DE69535716T2

DE69535716T2 - Methode für die Produktion von multivalenten Influenza Hämagglutinin Vakzinen

Info

Publication number: DE69535716T2
Application number: DE69535716T
Authority: DE
Inventors: Gale Eugene Wallingford Smith; Franklin Woodbridge Volvovitz; Bethanie E. Higganum Wilkinson; Andrei I. West Hartford Voznesensky; Craig Stanway Wallingford Hackett
Original assignee: Protein Sciences Corp
Current assignee: Protein Sciences Corp
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2015-05-27
Also published as: EP1275726A3; HK1054050A1; HK1054050B; ATE386812T1; EP1275726A2; PT1275726E; ES2300419T3; DE69535716D1; EP1275726B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der rekombinanten Influenza-Impfstoffe.
Epidemische Influenza tritt jährlich auf und ist eine Ursache für signifikante Erkrankung und Sterblichkeit weltweit. Kinder weisen die höchste Anfälligkeitsrate auf und sind wesentlich für Übertragung von Influenzaviren in der Gemeinschaft verantwortlich. Für Ältere und Personen mit bestehenden gesundheitlichen Problemen besteht ein erhöhtes Risiko für Komplikationen und stationäre Behandlung auf Grund einer Influenzainfektion. Allein in den USA gab es während jeder von sieben Influenza-Saisons zwischen 1956 und 1988 mehr als 10.000 Todesfälle auf Grund von Pneumonie und Influenza, und mehr als 40.000 Todesfälle wurden für jeweils zwei Saisons verzeichnet (aktuelle Daten: Influenza Activity – United States and Worldwide, und Composition of the 1992–1993 Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report. U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/Nr. 18: 315–323, 1992.) Influenzaviren sind hoch pleomorphe Partikel, bestehend aus zwei Oberflächen-Glycoproteinen, Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Das HA vermittelt Anheftung des Virus an die Wirtszelle und Fusion der Virus-Zellmembran während des Eindringens des Virus in die Zelle. Das Genom des Influenzavirus umfasst acht einzelsträngige Negativstrang-RNA-Segmente, von denen das viertgrößte Segment das HA-Gen codiert. Die Influenzaviren werden basierend auf Antigen-Unterschieden in die Typen A, B und C eingeteilt. Influenza-A-Viren werden mit einer Nomenklatur beschrieben, die den Subtyp oder Typ, geographischen Ursprung, Nummer des Stamms und Jahr der Isolierung umfasst, zum Beispiel A/Beijing/353/89. Es gibt mindestens 13 Subtypen des HA (H1–H13) und neun Subtypen der NA (N1–N9). Alle Subtypen lassen sich in Vögeln nachweisen, aber nur H1–H3 und N1–N2 lassen sich in Menschen, Schweinen und Pferden nachweisen (Murphy und Webster, "Orthomyxoviruses", in Virology, Hrsg. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., 1091–1152 (Raven Press, New York, (1990)).
Antikörper gegen HA neutralisieren das Virus und bilden die Basis für natürliche Immunität gegenüber Infektion durch Influenza (Clements, "Influenza Vaccines", in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, Hrsg. Ronald W. Ellis, S. 29–150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). Antigen-Variation im HA-Molekül ist für die häufigen Ausbrüche von Influenza und für begrenzte Kontrolle der Infektion durch Immunisierung verantwortlich.
Die dreidimensionale Struktur des HA und die Wechselwirkung mit seinem zellulären Rezeptor, Sialinsäure, ist intensiv untersucht worden (Wilson, et al., "Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A° resolution" Nature 289: 366–378 (1981); Weis, et al., "Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid" Nature, 333: 426–431 (1988); Murphy und Webster, 1990). Das HA-Molekül liegt im Virion als ein Trimer vor. Jedes Monomer besteht aus zwei Ketten, HA1 und HA2, die durch eine einzelne Disulfid-Bindung verbunden sind. Infizierte Wirtszellen produzieren ein glycosyliertes Vorläufer-Polypeptid (HAO) mit einem Molekulargewicht von etwa 85.000, das nachfolgend in HA1 und HA2 gespalten wird.
Die Anwesenheit von Influenza-HA-spezifischem, neutralisierendem IgG- und IgA-Antikörper ist mit Resistenz gegen Infektion und Erkrankung verbunden (Clements, 1992). Influenza-Impfstoffe aus inaktiviertem ganzem oder teilgereinigtem (gespaltene Untereinheit) Virus werden nach der Menge an HA aus jedem Stamm standardisiert. Influenza-Impfstoffe umschließen gewöhnlich 7 bis 25 Mikrogramm HA aus jedem von drei Influenza-Stämmen.
Die Rolle des anderen größeren Oberflächen-Glycoproteins, NA, für schützende Immunität von Antikörper- oder T-Zell-Antworten gegen Influenza ist nicht definiert worden. Neuraminidase ist dem Prozess der Reinigung und Lagerung gegenüber sehr unbeständig (Murphy und Webster, 1990), und die Menge an NA in den gegenwärtigen Influenza-Impfstoffen ist nicht standardisiert. Gereinigter HA-, nicht aber NA-Impfstoff verhindert Erkrankung von Tieren, die Influenza ausgesetzt wurden (Johansson, et al., "Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection" J. Virology, 63: 1239–1246 (1989)). Ein experimenteller, auf Neuraminidase-Antigen basierender Impfstoff erwies sich in einer Testreihe beim Menschen als nicht schützend (Orga et al., J. Infect. Dis. 135: 499–506 (1977)).
Zugelassene Influenza-Impfstoffe umfassen mit Formalin inaktivierte, ganze oder chemisch gespaltene Präparate von Untereinheiten aus zwei Influenzaviren des Subtyps A (H1N1 und H3N2) und einem Influenzavirus des Subtyps B. Vor jeder Influenza-Saison gibt das U. S. Food and Drug Administration's Vaccines and Related Biologicals Advisory Committee eine Empfehlung für die Zusammensetzung eines trivalenten Influenza-Impfstoffes für die bevorstehende Saison heraus. Der Impfstoff für 1992–93 enthielt A/Texas/36/91-artige (H1N1), A/Beijing/353/89-artige (H3N2) und B/Panama/45/90-Viren Die FDA hat empfohlen, dass der Influenza-Impfstoff für 1993–94 die selben Texas- und Panama-Stämme und einen neuen Influenza A-Beijing-Stamm (A/Beijing/32/92) beinhalten soll.
Jährliche Impfung von Personen mit hohem Risiko vor der Influenza-Saison ist die wirkungsvollste Weise, den Einfluss von Influenza zu reduzieren. Einschränkungen für die gegenwärtig verfügbaren Impfstoffe umfassen geringe Anwendungsraten; geringe Wirksamkeit bei älteren Personen und bei kleinen Kindern; Produktion in Eiern; Antigen-Variation und nachteilige Reaktionen.
Das Center for Disease Control (CDC) schätzt, dass jedes Jahr weniger als 30% der Personen mit hohem Risiko für Influenza geimpft werden (MMWR, 1992). Die gegenwärtigen inaktivierten Impfstoffe erreichen bei normal gesunden Erwachsenen eine hohe Schutzrate gegenüber Erkrankung, wenn die Antigene des Impfstoffes und jene der zirkulierenden Influenza-Viren eng verwandt sind. Bei älteren Personen ist die Schutzrate gegenüber einer Erkrankung wesentlich geringer, besonders bei jenen, die in einem Heim leben (Clements, 1992). In einer neuen Studie von Powers und Belshe, J. Inf. Dis. 167: 584–592 (1993) wurden signifikante Antikörper-Antworten auf einen trivalenten Influenza-Impfstoff mit Subvirionen bei weniger als 30 Prozent der 65-jährigen oder älteren Personen beobachtet.
Zuchtviren für Influenza-A- und B-Impfstoffe sind natürlich vorkommende Stämme, die sich mit hohen Titern in der Allantoin-Höhle von Hühnereiern vermehren. Alternativ ist der Stamm für die Influenza-A-Variante ein neu kombiniertes Virus mit den richtigen Genen für die Oberflächen-Antigene. Ein neu kombiniertes Virus ist eines, das auf Grund von Segmentierung des viralen Genoms Merkmale jedes Elternstammes aufweist. Wenn mehr als einer der viralen Influenza-Stämme eine Zelle infizieren, vermischen sich diese viralen Segmente, um ein progenes Virion zu bilden, das verschiedene Zusammenstellungen der Gene beider Elternteile enthält.
Der Schutz durch die gegenwärtigen ganzen oder gespaltenen Influenza-Impfstoffe ist kurzlebig und wird geringer, sobald Antigendrift in epidemischen Influenza-Stämmen auftritt. Influenza-Viren unterliegen der Antigendrift als ein Ergebnis der Immunselektion von Viren mit Änderungen in der Aminosäuresequenz des Hämagglutinin-Moleküls. Idealerweise passen die Impfstoff-Stämme zu den Stämmen des Influenzavirus, die die Erkrankung verursachen. Der gegenwärtige Herstellungsprozess für Influenza-Impfstoffe ist jedoch durch die Vermehrung des Virus in embryonierten Hühnereiern begrenzt. Nicht alle Influenza-Virusstämme vermehren sich gut in Eiern; die Viren müssen daher angepasst werden, oder es müssen virale Neukombinationen konstruiert werden. Es besteht umfangreiche Heterogenität zwischen dem Hämagglutinin von Influenzaviren, die in Eiern gezogen wurden, und Primärisolaten aus infizierten Individuen, die in Säugerzellen gezüchtet wurden (Wang, et al., Virol. 171: 275–279 (1989); Rajakumar, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4154–4158 (1990). Die Änderungen im HA während der Auswahl und Herstellung von Influenza-Impfstoffen kann zu einem Gemisch von antigen-distinkten Subpopulationen des Virus führen. Die Viren im Impfstoff können sich daher von den Varianten innerhalb des epidemischen Stammes unterscheiden, was suboptimale Schutzniveaus zur Folge hat.
Possee (1986 Virus Research, Band 5, Seiten 43–59) offenbart die Zelloberflächenexpression von Hämagglutinin des Influenzavirus in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors.
Matsuura et al. (1987 J Gene Virol Bd. 68, Seiten 1233–1250) offenbart zahlreiche Baculovirus-Expressionsvektoren und diskutiert die Erfordernisse einer Expression von Proteinen wie etwa Glycoproteinen in hohem Maße.
Kuroda et al. (1986 MBO Journal Bd. 5, Seiten 1359–1365) offenbart die Expression von Hämagglutinin des Influenzavirus in Insektenzellen durch einen Baculovirus-Vektor.
EP0546787 offenbart die Expression von spezifischen Immungenen unter Verwendung viraler Antigene und beschreibt besonders chimäre DNA-Fragmente, die jenen ähnlich sind, die das HA-Oberflächenprotein eines Influenza-A-Virus codieren.
Ayres et al. (1994 Virology Bd. 202, Seiten 586–605) offenbart eine vollständige DNA-Sequenz des Kern-Polyeder-Virus von Autographa californica, die 133.894 Basenpaare umfassen und etwa 154 putative offene Leserahmen von 150 oder mehr Nucleotiden codieren soll.
Sofortige hypersensitive Reaktionen können auf Grund von Ei-Proteinresten im Impfstoff bei Personen mit schwerer Ei-Allergie auftreten. Der Schweine-Influenza-Impfstoff von 1976 war mit einer ansteigenden Häufigkeit des Guillain-Barré-Syndroms verbunden. Bei nachfolgenden Impfstoffen, die aus anderen Influenza-Stämmen hergestellt wurden, ist bisher kein Anstieg des Auftretens dieser seltenen Krankheit beobachtet worden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffes, bei dem die Vermehrung in Eiern nicht erforderlich ist, würde zu einem reineren Produkt führen, das weniger leicht eine unerwünschte Immunreaktion hervorrufen würde. Darüber hinaus wurde ein reineres Impfstoffpräparat keine Inaktivierung des Virus oder organische Extraktion von viralen Membranbestandteilen erforderlich machen, wodurch Denaturierung der Antigen-Epitope und Sicherheitsbelange auf Grund von Rest-Chemikalien im Impfstoff vermieden würden.
Darüber hinaus würde bei einem Influenza-Impfstoff, der ohne Vermehrung im Ei hergestellt würde, die genetische Heterogenität vermieden, die während der Adaption und Passage durch Eier auftritt. Dies würde zu einem Impfstoff führen, der besser zu den epidemischen Influenza-Stämmen passt, was zu einer verbesserten Wirksamkeit führt.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffes bereitzustellen, das keine Vermehrung in Eiern erfordert.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, durch das ein Influenza-Impfstoff schnell, kostengünstig und hochgereinigt hergestellt werden kann und das die Herstellung von Impfstoffen aus Primärquellen von Influenza erlaubt.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor für die Herstellung eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen glycosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als Impfstoff verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein weiterhin ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin fusioniert ist, wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen umfasst: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die die Nucleotide 19–72 von SEQ ID NO: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid codieren, oder eine Nucleinsäure, die ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 codiert, die codierenden Sequenzen für reifes Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, eine codierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin RNA-Polyadenylierungssignal.
Das Signalpeptid ist bevorzugt aus dem Baculovirus-61K-Gen abgeleitet.
Vorzugsweise codiert die Sequenz, die das Signalpeptid und das Hämagglutinin codiert, keine dazwischen liegenden Aminosäuren.
Der Vektor umfasst bevorzugt eine Sequenz, die ein zweites Protein codiert, welches als ein Fusionsprotein mit dem Hämagglutinin exprimiert wird.
Der Vektor wird bevorzugt in kultivierte Insektenzellen transfiziert.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlich reinen, rekombinanten, reifen glycosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als ein Impfstoff verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein weiterhin ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin fusioniert ist, wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen umfasst: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die die Nucleotide 19–72 von SEQ ID NO: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid codieren, oder eine Nucleinsäure, die ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die codierenden Sequenzen für Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Influenza-A-Stämmen und Influenza-B-Stämmen, eine codierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylisierungssignal, wobei man Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale RNA, für Influenza-A-Stämme oder mRNA für Influenza-B-Stämme isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1)) für die virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder Random-Primer für die mRNA aus Influenza B-Stämmen synthetisiert, wobei die 5'- und 3'-Primer Restriktionsenzymstellen an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene zu finden sind, die Influenza-A- oder -B-Primer und die Influenza-cDNA mit den Hämagglutinin-Gensegmenten vermischt amplifiziert, um doppelsträngige DNA-Fragmente zu erzeugen, die die vollständigen, reifen Hämagglutinin-codierenden Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert und dann die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids in einen Vektor cloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen, glycosylierten Influenza-Hämagglutinins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist und eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als Impfstoff verwendet wird, wobei der Vektor die folgenden 5' -> 3'-Sequenzen enthält: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nucleinsäure, die die Nucleotide 19–72 von SEQ ID NO: 6 oder 8, die das Baculovirus-Signalpeptid codieren, umfasst, oder eine Nucleinsäure, die ein Baculovirus-Signalpeptid codiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die codierenden Sequenzen für Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Influenza-A-Stämmen und Influenza-B-Stämmen, die codierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylierungssignal, bei dem man: Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale RNA für Influenza-A-Stämme oder mRNA für Influenza-B-Stämme isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1)) für die virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder Random-Primer für die mRNA aus Influenza-B-Stämmen synthetisiert, wobei die 5'- und 3'-Primer Restriktionsenzymstellen an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene zu finden sind, die Influenza-A- oder -B-Primer und die Influenza-cDNA mit dem Hämagglutinin-Gensegmenten vermischt amplifiziert, um doppelsträngige DNA-Fragemente zu erzeugen, die die vollständigen, reifen Hämagglutinin-codierenden Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert und dann die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids in einen Vektor cloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält.
Vorzugsweise werden die Hämagglutinin-Gene mittels PCR in den (die) Vektor(en) cloniert, so dass der Vektor das Signalpeptid, das unmittelbar mit dem Hämagglutinin ohne dazwischenliegende Aminosäuren verknüpft ist, codiert.
Vorzugsweise umfasst das oben beschriebene Verfahren weiterhin die Transfektion des Vektors in Insektenzellen und das Selektieren von Zellen für die Hämagglutininexpression.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der nach dem/den beschriebenen Verfahren hergestellt ist. Vorzugsweise exprimiert dieser Vektor im Wesentlichen reines, rekombinantes, reifes glycolysiertes Influenza-Hämagglutinin.
Vorzugweise codiert der Vektor ein Signalpeptid und Hämagglutinin, die gemeinsam die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 aufweisen.
Vorzugsweise ist das Signalpeptid vom Baculovirus-61K-Gen abgeleitet.
Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Influenza-Hämagglutininproteins durch Expression in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems wird bereit gestellt. Das resultierende Protein ist zur Herstellung eines multivalenten Influenza-Impfstoffes nützlich, der auf einem Gemisch aus rekombinanten Hämagglutinin-Antigenen basiert, die aus Influenzaviren mit epidemischem Potential cloniert wurden. Die rekombinanten Hämagglutininproteine sind ungespaltene (HAO) Glycoproteine in vollständiger Länge, die die beiden Untereinheiten HA1 und HA2 umschließen (HAO) und unter nicht denaturierenden Bedingungen auf 95% oder höhere Reinheit, bevorzugt 99% gereinigt sind.
Ein Verfahren zur Clonierung von Influenza-Hämagglutinin-Genen aus Influenza-A- und -B-Viren unter Verwendung speziell entworfener Oligonucleotid-Sonden und des Polymerase-Kettenreaktion-Verfahrens (PCR) wird ebenfalls offenbart. In der bevorzugten Ausführungsform werden die clonierten HA-Gene durch Deletion der Nucleotide, die die natürlichen hydrophoben Signalpeptid-Sequenzen codieren, und Ersatz durch ein neues Baculovirus-Signalpeptid verändert, um eine Sequenz zu erhalten, die das Signalpeptid direkt angrenzend an das Hämagglutinin codiert. Diese chimären Gene werden in Baculovirus-Expressionsvektoren eingeführt, so dass der Polyhedrin-Promotor des Baculovirus die Expression von rekombinanten HA-Proteinen in infizierten Insektenzellen steuert. Das 18 Aminosäuren umfassende Signalpeptid des Baculovirus steuert die Translation von rHA in den Glycosylierungsstoffwechselweg der Insektenzelle und ist auf dem reifen rHA-Glycoprotein nicht anwesend. In der bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor entworfen, der keine zwischen dem Signalpeptid und dem Hämagglutininprotein liegenden Aminosäuren codiert.
Diese Vorgehensweise kann auf alle Typen von Influenzaviren ausgeweitet werden, einschließlich, aber nicht hierauf begrenzt, des prävalenten A-(H1N1)Subtyps, des A-(H3N2)Subtyps und des B-Subtyps, die Menschen infizieren, sowie auch auf die Influenzaviren, die andere Säuger- und Vogelarten infizieren.
Ein allgemeiner Ansatz zur wirksamen Extraktion und Reinigung von rekombinantem HA-Protein, das in Insektenzellen produziert wurde, wird für die Reinigung von rHA-Proteinen von Influenzaviren der A-Subtypen und des B-Typs offenbart. Der rekombinante Impfstoff kann aus Primärquellen von Influenza, zum Beispiel Nasensekretionen infizierter Individuen, eher als aus dem adaptierten und in Hühnereiern kultivierten Virus entwickelt werden. Dies erlaubt schnelle Entwicklung von Impfstoff direkt aus epidemischen Influenzastämmen und vermeidet sowohl die Probleme, die aus der Adaption des Virus zur Kultivierung in Eiern erwachsen, als auch Patientenreaktion auf Verunreinigung aus dem Ei in dem resultierenden Impfstoff.
Beispiele zeigen die Formulierung und klinische Wirksamkeit des Impfstoffes in einer immunisierenden Dosierungsform, die gereinigte rHA-Antigene aus drei Stämmen des Influenzavirus umschließen, die von der FDA für die Influenzaepidemie-Saisons 1993/1994 und 1994/1995 empfohlen worden waren. Funktionale Immunität wurde unter Verwendung von Untersuchungen bestimmt, die Antikörper quantifizieren, die das Influenza-Hämagglutinin binden, wodurch die Fähigkeit des Influenzavirus rote Blutzellen zu verklumpen blockiert wird oder wodurch das Influenzavirus neutralisiert wird. Schützende Immunantworten mit rHA-Impfstoffen wurden in Tieren, die für Influenza-Infektion anfällig waren, oder in Infektionsstudien mit Menschen ermittelt.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine schematische Darstellung der Clonierung von HA-Genen von Influenza-A-Stämmen aus gereinigten viralen RNA-Präparationen, Reinigung des exprimierten rHA und biologische Charakterisierung von rHA. Abkürzungen: FDA, Food and Drug Administration; MDCK, Niere des Madin Darby Hundes; TPCK, Tosylphenylalanyl-Chlormethylketon; RNA, Ribonucleinsäure; cDNA, komplementäre Desoxyribonucleinsäure; HA, Hämagglutinin; FBS, fötales Rinderserum; PCR, Polymerase-Kettenreaktion und BV, Baculovirus.
2 ist eine genauere schematische Darstellung des Verfahrens aus 1, angewandt auf die Clonierung und Expression des HA-Gens vom Influenzastamm A/Texas/36/91. Das Influenza-HA-Gen wurde aus RNA erhalten, die aus mit Influenza A/Texas/36/91 infizierten MDCK-Zellen gereinigt wurde, indem reverse Transkriptase und Universal-Primer (SEQ ID NO: 1) verwendet wurden, gefolgt von zwei Durchläufen der PCR-Amplifizierung und Clonierung. Wie dargestellt, wurden im ersten Durchlauf der PCR-Reaktionen die 3'-End-Primer SEQ ID NO: 2 und 3'-End-Primer SEQ ID NO: 3 verwendet. Im zweiten Durchlauf der PCR-Reaktionen wurden die 5'-End-Primer SEQ ID NO: 4 und 3'-End-Primer SEQ ID NO: 5 verwendet. Ein Baculovirus-Rekombinationsvektor wurde konstruiert, der den Polyhedrin-Promotor und eine Signalpeptid-Sequenz vom Baculovirus-61K-Gen (ein Baculovirus-Gen, das ein Signalpeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 61.000 codiert) umfasste, gefolgt von einer vollständigen Codierungssequenz für das reife HA-Protein. Dieser Rekombinationsvektor wurde dann verwendet, um einen Baculovirus-Expressionsvektor herzustellen, der HA von diesem Virusstamm produzierte.
3 ist eine grafische Darstellung der anti-HA-Immunantwort von Mäusen, Tag 42, n = 5, die den Antikörper-Titer für reines rHA0; den Impfstoff Fluzone^® und rHA0-Alaun in Dosierungen von 0,5 μg (schraffierte Balken), 0,1 μg (senkrecht gestreifte Balken), 0,02 μg (gepunktete Balken) und 0,004 μg (weiße Balken) darstellt.
4a, 4b und 4c sind grafische Darstellungen der anti-HA-Immunantwort von Mäusen, die mit rHA oder zugelassenem trivalenten Impfstoff, Formulierung 1994–1995, immunisiert worden waren; Wochen nach Impfung gegen HIA-Titer, für HAI A/Texas/36/91 (4a), HAI A/Shangdong/9/93 (4b), und HAI B/Panama/45/90 (4c); rHA (Rauten) und abgeschwächten, in Eiern kultivierten FLUVIRON^® Impfstoff (Quadrate).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Influenza-Impfstoffes wird beschrieben. Ein ungespaltenes (HAO) Hämagglutinin-Antigen voller Länge von einem Influenzavirus wird mit Baculovirus-Expressionsvektoren in kultivierten Insektenzellen hergestellt und unter nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt. Zwei oder mehr gereinigte Hämagglutinin-Antigene von Influenza A- und/oder Influenza B-Stämmen werden zusammengemischt, um einen multivalenten Influenza-Impfstoff herzustellen. Die rekombinanten Antigene können mit einem Adjuvans-Transportmittel zur erhöhten Wirksamkeit kombiniert werden.
Die Verwendung von rekombinanter DNA-Technik zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen bietet mehrere Vorteile: ein rekombinanter DNA-Influenza-Impfstoff kann unter sichereren und strenger kontrollierten Bedingungen hergestellt werden; Vermehrung von infektiöser Influenza in Eiern ist nicht erforderlich; rekombinantes HA-Protein kann höher gereinigt werden, was Nebenwirkungen auf Grund von verunreinigenden Proteinen praktisch beseitigt; Reinigungsverfahren für rekombinantes HA müssen keine Virusinaktivierung oder organische Extraktion von viralen Membranbestandteilen beinhalten, wodurch Denaturierung von Antigenen und zusätzliche Sicherheitsbelange auf Grund von Restchemikalien im Impfstoff vermieden werden; Herstellung von HA mittels rekombinanter DNA-Technik liefert eine Möglichkeit, die genetische Heterogenität zu vermeiden, die während der Adaptation und Passage durch Eier auftritt, wodurch es möglich sein sollte, Impfstämme besser an die epidemischen Influenzastämme anzupassen, was verbesserte Wirksamkeit nach sich ziehen würde; und ein rekombinanter Ansatz kann auch eine Stammselektion später im Jahr erlauben, wodurch Zeit für Selektionen gewonnen würde, die auf verlässlicheren epidemiologischen Daten basieren.
Das Baculovirus-Expressionssystem
Baculoviren sind DNA-Viren in der Familie der Baculoviridae. Von diesen Viren ist bekannt, dass sie einen engen Wirtsbereich haben, der primär auf Insektenarten der Lepidoptera (Schmetterlinge und Motten) begrenzt ist. Das Baculovirus von Autographa californica, Kernpolyeder-Virus (AcNPV), das das Prototyp-Baculovirus geworden ist, repliziert sich wirksam in empfänglichen kultivierten Insektenzellen. AcNPV hat ein doppelsträngiges, geschlossenes, ringförmiges DNA-Genom von etwa 130.000 Basenpaaren und ist im Hinblick auf Wirtsbereich, Molekularbiologie und Genetik gut beschrieben.
Viele Baculoviren, einschließlich AcNPV, bilden große kristalline Proteinocclusionen innerhalb des Zellkerns der infizierten Zellen. Ein einzelnes Polypeptid, als ein Polyhedrin bezeichnet, ist für etwa 95% der Proteinmasse dieser Occlusionskörper verantwortlich. Das Gen für Polyhedrin liegt als eine einzelne Kopie im viralen AcNPV-Genom vor. Weil das Polyhedrin-Gen für die Replikation des Virus in kultivierten Zellen nicht essentiell ist, kann es leicht modifiziert werden, um fremde Gene zu exprimieren. Die fremde Gensequenz wird in das AcNPV-Gen direkt 3' der Polyhedrin-Promotorsequenz inseriert, sodass sie unter der transkriptionalen Kontrolle des Polyhedrin-Promotors steht.
Rekombinante Baculoviren, die fremde Gene exprimieren, werden durch homologe Rekombination zwischen Baculovirus-DNA und chimären Plasmiden, die die Gensequenz von Interesse enthalten, hergestellt. Rekombinante Viren können durch ihre klar abgegrenzte Plaque-Morphologie nachgewiesen und auf Homogenität plaquegereinigt werden.
Baculoviren sind besonders gut zur Verwendung als eukaryontische Clonierungs- und Expressionsvektoren geeignet. Sie sind allgemein sicher aufgrund ihres engen Wirtsbereiches, der auf Arthropoden begrenzt ist. Die Environmental Protection Agency (EPA) der USA hat die Anwendung von drei Baculovirus-Arten zur Kontrolle von Insektenschädlingen genehmigt. AcNPV wird seit vielen Jahren gemäß der EPA-Genehmigung (Experimental Use Permits) bei Feldfrüchten verwendet.
Der AcNPV-Wildtyp und rekombinante Viren vermehren sich in einer Reihe von Insektenzellen, einschließlich kontinuierlicher Zelllinien, die vom Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae) abstammen. Zellen von S. frugiperda haben eine Populationsverdopplungszeit von 18 bis 24 Stunden und können in Kulturen aus einzelliger Schicht oder in freier Suspension gezüchtet werden.
Die Herstellung von rekombinanten HA-Proteinen kann in Zellen erfolgen, die von der Lepodoptera-Art Spodoptera frugiperda abstammen, ist aber nicht darauf begrenzt. Andere Insektenzellen, die vom Baculovirus infiziert werden können, wie etwa jene von den Arten Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni oder Lamanthria dispar, können gleichfalls als ein geeignetes Substrat verwendet werden, um rekombinante HA-Proteine herzustellen.
Die am meisten bevorzugte Wirtszelllinie zur Proteinproduktion von rekombinanten Baculoviren ist Sf900+. Eine andere bevorzugte Wirtszelllinie zur Proteinproduktion von rekombinanten Baculoviren ist Sf9. Sf900+ und Sf9 sind nicht transformierte, nicht tumorigene kontinuierliche Zelllinien, die vom Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae) abstammen. Sf900+- und Sf9-Zellen werden bei 28 ± 2°C ohne Kohlendioixd-Ergänzung gezüchtet. Das für Sf9-Zellen verwendete Kulturmedium ist TNMFH, ein einfaches Gemisch aus Salzen, Vitaminen, Zuckern und Aminosäuren, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum. Abgesehen vom fötalen Rinderserum werden keine anderen von Tieren stammenden Produkte (z. B. Trypsin etc.) zur Zellvermehrung verwendet. Serumfreies Kulturmedium (erhältlich als Sf900-Kulturmedien, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) kann ebenfalls zum Züchten von Sf9-Zellen verwendet werden und wird für die Vermehrung von Sf900+-Zellen bevorzugt.
Sf9-Zellen haben eine Populationsverdopplungszeit von 18–24 Stunden und können in Kulturen aus einzelliger Schicht oder in freier Suspension vermehrt werden. Es ist nicht berichtet worden, dass Zellen von S. frugiperda die Replikation eines der bekannten Säugerviren unterstützt.
Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen, dass der Expressionsvektor nicht auf ein Baculovirus-Expressionssystem begrenzt ist. Die rekombinanten HA-Proteine können auch in anderen Expressionsvektoren exprimiert werden, wie etwa Entomopockenviren (die Pockenviren der Insekten), cytoplasmatischen Polyederviren (CPV) und Transformation von Insektenzellen mit konstitutiver Expression des rekombinanten HA-Gens oder der rekombinanten HA-Gene.
Isolierung von Influenza-Stämmen
Ein oder mehrere Influenza-Stämme werden von Individuen isoliert, die mit der Krankheit infiziert sind. Bevorzugt sind die Influenza-Stämme jene, die von der Food and Drug Administration (FDA) oder CDC identifiziert sind, dass sie epidemisches Potential für die kommende Influenza-Saison haben. Ein Vorteil des hierin beschriebenen Verfahrens ist, dass klinische Proben wie etwa Nasensekret von Patienten, die mit Influenza infiziert sind, als direkte Quelle für das Virus verwendet werden können. Alternativ können sie von der FDA oder CDC erhalten werden.
Vermehrung von Influenza-Stämmen
Die Stämme werden dann in Zellen vermehrt, die hohe Virus-Titer erzeugen, wie etwa Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen (erhältlich bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC CCL34). Zum Beispiel werden MDCK-Zellen in Anwesenheit von Konzentrationen von Trypsin, das mit Tosylphenylalanyl-chloromethylketon (TPCK) teilweise inaktiviert wurde, und fötalem Rinderserum, die so optimiert sind, dass sie die höchsten Titer für die erste Passage des Virus erzeugen, infiziert. Die MDCK-Zellen werden mit den Influenza-Stämmen mit einer niedrigen Multiplizität der Infektion (0,1 bis 0,5) infiziert, was durch einen standardisierten HA-Test bestimmt wird (Rosen, "Hemagglutination with Animal Virusses" in Fundamental Techniques in Virology, Hrsg. K. Nabel und N. P. Salzmann, S. 276–28 (Academic Press, New York 1969)). Die infizierten Zellen werden bei 33°C über 48 Stunden inkubiert, und die Kulturmedien werden unter Verwendung des Hämagglutinierung-Aktivitätstest auf Virusproduktion untersucht. Die Bedingungen, die die höchste HA-Aktivität ergeben, werden dann verwendet, um große Mengen an Stammlösung des Influenzavirus zu erzeugen.
Reinigung des Virus
Viruspartikel, die bei der ersten Passage erzeugt wurden, werden von den Kulturmedien gereinigt, indem bekannte Reinigungsverfahren wie etwa Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation verwendet werden. Zum Beispiel wird das Virus 24–48 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugieren der Kulturmedien der mit Influenza infizierten MDCK-Zellen gewonnen. Der resultierende Virus-Niederschlag wird in Pufferlösung resuspendiert und durch einen gepufferten Saccharose-Gradienten zentrifugiert. Die Bande mit dem Influenzavirus wird aus der 40–45%igen Saccharose-Region gewonnen, mit Pufferlösung verdünnt und durch Zentrifugation mit 100.000 × g ausgefällt. Der gereinigte Virus-Niederschlag wird in Pufferlösung resuspendiert und bei –70°C gelagert.
