CN118147280A - 一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法及病原体活性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法及病原体活性检测试剂盒，属于核酸检测技术领域。本发明开发的一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术及病原体活性检测试剂盒，无需扩增、无气溶胶污染，实现了活性病原体RNA的免扩增直接检测。判断病原体活性，并解决扩增导致的气溶胶污染，可以直接用于活性病原体靶基因RNA的直接检测，有望用于病原体感染的状态判别，对药物治疗疗效的评估也具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法及病原体活性检测试剂盒。
背景技术
常规微生物检测技术主要是细菌分离培养方法，其为活病原体检测的黄金标准。培养细菌的阳性率低、培养时间长(通常为2-10天)，无法满足当前对微生物检测快速、高通量、敏感的需求；而分子生物学检测技术，如qPCR技术主要是检测样品中微生物的DNA模板，具有快速、准确、半定量的优点，但是该方法检测的是针对整个样本中所有微生物的DNA拷贝，包括具有生物活性的病原体DNA以及无生物学意义的死亡微生物释放的DNA，已有一些文献报道在某些感染治愈患者体内仍能用PCR的方法检测到病原体的DNA，这说明DNA靶标不能很好的反应病原体在体内的存活情况，这样会造成检测的结果与实际具有生物学活性的病原体含量的偏差，出现病原体“假阳性”结果，无法准确判断患者所处感染状态，导致药物误用、贻误治疗等问题。
各种病原体在宿主细胞内进行繁殖就必须要表达其所需的相关蛋白，而蛋白的合成必须由RNA进行翻译。患者在用药之后，病原体死亡，RNA会随之降解，因此，需要一种以RNA为检测靶标能更好的反应病原体在体内的存活情况，可以帮助临床对患者感染状态的评估。
CRISPR是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR和Cas蛋白协同作用，组成具有核酸切割能力的CRISPR/Cas系统，具有很强靶标特异性，可以识别特异性序列，近年来已经被应用于基因的精准检测领域。其中，CRISPR/Cas13系统可以根据设计的gRNA对目标RNA进行识别与捕获，导致其RNA酶切活性被激活，从而对体系中的ssRNA荧光探针进行高效反式切割，实现靶标RNA的特异性检测。
然而，CRISPR/Cas系统中crRNA引导的Cas蛋白与核酸靶标结合的亲和力有限，直接进行核酸检测的检出限约为pM水平，灵敏度很难满足临床诊断的要求。因此，为了获得更高的检测灵敏度，大部分基于CRISPR/Cas13的核酸检测技术需要耦合核酸扩增技术(常见的有聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和等温扩增)。基于PCR预扩增的Cas核酸检测方法具有高灵敏度，但热循环过程需要大型且昂贵的PCR仪，检测周期也相对较长，这使其在基层的推广和现场实时检测受到了极大的限制。虽然靶核酸的预扩增可以用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、环介导等温扩增、滚环扩增等多种等温扩增方法来取代PCR，减少对专业仪器设备的依赖，但是核酸扩增过程可能会产生非特异性扩增子、延长检测周期并增加操作的复杂性和气溶胶污染的风险，不可避免地对分析和应用造成了极大的限制。
同时，靶核酸预扩增步骤和CRISPR/Cas检测步骤的兼容性问题是基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术商业化应用的一个关键障碍，这些均使得基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术在简便性、成本和可用性等方面存在固有的局限性。
因此，能否利用CRISPR/Cas13a检测法的RNA靶标特异性对现有病原体检测方法进行改进，进而解决活性病原体精准检测、感染状态判断、治疗效果评估等问题，是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法及病原体活性检测试剂盒，无需扩增、无气溶胶污染。本发明开发一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术及病原体活性检测试剂盒，无需扩增、无气溶胶污染，实现了活性病原体RNA的免扩增直接检测。判断病原体活性，并解决扩增导致的气溶胶污染，可以直接用于活性病原体靶基因RNA的直接检测，有望用于病原体感染的状态判别，对药物治疗疗效的评估也具有非常重要的意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术，包括以下步骤；
(1)呼吸道样本中RNA提取；
(2)在0.5ml微量离心管中，加入5μg含模版RNA的样本、1μl 10μmol/Loligo(dT)12～18。轻轻混匀，稍离心。
(3)在65℃加热5分钟，迅速置于冰水浴骤冷，并在冰上静置2分钟。
(4)向离心管中加入下列试剂的混合物：4μl 5×反转录缓冲液、1μl12.5mmol/LdNTP、补充适量的DEPC处理水、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂，轻轻混匀，稍离心。
(5)在25℃下孵育25分钟，在55℃下孵育30分钟。
(6)在95℃加热5分钟以灭活反转录酶；
(7)向7μl反转录产物中加入2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；
(8)将10μL退火产物中加入T7-CRISPR/Cas13a体系，具体包括40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
(9)在37℃反应10-40分钟；
(10)在蓝光透照仪下，观察反应体系荧光。
所述的ssRNA报告分子为荧光标记的探针。
所述的ssRNA报告分子的序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
