CN118005733A - 检测炎症的肽适配体、试纸条、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种检测炎症的肽适配体、试纸条、试剂盒及其应用。所述肽适配体包括第一肽适配体第二肽适配体以及第三肽适配体中的一种或多种；所述第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；所述第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；所述第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。本申请的肽适配体能够用于检测炎症类型，具有快速、高效等优点。
Description
技术领域
本申请涉及技术领域，特别是涉及一种检测炎症的肽适配体、试纸条、试剂盒及其应用。
背景技术
病毒炎症和细菌炎症是临床上最常见的两种感染类型。目前，临床上主要通过病原学检测或抗体检测的方法来区分病毒感染引起的炎症和细菌感染引起的炎症。
抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等大型Y形蛋白质。抗体对某类蛋白或者某类物质具有特异性识别的特性，在体外诊断上被广泛应用于各类疾病的定量或定性检测，从而协助医务工作者判断患者的疾病状态。但是抗体作为一类大分子蛋白容易受PH、温度等环境的影响而失去活性，且合成较为昂贵；除此之外，抗体在使用过程容易受到样本中内源性抗体的干扰，使得检测结果呈现假阴性或假阳性。
因此，传统技术中检测炎症的方法仍有待改进。
发明内容
基于此，本申请的一个或者多个实施例提供了一种能够区分病毒炎症和细菌炎症的肽适配体、试纸条、试剂盒及其应用。技术方案包括：
根据本申请的第一方面，提供了一种肽适配体，所述肽适配体包括第一肽适配体、第二肽适配体以及第三肽适配体中的一种或多种；
所述第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；
所述第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；
所述第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
在其中一个实施例中，所述第一肽适配体、第二肽适配体和/或第三肽适配体的N末端还连接至少一个生物素。
根据本申请的第二方面，提供了如上述任一项所述的肽适配体在制备检测炎症的产品中的应用。
根据本申请的第三方面，提供了一种检测炎症的胶体金试纸条，包括基底，所述基底上设置有依次搭接的样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫；
所述结合垫上包括胶体金标记的捕获蛋白；
所述层析垫上设置有检测线和质控线；所述检测线包被上述任一项所述的肽适配体，用于特异性结合目标蛋白；所述质控线包被质控蛋白。
在其中一个实施例中，所述检测线包括第一检测线、第二检测线和第三检测线；
所述第一检测线包被第一肽适配体，所述第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；
所述第二检测线包被第二肽适配体，所述第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ IDNO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；
所述第三检测线包被第三肽适配体，所述第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ IDNO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
在其中一个实施例中，所述捕获蛋白包括第四肽适配体、第五肽适配体和第六肽适配体中的一种或多种；
所述第四肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6中至少一种所示，且所述第四肽适配体的氨基酸序列与第一肽适配体的氨基酸序列不同；
所述第五肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:12中至少一种所示，且所述第五肽适配体的氨基酸序列与第二肽适配体的氨基酸序列不同；
所述第六肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:18中至少一种所示，且所述第六肽适配体的氨基酸序列与第三肽适配体的氨基酸序列不同。
在其中一个实施例中，所述的第一检测线、第二检测线和第三检测线沿层析垫方向依次排列。
根据本申请的第四方面，提供了一种如上述任一项所述的胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：
将胶体金标记的捕获蛋白包被在结合垫上；
将上述任一项所述的肽适配体包被在层析垫上形成检测线；
将质控蛋白包被在层析垫上形成质控线；以及
将样品垫、包被有胶体金标记的捕获蛋白的结合垫、设置有检测线和质控线的层析垫以及吸水垫顺次搭接并粘贴在基底上，制备所述胶体金试纸条。
根据本申请的第五方面，提供了一种检测炎症的试剂盒，包括上述任一项所述的肽适配体或者上述任一项所述的检测炎症的胶体金试纸条。
根据本申请的第六方面，提供了一种检测样品中目标蛋白的方法，所述方法包括采用上述任一项所述的肽适配体、上述任一项所述的胶体金试纸条或者上述的试剂盒检测待测样品中目标蛋白的步骤；
所述目标蛋白包括MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白中的一种或多种。
与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：