Clonierung von Influenza-Hämagglutinin-Genen.
Ein Überblick über die Verfahren zur Clonierung von HA-Genen wird in 1 gegeben. Grundsätzlich werden die Zellen mit dem Influenza-Stamm infiziert, der cloniert werden soll. Das Virus wird aus den Zellkulturmedien gewonnen, und entweder wird virale RNA bei Influenza-A-Stämmen oder mRNA bei Influenza-B-Stämmen isoliert. Virale RNA (-RNA) wird aus gereinigten Virionen extrahiert und unter Verwendung von Standardverfahren auf Formaldehyd-Agarosegelen analysiert. cDNA wird synthetisiert, indem entweder ein universelles Primer-System für die virale RNA der Influenza-A-Stämme oder zufällige Primer für die mRNA der Influenza-B-Stämme verwendet werden. Komplementäre Plus-Strang-DNA (cDNA) wird unter Verwendung eines universellen Oligonucleotid-Primers (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1)) hergestellt, die homolog zu allen Hämagglutinin-RNA-Segmenten in Influenza-A- und -B-Viren ist (Davis et al., "Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (H0N1) of influenza virus" Gene, 10: 205–218 (1980). Primer werden entworfen, die homolog zu den konservierten Regionen an den 5'- und 3'-Enden der Influenza-Hämagglutinin-Gene sind. Sowohl 5'- als auch 3'-Primer weisen auch Stellen für Restriktionsenzyme an den Enden auf, die innerhalb der Hämagglutinin-Gene nicht gefunden werden.
Die geeigneten Primer für Influenza A oder B und die Influenza-cDNA werden gemischt und die Hämagglutinin-Gensegmente unter Verwendung von PCR-Standardverfahren amplifiziert. Die resultierenden doppelsträngigen DNA-Fragmente enthalten die gesamten Codierungssequenzen für reifes Hämagglutinin. Die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") wird verwendet, um das gesamte HA-Gen zu amplifizieren, welches dann in eine geeignete bakterielle Wirtszelle wie etwa E. coli cloniert wird. Die 5'-Enden werden sequenziert, um das Signalpeptid der HA-Gene zu identifizieren, dann wird die PCR verwendet, um die HA-Gene minus des Signalpeptids zu amplifizieren. Dieses wird dann in einen Plasmid-Transfervektor subcloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält. Die resultierenden Transfervektoren enthalten die folgenden 5'→3'-Sequenzen: Polyhedrin-Promotor vom Baculovirus A. californica-NPV, ein ATG-Translationsstartcodon, ein 61 K großes Baculovirus-Signalpeptid, die Codierungssequenzen für reifes Hämagglutinin, das natürliche Translationsterminierungscodon von Hämagglutinin, das Polyadenylierungssignal für Polyhedrin-RNA und flankierende Baculovirus-DNA.
Eine gereinigte chimäre Transferplasmid-DNA, die ein cloniertes Hämagglutinin-Gen enthält, wird dann mit AcNPV-DNA des Wildtyps vermischt, zusammen mit Calcium ausgefällt und in Zellen von S. frugiperda transfiziert. Rekombinante Baculoviren werden auf der Basis von Plaque-Morphologie selektiert und durch zusätzliche Runden der Plaque-Reinigung weiter gereinigt. Clonierte rekombinante Baculoviren werden auf Expression von Hämagglutinin durchmustert, und ein einzelner Baculovirus-Expressionsvektor wird ausgewählt, um eine Master-Virusbank zu erstellen.
Influenza A-Stämme:
HA-Gene aus Influenza A-Stämmen werden aus gereinigten RNA-Präparaten cloniert. Virale RNA wird aus 100–200 Mikrolitern gereinigter Influenza A-Virionen, die 1.000–2.000 Influenza-Hämagglutinin-Einheiten (HAU) enthalten, extrahiert. Eine HAU ist die Virusmenge, die 50% der roten Blutzellen im Standard-Agglutinationstest (Rosen 1961) agglutiniert. Die Virionen werden mit Proteinase K behandelt, um Protein zu spalten, dann wird die virale RNA mit gleichen Volumina von Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol in Anwesenheit eines tRNA-Trägers ausgefällt. Die virale RNA wird in Pufferlösung resuspendiert und mit RNAse-freier DNAse gespalten, um jede verunreinigende DNA zu entfernen, dann werden die Extraktions- und Fällungsschritte wiederholt. Virale RNA (vRNA) wird dann mit Hilfe von Formaldehyd-Agarosegelen analysiert, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. S. 86–96 und 366–367 (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N. Y. 1982) beschrieben.
Influenza B-Stämme:
HA-Gene von Influenza B-Stämmen werden aus vollständiger Boten-RNA (mRNA) cloniert, die aus mit dem Influenza B-Stamm infizierten Zellen extrahiert wird. Vollständige RNA wird dann aus den infizierten Zellen extrahiert. Die gewonnenen Zellen werden in Anwesenheit von Guanidiniumthiocyanat lysiert, und die vollständige Zell-RNA wird zum Beispiel unter Verwendung des RNA-Extraktionskit von Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ) gereinigt. Die vollständige mRNA wird aus zellulärer RNA unter Verwendung von Oligo-(dT)-Cellulose- Zentrifugationssäulen mit Hilfe zum Beispiel des mRNA Purification Kit von Pharmacia Biotech Inc. extrahiert.
Expression und Prozessierung von rekombinantem Hämagglutinin in Insektenzellen
Rekombinante Hämagglutinin-Antigene werden in großen Mengen in Zellen von S. frugiperda, die mit AcNPV-Hämagglutinin-Vektoren infiziert sind, exprimiert. Das primäre Genprodukt ist nicht prozessiertes Hämagglutinin in vollständiger Länge (rHA0) und wird nicht sekretiert, sondern bleibt mit den peripheren Membranen der infizierten Zellen verbunden. Dieses rekombinante HAO ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 68.000, das mit N-verbundenen Glycanen des Hoch-Mannose-Typs glycosyliert ist, die sich von den durch Expression der viralen Proteine in Säuger- oder Vogelzellen produzierten Glycanen unterscheiden. Es hat den Anschein, dass rHA0 posttranslational Trimere bildet, die in cytoplasmatischen Membranen akkumulieren.
Vektoren zur Expression von HAO und anderen Proteinen
HAO ist auf Grund seiner besseren Stabilität im Vergleich mit dem HA1/HA2-Komplex ein besserer Impfstoff und behält die korrekte Faltung während der Reinigung und Lagerung bei. Die bessere Stabilität tritt zum Teil auch bei den B-Stämmen auf und resultiert in Titern, die etwa fünffach höher als die, die mit käuflich zu erwerbenden abgeschwächten B-Stämmen zu erreichen sind.
Wie nachstehend in den Beispielen beschrieben wird, wurde bei der Clonierung der HA-Gene in pMGS12 über Restriktionsstellen das reife HA-Signalpeptid entfernt und durch das Chitinase-Signalpeptid des Baculovirus, als das 61-kD-Signalpeptid bezeichnet, ersetzt. Da das HA-Gen mit dem Chitinase-Signalpeptid durch eine Spaltstelle verbunden ist, befinden sich, abhängig von der ausgewählten Restriktionsstelle, zwischen drei und fünf Aminosäuren zwischen dem reifen HAO-Protein und dem 61-kD-Signalpeptid. Während dies kein Problem bei den A-Stämmen der Influenza darstellt, faltet sich das HAO vom B-Stamm nicht richtig, wenn es zusammen mit den zusätzlichen Aminosäuren exprimiert wird.
Zwei Wege zur Überwindung dieses Problems wurden entwickelt. Der erste besteht darin, einen neuen Vektor, pMGS3, zu verwenden, der das 61-kD-Signalpeptid nicht codiert. HAO mit seinem natürlichen Signalpeptid wird in den Vektor cloniert und exprimiert. Bei der Charakterisierung durch SDS-PAGE zeigt das in diesem Vektor exprimierte HAO des B-Stammes bessere Glycosylierung und Prozessierung als bei Expression in pMGS12. Das HAO faltete sich so gut, dass es quantitativ in HA1/HA2 umgewandelt werden kann. Unglücklicherweise ist die Ausbeute nicht so hoch, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Das zweite Verfahren erhöht die Ausbeute durch Verwendung des 61-kD-Signalpeptids in pMGS12 zur Steuerung der Expression, wobei das HAO-Gen ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen inseriert worden war. Der neue Vektor, der das 61-kD-Signalpeptid und das HAO-Gen ohne eine Sequenz, die fremde, dazwischen liegende Aminosäuren codiert, umfasst, wird als pMGS27 bezeichnet.
pMGS27 kann zur Clonierung und Expression jedes Genes in einem Baculovirus-Expressionssystem verwendet werden. Das Ziel-Gen wird, anstatt durch Restriktion und Ligierung in den Vektor cloniert zu werden, durch Anellierung in den Vektor cloniert. Reagenzien sind von Clontech in deren PCR-direct-Cloning System erhältlich. pMGS27 wurde so konstruiert, dass es am Ende der Codierungsregion für das Chitinase-Signalpeptid linearisiert werden kann und durch Behandlung des linearisierten pMGS27 mit T4-DNA-Polymerase plus dATP zwei lange, einzelsträngige Schwänze erzeugt werden können.
Das Ziel-Gen wird mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") oder der PCR mit reverser Transkriptase ("RT-PCR") mit einem Paar Oligonucleotiden amplifiziert, die entworfen wurden, um einzelsträngige Schwänze zu erzeugen, die komplementär zu den Schwänzen des behandelten pMGS27 sind, nachdem das PCR-Fragment mit T4-DNA-Polymerase und dTTP behandelt worden ist. Ein einfaches Anellieren kann dann die beiden Moleküle zu einem kreisförmigen Plasmid kombinieren, das die Wirtszelle transformieren kann. Neben der Tatsache, dass es schneller und einfacher als das herkömmliche Restriktions-Ligierungssverfahren zur Clonierung eines HA-Gens in pMGS12 ist, hat pMGS27 den entscheidenden Vorteil, dass es keine zusätzlichen Aminosäuren, codiert durch die Restriktionsstellen, die zwischen dem Chitinase-Signalpeptid und dem reifen HA-Protein erzeugt wurden, ergibt. Diese zusätzlichen Aminosäuren können gelegentlich zu Schwierigkeiten führen, etwa dass Signalpeptidase das Signal nicht abspalten kann oder dass das codierte Protein sich nicht korrekt falten kann, wie im Fall des HA vom B-Stamm.
Reinigung von rekombinantem HAO
Einige Tage nach der Infektion kann rHA0 selektiv aus den peripheren Membranen der mit AcNPV-Hämagglutinin infizierten Zellen mit einem nicht denaturierenden nichtionischen Detergenz oder anderen Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Insektenzellen bekannt sind, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, der Affinitäts- oder Gelchromatographie und Antikörperbindung, extrahiert werden. Das im Detergenz lösliche rHA0 kann unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch- und Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie oder anderer äquivalenter Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, weiter gereinigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das rHA0 unter Verwendung eines Verfahrens gereinigt, das sanfter ist und eine höhere Ausbeute an dem rHA0 aus B-Stämmen von Influenza zur Folge hat. Dieses Verfahren verläuft allgemein wie nachstehend beschrieben:
Das HAO-Protein, das einen integralen Bestandteil der Membran von Insektenzellen bildet, wird von den löslichen Proteinen, den peripheren Membranproteinen und der Mehrzahl der DNA und RNA durch Extraktion der Zellen in einer relativ viskosen alkalischen Lösung, für die ein alkalischer pH-Wert als zwischen 9,5 und 10,5 liegend definiert ist, getrennt. Die Viskosität wird durch den Einschluss von Saccharose in einer Konzentration von etwa 250 mM erhöht. Ein Disulfid-reduzierendes Agens, zum Beispiel β-Mercaptoethanol, wird in einer Konzentration eingeschlossen, die Disulfid-Bindung von Proteinen in dem Gemisch wirksam verhindert. Die Zellen werden in der Extraktionspufferlösung suspendiert, homogenisiert und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird durch Homogenisierung in einer Pufferlösung mit niedriger Ionenstärke, die ein Disulfid-reduzierendes Agens enthält, bei einem alkalischen pH-Wert (Leitfähigkeit im Allgemeinen geringer als 1 mS, pH-Wert 10,5) gewaschen, und der Niederschlag wird zentrifugiert. Das HAO wird dann in einer Pufferlösung aus dem Niederschlag, die zwischen 0,3 und 1,5% Detergenz wie etwa Triton, eine Menge an Disaggregationsagens, die Komplexbildung auf Grund von Ladungswechselwirkungen wirksam verhindert, wie etwa zwischen 0,3 und 1,0 M Betain oder Paurin enthält, bei einem alkalischen pH-Wert (9,5 ist bevorzugt) extrahiert. Das HAO im Überstand wird dann durch Anionenaustausch-Chromatographie, gefolgt von Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt. Das HAO wird auf die Anionenaustauschsäule, zum Beispiel DEAE oder Q-Sepharose^® (eine Säule mit Agarose-Perlen mit quartären Aminogruppen), in der selben Pufferlösung, in der es extrahiert wurde, aber mindestens 1:2 mit zusätzlicher Pufferlösung verdünnt, aufgetragen, nachdem die Säule in Pufferlösung äquilibriert wurde, die etwa 1/10 der Konzentration des Detergenz und Disulfid-reduzierenden Agens enthält. Das HAO wird dann durch Senken des pH-Wertes auf etwa 8,5 eluiert. Das eluierte HAO wird auf eine Kationenaustauschsäule in der im Wesentlichen gleichen Pufferlösung aufgetragen. Verunreinigungen werden durch Senken des pH-Wertes auf etwa 7,4 eluiert, dann wird das HAO durch Erhöhung der Salzkonzentration auf 0,15 M NaCl eluiert.
Dieses bevorzugte Verfahren zur Reinigung wird nachstehend genau beschrieben.
Präparation der Membranfraktion, die das rekombinante HA enthält. Zellen, die rekombinantes HA exprimieren (6,2 g Zellen aus 0,34 l Kulturansatz), werden in 100 mg/ml eisgekühltem Natriumpyrophosphat, 100 mM Natriumchlorid, 250 mM Saccharose, 0,1% β-Mercaptoethanol, pH-Wert 10,5 suspendiert. Die Zellen werden unter Verwendung eines Polytron^®-Homogenisators (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY) bei Stufe 4 über 2 min aufgebrochen. Der alkalische pH-Wert des Homogenisierungsmediums wird benötigt, um die Löslichkeit der verunreinigenden Proteine zu erhöhen und um die Reinheit der Membranpräparation zu erhöhen. Das Homogenat wird über 30 min bei 9.200 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag gesammelt. Der Präparation der Membranfraktion folgt ein Waschschritt bei niedriger Ionenstärke. Der Niederschlag wird auf das Ausgangsvolumen in eisgekühltem 0,1% β-Mercaptoethanol, 10,5, resuspendiert und unter Verwendung eines Polytron^®-Homogenisators bei Stufe 4 über 2 min homogenisiert. Das Homogenat wird über 30 min bei 9.200 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag gesammelt. Diese Waschung bei niedriger Ionenstärke entfernt einen zusätzlichen Teil der peripheren Membranproteine. Die Präparation der Membranfraktion führt zu der beachtlichen Anreicherung des rekombinanten HA und zur Entfernung von verunreinigenden Nucleinsäuren.
Extraktion des rekombinanten HA. Das rekombinante HA wird dann unter Bedingungen, die das Antigen nicht denaturieren, selektiv aus dem Membran-Niederschlag extrahiert. Der Membran-Niederschlag wird in 41 ml eisgekühltem 10 mM Ethanolamin, pH-Wert 9,5, 1% Triton N 101, 0,1% β-Mercaptoethanol, 25 mM NaCl, 400 mM Betain unter Verwendung eines Polytron^®-Homogenisators bei Stufe 4 über 2 min homogenisiert. Nach Inkubation über 40 min bei 23°C wird das Gemisch über 30 min bei 9.200 × g zentrifugiert. Der Überstand, der das rekombinante HA enthält, wird abgegossen und zweifach mit der gleichen Pufferlösung verdünnt.
Die Proteine werden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Proben werden in einem kochenden Wasserbad über 10 min in Anwesenheit von 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5% β-Mercaptoethanol aufgebrochen, dann wird eine Elektrophorese auf einem 11% Polyacrylamid-Gel in Anwesenheit von 0,1% SDS durchgeführt, dann wird mit Coomassie-Blau angefärbt.
