CN116656730A - 一种表达狂犬病病毒g、m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法 - Google Patents

一种表达狂犬病病毒g、m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法，相较于传统的同源重组方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3‑5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，大大减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程，缩短了获得重组病毒的时间，提高了效率。通过本发明方法构建的重组金丝雀痘病毒，相较于原始病毒基因组替换了串联表达的基因，可以同时表达狂犬病病毒G和M蛋白，并在感染细胞时形成病毒样颗粒，因此可为狂犬病免疫预防提供候选疫苗株，应用于疫苗免疫时可以发挥其免疫效应，拓展了CRISPR/Cas9技术的应用范围，为狂犬病病毒疫苗开发提供了新的方向。

Description

一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建 方法
技术领域
本发明涉及病毒学、分子生物学、基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法。
背景技术
狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，是引起狂犬病的病原体。狂犬病病毒的结构是由N、P(磷蛋白)、M(基质蛋白)、G、L五种蛋白组成。狂犬病病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原(G蛋白)，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原(N蛋白)，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患的传染病，对人和动物的危害很大，一但被狂犬病病犬咬伤，应尽快注射疫苗，出现狂犬病症状后死亡率近乎100％。鉴于本病尚无有效治疗手段，而疫苗免疫能够达到完全保护，故应加强预防接种以控制疾病的发生。
金丝雀痘病毒(Canarypox virus,CNPV)是痘病毒科(Poxviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae,ChPV)、禽痘病毒属(Avipoxvirus,APV)的重要成员之一，其所在的禽痘病毒属是唯一仅感染非哺乳动物宿主的病毒属。禽痘病毒属能在哺乳动物细胞中引发一过性感染，可以高效表达外源基因编码的抗原，进而安全的产生细胞、体液免疫应答，使用ALVAC作为载体可以很好的利用该优点。金丝雀痘病毒有很高的种属特异性与安全性。它严格来说只能在禽类中组装，而不在哺乳动物细胞中复制。用金丝雀痘病毒作为载体生产的重组疫苗，不会产生病毒载体的扩散，包括对非接种物和环境的影响。金丝雀痘病毒作为载体，在制备疫苗方面是十分有效的，通过与禽痘病毒作为载体相比，在诱导保护性免疫方面，金丝雀痘病毒比其高100倍。
目前传统的重组痘病毒构建方法同源重组效率低，子代病毒中重组病毒所占比率不足0.1％，不易筛选获得重组病毒。基因编辑工具CRISPR具有非常精准、廉价、易于使用、高效且精准的特点，可以增加病毒在复制过程中与同源片段的重组效率，进而快速构建重组病毒。
依托于Cas9工具酶的CRISPR系统自发明以来，主要应用于对细胞基因组DNA链的编辑，将其应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒目前鲜有报道。本申请人此前研究一种基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法(公布号CN 111500633 B)，创造性地将CRISPR系统应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒基因组的编辑，成功地构建了能够同时表达出犬瘟热病毒CDV M、F、H三种蛋白并能够包装形成犬瘟热病毒病毒样颗粒CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。且基于本实验室研究结果显示，狂犬病病毒的G和M蛋白可重组为狂犬病病毒病毒样颗粒，且具有良好的免疫原性。
鉴于目前还没有关于高效同时表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒，需要针对狂犬病病毒开发出一种新的构建方法以及新的重组金丝雀痘病毒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供了一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法。其中，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗FerretDistemper，所述重组金丝雀痘病毒为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白插入所述金丝雀痘病毒的基因组C6编码区而得。
进一步地，上述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，包括如下步骤：
S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因、下游同源臂C6R构成；上游同源臂C6L的序列如SEQ ID No.1所示，分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示，下游同源臂C6R的序列如SEQ IDNo.3所示；
S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白的重组金丝雀痘病毒。
进一步地，上述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，步骤S1的具体过程如下：
细胞铺至六孔板，利用CRISPR MAXTM Cas9转染质粒Cas9-C6gRNA，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染含有同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；
其中，质粒Cas9-C6gRNA的获得过程如下：
其中，质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2的获得过程如下：
1.1、确定小向导RNAC6gRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：5’-CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC-3’
C6-sgRNA-1-R：5’-CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC-3’
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-1-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA-1的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNAC6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、C6gRNA-1oligo二聚体的形成：
将C6gRNA-1-F、C6gRNA-1-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.4、转化：将步骤1.3得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1；
1.5、C6gRNA-2oligo二聚体的形成
将C6gRNA-2-F、C6gRNA-2-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.6、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.5中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.7、转化：将步骤1.6得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-2。
进一步地，上述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，构建所述包含同源重组模板的转移修复载体的过程为：
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光标记蛋白、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6L+R；
