CN116064947A - 基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，包括适用于猪捷申病毒检测的CRISPR/Cas12a检测体系，CRISPR/Cas12a检测体系包括针对猪捷申病毒的5’‑UTR保守基因的特异性gRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统，特异性gRNA为针对猪捷申病毒的13个血清型的gRNA 1‑3中的任意一种或多种，ssDNA报告系统包括用于荧光定量检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫层析试纸条检测的ssDNA FB reporter。本发明的猪捷申病毒检测方法检测下限为3.26 copy/μL，与除猪捷申病毒之外的其他病毒没有交叉反应。本发明采用CRISPR/Cas12a检测猪捷申病毒序列，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。另外，也公开了猪捷申病毒的检测方法。

Description

基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪捷申病毒(porcine tescho virus，也叫PTV)属于小RNA病毒科的捷申病毒属，会引起一种接触性的接触性病毒性传染病，即猪捷申病(Teschen disease)。该病毒会导致猪出现脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、腹泻、心包炎、心肌炎、皮肤损伤和肺炎等症状。猪捷申病分布的地理区域比较广泛，对猪捷申病毒的流行病学调查研究说明猪捷申病毒在我国分布广泛，但分布具有地域差异性，各个地区流行的血清型不同。虽然猪捷申病毒未对我国养猪业造成严重影响，相关研究学者以及研究报道较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，一旦猪捷申病毒出现爆发性流行，将对我国养猪业造成严重损失。而目前世界各地都有报道猪捷申病，猪捷申病已经成为世界范围的猪传染病之一，影响世界养猪业的正常生产，对猪捷申病的调查、诊断、预防和疫苗研发等相关研究值得广大研究者关注。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。根据这一特性。目前研究人员已经开发出CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas13等多种核酸检测系统。CRISPR-Cas12a的核酸检测系统是从待检临床样品中提取基因组DNA ，并在等温条件下进行环介导等温核酸扩增(LAMP)，CRISPR/Cas12a-gRNA复合物结合并切割靶标DNA，其激活ssDNA的反式切割，与ssDNA偶联的荧光报告系统在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，将为快速准确检测猪捷申病毒核酸提供了强有力的平台。
而免疫层析试纸条检测是临床快速检测的一种高效技术方案。在临床检测时反应时间短、可以长期稳定保存以及相对低成本，这些特性使其广泛适用临床上针对猪捷申病毒核酸的高特异性，高灵敏度，方便快捷的检测。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒及其检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，包括适用于猪捷申病毒检测的CRISPR/Cas12a检测体系。
优选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括针对猪捷申病毒的5’-UTR保守基因的特异性gRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统。
进一步的，所述特异性gRNA为针对猪捷申病毒的13个血清型的gRNA 1-3中的任意一种或多种，其序列为SEQ ID NO .1至SEQ ID NO .3。
进一步的，所述ssDNA报告系统包括用于荧光定量检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫层析试纸条检测的ssDNA FB reporter。
进一步的，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’，命名为ssDNA FQ reporter/5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’；ssDNA FQ reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .4；
所述ssDNA FB reporter为利用荧光素和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’，命名为ssDNA FB reporter/5’-FAM- TTATTATT-Biotin-3’；ssDNA FB reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .5。
进一步的，所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条检测是ssDNA的5’端与 3’端分别修饰 FAM基团与Biotin基团，且免疫层析试纸条中具有用金纳米颗粒标记的抗荧光素抗体，所述抗荧光素抗体可以与报告系统ssDNA FB reporter的荧光素修饰末端结合，所述免疫层析试纸条的质控线（C线）中具有链霉亲和素，所述链霉亲和素可以和生物素基团结合。
进一步的，所述特异性gRNA的制备方法包括：针对猪捷申病毒5’-UTR保守基因，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列TTTN的靶向序列，设计gRNA，设计完成后，由生物公司进行目的gRNA的合成。
进一步的，所述CRISPR/Cas12a蛋白由NEB公司（纽英伦生物技术(北京)有限公司）生产。
本发明提供的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒既可利用荧光定量检测也可以利用免疫层析试纸条检测。当使用荧光定量检测时，CRISPR/Cas12a检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FQ reporter，当使用免疫层析试纸条检测时，DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FB reporter。
