CN116064968A - 检测阿卡斑病毒rt-raa引物探针组和试剂盒及应用 - Google Patents

检测阿卡斑病毒rt-raa引物探针组和试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测阿卡斑病毒RT‑RAA引物探针组和试剂盒及应用。本发明的引物探针组经过简并设计后，能够快速，准确的检测出阿卡斑病毒，通过本申请设计的试剂盒在42℃，反应20min即可快速检测出AKAV，检测下限可达6.26×101copies/μL，与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等牛羊猪病毒无交叉反应，并具有良好的重复性，同时，本发明还制备了相应的RAA试剂盒并建立相应的RAA检测方法，临床样品检测表明，该试剂盒阳性检出率为43.24％，与RT‑qPCR检测结果符合率为94.59％。因此适用于临床快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组和试剂盒及应用
【技术领域】
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组和试剂盒及应用。
【背景技术】
阿卡斑病毒(Akabane Virus，AKAV)是一种虫媒病毒，属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunya Virus)辛波(Simbu)血清群成员。在自然界中，AKAV通过嗜血节肢动物媒介在动物中循环传播，主要引起牛羊流产、早产、死胎、木乃伊、胎儿畸形及新生胎儿发生关节萎缩和积水性无脑等症状。AKAV最早是在日本群马县赤羽村分离到，因此又命名为赤羽病毒。1972-1975年曾在日本大爆发，4万多头牛受感染，给养牛业造成了巨大的经济损失。目前AKAV已在澳大利亚、以色列、韩国、日本、马来西亚、土耳其等东南亚、东亚、非洲和南美洲等温带和热带地区广泛传播，在我国包括台湾在内的大部分省市都有阳性病例的相关报道，表明AKAV在我国广泛存在，一旦暴发将会给我国畜牧业造成严重的经济损失。因此赤羽病为世界动物卫生组织(OIE)法定通报的疫病，也是我国进口牛羊必检疫病之一。
目前，已经建立了很多AKAV实验室诊断方法，如微量血清中和试验(Microtitreneutralization test，SNT)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain，RT-PCR)、多重TaqMan测定法和逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification，RT-LAMP)方法，这些方法的应用为AKAV的诊断和流行病学调查提供了有力的技术支撑。但这些方法的应用依赖于专业的实验室，对仪器设备以及人员的要求高，限制其在现场和基层的应用。重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aidamplification，RAA)是近年出现的一种快速检测技术，利用重组酶替代了传统PCR热循环解链过程，实现常温下20min内快速完成核酸扩增，具有特异性强，敏感性高，操作简便的特点。本研究根据不同物种来源AKAVS基因的特异保守片段设计RAA引物及探针，构建AKAV荧光RT-RAA检测方法，为AKAV的现场快速诊断提供新的技术手段。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供快速检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组和试剂盒和方法，该方法能利用该试剂盒实现对阿卡斑病毒(AKAV)的快速检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组，包括用于鉴定阿卡斑病毒基因的上有引物AKAV-S-F4、下游引物AKAV-S-R1和AKAV-S-Probe探针，所述上游引物AKAV-S-F4的核苷酸序列为：5’-CRGGGTATGTGGCWTTTATCAGTAARYATGGG-3’；所述下游引物AKAV-S-R1的核苷酸序列为：5’-TGTCTGACACYGGRTTTGCAGTRTAYTGGG-3’；所述AKAV-S-Probe探针的核苷酸序列为：5’-CTTACATAAGACGCCACAACCAAGTGTCGA(FAM)(THF)T(BHQ1)ACTTTTGCAGGGGT-3’；所述探针第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基G被四氢呋喃THF代替，第34位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
本发明还包括包含所述检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组的试剂盒。
进一步说明，所述试剂盒还包含RNA提取试剂，RT-RAA基础荧光通用反应试剂、AKAV阳性及阴性对照品。
