CN102533680A - 狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种狂犬病毒病毒样颗粒，由狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基质蛋白M构成，具备稳定均一的空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白全部或部分片段，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。其内不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，无添加入灭活剂引入的质量风险。该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化，从原理上规避了传统灭活疫苗可能因加入灭活剂引入的质量风险。同时，由于其简单快速的构建、制备方式，能更方便快速的设计制造针对新出现毒株的新型疫苗。基于本发明原理，易于在该颗粒基础上形成多联、多价新型疫苗，能广泛的替代现有的诸如相关抗原抗体检测、功能蛋白载体等大量实用技术中的相关关键原材料。

Description

狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本专利涉及一种或多种狂犬病毒蛋白，利用体外重组方式表达或其他方式，形成具有一定空间结构的病毒样颗粒。该颗粒具有狂犬病毒的重要抗原特征，并能通过诱导T细胞免疫及B细胞免疫产生足够抵抗病毒攻击的能力。该颗粒的安全性和毒株构建的方便性均优于目前正在使用的全细胞灭活狂犬病疫苗。该颗粒能广泛用于相关多联多价疫苗研制、狂犬病毒相应抗原抗体体外检测及外源蛋白载体等方面。本专利还涉及一种该病毒样颗粒的纯化浓缩方式及鉴定方法。 

背景技术

病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。 

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的一种人畜共患传染病。全世界每年约有6万人死于狂犬病。我国每年狂犬病发病人数在印度之后，居世界第二位，近几年每年约1,000～1,200万人接受狂犬病暴露后接种。目前本病几乎无有效的治疗办法，只能通过接种疫苗来预防。自巴斯德首次制成狂犬病弱毒疫苗以来，世界各国不断完善并研制出了多种安全有效的人用、兽用狂犬病疫苗。狂犬疫苗的发展经历了神经组织(羊脑、鼠脑)灭活苗、原代细胞培养疫苗(例如鸡胚、鸭胚、地鼠肾细胞培养灭活疫苗)等。由于目前的狂犬病疫苗均为灭活疫苗，其安全性存在隐患。2004年，Pasteur公司因新型狂犬疫苗Imovax中含有活性的PM病毒，召回了若干批次产品。这又一次引起人们对狂犬疫苗为安全性问题的思考。 

由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢复，安全性不能保证。但VLPs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。加之VLP类似于真正病毒粒子的形态和空间结构，不仅能诱导受体产生体液免疫，也能产生细胞免疫[参见Bryce Chacherian，Virus-like particles：Flexible platform for vaccine development.Expert Rev.Vaccines 6(3)，381-390(2007)]。同时，作为一种抗原的承载平台，便于利用基因工 程或化学的方法进行修饰，或结合多种抗原已形成新的联合疫苗。这使得利用VLP作为新型疫苗的候选物有着先天的优势。此外，利用VLP良好的抗原特性及空间构象，也可作为基因治疗载体，通过插入外源蛋白表位，释放外源蛋白而达到特异性治疗的目的；或可作为抗原以检测血清中的特异性抗体，在临床血清学诊断中发挥重要的作用。 

病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装。利用各种表达系统表达多种病毒重组结构蛋白，利用结构蛋白的自组装特性形成病毒样颗粒的方法已在多种病毒上成功实现，并同时表现出很好的保护性。例如人和动物的免疫缺陷病毒、流感病毒、人乳头状瘤病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒和汉坦病毒等。通过表达形成的病毒样颗粒，颗粒大小一般在20～150nm之间。Sang-Moo Kang等人利用H1N1株流感病毒HA和M1蛋白同时表达，形成的VLP免疫小鼠后，不仅能保护A/PR8/34(H1N1)的攻击，同时也具有对A/WSN/33(H1N1)野毒株的攻击[参见Fu-Shi Quan，Chunzi Huang，Richard W.Compans，and Sang-Moo Kang.Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus.JOURNAL OF VIROLOGY.2007，81(7)：3514-3524]。同样H3N2和H9N2的VLP在此之前也相继被构建并表现出很好的保护性[参见Galarza，J.M.，T.Latham，and A.Cupo.2005.Virus-like particle(VLP)vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge.Viral Immunol.18：244-251.及Pushko，P.，T.M.Tumpey，F.Bu，J.Knell，R.Robinson，and G.Smith.2005.Influenza virus-like particles comprised of the HA，NA，and M1proteins of H9N2influenza virus induce protective immune responses in BALB/cmice.Vaccine 23：5751-5759.]。 

2006年Merck公司研制的HPV6、11、16、18四价VLP Gardasil^TM疫苗获得美国FDA许可且开始投放市场。这为VLP的研制与应用带来了希望。匹兹堡大学疫苗研究中心的Ted Ross博士在2009年109届美国微生物年会上展示的数据表示，构建的流感VLP在免疫原性和免疫持久性上均优于现有疫苗。 

