ES2302496T3 - Genes de calicivirus felino y vacunas recombinadas que los contienen. - Google Patents
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Abstract
Fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 6.
Description
Genes de calicivirus felino y vacunas
recombinadas que los contienen.
La presente invención trata de genes de cepas
concretas de calicivirus felinos, de las proteínas codificadas por
estos genes y de su uso en la realización de preparados
inmunogénicos y vacunas recombinadas o de subunidades contra la
calicivirosis felina. Estos preparados inmunogénicos y estas vacunas
también pueden combinarse con preparados inmunogénicos o con
vacunas preparadas a partir de otros agentes patógenos felinos, para
realizar preparados inmunogénicos y vacunas polivalentes.
Los calicivirus felinos (en inglés Feline
Calicivirus o FCV) fueron descritos por primera vez en 1957
(Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 382-389).
Los calicivirus felinos son junto con los herpesvirus felinos las
dos fuentes principales de afecciones víricas del tracto
respiratorio superior en el gato. Los virus FCV afectan a un gran
número de animales, con índices de portadores del FCV del orden del
15 al 25% y con una seroprevalencia anti-FCV del 70
al 100% (Coutts y otros, Vet. Rec. 1994. 135.
555-556; Ellis T.M. Australian Vet. J. 1981. 57.
115-118; Harbour y otros, Vet. Rec. 1991. 128.
77-80; Reubel y otros, Feline Dendistry 1992. 22.
1.347-1.360). Tras una fase inicial de hipertermia,
estas afecciones respiratorias suelen acompañarse de ulceraciones
bucales (paladar, lengua, labios, nariz), de rinitis, de
conjuntivitis, eventualmente de anorexia y de astenia. Los virus
FCV también pueden causar neumonías, enteritis y dolor articular
(síndrome de cojera).
La transmisión del virus FCV sólo se lleva a
cabo horizontalmente, no hay transmisión vertical de la madre a su
cría durante la gestación (Johnson R.P. Res. Vet. Sci. 1984. 31.
114-119). La transmisión del FCV se hace por
contacto entre animales infectados y animales sanos o por vía aérea
al estornudar (Wardley RC. Arch. Virol. 1976. 52.
243-249).
Los calicivirus felinos son virus desnudos de la
familia de los Caliciviridae, están provistos de un ARN positivo de
una sola hebra, con un tamaño de aproximadamente 7,7 kilo pares de
bases (kpb) (Carter M.J. Arch. Virol. 1994. 9.
429-439).
Igual que muchos virus de ARN, existe una gran
heterogeneidad dentro de la población vírica del FCV. Las
variaciones antigénicas, evidenciadas desde principios de la década
de 1970 con experimentos de seroneutralizaciones cruzadas, permiten
clasificar los FCV en muchas cepas víricas o casi especies (Radfoord
y otros, Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997.
93-99).
Se han aislado y secuenciado varias cepas de
FCV, en particular la cepa F9 (Carter y otros, Arch. Virol. 1992.
122. 223-235, secuencia depositada en la base de
datos GenBank con el número de adquisición M86379), CFI (Neill y
otros, J. Virol. 1991. 65. 5.440-5.447, número de
adquisición GenBank U13992 y M32819), Urbana o URB (Sosnovtsev et
Green Virology 1995. 210. 383-390, número de
adquisición GenBank L40021), F4 (Tohya y otros, Arch. Virol. 1991.
117. 173-181, números de adquisición GenBank D31836
y D90357), KCD (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18.
882-889, número de adquisición GenBank L09719), LLK
(número de adquisición GenBank U07131), NADC (número de adquisición
GenBank L09718), 2280 (número de adquisición GenBank X99445) y 255
(Kahn y Gillepsie, Cornel Vet. 1970. 60. 669-683,
número de adquisición GenBank U07130).
La vacuna contra el FCV fue puesta en
circulación a finales de la década de 1970 a partir de cepas
atenuadas de FCV, principalmente de la cepa F9 aislada en 1958 por
Bittle (Bittle y otros, Am. J. Vet. Res. 1960. 21.
547-550) o de cepas derivadas de F9 mediante paso
in vitro o in vivo
("F9-like").
También se hallan disponibles vacunas
inactivadas. Utilizan las cepas 255 y 2280, aisladas respectivamente
en 1970 en un gato que padecía una neumonía (Kahn y Gillepsie,
Cornell Vet. 1970. 60. 669-683) y en 1983 en un
gato que sufría cojera (Pedersen y otros, Fel. Prac. 1983. 13.
26-35).
La respuesta humoral se dirige fundamentalmente
contra la proteína de la cápside, también llamada p65 (Guiver y
otros, J. Gen. Virol. 1992. 73. 2.429-2.433). Los
genes que codifican la proteína de la cápside de numerosos
calicivirus felinos han sido secuenciados y comparados sin que
puedan distinguirse más particularmente determinadas secuencias
(Glenn y otros, Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997.
106-110; Geissler y otros, Virus Res. 1997. 48.
193-206; Neill y otros, Proc. 1st Int. Symp.
Caliciviruses ESVV 1997. 120-124).
El gen que codifica la proteína de la cápside
también ha sido clonado y expresado en distintos sistemas de
expresión, en particular el gen que codifica la proteína de la
cápside del virus FCV KS20 en plásmidos (Geissler y otros, J.
Virol. 1999. 73. 834-838), los genes que codifican
las proteínas de la cápside de los virus FCV
CFI-68, JOK63, JOK92, LS012 y F9 en baculovirus
(DeSilver y otros, Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997.
131-143), el gen que codifica la proteína de la
cápside del virus FCV F4 en herpesvirus felinos de tipo 1 (Yokoyama
y otros, J. Vet. Med. Sci. 1998. 60. 717-723). Estas
distintas construcciones han permitido la producción de proteínas
de la cápside recombinadas.
A causa de la deriva antigénica a lo largo del
tiempo, los antisueros producidos contra antiguas cepas vaccíneas
aisladas en las décadas de 1960-1970, tales como las
cepas F9, 255 o 2280, sólo neutralizan unas pocas muestras de la
década de 1990. Por ejemplo, el suero anti-F9
neutraliza el 43% de las muestras del período de
1990-96, frente al 56% en el período
1980-89 y el 86% en el período de
1958-79, y solamente el 10% de las muestras
inglesas del período de 1990-96 (Lauritzen y otros,
Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63).
La presente invención tiene por objetivo poner
de relieve la existencia de cepas de FCV, que en gatos inducen
anticuerpos que tienen un amplio espectro de neutralización
cruzada.
La invención tiene en particular como objetivo
aislar y caracterizar genes, a partir de cepas seleccionadas, que
codifiquen proteínas inmunogénicas utilizables para vacunar contra
la calicivirosis felina.
Otro objetivo de la invención es proponer
vectores de expresión recombinados in vitro e in vivo
que contengan y expresen por lo menos una secuencia de nucleótidos
de este tipo.
Aun otro objetivo de la invención es proponer
preparados de inmunógenos o de vacunas contra la calicivirosis
felina.
Aun otro objetivo de la invención es proponer
preparados de inmunógenos polivalentes o de vacunas polivalentes
contra la calicivirosis felina y contra por lo menos otro organismo
patógeno felino.
La invención se refiere fundamentalmente a dos
cepas FCV obtenidas por legrados faríngeos llevados a cabo en
Francia y el Reino Unido en gatos con signos de infección por
calicivirus felinos. Se trata respectivamente de la cepa G1
(depositada en la Colección nacional de cultivos de microorganismos
(o CNCM) del Instituto Pasteur de París, Francia, bajo el número de
adquisición I-2167) y de la cepa 431 (depositada en
la CNCM bajo el número de adquisición I-2166),
depositados ambas el 12 de marzo de 1999. Esta cepa FCV G1 aislada
en Francia no corresponde a la cepa FCV aislada por Tohya en 1978
en el Reino Unido (Tohya Y. y otros, Jpn. J. Sci., 1990, 52,
955-961) y también llamada G1.
La selección de cepas FCV 431 y G1 se ha llevado
a cabo mediante pruebas de seroneutralización cruzada frente a
muestras FCV de un panel de muestras de referencia. Este panel de
muestras de referencia está compuesto por 18 muestras actuales de
FCV extraídas de gatos que presentan signos de infección por
calicivirus felino y procedentes de tres zonas geográficas
distintas. 7 de las muestras son norteamericanas, estas muestras se
identifican como RMI1, RMl2, RMl3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMl9. Otras 7
muestras son francesas, se denominan A2, F1, G1, G3, F3031,
H3-2 y H1-4. Las últimas 4 muestras
son inglesas, se denominan 431, 388b, 337 y J5.
Las cepas de la muestra pueden obtenerse del
depositante con una simple petición. También han sido publicadas en
un artículo de la revista "Archives of Virology" (Poulet y
otros, Arch. Virol., febrero del 2000. 145 (2).
243-261), disponible en línea en Internet a partir
de la fecha del depósito.
Tras las pruebas de seroneutralización cruzada
entre las 18 muestras de FCV del panel de muestras de referencia,
se ha comprobado de manera sorprendente que el antisuero de la
muestra 431 neutraliza 14 de las 17 muestras heterólogas del panel
de muestras de referencia (el título homólogo de seroneutralización
no se tiene en cuenta). En comparación, los antisueros de las cepas
vaccíneas "históricas" 255 y F9 sólo neutralizan cada uno dos
de las 18 muestras del panel de muestras.