所述的单引物和crRNA针对病原体靶基因RNA进行设计；
所述的ssRNA报告子标记的荧光基团可以选择本领域常用的荧光基团，例如荧光基团为FAM基团。
所述的单引物设计方法为寻找cDNA5′端的“CC”或“CCC”，根据常规引物的设计原则，以“GG”或“GGG”为引物的5′端设计一条长度为20bp左右引物，在5′端引入一段额外的T7启动子序列(5′-TAATACGACTCACTATA-3′)；
本发明还提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系。将包括靶标RNA分子的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于结核分枝杆菌16srRNA的免扩增直接检测。该试剂盒包括1μl 10μmol/Loligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/LdNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
本发明还提供一种寒沙门菌检测试剂盒，包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系。将包括伤寒沙门菌vipR基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测。该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/LdNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
本发明还提供一种痢疾杆菌检测试剂盒，包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系。将包括痢疾杆菌ipaH基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测。该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/LdNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
本发明还提供一种人博卡病毒检测试剂盒，包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系。将包括人博卡病毒VP3基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测。该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/LdNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
本发明还提供一种人腺病毒检测试剂盒，包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系。将包括人腺病毒hexon基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测。该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/LdNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
相对于现有技术，具有如下优势：
(1)本发明通过退火T7转录介导的信号放大的方法，实现活性病原体RNA免扩增超灵敏分析，在灵敏度媲美PCR技术的情况下，所需时间更短，可以在20-40min内完成灵敏的核酸检测。
(2)本发明免去扩增所需的复杂热循环步骤，减少对专业仪器的依赖，简化操作步骤，避免操作人员的专业限制，可以实现基层医疗单位的推广和现场实时检测。
(3)本发明由于免去扩增步骤，从根本上杜绝了气溶胶污染带来的影响，支持安全的开盖操作，可以兼容微流控技术、电化学技术、测流层析等技术，可以支持CRISPR/Cas系统的核酸检测技术商业化应用。
(4)本发明无需扩增步骤所需的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶、UNG酶、Uvs X重组酶、Bst酶等)，检测成本低，适用于大规模的临床应用。
附图说明
图1是本发明中含不同浓度crRNA的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图2是本发明中含不同浓度LwaCas13a的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图3是本发明中含不同浓度ssRNA报告子的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图4是本发明中含不同浓度T7聚合酶的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图5是本发明中含不同浓度重组RNA酶抑制剂的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图6是本发明中含不同浓度牛血清白蛋白的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图7是本发明中含不同病原体的T7-CRISPR/Cas13a体系在蓝光下的测试；
图8是本发明中含不同病原体的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图9是本发明中含有不同拷贝数病原体的T7-CRISPR/Cas13a体系在蓝光下的测试；
图10是本发明中含有不同拷贝数病原体的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图11是本发明中人腺病毒的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图12是本发明中痢疾杆菌的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
