JP2003502303A - Ｐｃｖ−ｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 PCVからの遺伝子、特にPCV−2のORF1、PCV−2のORF2、PCV−1のORF1およびPCV−1のORF2から成る群から選択される遺伝子をコ−ドし、発現するプラスミドと、免疫応答を増加させる要素とから成る免疫原製剤およびワクチンに関する。上記要素は遺伝子の発現産物に応答するカルボマ−、ブタサイトカイン、例えばGM−CSF、式（Ｉ）のカチオン脂質にすることができる（R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基、R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基、Xは水酸基またはアミン基）。カチオン脂質はDMRIEでよく、DOPEと組み合わせることができる 【式１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、PMWS症候群（ブタ全身消耗症候群、porcine multisystemicwasting
syndromまたは離乳後全身消耗症候群）の原因であるブタシルコウイルス（porc
ine circovirus、PCV）の免疫原をコ−ドし、発現するプラスミド構造物と、ワ
クチン接種法方法と、DNAワクチンと、このワクチン製剤の製造方法とに関する
ものである。 なお、本明細書で引用した全ての文献の内容は本明細書の一部をなす。

【０００２】 PCVは最初にブタ腎臓細胞株PK/15の非細胞変性汚染物として検出された。この
ウィルスはニワトリ貧血ウィルス（Chicken Anaemia Virus、CAV）およびPBFDV
ウィルス（Pscittacine Beak Feather Disease Virus）とともにCircoviridaeに
分類された。これらに一般的な特性は1.76〜2.31キロ塩基（kb）のゲノムを含む
円形の一重鎖ＤＮＡの形をした小さいエンべロップのないウィルス（15〜24ナノ
メ−トル）である点である。当初、これらのゲノムは約30kDaのポリペプチドを
コ−ドすると思われた(Todd et al., Arch. Virol., 1991,117: 129−135)が、
最近の研究では、多くの複雑な転写をすることが示されている(Meehan B. M. et
al., J. Gen. Virol., 1997,78: 221−227）。さらに、これら３つの化学種の
間のヌクレオチド配列または抗原決定基に有意な共通性は認められていない。

【０００３】 PK/15細胞に由来するPCVは病原性でないと考えられている。その配列はB. M.
Meehan et al., J. Gen. Virol. 1997 (78) 221−227で公知である。このPCVの
菌株が病原があり、PMWS症候群と関連するとしたのはほんの最近である (G. P.
S. Nayar et al., Can. Vet. J., 1997,38: 385−387 and Clark E. G., Proc.
Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499−501）。Nayar et alはPCR法を用いてPMWS
症候群のブタのPCV DNAを検出している。

【０００４】 PMWS症候群の徴候を示すブタで見出されたシルコウイルスに対するモノクロ−
ナル抗体およびポリクロ−ナル抗体によってこれらのシルコウイルスとPK−15細
胞の栽培物から分離されたブタシルコウイルスシルコウイルスとが相違すること
がわかった(Allan G. M. et al. Vet Microbiol.,1999,66: 115−123）。

【０００５】 カナダ、米国およびフランスで検出さたPMWS症候群は体重の漸進的減少と、頻
呼吸、呼吸困難および黄疽のような臨床的症状の現れによって特徴付けられる。
病理学的にはリンパ球または肉芽腫性の溶浸、リンパ節症、肝炎、簡単にはリン
パ球または肉芽腫性の腎炎から明らかになる(Clark E. G., Proc. Am. Assoc. S
wine Prac. 1997: 499−501; La Semaine Veinaire No. 26, upplement to La S
emaine Veinaire 1996 (834); LaSemaine Veinaire 1997 (857): 54; G. P. S.
Nayer et al., Can. Vet. J., 1997,38: 385−387）。

【０００６】 北アメリカとヨ−ロッパで得られるシルコウイルスは非常に密接に関連し、ヌ
クレオチド配列の96%が一致するが、これらのシルコウイルスのヌクレオチド配
列とPK−15細胞から分離されたブタのシルコウイルスと比較するとその一致度は
80%以下である。そのため、二つのウイルスサブグループが提案され、PK−15細
胞から分離されるシルコウイルスをPCV−1とし、PMWS症候群に関連するシルコウ
イルスをPCV−2とされた (Meehan B. M. et al., J. Gen. Virol., 1998,79: 21
71−2179; WO−A−9918214）。

【０００７】

【発明が解決しよとする課題】

本発明はPCV−2免疫原をコ−ドし、発現するプラスミド構造物がブタのPMWS症
候群に対する免疫力があることを見い出した。 PCV−2免疫原はPCV−1免疫原と一緒にしてPCV−2に対して動物を免疫するため
に使うことができる。

【０００８】 好しくはないが、PCV−1免疫原単独で用いることもできる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】 本発明の対象は、PCV−1またはPCV−2免疫原、特にPCV−1の転写解読枠（ORFs
）1および／または2と、PVC−2のORFs 1および／または2とをコ−ドし、発現す
るプラスミド構造物にある。 ORFは転写解読枠（open reading frame）を意味する。 本発明が上記と均等なヌクレオチド配列をコ−ドし、発現するプラスミド、す
なわち、対応する遺伝子またはこの遺伝子でコー度されるポリペプチドの機能性
や株特異性（タイプ1型の菌株およびタイプ2型の菌株）を変えない配列を含むと
いうことは言うまでもない。コ−ドの縮重によって違っている配列ももちろん含
まれる。

【００１０】

【実施の形態】

実施例で使われるPCV−2配列はMeehan達から供給された（菌株Imp. 1010、ORF
1ヌクレオチド398−1342、ORF2ヌクレオチド1381−314、これらはそれぞれ1998
年9月25日出願の米国特許第09／161092号に記載のORF4およびORF13に対応し、WO
−A−9918214のCOL4およびCOL13に対応する）。他のPCV−2菌株およびそれらの
配列はWO−A−9918214に開示されており、ImplO08、Imp999、Imp1011−48285お
よびImplO11−48121とよばれている（A. L. Hamel et al. J. Virol. June 1998
, vol 72,6: 5262−5267 (GenBank AF027217）およびI. orozov et al. J. Clin
ical Microb. Sept. 1998 vol. 36,9: 2535−2541のGenBankAF086834、AF086835
およびAF086836、他の均等なORF配列も入手可能。