本发明还包括所述的试剂盒在检测阿卡斑病毒上的应用。
本发明还包括所述的试剂盒在制备检测阿卡斑病毒制剂中的应用，其特征在于，所述的制剂在进行阿卡斑病毒检测时包括如下步骤：
提取RNA：提取待测样品的RNA；RT-RAA反应体系扩增：以提取的RNA为模板，加入试剂盒中检测阿卡斑病毒的RT-RAA引物和探针以及包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂组成RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增；所述RT-RAA的反应条件为在42℃下恒温扩增30min，引物浓度为10μmol/L，探针浓度为5μmol/L；所述结果判定是阳性对照时：阳性对照：有典型扩增曲线出现，出峰时间≤15min；阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min；阳性对照和阴性对照均成立时，检测样品出现典型扩增曲线，并且出峰时间≤18min时为阳性，无扩增曲线或出峰时间＞18min为阴性。。
进一步的说明，包含的试剂盒中上游引物、下游引物和探针浓度为比为2:2:1。
进一步的说明，包含的试剂盒中上游引物、下游引物和探针浓度分别为10μmol/L、10μmol/L、5μmol/L。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)RT-RAA引物探针组和试剂盒及应用。本发明的引物探针组经过简并设计后，能够快速，准确的检测出AKAV，通过本申请设计的试剂盒在42℃，反应20min即可快速检测出AKAV，检测下限可达6.26×101copies/μL，与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等牛羊猪病毒无交叉反应，并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测，阳性检出率为43.24％，与RT-qPCR检测结果符合率为94.59％。综上所述，本研究建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点，可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法，适用于临床快速检测，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
图1为本发明不同引物对的荧光RT-RAA反应结果对比图。其中，1～13:AKAV-S-F1/AKAV-S-R1； AKAV-S-F1/AKAV-S-R2； AKAV-S-F1/AKAV-S-R3；AKAV-S-F2/AKAV-S-R1；AKAV-S-F2/AKAV-S-R2； AKAV-S-F2/AKAV-S-R3；AKAV-S-F3/AKAV-S-R1； AKAV-S-F3/AKAV-S-R2； AKAV-S-F3/AKAV-S-R3；AKAV-S-F4/AKAV-S-R1；AKAV-S-F4/AKAV-S-R2；AKAV-S-F4/AKAV-S-R3；阴性对照Negativecontrol。
图2为本发明不同温度对的荧光RT-RAA反应结果对比图；1:35℃；2:37℃；3:39℃；4:42℃；5阴性对照：Negativecontrol。
图3为本发明不同引物浓度对的荧光RT-RAA反应结果对比图；1:15μmol/L；2:10μmol/L；3:5μmol/L；4:2μmol/L；5:阴性对照Negativecontro。
图4为本发明不同探针浓度对的荧光RT-RAA反应结果对比图；1:15μmol/L；2:10μmol/L；3:5μmol/L；4:2μmol/L；5:阴性对照Negativecontrol。
图5为本发明荧光RT-RAA检测方法敏感性检测结果图。1～6：质粒标准品浓度为6.26×105～6.26×100copies/μL；7：阴性对照。
图6为本发明荧光RT-RAA检测方法特异性检测结果。1:AKAV；2:BVDV；3:BTV；4:PRV；5:PRRSV；6:阴性对照Negativecontrol。
图7为本发明荧光RT-RAA检测方法重复性检测结果。A：质粒拷贝数为6.26×101copies/μL；B：质粒拷贝数为6.26×103copies/μL；C：质粒拷贝数为6.26×105copies/μL。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：本发明用于检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组设计如下：
以阿卡斑病毒的S基因保守序列区域设计特异性引物及荧光探针：课题组设计了7条引物和1条探针具体如表1：
表1AKAVRT-RAA探针及引物
Figure BDA0004068495270000041
简并引物说明：R＝A/G；W＝A/T；Y＝C/T。