80年代以来，基于安全性的考虑，人们陆续对狂犬病毒的亚单位狂犬疫苗和重组疫苗产生重视。Wistar研究所的Wunner在对纯化的G蛋白研究后，说明了Gs(可溶性G蛋白)和G蛋白之间存在58个AA的丢失带来15倍的抗原性的降低。同时，限于当时的技术水平，E.Coli表达的重组G蛋白由于产量和糖基化的原因，不能达到有效的保护[参见WILLIAM H.WUNNER，et al.Rabies Subunit Vaccines.J.gen.Virol.(1983)，64，1649-1656.]。1989年Prehaud利用杆状病毒表达CVS株中的G蛋白，感染48h后G表达量最高，2×10⁹感染的Sf8细胞能 产生24mg G蛋白。12～120μg(大约10⁶～10⁷细胞)免疫小鼠14天后，能抵抗10⁴LD50CVS的攻击(药典3部上疫苗的效价测定是100LD50CVS)。低剂量的检测中，12ng(大约103细胞)也能抵抗CVS攻击，10～100细胞能推迟小鼠死亡时间[参见Christophe Prehaud，et al.Immunogenic and protective properties of rabies virus glycoprotein expressed by baculovirus vectors.VIROLOGY，173，390-399(1998).]。1992年，Pasteur研究所的Tordo利用杆状病毒表达狂犬病毒属的Mokola病毒G蛋白，10⁶Sf9细胞中能表达至少3.2μg的G蛋白，而5×10⁴细胞(大约160ng)G蛋白能起到保护作用[参见Noel Tordo，et al.Structure and expression in baculovirus of Mokola virus glycoprotein：An efficient recombinant vaccine.Virology，194，59-69(1993).]。1991年，傅振芳在杆状病毒中表达了N蛋白。其表达N蛋白的目的是G蛋白属膜蛋白，难以纯化，且纯化时需要加入对人体不利的去污剂成分(Triton)。同时，利用成本低廉的N蛋白作为初免，有可能作为暴露前预防的备选。2×10⁸细胞能产生大约5mg的N蛋白。加上完全弗式佐剂，能产生高于纯化RNP的免疫效果。但此文章中未出现和G蛋白的比较以及小鼠攻击实验[参见Z.F.Fu，et al.Rabies virus nucleoprotein expression in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine.PNAS，88，2001-2005(1991).]。1999年而Pasteur研究所的Perrin对G蛋白和N蛋白的免疫原性进行了比较，并明确的指出N蛋白仅仅增加中和抗体的产生，而并不能单独的刺激机体产生中和抗体。Perrin同样利用昆虫病毒表达G和N。在106细胞中，上清表达约5μg G蛋白，而沉淀中回收2.9μg G蛋白。上清中的蛋白400ng免疫小鼠14天后，RFFIT检测中和抗体3.2IU(虽然明显低于1μg的灭活疫苗产生的中和抗体22.6IU)[参见Pierre Perrin，et al.Is there an advantage to including the nucleoprotein in a rabies glycoprotein subunit vaccine？Vaccine，17(1999)，1549-1557.]。 

利用痘苗病毒或者腺病毒作为载体也取得了很大的突破。扈连良利用伪狂犬病毒作为载体，表达狂犬病毒G蛋白，但免疫效果与灭活疫苗相差明显。最近，Pasteur研究所与巴西Butantan研究所合作，开展了生产级的果蝇细胞表达G蛋白的工作，目前发表的文章是70～640ng/ml的产量并能以100ng左右的免疫达到80％对CVS攻击的保护。 

传统的狂犬病毒亚单位疫苗说考虑的仅是能表达具有刺激机体产生中和抗体的G蛋白的表达，而对表达G蛋白的空间构象和如何形成更具免疫保护效力空间结构的研究极度缺乏。截至目前为止，尚无研究机构发表体外重组表达狂犬病毒病毒样颗粒的相关研究。 

发明内容

本发明的任务是提供一种狂犬病毒病毒样颗粒，该狂犬病毒病毒样颗粒具备稳定均一的 空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。该病毒样颗粒不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，避免了可能因加入灭活剂引入的质量风险，该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化。 

实现本发明的技术方案是： 

本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒，包括但不限于狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病毒基质蛋白(M)，其中狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基质蛋白(M)可来源于重组蛋白或利用狂犬病毒培养液所裂解、分离、纯化方法得到，所述的重组蛋白可以是利用原核表达系统或真核的表达系统表达的重组蛋白。狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基质蛋白(M)的核酸或蛋白序列来源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能实现形成颗粒组装及狂犬病毒保护能力的其他狂犬病毒毒株。典型的CVS序列可参见GenBank中序列，GQGQ918139.1。其中2496-3104bp为M蛋白编码序列，3320-4894bp为G蛋白编码序列。发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒还可以有脂质双层膜。 

本发明提供的狂犬病毒病毒样颗粒加上辅助配方可制成药用组合物，所述的辅助配方可以是保护剂、稳定剂、佐剂及相应溶剂。 

本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒可以按以下步骤制备： 

步骤一：狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆，构建重组杆状质粒pFD_MG； 

步骤二：利用重组杆状质粒pFD-MG构建重组杆状病毒rV_MG； 

步骤三：利用重组杆状病毒rV_MG制备狂犬病毒病毒样颗粒。 

本发明实施例提供了制备本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒的具体方法。 

本发明中实施例1利用杆状病毒表达系统表达重组狂犬病毒G蛋白和M蛋白，利用其特性自主装配，形成具有均一空间结构的病毒样颗粒。因其的特性，该病毒样颗粒兼具亚单位和重组疫苗的安全性和狂犬病毒颗粒诱导T细胞免疫及B细胞免疫的高效性的同时，避免传统全细胞灭活疫苗中的可能潜在质量风险。 

本发明提供的狂犬病毒病毒样颗粒具备稳定均一的空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。该病毒样颗粒不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，避免了可能因加入灭活剂引入的质量风险。该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化。 

本发明从原理上规避了传统灭活疫苗可能存在的因加入灭活剂引入的质量风险。同时，由于其简单快速的构建、制备方式，能更方便快速的设计制造针对新出现毒株的新型疫苗。并且，基于本发明的原理，易于在该颗粒基础上逐渐多联、多价新型疫苗。鉴于该颗粒的特质，能广泛的替代现有的诸如相关抗原抗体检测、功能蛋白载体等大量实用技术中的相关关 键原材料。 