【００１１】 本発明はさらに、厳密な条件で考えた時に上記遺伝子のヌクレオチド配列とハ
イブリッド化が可能な均等な配列をも含むものである。こうした均等な配列とし
ては完全配列の免疫原性を保持した遺伝子断片はが挙げられる。

【００１２】 タイプ1および2の全ゲノムの相同性は約75%である。ORF1では約66%、ORF2では
約86%である。これに対してゲノム間およびタイプ2内のORF間の相同性は一般に9
5%以上である。

【００１３】 さらに、本発明の均等配列としては、ORF1の場合、菌株ImplOl0の88%以上、特
に90%以上、好ましくは92%または95%以上の相同性を有するか、ORF2の場合には
菌株ImplO10の80%以上、特に85%以上、好ましくは90%または95%以上の相同性を
有する配列が挙げられる。

【００１４】 Meehan 1998によるORF1およびORF2はそれぞれ37.7kDおよび27.8kDの予測分子
量を有する蛋白をコ−ドする。ORF3とORF4（Meehan et al. 1998はWO−A−99182
14のORF7とORF10にそれぞれ対応するこ）はそれぞれ11.9および6.5kDの予測分子
量を有する蛋白をコ−ドする。これらのORFsの配列はGenbank からAF 055392で
入手可能である。これらは本発明のプラスミドに取り入れることができ、単独ま
たは組み合わせて、例えばORF1および／またはORF2と一緒に使うことができる。

【００１５】 1998年9月25日米国特許第09/161,092号（WO−A−9918214のCOLs 1−3および5,
6,8−9,11−12）に開示されている他のORFs 1−3および5,6,8−9,11−12も本明
細書に記載の条件下で使うことができ、上記定義のORF 1および2と組み合わせる
ことができる。

【００１６】 種々のPCV−2菌株から来るORF、特にORF 2からの均等な配列を使用することが
できる。相同物とは菌株1010の対応ORFと相同性を有するORF2および／またはORF
1を有するPCVから来る配列を意味する。Meehanに従うORF3では菌株ImplOlOのORF
3と80%以上、特に85%以上、好ましくは90%または95%以上の相同性といえる。Mee
han 1998のORF4の場合には、菌株Impl010のORF4と86%以上、特に90%以上、好ま
しくは95%以上の相同性といえる。

【００１７】 例えばWO−A−99 18214に開示のゲノムのヌクレオチド配列から標準のソフト
ウェア（例えばMacVectort）を用いてORFを決定することはル−チンの技術であ
る。また、菌株1010のゲノムを整合させ、菌株1010のORFと比較して他の菌株（
例えばWO−A−99 18214に開示のもの）のゲノムのORFを決定することは当業者が
容易にできることである。整合させ、ソフトウェアを使用することで過度の実験
なしに均等なORFに直接接近できる。

【００１８】 「プラスミド」とは、生体内でポリヌクレオチド配列の形で発現すべきPCV配
列とその発現に必要な要素とを含む任意のDNA転写単位を含む用語である。円形
プラスミド、ス−パ−コイル、その他が好ましい。直鎖形状のプラスミドも本発
明の範囲に含まれる。

【００１９】

【課題を解決するための手段】

本発明の対象はプラスミド、特にpJP109（PCV−2（図1）のORF2遺伝子を含む
）と、pJP111（PCV−2（図2）のORF1遺伝子を含む）と、pJP120（PCV−1（図3）
のORF2遺伝子を含む）と、pJP121（PCV−1（図4）のORF1遺伝子を含む）とよば
れるプラスミドにある。

【００２０】 各プラスミドは、宿主細胞において、その対照の下に挿入された遺伝子の発現
を確実にすることができるプロモ−タから成る。それは、一般に強い真核性のプ
ロモ−タおよび特に、ヒトまたはネズミの起源のまたは選択的にラットまたはモ
ルモットのような他の起源の、シトメガロウィルス早いプロモ−タCMV−IEであ
る。より一般に、プロモ−タがウイルス性起源の細胞の起源のある。CMV−IE以
外のウイルスのプロモ−タとして、SV40ウイルス早いか後のプロモ−タまたはRo
us SarcomaウィルスLTRプロモ−タは挙げられる。また、遺伝子（例えば遺伝子
へのプロモ−タ特性）が誘導されるウィルスからのプロモ−タであってもよい。
細胞のプロモ−タとして、デスミン・プロモ−タまたは代わりにアクチン・プロ
モ−タのような、サイトスケルトン遺伝子のプロモ−タでもよい。いくつかの遺
伝子が同じプラスミドに存在するときに、それらは同じ転写単位において、また
は二つの異なる単位において、提供されることができる。

【００２１】 プラスミドは、また、実施例、イントロンタイプのスタビライジング配列、好
ましくはウサギp−グロビン遺伝子のイントロンIIのために、例えば要素を統制
している他の転写から成ることができる(van Ooyen et al. Science, 1979,206:
337−344), 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ遺伝子によって、コ−ドされる
蛋白質のシグナル配列(tPA; Montgomery et a !. Cell. Mol. Biol. 1997,43: 2
85−292）、そして、ウシの成長ホルモン（bGH）遺伝子（US−A−5122458）の事
項のポリアデニル酸化シグナル（polyA）、または、ウサギの−グロビン遺伝子
。

【００２２】 本発明の対象は、また、免疫原の製剤およびDNAワクチンである本発明、PCV−
1またはPCV−2免疫原のコ−ドしているおよび発現する一つ、上記のORFsのうち
の好ましくは一つに従う少なくとも一つのプラスミドから成ること、それに加え
て、獣医学上許容範囲内であるビヒクルまたは、獣医学上許容範囲内であるアジ
ュバントを有する、選択的に、それに加えて、希釈剤。

