen
verwendet wurde. Die Folge an Reagenzien von der festen Phase nach
außen
umfasste (1) gereinigtes rHA0-Antigen, (2) Serumarten, (3) an alkalische
Phosphatase konjugiertes Anti-Mensch-IgG der Ziege und (4) p-Nitrophenylphosphatdinatrium-Substrat.
Der ELISA-Titer wurde als die höchste
Verdünnung
ausgedrückt,
bei der die optische Dichte der Antigen enthaltenden Vertiefung
mindestens zweimal so hoch war wie die der zugehörigen Kontrollvertiefung ohne
Antigen. Neutralisierende Antikörper wurden
unter Verwendung des Mikroneutralisationstests gemessen, der zuvor
von Treanor, J. J. und Betts, R. F., J. Infect. Dis. 168: 455–459 (1993)
beschrieben wurde. Kurz, serielle Verdünnungen von Hitze-inaktivierten Seren
wurden mit etwa 100 TCID50 des Influenzavirus
A/Beijing/32/92 (H3N2) gemischt und bei 37°C über 1 h inkubiert. Das Virus-Seren-Gemisch
wurde dann an konfluente einzellige Schichten von Nierenzellen des
Madin-Darby-Hundes (MDCK) in Platten mit 96 Vertiefungen über 1 h
bei Zimmertemperatur adsorbiert. Die Platten wurden gewaschen, um
restliches Inoculum zu entfernen, mit serumfreiem Dulbecco-MEM mit
2 μg/ml Trypsin
aufgefüllt
und in 5% CO2 bei 33°C über 72 h inkubiert. Die Zellen
wurden dann mit Methanol fiixert, und die virale Replikation wurde
unter Verwendung einer Reihe an murinen monoclonalen Antikörpern, die
für die Matrix
spezifisch waren, und Nucleoproteinen des Influenza-A-Virus (Centers
for Disease Control, Atlanta, GA), gefolgt von mit alkalischer Phosphatase
gebundenem Anti-Maus IgG, gemessen.
-
Der
Endpunkt-Titer der Seren wurde als die höchste Verdünnung definiert, die zu einer
größeren als 50%igen
Reduktion des Signals im Vergleich zu nicht neutralisierten Kontrollvertiefungen
führte.
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Virologie.
Viruskulturen von Arten aus nasopharyngealen Abstrichen wurde an
jedem Institut mittels Standardtechniken angelegt. Die Proben wurden
entweder in MDCK- oder Nierenzellen von Rhesusaffen geimpft und
bei 33°C über 14 Tage
inkubiert. Die Hämadsorption
der einzelligen Schichten wurde mit 0,4% Erythrocyten vom Meerschweinchen
untersucht. Influenzaviren wurden in den Hämadsorptionpositiven Kulturen durch
HAI unter Verwendung von H3-spezifischen Antiseren (Centers for
Disease Control) identifiziert.
-
Statistische
Analysen. Der reziproke HAI-, ELISA-IgG- und neutralisierende Antikörper-Titer
wurde zur statistischen Analyse logarithmisch transformiert. Eine
signifikante Antwort auf die Impfung wurde als vierfacher oder größerer Anstieg
des Antikörper-Titers
zwischen den Serumproben vor der Impfung und 3 Wochen nach der Impfung
definiert. Labornachweis einer Influenza A (H3N2)-Virusinfektion
wurde definiert als die Isolierung des Virus aus nasopharyngealen
Sekreten und/oder einem vierfachen oder größeren Anstieg im HAI Antikörper-Titer
im Serum zwischen den 3 Wochen nach Impfung (Vorsaison) im Dezember
gesammelten Proben und den entsprechenden Proben nach der Saison,
die im nachfolgenden Frühling
gesammelt wurden. Unterschiede zwischen den Impfgruppen wurden unter
Verwendung des genauen Fischer-Tests analysiert, um den Anteil von
Testpersonen mit nachteiligen Reaktionen, signifikanten Antikörperantworten
oder im Labor nachgewiesener Influenza-Erkrankung oder -Infektion
zu vergleichen, und eine Analyse der Varianz (ANOVA) wurde durchgeführt, um
die mittleren reziproken log2-Antikörper-Titer
nach der Impfung zu vergleichen. Die modifizierte Bonferroni-Ungleichung und Tukey-Kramer-Tests
wurden da angewendet, wo sie geeignet waren, um vielfachen möglichen
Vergleichen Rechnung zu tragen.