附图说明

图1是狂犬病毒基因组结构示意图，图中线段表示狂犬病毒基因组，空心箭头表示基因组中基因成分。如图可见，狂犬病毒基因组由5个基因构成，全长约12kb，基因组长约12kb，从3′到5′端依次为编码N、P、M、G、L蛋白的5个基因，各个基因间还含非编码的间隔序列。其中N蛋白编码核糖核蛋白；P基因编码的磷酸化蛋白；M蛋白编码基质蛋白；G基因编码糖蛋白，L蛋白编码依赖RNA的RNA聚合酶。 

图2是狂犬病毒结构切面模式示意图，其中数字标识1为膜外糖蛋白G，2为基质蛋白M，3为脂质双层膜，4为病毒基因组。如图所示，病毒外形呈弹状，一端纯园，一端平凹，有囊膜，内含核衣壳呈螺旋对称。G基因编码的G蛋白是构成病毒表面刺突糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与免疫中起着关键作用；M蛋白编码基质蛋白，参与形成包膜结构。 

图3是本发明狂犬病毒病毒样颗粒切面结构示意图，其中数字标识1为膜外糖蛋白G，2为基质蛋白M，3为脂质双层膜。不同于上述图2所示天然狂犬病毒结构，狂犬病毒病毒样颗粒因不包含病毒基因组成分，坍塌为中空球形。 

图4是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD-M的构建策略图。如图所示，狂犬病毒M基因通过RT-PCR和TA克隆过程，形成重组TA克隆质粒pMD_M。然后通过酶切、连接、转化等亚克隆方法，形成重组杆状病毒质粒pFD_M。图中重组杆状病毒质粒pMD_M质粒中Amp为氨苄青霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Kpn I标识的是Kpn I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_M质粒中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，pP10表示杆状病毒pP10基因启动子，HSV表示单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase.HSV-tk)基因终止子。Tn7L与Tn7R表示细菌Tn7转座子转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。Kpn I所示为Kpn I酶切位点。 

图5是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_G构建策略图，如图所示，狂犬病毒G基因通过RT-PCR和TA克隆过程，形成重组TA克隆质粒pMD_G。然后通过酶切、连接、转化等亚克隆方法，形成重组杆状病毒质粒pFD_G。图中重组TA克隆质粒pMD_G中Amp为氨苄青霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，Hind III标识的是Hind III酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_G中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，pPH表示pPH多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40) 基因终止子，Tn7L与Tn7R表示Tn7转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。Hind III标识的是Hind III酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。 

图6是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_MG构建策略图。如图所示，通过酶切、连接、转化等亚克隆方法，将重组TA克隆质粒pMD_M中的狂犬病毒M基因亚克隆至重组杆状病毒质粒pFD_G中的相应位置。其中组TA克隆质粒pMD_M中Amp为氨苄青霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Kpn I标识的是Kpn I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_G中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，pPH表示pPH多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因终止子，Tn7L与Tn7R表示Tn7转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。HindIII标识的是HindIII酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。pFD_MG质粒中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，pP10表示杆状病毒pP10基因启动子，HSV表示单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase.HSV-tk)基因终止子，pPH表示pPH多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因终止子，Tn7L与Tn7R表示Tn7转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因，Knp I标识的是Kpn I酶切位点，Hind III标识的是HindIII酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。 

图7是实施例1中重组TA克隆质粒pMD_M及pMD_G琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组TA克隆质粒pMD_G，泳道3为重组TA克隆质粒pMD_G经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道4为重组TA克隆质粒pMD_M，泳道5为重组TA克隆质粒pMD_M经Kpn I酶切后产物。如图所示，重组TA克隆质粒pMD_M及重组TA克隆质粒pMD_G均在理论位置有明显条带。重组TA克隆质粒pMD_G经Hind III和Spe I双酶切后出现2.6kb及1.5kb两条条带，与原始质粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。PMD_M经Kpn I酶切后产生2.6kb及0.6kb两条条带，与原始质粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。 

此图说明按照实施例1的步骤和图3～4所述的策略，重组TA克隆质粒pMD_G及pMD_M的构建与预期一致。 

图8是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG琼脂糖凝胶电泳图。图中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组杆状病毒质粒pFD_MG，泳道3为重组杆状病毒质粒pFD_MG经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道4为重组杆状病毒质粒pFD_MG经Kpn I酶 切后产物，泳道5为重组杆状病毒质粒pFD_G，泳道6为重组杆状病毒质粒pFD_G经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道7为重组杆状病毒质粒pFD_M，泳道8为重组杆状病毒质粒pFD_M经Kpn I酶切后产物。如图所示，重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pFD_MG质粒均在理论大小位置有明显条带，重组杆状病毒质粒pFD_MG和pFD_G在经过Hind III和Spe I双酶切后，形成两条明显条带，条带位置与空载体及狂犬病毒G基因大小一致。重组杆状病毒质粒pFD_MG和pFD_M经Kpn I酶切后形成明显两条带，条带大小与空载体及狂犬病毒M基因大小一致。 

上述凝胶电泳图表明根据实施例1的步骤和图3～5所述的策略，重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG构建与预期一致。 

图9是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组杆状病毒质粒pFD_MG PCR反应后产物，泳道3为重组杆状病毒质粒pFD_G PCR反应后产物，泳道4为重组杆状病毒质粒pFD_M PCR反应后产物。G和M所示为狂犬病毒G基因和M基因理论位置。如图所示，重组杆状病毒质粒pFD_MG经PCR反应后，出现两条明显电泳带，分别与狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因大小一致；重组杆状病毒质粒pFD_G和pFD_M经PCR反应后，均只有单一条带，分别与狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因大小一致。 

上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果证实狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因按照图3～5的策略重组至重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG。 