AKAV-S-Probe探针第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基G被四氢呋喃THF代替，第34位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
通过将上述上、下游引物交叉组合形成12组引物对分别与探针结合。12组引物分别为AKAV-S-F1/AKAV-S-R1；AKAV-S-F1/AKAV-S-R2；AKAV-S-F1/AKAV-S-R3；AKAV-S-F2/AKAV-S-R1；AKAV-S-F2/AKAV-S-R2；AKAV-S-F2/AKAV-S-R3；AKAV-S-F3/AKAV-S-R1；AKAV-S-F3/AKAV-S-R2；AKAV-S-F3/AKAV-S-R3；AKAV-S-F4/AKAV-S-R1；AKAV-S-F4/AKAV-S-R2；AKAV-S-F4/AKAV-S-R3。
将上述12对引物进行普通的RAA电泳筛选，最后发现，除AKAV-S-F4/AKAV-S-R2引物对外，其他11组引物对均能检测到荧光信号，其中AKAV-S-F4(SEQ ID NO.1)/AKAV-S-R1(SEQ ID NO.2)引物对最先检测到荧光信号，且荧光信号强，斜率最大。因此，在上述引物探针组选择AKAV-S-F4(SEQ ID NO.1)/AKAV-S-R1(SEQ ID NO.2)+AKAV-S-Probe(SEQ IDNO.3)为检测引物探针组。
实施例2：
说明：病毒株和样本阿卡斑病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病毒(BTV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)及37份临床样品均由广西壮族自治区兽医研究所畜禽疫病诊治中心实验室保存。
本实施例为采用实施例1的引物探针组检测阿卡斑病毒的RT-RAA方法，具体如下：
(一)恒温荧光RT-RAA反应
1、分别将AKAV、BVDV、BTV、PRV、PRRSV等灭活病毒及临床的采集样品，采用病毒DNA/RNA提取试剂盒按说明书操作提取核酸，超微量紫外分光光度计测定核酸浓度。
2、以提取的AKAV总RNA为模板，使用引物AKAV-N-F:ATGGCAAATCAATTTATTTTCAACG与AKAV-N-R:AACTGGAGAATCAGCAGAGATTAGA进行RT-PCR扩增(722bp)，扩增产物经纯化回收后连接pGEM-T载体，经转化、摇菌、提取质粒后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。序列正确的重组质粒进行核酸浓度测定，选取A260/A280比值介于1.80～1.90间的质粒作为标准品，命名为pGEM-T-AKAV，-20℃保存备用。根据测定的质粒浓度计算拷贝数，拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×浓度(ng/μL)×10-9/(碱基数×340)，计算出pGEM-T-AKAV的拷贝数为6.26×1010copies/μL。
3、使用上有引物AKAV-S-F4、下游引物AKAV-S-R1和AKAV-S-Probe探针，以及RAA干粉管(南宁壮博生物科技有限公司)，以制备的DNA样品为模板进行RAA扩增，反应体系：反应管中加入反应缓冲液25.0μL，正向和反向引物(10μmol/L)各2μL，探针(10μmol/L)0.6μL，模板4.0μL，DEPC水补充至47.5μL；然后向每个反应管的管盖内侧加入2.5μL乙酸镁溶液，盖紧管盖并立即上下颠倒5～6次并瞬时离心，将上述反应管放置于实时恒温荧光检测仪中，39℃反应20min。
在研究反应体系时，课题组对引物不同浓度及反应条件进行了实验，具体如下：以浓度为6.26×105copies/μL的阳性重组质粒pET-FPV标准品为模板，根据上述的反应体系进行配制，在35℃、37℃、39℃、42℃(4个温度)下进行荧光RT-RAA反应，以试剂盒推荐的探针浓10μmol/L，将筛选的最佳引物对的浓度配制为2、5、10、15μmol/L进行荧光RT-RAA反应，以确定最佳引物浓度；待确定最佳反应温度和引物浓度后，将探针浓度配制为2、5、10、15μmol/L进行荧光RT-RAA反应，以确定最佳探针浓度。
通过综合分析比较，对荧光RT-RAA最佳反应温度进行筛选，结果显示(图2)，35℃～42℃均能进行有效扩增，其中在42℃时，最早检测到荧光信号，且荧光信号最强，因此将42℃设为最佳反应温度；进一步对荧光RT-RAA反应体系的引物和探针浓度进行筛选，结果显示(图3、4)，当引物浓度为10μmol/L，探针浓度为5μmol/L时，扩增效率最高，虽然探针浓度15umol/L最先收集到荧光信号，但其扩增效率不高。
4、将上述反应管置于荧光基因检测仪或荧光定量PCR仪中，40℃反应20min，进行荧光监测。
判定标准为：阳性对照：有典型扩增曲线出现，出峰时间≤15min；阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min；阳性对照和阴性对照均成立时，检测样品出现典型扩增曲线，并且出峰时间≤18min时为阳性，无扩增曲线或出峰时间＞18min为阴性。