【００２３】 本発明の対象は、特に免疫原の製剤およびワクチンであるPCV−1またはPCV−2
免疫原の一つをコ−ドし、発現する少なくとも一つのプラスミドを含むこと、組
成物は、アジュバント（特に、式の第四アンモニウム塩を含んでいるカチオンの
脂質）については配合した

【００２４】

【式２】

【００２５】 （ここで、 R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、 R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、 Xは水酸基またはアミン基を表す）

【００２６】 好ましくはDMRIE（N−（2− ヒドロキシエチル）−N（N）ジメチル−23− ビ
ス（テトラデシルオキシ）−1− プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）であ
り、中性脂質、例えばDOPE （ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン）と
組み合わされてDMRIE−DOPEの形になるのが好ましい。

【００２７】 好ましくは、このアジュバントを有するプラスミド混合物は使用の直前に作ら
れる。そして、好ましくは、その投与の前に動物にとって、したがって、生じる
混合物は、10から60分まで特に、30のための変動している期間の上の実施例のた
めの、錯体が時間を精密に計る形状に許される。

【００２８】 DOPEが現在（DMRIE）である時：DOPEモル割合は、95から好ましくは変動する
：5への5：95（特に1）：1. プラスミド：DMRIEまたはDMRIE−DOPEアジュバント重量割合は、特に、50から変
動できる：1への1：10からの事項の、10：1への1：好ましくは1：1から1まで、5
：2.

【００２９】 本発明の他の有利な型式によれば、アジュバントとして、化合物がポリマ−か
ら選んだアジュバントをアクリルに扱うことは可能であること、または、メタア
クリル酸および無水マレイン酸の、そして、アルケニル誘導体のコポリマ−。ポ
リマ−のアクリルのメタアクリル酸橋かけ特に、砂糖のポリアルケニル・エ−テ
ルを有するまたは多価アルコ−ルの好む。これらの化合物は、学術用語カルボマ
−（Pharmeuropa vol 8,No。1996年6月、2）によって、公知である。

【００３０】 当業者は、また、polyhydroxylatedされた化合物については橋かけされるこの
種のアクリル重合体を記述しているUS−A−2909462（引用したものとする）と称
することができる少なくとも三つのヒドロキシル基、好ましくはせいぜい8、少
なくとも三つのヒドロキシルの水素原子を有すること少なくとも二つの炭素原子
を有する不飽和の脂肪族ラジカルについてはとって代わられること。好適な基は
、それらが四つの炭素原子（例えば）に2を含むことである。

【００３１】 ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基。不飽和の基は、彼ら自身他の
置換基（例えばメチル）を含むことができる。学名Carbopol（GFグッドリッチ、
オハイオ、USA）の下に販売される産物は、特に適切である。それらは、アリル
・サッカロ−スについてはまたはアリルについては架橋されるペンタエリスリト
−ル。それらにおいて、Carbopolt 974P、934Pおよび971Pは挙げられることが可
能である。

【００３２】 無水マレイン酸の、そして、alkeny誘導体（EMAs&commat）のコポリマ−にお
ける、（モンサント）好む、無水マレイン酸のコポリマ−である。そして、エチ
レン（直鎖であるかまたは例えば橋かけされる）がジビニ−ルエ−テルについて
は橋かけした。関連は、J. Fields et al. Nature, 186:778−780,4 June 1960
（引用したものとする）に作られることが可能である。それらの構造の見解から
ポリマ−のアクリルのメタアクリル酸、そして、EMA及びcommat、好ましくは、
式に従う基礎的な単位から成る：

【００３３】

【式３】

【００３４】 （ここで、R₁とR₂はHまたはCH₃−を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、
x ＝ 0または1、好ましくはx ＝1であり、y ＝ 1または2で、x＋y ＝ 2) EMAs(登録商標)ではx＝ 0、y = 2であり、カルボマーではx = y = 1である。

【００３５】 水にこのポリマ−を溶解すると酸性溶液になるので、好ましくは、実際のワク
チンが取り入れられるアジュバント溶液を与えるために、生理学的なpHに中和す
る。ポリマ−のカルボキシル基は部分的にCOO−形になっている。本発明のアジ
ュバント溶液、特にカルボマ−の溶液では、好ましくは塩化ナトリウム存在下で
蒸留に溶かす。得られる溶液は酸性pHである。

【００３６】 この原液に必要な量の水を加えて所望の最終濃度まで薄めてアジュバントの溶
液を調製するのが好ましい。または、好ましくは生理的食塩水、好ましくはNaCl
を添加(9g NaC 9g/1)した生理的食塩水とNaOHで中和（pH 7.3〜7.4）する。生
理学的なpHのこの溶液は凍結乾燥するか、液状で凍った状態で保存され、プラス
ミドと混合するためにそのままに扱われる。 最終的なワクチン組成物のポリマ−濃度は0.01%〜2% w/v、特に0.06〜1% w/v、
好ましくは0.1〜0.6% w/vである。

【００３７】 特異的な実施例において、免疫原であるかワクチンの製剤は、PCV−2ORF1およ
びORF2をコ−ドし、発現するプラスミドのプラスミドまたは混合物から成る。

【００３８】 本発明はさらに、予防接種を有するブタ・シルコウイルスに対して他のブタ病
原体（特に、PMWS症候群と関連できるそれら）に対して予防接種を結合すること
を提供する。

【００３９】 例としては以下が挙げられる：仮性狂犬病ウイルス、ブタ・インフルエンザウ
ィルス、PRRS、ブタ・パルボウィルス、豚コレラウイルス、Actinobacilluspleu
ropneumoniae。 本発明の対象は、ブタ免疫原をコ−ドし、発現する最も少なく他のプラスミド
での少なくとも一つのプラスミドを含んでいる本発明のプラスミドの混合物であ
る、例えば仮性狂犬病ウイルスのグリコプロテインgBから成っているグル−プお
よびgDから選択される（仮性狂犬病ウイルスまたはPRV）ヘムアグルチニン、そ
して、ブタ・インフルエンザウィルスH1N1、ヘムアグルチニンおよびブタ・イン
フルエンザウィルスH3N2、ORF5およびLelystadおよびUSA菌株のPRRSウィルス、
ブタ・パルボウィルスのVP2蛋白質、E1および豚コレラウイルス（HCV）、apxI、
apxIIおよびActinobacillus pleuropneumoniaeからのapxIII遺伝子のE2蛋白質類
のORF3遺伝子のヌクレオプロテインのヌクレオプロテイン（WO−A−9803658のた
プラスミドを参照）。