在使用荧光定量检测时，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在猪捷申病毒基因时，会由在猪捷申病毒特异性gRNA介导下特异性激活CRISPR/Cas12a蛋白的核酸切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用荧光定量可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中不存在猪捷申病毒基因序列时，荧光读数显示为基底值。
在使用免疫层析试纸条检测时，将CRISPR/Cas12a切割后待检测样品加入到免疫层析试纸后，被胶体金标的抗荧光素抗体与荧光素标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告系统，从而显示条带；当CRISPR/Cas12a检测到猪捷申病毒的基因时，会将标记有荧光素和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而会有荧光素标记的ssDNA片段被检测线捕获后显色，当CRISPR/Cas12a检测不到猪捷申病毒的基因序列时，不能将标记有荧光素和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而不会产生荧光素标记的ssDNA片段被检测线捕获而显色。
本发明还提供猪捷申病毒的检测方法，采用上述基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒。
优选的，猪捷申病毒的检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用特异性引物 SEQ ID NO .6至SEQ ID NO .9，加入LAMP等温扩增体系，在63℃反应30min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用CRISPR/Cas12a检测体系检测猪捷申病毒：将步骤b中产物加入CRISPR/Cas12a检测体系，于37℃反应30min；
步骤d：利用荧光定量检测法或免疫层析试纸条检测样品中的猪捷申病毒。
本发明至少具有以下有益效果之一：
1、本发明通过利用CRISPR/Cas12a特异识别核酸联合免疫层析技术，实现对猪捷申病毒的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。根据研究发现，猪捷申病毒的5’-UTR基因具有高度保守性，选定5’-UTR基因作为检测的靶序列。根据CRISPR/Cas12a识别特定PAM序列特点，在5’-UTR基因靶序列上设计3条特异性gRNA。通过检测发现gRNA-1对于猪捷申病毒的检出有更高的灵敏度，因此选定对猪捷申病毒检测中使用gRNA-1，进一步建立CRISPR/Cas12a快速检测猪捷申病毒系统。
2、本发明是基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测工具，该工具包含免疫层析条带检测，能实现方便快捷的结果判读。
3、本发明利用CRISPR/Cas12a对特异性序列切割和免疫层析技术实现对猪捷申病毒的快速、高特异性、高灵敏性和可视化检测。可检测到3.26 copy/μL的猪捷申病毒核酸。本发明所建立的猪捷申病毒快速检测方法，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。
4、本发明公开了一系列用于猪捷申病毒检测的CRISPR/Cas12a反应体系和gRNA以及LAMP扩增引物，其序列依次如SEQ NO.1至NO.9所示。所述CRISPR/Cas12a，gRNA和LAMP扩增引物组合可用于猪捷申病毒检测。本发明系首次利用CRISPR/Cas12a检测猪捷申病毒，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于CRISPR/Cas12a免疫层析试纸条纸检测方法方便用于实验室和临床医学对猪捷申病毒的快速检测和诊断。
附图说明
图1为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a的gRNA-1检测猪捷申病毒的荧光检测结果(50min)图；
图2为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a的gRNA-2检测猪捷申病毒的荧光检测结果(50min)图；
图3为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a的gRNA-3检测猪捷申病毒的荧光检测结果(50min)图；
图4为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用荧光定量检测猪捷申病毒时，从gRNA-1到gRNA-3的结果对比图；
图5为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用荧光定量法检测猪捷申病毒灵敏性时，猪捷申病毒RNA浓度3.26×106、3.26×105、3.26×104、3.26×103、3.26×102、3.26×101、3.26×100、3.26×10-1和阴性对照对应的灵敏度检测结果；
图6为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用荧光定量法检测猪捷申病毒灵敏性时，猪捷申病毒RNA浓度3.26×106、3.26×105、3.26×104、3.26×103、3.26×102、3.26×101、3.26×100、3.26×10-1和阴性对照的灵敏度检测结果柱形图；
图7为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用免疫层析试纸条检测猪捷申病毒灵敏性时，猪捷申病毒 RNA浓度3.26×106、3.26×105、3.26×104、3.26×103、3.26×102、3.26×101、3.26×100、3.26×10-1和阴性对照的检测图；
图8为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用荧光定量法检测不同病毒和阴性对照对应的特异性检测图；
