CN111257559B - 一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法 - Google Patents

一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法，属于微生物定性定量分析技术领域。本发明采用蛋白A和抗体B与待测微生物特异性结合形成复合物，蛋白A连接有磁珠，通过磁架分离复合物；向复合物中加入HRP标记的二抗，可以实现待测微生物的可视化检测；对于可视化检测阳性的样品进行RT‑PCR扩增进行定量分析。本发明试剂盒具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。当本发明用于微生物检测时，免去了样品前处理及靶标提纯，同时实现RT‑PCR扩增，有利于实现对微生物的定性和定量分析。

Description

一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法
技术领域
本发明属于微生物定性定量分析技术领域，具体涉及一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法。
背景技术
目前用于微生物检测的方法，主要有传统的基于微生物培养的生化检验技术、分子生物学技术和免疫学检测方法等。
传统的微生物培养检验技术要经过培养、分离纯化、生化鉴定等步骤，存在操作繁琐耗时(3-7天)、检测灵敏度低、分析目标受限和容易出现假阳性结果等缺点，在应对突发性公共安全事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。
随着分子生物学的快速发展，对微生物的检测鉴定已不再局限于对其外部形态及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，由此衍生出了很多的分子检测技术，如DNA探针技术、聚合酶链式反应技术(PCR)、基因芯片技术等。尽管这些技术被广泛的用于微生物的检测，但无法达到直接检测微生物的目的，而且需要昂贵的高精密仪器支持与细胞裂解、DNA提取、扩增纯化等繁琐的样品处理过程，且无法区分微生物的生存形态。
免疫学检测方法的基本原理是抗原抗体的免疫反应，不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体，因此免疫学检测技术能够直接用于检测致病微生物。然而，抗体的生产成本高，易失活并容易发生交叉污染，严重限制了免疫学检测方法在实际中的应用。无论是食品工业生产流程的检测和质控，还是政府部门对食品安全的监管，都迫切需要更加快速、灵敏、简单的食源性致病微生物检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种微生物的快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法，以解决现有检测微生物技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种微生物快速定性定量的试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；
所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；
所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；
所述蛋白A和抗体B可与待检测微生物特异性结合形成三元复合体。
在上述方案的基础上，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白A，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。
在上述方案的基础上，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。
在上述方案的基础上，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。
在上述方案的基础上，所述微生物快速定性定量的试剂盒的使用方法为：
(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待检微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；
(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；
(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析。
一种微生物快速定性定量的方法，步骤如下：
(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；
(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；
(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析。
在上述方案的基础上，
所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；
所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体。
在上述方案的基础上，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白A，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。
在上述方案的基础上，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。
在上述方案的基础上，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。
本发明技术方案的优点
本发明试剂盒具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。
特别的，当本发明用于微生物检测时，免去了样品前处理及靶标提纯，但同时实现RT-PCR扩增，有利于实现对微生物的定性和定量分析。
附图说明
图1可视化快速检测微生物示意图；
图2快速磁珠分离联合PCR检测微生物示意图；