De manera inesperada, el depositante ha
descubierto por lo tanto en la cepa FCV 431 una cepa dominante que
puede utilizarse para la protección de félidos y en particular de
gatos contra la mayor parte de las cepas FCV. Gracias al panel de
muestras de cepas FCV publicadas aquí, el experto en la materia
puede seleccionar otras cepas FCV dominantes. De un modo
equivalente, la invención también tiene en cuenta las cepas FCV
equivalentes a esta última que tengan anticuerpos de amplio
espectro de neutralización cruzada.
Hay equivalencia cuando el antisuero de una cepa
FCV seroneutraliza por lo menos 13 de las 18 muestras heterólogas
del panel de muestras de referencia (es decir, incluido el FCV 431),
preferentemente cuando seroneutraliza por lo menos 14 de las 18
muestras heterólogas del panel de muestras de referencia, de manera
aún más preferente cuando seroneutraliza por lo menos 15 de las 18
muestras heterólogas del panel de muestras de referencia.
Generalmente se considera que una cepa de FCV
seroneutraliza otra cepa FCV cuando el título heterólogo de
seroneutralización es superior o igual a 1,2 log_{10} VN_{50}
(Povey C. e Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11,
877-885). El depositante ha tomado este valor como
umbral de positividad. Mientras, los resultados de
seroneutralización cruzada obtenidos mediante una muestra FCV con un
título homólogo de seroneutralización inferior o igual a 2
log_{10} VN_{50} no pueden interpretarse.
Un segundo método para establecer la
equivalencia de una cepa FCV respecto de la cepa FCV 431 es utilizar
anticuerpos monoclonales específicos de la cepa FCV 431 y comprobar
por inmunofluorescencia indirecta (IFI) la cepa FCV candidata. El
depositante ha podido de este modo producir varios anticuerpos
monoclonales que se ha comprobado que eran específicos de la cepa
431. Uno de ellos ha sido denominado 44. Hay equivalencia si hay
reactividad en inmunofluorescencia con los anticuerpos monoclonales
específicos de 431, por ejemplo con el anticuerpo monoclonal 44.
Este anticuerpo monoclonal y el hibridoma correspondiente se hallan
disponibles en el depositante a simple petición y también son
difundidos en el artículo de Poulet y otros, supra. El
hibridoma correspondiente también fue depositado el 11 de agosto de
1999 en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2282. No obstante, es evidente que el experto en
la materia es incluso perfectamente capaz de producir anticuerpos
monoclonales para las técnicas clásicas y clasificar, en relación
con el panel de muestras, aquellos que son específicos de la cepa
431.
La otra cepa FCV G1 ha sido elegida por su
complementariedad con respecto de la cepa FCV 431, a saber que la
combinación de los antisueros de 431 y de G1 seroneutralizan el 100%
de las muestras del panel de muestras de referencia, es decir que
la cepa FCV G1 tiene un título homólogo de seroneutralización
superior o igual a 2 log_{10} VN_{50} y títulos de
seroneutralización heterólogos superiores o iguales a 1,2 log_{10}
VN_{50} con respecto de las muestras FCV del panel de muestras de
referencia frente a las cuales el antisuero 431 no seroneutraliza o
lo hace débilmente (valor inferior a 1,2 log_{10} VN_{50}). La
invención también se refiere a las cepas FCV equivalentes que
tienen la misma complementariedad con respecto de la cepa FCV 431.
También pueden producirse y seleccionarse anticuerpos específicos de
esta cepa, lo que permite determinar equivalentes de esta otra
base.
El depositante ha podido además aislar,
caracterizar y secuenciar el gen de la cápside de FCV 431 y FCV G1,
la proteína de la cápside, y ha determinado las secuencias de ADNc
(ADN complementario) correspondientes.
La invención tiene pues por objeto un fragmento
de ácido nucleico que comprende toda o parte de la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína de la cápside del virus 431
cuya secuencia de aminoácidos se halla representada por la SEC ID
N.º: 7 o de la figura 2, o un fragmento inmunológicamente activo de
esta proteína, es decir un epítopo, un péptido o un polipéptido que
conserva fundamentalmente la actividad inmunogénica de la proteína
de la
cápside.
cápside.
La invención tiene en particular por objeto un
fragmento de ADN que comprende la secuencia de ADNc de la SEC ID
N.º: 6 o un fragmento que conserva las propiedades fundamentales de
la secuencia completa, es decir que codifica un péptido, un
polipéptido o un epítopo que conserva fundamentalmente la actividad
inmunogénica de la proteína de la cápside. La invención tiene en
particular por objeto un fragmento de ADN que comprende esta
secuencia de ADNc, en particular unida a elementos de regulación de
la transcripción.
Es obvio que la invención engloba
automáticamente los fragmentos de ácido nucleico, fragmentos de ADN
y secuencias de ADNc equivalentes, es decir los fragmentos y
secuencias de nucleótidos específicos de la cápside FCV sin cambiar
la funcionalidad ni la especificidad de cepa de la secuencia
descrita o los polipéptidos codificados por esta secuencia. Dando
por supuesto que se incluirán las secuencias que difieren por
degeneración del código.
La invención también engloba automáticamente las
secuencias de nucleótidos (ARN, ADN, ADNc) equivalentes a las
reivindicadas. En particular se trata de secuencias que proceden de
cepas FVC equivalentes según la definición proporcionada
anteriormente con respecto del panel de muestras y/o del anticuerpo
monoclonal 44.
La invención comprende un fragmento de ácido
nucleico que comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos
que codifica la proteína de la cápside del virus G1 tal como se
halla representada por la SEC ID N.º: 5 o de la figura 1, o un
fragmento inmunológicamente activo de esta proteína, es decir un
epítopo, un péptido o un polipéptido que conserva fundamentalmente
la actividad inmunogénica de la proteína de la cápside.
La invención tiene en particular por objeto un
fragmento de ADN que comprende la secuencia de ADNc de la SEC ID
N.º: 4 o un fragmento que conserva las propiedades fundamentales de
la secuencia completa, es decir que codifica un péptido, un
polipéptido o un epítopo que conserva fundamentalmente la actividad
inmunogénica de la proteína de la cápside. La invención tiene en
particular por objeto un fragmento de ADN que comprende esta
secuencia de ADNc, en particular unida a elementos de regulación de
la transcripción. Es obvio que la invención engloba automáticamente
los fragmentos de ácido nucleico, fragmentos de ADN y secuencias de
ADNc equivalentes, es decir los fragmentos y secuencias de
nucleótidos sin cambiar la funcionalidad ni la especificidad de
cepa de la secuencia descrita o de los polipéptidos codificados por
esta secuencia. Dando por supuesto que se incluirán las secuencias
que difieren por degeneración del código.
La invención también engloba automáticamente las
secuencias de nucleótidos (ARN, ADN, ADNc) equivalentes a las
reivindicadas. Se trata en particular de secuencias de nucleótidos
que proceden de cepas FCV complementarias según el sentido
proporcionado anteriormente.
El gen que codifica la proteína de la cápside de
los virus FCV G1 y FCV 431 tiene un tamaño de 2.007 nucleótidos en
el caso del FCV 431 y de 2.010 nucleótides en el caso del FCV G1. La
proteína de la cápside tiene un tamaño de 668 aminoácidos en el
caso del FCV 431 y de 669 aminoácidos en el caso del FCV G1, y una
masa de 60-65 kDa (proteína p65).
La invención también tiene por objeto un vector
de expresión que comprenda por lo menos un fragmento de ADN según
la invención en condiciones que permitan su expresión in
vivo. Siguiendo una modalidad particular, el vector de
expresión comprende un ADNc de tipo 431 y un ADNc de tipo G1. Se
entiende por "tipo" que el ADNc es complementario de una
secuencia de ARN de la cepa considerada.
Estos vectores de expresión pueden ser poxvirus,
por ejemplo el virus de la viruela, los poxvirus (canarypox, virus
de la viruela aviar), incluidos los poxvirus específicos de especie
(porcino, de mapache y de camello), los adenovirus y los
herpesvirus, tales como los herpesvirus felinos (por ejemplo,
FR-A-2741806). En el caso de los
poxvirus, puede remitirse al experto en la materia a los documentos
WO-A-9215672,
WO-A-9526751,
WO-A-9012882 y
WO-A-9527780.
Pueden utilizarse varias estrategias de
inserciones para la expresión de varias secuencias de nucleótidos
heterólogos a partir del mismo vector de expresión in vivo.
Estas estrategias de inserción son en particular el uso de un doble
casete de expresión que tenga una orientación opuesta o el uso de un
doble casete de expresión que tenga una orientación idéntica o
incluso un casete múltiple de expresión con un elemento "IRES"
(International Ribosome Entry Site) situado entre cada inserto
(patente EP-A1-0803573).
Las secuencias de nucleótidos heterólogos se
insertan en función de señales reguladoras de la transcripción y en
particular promotores, preferentemente proporcionados en el momento
de la inserción. Sin embargo no se excluye la posibilidad de
expresar estas secuencias de nucleótidos heterólogos bajo el control
de señales propias del vector de expresión utilizado. En el caso de
los vectores de expresión canarypox, uno de los promotores
preferidos es el promotor de la vacuna H6 (Taylor y otros, Vaccine,
1988, 6, 504-508; Guo P. y otros, J. Virol., 1989,
63, 4.189-4.198; Perkus M. y otros, J. Virol., 1989,
63, 3.829-3.836).