Chromatographische Reinigung. Chromatographische Reinigung des rekombinanten HA wurde vereinfacht, und die teure Affinitätschromatographie auf Lentil-Lectin-Sepharose wurde aus dem Prozess eliminiert und durch einen chromatographischen Reinigungsprozess in zwei Stufen ersetzt, was zu einem hoch gereinigten rekombinanten HA-Antigen führt, das nicht denaturiert ist und als ein Bestandteil eines Influenza-Impfstoffes zur Anwendung beim Menschen geeignet ist. Die verwendeten Chromatographie-Gelmatrices sind Pharmacia Q-Sepharose^® Fast Flow und CM-Sepharose Fast Flow^®.
Anionenaustausch-Chromatographie. Alle Chromatographien werden bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der rekombinantes HA enthaltende Extrakt, der wie vorstehend präpariert wurde, wird mit 1 ml/min auf Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow^® aufgetragen (5 ml in einer C10/10-Pharmacia Säule), die mit 10 mM Ethanolamin, pH 9,5, 0,1% Triton^® N101, 0,01% β-Mercaptoethanol, 25 mM NaCl, 400 mM Betain äquilibriert worden war. Die Säule wird dann mit der Pufferlösung zur Äquilibrierung gewaschen, bis die UV-Absorption des Effluens zur Grundline zurückkehrt. Unter diesen Bedingungen bindet rekombinantes HA an die Säule, während Teile der Verunreinigungen durchfließen. Zum Teil gereinigtes rekombinantes HA wird dann mit 30 mM Diethanolamin, pH 8,5, 0,1% Triton^® N101, 0,01% β-Mercaptoethanol, 25 mM NaCl, 400 mM Betain eluiert.
Kationenaustausch-Chromatographie. Das Q-Sepharose-Eluat (23 ml) wird zweifach mit 30 mM Diethanolamin, pH 8,5, 0,1% Triton^® N 101, 0,01% β-Mercaptoethanol, 10 mM NaCl, 400 mM Betain verdünnt. Die Säule wird dann mit 35 ml 10 mM-Natriumphosphat, pH 7,4, 0,1% Triton^® N 101, 0,01% β-Mercaptoethanol, 10 mM NaCl, 400 mM Betain gewaschen. Diese Behandlung eluiert die Verunreinigungen aus der Säule, während rekombinantes HA an die CM-Sepharose gebunden bleibt. Das Detergenz wird dann durch Waschen der Säule mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 10 mM NaCl entfernt, bis die UV-Absorption des Effluens zur Grundlinie zurückkehrt. Gereinigtes rekombinantes HA wird mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, pH 7,5 (PBS) eluiert.
Gereinigtes rHA0 wird in einer isotonischen, gepufferten Lösung resuspendiert. Nach der Entfernung des Detergenz wird gereinigtes rHA0 rote Blutzellen wirksam agglutinieren.
Strukturelle und biologische Eigenschaften von rekombinantem HAO
rHA0 wird auf mindestens 95% Reinheit, stärker bevorzugt 99% gereinigt. Dieses wandert vorwiegend als ein einzelnes Haupt-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 68.000 auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel. Die Quartärstruktur von gereinigtem, rekombinantem HAO-Antigen wurde mittels Elektronenmikroskopie, Trypsin-Resistenz, Dichtesedimentationsanalyse und der Fähigkeit, rote Blutzellen zu agglutinieren untersucht. Diese Daten zeigen, dass rekombinantes HAO Trimere bildet, die sich in Rosetten anordnen.
Gereinigtes rHA0 agglutiniert Zellen nicht vor der Entfernung des Detergenz, was nahelegt, dass das Antigen Komplexe (Rosetten) bilden muss, um Kreuzbindung mit roten Blutzellen von Küken einzugehen. Die quantitative Fähigkeit von gereinigtem rHA0, Zellen zu agglutinieren, wird als ein Maß für die Übereinstimmung des Antigens von Charge zu Charge verwendet. Eine Hämagglutinin-Einheit ist als die Menge an Antigen definiert, die notwendig ist, um 50% Agglutinierung in einem standardisierten Hämagglutinin-Test mit roten Blutzellen von Küken zu bewirken. Vergleichende Daten zeigen, dass gereinigte rHA0-Antigene rote Blutzellen mit einer Wirksamkeit agglutinieren, die jener vergleichbar ist, die mit den vollständigen Influenza-Virionen beobachtet wird.
Das rekombinante HAO kann an der Disulfidbrücke gespalten werden, was eine Konformationsänderung bedingt, die in der Bildung von zwei Ketten, HA1 und HA2, mündet, wie von Carr, C. M. und Kim, P. S., "A Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza Hemagglutinin", Cell 73: 823–832 (1993) beschrieben wurde. Spaltung von rekombinantem HAO wird nachstehend in Beispiel 6 genauer beschrieben. Man nimmt an, dass die Ketten durch die Spaltung von natürlichem HAO in HA1 und HA2 infektiös werden, indem sie dadurch die Fähigkeit erwerben, mit einer Zelle zu fusionieren, womit sie eine verstärkte Immunantwort hervorrufen. Die Prozessierung von Antigenen wie etwa Influenza-Hämagglutinin geschieht durch die Bindung von Antigen-Peptiden an Haupthistokompatibilitäts-Moleküle (MHC). Der Antigen/MHC-Komplex wird von T-Zellen erkannt und leitet eine Immunantwort ein, wie in dem Überblick von Harding und Geuze, Current Opinion in Cell Biology 5: 596–605 (1993) beschrieben. Das in einem Baculovirus produzierte rHA0 ist jedoch hochstabil und immunogen wie das intakte Molekül.
Vergleich der Zuckermoleküle auf dem HAO, das in Insektenzellen exprimiert wird, zeigt, dass die Glycane sich von denen unterscheiden, die auf dem HAO in Säuger- oder Vogelzellen exprimiert werden.
Herstellung von Fusionsproteinen
Fusionsproteine, die aus dem HAO fusioniert mit einem zweiten, antigen wirkenden Protein bestehen, können hergestellt werden, wobei die antigene Aktivität des zweiten Proteins gering ist oder es Vorteile gibt, eine Immunantwort auf multiple Antigene hervorzurufen. Ein Beispiel für ein bevorzugtes zweites Antigen ist die Neuraminidase, produziert durch Influenza. Das Antigen kann aus einem zellulären, viralen oder bakteriellen Protein oder dem antigen wirkenden Teil hiervon bestehen, der mindestens fünf bis acht Aminosäuren umschließt. Andere Antigene schließen das Hepatitis B-Antigen, HIV-Antigene und carcinoembryonisches Antigen ein. Eine „Immunantwort" betrifft, wie hierin verwendet, entweder eine humorale Antwort, gemessen an der Produktion von Antkörpern gegen das Antigen, oder eine zelluläre Antwort, gemessen am Hervorrufen einer T-Zell-vermittelten Antwort auf das Antigen. In einigen Fällen kann ein "Linker" aus nicht antigen wirkenden Aminosäuren zwischen das HA und das Antigen geschoben sein, um die Antigenität des Antigens im Vergleich zum HA weiter zu verstärken. Der Prozess beinhaltet die Konstruktion eines DNA-Plasmids, um Ziel-Antigengene mit dem Vollängen- oder mit Fragmenten des HA-Gens des Influenzavirus zu fusionieren, wobei die Verfahren der Oligonucleotid-Sonden und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden.
Die HA-Zielantigen-Fusionsgene werden für eine ordnungsgemäße Expression in Insektenzellen verändert, indem die natürlichen hydrophoben Signalpeptid-Sequenzen deletiert und durch ein neues Baculovirus-Signalpeptid ersetzt werden. Das Fusionsgen wird in den Baculovirus-Expressionsvektor eingebracht, so dass der Polyhedron-Promotor des Baculovirus die Transkription des Fusionsproteins in infizierten Insektenzellen steuert. Das Baculovirus-Signalpeptid mit einer Länge von 18 Aminosäuren steuert die Translation des HA-Zielantigen-Fusionspolypeptids in den Glycosylierungsstoffwechselweg der Insektenzelle und ist bei dem reifen Fusionsprotein nicht anwesend.
Zum Beispiel wurde Plasmid pA9440, der das HA-Gen des Stammes A/Beijing/32/92 in dem nachstehend beschriebenen pMGS12-BaculovirusTransferplasmid enthält, als eine Matrize für die Amplifizierung des HA-Gens durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls (Gene Amp PCR-Clonierungskit, Perkin Elmer Cetus) verwendet. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt 20 pMol an Primern, die zur Anheftung an Teile der HA-Gene entworfen worden waren. Die 5'- und 3'-Primer enthielten Stellen für Restriktionsendonucleasen an den Enden, die nicht innerhalb des HA-Gens gefunden wurden. Der 5'-PCR-Primer (O-567) für die HAO- und HA1-Fragmente beginnt 52 Basenpaare stromabwärts vom 5'-Ende der natürlichen Codierungssequenz des HA-Gens, wobei die natürliche Signalpeptid-Sequenz deletiert wird, und fügt eine SmaI-Stelle direkt 5' an die HA-Codierungssequenzen an. Der 5'-PCR-Primer (O-651) für das HA2-Fragment beginnt am Nucleotid 1108 des natürlichen HA-Gens, direkt auf das Codon folgend, das den Arginin-Rest codiert, der während der Spaltung von HAO in HA1 und HA2 entfernt wird. Der 3'-PCR-Primer (O-680) für die HAO- und HA2-Fragmente wurde entworfen, um eine KpnI-Stelle direkt nach den HA-Codierungssequenzen hinzuzufügen, was das natürliche Stoppcodon entfernt. Der 3'-PCR-Primer für HA1 (O-679) verkürzt das Gen direkt vor dem Arginin-Rest, der während der HAO-Spaltung entfernt wird. Amplifizierung des HA-Genfragmentes wurde über 30 Zyklen durchgeführt, jeder bestehend aus 1 min bei 94°C zur Denaturierung, 2 min bei 55°C zur Anheftung der Primer und 2 min bei 72°C zur Extension. Die entstandenen amplifizierten HA-Genfragmente wurden der Elektrophorese auf Agarosegelen unterworfen, unter Verwendung eines GeneClean-Kits (Bio 101, Inc.) vom Gel gereinigt und in ein zur Aufnahme von PCR-erzeugten Fragmenten entworfenes Plasmid (pCRII; Invitrogen) ligiert. Auf diese Weise wurden die Plasmide pB142, pB144 und pB330 erhalten, die die HAO-, HA1- bzw. HA2-Genfragmente enthielten.
Die HA-Genfragmente wurden aus den Plasmiden pB142, pB144 und pB330 mit SmaI- und KpnI-Restriktionsenzymen entfernt und dann mit Standardtechniken für rekombinante DNA (Sambrook et al., 1989) in das AcNPV-Transferplasmid pMGS12 subcloniert. Das pMGS12-Plasmid umfasst, vom 5'- zum 3'-Ende, den AcNPV-Polyhedron-Promotor, ein ATG-Initiationscodon, die Sequenz für ein abspaltbares Signalpeptid von einem Baculovirus-Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 61.000 (61K), SmaI- und KpnI-Restriktionsenzym-Clonierungsstellen und eine universelle TAA-Stoppcodon-Sequenz. Diese Regulationsregionen werden von DNA aus dem EcoRII-Fragment aus dem AcNVP-Genom flankiert (Summers und Smith, "A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures". Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987)). Die clonierten HA-PCR-Fragmente wurden mit SmaI und KpnI aus dem pCRII-Clonierungsvektor ausgeschnitten, mit Agarosegel-Elektrophorese und dem GeneClean-Kit gereinigt und in pMGS12 ligiert, das gleichfalls mit SmaI und KpnI gespalten worden war. Die entstandenen AcNPV-Transferplasmide, pB879, pB1201 und pB1205 enthielten die Codierungsregionen für HAO, HA1 bzw. HA2, im Rahmen verbunden mit dem abspaltbaren Baculovirus-Signalpeptid vom 61K-Gen und dem Polyhedron-Promotor. Die AcNPV-Transferplasmide pB879, pB1201 und pB1205 können verwendet werden, um HAO, HA1 oder HA2 mit jedem Gen von Interesse zu fusionieren.
Der zweite Schritt bei der Konstruktion von Transferplasmiden für HA-CEA-Fusionsgene bestand darin, die CEA-Codierungssequenz in die HA-codierenden Konstruktionen zu inserieren. Stellen für Erkennung/Abspaltung von Restriktions-Endonucleasen für SmaI und KpnI wurden durch PCR-Amplifizierung des Plasmids pA9080 an beiden Enden des CEA-Gens platziert. Der 5'-Primer, O-649, beginnt 82 Basenpaare vom 5'-Ende des Gens entfernt und deletiert die natürliche CEA-Signalpeptid-Sequenz. Der 3'-PCR-Primer, O-650, wurde entworfen, um die letzten 72 Basenpaare am 3'-Ende des Gens, das die Sequenz der hydrophoben C-terminalen Region codiert, zu deletieren. Amplifizierung des CEA-Genfragmentes wurde in 30 Zyklen durchgeführt, von denen jeder 1 min bei 94°C zur Denaturierung, 2 min bei 55°C zur Wiederanheftung und 2 min bei 72°C zur Extension umfasste. Das entstandene amplifizierte CEA-Genfragment wurde der Elektrophorese auf einem Agarose-Gel unterworfen, mit dem GeneClean-Verfahren gereinigt und nach Angaben des Herstellers in pCRII (Invitrogen) ligiert. Das entstandene Plasmid, pB806, enthält das CEA-Gen ohne sein natürliches Signalpeptid, eine C-terminale hydrophobe Domäne oder ein Stoppcodon, aber sowohl mit SmaI- als auch KpnI-Stellen an beiden Enden des Gens.
Eine Plasmid-Herstellung in großem Umfang wurde mit dem pB806-Plasmid durchgeführt, und die DNA wurde entweder mit SmaI oder KpnI gespalten. Die CEA-codierenden Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese und den GeneClean-Kit gereinigt, und die gereinigten Fragmente wurden in jedes der drei HA-codierenden Konstruktionen (pB879, pB1201 oder entsprechend pB1205), die mit dem selben Restriktionsenzym gespalten worden waren, ligiert. Zum Beispiel wurden CEA-codierende Fragmente mit SmaI-gespaltenen Enden in die HAO-, HA1- und HA2-codierenden Konstruktionen (pB879, pB1201 bzw. pB1205) ligiert, die mit SmaI geschnitten worden waren, um die Plasmide pB1250, pB1555 bzw. pB1584 zu erzeugen. CEA-codierende Fragmente mit KpnI-geschnittenen Enden wurden in die HAO-, HA1- und HA2-codierenden Konstruktionen, die mit KpnI geschnitten worden waren, ligiert, um pB1264, pB1564 bzw. pB1593 zu erzeugen. Insertion des CEA- Gens an der SmaI-Stelle platzierte die CEA-codierende Sequenz stromabwärts der HA-codierenden Sequenz. Für alle Konstruktionen wurden die PCR-Primer so entworfen, dass das EA-Gen im Rahmen mit HA inseriert war und die Translation des Fusionsgens am universellen Signal zur Translationsterminierung (TAATTAATTAA) (Sequenz ID NO: 4) in den pMGS12-Vektorsequenzen stromabwärts der KpnI-Stelle beendet werden würde.
Diese Konstruktion kann durch Deletion der dazwischen liegenden Aminosäuren, entweder zwischen dem Signalpeptid und HAO, wie nachstehend beschrieben, oder zwischen dem HAO und dem Fusionsgen, verbessert werden, um Faltung und Immunogenität zu verstärken.
Formulierung und Verpackung von Impfstoffen
Das rHA kann unter Verwendung von Verfahren und Materialien, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Influenza-Impfstoffe bekannt sind, allein oder in Kombination mit anderen Influenza-Antigenen formuliert und verpackt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden HA-Proteine von zwei A-Stämmen und einem B-Stamm kombiniert, um einen multivalenten Impfstoff zu erhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die HAs mit einem Adjuvans in einer Menge kombiniert, die die immunogene Antwort gegen die HA-Proteine wirksam erhöht. Zur Zeit ist das einzige Adjuvans, das weithin beim Menschen verwendet wird, Alaun (Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid). Saponin und sein gereinigter Bestandteil Quil A, vollständiges Freundsches Adjuvans und andere Adjuvanzien, die in Forschungs- und veterinären Anwendungen verwendet werden, weisen Toxizitäten auf, die ihre möglichen Verwendungen in menschlichen Impfstoffen begrenzen. Neue chemisch definierte Präparate jedoch, wie etwa Muramyldipeptid, Monophosphoryllipid A, Phospholipid-Konjugate wie etwa jene, die von Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147: 410–415 (1991) beschrieben werden, Einkapselung des Proteins in einem Proteoliposom, wie von Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739–1744 (1992) beschreiben, und Einkapselung des Proteins in Lipidvesikel wie etwa Novasome^TM-Lipidvesikel (Mikro Vascular Systems, Inc., Nashua, NH) sollten ebenfalls nützlich sein.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der Impfstoff in einer einzelnen Dosierungseinheit zur Immunisierung durch parenterale (d. h. intramuskuläre, intradermale oder subkutane) Verabreichung oder nasopharyngeale (d. h. intranasale) Verabreichung verpackt. Die wirksame Dosis wird, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, bestimmt. Der Trägerstoff ist gewöhnlich Wasser oder eine gepufferte Kochsalzlösung, mit oder ohne Zusatz eines Konservierungsmittels. Das Antigen kann zur Resuspension zum Zeitpunkt der Verabreichung oder in Lösung lyophilisiert sein.