-
ERGEBNISSE
-
Vermögen, eine
Reaktion hervorzurufen. Die in dieser Studie verwendeten rHA0-Impfstoffe waren
sicher und gut verträglich.
Die Häufigkeit
von nachteiligen Reaktionen schien nicht von der Änderung
der Dosis an rHA0-Antigen von 15 μg
auf 90 μg
beeinflusst zu sein, kann jedoch durch die Zugabe von Alaun leicht
erhöht worden
sein. Lokales Erythem, Schmerz und Empfindlichkeit an der Injektionsstelle wurden
jeweils signifikant häufiger
von den Teilnehmern berichtet, die zugelassenen Subvirion-Impfstoff
erhalten hatten, als von jenen, die entweder 15 μg oder 90 μg rHA0 in Kochsalzlösung erhalten
hatten. Mit Ausnahme einer Testperson, die mittelschweren Schmerz,
Empfindlichkeit und Steifheit im Arm nach Immunisierung mit zugelassenem
Impfstoff empfand, wurden alle Symptome ihrem Wesen nach als mild
eingestuft und hielten allgemein 1–2 Tage an. Lokales Erythem
und/oder Verhärtung
waren, falls auftretend, in ihrer Größe stets kleiner als die Fläche einer
Vierteldollarmünze.
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Immunogenität. Basistiter
von HAI-Antikörper
aus dem Serum gegen das Influenzavirus A/Beijing/32/92 (H3N2) waren
geringer oder gleich 1:8 bei 64 (50%) der 127 teilnehmenden Testpersonen.
Die meisten Testpersonen aus jeder der vier Impfstoff-Gruppen zeigten
HA-spezifische serologische Antworten, die durch HAI- und ELISA-Tests
gemessen wurden (Tabelle 4). Serum-Titer von HAI-Antikörpern nach
Impfung waren größer oder
gleich 1:32 bei allen Testpersonen, die Impfstoff erhalten hatten,
mit Ausnahme von zwei Personen, die 15 μg rHA0 erhalten hatten, und
einer Person, der zugelassener Impfstoff verabreicht worden war.
Bei der Mehrheit der freiwilligen Teilnehmer war Impfung auch mit
der Produktion von neutralisierenden Antikörpern verbunden. Mittlere Anstiege
von Antikörper-Titern
und Serokonversionsraten schienen nach Immunisierung mit 15 μg rHA0 geringfügig niedriger
als mit zugelassenem Impfstoff zu sein, obgleich diese Unterschiede
nicht statistisch signifikant waren. Antikörperantwort auf rHA0 wurde
durch die Zugabe von Alaun nicht verstärkt. Testpersonen, die mit
90 μg rHA0
immunisiert worden waren, erreichten nach der Impfung mittlere HAI-
und ELISA-IgG-Antikörpertiter,
die zwei- bis fünffach höher als
in jeder der anderen drei Impfstoffgruppen waren (Unterschiede waren
beim Vergleich der HAI-Titer im Serum statistisch signifikant).
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Wirksamkeit
des Schutzes. Während
des Zeitraumes der Überwachung
wurden insgesamt 28 Influenza-ähnliche
Erkrankungen von 26 Testpersonen berichtet. Bei vier dieser Personen
(drei von ihnen hatten ein Placebo erhalten, und eine von ihnen
war mit 15 μg
rHA0 immunisiert worden) ließ sich
das Influenzavirus A (H3N2) aus nasopharyngealen Kulturen isolieren.