【００４０】 それに加えて、上記のように獣医学上許容範囲内であるアジュバントについて
は、プラスミドのこれらの混合物は獣医学上許容範囲内であるビヒクルまたは希
釈剤において、選択的にとられる。このように、免疫原の製剤または多価のDNA
ワクチンを形成している。これらの製剤または多価ワクチンは、特に、好ましく
は上記のように、特定のDMRIEの、カチオンの脂質については配合されることが
できて、中性脂質、DOPE、形状へのDMRIE−DOPEに好ましくは接続させられるこ
とが可能である。 特定のブタGM−CSFにおいて、本発明（配合されるかまたはアジュバントについ
ては上記のように違っている）の製剤または一価性であるか多価のDNAワクチン
は、また、好ましくは好ましくはブタ起源のサイトカインで補われることができ
る。ブタGM−CSFのこの添加（顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、C
lark S. C. et al. Science 1987,230: 1229; Grant S. M. et al. Drugs, 1992
,53: 516)が、特に、製剤に結合することによって、またはワクチンにも実行さ
れることができるブタGM−CSF蛋白質またはブタGM−CSF遺伝子をコ−ドし、発現
するプラスミド（Inumaru S. andTakamatsu H. Immunol。Cell。Biol.（1995,73
：474−476）。

【００４１】 好ましくは、ブタGM−CSF遺伝子は、それらがPCV免疫原または他のブタ免疫原
をコ−ドすることと、異なるプラスミドに挿入される。 特に、ブタGM−CSFをコ−ドし、発現するプラスミドは、プラスミドpJP058（図5
）であってもよい。

【００４２】 本発明の免疫原の製剤および一価性であるか多価のDNAワクチンは、また、少
なくとも一つの従来のワクチン（生を弱めた、機能させなくされたサブユニット
）については結合でもよいまたは異なるか同一である少なくとも一つのブタ病原
体にあてる組換え型ワクチン（ウイルス性ベクタ−）。本発明が、特に、アジュ
バント−含んでいる従来のワクチンを有する組み合わせのために、提供する（生
（インアクチベタ・サブユニット）を弱めた）。機能させなくされたサブユニッ
ト・ワクチンのために、特に、ただであるかサポニンについては混合したアルミ
ナゲルを含んでいるそれらはアジュバントとして挙げられることが可能である、
または、それらは油−水乳濁液の形で配合した。

【００４３】 本発明の対象は、また、本発明のシルコウイルスの方へブタの免疫応答を誘発
することを可能にする免疫化の方法である。その対象は、特に、ブタに効果的で
あるワクチン接種法である。免疫化および予防接種のこれらの方法は、上記のよ
うに製剤の一つのまたは一価性であるか多価のDNAワクチンの一つの投与から成
る。免疫化および予防接種のこれらの方法は、これらの製剤またはDNAワクチン
の一つ以上の連続した投与量の投与から成る。免疫化のこの方法のまたは、ポリ
ヌクレオチド予防接種のための従来技術において、提案される投与の種々の経路
による、予防接種の状況において、製剤およびDNAワクチンを、投与できる特に
、および公知の投与手技によって、筋肉内のおよび皮内の経路針を有する注射器
を有する特定の注射の、液体ジェットによって、（Furth et al. AnalyticalBio
ch., 1992,205: 365−368) または、金の投射によって、粒子がDNAについては被
覆したこと（Tang et al. Nature, 1992,356: 152−154)。この方法成人ブタへ
の投与のための許すだけである雌以外のまた、若いものに、そして、妊娠するこ
とに、後者の場合、これは新生児（母性の抗体）の上へ受身免疫を授けることを
、特に、可能にする。好ましくは、雌ブタは、増殖の前に予防接種をされる、お
よび／または役に立つことの前におよび／または妊娠の間。

【００４４】 好ましくは、接種が給仕およびそれの前にされる少なくとも1は、妊娠の間、
実行される接種によって、好ましくは従われる、mid−gestation（妊娠の6−8週
間ころに）ころのおよび／または妊娠（妊娠の11−13週間ころに）の終わりに、
例えば。したがって、有利な規制飼育は、役に立つことの前の接種および妊娠の
間のブ−スタ接種である。その後で、再接種が各役に立つ前におよび／または妊
娠の間、mid−gestationころにおよび／または妊娠の終わりにあることができる
。好ましくは、再接種が妊娠の間、ある。

【００４５】 子豚（例えば予防注射をされた雌（ここで、論議されるように、例えばは接種
した）からの子豚）は、継続期間の最初の週以内で予防接種をされる、例えば接
種が、償うおよび／または2および／または3および／または4および／または5週
間の継続期間。好ましくは、子豚は継続期間の最初の週以内でまたは継続期間（
離乳の時点で、例えば）の第3の週以内で最初に予防接種をされる。好ましくは
、この種の子豚は、それから2〜4週間後に押し上げられる。

【００４６】 本発明のワクチンにおいて使われるDNAの量は好ましくは約50μg〜約1000μg
、特に約10μg〜約2000μgである。当業者は、正確に各免疫化または予防接種プ
ロトコルのために使われるDNAの効果量を定義するのに必要な応答能を有する。

【００４７】 投与量容積は好ましくは2〜3ml、特に0.5〜5mlにすることができる。免疫化の
または予防接種の好適な方法は、筋肉内の経路によって、本発明のDNAワクチン
の投与に本質がある。 以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定
れるものではない。