图10是按照实施例3进行浓缩、纯化后，本发明狂犬病毒病毒样颗粒的扫描电镜图，图中标尺中每一小格表示100nm。如图所示，在经过浓缩、纯化后，能形成形态、大小均一的具有一定空间结构的颗粒，颗粒中间由于不含任何核酸成分，形成空洞，因此在经过负染后，显示黑色。而颗粒表面有显示明显蛋白聚集。 

图11是实施例4中，狂犬病毒G蛋白夹心法ELISA检测工作曲线，图中，纵坐标表示检测450吸光度的检测结果，横坐标表示标准样品不同稀释度的理论IU值。 

由图可见随着标准样品的IU值的增加，ELISA检测的450nm吸光度也相应增加。利用一定的非线性回归的方法，能根据工作曲线对平行试验样本检测的450nm吸光度回归相应的IU值。由于此方法利用抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体进行板条的包埋，因此利用此种方法检测狂犬病毒G蛋白具有极高的敏感性和特异性。 

图12是按照实施例4中所述方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫小鼠后并经标准攻击毒株(CVS)攻击后存活率与传统灭活疫苗、重组G蛋白、空白对照的比较。图中，不同线段表示不同天数后小鼠存活率的变化。”*”和”**”表示统计学上的差异。如图所示，空白对 照组10只小鼠在10天后发病全部死亡。这说明如无外源免疫原接种，小鼠不能抵抗CVS毒株的攻击。传统灭活疫苗在观察14天后无死亡，说明在传统疫苗接种后能产生保护性抗体。病毒样颗粒和重组G蛋白免疫后在观察14天后，也能产生一定的保护，死亡小鼠分别为1只及2只，均在国家规定的80％保护率范围内。从统计学分析结构来说，传统灭活疫苗、病毒样颗粒和重组G蛋白均与空白对照有明显显著差异(P＜0.01)，但之间没有统计学差异。尽管如此，从本实验保护率上，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫保护力优于重组G蛋白。 

图13为按照实施例4中方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫两次后，中和抗体生成情况与传统灭活疫苗、重组G蛋白及空白对照的比较。 

图中纵坐标为血清中和抗体的几何平均滴度，横坐标为检测时间。不同的线段表示不同的免疫原。根据WHO建议，保护性水平为0.5IU。免疫原在0周初免，1周进行加强。 

如图所示，传统灭活疫苗、本发明狂犬病毒病毒样颗粒和重组G蛋白均在免疫后刺激小鼠产生一定的具有保护性的中和抗体。而空白对照无法产生高于保护性水平的中和抗体。同时，根据图中所示结果，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫后生成保护性中和抗体滴度与传统灭活疫苗接近，且远高于重组G蛋白免疫后产生的中和抗体。这与上述图11～12中攻击实验结果一致。也同时说明本发明狂犬病毒病毒样颗粒作为疫苗备选物所产生的保护性功能与传统灭活疫苗基本一致，而远高于重组G蛋白。 

图14是按照实施例4中方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫小鼠后，CD4+和CD8+T细胞生成情况与传统灭活疫苗、重组G蛋白及空白对照的比较。图中纵坐标表示检测的细胞比例，横坐标分为3组，分别是CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例。不同的免疫原以不同的柱表示。如图所示，传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组在免疫后，刺激机体产生的CD4+T细胞的数量远高于阴性对照组和重组G蛋白组，并且在统计学上存在明显显著差异(P＜0.001，图中以“**”表示)和明显差异(P＜0.05，图中以“*”表示)。在刺激小鼠产生CD8+T细胞上，上述4种不同类别的免疫原虽没有统计学差异，但传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组也高于阴性对照组和重组G蛋白组。一般认为，CD4+T细胞数量的增加反应小鼠在免疫原刺激后体液免疫反应水平，而CD8+T细胞数量的增加反应小鼠在免疫原刺激后细胞免疫反应水平。因此传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组均能在免疫小鼠后，产生高的体液免疫反应，同时也能产生一定的细胞免疫反应。 

具体实施方式

下面结合实施例描述本发明。 

实施例1重组狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆： 

1.狂犬病毒CVS病毒株RNA提取 

1)预配制试剂： 

a)含carrier RNA的缓冲液AVE的配制：将310μl缓冲液AVE加入装有310μg carrier RNA的小管中，得到浓度为1μg/μl的溶液。 

b)缓冲液AW1的配制：向未使用的缓冲液AW1(19ml)中加入25ml乙醇(96-100％)，使其终体积到达44ml。 

c)缓冲液AW2的配制：向未使用的缓冲液AW2(13ml)中加入30ml乙醇(96-100％)，使其终体积到达43ml； 

2)取1.5ml Ep管，加入554.4μl缓冲液AVL及5.6μl含carrier RNA的缓冲液AVE，混匀。 

3)向Ep管中加入150μlCVS病毒液，振荡混匀15s，室温静置10min。 

4)短暂离心去除挂壁水珠。 

5)向Ep管中加入560μl乙醇(96-100％)，振荡混匀15s，短暂离心去除挂壁水珠。 

6)加630μl液体到带2ml套管的spin column中，室温8000 rpm 1min，弃除液体。 

7)将剩余的630μl液体加入上述带2ml套管的spin column中，室温8000 rpm 1min，弃除液体并置换新的套管。 

8)向spin column中加入500μl缓冲液AW1，室温8000 rpm 1min，弃除液体并置换新的套管。 

9)向spin column中加入500μl缓冲液AW2，室温14000 rpm 3min，弃除液体。 

10)再次室温14000 rpm 1min以确保液体去除干净。 

11)将spin column置于1.5ml Ep管中，向其中加入40μl缓冲液AVE，室温静置1min后8000rpm 1min，取出液体再次加入spin column中，室温静置1min后8000 rpm 1min。 