Signifikante Anstiege des HAI-Antikörper-Titers gegen Influenza
A/Beijing/32/92 (H3N2) zwischen Serumproben vor und nach der Saison
waren ebenfalls in drei der vier durch Kultur nachgewiesenen Fälle zu verzeichnen,
jedoch bei keiner anderen Person, die Erkrankung berichtete. Der
einzige Empfänger
von rHA0, der in der Folge Labor-bestätigte Erkrankung an Influenza
entwickelte, hatte die positive Kultur 31 Tage nach der Immunisierung
erhalten und hatte eine Serumveränderung
von einem HAI-Titer vor der Impfung von weniger als 1:4 zu einem
Titer nach der Impfung (vor der Saison) von 1:32. Bei zwei weiteren
Empfängern
von Placebos und einem Freiwilligen, der mit zugelassenem Impfstoff
immunisiert worden war, war eine Infektion mit Influenzavirus A
(H3N2) während
der epidemischen Saison serologisch nachzuweisen, ohne dass es zu
einer klinischen Erkrankung kam. Beim Vergleich aller geimpfter
Personen (oder aller Personen, die einen der rHA0-Impfstoffe erhalten
hatten) als Gruppe erlitt eine signifikant größere Gruppe von Placebo-Empfängern Labor-bestätigte Erkrankung
(p < ,05) an oder
Infektion (p < ,005)
mit Influenza A (H3N2).
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Die
vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, dass Influenza-Impfstoffe,
die gereinigtes rHA0-Antigen enthalten und wie in der vorstehend
genannten Patentanmeldung beschrieben hergestellt werden, gut verträglich und
in der Lage sind, schützende
Immunantworten beim Menschen hervorzurufen. Selbst bei einer Dosis
von 90 μg
rief das in dieser Studie bewertete rHA0 keine stärkeren Reaktionen
als Kochsalzlösung-Placebo hervor
und verursachte signifikant weniger lokale nachteilige Reaktionen
als ein zugelassenen trivalenter Subvirion-Impfstoff, der halb so
viel (d. h. 45 μg)
an Gesamt-HA-Antigen enthielt.
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Neutralisierende
HA-spezifische Antikörperantworten
auf das 15 μg-rHA0-Präparat waren
mit jenen vergleichbar, die durch Subvirion-Impfstoff hervorgerufen
wurden, und wurden durch Erhöhen
der Dosis an rHA0 auf 90 μg
signifikant verbessert.
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Die
Gesamtraten an Infektion und Erkrankung als Folge natürlicher
Exposition gegenüber
dem zirkulierenden epidemischen Stamm des Influenzavirus A (H3N2)
waren unter geimpften Personen signifikant geringer als unter Placeboempfängern. Die
Daten legen nahe, dass von rHA0 übertragene
schützende
Immunität,
besonders bei Verabreichung in hohen Dosen, vergleichbar oder besser
als jene ist, die durch zur Zeit verfügbare Impfstoffe hervorgerufen
wird.
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Beispiel 11: Verfahren zur Herstellung
eines verbesserten HAO-Clonierungsvektors.
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Ein
verbesserter Clonierungsvektor zur Expression von reifem HA wurde
entworfen, in dem das HA codierende Gen direkt stromabwärts der
Sequenz gelegen ist, die das Chitinase-Signalpeptid codiert.
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Lineares pMGS27 mit einzelsträngigen Enden
wurde erzeugt
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In
das Plasmid pMGS12 wurde HA in SmaI- oder KpnI-Stellen direkt stromabwärts des
Chitinase-Signalpeptids cloniert. Die Nuclein- beziehungsweise Aminosäuresequenzen
werden als SEQ ID NO: 22 und SEQ ID NO: 23 dargestellt.