【００４８】

【実施例】

クロ−ニングORFsで使うPCV−2菌株は、たとえばECACCで寄託された受入れ番
号V97100219（Impl008）,V97100218（ImplOlO）およびV971G0217（Imp999）(こ
れは1997年10月2日に寄託された)、V98011608（ImplO11'48285）およびV9801160
9(Imp1011−48121) （これは1998年1月16日に寄託された）菌株である。以下の
実施例は菌株Imp1010を使用して作った。当業者は他のPCV−2菌株に適応させる
ことが可能である。

【００４９】実施例1 プラスミドpJP109の構築 EcoRI断片の形でPCV−2ウィルスのゲノムを含むプラスミドpGEM7Z−Impl010 S
toon−EcoRI No.14 (B. Meehan et al. J. Gen. Virol.1998.79 2171−2179)を
EcoRIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動の後、1768の塩基対（bp）のEcoRIEco
RI断片を分離した。この断片を自己リゲ−トした。PCV−2ウィルス菌株1010−St
oon (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1998.79.2171−2179のORF2遺伝子、Gen
Bank配列寄託番号AF055392)は、自己リゲ−トしたEcoRI−EcoRI断片から成るひ
な型を用い、下記オリゴヌクレオチドのPCR法（PCR）法により増幅した：

【００５０】 JP779（配列番号 1）（35mer）： 5'CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3' JP780（配列番号 2）（36mer）： 5'TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3'

【００５１】 730bp PCR断片を得る。この断片をSalIおよびBglIIで消化し、アガロ−スゲル電
気泳動の後、715bp SalI−BglII制限断片を単離する。この断片はプラスミドpVR
1012（Hartikka J. wt al Human Gene Therapy. 1996.7.1205−1217）でリゲ−
トされ、予めSalIおよびBglIIで消化して、プラスミドにpJP109（5567pb）（図1
）を得る。

【００５２】実施例2 プラスミドpJP111の構築 プラスミドpGem7Z−Impl010−Stoon（Example 1を参照）について PCR法を実
行し(B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1998.79.2171−2179)、下記オリゴヌク
レオチドを用いた：

【００５３】 JP781（配列番号 3）（35mer）： 5'CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3' JP782（配列番号 4）（36mer）： 5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3' PCV−2ウィルスのORF1遺伝子を含む970bp PCR断片を得た。この断片をSalIおよ
びBglIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動の後、955bp SalI−BglII制限断片を
単離した。この断片をプラスミドpVR1012（実施例1）でリゲ−トして、プラスミ
ド（実施例２）を得た。

【００５４】実施例３ プラスミドpJP120（PCV−1ORF2）の構築 プラスミドpPCVl (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997. 78.221−227) に
ついてPCR法を実行し、下記オリゴヌクレオチドを用いた：

【００５５】 JP783（配列番号 5）（35mer）： 5'CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3' JP784(配列番号 6）（40mer）： 5'TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3'

【００５６】 PCV−1ウィルスのORF2geneを含む730bpの PCR断片（PK−15菌株、GenBank配列寄
託番号U49186）を得る。この断片をSalIおよびBglIIで消化し、アガロ−スゲル
電気泳動の後、715bp SalI−BglII制限断片を単離する。この断片をプラスミドp
VR1012（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドにpJPl20（5565bp）（図3）を得る
。

【００５７】実施例4 プラスミドpPCVl（PCV−1 ORF1）の構築 PstI断片の形でPCV1ウイルスゲノムを含むプラスミドpJP121 (B. Meehan et a
l. J. Gen. Virol. 1997,78,221−227)をPstIで消化し、アガロ−スゲル電気泳
動の後、1759塩基対（bp）PstI−PstI断片を分離する。この断片を自己リゲ−ト
する。PCV−1ウィルス菌株PK−15のORF1遺伝子（E. Meehan et al. J. Gen. Vir
ol. 1997,78,221−227、GenBank配列寄託番号U49186）は、自己リゲ−トされたP
st−pst断片から成るひな型を用い、下記オリゴヌクレオチド２からPCR法（PCR
）で増幅した：

【００５８】 JP785（配列番号 7）（35mer）： 5'CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3' JP786（配列番号 8）（36mer）： 5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3'

【００５９】 PCV−1ウィルス（菌株PK−15）のORF1遺伝子を含む955bp PCR断片を得る。この
断片をSalIおよびBglIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動後、946 bp SaiI−Bg
lII制限断片を分離する。この断片をプラスミドpVR1012（実施例1）でリゲ−ト
し、プラスミドpJP121（5804bp）（図4）を得る。

【００６０】実施例5 プラスミドpJP058（ブタGM−CSF）の構築 頸静脈からEDTAを含んでいる管を通じてブタ血液を集める。単核化した細胞を
フィコ−ル勾配の遠心分離で回収し、RPMI 1640培地（Gibco−BRL）でインビト
ロで培養する。約５μgの終濃度/培地mlにconcanavaline A（シグマ）を添加し
て刺激する。72時間刺激した後、リンパ芽球を回収し、細胞の全RNAを抽出キッ
ト"MicroScale Total RNA Separator Kit" (Clontech)でこのメーカの推薦方法
に従って抽出する。

【００６１】 逆転写反応はキット"lst−Strand cDNA Synthesis Kit (Perkin Elmer)」を
用いて行い、リンパ芽球から抽出される全RNAに下記オリゴヌクレオチドを用い
てPCR法を実行した：

【００６２】 RG972（33mer）（配列番号.9）： 5'TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3' RG973（34mer）：（配列番号.10） 5'TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3'

【００６３】 約450の塩基対（bp）のPCR断片を得る。この断片をNotIで消化し、アガロ−スゲ
ル電気泳動後、450bp NotI−NotI断片を分離する。この断片を好ましくはNotIで
リゲートしたプラスミドpVR1012（実施例1）で消化し、脱ホスホリル化し、プラ
スミドpJP058（5405bp）（図5）を得る。

【００６４】 pGM−CSF遺伝子配列をプラスミドpJP058でクロ−ニングし、検査した結果、Ge
nBankデ−タベ−ス（寄託番号D21074）で入手可能なものと同一であることがわ
かる。