Los vectores de expresión in vivo también
pueden ser plásmidos. El término plásmido significa englobar
cualquier unidad de transcripción de ADN bajo la forma de una
secuencia de polinucleótidos que comprenda una secuencia de ADNc
según la invención y los elementos necesarios para su expresión
in vivo. Se prefiere la forma plásmido circular, esté o no
superenrollado. La forma lineal también entra dentro del marco de
esta invención.
Cada plásmido comprende un promotor apto para
asegurar, en las células huésped, la expresión del ADNc insertado
bajo su dependencia. En general, se trata de un promotor eucariota
fuerte y en particular de un promotor temprano del citomegalovirus
CMV-IE, de origen humano o murino, o eventualmente
incluso de otro origen tal como una rata, una cobaya. De manera más
general, el promotor tiene bien un origen vírico, bien un origen
celular. Como promotor vírico distinto del CMV-IE,
puede mencionarse el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el
promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Como promotor celular,
puede mencionarse el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como
por ejemplo el promotor de la desmina o incluso el promotor de la
actina. Un subfragmento de estos promotores, que conserva la misma
actividad de promotor, forma parte de la presente invención, por
ejemplo los promotores CMV-IE truncados según el
documento WO-A-98/00166.
Cuando varias secuencias heterólogas (ADNc y/o
genes de FCV o de otros organismos patógenos felinos) aparecen en
el mismo plásmido, éstas pueden presentarse en la misma unidad de
transcripción o en dos unidades distintas.
Los plásmidos también pueden comprender otros
elementos de regulación de transcripción, tales como por ejemplo
secuencias estabilizadoras de tipo intrón, preferiblemente el intrón
Il del gen de la \beta-globina de conejo (van
Ooyen y otros, Science, 1979, 206: 337-344),
secuencia señal de la proteína codificada por el gen del activador
del plasminógeno tisular (tPA; Montgomery y otros, Cell. Mol. Biol.
1997, 43: 285-292) y señal de poliadenilación
(poliA), en particular del gen de la hormona de crecimiento bovino
(bGH) (US-A-5122458) o del gen de
la \beta-globina del conejo.
La invención también tiene por objeto la
utilización de los ADNc según la invención para la producción in
vitro de proteínas de la cápside o de sus fragmentos y epítopos
inmunológicamente activos y para su incorporación en los preparados
inmunogénicos y en vacunas subunitarias.
La invención también tiene por objeto un
preparado inmunogénico o una vacuna contra la calicivirosis felina
que comprenda por lo menos un vector de expresión in vivo
recombinado según la invención y un vehículo o excipiente aceptable
en el plan veterinario, y eventualmente un adyuvante.
El concepto de preparado inmunogénico engloba
cualquier preparado susceptible, una vez administrado al gato, de
inducir por lo menos una respuesta inmunitaria dirigida contra el
organismo patógeno felino en cuestión. Se entiende por vacuna un
preparado capaz de inducir una protección eficaz.
Preferiblemente, este preparado inmunológico o
esta vacuna comprenden un vector de expresión in vivo en el
cual se inserta un ADNc de tipo FCV 431, lo que incluye sus
equivalentes.
Según una primera particularidad muy ventajosa,
este preparado inmunológico o esta vacuna comprenden un vector de
expresión en el cual se inserta un ADNc de tipo FCV 431, lo que
incluye sus equivalentes, y un ADNc de tipo FCV G1, lo que incluye
también los equivalentes de este último.
Según una segunda particularidad muy ventajosa,
este preparado inmunológico o esta vacuna comprenden por lo menos
dos vectores de expresión: en el primero se inserta un ADNc de tipo
FCV 431, lo que incluye sus equivalentes, y en el segundo un ADNc
de la cepa FCV G1, lo que incluye también los equivalentes de este
último.
Para adyuvar los preparados y vacunas conforme a
la invención, puede utilizarse cualquier adyuvante apropiado que
conozca el experto en la materia. Sin embargo, se prefiere bien
formularlos en forma de emulsiones
aceite-en-agua, bien añadirlos a
polímeros del ácido acrílico o metaacrílico o a copolímeros de
anhídrido maleico y de derivado alquenilo, o incluso a un lípido
catiónico que contenga una sal de amonio cuaternaria.
Entre los polímeros, se prefieren los polímeros
del ácido acrílico o metaacrílico reticulados, en particular por
éteres polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes. Estos
compuestos se conocen bajo el término carbomero (Pharmacopea vol.
8, n.º 2, junio de 1996). El experto en la materia también puede
remitirse a la patente de EE.UU.
US-A-2909462 (incorporada por
referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados por
un compuesto polihidroxilado que tenga por lo menos 3 grupos
hidroxilo, preferiblemente no más de 8, y con los átomos de
hidrógeno de por lo menos tres hidroxilados sustituidos por
radicales alifáticos insaturados que tengan por lo menos 2 átomos
de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4
átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos
etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados también
pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los
productos comercializados bajo la denominación Carbopol® (BF
Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente adecuados. Son
reticulados por un alilo sacarosa o por el alilo pentaeritritol.
Entre ellos, pueden mencionarse los Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de
derivado alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son
copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados,
por ejemplo reticulados por el diviniléter. Puede remitirse a J.
Fields y otros, Nature, 186: 778-780, 4 de junio de
1960 (incorporado por referencia). En cuanto a su estructura, los
polímeros de ácido acrílico o metaacrílico y los EMA® están
compuestos preferentemente por motivos de base con la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual:
- R1 y R2, idénticos o distintos, representan H
o CH_{3}
- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1
- y=1 o 2, siendo x+y=2
En el caso de los EMA®, x = 0 e y = 2. En el
caso de los carbómeros, x = y = 1.
Estos polímeros se hallan disueltos en el agua o
en el agua fisiológica (NaCl a 20 g/l) y el pH se halla ajustado a
7,3-7,4 con sosa cáustica, para proporcionar la
solución adyuvante en la cual se incorporarán el vector de
expresión o las subunidades.
La concentración en polímero en la composición
vacunal final será de 0,01% a 1,5% P/V, más concretamente de 0,05 a
1% P/V, preferiblemente de 0,1 a 0,4% P/V.
Los lípidos catiónicos que contienen una sal de
amonio cuaternaria, que están en particular pero no exclusivamente
adaptados a los vectores de expresión plasmídicos que responden a la
fórmula:
en la que R1 es un radical
alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos
de carbono, R2 es otro radical alifático, que engloba 2 o 3 átomos
de carbono, e X es un grupo hidroxilo o
amino.
Se prefiere el DMRIE
(N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(tetradeciloxi)-1-propanoamonio;
WO-A-9634109), preferiblemente
unido a un lípido neutro, en particular el DOPE
(dioleoil-fosfatidil-etanolamina),
para formar el DMRIE-DOPE. Preferiblemente, la
mezcla de plásmido con este adyuvante se hace de forma extemporánea
y, antes de administrarlo al animal, es preferible dejar tiempo a
la mezcla constituida de este modo para que se formen complejos,
por ejemplo durante un período de entre 10 y 60 minutos, en
particular del orden de 30 minutos.
Cuando hay presencia de DOPE, la proporción
molar DMRIE: DOPE oscila preferiblemente entre 95:5 y 5:95, más
particularmente 1:1.
La proporción ponderal plásmido: adyuvante DMRIE
o DMRIE-DOPE puede oscilar en particular entre 50:1
y 1:50, en particular entre 10:1 y 1:5, preferiblemente entre 1:1 y
1:2.
Los vectores de expresión in vivo que
codifican un ADNc de tipo FCV según la invención también pueden
codificar el GM-CSF felino o estar asociados a un
segundo vector que codifica el GM-CSF felino (por
ejemplo los plásmidos pJP089 y pJP090, figura 5 y figura 6
respectivamente). En el caso de los plásmidos, se prefiere una
mezcla de dos plásmidos. En el caso de vectores víricos, se prefiere
un único vector. Este vector de expresión o esta mezcla de vectores
de expresión también pueden ser adyuvados tal como se ha descrito
anteriormente.
La invención también tiene por objeto un
preparado inmunogénico polivalente o una vacuna polivalente contra
la calicivirosis felina y contra por lo menos otro organismo
patógeno felino, utilizando un mismo vector de expresión in
vivo recombinado que contenga y exprese por lo menos un ADNc de
tipe FCV según la invención y por lo menos una secuencia de
nucleótidos de un inmunógeno de otro organismo patógeno felino o de
un fragmento inmunológicamente activo de este inmunógeno.
La invención también tiene por objeto un
preparado inmunogénico polivalente o una vacuna polivalente que
comprenda por lo menos un vector de expresión in vivo en el
cual haya insertado por lo menos un ADNc de tipo FCV según la
invención y por lo menos un segundo vector de expresión en el cual
haya insertada una secuencia que codifique un inmunógeno, o un
fragmento inmunológicamente activo, de otro organismo patógeno
felino. Los plásmidos apropiados en los cuales hay insertada una
secuencia que codifica un inmunógeno, o un fragmento
inmunológicamente activo, de otro organismo patógeno felino, que
puede ser en particular alguno de los descritos en los ejemplos 7 a
15 y 17 a 19 de la solicitud de patente
WO-A-9803660 (pPB179, pPB180,
pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030,
pAB083, pAB041).
Las vacunas recombinadas monovalentes o
polivalentes, tales como las descritas anteriormente, también
pueden asociarse con por lo menos una vacuna clásica (inactivada,
atenuada, de subunidades) dirigida contra por lo menos un organismo
patógeno felino idéntico o distinto.