Der Trägerstoff kann auch ein Polymersystem zur verzögerten Freisetzung sein. Synthetische Polymere sind besonders zur Formulierung eines Impfstoffes geeignet, um die kontrollierte Freisetzung des Antigens zu bewirken. Ein frühes Beispiel hierfür war die Polymerisation von Methylmethacrylat in Kugeln mit Durchmessern von weniger als einem Mikron, um so genannte Nanopartikel zu bilden, berichtet von Kreuter, J. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (Hrsg.) CRC Press, S. 125–148. Sowohl die Antikörperantwort als auch der Schutz gegen Infektion mit dem Influenzavirus war signifikant besser als bei Verabreichung des Antigens in Kombination mit Aluminiumhydroxid. Experimente mit anderen Partikeln haben gezeigt, dass die Adjuvans-Wirkung dieser Polymere von Partikelgröße und Hydrophobie abhängig ist.
Mikroverkapselung wurde bei der Injektion von mikroverkapselten pharmazeutischen Stoffen angewendet, um eine kontrollierte Freisetzung zu erreichen. Eine Reihe von Faktoren trägt zur Auswahl eines bestimmten Polymers zur Mikroverkapselung bei. Die Reproduzierbarkeit der Polymersynthese und der Prozess der Mikroverkapselung, die Kosten der Mikroverkapselung, Materialien und Verfahren, das toxikologische Profil, die Erfordernisse für variable Freisetzungskinetik und die physikochemische Verträglichkeit des Polymers und der Antigene sind alles Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Beispiele für nützliche Polymere sind Polycarbonate, Polyester, Polyurethane, Polyorthoester und Polyamide, besonders solche, die biologisch abbaubar sind.
Häufig wird als Trägerstoffes für pharmazeutische Stoffe und seit einiger Zeit für Antigene Poly(d,1-lactid-co-glycolid) (PLGA) gewählt. Dies ist ein biologisch abbaubarer Polyester, der eine lange Tradition medizinischer Verwendung bei abbaubaren Nähten, Knochenplatten und anderen zeitlich begrenzten Prothesen aufweist, bei denen er keinerlei Toxizität zeigte. Eine Vielzahl von pharmazeutischen Stoffen, einschließlich Peptiden und Antigenen, sind in PLGA-Mikrokapseln formuliert worden. Datensammlungen zur Adaptation von PLGA für die kontrollierte Freisetzung von Antigen liegen vor, zum Beispiel im Überblick von Eldridge, J. H., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 146: 59–66 (1989). Es hat sich herausgestellt, dass der Einschluss von Antigenen in PLGA-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 10 Mikron eine bemerkenswerte Adjuvans-Wirkung hat, wenn sie oral verabreicht werden. Das Verfahren zur PLGA-Mikroverkapselung verwendet eine Phasentrennung einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Verbindung von Interesse wird als eine wässrige Lösung hergestellt, und der PLGA wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie etwa Methylenchlorid und Ethylacetat gelöst. Diese beiden nicht vermischbaren Lösungen werden durch Rühren mit hoher Geschwindigkeit co-emulgiert. Ein Nicht-Lösungsmittel für das Polymer wird dann zugegeben, was die Fällung des Polymers rund um die wässrigen Tropfen zur Folge hat, um die embryonischen Mikrokapseln zu bilden. Die Mikrokapseln werden gesammelt und mit einem Agens aus einer Reihe von Agenzien (Polyvinylalkohol (PVA), Gelatine, Alginate, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Methylcellulose) stabilisiert, und das Lösungsmittel wird entweder durch Trocknung im Vakuum oder Lösungsmittelextraktion entfernt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden den Schutzumfang nicht einschränkenden Beispiele weiter verdeutlicht.
Beispiel 1: Vermehrung und Reinigung von Influenzaviren.
Die nachstehenden Influenza-Impfstoffstämme wurden von der FDA in Allantoinflüssigkeit von Hühnereiern erhalten.
A/Beijing/353/89-artig (H3N2)
A/Beijing/32/92-artig (H3N2)
A/Texas/36/91-artig (H1N1)
B/Panama/45/90
Um die von der FDA erhaltene ursprüngliche Stammlösung an Influenzaviren zu vermehren, wurden MDCK-Zellen in Anwesenheit von TPCK-behandeltem Trypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) infiziert und die Konzentration an fötalem Rinderserum optimiert, um die höchsten Titer für Viren der ersten Passage zu erhalten. Die MDCK-Zellen wurden mit den Influenza-Stämmen bei einer niedrigen Multiplizität der Infektion (0,1 bis 0,5) infiziert, wie durch einen Standard-HA-Test (Rosen, "Hemagglutination with Animal Viruses" in Fundamental Techniques in Virology, Hrsg. K. Nabel und N. P. Salzmann, S. 276–28 (Academic Press, New York 1969)) nachgewiesen wurde. Die infizierten Zellen wurden bei 33°C über 48 h inkubiert, und das Kulturmedium wurde unter Verwendung des Tests zur Aktivität der Hämagglutinierung auf Virusproduktion untersucht. Die Bedingungen, die die höchste HA-Aktivität ergaben, wurden verwendet, um eine große Menge an Stammlösung des Influenzavirus herzustellen. Die optimalen Konzentrationen an TPCK-Trypsin und fötalem Rinderserum für die vorstehend genannten Influenzaviren sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1. Optimale Konzentration von TPCK-Trypsin und fötalem Rinderserum.

A/Beijing/353/89 A/Beijing/32/92 A/Texas/36/91 B/Panama/45/90

% fötales Rinderserum 0.25% 0.25% 0.25% 5.0%

Menge an TPCK-behandeltem Trypsin 45 μ/ml 45 μg/ml 45 μ/ml 3 μ/ml
Reinigung des Influenzavirus: Das Virus wurde 24–48 Stunden nach Infektion aus 10 T175-Gewebekulturflaschen durch Klärung des Kulturmediums (1.000 × g über 10 Minuten) aus mit Influenza infizierten MDCK-Zellen gewonnen. Das Virus wurde bei 100.000 × g über 1 Stunde aus dem Kulturmedium ausgefällt. Der erhaltene Virus-Niederschlag wurde in 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, resuspendiert und durch einen 20 ml 20–60% (Gew./Vol.) Saccharosegradienten in PBS zentrifugiert. Die Influenzavirus-Bande wurde aus der 40–45%-Saccharose-Region des Gradienten gewonnen, mit PBS verdünnt und mit 100.000 × g gefällt. Der gereinigte Virus-Niederschlag wurde in 0,5 ml PBS resuspendiert und bei –70°C gelagert.
Beispiel 2: Clonierung des HA-Gens von Influenza A/Texas/36/91.
Ein spezifisches Beispiel für den Clonierungsschritt für eines der Influenza-HA-Gene wird in 2 dargestellt. Virale RNA wurde, wie vorstehend beschrieben, aus Influenza A/Texas/36/91 extrahiert, das vom CDC bezogen worden war. Der universelle Primer, komplementär zum 3'-Ende der Influenza-RNA-Segmente 5'- AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1) wurde mit der reversen Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MuLV) verwendet, um Influenza-cDNAs zu erzeugen. Gereinigte virale RNA oder mRNA (5 μg) wurde als eine Matrize verwendet, um cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase von M-MuLV, die mit dem First-Strand cDNA Synthesis Kit von Pharmacia Inc. geliefert wird, herzustellen. Der Primer, der für cDNA von viraler RNA von Influenza A-Stämmen verwendet wurde, war ein synthetischer Oligonucleotid-Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID NO: 1), der mit dem 3'-Ende aller Virion-HA-Gensegmente homolog ist.
Amplifizierung der HA-Gene von der cDNA wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Standard-Reaktionsbedingungen (Gene-Amp-Kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt 20 pMol Primer, die für 5'- und 3'-Enden des HA-Gens von Influenza A (H3) oder A (H1) oder Influenza B-Stämmen spezifisch waren, was durch Konsensus-Sequenzen aus DNA-Datensätzen der GenBank bestimmt wurde, wie in Tabelle 2 dargestellt. Amplifizierung wurde in 30 Durchgängen durchgeführt, wobei jeder Durchgang aus 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C zur erneuten Anheftung und 3 Minuten bei 72°C zur Extension bestand. Die PCR-Produkte wurden vor der Clonierung auf 0,8% Agarosegelen auf die richtige Größe untersucht.
PCR-Primer vom 5'-Ende des HA-Gens:
(SEQ ID NO: 2) und vom 3'-Ende des HA-Gens:
(SEQ ID NO: 3) wurden bei der PCR verwendet, um das HA-Gen in voller Länge zu erhalten.
Ein neuer 5'-PCR-Primer wurde vom 5'-Ende des Gens entworfen: 5'-Ende minus Signalsequenz:
(SEQ ID NO: 4) und das 3'-Ende des Gens:
(SEQ ID NO: 5). Diese wurden in der PCR verwendet, um das HA-Gen minus der Signalpeptid-Sequenz zu erhalten. Dies wurde dann in den mit KpnI geschnittenen TA-Vektor inseriert. Das 61K-Signalpeptid zur Baculovirus-Expression und der Polyhedrin-Promotor wurden in den TA-Vektor inseriert, der das HA-Gen minus der Influenza-Signalpeptid-Sequenz umfasste. Der resultierende Baculovirus-Rekombinationsvektor umfasst den Polyhedrin-Promotor, das 61K-Baculovirus-Signalpeptid und das HA-Gen für Influenza A/Texas/36/91.
HA-Gene von Influenza B-Stämmen wurden aus vollständiger Boten-RNA (mRNA) extrahiert, aus MDCK-Zellen cloniert, die mit dem Influenza B-Stamm B/Panama/45/90 infiziert worden waren. Vollständige RNA wurde aus 5 T175-Flaschen mit infizierten Zellen gewonnen. Die geernteten Zellen wurden in Anwesenheit von Guanidiniumthiocyanat lysiert, und vollständige Zell-RNA wurde, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Vollständige mRNA wurde unter Verwendung von Oligo-(dT)-Cellulose-Zentrifugationssäulen extrahiert, wie vorstehend beschrieben.
Der für mRNA aus Influenza B-Stämmen verwendete Primer war ein zufälliger Oligonucleotid-DNA-Primer (Pharmacia, Inc.).
Tabelle 2. Primer, die bei der PCR-Amplifizierung verwendet wurden.
Tabelle 2, Fortsetzung
Ein Beispiel für cDNA-Syntheseprodukte verwendete die virale RNA von Influenzavirus A/Texas/3691 als eine Matrize. Die Lokalisierung der cDNA-Segmente, die die Influenza-Proteine codieren, konnte in nachstehender Weise bestimmt werden. Gereinigte virale RNA wurde im Reaktionsgemisch mit dem universellen einzelsträngigen DNA-Primer 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1) kombiniert. Dieser Primer ist zum 3'-Ende der Segmente des Influenza-Virions komplementär, wie vorstehend beschrieben. Die Reaktion enthielt auch den Zusatz von [α-³²P]dCTP, um die cDNA-Produkte sichtbar zu machen, die auf 1,5% alkalischem Hydrolyse-Gel (Maniatis, et al., (1982)) aufgetrennt und X-OMAT-AR-Filmmaterial ausgesetzt worden waren.
Beispiel 3: Clonierung von HA-Genen in bakterielle Plasmide.
Die mittels PCR amplifizierten rHA-Gene wurden unter Verwendung des TA-Cloningsystem (Invitrogen, Inc.) in einen pUC-ähnlichen Plasmid-Vektor cloniert. Die Anwesenheit der HA-Gene wurde durch Analyse der Plasmid-DNA, die mit Standardverfahren gereinigt worden war (Maniatis et al., 1982), durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt. Die 5'-Enden der rHA-Gene wurden dann durch DNA-Sequenzierung analysiert, und neue Primer wurden entworfen, um die Sequenzen zu entfernen, die die hydrophoben Signalpeptide am N-terminalen Ende der HA-Proteine codieren. Die in Tabelle 2 angeführten, spezifischen 5'- und 3'-Oligonucleotid-Primer wurden dann verwendet, um cDNA-Produkte mittels PCR zu amplifizieren, und wurden mit Hilfe von Standard-Clonierungsverfahren in TA-Plasmid-Vektoren von E. coli (Invitrogen, Inc.) cloniert. Die resultierenden DNA-Clone enthielten Codierungssequenzen für die reifen HAs.
Die rHA-Gene von A/Texas/36/91, A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 und B/Panama/45/90 wurden mit Standardverfahren (Maniatis et al., 1982) in Baculovirus-Expressionsvektoren subcloniert. Die HA-Gene wurden aus den TA-Clonierungsplasmiden mit den geeigneten Restriktionsenzymen entfernt, und das gereinigte HA-DNA-Fragment wurde in ein Baculovirus-Rekombinationsplasmid inseriert. Die erhaltenen Bakterienclone wurden auf Ampicillin-Resistenz durchmustert und dann mit Restriktionsenzymen geschnitten, um das inserierte HA-Gen freizusetzen, um seine Anwesenheit nachzuweisen. Die Rekombinationsplasmide, die die HA-Gene enthielten, wurden auf Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt (Maniatis et al., 1982). Das 5'-Ende der Plasmide wurde sequenziert, um die Anwesenheit der richtigen Baculovirus-Signale (AcNPV-Polyhedrin-Promotor, ATG-Translationsstartsignal und Baculovirus-Signalpeptid sequenz) und der vollständigen HA-Codierungssequenz im richtigen Leserahmen nachzuweisen. Die DNA-Sequenzen am 5'-Ende der HA-Gene und der flankierende AcNPV-Polyhedrin-Promotor und das Baculovirus-Signalpeptid (die ersten 18 Aminosäuren von jeder Aminosäuresequenz) sind im SEQUENZPROTOKOLL angegeben.
SEQ ID NO: 6 codiert die 5'-Endsequenz des HA-Gens für A/Beijing/32/92 (Sequenzbereich 1–481). SEQ ID NO: 7 ist die dazu gehörige Aminosäuresequenz (beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 19] der SEQ ID NO: 6). Die Aminosäuresequenz des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 7 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
SEQ ID NO: 8 codiert die 5'-Endsequenz des HA-Gens für A/Texas/36/91 (Sequenzbereich 1–481). SEQ ID NO: 9 ist die dazu gehörige Aminosäuresequenz (beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 19] der SEQ ID NO: 8). Die Aminosäuresequenz des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 9 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
SEQ ID NO: 10 codiert die 5'-Endsequenz des HA-Gens für B/Panama/45/90 (Sequenzbereich 1–434). SEQ ID NO: 11 ist die dazu gehörige Aminosäuresequenz (beginnend am Startcodon "ATG" [Nucleotid 21] der SEQ ID NO: 10). Die Aminosäuresequenz des 61K-Signalpeptids wird in SEQ ID NO: 11 als Aminosäuren 1–18 dargelegt.
In den SEQ ID NO: 6, 8 und 10 stellen die Nucleotide 1–20 das 3'-Ende des Polyhedrin-Promotors dar, die Nucleotide 21–74 codieren das 61K-Signalpeptid und die Nucleotide 75 bis zum Ende codieren das 5'-Ende des HA-Gens.
Beispiel 4: Expression von rekombinantem HA in Insektenzellen.
Die chimären Rekombinationsplasmide, die clonierte HA-Gene enthalten, wurden gereinigt, und 2 μg wurden mit 1 μg der AcNPV-DNA des Wildtyps vermischt. Die DNAs wurden zusammen mit Calcium ausgefällt und unter Verwendung von Standardverfahren (Smith, Summers und Fraser, Mol. and Cell. Biol. 3: 2156–2165 (1983)) in Zellen von S. frugiperda transfiziert. Rekombinante Baculoviren wurden auf Grund von Plaque-Morphologie identifiziert und dann durch zusätzliche Runden der Plaque-Reinigung weiter gereinigt. Plaque-gereinigte rekombinante Baculoviren wurden auf Expression von rHA durchmustert, und ein einzelner Baculovirus-Expressionsvektor wurde zur weiteren Entwicklung ausgewählt.