【００６５】実施例6 ブタ予防接種用精製プラスミドの生産 大腸菌K12バクテリアの（菌株DH10BまたはSCS1）を実施例1〜５のプラスミドp
JP109、pJPlll、pJP058、pJP120およびpJP121で変性する。５つのプラスミドか
ら得られる５つの形質転換クロ−ンを+37℃でLuria−Broth (LBの)培地で振盪培
養する。培養細菌を対数期の終わりに収穫し、プラスミドをアルカリ溶解技術に
従って抽出する。抽出されたプラスミドをSambrook et al. (Molecular Biology
: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, Cold Spring HarborLaboratory,
Cold Spring Harbor, NYにに記載の技術に従って、塩化セシウム勾配で精製する
。エチジウムブロミドの最終抽出および絶対エタノ−ル存在下での沈降後に得ら
れる精製されたプラスミドをTE緩衝液、1mMトリス/EDTA、pH 8.0に再懸濁し、l
ｍｌ当たり2mgのプラスミドを含む原液を得る。この原液は−20℃で使用時るで
保存する。

【００６６】実施例7 PCV−2ウィルスのORFs 1および2の発現（対照） 対照としてPCV−2 ORF2およびPCV−2 ORF1遺伝子の発現産物をそれぞれプ
ラスミドpJP109およびpJPlllでクロ−ニングする。これらのプラスミドはトラン
スフェクションキット（Lipofectamine Plus (登録商標)、Gibco−BRL、Catalog
ue&num、10964−013）を用い、メーカ推薦の方法に従ってCHO−K1（中国Hamster
Ovary）細胞（ATCC番号CCL−61）に形質移入した。

【００６７】 48時間トランスフェクションの後、トランスフェクション細胞を蒸留水に通し
、3分間の氷温の95%アセトン溶液で室温で固定した。PCV−2 ORF1蛋白質類（F19
9 1D3GAおよびF210 7G5GD）およびORF2蛋白質類（F190 4C7CF、F190 2B1BCおよ
びF1903A8BC）のための５つのモノクロ−ナル抗体特性を最初の抗体として用い
た。抗マウス免疫グロブリンG接合体（Cy3についてはラベルをつけられる）が、
使われた特異的な標識付けを表すこと。APCV−2特異的な蛍光は、細胞の三つのP
CV−2 ORF2モノクロ−ナルについては観測されたプラスミドpJPlllについては形
質移入されるそれらの以外でない、プラスミドpJP109については形質移入した。
対照的に、PCV−2特異的な蛍光は、プラスミドpJPlllについては形質移入される
が、それらにおいて、プラスミドpJP109については形質移入されない細胞の二つ
のPCV−2 ORF1モノクロ−ナルについては観測された。inCHO細胞がプラスミドpV
R1012についてはまたは非trarsfectedされたCHO細胞において、単独で形質移入
したPCV−2モノクロ−ナルについては、蛍光は検出されなかった。同じ発現結果
は、PCV−2ウィルスのためのポリクロ−ン性の血清特性については得られた。

【００６８】 この場合、フルオレセインのラベルが付いた坑ブタ免疫グロブリンG接合体は
、特異的な蛍光を検出するために用いた。蛍光は、プラスミドpVR1012について
はまたは非形質移入されたCHO細胞において、単独で形質移入されるこのポリク
ロ−ン性の血清inCHO細胞については検出されなかった。

【００６９】実施例8 ブタへの裸ＤＮＡの予防接種 8.1 誕生１日目の子豚 カーサリアンで得たブタのグループをプロトコルのDO（一日目）に分離単位に
置いた。これらの子豚には2日にプラスミドの各種ワクチン溶液を筋肉内経路で
予防注射した。ワクチン溶液は無菌生理的食塩水（0.9% NaCl）に原液を薄めて
調製した。各子豚には下記を予防注射した： プラスミドpJP109単独 プラスミドpJP109およびpJP111の混合物 プラスミドpJP109およびpJP058の混合物 プラスミドpJP109、pJP111およびpJP058の混合物 ワクチン溶液は各プラスミドの500μｇから成る。 容積：ワクチン溶液は、2mlの全容積を筋肉内経路で注射する。予防接種（1−2
日）では子豚の首の各側面に（= 2×1ml）注射した。

【００７０】 二回のワクチン注射は2週の間隔で実行した（すなわちプロトコルのD2とD14）
。抗原投与はビルレントなPCV−2菌株のプロトコルまたはウイルスのサスペンシ
ョンを鼻噴投与した（D21）。その後、離乳後全身消耗症候群の特異的な臨床徴
候を観察するために子豚を3週間モニターした。モニタ−した徴候は以下の通り
：

【００７１】 直腸温： 最初の14日、その後は抗原投与後第3週まで毎日測定。 重量：抗原投与直前と、抗原投与後3週間、１週間に１回子豚を秤量。 ウイルス血症／抗体検査用血液サンプルの収集： D2、D14、D21、D28、D35、D4
2に血液サンプルを採取。 検死： 生き残ったブタは病変を捜すためにD42に屠殺し、病理解剖し、肝臓、
リンパ節、脾臓、腎臓および胸腺から組織を取り、組織の障害を調べた。

【００７２】 8.2 5〜7周齢のブタ 旧7−週間子豚への週旧子豚5、PCV−2ウィルスのために特異的なもはや有し
ていない母性の抗体は、筋肉内の経路によって、予防注射をされる： プラスミドpJP109だけ プラスミドpJP109およびpJP111の混合物 プラスミドpJP109 andpJP058の混合物 プラスミドpJP109、pJP111およびpJP058の混合物 これらは実施例8.1（プラスミドにつき500のμｇ）において、指示を出したよ
うに、ワクチンの投与量は同じものである。ワクチンの溶液は、2ml（首筋への
、2mlの単独投与）の容積の筋肉内の経路により注射される。

【００７３】 二回の予防接種は、21日の間隔（DOおよびD21）で実行される。抗原投与は、
最後の予防接種（D35）の後、ビルレントなPCV−2菌株のウイルスのサスペンシ
ョンの筋内投与によって、14日を作られる。 各ブタは、それから子豚の全身消耗症候群の特異的な臨床徴候を見るための8
週間間モニタ−される。観測の全持続期間が今度は8週間であることを除いては
、抗原投与の後の子豚の臨床監視結果は実施例8.1に記載されているそれに同一
である。