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Diese
Region wurde durch Oligo-gerichtete Mutagenese verändert, um
pMGS27 zu erzeugen (veränderte
Basen wurden unterstrichen) (SEQ ID NO: 24):
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Plasmid
pMGS27 wurde mit einem PstI-Schnitt linearisiert (Reste 6–35 von
SEQ ID NO: 24 dargestellt):
dann wurde
das linearisierte pMGS27 mit T4-DNA-Polymerase plus dATP behandelt,
um einzelsträngige
Enden zu erzeugen, wie nachstehend dargestellt (Reste 23–36 und
Komplement der Reste 6–18
der SEQ ID NO: 24):
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Ziel-HA-Gen wurde in pMGS27 cloniert
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Schritt
1. PCR-Primer wurden synthetisiert. Vorwärtsoligo (SEQ ID NO: 25):
-
- (20 Basen vom 5'-Ende
des reifen HA)
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Reverses
Oligo (Komplement SEQ ID NO: 26):
(20 Basen vom 3'-Ende des reifen
HA)
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PCR des HA-Gens
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PCR
des Ziel-HA-Gens mit den zwei Oligos wurde verwendet, um
zu erhalten
(SEQ ID NO: 25 und SEQ ID NO: 26).
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Anellierung des Ziel-HA-Gens an pMGS27
und Transformierung von E. coli.
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Lineares
pMGS27 und das mit T4-Polymerase behandelte PCR-Fragment des HA-Gens wurden vermischt.
Die beiden Moleküle
anellieren aneinander, um ein ringförmiges Plasmid zu bilden, das
direkt zur Transformierung von E. coli verwendet werden kann. Das
Diagramm umschließt
die SEQ ID NO: 25 und 26, die Reste 23–36 und 6–18 der SEQ ID NR. 24.
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Wie
vorstehend dargestellt gibt es keine zusätzliche Aminosäure zwischen
dem Signalpeptid und dem reifen HA.
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Beispiel 12: Herstellung und Wirksamkeit
eines trivalenten Impfstoffes aus Influenzaviren vom Typ A und B 1995–1996.
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Influenzavirus-Impfstoff, gereinigtes
rekombinantes Hämagglutinin,
trivalent, Typen A und B
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Influenzavirus-Impfstoff,
gereinigtes rekombinantes Hämagglutinin,
trivalent, Typen A und B (A/Texas/36/92\1 (H1N1), A/Johannesburg/33/94
(H3N2) und B/Harbin/7/94) ist eine nicht infektiöse Untereinheit, die von gereinigten
rekombinanten Influenza-Hämagglutinin-Antigenen
(HA) abstammt. Diese HA-Gene wurden aus Influenzaviren der Stämme A und
B, die von Center for Disease Control/Food and Drug Administration empfohlen
worden waren, wie vorstehend beschrieben cloniert, und die Identität eines
jeden clonierten Gens wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt. Baculovirus-Expressionsvektoren,
die die clonierten HA-Gene des Influenzavirus der Stämme A/Texas/36/91
(HINZ), A/Johannesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 enthielten, wurden
verwendet, um die rekombinanten HA-Antigene in kultivierten Insektenzellen
herzustellen. Die rekombinanten HA-Proteine sind ungespaltene Hämagglutinine
in voller Länge
(rHA0) mit einem Molekulargewicht von annähernd 69.000. Die rHA0 wurden
in einer Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) produziert,
die in einem serumfreien Kulturmedium gehalten wurden. Der trivalente
Impfstoff ist aus gereinigtem (Reinheit größer als 95%, wahrscheinlicher
größer als
99%ige Reinheit) rHA0 aus den beiden Influenza A-Stämmen
und einem B-Stamm zu gleichen Anteilen vermischt zusammengesetzt.
Der Impfstoff wird zur klinischen Verwendung als gereinigte rHA0-Proteine
vom Typ A und B in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Zusatz von Konservierungsstoffen
geliefert.
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Tierversuche
mit monovalenten, bivalenten und trivalenten rHA0-Impfstoffen haben
gezeigt, dass sie frei von signifikanter Toxizität sind. Es gibt keine nachweisbaren,
toxischen oder zufälligen
Agenzien im Impfstoff. Allgemeine Studien zur Sicherheit und Immunogenität von A/Beijing/32/92-
und A/Texas/36/91-rHA0 wurden an Mäusen und Meerschweinchen durchgeführt. Keine
nachteiligen Reaktionen wurden verzeichnet. Bei Mäusen induziert
eine einzelne Immunisierung mit 15 Mikrogramm rHA0-Antigenen ohne
Adjuvans in zwei bis drei Wochen hohe Spiegel an anti-HA-IgG-Antikörpern, Hämagglutinin
inhibierenden (HAI)-Antikörpern
und neutralisierenden Antikörpern.