12)取离心溶液，加入0.5μlRNA酶抑制剂，-20℃冻存备用。 

2.狂犬病毒RNA的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 

1)取PCR管，加入提取15μl RNA及2μl逆转录通用引物(10μM)，72℃5min后10℃5min，以破坏RNA二级结构。 

2)配制逆转录反应体系，总体积25μl，如下： 

5×Reaction Buffer    5μl 

dNTP Mixture(10mM)    1μl 

AMV Reverse Transcriptase  1μl 

Ribonuclease Inhibitor   1μl 

补去离子水至  25μl 

3)逆转录反应程序如下：42℃1h，95℃5min，4℃5min； 

4)取另三个PCR管，配制PCR反应体系，总体积50μl，组成如下： 

10×Buffer 5μl 

dNTP Mixture(2.5mM)5μl 

上游引物(10μM)2μl 

下游引物(10μM)2μl 

cDNA模板3μl 

Pfu DNA Polymerase  0.5μl 

补去离子水至50μl 

G蛋白特异性上游引物：ataac tagta tggtt cctca ggttc ttttg 

G蛋白特异性下游引物：tacaa gcttt aacag tctgat ctcac ctcc 

M蛋白特异性上游引物：atagg tacca tgaac gttct acgca agat 

M蛋白特异性下游引物：tacgg tacct tattc tagaa gcaga gaga 

5)PCR反应程序如下：95℃5min，循环30次(95℃30s，57℃30s，72℃4min)，72℃10min，4℃10min。 

6)1％琼脂糖凝胶电泳 

a)称取一定量琼脂糖，加入适量TAE缓冲液，放入微波炉中加热溶解，配成1％浓度的琼脂糖凝胶。 

b)按每100ml凝胶加入5μl Gold View染料，向琼脂糖凝胶中加入相应体积Gold View。 

c)待琼脂糖凝胶冷却至不烫手(60℃左右)，倒入模具内。 

d)待琼脂糖完全凝固，拔出模具中的齿槽，置入含TAE缓冲液的电泳槽中，加入样品(1μl 5×上样缓冲液+5μl样本)，接通电源，设置恒定电压120V，电泳时间约40min。 

e)电泳完毕后，ImageQuant 300凝胶成像系统紫外检测结果。 

3.G和M目的片段的T-A克隆 

3.1凝胶回收PCR产物 

1)用锋利的刀片切下G和M目的条带，尽量减少凝胶的尺寸，弃除多余的凝胶。 

2)在无色的Ep管中称量胶，1质量的胶加3体积的QG缓冲液，如100mg凝胶加入300μlQG缓冲液。 

3)50℃孵育10min(直到见胶溶解)促使溶解可每2-3min震摇管。 

4)胶完全溶解后，检查混合物的颜色是否为黄色，(类似与QG Buffer)若其为橘色 或紫色，加10μl的3M sodium acetate ph5.0混合直至变黄。 

5)将QIAquick柱于2ml的收集管中 

6)加样本于QIAquick柱，离心1min。柱能装的最大体积为800μl，对于＞800μl的可再次装柱再次离心。 

7)弃透过液，QIAquick柱可放回原收集管。 

8)加0.5ml的QG Buffer到QIAquick柱并离心1min。 

9)洗脱：加0.75ml的PE Buffer到QIAquick柱，离心1min。因为DNA产物将用于盐敏感的实验粘端连接，因此在离心之前将柱平衡2-5min。 

10)弃除透过液，并再次离心QIAquick柱1min，残留的乙醇(来自PE Buffer)将不能被清除干净，除非在离心之前的透液已清除干净。 

11)将QIAquick柱放在1.5ml的离心管。 

12)DNA回收：为了提高DNA的浓度，可加30μl的蒸馏水于QIAquick柱膜的中心，平衡1min，离心1min。为保证DNA的有效洗脱，如果用水，则水的PH应在7.0-8.5之间。 

13)纯化的G和M的DNA保存于-20℃备用。 

3.2平端G和M PCR产物加A-Tailing 

1)平端G和M的PCR纯化产物2μg加入1μl TaqDNA聚合酶10×Buffer(含MgCl₂)，并加入dATP至终浓度0.2mM； 

2)加入5个单位TaqDNA聚合酶，加入去离子水至终体积为10μl； 

3)70℃孵育30min； 

4)加尾产物可用于后续的连接反应或保存于-20℃备用。 

3.3G和M片段的TA克隆 

1)短暂离心pMD18-T Simple载体，纯化并加A尾的G和M片段及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底。 

2)充分混匀各种成分，目的片段：载体的摩尔比按3∶1进行连接。 

3)如下体系连接反应： 

	标准反应	阳性对照
			T4DNA连接酶缓冲液	5μl	5μl
pMD18-T载体(50ng)	1μl	1μl
			PCR产物(G和M)	3μl	-
插入DNA对照	-	2μl
			T4DNA连接酶	1μl	1μl
补加去离子水	10μl	10μl

[0113]  4)短暂离心使连接反应混匀后，16℃连接16-18h。 

3.4转化 

1)将含AMP的LB平板及SOC培养基平衡至室温。 

2)离心使连接反应内容物汇集到管底，取2μl连接反应产物加到置于冰上的1.5mlEp管中，向另一置于冰上的1.5mlEp管加入未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。 

3)将冻存的TOP10高感受态细胞从-70℃冰箱中取出，置于冰上至融化，轻轻震荡离心管使之混匀。 

4)向步骤2中每个Ep管中加入50μl高感受态细胞。 

5)轻轻震荡Ep管混匀，冰浴30min。 

6)在精确的42℃水浴中热击60s(不要震动)。 

7)迅速将管移到冰浴中，使细胞冷却2min。 

8)每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950μlSOC培养基，而转化未酶切的质粒的细胞中加入900μlSOC培养基。 