Zellen von S. frugiperda wurden mit einem Baculovirus-Vektor infiziert, der das HA-Gen vom Influenza-Stamm B/Panama/45/90 enthielt. 24, 48 und 72 Stunden nach der Infektion wurden 1 × 10⁶ Zellen mit 25 μCi [³⁵S]Methionin über 15 Minuten gepulst, um die gerade synthetisierten Proteine zu markieren. Die Zellen wurden gesammelt, und die Proteine wurden auf einem 11%-Polyacrylamid-Gel in Anwesenheit von 0,1% SDS getrennt. Die radiomarkierten Proteine wurden durch Belichtung von X-OMAT-AR-Filmmaterial nachgewiesen. Die Lage von Proteinstandards und ihre Größe in Kilodalton (kd) zeigten an, dass das rekombinante HA-Protein mit einer Größe von 85 kd eines der Hauptproteine ist, die in den Zellen 48 Stunden und 72 Stunden nach der Infektion synthetisiert werden.
Beispiel 5: Herstellung und Reinigung von rekombinantem HA.
Der Baculovirus-Expressionsvektor A8611, der das Gen für Influenza A/Beijing/353/89 enthält und im Wesentlichen, wie vorstehend für A/Beijing/32/92 Hämagglutinin unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors beschrieben, hergestellt worden war, wurde verwendet, um Zellen von S. frugiperda zu infizieren. Die Zellen wurden bei 27°C bis zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml in TNMFH-Kulturmedium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) gezüchtet, das mit 10% fötalem Rinderserum angereichert war, und wurden mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 mit dem rekombinanten Baculovirus A8611 infiziert. Während der Infektion wird das Hämagglutinin von Influenza A/Beijing/353/89 unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedrin-Promotors vom Baculovirus produziert. Die Zellen werden 72 Stunden nach Infektion durch Zentrifugation über 15 Minuten bei 3.400 × g geerntet und durch Resuspension in serumfreiem TNMFH-Kulturmedium gewaschen und anschließend über 30 Minuten bei 10.400 × g zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen, und die Niederschläge der infizierten Zellen werden bei –70°C gelagert.
Ein Verfahren wurde entwickelt, mit dem das rekombinante HA selektiv aus den infizierten Zellen unter Bedingungen extrahiert wird, die das Antigen nicht denaturieren. Soweit nicht anders angegeben, werden alle Extraktionsschritte bei 4°C durchgeführt. Der Zellniederschlag aus 0,5 l der Kultur (etwa 5 × 10⁸ Zellen) wurde über 2 Minuten in 40 ml eisgekühltem 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 1% (Vol./Vol.) Tween-20, 1 mg/ml Leupeptin unter Verwendung eines Polytron^TM-Homogenisators (Brinkmann Instruments Inc. Westbury, NY) aufgebrochen. Das Homogenat wurde über 30 Minuten bei 9.200 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag gesammelt. Dieser Schritt entfernt lösliche und periphere Membranproteine aus den Insektenzellen, ohne die integralen Membranproteine wie rHA zu extrahieren. Um das rHA zu extrahieren, wurde der Niederschlag über 2 Minuten auf Stufe 4 in 40 ml eisgekühltem 30 mM Tris, 10 mM Ethanolamin, pH 11, 25 mM LiCl, 2% Tween-20 homogenisiert. Nach einer Inkubation von 60 Minuten auf Eis wurde der pH-Wert des Homogenats mit 1 N HCl auf 8,4 eingestellt, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation über 30 Minuten bei 9.200 × g entfernt. Der das lösliche rHA enthaltende Überstand wurde abgegossen, und der pH wurde überprüft und, falls notwendig, auf 8,4 bei Zimmertemperatur eingestellt. Das unlösliche Material wurde zur Analyse in 40 ml Wasser resuspendiert. Das integrale Membranprotein HA wurde unter den Bedingungen von hohem pH-Wert und Tween-20-Detergenzbedingungen solubilisiert, und bleibt in Lösung, nachdem der pH-Wert gesenkt wurde.
Die Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Proben wurden in einem 10-minütigen Bad mit kochendem Wasser in Anwesenheit von 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5% beta-Mercaptoethanol aufgebrochen, dann der Elektrophorese auf einem 11% Polyacrylamidgel in Anwesenheit von 0,1% SDS unterworfen, dann mit Coomassie-Blau angefärbt.
Ein chromatographisches Verfahren zur Reinigung wurde entwickelt, um rekombinantes HA zu reinigen, das zu einem hoch gereinigten rekombinanten HA-Antigen führt, das nicht denaturiert ist und als ein Bestandteil eines influenza-Impfstoffes für die Verwendung beim Menschen geeignet ist. Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde verwendet, um das HA von A/Beijing/353/89 aus Zellen von S. frugiperda, die mit dem rekombinanten Virus A8611 infiziert waren, zu reinigen.
Die Chromatographiegel-Matrices, die zur Reinigung von HA aus 0,5 l an infizierten Zellen von S. frugiperda verwendet wurden, waren 30 ml DEAE-Sepharose Fast Flow von Pharmacia (in einer C16/20-Säule von Pharmacia) und 4 ml Lentil-Lectin-Sepharose 4B von Pharmacia (in einer C10/10-Säule von Pharmacia). Der Auslass der DEAE-Säule ist mit dem Einlass der Lentil-Lectin-Säule verbunden, und der, wie vorstehend beschrieben, hergestellte S/N 2-Zellextrakt wurde mit einer Flussrate von 1 ml/Minute auf die verbundenen Säulen aufgetragen. Die Säulen wurden mit 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20 gewaschen, bis die UV-Absorption bei 280 nm des Lentil-Lectin-Ausflusses zur Grundlinie zurückkehrte. Unter diesen Bedingungen binden die meisten der verunreinigenden Proteine an DEAE, rekombinantes HA aber fließt durch die Säule. Die verbleibenden Verunreinigungen fließen durch die Lectin-Säule, und glycosyliertes rHA bindet an die Lentil-Lectin-Affinitätsmatrix. Die DEAE-Säule wird abgekoppelt, und die Lectin-Säule wird mit weiteren 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20 gewaschen. Als nächstes wird die Lectin-Säule mit 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (Vol./Vol.) Natriumdesoxycholat (DOC) gewaschen. Dieser Schritt ersetzt das Detergenz Tween-20 durch ein Detergenz wie DOC, das durch Dialyse vom Protein entfernt werden kann. Rekombinantes HA wird dann aus der Lectin-Säule mit etwa 20 ml aus 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (Vol./Vol.) Natriumdesoxycholat, die 0,3 M a-D-Methylmannosid enthalten, eluiert. Die Ergebnisse werden mit Hilfe von 11% PAGE analysiert.
Auf Grund der genetischen Variabilität der Influenza-HA-Proteine können die Details des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens mit jedem einzigartigen rekombinanten HA-Protein variieren. Zum Beispiel kann das rHA an die DEAE-Ionenaustauschsäule binden, anstatt hindurch zu fließen. Sollte dies auftreten, würde das rHA von der DEAE-Säule durch Waschen der Säule mit Pufferlösung, die eine höhere Konzentration an LiCl, NaCl oder anderen Salzen enthält, entfernt werden.
Um das DOC-Detergenz und andere Bestandteile der Pufferlösung zu entfernen, wurde das Eluat aus der Lectin-Säule, das das gereinigte rHA enthielt, gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5 (PBS) dialysiert. Das gereinigte rekombinante HA hatte eine Reinheit von mindestens 95%, was durch Analyse auf SDS-Polyacrylamidgelen bestimmt wurde.
Beispiel 6: Analyse von rHA-Resistenz gegenüber Protease
Reifes HA ordnet sich in trimeren Strukturen an, die gegen eine Reihe von Proteasen, einschließlich Trypsin, die HA-Monomere abbauen, resistent sind (Murphy und Webster, 1990). Resistenz gegenüber Behandlung mit Trypsin kann daher als ein Test für die funktionale Trimerbildung verwendet werden. Das nachstehende Verfahren wurde verwendet, um die Resistenz von rHA gegenüber Behandlung mit Protease zu untersuchen.
Zwei Aliquots an gereinigtem rHA (A/Beijing/353/89) zu 60 μg/ml wurden auf Eis über 30 Minuten in 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 150 mM NaCl mit und ohne 50 μg/ml TPCK- behandeltem Trypsin inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 57,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid in Isopropanol zu einer Endkonzentration von 1 mM gestoppt. Aliquots von jeder Probe wurden durch Kochen in 3% SDS unter reduzierenden Bedingungen denaturiert, der Elektrophorese auf 11,5% Polyacrylamidgelen unterzogen und unter Verwendung von Standardverfahren der Western-Blot-Analyse auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die HA-Polypeptide wurden unter Verwendung von Anti-HA-Serum vom Meerschweinchen, das gegen gereinigtes HA hergestellt worden war, und einem Konjugat aus Anti-Meerschweinchen-IgG der Ziege und alkalischer Phosphatase nachgewiesen.
Unbehandeltes rHA wandert bei der Größe des HA-Vorläufers (HA0). Behandlung mit Protease führt zu zwei Hauptbanden, die bei den Größen wandern, die für Influenza-Hämagglutinin HA1 und HA2 vorausgesagt worden waren. Die Ergebnisse zeigen, dass Trypsin das rHA-Protein einmal spaltet, um zwei Polypeptide zu erzeugen, die die Größen aufweisen, die für HA1 und HA2 vorausgesagt worden waren. Ein weiterer proteolytischer Vorgang tritt nicht ein. Diese Ergebnisse zeigen, dass rHA, das durch den vorstehend beschriebenen Prozess gereinigt wird, resistent gegenüber Abbau durch Protease ist. Diese Eigenschaft stimmt damit überein, dass gereinigtes rHA in der Form von Trimeren vorliegt.
Beispiel 7: Immunogenität von rHA unter Verwendung des standardisierten Maus-Potenz-Test.
Ein Ansatz, die Immunogenität eines Antigens zu messen, ist die Bestimmung der Menge, die notwendig ist, eine nachweisbare Antikörperantwort in Mäusen hervorzurufen (Maus-Potenz-Test). Ein standardisierter Maus-Potenz-Test wird verwendet, um die Immunogenität von rHA0-Impfstoff zu messen. Gruppen aus 5–10 Mäusen werden einmal mit Impfstoff immunisiert, der serielle Verdünnungen von rHA enthält, d. h. 0,500 μg, 0,1 μg, 0,02 μg und 0,004 μg gereinigtes rHA. Seren werden 28 Tage nach der Immunisierung gewonnen, und Antikörper gegen das rHA-Antigen werden in einer standardisierten enzymverbundenen immunologischen Festphasen-Untersuchung (ELISA) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemessen. Eine Maus ist serumkonvertiert, wenn die OD450 bei einer Verdünnung von 1:100 der 28-Tage-Antiseren größer ist als drei Standardabweichungen vom Mittelwert der OD450 der Prä-Immunseren der Mäuse. Die wirksame Dosis des Impfstoffes, die benötigt wird, um Serumkonversion von 50% der Mäuse zu erreichen (ED50), ist ein Maß für die Immunogenität des Antigens.
Zum Beispiel werden vier Gruppen zu 10 Mäusen einmal mit entweder 0,1 μg, 0,02 μg, 0,004 μg oder 0,0008 μg (5-fache Verdünnungen) des rHA0-Impfstoffes immunisiert. Seren werden 28 Tage nach Immunisierung gewonnen, und gegen jedes rHA0-Antigen im Impfstoff mit einem ELISA-Test auf Serumkonversion untersucht. Die Dosis, die notwendig ist, um bei 50% der Mäuse eine Serumkonversion auszulösen (ED₅₀), wird berechnet, und eine Minimum-ED₅₀ wird für jedes rHA0-Antigen festgesetzt.
Vorausgehende Daten zeigen, dass eine einzelne Dosis von 0,004 μg rHA0 zu einer Serumkonversion bei mindestens 50% der Mäuse führt.
Beispiel 8: Verabreichung von rHA in Kombination mit einem Adjuvans und Vergleich mit verfügbaren Influenza-Impfstoffen.
Die Wirksamkeit von gereinigtem rHA vom Influenza-Stamm A/Beijing/353/89 in der Maus wurde mit Alaun und ohne Alaun (rein) untersucht und mit einem kommerziellen Influenza-Impfstoff, FLUZONE^® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) verglichen, der den Influenza-Stamm A/Beijing/353/89 enthält. Der Impfstoff wurde in einer Dosierung von 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg und 0,04 μg verabreicht. Die Mäuse erhielten an Tag 28 mit der vorstehend beschriebenen Dosis an gereinigtem rHA eine Auffrischungsimpfung. An Tag 42 wurden die Seren gewonnen und in einem ELISA-Test wurde der Titer für Anti-HA-IgG-Antikörper bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Bei Fehlen eines Adjuvans induzierte nur eine Dosis von 0,5 μg die Erzeugung eines signifikanten Antikörper-Titers (200.000). Bei Anwesenheit eines Adjuvans erzeugte schon die geringe Dosis von 0,004 μg rHA0 signifikante Antikörpermengen. Die Tiere, die mit rHA (rein) immunisiert worden waren, erzeugten etwa die gleichen Spiegel an Anti-HA-Antikörpern wie der kommerzielle Impfstoff. Alaun erhöhte die Immunogenität von rHA, und es wurden Anti-HA-Titer erzeugt, die 10-fach oder höher als ohne Adjuvans waren.
Zusammenfassend zeigt der Vergleich der Immunogenität von gereinigten rHA0s mit einem Influenza-Impfstoff aus dem ganzen Virion (FLUZONE^® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA), dass rHA0 eine ähnliche Immunantwort in Mäusen über einen Zeitraum von 42 Tagen hervorruft. Adsorption des rHA0 an Alaun erhöht die Immunogenität des gereinigten rHA0 in Mäusen signifikant, wie durch die in Beispiel 7 beschriebene Untersuchung gemessen wurde. Die Kombination mit Alaun ruft eine höhere Anzahl an IgG-Hämagglutinin-Antikörpern hervor als die Influenza-Impfstoffe FLUZONE^®.
Beispiel 9: Studien zur Hemmung von Hämagglutinierung.
Antikörper zur Hemmung von Hämagglutinierung (HAI) binden an drei von vier bekannten Epitopen auf dem Hämagglutinin und blockieren die Fähigkeit von Influenza, rote Blutzellen zu agglutinieren (Wilson et al., "Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A° resolution". Nature, 289: 366–378 (1981)). Diese antigenen Determinanten sind rund um die Bindungsstelle des Sialinsäurerezeptors auf Hämagglutinin-Trimeren gruppiert. Antikörper gegen diese Stellen werden die Infektiosität des Virus neutralisieren (Weis, et al., "Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid", Nature 333: 426–431 (1988)). Der Titer und die Spezifität von HAI-Antikörpern sind ein wichtiges Maß für das Potential eines Influenza-Impfstoffes, gegen Infektion mit ähnlichen und verwandten Influenza-Stämmen zu schützen.
Studien an Mäusen wurden durchgeführt, in denen die Fähigkeit von gereinigtem rHA0 von A/Beijing/353/89 und FLUZONE^® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) HAI-Antikörper hervorzurufen verglichen wurden. Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 0 und 28 mit 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg und 0,004 μg rHA0 oder mit dem Dreifachen dieser Mengen an FLUZONE^®-Hämagglutinin geimpft, so dass gleiche Mengen an rekombinantem oder viralem Hämagglutinin von A/Beijing/353/89 verabreicht wurden. Zum Beispiel wurden Mäuse in der Gruppe der höchsten Dosierung mit 1,5 μg FLUZONE^®-Hämagglutinin (0,5 μg Hämagglutinin von jedem Stamm) und 0,5 μg rHA0 immunisiert. Die Anwesenheit von zusätzlichem Hämgglutinin-Antigen von zwei anderen Influenza-Stämmen in FLUZONE^® kann für einige kreuzreaktive Antikörper verantwortlich sein.