Dichos otros organismos patógenos felinos se
eligen en particular de entre el grupo que comprende el virus de la
rinotraqueítis felina o herpesvirus felino (FHV), el virus de la
leucemia felina (FeLV), los parvovirus felinos (FPV), el virus de
la peritonitis infecciosa felina (FIPV), el virus de la
inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la rabia,
Chlamydia.
La invención comprende las proteínas de la
cápside aisladas, purificadas o sintéticas, de la cepa FCV 431 y de
la cepa FCV G1, cuya secuencia de aminoácidos se halla representada
por la SEC ID N.º: 7, respectivamente SEC ID. N.º: 5. Esto
corresponde automáticamente a las proteínas equivalentes, es decir
procedentes de cepas equivalentes a las cepas FCV 431 y FCV G1
según las definiciones proporcionadas anteriormente (establecimiento
del panel de muestras y/o de un anticuerpo monoclonal, en
particular el anticuerpo 44). Ventajosamente, estas proteínas de la
cápside pueden unirse en forma de cápsides vacías.
La invención tiene también por objeto los
fragmentos y epítopos (por lo menos de unos 8 a 10 aminoácidos) de
estas proteínas, que conservan la especificidad y la inmunogenicidad
de toda la proteína.
Las proteínas de la cápside, eventualmente
unidas en forma de cápsides vacías, y sus fragmentos y epítopos,
pueden producirse mediante expresión in vitro. La secuencia
de nucleótidos correspondiente se halla insertada dentro de un
sistema de expresión in vitro y es expresada por este
sistema, el producto de expresión es recogido y eventualmente
purificado, como ya se conoce.
El sistema de expresión puede ser de origen
vírico, en particular el baculovirus (patente de EE.UU.
US-A-4 745 051). Se integra la
secuencia codificante o un fragmento (en el caso del epítopo o del
fragmento) en el genoma del baculovirus (por ejemplo el baculovirus
Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV) y
este último se propaga de inmediato, en particular en células de
insectos, por ejemplo, Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito
ATCC CRL 1711).
El sistema de expresión in vitro puede
ser de origen procariota, por ejemplo Escherichia coli, o
eucariota, en particular levaduras, por ejemplo Saccharomyces
cerevisiae, o células eucariotas de mamíferos, en particular
líneas celulares tales como CHO (células ováricas de hámster), HeLa,
BHK o células de insectos, por ejemplo Spodoptera frugiperda
(supra), o incluso células felinas.
Como promotores utilizables en estas
construcciones celulares, pueden mencionarse los promotores víricos
fuertes tales como los del virus SV40 (Fiers y otros, Nature, (1978)
273: 113) y el promotor temprano (CMV-IE) del virus
CMV o citomegalovirus humano (McGregor y Caskey, Nucleic Acids Res.
17: 2.365, 1989), murino o de otro origen, o incluso el del gen de
polihedrina del baculovirus AcNPV (Hooft van Iddekinge y otros,
1983, Virology 131
561-565).
561-565).
El experto en la materia sabe cómo purificar y/o
aislar las proteínas, unidas o no en forma de cápsides vacías, sus
fragmentos y epítopos a partir del resultado de técnicas descritas
anteriormente. A título de ejemplo, puede recordarse que el experto
en la materia tiene a su disposición distintos procedimientos que
comprenden en particular: precipitación basada en la solubilidad de
las proteínas, fragmentos y epítopos de interés en función de las
condiciones salinas del medio, precipitación por parte de solventes
orgánicos, polímeros y otras materias, precipitación de afinidad y
desnaturalización selectiva, cromatografía en columna, incluida
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía
de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, cromatografía
de inmunoafinidad, cromatografía que utilice ligandos,
inmunoprecipitación, filtración en gel, electroforesis,
procedimientos de filtración, en particular ultrafiltración y
ultracentrifugación en gradiente.
El experto en la materia puede remitirse a
título de ejemplo a K.Y. Green y otros, J. Clin. Microb., julio de
1997, Vol 35, 7: 1.909-1.914, para la producción de
cápsides en baculovirus propagadas en células Sf9 y recogidas
mediante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa (10 a
50%).
Las proteínas de la cápside, y sus fragmentos y
epítopos, también pueden producirse por síntesis química mediante
los procedimientos de que dispone el experto en la materia.
La invención comprende los preparados
inmunogénicas y vacunas que comprenden por lo menos un antígeno
subunitario formado por una proteína de la cápside, preferiblemente
unida en forma de cápsides vacías, de FCV 431 y/o FCV G1, o de un
fragmento o epítopo correspondiente, en un vehículo o excipiente
aceptable para el plan veterinario, y preferiblemente un adyuvante.
Preferiblemente, los preparados y vacunas según la invención
comprenden antígenos subunitarios procedentes de dos cepas FCV 431 y
FCV G1. Del mismo modo, los preparados y vacunas pueden comprender
proteínas de la cápside no unidas y proteínas unidas en forma de
cápsides vacías.
Para adyuvar los preparados inmunogénicos y las
vacunas subunitarias según la invención, puede utilizarse como
adyuvante (1) el hidróxido de aluminio, (2) un polímero del ácido
acrílico o metaacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de
derivado alquenilo (descritos anteriormente), o (3) formular el
preparado inmunogénico o vacuna en forma de una emulsión de aceite
en agua, en particular la emulsión SPT descrita en la pág. 147
"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"
editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión
MF59 descrita en la pág. 183 de la misma obra.
La emulsión de aceite en agua puede ser en
particular a base de aceite de parafina líquida ligera (tipo
Farmacopea europea); de aceite isoprenoide tal como el escualano, el
escualeno; de aceite resultado de la oligomeración de alquenos, en
particular isobuteno o deceno; de ésteres de ácidos o alcoholes de
agrupación alquilo lineal, más concretamente los aceites vegetales,
el oleato de etilo, el di(caprilato/caprato) de
propilenglicol, el tri(caprilato/caprato) de glicerol, el
dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o de alcoholes grasos
ramificados, en particular ésteres del ácido isosteárico. El aceite
se utiliza junto con emulsionantes para formar la emulsión. Los
emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos en
particular los ésteres del sorbitán, manida, glicerol,
poliglicerol, propilenglicol y del ácido oleico, isosteárico,
ricinoleico, hidroxiesteárico, eventualmente etoxilos, los bloques
de copolímeros polioxipropilen-polioxietilenoglicol,
en particular los Pluronic®, en particular L121.
La invención también tiene por objeto los
preparados inmunogénicos y vacunas multivalentes en los que la
valencia FCV es una valencia subunitaria como la descrita
anteriormente.
La presente invención también tiene por objeto
un procedimiento de vacunación de gatos, contra las enfermedades
debidas a los virus de la calicivirosis felina.
Este procedimiento comprende la administración a
gatos de un preparado inmunológico o de una vacuna según la
invención. Esta administración puede llevarse a cabo en particular
por vía parenteral, mediante administración subcutánea,
intradérmica, intramuscular, intraperitoneal. Preferiblemente, la
administración se lleva cabo por vía subcutánea o intramuscular.
Pueden utilizarse distintas vías de
administración para los preparados inmunogénicos y para las vacunas
plasmídicas, en especial partículas de oro recubiertas de ADN y
proyectadas de tal modo que penetren en las células de la piel del
sujeto que hay que vacunar (Tang y otros, Nature 1992. 356.
152-154) y los inyectores de chorro líquido que
permiten transfectar a la vez células de la piel y células de los
tejidos subyacentes (Furth y otros, Analytical Bioch. 1992. 205.
365-368).
El experto en la materia posee las competencias
necesarias para definir con exactitud el número de administraciones
y las dosis que hay que utilizar en cada protocolo de
vacunación.
A continuación se describirá la invención con
mayor detalle con ayuda de los modos de realizarla tomados como
ejemplos no limitantes y haciendo referencia al diseño en el
cual:
Figura 1: Secuencia de ADNc y de la proteína de
la "cápside" de la cepa FCV G1
Figura 2: Secuencia de ADNc y de la proteína de
la "cápside" de la cepa FCV 431
Figura 3: Mapa de restricción del plásmido
pJCA151
Figura 4: Secuencia de la región C6L del genoma
del virus de canarypox (cepa ALVAC)
Figura 5: Mapa de restricción del plásmido
pJP089
Figura 6: Secuencia del gen
GM-CSF felino 3R3
Figura 7: Mapa de restricción del plásmido
pJP090
Figura 8: Secuencia del gen
GM-CSF felino 3R4
Figura 9: Tabla de los títulos de
seroneutralización cruzada
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID N.º 1: Oligonucleótido PB331
SEC ID N.º 2: Oligonucleótido PB333
SEC ID N.º 3: Oligonucleótido PB332
SEC ID N.º 4: Secuencia de ADNc de la cápside
FCV G1
SEC ID N.º 5: Secuencia de la proteína de la
cápside FCV G1
SEC ID N.º 6: Secuencia de ADNc de la cápside
FCV 431
SEC ID N.º 7: Secuencia de la proteína de la
cápside FCV 431
SEC ID N.º 8: Oligonucleótido JCA289
SEC ID N.º 9: Oligonucleótido JCA290
SEC ID N.º 10: Secuencia de la región C6L del
virus de canarypox (cepa ALVAC)
SEC ID N.º 11: Oligonucleótido C6A1
SEC ID N.º 12: Oligonucleótido C6B1
SEC ID N.º 13: Oligonucleótido C6C1
SEC ID N.º 14: Oligonucleótido C6D1
SEC ID N.º 15: Oligonucleótido JCA291
SEC ID N.º 16: Oligonucleótido JCA292
SEC ID N.º 17: Oligonucleótido JCA293
SEC ID N.º 18: Oligonucleótido JCA294
SEC ID N.º 19: Oligonucleótido JCA295
SEC ID N.º 20: Oligonucleótido JP578
SEC ID N.º 21: Oligonucleótido JP579
SEC ID N.º 22: Secuencia del gen
GM-CSF felino 3R3
SEC ID N.º 23: Secuencia del gen
GM-CSF felino 3R4
Todas las construcciones de plásmidos han sido
realizadas utilizando las técnicas estándar de biología molecular
(clonación, digestión mediante las enzimas de restricción, sintasa
de un ADN complementario de una sola hebra, amplificación en cadena
mediante polimerasa, elongación de un oligonucleótido mediante una
ADN polimerasa...) descritas por Sambrook J. y otros, (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2.ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Cold Spring Harbor. Nueva York, 1989). Todos los
fragmentos de restricción utilizados en la presente invención, así
como los diversos fragmentos de amplificación en cadena mediante
polimerasa (= ACP o PCR), han sido aislados y purificados utilizando
el kit "Geneclean7" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de calicivirus felino designada como G1
se obtuvo a partir de la obtención de una muestra llevada a cabo en
Francia en un gato que presentaba signos de calicivirosis. Esta cepa
FCV G1 fue depositada el 12 de marzo de 1999 en la Colección
nacional de cultivos de microorganismos (o CNMC) del Instituto
Pasteur de París, Francia, bajo el número de adquisición
I-2167.