图9为本明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用荧光定量法检测不同病毒和阴性对照对应的结果特异性柱形图；
图10为本发明实施例中基于CRISPR/Cas12a，用免疫层析试纸条检测不同病毒和阴性对照对应的特异性结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中：环介导等温核酸扩增试剂盒(LAMP)和CRISPR/Cas12a酶购自NEB公司；gRNA和环介导扩增引物核酸和ssDNA探针由生工生物公司合成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。猪捷申病毒由实验室分离鉴定保存。
猪捷申病毒片段快速灵敏检测
1 .1核酸制备
本案例中猪捷申病毒基因片段，是由实验室分离鉴定的猪捷申病毒-2型毒株。
利用本发明中通过对病毒细胞培养上清，离心除去含有107个空斑形成单位的0.5mL培养上清液中的细胞碎片，然后按照操作规程用诺威赞的病毒提取试剂盒提取病毒RNA。评估检测下限，用分光光度法测定PTV RNA的量，并计算出其分子拷贝数，分别以10倍稀释的猪捷申病毒RNA为模板，利用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（诺唯赞）进行反转录实验。反转录的反应体系和反应流程见表1：
表1反转录体系
将反转录后的RNA样品，分别进行LAMP扩增反应LAMP反应混合物包含5mM F3和B3引物各1.0μL、40mM FIP和BIP引物各1.0μL、2.5μL 10×反应缓冲液、1.0μL 8U/μL Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、3.5μL 10 mM dNTP混合物(Takara)、5.0μL 30 mM MgSO4(Sigma)、1μL 反转录后的RNA样品和3.0μL无核酸酶超纯水，于63℃反应30min，获得样品进行下一步核酸检测。其中，5mM F3和B3引物、40mM FIP和BIP引物的序列（SEQ ID NO .6-9）见表2。
表2 . 猪捷申病毒 LAMP 引物设计
1 .2 猪捷申病毒特异性gRNA的设计制备
gRNA制备按照如下方案进行，针对猪捷申病毒5’-UTR基因保守区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计识别长度为48nt的gRNA，分别命名为gRNA-1至3(SEQ NO .1至SEQ NO .3) 。设计完成后，于生工生物公司直接合成gRNA。
本发明提供的猪捷申病毒 gRNA包括SEQ ID NO .1至SEQ ID NO .3，具体靶向识别区域信息如表3所示。
表3 .猪捷申病毒特异性gRNA
本检测采用20μL体系如表4所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表4 .猪捷申病毒CRISPR/Cas12a检测体系
其中，ssDNA报告系统为ssDNA FQ reporter和/或ssDNA FB reporter。
ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’，命名为ssDNA FQ reporter/5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’；ssDNA FQ reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .4；
ssDNA FB reporter为利用荧光素和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’，命名为ssDNA FB reporter/5’-FAM- TTATTATT-Biotin-3’；ssDNAFB reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .5。
ssDNA FQ reporter和ssDNA FB reporter中的ssDNA如表5所示：
表5.
另外，该试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条检测是ssDNA的5’端与3’端分别修饰FAM基团与Biotin基团，且免疫层析试纸条中具有用金纳米颗粒标记的抗荧光素抗体，抗荧光素抗体可以与报告系统ssDNA FB reporter的荧光素修饰末端结合，免疫层析试纸条的质控线中具有链霉亲和素，链霉亲和素可以和生物素基团结合。
1 .3荧光定量检测
荧光定量检测中，CRISPR/Cas12a对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30s一个循环，荧光信号检测100个循环。
利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。使用荧光定量用于测量检测反应的荧光，针对猪捷申病毒的每条gRNA(gRNA1～3)切割检测动力学监测如图2(100个循环) ，猪捷申病毒检测中，针对猪捷申病毒每条gRNA(gRNA1～3)切割检测动力学监测。该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对猪捷申病毒的检测。
1 .4免疫层析试纸条检测
免疫层析试纸条检测中，CRISPR/Cas12a对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30min。
本发明中免疫层析试纸条检测步骤如下：将20μL CRISPR/Cas12a切割产物与30 μL超纯水进行混合。将测试条浸入混合物中，反应5分钟后，可由肉眼进行结果判定。
实施例1
荧光定量用于测量检测 CRISPR/Cas12a反应动力学监测，如附图1~3所示，针对猪捷申病毒的每条gRNA(gRNA1～3)切割检测动力学监测(100个循环)；如附图4所示，猪捷申病毒检测中发现gRNA-1对于猪捷申病毒的检出有较高的荧光值。
根据实施例1所得结果，gRNA-1对检测的猪捷申病毒基因有较高荧光值，因此采用这条特异性gRNA进行后续检测。本检测采用20μL体系如表2所示，但不限于此。
实施例2
CRISPR/Cas12a检测猪捷申病毒灵敏度