9)在37℃震荡培养150rpm 1.5h。 

10)将每个转化的培养基100μl涂到LB/AMP/IPTG/X-GAL平板上。 

11)将平板于37℃12-16h培养。 

4.质粒提取 

1)分别挑取G和M质粒转化平板上的单菌落各6-8个并分别加入至6ml LB+AMP液体培养基中，37℃恒温摇床中200rpm培养12～16h；取细菌培养液于1.5ml Ep管中，10000g离心1min，弃上清，并倒立用吸水纸吸尽菌液； 

2)以250μl Buffer P1重悬细菌并转移到离心管中(保证RNase A已加到Buffer P1，重悬沉淀时未见明显细菌凝块，若lyseBlue到Buffer P1，用之前摇匀保证其混匀，细菌应该震荡或用吸管上下吹打混匀)； 

3)加Buffer P2到离心管中，通过上下倒置试管4-6次(通过上下倒置混匀而非震荡，震荡导致DNA的剪切，也可上下倒置直到溶液变粘，较清，但此过程不要超过5min。如果lyseBlue到Buffer P1中，在加Buffer P2后会发现细胞上清会变兰，混匀也为类似的颜色，如果上清中有部分仍为无色或仍可见细菌团块，继续混匀直到可见同样的颜色)； 

4)加350μl Buffer N3并通过倒置试管4-6次混匀(为避免局部沉淀，在加Buffer N3后立即混匀，若大于5ml的菌液则需要颠倒10次，此时溶液为浑浊云雾状。如果lyseBlue到Buffer P1则溶液由蓝色变为无色，无色指示SDS已被有效沉淀)； 

5)离心10min 13000rpm(17900g)可见白色的团块； 

6)取上述上清于QIAprep column中，离心30-60s弃透过液； 

7)加Buffer PE并离心30-60s； 

8)弃透过液并再次离心1min，除去残余洗脱液； 

9)置QIAprep column于干净的1.5ml的Ep管中，为洗脱DNA加50μl去离子水于QIAprep column的中心，静置1min，离心1min，收集洗脱液，冻存于-20℃备用。 

5.重组质粒pMD-G和pMD-M的酶切鉴定 

酶切体系如下： 

	pMD G	pMD M
			Spe I	1μl
Hind III	1μl
			Kpn I		1μl
10×Buffer	2μl	2μl
			质粒	10μl	10μl
去离子水补至	20μl	20μl

37℃水浴2h，1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像。 

6.pFastBacDual载体及pMD-G与pMD-M的酶切连接 

6.1酶切 

1)取两Ep管，按以下酶切体系反应： 

	pFD-G	pMD-G	pFD-M	pMD-M
					10×Buffer	5μl	5μl	5μl	5μl
Spe I	5μl	5μl
					HindIII	5μl	5μl
Kpn I			5μl	5μl
					100×BSA			0.5μl	0.5μl
pFastBacDual	10μl	-	10μl	-
					pGEM-HA质粒	-	10μl	-	10μl
去离子水补至	50μl	50μl	50μl	50μl

2)放上述反应管于37℃水浴箱中2h。 

3)1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像。 

6.2凝胶回收 

1)见上凝胶回收操作步骤 

2)1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像。 

6.3连接 

以T4DNA连接酶连接G片段、M片段和pFastBacDual载体，反应条件如下： 

10×ligation Buffer  2μl 

T4 DNA ligase 2μl 

pMD-G或pMD-M片段10μl 

pFD-G或pMD-M载体6μl 

16℃连接18h。 

6.4转化 

1)65℃10min热灭活连接反应混合物，除去T4DNA连接酶。 

2)将每个转化的培养基100μl涂到LB/AMP平板上。 

3)将平板于37℃12-16h培养，观察白色菌落。 

6.5重组质粒pFD-MG的鉴定 

分别挑取上述6-8个质粒转化平板上的单菌落分别加入至6ml LB+AMP液体培养基中，37℃恒温摇床中200rpm培养12-16h；取细菌培养液于1.5ml Ep管中，提取质粒酶切鉴定，获得重组杆状病毒质粒pFD-G及pFD-M。 

6.6重组质粒pFD-MG的制备及鉴定 

将上述鉴定后的pFD-M质粒按照上述酶切连接过程，与pMD-G酶切产物同时进行酶切、连接，得到重组杆状病毒质粒pFD-MG。 

实施例2利用重组杆状病毒质粒pFD-MG制备重组病毒rV_MG 

1.重组质粒pFDual_MG转化DH10Bac高感受态细胞 

1)将LB平板(含庆大霉素，四环素，卡那霉素，IPTG及X-GAL)及SOC培养基平衡至室温。 

2)将冻存的DH10Bac高感受态细胞从-70℃冰箱中取出，置于冰上至融化，轻轻震荡离心管使之混匀。并取二个1.5mlEp管置于冰上。 

3)向步骤2中每个Ep管中加入50μl高感受态DH10Bac细胞。其中一管加入重组质粒，另一管加入对照pUC19DNA。 

4)轻轻震荡Ep管混匀，冰浴30min。 

5)在精确的42℃水浴中热击60s(不要震动)。 

6)迅速将管移到冰浴中，使细胞冷却2min。 

7)每管转化细胞中加入平衡至室温的950μlSOC培养基。 

8)在37℃震荡培养重组质粒225rpm 4h，对照225rpm 1h。 

9)取适量已转化的感受态菌均匀涂布于将LB平板(含庆大霉素，四环素，卡那霉素，IPTG及X-GAL)上，将平板置于37℃培养箱中至液体被吸收，倒置平板继续培养48h直至出现蓝色及白色菌落。 