La cepa de calicivirus felino designada como 431
se obtuvo a partir de la obtención de una muestra llevada a cabo en
Inglaterra en un gato que presentaba signos de calicivirosis. Esta
cepa FCV 431 fue depositada el 12 de marzo de 1999 en la Colección
nacional de cultivos de microorganismos (o CNMC) del Instituto
Pasteur de París, Francia, bajo el número de adquisición
I-2166.
Para su amplificación, las cepas de calicivirus
felino han sido cultivadas sobre células de la línea renal de gato
(Crandell-Reese Feline Kidney o CRFK, N.º ATCC
CCL-94, Crandell y otros, In Vitro 1973, 9,
176-185).
Las células CRFK se colocan en una placa de
cultivo de 96 pocillos o en placas de cultivo celular Falcon de 25
cm^{2} con medio DMEM complementado con suero de ternera fetal al
5% que contenga aproximadamente 100.000 células por ml. Las células
se cultivan a +37ºC en una atmósfera que contenga un 5% de
CO_{2}.
Al cabo de 3 días se obtiene confluencia del
lecho celular. Entonces se sustituye el medio de cultivo por medio
DMEM sin suero al que se ha añadido 50 mg/l de gentamicina y se
añaden las muestras víricas FCV a razón de un volumen de 100 \mul
de diluciones seriadas de cuarto en cuarto por pocillo para la
clonación en diluciones limitadas de virus FCV o de 1 ml por placa
Falcon.
Cuando el efecto citopático (CPE) es completo
(24-48 horas después de haber iniciado el cultivo),
se recogen las suspensiones víricas y se congelan a -70ºC.
Generalmente se requieren de 3 a 4 pasos sucesivos para la
producción de un lote vírico. El lote vírico se almacena a
-70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células CRFK se cultivan a 37ºC en frascos
con ruedas de 2 litros (850 cm^{2}) en medio Eagle modificado
(MEM, Gibco BRL) complementado con hidrolizado de lactoalbúmina al
2,5% (Gibco BRL) y con suero de ternera fetal al 5% (Gibco BRL) A
cada frasco con ruedas se añaden 300 ml de una suspensión celular en
medio MEM de aproximadamente 100.000 células/ml Al cabo de días se
obtiene confluencia del lecho celular. El medio de cultivo celular
es entonces sustituido por medio MEM sin suero y el virus FCV
añadido tiene una multiplicidad celular de infección (MOI) de 0,5
DICC_{50}/célula. Se mantiene el cultivo vírico a 37ºC durante un
período de 24 a 48 horas hasta la obtención de un efecto citopático
para el conjunto del tapiz celular. Se recoge la suspensión vírica
y a continuación es clarificada mediante centrifugación.
El ARN vírico contenido en 100 ml de suspensión
vírica de la cepa FCV G1, que se acaba de preparar, se ha extraído
con las soluciones del kit "High Pure^{TM} Viral RNA Kit" Cat
# 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals), siguiendo las
instrucciones del fabricante para las etapas de extracción. El
residuo de ARN obtenido al final de la extracción se ha
resuspendido con 10 ml de agua destilada estéril sin
ribonucleasa.
El ARN vírico de la cepa FCV 431 se ha extraído
en las mismas condiciones a partir de 100 ml de suspensión vírica
de la cepa correspondiente. El residuo de ARN obtenido al final de
la extracción se ha resuspendido con 10 ml de agua destilada
estéril sin ribonucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADN complementarios correspondientes a los
genes de las cápsides de las cepas G1 y 431 del calicivirus felino
han sido sintetizados con el kit "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #
N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859,
EE.UU.) utilizando las condiciones dadas por el fabricante.
Para la cepa FCV G1, se ha realizado una
reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de
amplificación en cadena (reacción "TI-ACP" o
"RT-PCR") con 1 ml de la suspensión de ARN
vírico FCV G1 (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes:
Las condiciones de síntesis de la primera hebra
de ADN complementaria son una temperatura de 42ºC durante 15
minutos, después 99ºC durante 5 minutos y por último 4ºC durante 5
minutos. Las condiciones de la reacción ACP son una temperatura de
95ºC durante 2 minutos, después 35 ciclos (95ºC durante 1 minuto,
después 62ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos) y por último
72ºC durante 7 minutos para producir un fragmento
RT-PCR de aproximadamente 2.000 pares de bases (pb)
que se ha identificado como "G1-4".
Para la cepa FCV 431, se ha realizado una
reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de
amplificación en cadena (reacción "TI-ACP" o
"RT-PCR") con 1 ml de la suspensión de ARN
vírico FCV 431 (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos
siguientes:
Las condiciones de síntesis de la primera hebra
de ADN complementaria son una temperatura de 42ºC durante 15
minutos, después 99ºC durante 5 minutos y por último 4ºC durante 5
minutos. Las condiciones de la reacción ACP son una temperatura de
95ºC durante 2 minutos, después 35 ciclos (95ºC durante 1 minuto,
después 62ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos) y por último
72ºC durante 7 minutos para producir un fragmento
RT-PCR de aproximadamente 2.000 pares de bases (pb)
que se ha identificado como "431-2".
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento RT-PCR
"G1-4" ha sido digerido mediante NarI después
mediante NotI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa,
el fragmento NarI-NotI de aproximadamente 2.000 pb.
Este fragmento se ha unido con el vector pBlueScript® II KS+ (Cat #
212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, EE.UU.), anteriormente
digerido mediante NotI y ClaI, después desfosforilado, para dar el
plásmido pG1-4-5 (5.033 pb).
El fragmento NotI-NarI clonado
en este plásmido ha sido secuenciado por completo en las dos hebras
para determinar la secuencia del gen de la cápside. La secuencia del
gen de la cápside de la cepa FCV G1 (2.010 pb) (SEC ID N.º 4), así
como la secuencia de la proteína de la cápside (p65) (668
aminoácidos) (SEC ID N.º 5) codificada por este gen, aparecen en la
figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento RT-PCR
"431-2" ha sido digerido mediante NarI después
mediante NotI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa,
el fragmento NarI-NotI de aproximadamente 2.000 pb.
Este fragmento ha sido ligado con el vector pBlueScript® II KS+
(Cat # 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, EE.UU.),
anteriormente digerido mediante NotI y ClaI, después desfosforilado,
para dar el plásmido p431-2-1 (4.985
pb).
El fragmento NotI-NarI clonado
en este plásmido ha sido secuenciado por completo en las dos hebras
para determinar la secuencia del gen de la cápside. La secuencia del
gen de la cápside de la cepa FCV 431 (2.007 pb) (SEC ID N.º 6), así
como la secuencia de la proteína de la cápside (p65) (668
aminoácidos) (SEC ID N.º 7) codificada por este gen, aparecen en la
figura 2.
Se ha realizado une reacción ACP utilizando el
plásmido p431-2-1 (ejemplo 5) como
matriz y los oligonucleótidos siguientes:
para amplificar un fragmento ACP de
aproximadamente 2.030 pb. Este fragmento ha sido digerido con las
enzimas de restricción SalI y EcoRV para aislar, tras
electroforesis en gel de agarosa, un fragmento
SalI-EcoRV de 2.014 pb. Este fragmento de
restricción se ha unido a continuación al plásmido pVR1012 (Hartikka
J. y otros, Human Gene Therapy. 1997. 7.
1.205-1.217), anteriormente digerido mediante Sali y
EcoRV, para dar el plásmido pJCA151 (6.908 pb) (figura
3).
La figura 4 (SEC ID N.º 10) muestra la secuencia
de un fragmento de 3.700 pb del ADN genómico del virus canarypox.
El análisis de esta secuencia ha revelado un marco abierto de
lectura (ORF) que se ha denominado C6L, que empieza en la posición
377 y termina en la posición 2.254. La construcción de un plásmido
de inserción que lleva a la eliminación del ORF C6L y a su
sustitución por un sitio de clonación múltiple flanqueado por
señales de terminación de la transcripción y la traducción se ha
realizado tal como se describe posteriormente.