图13是本发明中人博卡病毒的T7-CRISPR/Cas13a体系的测试；
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1病原体靶基因T7引物设计与筛选
本实施例根据常规引物的设计原则，以“GG”或“GGG”为引物的5′端设计一条长度为20bp左右引物，在5′端引入一段额外的T7启动子序列(5′-TAATACGACTCACTATA-3′)，设计了3条结核分枝杆菌16srDNA单退火T7引物进行筛选，采用反转录体系对设计的3条结核分枝杆菌16srDNA单退火T7引物进行筛选。在0.5ml微量离心管中，加入7μl以10倍梯度稀释的结核分枝杆菌16srDNA标准品(1.0×107copies/mL、1.0×106cop ies/mL、1.0×105copies/mL和1.0×104copies/mL)、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；将10μL退火产物中加入T7-CRISPR/Cas13a体系，具体包括40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)，在37℃反应10-40分钟，在蓝光透照仪下，观察反应体系荧光，筛选结核分枝杆菌16srDNA的最优单退火T7引物-1。
所述单退火T7引物如下表1；
表1单退火T7引物序列
实施例2病原体靶基因RNA反转录体系测试
本实施例将结核分枝杆菌16srRNA进行反转录反应，首先将5μg含结核分枝杆菌16srRNA的样本加入反转录反应液混合，包括5μg RNA、1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18，在65℃加热5分钟，迅速置于冰水浴骤冷，并在冰上静置2分钟；然后向体系中加入4μl的5×反转录缓冲液、1μl的12.5mmol/L dNTP、0.5μl的20U/μl反转录酶、0.5μL的40U/μL重组RNA酶抑制剂，总体积为7μl，轻轻混匀，离心后在25℃下孵育25分钟，在55℃下孵育30分钟，于95℃加热5分钟以灭活反转录酶，将反转录产物置于-20℃冰箱保存。所述结核分枝杆菌16srRNA序列如下表2；
所述反转录体系如下表3；
表2结核分枝杆菌16srRNA序列
表3反转录体系
实施例3反应体系的优化
向实施例2中反转录所得cDNA中加入Annealing buffer、单退火T7引物-1，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；
将10μL退火产物中加入CRISPR/Cas13a体系，具体包括40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
在37℃反应10-40分钟；
在蓝光透照仪下，观察反应体系荧光。
(1)crRNA浓度优化
设置4个不同crRNA浓度水平(浓度分别为：20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试不同crRNA浓度对检测结果的影响。结果显示，crRNA在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(20nmol/L)或者浓度过高(160nmol/L)的crRNA会降低检测荧光强度，crRNA的浓度为40nmol/L或80nmol/L时均有较强的荧光强度且有一定的差异，易于区分(图1)。考虑长期保存稳定性，最终确定反应体系中crRNA的浓度为80nmol/L。
(2)LwaCas13a浓度优化
设置4个不同LwaCas13a浓度水平(浓度分别为：20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试不同LwaCas13a浓度对检测结果的影响。结果显示，LwaCas13a在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(20nmol/L)或者浓度过高(160nmol/L)的LwaCas13a会降低检测荧光强度，crRNA的浓度为40nmol/L或80nmol/L时均有较强的荧光强度且有一定的差异，易于区分(见附图4)。考虑检测成本问题，最终确定反应体系中LwaCas13a的浓度为40nmol/L。
(3)ssRNA报告子浓度优化
设置4个不同ssRNA报告子浓度水平(浓度分别为：50nmol/L、100nmol/L、250nmol/L、500nmol/L)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试不同浓度ssRNA报告子对检测结果的影响。结果显示，ssRNA报告子在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(50nmol/L)的ssRNA报告子会降低检测荧光强度，ssRNA报告子的浓度为100nmol/L、250nmol/L或500nmol/L时均有较强的荧光强度且有一定的差异，易于区分(见附图4)。考虑长期保存稳定性，最终确定反应体系中ssRNA报告子的浓度为500nmol/L。
(4)T7聚合酶浓度优化
设置4个不同T7聚合酶浓度水平(浓度分别为：0.2U/μL、0.5U/μL、1U/μL、2U/μL)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试不同T7聚合酶浓度对检测结果的影响。结果显示，T7聚合酶在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(0.2U/μL、0.5U/μL)的T7聚合酶会降低检测荧光强度，T7聚合酶的浓度为1U/μL或2U/μL时均有较强的荧光强度且无显著的差异(见附图4)。最终确定反应体系中T7聚合酶的浓度为1U/μL。
(5)重组RNA酶抑制剂浓度优化