2.重组Bacmid的提取 

1)用无菌枪头挑取5个白色的单克隆菌落，至6ml LB三抗(含庆大霉素，四环素，卡那霉素)液体培养基中培养，37℃恒温摇床中250rpm16-18h。 

2)取菌液至灭菌1.5ml Ep管中，10,000g，室温离心1min； 

3)吸净上清，加入0.3ml预冷的Solution I吹打混匀以重悬沉淀； 

4)加入0.3ml现配Solution II，轻轻上下颠倒混匀以裂解菌体，室温放置5min； 

5)缓慢加入0.3ml3M预冷的乙酸钾，轻轻上下颠倒混匀，冰浴5-10min； 

6)14,000g室温离心10min； 

7)吸取上清，加入至含0.8ml异丙醇的Ep管中，轻轻上下颠倒以混匀，冰浴5-10min； 

8)14,000g室温离心15min； 

9)吸弃上清，加入0.5ml 70％乙醇，上下颠倒混匀以清洗沉淀； 

10)14,000g室温离心5min； 

11)11.2.10室温干燥沉淀5-10min，加入30μl灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用； 

3.重组Bacmid的鉴定 

以所提取的重组Bacmid为模板进行PCR，以HA，NA和M1特异性引物扩增基因片段，配制PCR反应体系如下： 

10×Buffer 5μl 

dNTP Mixture(2.5mM)5μl 

上游引物(10μM)2μl 

下游引物(10μM)2μl 

重组Bacmid 3μl 

Taq DNA Polymerase(10μ/μl)0.5μl 

补去离子水至50μl 

G蛋白特异性上游引物：ataac tagta tggtt cctca ggttc ttttg 

G蛋白特异性下游引物：tacaa gcttt aacag tctgat ctcac ctcc 

M蛋白特异性上游引物：atagg tacca tgaac gttct acgca agat 

M蛋白特异性下游引物：tacgg tacct tattc tagaa gcaga gaga 

PCR反应程序如下：95℃5min，(95℃30s，56℃30s，72℃3min)，循环30次，72℃10min，4℃10min，1％琼脂糖凝胶电泳。 

4.阳性克隆的纯化筛选 

用无菌枪头挑取一个白色的单克隆菌落，加6ml LB含三抗液体培养基，37℃恒温摇床中250rpm过夜；次日在涂抹X-gal和IPTG的三抗琼脂平板表面划线，37℃培养箱中倒置培 养48h观察所有菌落均为白色；按上述相同的方法再挑2个白色的单克隆菌落，摇菌培养并划线，经两次单克隆纯化后，提取重组Bacmid经PCR鉴定，用于后续转染过程或-70℃保存。 

5.重组Bacmid转染Sf9细胞制备重组杆状病毒 

1)取10μl鉴定正确的重组Bacmid加入至100μl无血清培养基中并混匀； 

2)取10μl CELLFECTIN Reagent加入至100μl无血清培养基中并上下颠倒5-10次混匀；将上述两种液体轻轻混合，室温放置30min； 

3)以5×10⁵细胞/ml密度接种细胞至6孔板，每孔2ml，28℃贴附1h； 

4)取2ml无血清培养基清洗细胞表面，并吸弃； 

5)每孔加入800μl无血清培养基，再加入含有重组Bacmid和CELLFECTIN Reagent的混合液并轻轻旋转六孔板混匀；另一孔细胞加空Bacmid及CELLFECTIN Reagent所用稀释液作为阴性对照； 

6)28℃培养箱中静置培养4h； 

7)上述两孔分别吸弃上清并加入2ml细胞维持液，28℃培养箱中继续静置培养72h； 

8)显微镜下见实验孔出现较明显的细胞病变后收获上清液至1.5mlEp管中，500g离心10min，取上清至另一Ep管，并小量分装，此即为重组杆状病毒P1代，置于-70℃冰箱避光保存。 

至此，获得重组杆状病毒rV_MG。 

实施例3利用重组杆状病毒rV_MG感染细胞后表达产物制备狂犬病毒病毒样颗粒及狂犬病毒病毒样颗粒的鉴定 

1.狂犬病毒病毒样颗粒的制备 

1)将重组杆状病毒rV_MG以MOI＝5接种4瓶密度达80％左右的Sf9细胞，置于28℃培养箱培养，144h收取上清进行浓缩。 

2)将细胞培养液上清置于50ml离心管中1000g离心10min，取上清于超滤离心管中， 

3)超滤离心管4℃4,000rpm离心1h，上清液浓缩后加无菌PBS至1ml； 

4)分别取1ml不同密度蔗糖由高至低配制蔗糖连续梯度，蔗糖浓度分别为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％和60％； 

4)将浓缩后样品轻轻加入蔗糖连续梯度的最上层，4℃30,000rpm离心6h；分层收集样品1ml/管，取样ELISA检测； 

5)将ELISA检测阳性的样品，置于超滤离心管中，以PBS脱糖，4℃4,000rpm离心1h以置换蔗糖，像重复3次，并将该样品作为电镜和免疫抗原用。 

2.狂犬病毒病毒样颗粒的电镜检测 

1)将样品混匀后取1滴，滴加到铜网上，1min后用滤纸沿铜网边缘吸干； 

2)在样品上滴加1滴磷钨酸染色液(用蒸馏水配成2％的磷钨酸溶液，以1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾调整pH6.8，滤过后置4℃，可长期使用)；90s后用滤纸沿铜网边缘吸干； 