图3检测操作步骤示意图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
RT-PCR即逆转录PCR的扩增技术，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
本发明试剂盒中的洗脱液可以为磷酸缓冲盐液等常用洗脱溶液；HRP-二抗为能够特异性识别抗体B的HRP标记的抗体；本发明试剂盒中的RNA提取试剂为本领域常用RNA提取试剂；扩增缓冲液为普通PCR扩增缓冲液。本发明的试剂盒在进行定量分析时，可采用qPCR的方式对待测微生物进行准确定量，扩增引物包含荧光定量PCR的正向和反向引物以及探针引物。
本发明试剂盒的检测原理
本发明利用两种蛋白质识别靶标微生物，一种是微生物的受体蛋白A、一种是微生物的抗体B，均可作用于微生物。受体蛋白A与磁珠偶联可用于纯化分离微生物，抗体B识别元件结合微生物，并且作为HRP-二抗的结合位点引入HRP，可将信号进行转化和放大。本发明利用两种方法来检测微生物，一种是利用引入的HRP催化底物实现可视化检测，另一种是对蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，实现对微生物的定性和定量分析。
下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。
参照图1，蛋白A包裹在磁珠表面，形成蛋白A-磁珠；蛋白A和抗体B都特异性作用于待测微生物；向待测微生物溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育5min，蛋白A和抗体B特异性结合在待测微生物上；放置于磁力架上静置1min，用缓冲液洗脱三次，得到蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；向蛋白A-磁珠/微生物/抗体B中加入HRP-二抗，HRP-二抗特异性识别结合抗体B，从而在复合物上引入了HRP，从而引起底物的颜色变化，实现可视化检测。
参照图2，蛋白A包裹在磁珠表面，形成蛋白A-磁珠；蛋白A和抗体B都特异性作用于待测微生物；向待测微生物溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育5min，蛋白A和抗体B特异性结合在待测微生物上；放置于磁力架上静置1min，用缓冲液洗脱三次，得到蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；对目标微生物的RNA，进行RT-PCR扩增，实现对微生物的定性和定量分析。
实施例1
一种冠状病毒的快速定性定量试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；
所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为ACE2蛋白；所述抗体B为S蛋白抗体；
所述的扩增引物为：
定量引物信息：
F：5’-CACATTGGCACCCGCAATC-3’用量600nM
R：5’-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3’用量800nM
探针引物：
P：5’-FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BBQ-3’用量200nM
扩增条件：55℃for 10min逆转录,PCR热循环条件：95℃for 3min，45个循环[95℃for 15s,58℃for 30s.]
所述的蛋白ACE2磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白ACE2，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白ACE2，活化10min；将活化后的蛋白ACE2加入到牛血清白蛋白修饰的四氧化三铁磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白ACE2包裹磁珠。
使用上述试剂盒对冠状病毒快速定性定量的方法，步骤如下：
1)向含有冠状病毒溶液中加入浓度为1mg/mL的ACE2-磁珠1mL和1μg/mL的S蛋白抗体0.5mL，37℃混合孵育5min。
2)磁分离纯化：将1)中的混合液放置于磁力架上，静置1min，将混合液中的ACE2-磁珠/冠状病毒/S蛋白抗体的复合物通过磁珠吸附方式分离出来；
3)可视化检测：向步骤2)分离出的磁珠中加入1μg/mL的HRP修饰的二抗0.5mL，孵育后进行磁分离，洗脱得到蛋白ACE2-磁珠/冠状病毒/S蛋白抗体/HRP-二抗的复合物；最后加入TMB和双氧水各200μL；HRP催化底物，发生颜色变化，从而达到可视化的检测目的。
4)核酸检测：用去离子水重悬上述步骤2)分离出的磁珠，其后提取冠状病毒的RNA，反转录后，加入上下游引物进行RT-PCR扩增，得到的单链核酸的量(核酸具体定量通过qPCR的Ct值来定)，确定待检测微生物的浓度。
5)先通过可视化检测方法初步判断样品中是否含有待测微生物，即如果有待测微生物，HRP可以催化底物发生颜色反应；如果无待测微生物，则不发生颜色反应。当发生颜色反应时，再使用RT-PCR进行待测微生物的核酸检测；若不发生颜色反应，不需要进行第二步的核酸检测步骤。
本发明上述方法的检测灵敏度和检出限为1cfu/mL，在加标反应中回收率为92.3％～110.9％，稳定性好。
实施例2
一种沙门氏菌的快速定性定量试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；
所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为Flic蛋白；所述抗体B为O-抗原抗体；
所述扩增引物为：
定量引物信息：
F：GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA用量600nM
R：CGTTCGGGCAATTCGTTA用量500nM
探针引物：
P：5′-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-MGB-3’用量200nM
扩增条件：55℃for 10min逆转录,PCR热循环条件：95℃for 3min，45个循环[95℃for 15s,58℃for 30s.]