在灵敏度检测案例中，将细胞培养的猪捷申病毒进行裂解提取的RNA，根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释后反转录，获得每μL含有3.26×107、3.26×106、3.26×105、3.26×104、3.26×103、3.26×102、3.26×101、3.26×100拷贝数(copy/μL)。将1μL梯度稀释并反转录的样品，分别进行LAMP扩增反应：LAMP反应混合物包含5mM F3和B3引物各1.0μL、40mM BIP和FIP引物各1.0μL、2.5μL 10×反应缓冲液、1.0μL 8U/μL Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、3.5μL 10 mM dNTP混合物(Takara)、5.0μL 30 mM MgSO4(Sigma)、1μL 反转录后的RNA和3.0μL无核酸酶超纯水。混合均匀，于63℃反应30min ，获得样品进行下一步核酸检测。
本实施例2所得结果如附图5~7所示，针对猪捷申病毒灵敏性检测结果，本实施例中，应用CRISPR/Cas12a荧光法和试纸条法检测猪捷申病毒，能够实现3.26×100拷贝的高灵敏度检出。
实施例3
对猪捷申病毒的特异性检测用于分析所建立的CRISPR/Cas12a检测方法的特异性：猪捷申病毒（PTV）、伪狂犬病毒（PRV），盖塔病毒（GETV）、呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪瘟病毒（CSFV）和乙型脑炎病毒（JEV）。
本实施例3所得结果，在含有PRV、GETV、PRRSV、PCV、CSFV、JEV、PTV的cDNA/DNA模板的荧光法和试纸条法的反应结果如附图8~10所示，CRISPR/Cas12a检测具有高度的特异性。
本实施例对临床样品的核酸进行快速检测，所有样品及操作均在实验室中完成，本案例中样本为实验室分离鉴定的病毒核酸提取获得的核酸进行CRISPR/Cas12a检测。本实施例使用购自诺唯赞公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(过柱法)获得预处理的核酸。并进行下一步检测。
实施案例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。在CRISPR/Cas12a检测体系中，依次加入各组分混合均匀后使用荧光定量用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，每30s检测一次，持续检测100个循环。阳性判定结果与临床样本检测结果一致。结果显示，基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术能够实现对猪捷申病毒核酸的灵敏、快速、准确检测。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于，包括适用于猪捷申病毒检测的CRISPR/Cas12a检测体系。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a检测体系包括针对猪捷申病毒的5’-UTR保守基因的特异性gRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述特异性gRNA为针对猪捷申病毒的13个血清型的gRNA 1-3中的任意一种或多种，其序列为SEQ ID NO .1至SEQ ID NO .3。
4.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述ssDNA报告系统包括用于荧光定量检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫层析试纸条检测的ssDNA FB reporter。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’，命名为ssDNA FQ reporter/5’-FAM-TTATTATT-BHQ-3’；ssDNAFQ reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .4；
所述ssDNA FB reporter为利用荧光素和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’，命名为ssDNA FB reporter/5’-FAM- TTATTATT-Biotin-3’；ssDNAFB reporter中ssDNA的序列为SEQ ID NO .5。
6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条检测是ssDNA的5’端与3’端分别修饰FAM基团与Biotin基团，且免疫层析试纸条中具有用金纳米颗粒标记的抗荧光素抗体，所述抗荧光素抗体可以与报告系统ssDNA FB reporter的荧光素修饰末端结合，所述免疫层析试纸条的质控线中具有链霉亲和素，所述链霉亲和素可以和生物素基团结合。
7.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于，所述特异性gRNA的制备方法包括：针对猪捷申病毒5’-UTR保守基因，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列TTTN的靶向序列，设计gRNA，设计完成后，由生物公司进行目的gRNA的合成。
8.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a蛋白由NEB公司生产。
9.猪捷申病毒的检测方法，其特征在于：采用权利要求1～8中任一项所述的基于CRISPR/Cas12a的猪捷申病毒检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的猪捷申病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用特异性引物SEQ ID NO .6至SEQ ID NO .9，加入LAMP等温扩增体系，在63℃反应30min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用CRISPR/Cas12a检测体系检测猪捷申病毒：将步骤b中产物加入CRISPR/Cas12a检测体系，于37℃反应30min；
步骤d：利用荧光定量检测法或免疫层析试纸条检测样品中的猪捷申病毒。
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