本申请筛选得到的肽适配体，能够与待测样本中的MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白靶向结合。根据肽适配体与目标蛋白的结合情况，能够快速、准确地区分正常样本、病毒炎症样本和细菌炎症样本。此外，本申请的肽适配体具有合成成本低、结构稳定等优点。
本申请的胶体金试纸条能够用于区分正常样本、病毒炎症样本和细菌炎症样本，且具有操作简单、反应快速、结果准确等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请一实施方式的试纸条结构示意图。
附图标记说明：10、样本垫；20、结合垫；30、检测线；31、第一检测线；32、第二检测线；33、第三检测线；40、质控线；50、层析垫；60、吸水垫；70、基底。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
“肽适配体”是一种短链氨基酸，能够高亲合力地与靶物质特异性结合。
本申请的第一方面，提供了一种肽适配体，包括第一肽适配体、第二肽适配体以及第三肽适配体中的一种或多种；
第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
具体地，第一肽适配体能够特异性地捕获MxA蛋白结合，第二肽适配体能够特异性地捕获CRP蛋白，第三肽适配体能够特异性地捕获SAA蛋白。
在其中一些实施方式中，第一肽适配体、第二肽适配体和/或第三肽适配体的N末端还连接至少一个生物素。
在肽适配体的氨基酸序列N末端修饰生物素，使之能够与质控线匹配。
本申请筛选得到的肽适配体，能够快速、准确地与待测样品中的MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白结合，反映待测样品中目标蛋白的水平。
本申请筛选得到的肽适配体至少具有如下优点：（1）氨基酸序列较短，合成成本较低；（2）分子量小，与目标蛋白结合时不易受到内源性抗体和内源游离DNA序列的影响；（3）结构简单，受pH值、温度等环境因素的影响较小。
本申请的第二方面，提供了上述的肽适配体在制备检测炎症的产品中的应用。
本申请的第三方面，提供了一种检测炎症的胶体金试纸条，包括基底70，基底70上设置有依次搭接的样品垫10、结合垫20、层析垫50和吸水垫60；
结合垫20包被有胶体金标记的捕获蛋白；
层析垫50上设置有检测线30和质控线40；检测线30包被上述任一实施方式的肽适配体，用于特异性结合目标蛋白；质控线40包被质控蛋白。
在其中一些实施方式中，检测线30包括第一检测线31、第二检测线32和第三检测线33。
在其中一些具体示例中，第一检测线31包被第一肽适配体，第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；第二检测线32包被第二肽适配体，第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；第三检测线33包被第三肽适配体，第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
在一个具体示例中，氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7~SEQID NO:10和SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16所示的肽适配体的N末端均修饰有一个生物素。
在其中一些具体示例中，捕获蛋白包括第四肽适配体、第五肽适配体和第六肽适配体中的一种或多种；
第四肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6中至少一种所示，且第四肽适配体的氨基酸序列与第一肽适配体的氨基酸序列不同。
在其中一些具体示例中，第五肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:12中至少一种所示，且第五肽适配体的氨基酸序列与第二肽适配体的氨基酸序列不同。
在其中一些具体示例中，第六肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ IDNO:18中至少一种所示，且第六肽适配体的氨基酸序列与第三肽适配体的氨基酸序列不同。
进一步地，SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:18所示的肽适配体的N末端均修饰有一个生物素。
具体地，氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6所示的第四肽适配体能够特异性捕获MxA蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:12所示的第五肽适配体能够特异性捕获CRP蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:18所示的第六肽适配体能够特异性捕获SAA蛋白。
在其中一些具体示例中，质控蛋白包括生物素抗体。生物素抗体能够与肽适配体N末端的修饰生物素特异性识别。
在一些具体示例中，检测线和质控线相互间隔分布。
在一些实施例中，层析垫50为硝酸纤维素膜。
在一些实施例中，基底70为PVC底板。
本申请的第四方面，提供了一种上述的胶体金试纸条的制备方法，包括步骤S10~S40。
步骤S10：将胶体金标记的捕获蛋白包被在结合垫20上；
步骤S20：将上述的第一肽适配体、第二肽适配体和第三肽适配体分别包被在层析垫50上形成检测线30；
步骤S30：将质控蛋白包被在层析垫50上形成质控线40；以及
步骤S40：将样品垫10、包被有胶体金标记的捕获蛋白的结合垫20、设置有检测线和质控线的层析垫50以及吸水垫60顺次搭接，并粘贴在基底70上，制备胶体金试纸条。