【００７４】実施例9 DMRIE−ドープしたDNA断片でのブタの予防接種 実施例8に記載の裸のプラスミドＤＮＡ溶液の代わりに、DMRIE−ドープしたプ
ラスミドＤＮＡの溶液を使用することができる。ＤＮＡ溶液（実施例6の一種以
上のプラスミドを含む）を1mg/ml、0.9% NaClで調製する。0.75mMでのDMRIE−DO
PE溶液は、滅菌蒸留水の適切な容積のDMRIE−DOPEの生理食塩水で取り調製する
。

【００７５】 プラスミドＤＮＡ−カチオンの脂質錯体の化成は、等しい部分（0.9% NaClの1
mg/mlでのDNA溶液を有する0.75mMでのtheDMRIE−DOPE溶液）において、薄くなる
ことによって、成し遂げられる。気泡の化成を避けるためにカチオンの脂質溶液
を含んでいる小びんの内壁に沿って、26G針については取り付けられる注射器を
用いて、DNA溶液は、徐々に導かれる。二つの溶液が混合しているとすぐに、穏
やかな振盪は実行される。DNAの0.375mM DMRIE−DOPEおよび500のRg/mlから成っ
ている組成物は、最後に得られる。全ての上記した運営のための室温であること
は、使われる全ての溶液には望ましい。DNA/DMRIE−DOPE錯体生成は、30分間の
室温でブタを免疫する前に実行される。

【００７６】 それからブタに実施例8.1および8.2に記載の条件で予防注射する。

【００７７】実施例10 子豚の予防接種とその結果 第1実験 ： 3〜4匹の子豚（caesarianから入手）の0日をアイソレ−タに入れた。子豚には
日2にpJP109単独またはpJP109 ＋pJP111プラスミド混合物を予防注射した。対照
群には生理学溶液を投与した。各プラスミドは無菌の生理溶液（NaCl 0,9%）に2
50 μg/（μl最終濃度）で希釈した。2ml容積は、1ml（1つを首の各側面）の二
つの先端の筋注経路により注射される。ワクチンまたはプラセボの第2の注射は
、投与された日14である。DNAを有する予防接種は子豚によって、よく我慢され
る。そして、予防接種への副作用のための証明は強調されない。子豚は、PCV−2
ウイルス性サスペンション（各外鼻孔の1ml）の口鼻投与による抗原投与日21で
ある。抗原投与の後、週に一度子豚の重さを量る。直腸温は日17,21,22,24,27,2
9,31,34、37,41,44に記録する。日44の糞便のスワブは、落ちている各子豚PCV−
2から集められる。ウィルスは、検出されて、量的なPCRによって、定量化される
。日45の剖検は実行される。そして、組織サンプルはウィルス単離のために集め
られる。

【００７８】臨床症状 グル−プ間の平均の生地体重増加または平均の体温のための有意差が、ない。
総体の所見だけがブタにおいて、停止反応で強調した剖検病変 ： 気管支のリンパ節症である。病変は、以下の基準を一致させて記録される。

【００７９】 0 =リンパ節が見えるが拡大でない。 １=わずかなリンパ節拡大、気管支のリンパ節に限られる ２=適度なリンパ節拡大、節は気管支のリンパに制限 ３=激しいリンパ節拡大、長時間の気管支であるsubmandibullar prescapsularお
よびinguinallymph節。 stdは標準偏差の省略である。 Nは各グル−プの動物の数である。

【００８０】

【表１】

【００８１】 N = 各グル−プの子豚の数 リンパ節病変の低下が4匹中3匹の子豚において観測されるpJP109およびpJP109
およびpJP111プラスミド混合物については免疫される1匹の外の3匹の子豚につい
ては免疫した。この相違は、標準偏差（std）の高い値のために有意でない（p >
0.05）。

【００８２】リンパ節組織中のウィルス負荷 ： 量的なウィルスre−isolationは、気管支のおよび腸間膜のリンパ節から調製
される組織ホモゲネ−トに実行される。提示されるデ−タは、論理のトランスフ
ォ−メ−ションの後、組織ホモゲネ−トのウィルス力価に対応する。

【００８３】

【表２】

【００８４】 気管支のリンパ節は、最も感染のウィルスを含むようである。ウイルスの荷重
の低下は、気管支のおよび腸間膜のリンパ節において、子豚から観測されるpJP1
09かpJP109＋pJP111プラスミド混合物については免疫した。この低下が、有意で
ある（プラスミド混合物のためのp < 0.05。

【００８５】ウイルスの排出 ： ポスト抗原投与糞便のスワブは、確認されるPCRによって、PCV−2 orf2の増幅
に基づいてPCV−2をscheddingするための。 各検定は、2mlのサンプル上の三つ組の一つにおいて、実行される。Unvaccinate
dされた対照は、PCRの妥当性を確かめている抗原投与の後の従来の抗原投与およ
び正が分析するPCV−2のためのネガ型である。 値が、loglo（二つのulサンプルの分子数ofPCV−2 DNA）として発現される。

【００８６】

【表３】 グル−プ間の相違は、有意でない（p > 0.05）。

【００８７】第2実験 14週齢の通常の子豚（各グル−プ毎に８匹）を二回の投与で免疫した（pJP109
と、pJPlllプラスミド＋DMRIE DOPE混合物とを日0および日20）。各投与では2ml
を首側に筋注経路で耳の後に注射した。ワクチン組成物は、各プラスミドのため
の250ig/生理学的な溶液（0,9% NaCl）および0.375mM DMRIE DOPEのmlである。