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In
einer Studie wurden Gruppen mit zehn Mäusen mit 15 Mikrogramm gereinigtem
rHA0 A/Beijing/32/92 (H3N2) immunisiert, das in Zellen hergestellt
worden war, die an Kulturmedien mit 10% fötalem Rinderserum angepasst
waren, oder mit rHA0, das in Insektenzellen hergestellt worden war,
die an Medien angepasst waren, die 10% fötales Rinderserum enthielten,
oder mit rHA0, das in Insektenzellen hergestellt worden war, die
an ein serumfreies Kulturmedium (rHA0-SF) angepasst waren. Zwei
und drei Wochen nach Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen und Serumproben
wurden hergestellt. Jedes Serum wurde auf anti-HA-IgG- und HAI-Antikörper untersucht.
Sowohl rHA0- als auch rHA0-SF-Antigene rufen ähnliche Titer für anti-HA-
und -HAI-Antikörper
hervor. Zwei Wochen nach der einzelnen Immunisierung haben die meisten
Mäuse signifikante
Titer für
HAI-Antikörper,
und in Woche 3 hatten 8/10 Mäusen
in jeder Gruppe HAI-Titer von 32 oder mehr. Diese und andere biochemische
und immunologische Studien zeigen, dass rHA0, das in serumfreien
Kulturen aus Insektenzellen hergestellt wird, nicht von rHA0 zu
unterscheiden ist, das unter Serum enthaltenden Fermentationsbedingungen
hergestellt wurde.
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Ein
Studie wurde durchgeführt,
in der die Formulierung des trivalenten rHA0-Influenza-Impfstoffes von 1994–1995 mit
einem zugelassenen Impfstoff aus gereinigtem Oberflächen-Antigen
des Virus, Fluvirin
® (ein abgeschwächter Influenzavirus-Impfstoff,
der durch Kultivierung in Eiern hergestellt worden war) verglichen wurde.
Jeder Impfstoff enthielt 15 Mikrogramm rHA0 oder virales HA pro
0,5 ml der Influenza-Stämme
A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) und B/Panama/45/90.
Sowohl das rekombinante rHA0 als auch Tabelle
5: Vergleich des trivalenten rHA0-Impfstoffes mit Fluvirin
®.
| trivalenter
rHA0-Fluvirin®-Influenza-Impfstoff
GMT (n = 10 Mäuse) |
GMT (n = 10 Mäuse) als Antigen verwendeter
Virusstamm | anti-HA
IgG | anti-HA IgG |
Woche
0 | Woche
3 | Woche
0 | Woche
3 |
A/Texas/36/91
(H1N1) | < 1000 | 103,000 | < 1000 | 11,200 |
A/Shangdong/32/92
(H3N2) | < 1000 | 162,400 | < 1000 | 41,000 |
B/Panama/45/90 | < 1000 | 164,800 | < 1000 | 26,000 |
als
Antigen verwendeter Virusstamm | HAI | HAI |
A/Texas/36/91
(H1N1) | < 8 | 1,522 | < 8 | 1,088 |
A/Shangdong/32/92
(H3N2) | < 8 | 494 | < 8 | 435 |
B/Panama/45/90 | < 8 | 174 | < 8 | 42 |
als
Antigen verwendeter Virusstamm | neutralisierender
AK | neutralisierender
AK |
A/Texas/36/91
(H1N1) | < 100 | 5,800 | < 100 | 2,720 |
A/Shangdong/32/92
(H3N2) | < 100 | 840 | < 100 | 360 |
B/Panama/45/90 | < 100 | 1,300 | < 100 | 700 |
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Modifikationen
und Variationen der hierin beschriebenen Verfahren und Zusammenstellungen
zur Herstellung und Verwendung eines rekombinanten Influenza-Impfstoffes
werden Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Solche Modifikationen
und Variationen sollen im Schutzumfang der angefügten Patentansprüche umfasst
sein.
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