2.2、将合成的基因片段C6L+R用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中得到pGH-C6L+R载体质粒上消化下来并回收；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；
2.4、将步骤2.2中回收的C6L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6，-20℃下保存待用；
2.6、PCR扩增得到含狂犬病病毒G、M蛋白的基因片段；用NotⅠ单酶切步骤2.5构建的质粒pCA-C6通过无缝克隆连接含狂犬病病毒G蛋白的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒；
2.7、用MssⅠ与CpoⅠ双酶切步骤2.6的质粒，通过无缝克隆连接含狂犬病病毒M蛋白的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。
进一步地，上述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，步骤S2的具体过程为：
S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；
S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；
S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；
S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；
S2.5、48-72h观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；
S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，即可以同时表达狂犬病病毒G蛋白和M蛋白的重组金丝雀痘病毒。
进一步地，上述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，所述荧光标记蛋白的基因序列选自红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP或黄色荧光蛋白YFP。
本发明的另一目的是提供一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒，其通过上述任一项所述的构建方法获得。
现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明提供的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，依托于Cas9工具酶的CRISPR系统，将其应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒基因组的编辑，并成功构建出高效串联表达狂犬病病毒G和M蛋白的重组金丝雀痘病毒，该方法相较于传统的同源重组方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3-5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，大大减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程，缩短了获得重组病毒的时间，提高了效率。
通过本发明方法构建的重组金丝雀痘病毒，相较于原始病毒基因组替换了串联表达的基因，可以同时表达狂犬病病毒G和M蛋白，并在感染细胞时形成病毒样颗粒，因此可为狂犬病免疫预防提供候选疫苗株，应用于疫苗免疫时可以发挥其免疫效应。综上，本发明不仅拓展了CRISPR/Cas9技术的应用范围，同时也为狂犬病病毒疫苗药物开发提供了新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒绿色荧光蛋白表达结果(黑色为背景颜色，颜色较浅的区域为绿色荧光区域)。图中，(a)为构建重组金丝雀痘病毒时获得的子代病毒进行第一轮噬斑纯化时筛选到的荧光斑，(b)为纯化后的重组金丝雀痘病毒在CEF细胞上扩增得到的荧光图。
图2为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒表达的RV G蛋白Western Blot鉴定结果。
图3为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒感染表达病毒样颗粒电镜观察结果。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验材料：DF-1细胞为鸡胚成纤维细胞系(ATCC ID：CRL-12203)；CEF细胞为分离自9-11日龄SPF鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞；转移修复载体骨架质粒pCAGGS；T4DNAPolymerase购自NEB(M0203L)；DH5α感受态细胞(Code:No 9057)、核酸分子量MarkerDL10000/DL5000/DL2000(Code:No 3584A/3428A/3427A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；禽Cas9/gRNA构建试剂盒购自北京唯尚立德生物科技公司(VK001-08)；质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(CW2106)；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA(D2500-01)；ClonExpress II One Step Cloning Kit、2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)购自诺唯赞公司，超保真DNA聚合酶购自NEB公司；LipofectamineTMCRISPRMAXTMCas9转染试剂、限制性内切酶CpoI(RsrII)、限制性内切酶MssI、限制性内切酶NotI、双抗(青霉素-链霉素)、DMEM粉末购自Thermo Scientific公司，病毒DNA提取试剂盒购自天根公司，/>West Dura持久性化学发光底物购自Thermo Scientific公司，Anti-RV G antibody购自Millipore、Goat Anti-Rabbit(HRP)购自Bioworld公司。低熔点琼脂糖购自LONZA(50100)；DMEM培养液购自Corning(10-013-CVR)；胎牛血清(FBS)购自BI(04-001-1A)。本发明所使用的的金丝雀痘病毒(ALVAC)分离自商品化疫苗/>Ferret Distemper。同源重组模板以pCAGGS为载体，由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白EGFP基因、下游同源臂C6R构成，构成的转移修复载体命名为pCA-C6-EGFP。
上游同源臂C6L序列如SEQ ID NO.1所示，长度为482bp，位于C6编码区上游。
分别带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白EGFP基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中昆虫痘病毒42K启动子的长度为32bp，荧光标记蛋白EGFP长度为720bp(序列为
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTG
GTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGC
GAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC
TGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCC
TGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCA
GCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGC
ACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTG
AAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATC
GACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAAC
TACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC
ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTG
CAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCC
GTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA
AAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA)，其余的是启动子，酶切位点以及FRT序列。
下游同源臂C6R序列如SEQ ID NO.3所示，长度为500bp，位于C6编码区下游。
实验步骤如下：
1、Cas9-C6gRNA共表达质粒的构建及改造。
1.1、小向导RNAC6-sgRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC(SEQ ID NO.4)
C6-sgRNA-1-R：CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC(SEQ ID NO.5)
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒(ALVAC)基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下可将ALVAC基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNA C6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’(SEQ ID NO.6)
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
(SEQ ID NO.7)
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、oligo二聚体的形成：
将C6-sgRNA-F 1μL、C6-sgRNA-R 1μL、Solution1 5μL、ddH2O 3μL加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体。
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、家禽Cas9/gRNA构建试剂盒中提供的线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温(25℃)静置5min。
1.4、转化：
取5μL步骤1.3中得到的最终产物加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，直接涂于氨苄抗性的平板，平板放置于37℃温箱培养12h左右，观察菌落生长情况；然后挑取5-10个单菌落，接种至4mL无菌氨苄抗性LB培养液中，37℃摇床摇菌12h左右，按康为世纪质粒小提试剂盒说明书提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，送至测序公司进行测序鉴定，鉴定引物为sqprimer：TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG。鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1。构建好的Cas9-C6gRNA-1载体质粒能够同时通过pCAG启动表达Cas9蛋白及家禽的U6启动子表达gRNA，实现CRISPR技术进行目标基因的敲除和编辑。
同理提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-2。
2、转移修复载体的构建
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光蛋白基因EGFP、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6。
2.2、将合成的基因片段C6用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中的pGH-C6载体质粒上消化下来并回收：
酶切体系包括pGH-C6载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIⅡ5μL、10×buffer 5μL、ddH2O补足至50μL；置于37℃，酶切1h，琼脂糖凝胶电泳回收C6片段；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；酶切体系为pCAGGS载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIⅡ5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至50μL；
2.4、将步骤2.2中回收的C6片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；连接反应体系为线性化pCAGGS载体2μL、C6片段6μL、T4连接酶1μL、T4连接酶buffer 1μL；连接条件为25℃下反应2h；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP，-20℃下保存待用；
2.6、合成包含RV病毒G和M蛋白基因的质粒，引物序列如下所示：RV-G(NotI)-F(SEQ ID NO.6)：
5’-AAACAGCTGGGGCCCGCGGCCGCGCCACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCT GT-3’
RV-G(NotI)-R(SEQ ID NO.7)：
5’-CCCGATCCATAAAAATCAGCGGCCGCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCACT-3’
RV-M(MssI)-F(SEQ ID NO.8)：
5’-AATATAAACCGCGGGTTTAAACGCCACCATGAACTTTCTACGTAA GATAGT-3’
RV-M(CpoI)-R(SEQ ID NO.9)：
5’-AAACCCGGGATAAAAATTACGGTCCGTTATTCTAGAAGCAGAGAGGAAT-3’
2.7、PCR反应体系包括5×Phusion HF缓冲液10μL、10mM dNTPs 1μL、RV-G(NotI)-F 2.5μL、RV-G(NotI)-R 2.5μL、Phusion DNA聚合酶0.5μL、RV质粒2.5μL、ddH2O补至50μL。PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性5s，退火55℃10s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物由1％的琼脂糖凝胶电泳观察是否正确后胶回收。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收RV-G片段。如图2所示，重组病毒G蛋白Western Blot鉴定结果。
2.8、用NotI酶切消化步骤2.5构建的质粒pCA-C6-EGFP。pCA-C6-EGFP的酶切体系包括pCA-C6-EGFP 5μg、NotI 10μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-EGFP线性化质粒。
2.9、利用无缝克隆将RV-G片段连接至线性化质粒pCA-C6-EGFP。连接体系包括5×CEⅡbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP-RV-G。
2.10用MssⅠ/CpoⅠ双酶切消化步骤2.9构建的质粒pCA-C6-EGFP-RV-G。酶切体系包括pCA-C6-EGFP-RV-G 5μg、MssⅠ5μL、CpoⅠ5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-EGFP-RV-G线性化质粒。
2.11利用无缝克隆将片段RV-M连接至线性化质粒pCA-C6-EGFP-RV-G，连接体系包括5×CEⅡbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP-RV-GM。
3、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用细胞内同源重组的基因修复机制，向细胞中提供步骤2.11得到的质粒pCA-C6-EGFP-RV-GM，将金丝雀痘病毒C6编码区替换为RV的G和M基因。
具体过程为：DF-1细胞铺至6孔板，24h后利用Thermo LipofectamineTM CRISPRMAXTM Cas9转染Cas9-C6gRNA，37℃培养24h后接种ALVAC，37℃吸附1h，补加细胞维持液(5％FBS DMEM)1mL，37℃继续培养2h后，继续转染pCA-C6-EGFP-RV-GM，6h后弃去转染液，补加2mL细胞维持液，37℃继续培养72h，-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒。