Se ha realizado una reacción ACP a partir de la
matriz constituida por el ADN genómico del virus canarypox y con
los oligonucleótidos siguientes:
para aislar un fragmento ACP de 432
pb (fragmento
A).
Se ha realizado una reacción ACP a partir de la
matriz constituida por el ADN genómico del virus canarypox y con
los oligonucleótidos siguientes:
para aislar un fragmento ACP de
1.210 pb (fragmento
B).
Los fragmentos A y B han sido hibridados
conjuntamente para ser utilizados como matriz de una reacción ACP
realizada con los oligonucleótidos C6A1 (SEC ID N.º 11) y C6D1 (SEC
ID N.º 14) para generar un fragmento ACP de 1.630 pb. Este
fragmento ha sido digerido mediante las enzimas de restricción SacI
y KpnI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, un
fragmento SacI-KpnI de 1.613 pb. Este fragmento se
ha unido con el vector pBlueScript® II KS+ (Cat # 212205 Stratagene
Inc., La Jolla, CA, EE.UU., Cat # 212205), anteriormente digerido
mediante las enzimas SacI y KpnI, para dar el plásmido pC6L. La
secuencia de este plásmido se ha verificado mediante secuenciación.
Este plásmido contiene 370 pb de secuencias situadas por encima del
COL C6L ("brazo flanqueante izquierdo C6"), una señal vacuna
de terminación precoz de la transcripción, codones de terminación
en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que
contiene los sitios de restricción SmaI, PstI, XhoI y EcoRI y por
último 1.156 pb de secuencias situadas más allá de COL C6L ("brazo
flanqueante izquierdo C6.")
El plásmido pMP528HRH (Perkus M. Y otros, J.
Virol. 1989. 63. 3.829-3.836) ha sido utilizado como
matriz para amplificar la secuencia completa del promotor vacuna H6
(N.º de adquisición GenBank M28351) con los oligonucleótides
siguientes:
para amplificar un fragmento ACP de
149 pb. Este fragmento ha sido digerido mediante las enzimas de
restricción SacI y EcoRI para aislar, tras electroforesis en gel de
agarosa, un fragmento de restricción SmaI-EcoRI de
138 pb. Entonces se ha unido este fragmento al plásmido pC6L
anteriormente digerido mediante las enzimas SmaI y EcoRI, para dar
el plásmido
pJCA150.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha realizado une reacción ACP utilizando el
plásmido p431-2-1 (ejemplo 5) como
matriz y los oligonucleótidos siguientes:
para amplificar un fragmento ACP de
aproximadamente 2.050 pb. Este fragmento ha sido digerido con las
enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, tras electroforesis
en gel de agarosa, el fragmento NruI-SalI de 2.035
pb (fragmento A). El plásmido pJCA150 (ejemplo 7) ha sido digerido
por las enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, tras
electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción
NruI-SalI de aproximadamente 4.500 pb (fragmento
B). Entonces se han unido los fragmentos A y B para proporcionar el
plásmido pJCA152. El plásmido pJCA152 ha sido linealizado mediante
NotI, a continuación transfectado en células primarias de embriones
de pollos infectados con el virus canarypox (cepa ALVAC) según la
técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita
anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79.
4.927-4.931; Piccini y otros, En Methods in
Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. y
Grossman L. Academic Press). Se han seleccionado placas positivas
en base a una hibridación con una sonda radiomarcada específica del
gen de la cápside de la cepa FCV 431. Estas placas han sufrido 4
ciclos sucesivos de selección/purificación hasta que se ha aislado
una población pura. Entonces se ha amplificado una placa
representativa de la recombinación in vitro entre el
plásmido donador pJCA152 y el genoma del virus canarypox ALVAC y el
stock de virus recombinado obtenido se ha designado
vCP1710.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha realizado une reacción ACP utilizando el
plásmido pG 1-4-5 (ejemplo 4) como
matriz y los oligonucleótidos siguientes:
para amplificar un fragmento ACP de
aproximadamente 2.050 pb. Este fragmento ha sido digerido con las
enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, tras electroforesis
en gel de agarosa, el fragmento NruI-SalI de 2.035
pb (fragmento A). El plásmido pJCA150 (ejemplo 7) ha sido digerido
por las enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, tras
electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción
NruI-SalI de aproximadamente 4.500 pb (fragmento
B). Entonces se han unido los fragmentos A y B para dar el plásmido
pJCA153.
El plásmido pJCA153 ha sido linealizado mediante
NotI, a continuación transfectado en células primarias de embriones
de pollos infectados con el virus canarypox (cepa ALVAC) según la
técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita
anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79.
4.927-4.931; Piccini y otros, En Methods in
Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. y
Grossman L. Academic Press). Se han seleccionado placas positivas
en base a una hibridación con una sonda radiomarcada específica del
gen de la cápside de la cepa FCV G1. Estas placas han sufrido 4
ciclos sucesivos de selección/purificación hasta que se ha aislado
una población pura. Entonces se ha amplificado una playa
representativa de la recombinación in vitro entre el
plásmido donador pJCA152 y el genoma del virus canarypox ALVAC y el
stock de virus recombinado obtenido se ha designado
vCP1711.
Se ha obtenido sangre de gato mediante
extracción de sangre en un tubo que contiene EDTA. Las células
mononucleadas han sido obtenidas mediante centrifugación en
gradiente de Ficoll, a continuación se han cultivado en placas de
Petri de 60 mm de diámetro. Las células mononucleadas de gato han
sido a continuación estimuladas con concanavalina A (ConA)
(concentración final de aproximadamente 4 \mug/ml) y con
fitohemoaglutinina (PHA) (concentración final de aproximadamente 10
\mug/ml). Tras la estimulación, se han obtenido los linfoblastos
"Con A" y "PHA" mediante raspado de las placas de cultivo
y se ha extraído todo el ARN de estas células utilizando el kit
"mRNA isolation kit for White Blood Cells" (Boehringer
Mannheim/ Roche Cat # 1 934 325).
El ARN total extraído de los linfoblastes de
gato estimulados por ConA y PHA sirven de matriz para la síntesis
de la primera hebra del ADN complementario. Esta primera hebra de
ADN complementario se ha producido mediante elongación del
oligonucleótido p (dT) (Boehringer Mannheim/ Roche Cat # 814 270).
El ADN complementario de una sola hebra obtenido se ha utilizado de
inmediato como matriz para una reacción ACP con los oligonucleótidos
siguientes:
para amplificar un fragmento ACP de
aproximadamente 450 pares de bases (pb). Este fragmento ha sido
digerido mediante NotI para aislar, tras electroforesis en gel de
agarosa, el fragmento NotI-NotI de 450 pb. Este
fragmento se ha unido entonces al plásmido pVR1012 (Hartikka J. y
otros, Human Gene Therapy. 1997. 7. 1.205-1.217).
Dos clones que contienen la secuencia GM-CSF felina
(SEC ID N.º 22 y SEC ID N.º 23), con la orientación buena con
respecto del promotor hCMV/IE, han sido identificados
respectivamente como pJP089 y pJP090. Estos dos plásmidos tienen un
tamaño de 5.364 pb (figuras 5 y
7).
La secuencia del gen GM-CSF
felino clonado en el plásmido pJP089 consta de 13 diferencias a
nivel nucleotídico con la secuencia GM-CSF felina
disponible en GenBank (n.º de adquisición AF053007). El cambio más
importante es un cambio C ® T que comporta un cambio leucina ®
fenilalanina en el aminoácido (primera base del codón del
aminoácido # 107; figura 6). La secuencia del gen
GM-CSF felino clonado en el plásmido pJP090 equivale
a la contenida en el plásmido pJP089, a no ser que el cambio
leucina ® fenilalanina no exista para el aminoácido # 107 (figura
8). La verificación de la secuencia 3' del gen
GM-CSF felino mediante el kit 3' RACE ha puesto de
manifiesto que, en esta posición 107, puede observarse en el mismo
gato, el aminoácido leucina o el aminoácido fenilalanina
Se mezclan los diversos plásmidos necesarios
para la fabricación de una vacuna asociada. Estos plásmidos pueden
ser en particular los descritos en los ejemplos 6 y 10 (pJCA151,
pJP089 y pJP090) y los ejemplos 7 a 15 y 17 a 19 de la solicitud de
patente WO-A-9803660 (pPB179,
pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029,
pAB030, pAB083, pAB041). Las mezclas se llevan a cabo de tal manera
que la concentración final de cada plásmido corresponde a la dosis
eficaz de cada plásmido. Las soluciones utilizables para ajustar la
concentración final de la vacuna pueden ser bien una solución de
NaCl al 0,9% o bien un tampón PBS.
La solución de ADN que contiene uno o más
plásmidos según el ejemplo 11 se concentra mediante precipitación
etanólica tal como se describe en Sambrook y otros (1989). Se
recupera el residuo de ADN mediante una solución de NaCl al 0,9%
para obtener una concentración de 1 mg/ml. Se prepara una solución
de DMRIE-DOPE 0,75 mM recuperando un liofilizado de
DMRIE-DOPE mediante un volumen adaptado de H_{2}O
estéril.