在其中一些实施方式中，步骤S20中，包括如下步骤：
将氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示的肽适配体包被在层析垫50上形成第一检测线31；
将氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示的肽适配体包被在层析垫50上形成第一检测线32；
将氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示的肽适配体包被在层析垫50上形成第一检测线33。
本申请的第五方面，提供了一种检测炎症的试剂盒，包括上述的肽适配体或者上述的检测炎症的胶体金试纸条。
在其中一些实施方式中，试剂盒包括试纸卡，试纸卡包括壳体以及安装在壳体中的检测试纸。可选地，检测试纸选自上述任一实施方式的胶体金试纸条。
在其中一些具体示例中，壳体上包括加样孔和检测窗口。加样孔与胶体金试纸条上的结合垫20对应，用于向结合垫20上滴加待测样本；检测窗口与胶体金试纸条上的层析垫50对应，用于观察检测结果。
本申请的第六方面，提供了一种检测样品中目标蛋白的方法，包括采用上述的肽适配体、上述的胶体金试纸条或者上述的试剂盒检测待测样品中目标蛋白的步骤；目标蛋白包括MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白中的一种或多种。
在其中一些实施方式中，检测样品中目标蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤a：将待测样本加到胶体金试纸条的样品垫10上，观察检测线30和质控线40。
步骤b：根据检测线30和质控线40的显色结果，对待测样本中目标蛋白进行定性分析。
可选地，待测样本包括血清、血浆和全血中的一种或多种。
本申请的第七方面，提供了一种检测炎症的方法，包括如下步骤：
根据上述步骤b中待测样本中MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白的定性分析结果，判断待测样本的炎症类型。
具体地，判断待测样本的炎症类型包括如下步骤：
待测样本中同时含有MxA蛋白和SAA蛋白，则待测样本为病毒炎症；
待测样本中同时含有CRP蛋白和SAA蛋白且不含MxA蛋白，则待测样本为细菌炎症；
待测样本中仅含有SAA蛋白或者三种蛋白都不含，则待测样本为正常样本。
本申请的检测炎症的方法，能够快速、高效地区分正常样本、病毒炎症样本和细菌炎症样本，同时具有较高的灵敏度和特异性，为临床上区分病毒炎症和细菌炎症提供了新的思路。
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。
本申请实施例中使用的MxA蛋白购买自杭州华葵金配生物科技有限公司，货号为E30131；CRP蛋白购买自北京霍尔姆斯生物科技有限公司，货号为HA012AN；SAA蛋白购买于上海墨迪斯医疗技术有限公司，目录号为610070。
实施例1：
（1）肽适配体的筛选
a) 将100μL的浓度为1mg/mL的MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白分别添加到96孔板中孵育。孵育的具体步骤包括：向96孔板中加入500μL pH值为8.0、浓度为0.2M的CB缓冲液（碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液），置于4℃过夜包被，使MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白固定在孔壁上；弃去废液，用0.01M PBS缓冲液清洗3遍，采用10%的牛血清白蛋白进行封闭（0.01MPBS溶解），封闭2h；加入100μL的M13噬菌体文库溶液进行孵育，孵育体系为0.1%(v/v)TBST（TrisBuffered Saline with Tween）缓冲液，即50mM Tris-HCl（pH=7.5）、150mM NaCl和0.1%(v/v)Tween-20；孵育条件为37℃孵育30min。
b) 清洗除去未结合的噬菌体，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过5轮重复筛选，收集到具有最高结合亲和力的噬菌体菌落，通过翻译pIII蛋白结构域的DNA序列，筛选得到合适的肽适配体。
胶体金试纸条上需设置质控线，为了使上述肽适配体能够应用于胶体金试纸条，因此对各肽适配体的N末端进行生物素修饰（bio-），从而得到如表1所示的肽适配体。
表1 肽适配体序列信息
（2）制备胶体金试纸条
a) 将浓度为60nM的胶体金（湖南远泰）分别与MxA、CRP、SAA的适配体进行混合，得到浓度为5ug/mL的混合标记物。
b) 调整喷膜划线仪的位置，分别将MxA、CRP、SAA的不同肽适配体按照0.7 mg/mL的浓度进行划线，质控线采用浓度为1.5mg/mL的生物素抗体（湖南远泰）进行划线。
c) 组装
在PVC底板上依次粘贴设置有检测线30和质控线40的层析垫50、包被有胶体金-肽适配体的结合垫20、样品垫10以及吸水垫60，制备得到胶体金试纸条，图1为试纸条的结构示意图。
按照上述的步骤，制备得到肽适配体信息如表2所示的10种胶体金试纸条。
表2 试纸条上包被的肽适配体
（4）检测结果
从临床收集10例正常人的血清样本、以及20例炎症患者的血清样本。通过临床诊断结果将20例炎症患者分为细菌感染炎症患者和病毒感染炎症。
采用表3制备得到的编号为1~10的试纸条分别对上述30例样本进行检测，检测结果分别如表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11、表12所示（“+”表示阳性，“-”表示阴性）。
表3 第1组胶体金试纸条的检测结果
表4 第2组胶体金试纸条的检测结果
表5 第3组胶体金试纸条的检测结果