所述的蛋白Flic磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白Flic，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白Flic，活化10min；将活化后的蛋白Flic加入到牛血清白蛋白修饰的四氧化三铁磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白Flic包裹磁珠。
使用上述试剂盒对沙门氏菌快速定性定量的方法，步骤如下：
1)向含有沙门氏菌溶液中加入浓度为1mg/mL的Flic蛋白-磁珠1mL和1μg/mL的O-抗原抗体0.5mL，37℃混合孵育5min。
2)磁分离纯化：将1)中的混合液放置于磁力架上，静置1min，将混合液中的Flic-磁珠/冠状病毒/O-抗原抗体的复合物通过磁珠吸附方式分离出来；
3)可视化检测：向步骤2)分离出的磁珠中加入1μg/mL的HRP修饰的二抗0.5mL，孵育后进行磁分离，洗脱得到Flic-磁珠/冠状病毒/O-抗原抗体/HRP-二抗的复合物；最后加入TMB和双氧水各200μL；HRP催化底物，发生颜色变化，从而达到可视化的检测目的。
4)核酸检测：用去离子水重悬上述步骤2)分离出的磁珠，其后提取冠状病毒的RNA，反转录后，加入上下游引物进行RT-PCR扩增，得到的单链核酸的量(核酸具体定量通过qPCR的Ct值来定)，确定待检测微生物的浓度。
5)先通过可视化检测方法初步判断样品中是否含有沙门氏菌，即如果有沙门氏菌，HRP可以催化底物发生颜色反应；如果无沙门氏菌，则不发生颜色反应。当发生颜色反应时，再使用RT-PCR进行待测微生物的核酸检测；若不发生颜色反应，不需要进行第二步的核酸检测步骤。
本发明上述方法的检测灵敏度和检出限为2.6cfu/mL，在加标反应中回收率为90.7％～121.3％％，稳定性好。
实施例3
一种乙肝病毒的快速定性定量试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；
所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为HBsAg蛋白；所述抗体B为T1蛋白抗体；
所述扩增引物为：
定量引物信息：
F：5′-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATT-3′；用量400nM
R：5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3’；用量400nM
探针引物：P：5′-FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB-3’用量300nM。
扩增条件：55℃for 10min逆转录,PCR热循环条件：95℃for 3min，45个循环[95℃for 15s,58℃for 30s.]
所述的蛋白HBsAg磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白HBsAg，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白HBsAg，活化10min；将活化后的蛋白HBsAg加入到牛血清白蛋白修饰的四氧化三铁磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白HBsAg包裹磁珠。
使用上述试剂盒对乙肝病毒快速定性定量的方法，步骤如下：
1)向含有乙肝病毒溶液中加入浓度为1mg/mL的HBsAg蛋白-磁珠1mL和1μg/mL的T1蛋白抗体0.5mL，37℃混合孵育5min。
2)磁分离纯化：将1)中的混合液放置于磁力架上，静置1min，将混合液中的HBsAg-磁珠/冠状病毒/T1蛋白抗体的复合物通过磁珠吸附方式分离出来；
3)可视化检测：向步骤2)分离出的磁珠中加入1μg/mL的HRP修饰的二抗0.5mL，孵育后进行磁分离，洗脱得到蛋白HBsAg-磁珠/冠状病毒/T1蛋白抗体/HRP-二抗的复合物；最后加入TMB和双氧水各200μL；HRP催化底物，发生颜色变化，从而达到可视化的检测目的。
4)核酸检测：用去离子水重悬上述步骤2)分离出的磁珠，其后提取冠状病毒的RNA，反转录后，加入上下游引物进行RT-PCR扩增，得到的单链核酸的量(核酸具体定量通过qPCR的Ct值来定)，确定待检测微生物的浓度。
5)先通过可视化检测方法初步判断样品中是否含有乙肝病毒，即如果有乙肝病毒，HRP可以催化底物发生颜色反应；如果无乙肝病毒，则不发生颜色反应。当发生颜色反应时，再使用RT-PCR进行乙肝病毒的核酸检测；若不发生颜色反应，不需要进行第二步的核酸检测步骤。
本发明上述方法的检测灵敏度和检出限为4.2cfu/mL，在加标反应中回收率为91.1％～108.9％，稳定性好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，包含定量反应体系和定性反应体系；所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；
所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；
所述蛋白A和抗体B与待检测微生物特异性结合形成三元复合体；
使用方法为：
(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；
(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；
(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析。
2.根据权利要求1所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白A，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。
3.权利要求2所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。
4.根据权利要求1～3任一项所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。
5.一种微生物快速定性定量的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；
(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；
(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析；
所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；
所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体。
6.根据权利要求5所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白A，169.31mg EDC和47.98mg NHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。
7.权利要求6所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。
8.根据权利要求5～7任一项所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。
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