La formación de los complejos ADN
plasmídico-lípido se lleva a cabo mediante dilución
a partes iguales de la solución de DMRIE-DOPE 0,75
mM con la solución de ADN de 1 mg/ml en NaCl al 0,9%. La solución de
ADN se introduce progresivamente con ayuda de una aguja de insertar
26G a lo largo de la pared del frasco que contiene la solución de
lípido catiónico para evitar la formación de espuma. A partir del
momento en que las dos soluciones se han mezclado se procede a
agitar suavemente. Se obtiene una composición final que comprende
0,375 mM de DMRIE-DOPE y 500 \mug/ml de
plásmido.
Es deseable que en todas las operaciones
descritas anteriormente las soluciones utilizadas estén en conjunto
a temperatura ambiente. Se deja que se formen complejos
ADN/DMRIE-DOPE a temperatura ambiente durante 30
minutos antes de proceder a la vacunación de los animales.
Para la preparación de vacunas, los virus
recombinados canarypox vCP1710 (ejemplo 8) y vCP1711 (ejemplo 9)
pueden adyuvarse con soluciones de carbómero. El carbómero preferido
es el Carbopol^{TM} 974P fabricado por BF Goodrich, Ohio, EE.UU.
(peso molecular de aproximadamente 3.000.000).
Inicialmente se prepara una solución
stock al 1,5% de Carbopol^{TM} 974P en agua destilada que
contenga 1 g/l de cloruro de sodio. Entonces se utiliza esta
solución stock para la elaboración de una solución de 4
mg/ml de Carbopol^{TM} 974P en agua fisiológica. La solución
stock se mezcla con un volumen adecuado de agua fisiológica,
bien en una única etapa o bien en varias etapas sucesivas, el valor
del pH se ajusta en cada etapa con una solución de hidróxido de
sodio 1N (o aun más concentrada) a fin de obtener un valor final de
pH de 7,3-7,4.
La solución de Carbopol^{TM} 974P preparada
para ser utilizada obtenida de este modo puede utilizarse para
recuperar virus recombinados liofilizados (por ejemplo vCP1710,
vCP1711) o para diluir las soluciones stock concentradas de
virus recombinados (por ejemplo vCP1710, vCP1711). Por ejemplo, para
obtener una suspensión vírica que contenga 108 PFU por dosis de 1
ml, puede diluirse una solución vírica stock de manera que
se obtenga una titilación de 108,3 pfu/ml, a continuación se diluye
a partes iguales con dicha solución de Carbopol^{TM} 974P
preparada para ser utilizada de 4 mg/ml.
Las pruebas IFI se llevan a cabo sobre placas de
96 pocillos que contienen las células CRFK cultivadas en monolechos
e infectadas por los virus FCV que hay que someter a prueba.
Se cultivan 200 \mul por pocillo de una
suspensión de células CRFK de 90.000 células/ml en medio F15 (Gibco
BRL, Cat # 045-1075) que contiene suero de ternera
fetal al 5% en una placa de 96 pocillos. Cuando hay confluencia, se
inoculan 320 DICC_{50} de FCV en 100 \mul de medio F15. Cuando
aparecen los primeros focos de ECP, se lavan las células con PBS
frío sin calcio ni magnesio (PBS, Sigma), después se fijan a -20ºC
durante 30 minutos con acetona fría que contenga un 5% v/v de agua.
Una vez secadas, las células infectadas y fijadas se ponen en
contacto durante 30 minutos a 37ºC con 100 \mul por pocillo de
líquido de ascitis que corresponde al anticuerpo monoclonal 44
anti-FCV (hibridoma 431 2 0 17 E9, depositado en la
CNCM bajo el número de adquisición I-2282),
diluidas aproximadamente a 1/5.000 en tampón
Tris-Hcl 50 mM, pH de 7,6.
Tras dos lavados en PBS, la fijación de los
anticuerpos se manifiesta por incubación en las mismas condiciones
que un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón
conjugado con isotianato de fluoresceína (Biosys, conjugado FITC a
2 mg/ml) y diluido a 1/150 en tampón TRIS-HCl 50 mM
pH de 7,6. La lectura se hace bajo el microscopio óptico con luz
UV.
Este anticuerpo monoclonal ha sido sometido a
prueba con respecto a cada una de las muestras del panel de
muestras. Se ha fijado exclusivamente sobre las células CRFK
infectadas por el FCV 431.
Esta prueba puede utilizarse para determinar los
equivalentes de la cepa FCV 431. Estos equivalentes son aquellos
sobre los cuales se fija el anticuerpo monoclonal 44.
Las pruebas de seroneutralización cruzada se han
efectuado entre 18 muestras de campo obtenidas mediante legrados
faríngeos practicados en gatos que presentan signos de calicivirosis
felina. 7 tienen por origen geográfico Francia, se trata de las
muestras identificadas como A2, F3031, G1, G3, F1,
H3-2 y H1-4. 4 tienen por origen
geográfico Gran Bretaña, se trata de las muestras identificadas como
J5, 337, 388b y 431. Por último, 7 tienen por origen geográfico los
EE.UU., se trata de las muestras identificadas como RMI1, RMI2,
RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9.
Para cada virus FCV, se ha producido un
antisuero mediante inoculación de las crías de gato por vía
oronasal con 106,0 DICC_{50} del virus FCV en cuestión. Las crías
de gato sin organismos patógenos específicos (EOPS) tenían de 10 a
14 semanas.
El suero de cada animal se recogió al cabo de un
mes de la infección. Los sueros fueron inactivados por el calor (30
minutos a 56ºC), se distribuyeron, se dividieron en partes alícuotas
y se almacenaron a -20ºC.
El suero obtenido para cada muestra se ha
sometido a prueba para ver su capacidad para neutralizar las 18
muestras. Los sueros han sido diluidos en cascada hasta un tercio
con medio DMEM en placas de 96 pocillos para cultivo celular. A
0,05 ml de suero diluido se han añadido 0,05 ml de medio de cultivo
que contiene aproximadamente 100 DICC_{50} de la cepa vírica
seleccionada. Esta mezcla se ha incubado durante 2 horas a 37ºC en
un autoclave en una atmósfera que contiene un 5% de CO_{2}.
A continuación a cada mezcla se han añadido 0,15
ml de una suspensión de células CRFK que contiene aproximadamente
100.000 células por ml. El efecto citopático se ha observado
mediante microscopía de contraste de fase al cabo de 4 días de
cultivo a 37ºC en una atmósfera que contiene un 5% de CO2. Los
títulos neutralizantes de cada suero se han calculado a partir del
procedimiento de Kärber. Los títulos se dan en forma de la dilución
más importante que inhibe el efecto citopático del 50% de los
pocillos. Los títulos se expresan en log_{10}. El título mínimo
obtenido así ha sido de 0,7 log_{10} VN_{50}. Cada suero ha sido
titulado por lo menos dos veces, preferiblemente tres.
La figura 9 proporciona el conjunto de títulos
neutralizantes obtenidos en el momento de las seroneutralizaciones
cruzadas efectuadas entre estas 18 cepas FCV y estos 18 sueros.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias bibliográficas
mencionada por el solicitante sólo tiene por objeto ayudar al lector
y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha
tenido una gran precaución al recopilar las referencias
bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones y la
Oficina Europea de patentes declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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<110> MERIAL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes de calicivirus felino y vacuna
recombinada que los incorpora
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FCV recombinado
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcggccgc tgtgatgtgt tcgaagtttg agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcgccgy tgaccmagtg cagcyttrtc caattc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcgccaa ywgtrttwgh tacagtrtca acyarrcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2010
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> calicivirus felino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> calicivirus felino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2007
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> calicivirus felino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 668
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> calicivirus felino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacgcgtcg acatgtgctc aacctgcgct aacgtg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgatatc tcatatttta accattccac tcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3701
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus canarypox
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaatcgcgat atccgttaag tttgtatcgt aatgtgctca acctgcgcta acgtg
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgtcgac tcatatttta accattccac tcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgtcgac tcatagtttt gtcatagtac tcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgcggccg ctacgtatca cttcttgact ggtttc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Felis catus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Felis catus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
Claims (49)
1. Fragmento de ácido nucleico que comprende la
secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 6.
2. Fragmento de ácido nucleico de la secuencia
de nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 6 que codifica un
epítopo, péptido o polipéptido, siendo dicho epítopo, péptido o
polipéptido capaz de inducir in vivo en el gato anticuerpos
que tengan el espectro de neutralización cruzada del antisuero de la
cepa FCV 431 tal como la depositada en la CNCM bajo el número de
adquisición I-2166.
3. Fragmento de ácido nucleico que codifica la
proteína de la cápside representada por la SEC ID N.º: 7.
4. Fragmento de ácido nucleico que codifica un
fragmento inmunológicamente activo de la proteína de la cápside
representada por la SEC ID N.º: 7, siendo dicho fragmento
inmunológicamente activo capaz de inducir in vivo en el gato
anticuerpos que tengan el espectro de neutralización cruzada del
antisuero de la cepa FCV 431 tal como la depositada en la CNCM bajo
el número de adquisición I-2166.
5. Fragmento de ácido nucleico que codifica la
proteína de la cápside de un calicivirus felino (FCV) reconocido
por el anticuerpo monoclonal 44 secretado por el hibridoma
depositado en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2282, siendo dicha proteína de la cápside capaz de
inducir in vivo en el gato anticuerpos que tengan el
espectro de neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV 431
tal como la depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2166.
6. Fragmento de ácido nucleico que codifica un
fragmento inmunológicamente activo de la proteína de la cápside de
un calicivirus felino (FCV) reconocido por el anticuerpo monoclonal
44 secretado por el hibridoma depositado en la CNCM bajo el número
de adquisición I-2282, siendo dicho fragmento
inmunológicamente activo capaz de inducir in vivo en gatos
anticuerpos que tengan el espectro de neutralización cruzada del
antisuero contra la cepa FCV 431 depositada en la CNCM bajo el
número de adquisición I-2166.