4、利用噬斑纯化技术，将步骤3收获的重组金丝雀痘病毒接种至CEF细胞，将表达绿色荧光蛋白的噬斑接种CEF细胞，继续进行5轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-RV-GM，即获得可以同时表达RV的G和M蛋白的重组金丝雀痘病毒。重组病毒绿色荧光蛋白表达结果如图1所示，其中，(a)为构建重组病毒时获得的子代病毒进行第一轮噬斑纯化时筛选到的荧光斑，(b)为纯化后的重组病毒在CEF细胞上扩增得到的荧光图。
噬斑纯化的具体步骤如下：
4.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层。
4.2、将步骤3中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
4.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤4.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％双抗(青霉素-链霉素)、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用。
4.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL 半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板置于37℃5％CO2细胞培养箱培养。
4.5、48-72h内观察噬斑及绿色荧光蛋白表达情况，吸取表达绿色荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次。
4.6、将步骤4.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤4.2-4.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，命名为ALVAC-EGFP-RV-GM，即获得可以同时表达RV的G和M两种蛋白的重组金丝雀痘病毒。
重组病毒感染细胞后可形成病毒样颗粒，其电镜观察结果如图3所示。因此该重组病毒应用于疫苗免疫时可以发挥其免疫效应，可为狂犬病免疫预防提供候选疫苗株，为狂犬病病毒疫苗药物开发提供了新的方向。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (7)

1.一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗
Ferret Distemper，所述重组金丝雀痘病毒为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白插入所述金丝雀痘病毒的基因组C6编码区而得。
2.根据权利要求1所述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白基因、下游同源臂C6R构成；上游同源臂C6L的序列如SEQ ID No.1所示，分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示，下游同源臂C6R的序列如SEQ ID No.3所示；
S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达狂犬病病毒G、M蛋白和荧光标记蛋白的重组金丝雀痘病毒。
3.根据权利要求2所述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，步骤S1的具体过程如下：
细胞铺至六孔板，利用CRISPR MAXTM Cas9转染质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染含有同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；
其中，质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2的获得过程如下：
1.1、确定小向导RNAC6gRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：5’-CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC-3’
C6-sgRNA-1-R：5’-CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC-3’
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-1-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA-1的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNA C6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、C6gRNA-1oligo二聚体的形成：
将C6gRNA-1-F、C6gRNA-1-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.4、转化：将步骤1.3得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1；
1.5、C6gRNA-2oligo二聚体的形成
将C6gRNA-2-F、C6gRNA-2-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.6、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.5中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.7、转化：将步骤1.6得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-2。
4.根据权利要求2所述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，构建所述包含同源重组模板的转移修复载体的过程为：
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光标记蛋白、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6L+R；
2.2、将合成的基因片段C6L+R用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中得到pGH-C6L+R载体质粒上消化下来并回收；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；
2.4、将步骤2.2中回收的C6L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6，-20℃下保存待用；
2.6、PCR扩增得到含狂犬病病毒G、M蛋白的基因片段；用NotⅠ单酶切步骤2.5构建的质粒pCA-C6通过无缝克隆连接含狂犬病病毒G蛋白的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒；
2.7、用MssⅠ与CpoⅠ双酶切步骤2.6的质粒，通过无缝克隆连接含狂犬病病毒M蛋白的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。
5.根据权利要求2所述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，步骤S2的具体过程为：
S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；
S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；
S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化后42℃保温的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；
S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；
S2.5、48-72h内观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；
S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，即可以同时表达狂犬病病毒G蛋白和M蛋白的重组金丝雀痘病毒。
6.根据权利要求1所述的表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述荧光标记蛋白的基因序列选自红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP或黄色荧光蛋白YFP。
7.一种表达狂犬病病毒G、M蛋白的重组金丝雀痘病毒，其特征在于，通过权利要求1-6任一项所述的构建方法获得。
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