Anti-Hämagglutinin-Antikörper (Hämagglutinin-IgG) wurden in einem standardisierten Verdünnungs-ELISA-Test gegen gereinigtes rHA0 gemessen. HAI-Antikörper wurden gegen 4 Hämagglutinin-Einheiten der nachstehenden Antigene gemessen: vollständiges Influenzavirus A/Beijing/353/89 (A/Bei), gereinigtes rHA0-A/Beijing/353/89-Antigen und FLUZONE^®. Der HAI-Titer ist reziprok zur höchsten Verdünnung der Antiseren, die die Agglutinierung von roten Blutzellen von Küken um 50% hemmt.
Tabelle 3 fasst die Titer von Hämagglutinin-IgG aus dem Serum und HAI-Titer der Mäuse am Tag 42 zusammen. Hohe Spiegel an anti-Hämagglutinin-Antikörper wurden mit dem rekombinanten rHA0-Impfstoff erzeugt. Die Titer waren etwa 10-fach höher als für FLUZONE^®. Am signifikantesten ist, dass der rHA0-Impfstoff gute Titer an Antikörpern erzeugte, die die Agglutinierung von roten Blutzellen durch das A/Beijing/353/89-Virus und rHA0-Antigene blockieren. Auf diese Weise erzeugte der rHA0-Impfstoff HAI-Antikörper, die das Immunogen und das A/Beijing-Influenzavirus gleich gut erkannten. Die niedrigeren HAI-Titer gegen FLUZONE^® können auf die Unfähigkeit der Antiseren zurückgeführt werden, Agglutinierung durch die anderen beiden Hämagglutininarten im FLUZONE^®-Impfstoff zu blockieren. Dagegen erzeugten mit FLUZONE^® immunisierte Mäuse hohe HAI-Antikörper-Titer, wenn nur gegen sie selbst gemessen wurde. Die HAI-Titer gegen das Influenzavirus A/Beijing/353/89 und das rHA0-Antigen waren beachtlich reduziert. Ähnliche Muster wurden bei Mäusen aus den Gruppen mit niedrigerer Dosierung beobachtet.
Tabelle 3. HAI-Titer gegen rHA0 und FLUZONE^®
Diese Daten legen auch nahe, dass zwischen dem Influenza-Stamm A/Beijing/353/89 in FLUZONE^® und diesem gleichen Influenza-Stamm, der von der FDA bezogen wurde und vor der Verwendung des HAI-Tests einmal die Passage durch Eier durchlaufen hat, genetische Unterschiede bestehen. Die Tatsache, dass Antikörper, die als Antwort auf das aus Influenza A/Beijing/353/89 clonierte rekombinante HAO erzeugt wurden, Agglutinierung von roten Blutzellen durch diesen Influenza-Stamm ebenso wie diesen selbst blockieren, ist ein guter Beweis dafür, dass es während des Clonierungsprozesses keine genetischen Veränderungen gab, die die Bindungsstelle für den Sialinsäure-Rezeptor auf dem gereinigten rHA0-Antigen betreffen.
Beispiel 10: Formulierung und klinische Wirksamkeit eines Influenza-Impfstoffes von 1993/1994.
Eine Serie von klinischen Tests am Menschen wurde durchgeführt, um die Sicherheit und Immunogenität eines experimentellen Influenza-Impfstoffes, der rekombinantes HA enthielt, zu charakterisieren und vorbereitende Daten zu sammeln, die die Schutzwirkung eines solchen Impfstoffes gegen natürliche Infektion während einer epidemischen Saison betreffen. Die Ergebnisse zeigen, dass Impfstoffe, die das rekombinante Influenza-Hämagglutinin (rHA0) enthalten und gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zu einem kommerziell verfügbaren, zugelassenen abgeschwächten Influenza-Impfstoff, der in Eiern produziert worden war, überraschend weniger lokale nachteilige Reaktionen hervorriefen und eine gleichwertige oder bessere, schützende Immunantwort lieferten.
MATERIAL UND METHODEN
Impfstoffe. Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten HA-Impfstoffe enthielten ungespaltenes HA (HAO)-Glycoprotein in voller Länge vom Influenzavirus A/Beijing/32/92 (H3N2). Rekombinantes HA0 (rHA0) wurde in Kulturen von Lepidoptera-(Insekten-)Zellen produziert, nachdem sie einem Baculovirus-Vektor ausgesetzt waren, der die HA-Gene codierende cDNA-Insertionen enthielt. Das exprimierte Protein wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen auf > 95% gereinigt, wie durch quantitative Scan-Densitometrie des Haupt-Antigens, das der Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen unterzogen worden war, gemessen wurde. Die Identität des Peptids wurde durch Aminosäure-Analyse, N-terminale Sequenzierung und Western-Blot-Analyse mit Anti-Influenza A/Beijing32/92-Seren bestätigt. Die rHA0-Impfstoffe enthielten eine spezifizierte Menge an dem synthetischen HA-Antigen, entweder in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung gelöst oder in Form einer Gelsuspension an das Adjuvans Aluminiumphosphat (Alaun) adsorbiert. Der in dieser Studie verwendete zugelassene trivalente Subvirion-Impfstoff enthielt 15 μg/Dosis von jedem der HAs der Influenzaviren A/Texas/36/91 (N1N1), A/Beijing/32/92 (H3N2) und B/Panama/45/90 (in Eiern hergestellter abgeschwächter Influenza-Impfstoff FLUZONE^TM, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA).
Klinische Studien. Identische Untersuchungsprotokolle wurden durch die Institutional Review Boards der Saint Louis-Universität und die Universität von Rochester genehmigt. An beiden Instituten wurden gesunde Erwachsene im Alter von 18 bis 45 Jahren untersucht. Die Testpersonen wurden nach dem Zufallsprinzip für eine der nachstehenden fünf Impfstoffpräparate in einem Doppelblindverfahren ausgewählt: (1) 15 μg rHA0, (2) μg rHA0 plus Alaun, (3) 90 μg rHA0, (4) zugelassener, trivalenter, inaktivierter Influenza-Impfstoff oder (5) Placebo aus Kochsalzlösung. Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion mit einem Volumen von 0,5 ml verabreicht. Um eine anfängliche Untersuchung zur Sicherheit der drei Impfstoffpräparate, die rHA0 enthielten, zu gewährleisten, wurden die ersten 25 Testpersonen nach dem Zufallsprinzip (d. h. fünf Personen pro Teilstudie) unabhängig von den anderen Testpersonen ausgewählt und über 48 Stunden nach Impfung eng mittels Telefonkontakt überwacht, bevor mit den übrigen Impfungen fortgefahren wurde. Alle Testpersonen waren angewiesen, während der ersten sechs Tage nach der Impfung einen täglichen Berichtsbogen über nachteilige Reaktionen einschließlich sowohl lokaler als auch systemischer Symptome auszufüllen. Die Symptome wurden selbst ihrem Wesen nach als mild, mittel oder schwer eingestuft. Orale Temperatur wurde von den Teilnehmern gemessen und aufgezeichnet, wenn sie sich fiebrig fühlten. Falls auftretend, wurden lokale Schwellungen oder Erytheme an der Injektionsstelle danach eingestuft, ob der Bereich kleiner oder größer als eine Vierteldollarmünze im Durchmesser war. Alle Impfungen wurden in der letzten Woche im November und ersten Woche im Dezember 1993 durchgeführt. Serumproben wurden von den Testpersonen zum Zeitpunkt der Impfung, 3 Wochen nach Impfung und noch einmal im späten März oder April 1994 genommen, mindestens 2 bis 3 Wochen nachdem die Influenzaviren nicht mehr in den lokalen Gemeinschaften zirkulierten. Die Freiwilligen jedes Instituts wurden angewiesen, mit dem Studienzentrum Kontakt aufzunehmen, sobald sie eine Influenza-ähnliche Erkrankung während der winterlichen Influenza-Epidemiesaison erlitten. Eine Influenza-ähnliche Erkrankung wurde als das Auftreten aller respiratorischen Symptome von zwei Tagen oder längerer Dauer, begleitet von Fieber und/oder systemischen Symptomen von Myalgie oder Schüttelfrost definiert. Bei Testpersonen, die von Influenza-ähnlichen Symptomen berichteten, wurden nasale und pharyngeale Abstriche zur Viruskultur und Identifikation gemacht. Klinische Teilnehmer erhielten codierte Identifikationsnummern und wurden im Blindversuch behandelt.
Serologie. Für jeden Typ serologischer Untersuchung wurden alle Proben aus beiden Instituten in einer Gruppe durch ein einzelnes Labor untersucht. Antikörper gegen das Influenzavirus-Antigen A/Beijing/32/93 zur Hämagglutinationshemmung (HAI) wurden in Seren durch einen standardisierten Mikrotiter-Test gemessen, nachdem nicht spezifische Inhibitoren mit einem Rezeptor zerstörenden Enzym und kalte Agglutinine durch Hämadsorption bei 4°C entfernt worden waren. Der Titer wurde als die höchste Serumverdünnung definiert, die Hämagglutinierung durch 4 Antigen-Einheiten des Virus vollständig verhinderte, wobei 1:4 als die Startverdünnung verwendet wurde. HA-spezifische Immunglobulin G (IgG)-Antikörper im Serum wurden durch enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) gemessen, wobei gereinigtes rHA0 von Influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) als Hüll-Antigen verwendet wurde. Die Folge an Reagenzien von der festen Phase nach außen umfasste (1) gereinigtes rHA0-Antigen, (2) Serumarten, (3) an alkalische Phosphatase konjugiertes Anti-Mensch-IgG der Ziege und (4) p-Nitrophenylphosphatdinatrium-Substrat. Der ELISA-Titer wurde als die höchste Verdünnung ausgedrückt, bei der die optische Dichte der Antigen enthaltenden Vertiefung mindestens zweimal so hoch war wie die der zugehörigen Kontrollvertiefung ohne Antigen. Neutralisierende Antikörper wurden unter Verwendung des Mikroneutralisationstests gemessen, der zuvor von Treanor, J. J. und Betts, R. F., J. Infect. Dis. 168: 455–459 (1993) beschrieben wurde. Kurz, serielle Verdünnungen von Hitze-inaktivierten Seren wurden mit etwa 100 TCID₅₀ des Influenzavirus A/Beijing/32/92 (H3N2) gemischt und bei 37°C über 1 h inkubiert. Das Virus-Seren-Gemisch wurde dann an konfluente einzellige Schichten von Nierenzellen des Madin-Darby-Hundes (MDCK) in Platten mit 96 Vertiefungen über 1 h bei Zimmertemperatur adsorbiert. Die Platten wurden gewaschen, um restliches Inoculum zu entfernen, mit serumfreiem Dulbecco-MEM mit 2 μg/ml Trypsin aufgefüllt und in 5% CO₂ bei 33°C über 72 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Methanol fiixert, und die virale Replikation wurde unter Verwendung einer Reihe an murinen monoclonalen Antikörpern, die für die Matrix spezifisch waren, und Nucleoproteinen des Influenza-A-Virus (Centers for Disease Control, Atlanta, GA), gefolgt von mit alkalischer Phosphatase gebundenem Anti-Maus IgG, gemessen.
Der Endpunkt-Titer der Seren wurde als die höchste Verdünnung definiert, die zu einer größeren als 50%igen Reduktion des Signals im Vergleich zu nicht neutralisierten Kontrollvertiefungen führte.
Virologie. Viruskulturen von Arten aus nasopharyngealen Abstrichen wurde an jedem Institut mittels Standardtechniken angelegt. Die Proben wurden entweder in MDCK- oder Nierenzellen von Rhesusaffen geimpft und bei 33°C über 14 Tage inkubiert. Die Hämadsorption der einzelligen Schichten wurde mit 0,4% Erythrocyten vom Meerschweinchen untersucht. Influenzaviren wurden in den Hämadsorptionpositiven Kulturen durch HAI unter Verwendung von H3-spezifischen Antiseren (Centers for Disease Control) identifiziert.
Statistische Analysen. Der reziproke HAI-, ELISA-IgG- und neutralisierende Antikörper-Titer wurde zur statistischen Analyse logarithmisch transformiert. Eine signifikante Antwort auf die Impfung wurde als vierfacher oder größerer Anstieg des Antikörper-Titers zwischen den Serumproben vor der Impfung und 3 Wochen nach der Impfung definiert. Labornachweis einer Influenza A (H3N2)-Virusinfektion wurde definiert als die Isolierung des Virus aus nasopharyngealen Sekreten und/oder einem vierfachen oder größeren Anstieg im HAI Antikörper-Titer im Serum zwischen den 3 Wochen nach Impfung (Vorsaison) im Dezember gesammelten Proben und den entsprechenden Proben nach der Saison, die im nachfolgenden Frühling gesammelt wurden. Unterschiede zwischen den Impfgruppen wurden unter Verwendung des genauen Fischer-Tests analysiert, um den Anteil von Testpersonen mit nachteiligen Reaktionen, signifikanten Antikörperantworten oder im Labor nachgewiesener Influenza-Erkrankung oder -Infektion zu vergleichen, und eine Analyse der Varianz (ANOVA) wurde durchgeführt, um die mittleren reziproken log₂-Antikörper-Titer nach der Impfung zu vergleichen. Die modifizierte Bonferroni-Ungleichung und Tukey-Kramer-Tests wurden da angewendet, wo sie geeignet waren, um vielfachen möglichen Vergleichen Rechnung zu tragen.
ERGEBNISSE
Vermögen, eine Reaktion hervorzurufen. Die in dieser Studie verwendeten rHA0-Impfstoffe waren sicher und gut verträglich. Die Häufigkeit von nachteiligen Reaktionen schien nicht von der Änderung der Dosis an rHA0-Antigen von 15 μg auf 90 μg beeinflusst zu sein, kann jedoch durch die Zugabe von Alaun leicht erhöht worden sein. Lokales Erythem, Schmerz und Empfindlichkeit an der Injektionsstelle wurden jeweils signifikant häufiger von den Teilnehmern berichtet, die zugelassenen Subvirion-Impfstoff erhalten hatten, als von jenen, die entweder 15 μg oder 90 μg rHA0 in Kochsalzlösung erhalten hatten. Mit Ausnahme einer Testperson, die mittelschweren Schmerz, Empfindlichkeit und Steifheit im Arm nach Immunisierung mit zugelassenem Impfstoff empfand, wurden alle Symptome ihrem Wesen nach als mild eingestuft und hielten allgemein 1–2 Tage an. Lokales Erythem und/oder Verhärtung waren, falls auftretend, in ihrer Größe stets kleiner als die Fläche einer Vierteldollarmünze.
Immunogenität. Basistiter von HAI-Antikörper aus dem Serum gegen das Influenzavirus A/Beijing/32/92 (H3N2) waren geringer oder gleich 1:8 bei 64 (50%) der 127 teilnehmenden Testpersonen. Die meisten Testpersonen aus jeder der vier Impfstoff-Gruppen zeigten HA-spezifische serologische Antworten, die durch HAI- und ELISA-Tests gemessen wurden (Tabelle 4). Serum-Titer von HAI-Antikörpern nach Impfung waren größer oder gleich 1:32 bei allen Testpersonen, die Impfstoff erhalten hatten, mit Ausnahme von zwei Personen, die 15 μg rHA0 erhalten hatten, und einer Person, der zugelassener Impfstoff verabreicht worden war. Bei der Mehrheit der freiwilligen Teilnehmer war Impfung auch mit der Produktion von neutralisierenden Antikörpern verbunden. Mittlere Anstiege von Antikörper-Titern und Serokonversionsraten schienen nach Immunisierung mit 15 μg rHA0 geringfügig niedriger als mit zugelassenem Impfstoff zu sein, obgleich diese Unterschiede nicht statistisch signifikant waren. Antikörperantwort auf rHA0 wurde durch die Zugabe von Alaun nicht verstärkt. Testpersonen, die mit 90 μg rHA0 immunisiert worden waren, erreichten nach der Impfung mittlere HAI- und ELISA-IgG-Antikörpertiter, die zwei- bis fünffach höher als in jeder der anderen drei Impfstoffgruppen waren (Unterschiede waren beim Vergleich der HAI-Titer im Serum statistisch signifikant).