(二)敏感性试验
对构建的质粒标准品进行10倍比稀释，以浓度6.26×105～6.26×100copies/μL的标准品为阳性模板，DEPC水为阴性对照，进行荧光RT-RAA反应，以评估检测方法的敏感性。
质粒标准品进行10倍倍比稀释，选取浓度为6.26×105～6.26×100copies/μL的标准品进行敏感性试验，结果显示，荧光RT-RAA方法最低可以检测的质粒浓度为6.26×101copies/μL(图5)，具有较高的敏感性。
(三)特异性试验
以AKAV、BVDV、BTV、PRV、PRRSV等病毒核酸以及DEPC水为模板，进行荧光RT-RAA反应，以评估检测方法的特异性。
用建立的荧光RT-RAA方法对AKAV、BVDV、BTV、PRV、PRRSV的病毒核酸进行扩增进行特异性试验。结果显示(图6)，只有AKAV收集到特异性荧光信号，其他病毒核酸和阴性对照均无荧光曲线，表明建立的方法特异性强。
(四)重复性试验
取6.26×105、6.26×103、6.26×101copies/μL高中低三个浓度的质粒标准品进行荧光RT-RAA反应，每个浓度重复3次，以评估检测方法的重复性。
以6.26×101、6.26×103、6.26×105copies/μL三个浓度的质粒标准品为模板分别进行3次组内重复性试验。结果显示(图7)，三个浓度的组内重复均有良好的扩增曲线，起峰差异小，表明建立的方法重复性好。
实施例3：
临床样品检测试验
提取实验室保存的37份羊、竹鼠以及小鼠组织样品的病毒RNA，以此为模板，用本研究建立的荧光RT-RAA方法进行检测，与AKAVRT-qRCR检测结果进行比对，分析两种检测方法的阳性检出率是否有差异，计算两种方法的符合度
对37份临床样品分别进行荧光RT-RAA和RT-qPCR检测，结果显示(表2)，荧光RT-RAA阳性检出16例，阳性检出率高于RT-qPCR，两种方法的总符合率为94.59％，表明本研究建立的荧光RT-RAA方法能满足检测需求，并具有不亚于RT-qPCR的灵敏度。
表2临床样品检测结果比较
Figure BDA0004068495270000071
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干变形和改进这些都属于本发明的保护范围。因此本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组，其特征在于：包括用于检测阿卡斑病毒基因的上游引物AKAV-S-F4、下游引物AKAV-S-R1和AKAV-S-Probe探针，所述上游引物AKAV-S-F4的核苷酸序列为：5’-CRGGGTATGTGGCWTTTATCAGTAARYATGGG-3’；所述下游引物AKAV-S-R1的核苷酸序列为：5’-TGTCTGACACYGGRTTTGCAGTRTAYTGGG-3’；所述AKAV-S-Probe探针的核苷酸序列为：
5’-CTTACATAAGACGCCACAACCAAGTGTCGATGTTACTTTTGCAGGGGT-3’；所述探针第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基G被四氢呋喃THF代替，第34位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
2.包含如权利要求1所述检测阿卡斑病毒RT-RAA引物探针组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含RNA提取试剂，RT-RAA基础荧光通用反应试剂、AKAV阳性及阴性对照品。
4.如权利要求2所述的试剂盒在检测阿卡斑病毒上的应用。
5.如权利要求2所述的试剂盒在制备检测阿卡斑病毒制剂中的应用，其特征在于，所述的制剂在进行阿卡斑病毒检测时包括如下步骤：
提取RNA：提取待测样品的RNA；RT-RAA反应体系扩增：以提取的RNA为模板，加入试剂盒中检测阿卡斑病毒的RT-RAA引物和探针以及包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂组成RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增；所述RT-RAA的反应条件为在42℃下恒温扩增20min；所述结果判定是：阳性对照：有典型扩增曲线出现，出峰时间≤15min；阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min；阳性对照和阴性对照均成立时，检测样品出现典型扩增曲线，并且出峰时间≤18min时为阳性，无扩增曲线或出峰时间＞18min为阴性。
6.如权利要求2或3或4中包含的试剂盒中上游引物、下游引物和探针浓度为比为2:2:1。
7.如权利要求2或3或4中包含的试剂盒中上游引物、下游引物和探针浓度分别为10μmol/L、10μmol/L、5μmol/L。
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