7. Vector de expresión in vivo o in
vitro que comprende un fragmento de ácido nucleico según una de
las reivindicaciones 1 a 6.
8. Vector de expresión in vivo o in
vitro según la reivindicación 7, en el que el fragmento de ácido
nucleico depende de señales reguladoras de la transcripción.
9. Vector de expresión in vivo o in
vitro según la reivindicación 7 o 8, elegido dentro del grupo
constituido de los poxvirus, adenovirus, herpesvirus y
baculovirus.
10. Vector de expresión in vivo o in
vitro según la reivindicación 7 o 8, siendo el vector de
expresión un plásmido.
11. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que
comprende además un fragmento de ácido nucleico que comprende toda
o parte de la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID
N.º: 4.
12. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que
comprende un fragmento de ácido nucleico adicional, comprendiendo
el fragmento de ácido nucleico adicional la secuencia de
nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 4.
13. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que
comprende un fragmento de ácido nucleico adicional, comprendiendo
el fragmento de ácido nucleico adicional un fragmento de la
secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 4 que
codifica un epítopo, péptido o polipéptido capaz de inducir in
vivo en el gato anticuerpos que tengan el espectro de
neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV G1 tal como la
depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2167.
14. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que
comprende un fragmento de ácido nucleico adicional, comprendiendo
el fragmento de ácido nucleico adicional la secuencia de
nucleótidos representada por la SEC ID N.º: 5.
15. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que
comprende un fragmento de ácido nucleico adicional, coficando el
fragmento de ácido nucleico adicional un fragmento
inmunológicamente activo de la proteína de la cápside representada
por la SEC ID N.º: 5, siendo dicho fragmento inmunológicamente
activo capaz de inducir in vivo en el gato anticuerpos que
tengan el espectro de neutralización cruzada del antisuero de la
cepa FCV G1 tal como la depositada en la CNCM bajo el número de
adquisición I-2167.
16. Vector de expresión in vivo o in
vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el
que el fragmento de ácido nucleico depende de señales reguladoras de
la transcripción.
\newpage
17. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 16, que comprende además una secuencia de
nucleótidos de un inmunógeno de otro organismo patógeno felino.
18. Vector de expresión según la reivindicación
17, en el que el otro organismo patógeno felino se elige de entre
el grupo que consta del virus de la rinotraqueítis felina (también
llamado herpesvirus felino FHV), el virus de la leucemia felina
(FeLV), el parvovirus felino (FPV), el virus de la peritonitis
infecciosa felina (FIPV), el virus de la inmunodeficiencia felina
(FIV), el virus de la rabia, Chlamydia.
19. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina que comprende un vector de expresión in
vivo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18, y un
vehículo o excipiente aceptable en el plan veterinario.
20. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina y contra por lo menos otro organismo patógeno
felino, que comprende un primer vector de expresión in vivo
según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18 y un segundo vector
de expresión in vivo en el que se inserta una secuencia que
codifica un inmunógeno de otro organismo patógeno felino.
21. Preparado inmunogénico o vacuna polivalente
contra la calicivirosis felina y contra por lo menos otro organismo
patógeno felino, que comprende un vector de expresión in vivo
según la reivindicación 17 o 18 y un vehículo o excipiente
aceptable en el plan veterinario.
22. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que por lo menos
uno de los vectores de expresión in vivo es un poxvirus.
23. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 22, en el que el poxvirus es un canarypox.
24. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, que comprende además un
adyuvante.
25. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 24, en el que por lo menos uno de los vectores de
expresión in vivo es un plásmido y en el que el adyuvante es
un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternaria, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R1 es un radical
alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos
de carbono, R2 es otro radical alifático, que engloba 2 o 3 átomos
de carbono, y X es un grupo hidroxilo o
amino.
26. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 25, en el que el adyuvante es el DMRIE.
27. Preparado inmunogénico o vacuna según una u
otra de las reivindicaciones 25 y 26, en el que el adyuvante está
unido a un lípido neutro.
28. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 27, en el que el lípido neutro comprende el DOPE.
29. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 27, en el que el adyuvante comprende el
DMRIE-DOPE.
30. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 22 o 23, que comprende además un adyuvante que
comprende un polímero del ácido acrílico o metaacrílico.
31. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 24, en el que el adyuvante comprende un
carbómero.
32. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, que comprende además un
vector plasmídico de expresión in vivo en el que se inserta
el gen que codifica el GM-CSF felino.
33. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina que comprende la proteína de la cápside de la
cepa FCV 431 unida en forma de cápsides vacías, teniendo esta
proteína la secuencia SEC ID N.º: 7.
34. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina que comprende un fragmento o epítopo
inmunológicamente activo de la secuencia SEC ID N.º: 7, siendo
dicho fragmento o epítopo inmunológicamente activo capaz de inducir
in vivo en el gato anticuerpos que tengan el espectro de
neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV 431 tal como la
depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2166.
35. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina que comprende la proteína de la cápside de un
calicivirus felino reconocido por el anticuerpo monoclonal 44, unida
en forma de cápsides vacías.
36. Preparado inmunogénico o vacuna contra la
calicivirosis felina, que comprende un fragmento o epítopo
inmunológcamente activo de la proteína de la cápside de un
calicivirus felino reconocido por el anticuerpo monoclonal 44,
siendo dicho fragmento o epítopo inmunológicamente activo capaz de
inducir in vivo en el gato anticuerpos que tengan el
espectro de neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV 431
tal como la depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2166.
37. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, que comprende además la
proteína de la cápside de la cepa FCV G1 unida en forma de cápsides
vacías, teniendo esta proteína la secuencia SEC ID N.º: 5.
38. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, que comprende además un
fragmento o epítopo inmunológicamente activo de la proteína que
tiene la secuencia SEC ID N.º: 5, siendo dicho fragmento o epítopo
inmunológicamente activo capaz de inducir in vivo en el gato
anticuerpos que tengan el espectro de neutralización cruzada del
antisuero de la cepa FCV G1 tal como la depositada en la CNCM bajo
el número de adquisición I-2167.
39. Proteína de la cápside aislada, purificada o
sintética que tiene la secuencia SEC ID N.º: 7 unida en forma de
cápsides vacías.
40. Fragmento o epítopo inmunológicamente activo
de la proteína que tiene la secuencia SEC ID N.º: 7, siendo dicho
fragmento o epítopo inmunológicamente activo capaz de inducir in
vivo en el gato anticuerpos que tengan el espectro de
neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV 431 tal como la
depositada en el CNCM bajo el número de adquisición
I-2166.
41. Proteína de la cápside aislada, purificada o
sintética, de un calicivirus felino reconocido por el anticuerpo
monoclonal 44, unida en forma de cápsides vacías, siendo dicha
proteína capaz de inducir in vivo en el gato anticuerpos que
tengan el espectro de neutralización cruzada del antisuero de la
cepa FCV 431 tal como la depositada en la CNCM bajo el número de
adquisición I-2166.
42. Fragmento o epítopo inmunológicamente activo
de la proteína de la cápside aislada, purificada o sintética, de un
calicivirus felino reconocido por el anticuerpo monoclonal 44,
siendo dicho fragmento o epítopo inmunológicamente activo capaz de
inducir in vivo en el gato anticuerpos que tengan el espectro
de neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV 431 tal como
la depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
I-2166.
43. Preparado inmunogénico o vacuna, que
comprende una proteína de la cápside aislada, purificada o sintética
o un fragmento o epítopo inmunológicamente activo según cualquiera
de las reivindicaciones 30 a 42, y un vehículo o excipiente
aceptable en el plano veterinario.
44. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 43, que comprende además un inmunógeno de otro
organismo patógeno felino o un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos de un inmunógeno de otro organismo
patógeno felino.
45. Preparado inmunogénico o vacuna según la
reivindicación 44, en el que el otro organismo patógeno felino se
elige de entre el grupo que consta del virus de la rinotraqueítis
felina (también llamado herpesvirus felino, FHV), el virus de la
leucemia felina (FeLV), el parvovirus felino (FPV), el virus de la
peritonitis infecciosa felina (FIPV), el virus de la
inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la rabia,
Chlamydia.
46. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, que comprende además la
proteína de la cápside aislada, purificada o sintética que tiene la
secuencia SEC ID N.º: 5.
47. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, que comprende además un
fragmento o epítopo inmunológicamente activo de la proteína que
tiene la secuencia SEC ID N.º: 5, siendo dicho fragmento o epítopo
inmunológicamente activo capaz de inducir in vivo en el gato
anticuerpos que tengan el espectro de neutralización cruzada del
antisuero de la cepa FCV G1 tal como la depositada en la CNCM bajo
el número de adquisición I-2167.
48. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, que comprende además un
vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifican la proteína que tiene la secuencia SEC ID N.º: 5.
49. Preparado inmunogénico o vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, que comprende además un
vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifican un fragmento o epítopo inmunológicamente activo de la
proteína que tiene la secuencia SEC ID N.º: 5, siendo dicho
fragmento o epítopo inmunológicamente activo capaz de inducir in
vivo en el gato anticuerpos que tengan el espectro de
neutralización cruzada del antisuero de la cepa FCV G1 tal como la
depositada en la CNCM bajo el número de adquisición
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