设置4个不同重组RNA酶抑制剂浓度水平(浓度分别为：0.2U/μL、0.5U/μL、1U/μL、2U/μL)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试不同重组RNA酶抑制剂浓度对检测结果的影响。结果显示，重组RNA酶抑制剂在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(0.2U/μL)或浓度过高(2U/μL)的重组RNA酶抑制剂会降低检测荧光强度，重组RNA酶抑制剂的浓度为0.5U/μL或1U/μL时均有较强的荧光强度且易于区分(见附图4)。最终确定重组RNA酶抑制剂的浓度为1U/μL。
(6)牛血清白蛋白浓度优化
设置4个不同牛血清白蛋白浓度水平(浓度分别为：10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，添加终浓度为1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌16srRNA样本及阴性对照作为待测标本进行T7-CRISPR反应，测试牛血清白蛋白浓度对检测结果的影响。结果显示，牛血清白蛋白在4种不同浓度下对1.0×103copies/mL的结核分枝杆菌检测结果均为阳性。浓度过低(10μg/mL、20μg/mL)的重组RNA酶抑制剂会降低检测荧光强度，牛血清白蛋白的浓度为50μg/mL或100μg/mL时均有较强的荧光强度且易于区分(见附图4)。最终确定牛血清白蛋白的浓度为100μg/mL。
T7-CRISPR/Cas13a体系的应用
为了验证用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术的特异性，本实施例使用实施例2中结核分枝杆菌16srRNA反转录产物，与人腺病毒、人博卡病毒、伤寒沙门杆菌、痢疾杆菌模版DNA，加入Annealing buffer、单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；将10μL退火产物中加入T7-CRISPR/Cas13a体系，在37℃下反应10-40分钟；在蓝光透照仪下观察靶标病原体的检测结果；其中退火体系包括2μL的Annealing buffer、1μL的单退火T7引物、1μL cDNA，其中T7-CRISPR/Cas13a体系包括40nM的LwaCas13a、80nM crRNA、500nM的ssRNA报告分子、10μL退火产物、1U/μL的NEBr3.1缓冲液、1U/μL的T7聚合酶混合物、1mM的NTP混合物、1U/μL的重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。在蓝光透照仪下观察的结果表明，本发明可以异性地结合目标结核分枝杆菌16srRNA(图1)。
所述退火体系下表4；
所述T7-CRISPR/Cas13a体系如下表5；
所述结核分枝杆菌的16srRNA序列、单退火T7引物和crRNA序列如下表6；
表4退火体系
表5T7-CRISPR/Cas13a体系
表6靶标病原体的单退火T7引物和crRNA序列
实施例3一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术的敏感性评估测试为了确定用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术敏感性，本实施例分别将104，103，102，50，10，0copies的结核分枝杆菌16srDNA加入Annealing buffer、单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；将10μL退火产物中加入含靶向结核分枝杆菌的crRNA的T7-CRISPR/Cas13a体系，在37℃反应10-40分钟；在蓝光透照仪下观察检测结果；其中退火体系包括2μL的Annealing buffer、1μL的单退火T7引物、1μL cDNA，其中T7-CRISPR/Cas13a体系包括40nM的LwaCas13a、80nM crRNA、500nM的ssRNA报告分子、10μL退火产物、1U/μL的NEBr3.1缓冲液、1U/μL的T7聚合酶混合物、1mM的NTP混合物、1U/μL的重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。在蓝光透照仪下观察的结果表明，结果表明基于退火T7转录信号放大的免扩增CRISPR/Cas13a的活性病原体RNA检测方法可以检测到50copies的结核分枝杆菌，可见本发明提供一种高度敏感和特定的方法来检测病原体痕量感染(图8)。
实施例4多种病原体RNA的免扩增CRISPR/Cas13a检测
为了验证用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a技术检测效果，本实施例使用人腺病毒、人博卡病毒、伤寒沙门杆菌、痢疾杆菌模版DNA，向7μl模版DNA中加入2μL Annealingbuffer、1μL单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；将10μL退火产物中加入T7-CRISPR/Cas13a体系，具体包括40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1×NEBr3.1缓冲液、1×T7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；在37℃反应10-40分钟；在蓝光透照仪下，观察反应体系荧光。结果显示本发明可以异性地结合目标病原体。
所述的人腺病毒、人博卡病毒、伤寒沙门杆菌、痢疾杆菌DNA序列、单退火T7引物、crRNA如下表7；
表7人腺病毒、人博卡病毒、伤寒沙门杆菌、痢疾杆菌基因、单退火T7引物、crRNA序列
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法，其特征在于：首先以病原体RNA为模版，经反转录合成cDNA，通过设计一条与cDNA互补配对的单引物，其5′端引入了T7启动序列，引物与cDNA经过退火结合后作为T7体外转录的模版，生产的大量RNA进一步可以作为CRISPR/Cas13a识别的底物，以此实现耦合信号放大。