表6 第4组胶体金试纸条的检测结果
表7 第5组胶体金试纸条的检测结果
表8 第6组胶体金试纸条的检测结果
表9 第7组胶体金试纸条的检测结果
表10 第8组胶体金试纸条的检测结果
表11 第9组胶体金试纸条的检测结果
表12 第10组胶体金试纸条的检测结果
表3~表12中，试纸条上的质控线能够显色则表明试纸条处于正常状态，其检测结果可信。其中，第1组~第3组、第6组~第8组试纸条的检测结果均满足如下规则：正常样本的第一检测线（MxA）和第二检测线（CRP）均不显色，第三检测线（SAA）不显色或轻微显色，表明正常样本中的CRP、MxA、SAA适配体均不会有非特异性的识别。炎症样本的第三检测线（SAA）均显色，说明SAA的所有肽适配体均能识别炎症样本中的SAA抗原；细菌炎症样本中第二检测线（CRP）显色而第一检测线（MxA）不显色，说明CRP的肽适配体能特异性识别细菌炎症样本中的CRP。病毒炎症样本的第二检测线（CRP）不显色而第一检测线（MxA）显色，说明MxA的肽适配体能特异性识别病毒炎症样本中的MxA。
第4组~第5组、第9组~第10组中检测结果异常，原因可能是肽适配体无法准确识别目的蛋白，或者结合垫中包被的肽适配体无法与检测线中包被的肽适配体配对。
上述结果表明本申请筛选得到的靶向MxA、CRP、SAA三种蛋白的肽适配体能够用于鉴别病毒感染引起的炎症和细菌感染引起的炎症。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种肽适配体，其特征在于，所述肽适配体包括第一肽适配体、第二肽适配体以及第三肽适配体中的一种或多种；
所述第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；
所述第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；
所述第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
2.根据权利要求1所述的肽适配体，其特征在于，所述第一肽适配体、第二肽适配体和/或第三肽适配体的N末端还连接至少一个生物素。
3.如权利要求1~2任一项所述的肽适配体在制备检测炎症的产品中的应用。
4.一种检测炎症的胶体金试纸条，其特征在于，包括基底，所述基底上设置有依次搭接的样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫；
所述结合垫上包括胶体金标记的捕获蛋白；
所述层析垫上设置有检测线和质控线；所述检测线包被权利要求1至2中任一项所述的肽适配体，用于特异性结合目标蛋白；所述质控线包被质控蛋白。
5.根据权利要求4所述的检测炎症的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线包括第一检测线、第二检测线和第三检测线；
所述第一检测线包被第一肽适配体，所述第一肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中至少一种所示；
所述第二检测线包被第二肽适配体，所述第二肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10中至少一种所示；
所述第三检测线包被第三肽适配体，所述第三肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:16中至少一种所示。
6.根据权利要求5所述的检测炎症的胶体金试纸条，其特征在于，所述捕获蛋白包括第四肽适配体、第五肽适配体和第六肽适配体中的一种或多种；
所述第四肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6中至少一种所示，且所述第四肽适配体的氨基酸序列与第一肽适配体的氨基酸序列不同；
所述第五肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:12中至少一种所示，且所述第五肽适配体的氨基酸序列与第二肽适配体的氨基酸序列不同；
所述第六肽适配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ ID NO:18中至少一种所示，且所述第六肽适配体的氨基酸序列与第三肽适配体的氨基酸序列不同。
7.根据权利要求5~6任一项所述的检测炎症的胶体金试纸条，其特征在于，所述的第一检测线、第二检测线和第三检测线沿层析垫方向依次排列。
8.一种如权利要求4~7任一项所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将胶体金标记的捕获蛋白包被在结合垫上；
将权利要求1至2任一项所述的肽适配体包被在层析垫上形成检测线；
将质控蛋白包被在层析垫上形成质控线；以及
将样品垫、包被有胶体金标记的捕获蛋白的结合垫、设置有检测线和质控线的层析垫以及吸水垫顺次搭接并粘贴在基底上，制备所述胶体金试纸条。
9.一种检测炎症的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~2任一项所述的肽适配体或者权利要求4~7任一项所述的检测炎症的胶体金试纸条。
10.一种检测样品中目标蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1~2任一项所述的肽适配体、权利要求4~7任一项所述的胶体金试纸条或者权利要求9所述的试剂盒检测待测样品中目标蛋白的步骤；
所述目标蛋白包括MxA蛋白、CRP蛋白和SAA蛋白中的一种或多种。
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|---|---|---|---|
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