3)将制备好的负染色样品在电子显微镜(TACAN)下观测并照像。 

实施例4  制备的狂犬病毒病毒样颗粒的生物学活性检测 

1.狂犬病毒G蛋白夹心法ELISA检测 

1)取包被抗狂犬病毒G单抗蛋白ELISA检测板条与常温平衡30min； 

2)将标准品与待测样品以样品稀释液梯度稀释，并按100μl/孔加入板条，混匀后37℃放置1h。 

3)倾去板条内液体，以1×PBST充分洗5次； 

4)按100μl/孔加入酶标复合物，37℃30min。 

5)倾去板条内液体，以1×PBST充分洗5次；。 

6)每孔内加入50μl底物A和50μl底物B，37℃反应15min后，加入50μl终止液。 

7)酶标阅读仪读取450nm吸光值，按照非线性回归方法得到样品相对IU值。 

2.动物攻击实验 

采用12-14g雌性BALB/c鼠，以制备的狂犬病毒病毒样颗粒肌肉注射，0.5ml/只，7天后加强免疫，剂量、途径同初免。实验分4组，疫苗对照、阴性对照、共表达的狂犬病毒G蛋白M蛋白的病毒样颗粒和仅表达的狂犬病毒G蛋白。每组20只小鼠。初免后14天以25～30LD50进行攻击。攻击毒种选用CVS标准攻击毒株及一种街毒株进行分别攻击。攻击后逐天记录小鼠发病死亡情况，直至攻击后21天。 

3.小鼠免疫后血清学检测 

1.中和抗体检测 

1)选用疫苗对照、阴性对照、共表达的狂犬病毒G蛋白M蛋白的狂犬病毒病毒样颗粒和仅表达的狂犬病毒G蛋白共对12-14g雌性BALB/c鼠，按照0.5ml/只肌肉注射进行初免，7天后加强免疫，每组6只小鼠； 

2)按照0、1、2、3、4、7周进行小鼠眼眶采血，37℃放置30min后，500g离心15min，取上清置于-20℃保存。 

3)上述血清样本于56℃水浴30min后去除补体，用于RFFIT检测。 

4)将CVS-11毒种按MOI＝0.1的量加入1×10⁶/mL细胞中。37℃孵育1h后，置于培养瓶中。37℃1d后转入34℃继续培养，2d后收集培养上清，离心去掉细胞碎片，分装入小管， -70℃保存，取其中一只融化后在96孔培养板上从1∶3开始做3倍系列稀释(50μL样品加入200μL培养液中/孔)，然后加入BSR细胞(5×10⁶/mL，50μL孔)于孔中，平行做2份，24h弃培养上清，用PBS洗1遍，再用80％冷丙酮室温固定30min，加入抗狂犬病毒核蛋白荧光单抗，37℃孵育30min后，PBS洗3遍，滴加80％甘油，镜检，并计数每孔中的荧光灶数，根据巴斯德所计算方法得出中和用CVS毒株滴度。 

5)将待检血清用含7％灭活小牛血清的DMEM 3倍系列稀释于96孔培养板中(100μL/孔)，与50μL CVS-11病毒37℃中和1h后加入50μL BSR细胞(DMEM内含7％灭活小牛血清及抗生素)，24h后固定(80％冷丙酮4℃或室温固定30min，或-20℃固定7min)，确定低于和高于50％病变的孔，根据Reed&Muench公式，计算各血清样品及对照参考品的ED50从而得出待检样品的中和抗体效价。 

2.CD4，CD8分子检测 

1)小鼠加强免疫7天后，摘眼眶取血。以PBS稀释的20U肝素钠作为抗凝剂。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积PBS稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液。2000r/min离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入PBS 3ml，混匀后，1500r/min离心5min。弃去上清，重复3次，细胞加入0.5ml DMEM培养基含10％小牛血清，50g/ml青霉素和50g/ml链霉素重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度备用。 

2)取5×10⁵分离的外周血单个核细胞加入适量抗小鼠CY3-FITC，CD4-PE，CD3-PE-CY5，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液1mL裂解残余红细胞，2mlPBS洗涤细胞3次，多聚甲醛固定。流式细胞仪(FACSCalibur，BectonDickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角FSC和侧向角SSC散射光散点图设门区分淋巴细胞。 

3.IL-4，IFN-γ检测 

分离外周血单个核细胞，加入100ng/mL PMA和1μg/mL离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，均加入CD3-PE-CY5，CD-FITC，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1mL，混匀，室温放置10min，1000×g离心min，弃上清。加入固定/破膜液200μl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入PBS 1ml，1500r/min离心5min，弃上清，重复3次。两管分别加入IFN-γ-PE、IL-4-PE各5μl，4℃避光孵育30min。加入PBS液洗涤2次。最后以300μl多聚甲醛重悬细胞。采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角FSC和侧向角SSC散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞(CD3⁺CD8^-)。 

Claims (7)

1.一种狂犬病毒病毒样颗粒，包括但不限于狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基质蛋白M。

2.根据权利要求1所述的犬病毒病毒样颗粒，其特征在于还有脂质双层膜。

3.根据权利要求1或2所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基质蛋白M来源于重组蛋白或利用狂犬病毒培养液所裂解、分离、纯化方法得到。

4.根据权利要求3所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的重组蛋白是利用原核表达系统或真核的表达系统表达的重组蛋白。

5.根据权利要求1所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基质蛋白M的核酸或蛋白序列来源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能实现形成颗粒组装及狂犬病毒保护能力的其他狂犬病毒毒株。

6.一种药用组合物，包由权利要求1所述狂犬病毒病毒样颗粒和辅助配方组成，所述的辅助配方是可以是保护剂、稳定剂或佐剂。

7.一种狂犬病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆，构建重组杆状质粒pFD_MG；

步骤二：利用重组杆状质粒pFD-MG构建重组杆状病毒rV_MG；

步骤三：利用重组杆状病毒rV_MG制备狂犬病毒病毒样颗粒。

Images