2.根据权利要求1所述的用于RNA检测的免扩增CRISPR/Cas13a的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在0.5ml微量离心管中，加入5μg RNA、1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、补充适量的DEPC处理水；轻轻混匀，稍离心；
(2)在65℃加热5mi，迅速置于冰水浴骤冷，并在冰上静置2分钟；
(3)向离心管中加入下列试剂的混合物：4μl 5×反转录缓冲液、1μl12.5mmol/L dNTP、补充适量的DEPC处理水、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂；轻轻混匀，稍离心；
(4)在25℃下孵育25分钟，在55℃下孵育30分钟；
(5)在95℃加热5分钟以灭活反转录酶；
(6)向反转录所得cDNA中加入Annealing buffer、单退火T7引物，在95℃加热2分钟，每八秒下降0.1℃，进行700个循环，直至25℃；
(7)将10μL退火产物中加入CRISPR/Cas13a体系，具体包括40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nMssRNA报告分子、1U/μLNEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)；
(8)在37℃反应10-40分钟；
(9)在蓝光透照仪下，观察反应体系荧光。
3.根据权利要求1或2方法制备的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于：包括所述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系，将包括靶标RNA分子的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于结核分枝杆菌16srRNA的免扩增直接检测；该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/L dNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μLAnnealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1U/μL NEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
4.根据权利要求1或2方法制备的寒沙门菌检测试剂盒，其特征在于：包括所述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系，将包括伤寒沙门菌vipR基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测；该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/L dNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1U/μL NEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
5.根据权利要求1或2方法制备的痢疾杆菌检测试剂盒，其特征在于：包括所述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系，将包括痢疾杆菌ipaH基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测；该试剂盒包括1μl10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/L dNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μLAnnealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1U/μL NEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
6.根据权利要求1或2方法制备的人博卡病毒检测试剂盒，其特征在于：包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系；将包括人博卡病毒VP3基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测；该试剂盒包括1μl 10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/L dNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μL Annealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1U/μL NEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
7.根据权利要求1或2方法制备的人腺病毒检测试剂盒，其特征在于：包括上述的反转录体系与T7-CRISPR/Cas13a体系；将包括人腺病毒hexon基因RNA的待测物加入试剂盒中形成混合体系，通过上述步骤，可应用于活性病原体RNA的免扩增直接检测；该试剂盒包括1μl10μmol/L oligo(dT)12～18、4μl 5×反转录缓冲液、1μl 12.5mmol/L dNTP、0.5μl反转录酶、0.5μl重组RNA酶抑制剂、2μLAnnealing buffer、1μL单退火T7引物、40nMLwaCas13a、80nMcrRNA、500nM ssRNA报告分子、1U/μL NEBr3.1缓冲液、1U/μLT7聚合酶混合物、1mMNTP混合物、1U/μL重组RNA酶抑制剂、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
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