Wirksamkeit des Schutzes. Während des Zeitraumes der Überwachung wurden insgesamt 28 Influenza-ähnliche Erkrankungen von 26 Testpersonen berichtet. Bei vier dieser Personen (drei von ihnen hatten ein Placebo erhalten, und eine von ihnen war mit 15 μg rHA0 immunisiert worden) ließ sich das Influenzavirus A (H3N2) aus nasopharyngealen Kulturen isolieren. Signifikante Anstiege des HAI-Antikörper-Titers gegen Influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) zwischen Serumproben vor und nach der Saison waren ebenfalls in drei der vier durch Kultur nachgewiesenen Fälle zu verzeichnen, jedoch bei keiner anderen Person, die Erkrankung berichtete. Der einzige Empfänger von rHA0, der in der Folge Labor-bestätigte Erkrankung an Influenza entwickelte, hatte die positive Kultur 31 Tage nach der Immunisierung erhalten und hatte eine Serumveränderung von einem HAI-Titer vor der Impfung von weniger als 1:4 zu einem Titer nach der Impfung (vor der Saison) von 1:32. Bei zwei weiteren Empfängern von Placebos und einem Freiwilligen, der mit zugelassenem Impfstoff immunisiert worden war, war eine Infektion mit Influenzavirus A (H3N2) während der epidemischen Saison serologisch nachzuweisen, ohne dass es zu einer klinischen Erkrankung kam. Beim Vergleich aller geimpfter Personen (oder aller Personen, die einen der rHA0-Impfstoffe erhalten hatten) als Gruppe erlitt eine signifikant größere Gruppe von Placebo-Empfängern Labor-bestätigte Erkrankung (p < ,05) an oder Infektion (p < ,005) mit Influenza A (H3N2).
Die vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, dass Influenza-Impfstoffe, die gereinigtes rHA0-Antigen enthalten und wie in der vorstehend genannten Patentanmeldung beschrieben hergestellt werden, gut verträglich und in der Lage sind, schützende Immunantworten beim Menschen hervorzurufen. Selbst bei einer Dosis von 90 μg rief das in dieser Studie bewertete rHA0 keine stärkeren Reaktionen als Kochsalzlösung-Placebo hervor und verursachte signifikant weniger lokale nachteilige Reaktionen als ein zugelassenen trivalenter Subvirion-Impfstoff, der halb so viel (d. h. 45 μg) an Gesamt-HA-Antigen enthielt.
Neutralisierende HA-spezifische Antikörperantworten auf das 15 μg-rHA0-Präparat waren mit jenen vergleichbar, die durch Subvirion-Impfstoff hervorgerufen wurden, und wurden durch Erhöhen der Dosis an rHA0 auf 90 μg signifikant verbessert.
Die Gesamtraten an Infektion und Erkrankung als Folge natürlicher Exposition gegenüber dem zirkulierenden epidemischen Stamm des Influenzavirus A (H3N2) waren unter geimpften Personen signifikant geringer als unter Placeboempfängern. Die Daten legen nahe, dass von rHA0 übertragene schützende Immunität, besonders bei Verabreichung in hohen Dosen, vergleichbar oder besser als jene ist, die durch zur Zeit verfügbare Impfstoffe hervorgerufen wird.
Beispiel 11: Verfahren zur Herstellung eines verbesserten HAO-Clonierungsvektors.
Ein verbesserter Clonierungsvektor zur Expression von reifem HA wurde entworfen, in dem das HA codierende Gen direkt stromabwärts der Sequenz gelegen ist, die das Chitinase-Signalpeptid codiert.
Lineares pMGS27 mit einzelsträngigen Enden wurde erzeugt
In das Plasmid pMGS12 wurde HA in SmaI- oder KpnI-Stellen direkt stromabwärts des Chitinase-Signalpeptids cloniert. Die Nuclein- beziehungsweise Aminosäuresequenzen werden als SEQ ID NO: 22 und SEQ ID NO: 23 dargestellt.
Diese Region wurde durch Oligo-gerichtete Mutagenese verändert, um pMGS27 zu erzeugen (veränderte Basen wurden unterstrichen) (SEQ ID NO: 24):
Plasmid pMGS27 wurde mit einem PstI-Schnitt linearisiert (Reste 6–35 von SEQ ID NO: 24 dargestellt):
dann wurde das linearisierte pMGS27 mit T4-DNA-Polymerase plus dATP behandelt, um einzelsträngige Enden zu erzeugen, wie nachstehend dargestellt (Reste 23–36 und Komplement der Reste 6–18 der SEQ ID NO: 24):
Ziel-HA-Gen wurde in pMGS27 cloniert
Schritt 1. PCR-Primer wurden synthetisiert. Vorwärtsoligo (SEQ ID NO: 25):

(20 Basen vom 5'-Ende des reifen HA)

Reverses Oligo (Komplement SEQ ID NO: 26): (20 Basen vom 3'-Ende des reifen HA)
PCR des HA-Gens
PCR des Ziel-HA-Gens mit den zwei Oligos wurde verwendet, um
zu erhalten (SEQ ID NO: 25 und SEQ ID NO: 26).
Anellierung des Ziel-HA-Gens an pMGS27 und Transformierung von E. coli.
Lineares pMGS27 und das mit T4-Polymerase behandelte PCR-Fragment des HA-Gens wurden vermischt. Die beiden Moleküle anellieren aneinander, um ein ringförmiges Plasmid zu bilden, das direkt zur Transformierung von E. coli verwendet werden kann. Das Diagramm umschließt die SEQ ID NO: 25 und 26, die Reste 23–36 und 6–18 der SEQ ID NR. 24.
Wie vorstehend dargestellt gibt es keine zusätzliche Aminosäure zwischen dem Signalpeptid und dem reifen HA.
Beispiel 12: Herstellung und Wirksamkeit eines trivalenten Impfstoffes aus Influenzaviren vom Typ A und B 1995–1996.
Influenzavirus-Impfstoff, gereinigtes rekombinantes Hämagglutinin, trivalent, Typen A und B
Influenzavirus-Impfstoff, gereinigtes rekombinantes Hämagglutinin, trivalent, Typen A und B (A/Texas/36/92\1 (H1N1), A/Johannesburg/33/94 (H3N2) und B/Harbin/7/94) ist eine nicht infektiöse Untereinheit, die von gereinigten rekombinanten Influenza-Hämagglutinin-Antigenen (HA) abstammt. Diese HA-Gene wurden aus Influenzaviren der Stämme A und B, die von Center for Disease Control/Food and Drug Administration empfohlen worden waren, wie vorstehend beschrieben cloniert, und die Identität eines jeden clonierten Gens wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt. Baculovirus-Expressionsvektoren, die die clonierten HA-Gene des Influenzavirus der Stämme A/Texas/36/91 (HINZ), A/Johannesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 enthielten, wurden verwendet, um die rekombinanten HA-Antigene in kultivierten Insektenzellen herzustellen. Die rekombinanten HA-Proteine sind ungespaltene Hämagglutinine in voller Länge (rHA0) mit einem Molekulargewicht von annähernd 69.000. Die rHA0 wurden in einer Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) produziert, die in einem serumfreien Kulturmedium gehalten wurden. Der trivalente Impfstoff ist aus gereinigtem (Reinheit größer als 95%, wahrscheinlicher größer als 99%ige Reinheit) rHA0 aus den beiden Influenza A-Stämmen und einem B-Stamm zu gleichen Anteilen vermischt zusammengesetzt. Der Impfstoff wird zur klinischen Verwendung als gereinigte rHA0-Proteine vom Typ A und B in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Zusatz von Konservierungsstoffen geliefert.
Tierversuche mit monovalenten, bivalenten und trivalenten rHA0-Impfstoffen haben gezeigt, dass sie frei von signifikanter Toxizität sind. Es gibt keine nachweisbaren, toxischen oder zufälligen Agenzien im Impfstoff. Allgemeine Studien zur Sicherheit und Immunogenität von A/Beijing/32/92- und A/Texas/36/91-rHA0 wurden an Mäusen und Meerschweinchen durchgeführt. Keine nachteiligen Reaktionen wurden verzeichnet. Bei Mäusen induziert eine einzelne Immunisierung mit 15 Mikrogramm rHA0-Antigenen ohne Adjuvans in zwei bis drei Wochen hohe Spiegel an anti-HA-IgG-Antikörpern, Hämagglutinin inhibierenden (HAI)-Antikörpern und neutralisierenden Antikörpern.
In einer Studie wurden Gruppen mit zehn Mäusen mit 15 Mikrogramm gereinigtem rHA0 A/Beijing/32/92 (H3N2) immunisiert, das in Zellen hergestellt worden war, die an Kulturmedien mit 10% fötalem Rinderserum angepasst waren, oder mit rHA0, das in Insektenzellen hergestellt worden war, die an Medien angepasst waren, die 10% fötales Rinderserum enthielten, oder mit rHA0, das in Insektenzellen hergestellt worden war, die an ein serumfreies Kulturmedium (rHA0-SF) angepasst waren. Zwei und drei Wochen nach Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen und Serumproben wurden hergestellt. Jedes Serum wurde auf anti-HA-IgG- und HAI-Antikörper untersucht. Sowohl rHA0- als auch rHA0-SF-Antigene rufen ähnliche Titer für anti-HA- und -HAI-Antikörper hervor. Zwei Wochen nach der einzelnen Immunisierung haben die meisten Mäuse signifikante Titer für HAI-Antikörper, und in Woche 3 hatten 8/10 Mäusen in jeder Gruppe HAI-Titer von 32 oder mehr. Diese und andere biochemische und immunologische Studien zeigen, dass rHA0, das in serumfreien Kulturen aus Insektenzellen hergestellt wird, nicht von rHA0 zu unterscheiden ist, das unter Serum enthaltenden Fermentationsbedingungen hergestellt wurde.

Ein Studie wurde durchgeführt, in der die Formulierung des trivalenten rHA0-Influenza-Impfstoffes von 1994–1995 mit einem zugelassenen Impfstoff aus gereinigtem Oberflächen-Antigen des Virus, Fluvirin^® (ein abgeschwächter Influenzavirus-Impfstoff, der durch Kultivierung in Eiern hergestellt worden war) verglichen wurde. Jeder Impfstoff enthielt 15 Mikrogramm rHA0 oder virales HA pro 0,5 ml der Influenza-Stämme A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) und B/Panama/45/90. Sowohl das rekombinante rHA0 als auch Tabelle 5: Vergleich des trivalenten rHA0-Impfstoffes mit Fluvirin^®.

	trivalenter rHA0-Fluvirin^®-Influenza-Impfstoff GMT (n = 10 Mäuse)
GMT (n = 10 Mäuse) als Antigen verwendeter Virusstamm	anti-HA IgG			anti-HA IgG
GMT (n = 10 Mäuse) als Antigen verwendeter Virusstamm	Woche 0	Woche 3	Woche 0	Woche 3
A/Texas/36/91 (H1N1)	< 1000	103,000	< 1000	11,200
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	< 1000	162,400	< 1000	41,000
B/Panama/45/90	< 1000	164,800	< 1000	26,000
als Antigen verwendeter Virusstamm	HAI			HAI
A/Texas/36/91 (H1N1)	< 8	1,522	< 8	1,088
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	< 8	494	< 8	435
B/Panama/45/90	< 8	174	< 8	42
als Antigen verwendeter Virusstamm	neutralisierender AK			neutralisierender AK
A/Texas/36/91 (H1N1)	< 100	5,800	< 100	2,720
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	< 100	840	< 100	360
B/Panama/45/90	< 100	1,300	< 100	700

Modifikationen und Variationen der hierin beschriebenen Verfahren und Zusammenstellungen zur Herstellung und Verwendung eines rekombinanten Influenza-Impfstoffes werden Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Solche Modifikationen und Variationen sollen im Schutzumfang der angefügten Patentansprüche umfasst sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vektor für die Herstellung eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen, glykosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als ein Impfstoff verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein weiterhin ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin fusioniert ist, wobei der Vektor die folgenden 5' –> 3'-Sequenzen umfasst: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nukleinsäure, die die Nukleotide 19–72 von SEQ ID No: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid kodieren, oder eine Nukleinsaure, die ein Baculovirus-Signalpeptid kodiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 kodiert, die kodierenden Sequenzen für reifes Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, eine kodierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin RNA-Polyadenylierungssignal.
Vektor nach Anspruch 1, wobei das Signalpeptid aus dem Baculovirus-61K-Gen abgeleitet ist.
Vektor nach Anspruch 1, wobei die Sequenz, die das Signalpeptid und das Hämagglutinin kodiert, keine dazwischen liegenden Aminosäuren kodiert.
Vektor nach Anspruch 1, welcher weiterhin eine Sequenz umfasst, die ein zweites Protein kodiert, welches als ein Fusionsprotein mit dem Hämagglutinin exprimiert wird.
Vektor nach Anspruch 1, welcher in kultivierte Insektenzellen transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen, glykosylierten Influenza-Hämagglutinin-Proteins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist, eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als ein Impfstoff verwendet wird, und wobei das Hämagglutinin-Protein weiterhin ein zweites Protein umfasst, welches mit dem Hämagglutinin fusioniert ist, wobei der Vektor die folgenden 5' –> 3'-Sequenzen umfasst: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nukleinsäure, die die Nukleo tide 19–72 von SEQ ID No: 6 oder 8 umfasst, welche ein Baculovirus-Signalpeptid kodieren, oder eine Nukleinsäure, die ein Baculovirus-Signalpeptid kodiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die kodierenden Sequenzen für Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Influenza-A-Stämmen und Influenza-B-Stämmen, eine kodierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylierungssignal, wobei man: Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale RNA, für Influenza-A-Stämme, oder virale mRNA, für Influenza-B-Stämme, isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO. 1)) für die virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder Random-Primer für die mRNA aus Influenza-B-Stämmen, synthetisiert, wobei die 5'-und 3'-Primer Restriktionsenzymstellen an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene zu finden sind, die Influenza A- oder -B-Primer und die Influenza-cDNA mit dem Hämagglutinin-Gensegmenten vermischt amplifiziert, um doppelstrangige DNA-Fragmente zu erzeugen, die die vollständigen, reifen Hämagglutinin-kodierenden Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert und dann die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids in einen Vektor kloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors zum Exprimieren eines im Wesentlichen reinen, rekombinanten, reifen, glykosylierten Influenza-Hämagglutinins, welches durch ein Baculovirus-Expressionssystem in kultivierten Insektenzellen erzeugt wird, wobei das Hämagglutinin-Protein bis zu 95% oder mehr aufgereinigt ist, und wobei das Protein immunogen ist und eine protektive Immunantwort induziert, wenn es als ein Impfstoff verwendet wird, wobei der Vektor die folgenden 5' –> 3'-Sequenzen enthält: einen Polyhedrin-Promotor aus einem Baculovirus, eine Nukleinsäure, die die Nukleotide 19–72 von SEQ ID No: 6 oder 8, die das Baculovirus-Signalpeptid kodieren, umfasst, oder eine Nukleinsäure, die ein Baculovirus-Signalpeptid kodiert, welches die Aminosäuren 1–18 von SEQ ID NO: 7 oder 9 umfasst, die kodierenden Sequenzen für Hämagglutinin aus einem Stamm von Influenza, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Influenza-A-Stämmen und Influenza-B-Stämmen, die kodierende Sequenz für das zweite Protein, ein Translationsterminationscodon und ein Polyhedrin-RNA-Polyadenylierungssignal, bei dem man: Virus aus einem Zellmedium erntet und entweder virale RNA, für Influenza-A-Stämme, oder virale mRNA, für Influenza-B-Stämme, isoliert, cDNA unter Verwendung von entweder einem universellen Primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO. 1)) für die virale RNA aus den Influenza-A-Stämmen oder Random-Primer für die mRNA aus Influenza-B-Stämmen, synthetisiert, wobei die 5'- und 3'-Primer Restriktionsenzymstellen an den Enden aufweisen, die nicht innerhalb der Hämagglutinin-Gene zu finden sind, die Influenza-A- oder -B-Primer und die Influenza-cDNA mit dem Hämagglutinin-Gensegementen vermischt amplifiziert, um doppelstrangige DNA-Fragmente zu erzeugen, die die vollständigen, reifen Hämagglutinin-kodierenden Sequenzen enthalten, das Signalpeptid der Hämagglutinin-Gene identifiziert und dann die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids amplifiziert und die Hämagglutinin-Gene abzüglich des Signalpeptids in einen Vektor kloniert, der den AcNPV-Polyhedrin-Promotor enthält.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Hämagglutinin-Gene in den Vektor unter Anwendung von PCR kloniert werden, so dass der Vektor das Signalpeptid unmittelbar verknüpft mit dem Hämagglutinin ohne jegliche dazwischen liegende Aminosäuren kodiert.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem man weiterhin den Vektor in Insektenzellen transfiziert und die Zellen auf die Hämagglutininexpression selektioniert.
Vektor, hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
Vektor nach Anspruch 10, wobei der Vektor im Wesentlichen reines, rekombinantes, reifes, glykosyliertes Influenza-Hämagglutinin exprimiert.
Vektor nach Anspruch 3 oder Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein Signalpeptid und ein Hämagglutinin kodiert, die gemeinsam die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Signalpeptid aus dem Baculovirus-61K-Gen abgeleitet ist.