【００８８】 対照群の子豚は生理学溶液を注射される。子豚には日32に口鼻経路（5mlのPCV
−2ウイルス性サスペンションを抗原投与した（各外鼻孔の注射器を有する105*6
TCID50/mlタイタ−）。 子豚は、臨床症状、へばり、おう吐物、呼吸困難、咳、食欲不振および高体温
のためにモニタ−されるよりゆっくり（直腸温は、28日ポスト抗原投与の間の記
録された毎日である）栽培（子豚は、重さを量られた日32、40、46、53、60であ
る）。徴候は、以下の基準を一致させて記録される：付属書l （1匹の子豚のた
めの評点は、観測の異なる日に対応する評点の合計に等しい）日60の剖検は実行
される。そして、病変は以下の基準を一致させて記録される：付属書2 （1匹の
子豚のための評点は、観測される各器官に対応する評点の合計に等しい）特定の
リンパ節において、組織サンプルは、集められる。

【００８９】 直腸スワブをウイルス排出を調べるために集めた（日32、39、42、46、49、53
、56、60）。

【００９０】 臨床症状： 臨床的症状の有意な低下が対照と比較して免疫された子豚のグル−プに観測さ
れる。対照群1ではPMWS徴候で死んだが、予防注射をされた子豚グル−プは死な
なかった。

【００９１】

【表４】 （Kruskal−Wallisテスト p < 0.01）

【００９２】 抗原投与後の高体温の持続期間での有意な低下が免疫された子豚（p：0.05）
のグル−プにおいて観測される。

【００９３】

【表５】

【００９４】 毎日の体重増加は抗原投与後は予防注射をされたグル−プおよび対照グル−
プとの間に差はない。

【００９５】病変検死 ： 病変の有意な差が特にリンパ節症（p # 0.05）で対照と比較して免疫された子
豚において観測される。

【００９６】

【表６】

【００９７】リンパ節組織のウィルス負荷 ： 腸間膜のおよび縦隔のリンパ節のウィルス負荷が免疫化学により決定される。
以下の基準が、評点のために使われる： 0 = 蛍光なし 1 =いくつかの器官スライド上にいくらかの蛍光が見える。 ２= 約１つの器官が蛍光。 ３= 全てが螢光性器官。

【００９８】 ウィルス負荷の有意な差が免疫されたグル−プ（p < 05）に観測される。

【表７】

【００９９】ウイルス排出 搬出スワブがPCV−2のPCRで確認される。

【０１００】 結果は、以下の基準で記録した： ０＝PCV−２なし １＝PCV−2存在

【０１０１】 免疫されたグル−プ大便の38%にPCV−2が存在、これに対して、対照群の子豚
の排出物では88%。ウイルス性排出の持続期間は、対照と比較される予防注射を
されたグル−プにおいて大幅に減少している。

【０１０２】

【表８】

【０１０３】 本発明が実施例に限定されるものではなく、本発明の精神を逸脱しない限り、
種々偏向することができるということは理解されなければならない。

【０１０４】 ANNEXE 1：

【表９】

【０１０５】 ANNEXE 2：

【表１０】

【０１０６】 添付配列表は下記を表す： 配列番号.1：オリゴヌクレオチドJP779 配列番号.2：オリゴヌクレオチドJP780 配列番号.3：オリゴヌクレオチドJP781 配列番号.4：オリゴヌクレオチドJP782 配列番号.5：オリゴヌクレオチドJP783 配列番号.6：オリゴヌクレオチドJP784 配列番号.7：オリゴヌクレオチドJP785 配列番号.8：オリゴヌクレオチドJP786 配列番号.9：オリゴヌクレオチドRG972 配列番号.10：オリゴヌクレオチドRG973

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpJP109の図

【図２】 プラスミドpJP111の図

【図３】 プラスミドpJP120の図

【図４】 プラスミドpJP121の図

【図５】 プラスミドpJP058の図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ペレ，ジェニファー，マリア アメリカ合衆国 12062 ニューヨーク イースト ナッソー スミス ヒル ロー ド 27 (72)発明者 シャレール，カテリーヌ，エリザベス フランス国 69720 サン−ロラン ドゥ ムレ リュ フェルデナンド ゴチエ 42 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 AA13 AA14 BA35 CA01 DA01 DA19 MA05 NA05 NA14 ZB072 ZC612 4C085 AA03 AA38 BA51 CC01 CC08 EE01 EE06 FF17 FF18

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 PCV−2のORF1、PCV−2のORF2、PCV−1のORF1およびPCV−1のOR
   F2から成る群の中から選択される遺伝子をコ−ドし、発現するプラスミドと、こ
   の遺伝子の発現産物に対する免疫応答を増加することができる要素とからなる免
   疫原製剤またはワクチン。
2. 【請求項２】 免疫応答を増加させることができる要素が下記の［式１］のカ
   チオン脂質から成るアジュバントである請求項1に記載の免疫原製剤またはワク
   チン： 【式１】 （ここで、 R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、 R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、 Xは水酸基またはアミン基を表す）
3. 【請求項３】 カチオン脂質がDMRIEである請求項2に記載の免疫原製剤または
   ワクチン。
4. 【請求項４】 DMRIEと中性脂質とを組み合わせた請求項3に記載の免疫原製剤
   またはワクチン。
5. 【請求項５】 DMRIEとDOPEとを組み合わせた請求項4に記載の免疫原製剤また
   はワクチン。
6. 【請求項６】 免疫応答を増加させることができる要素がカルボマ−から成る
   アジュバントを含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。
7. 【請求項７】 免疫応答を増加させることができる要素がブタサイトカインを
   含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。
8. 【請求項８】 ブタサイトカインがGM−CSFである請求項7に記載の免疫原製剤
   またはワクチン。
9. 【請求項９】 ブタサイトカインをコ−ドし、発現するプラスミドを含む請求
   項7または8に記載の免疫原製剤またはワクチン。
10. 【請求項１０】 免疫応答を増加させることができる要素がブタサイトカイン
    と、DMRIE、DMRIE/DOPEおよびカルボマ−から成る群の中から選択されるアジュ
    バント化合物とを含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。
11. 【請求項１１】 他のブタの免疫原をコ−ドし、発現するプラスミドを含む請
    求項１〜10のいずれか一項に記載の免疫原製剤またはワクチン。