ES2376817T3

ES2376817T3 - Prevención de afecciones asociadas con circovirus-2 porcino.

Info

Publication number: ES2376817T3
Application number: ES00960628T
Authority: ES
Inventors: John Albert Ellis; Gordon Moore Allan; Brian Meehan; Edward Clark; Deborah Haines; Lori Hassard; John Harding; Catherine Elisabeth Charreyre; Gilles Emile Chappuis; George Steve Krakowka; Jean-Christophe Francis Audonnet; Francis Mcneilly
Original assignee: University of Saskatchewan; Merial SAS; Queens University of Belfast
Current assignee: University of Saskatchewan; Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS; Queens University of Belfast
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2012-03-20
Anticipated expiration: 2020-08-28
Also published as: US6517843B1; BR0014155A; HU229195B1; WO2001016330A2; PL353068A1; BRPI0014155B1; JP2003513617A; HUP0203834A3; AU2005220241A1; CN1409765A; AU782418B2; ATE527361T1; EP1246920B1; CN102416173A; MXPA02002208A; EP1246920A2; PL205130B1; DK1246920T3; AU2005220241B2; CA2383367A1

Abstract

Un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

Description

Prevención de afecciones asociadas con circovirus-2 porcino

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere a vectores de ADN y/o composiciones para reducir la carga viral en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El circovirus-2 porcino (PCV-2) se identificó recientemente como un agente que se ha asociado consistentemente con síndrome multisistémico de emaciación posdestete (SMEP) en poblaciones porcinas en varias partes del mundo (Allan y col., 1998; Ellis y col., 1998). Las muestras aisladas de PCV-2 obtenidas de cerdos infectados en varios países son virtualmente idénticas genéticamente, y son claramente diferentes del PCV (CCL33, PCV-1) que fue identificado originariamente en la década de 1970 como un contaminante no citopático de la línea celular de riñón porcino (PK/15) (Meehan y col., 1998; Tischer y col., 1974). Los cerdos con infecciones por PCV-2 adquiridas naturalmente o inducidas experimentalmente se presentan con pérdida de peso progresiva, taquipnea, disnea e ictericia (Allan y col., 1998; Allan y col., 1999; Ellis y col., 1998; Ellis y col., 1999). Entre los grandes hallazgos patológicos que se han asociado directamente con antígeno de PCV-2 se incluyen linfadenopatía, neumonía intersticial, hepatitis y nefritis (Allan y col., 1998; Allan y col., 1999; Ellis y col., 1998; Ellis y col., 1999). Véanse también los documentos WO-A-99/18.214, WO-A-00/01.409, WO-A-99/29.717 y WO-A99/29.871. Hasta el presente PCV-2 no se ha relacionado directamente con aborto o lesiones en cerdos fetales.

[0003] Así, hasta el momento, no se ha propuesto abordar la cuestión de la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2.

OBJETOS Y RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0004] Sorprendentemente se ha encontrado que PCV-2 es un agente causante de miocarditis, aborto e infección intrauterina, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete.

[0005] Por definición, un inmunógeno de PCV-2 pretende comprender PCV-2 vivo atenuado o inactivado, o subunidad(es) de PCV-2 obtenida(s) por expresión in vitro o por extracción, o fragmento(s) que comprende(n) al menos un epítopo de interés que puede obtenerse por síntesis química o por expresión recombinante in vitro, así como vector(es) recombinante(s) que comprende(n) y que expresa(n) secuencia(s) o fragmento(s) o epítopo(s) in vivo de genoma de PCV-2 según se desvela en la presente memoria descriptiva o según se cita en los documentos o se refiere en la presente memoria descriptiva.

[0006] Se aplica una definición similar para un inmunógeno de otro patógeno porcino según se desvela en la presente memoria descriptiva.

[0007] Por definición, una composición inmunógena desencadena una respuesta inmunógena local o sistémica. Una composición de vacuna desencadena una respuesta de protección local o sistémica. El término "composición inmunógena" incluye una "composición de vacuna" (ya que el término anterior puede ser composición protectora).

[0008] Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

[0009] Según un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo, en la que dicha composición comprende:

a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, y

b) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

[0010] Según un tercer aspecto de la presente invención se proporciona uso de:

a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2 y

b) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario en la preparación de una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

[0011] Según un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de la cepa Imp1010 de PCV-2, y un segundo vector de plásmido de ADN que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2, para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

[0012] Según un quinto aspecto de la presente invención se proporciona una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo, en la que dicha composición comprende:

a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2,

b) un segundo vector de plásmido de ADN que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2, y

c) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario

[0013] Según un sexto aspecto de la presente invención se proporciona el uso de:

c) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario en la preparación de una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.

[0014] Según un séptimo aspecto de la presente invención se proporciona el primer plásmido para su uso según el primer aspecto de la presente invención; o la composición inmunógena para su uso según el segundo aspecto de la presente invención; o el uso del primer plásmido según el tercer aspecto de la presente invención; o los plásmidos primero y segundo para su uso según el cuarto aspecto de la presente invención; o la composición inmunógena para su uso según el quinto aspecto de la presente invención; o el uso de plásmidos primero y segundo según el sexto aspecto de la presente invención; en el que dicha primera secuencia de nucleótidos es ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2.

[0015] Según un octavo aspecto de la presente invención se proporcionan los plásmidos primero y segundo para su uso según el cuarto o el séptimo aspecto de la presente invención; o la composición inmunógena para su uso según el quinto o el séptimo aspecto de la presente invención; o el uso de un primer y segundo plásmido según el sexto y el séptimo aspecto de la presente invención; en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos es ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2.

[0016] Los autores de la invención describen procedimientos y/o composiciones para la prevención y/o tratamiento de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y/o secuelas patológicas que incluyen pero no se limitan a síndrome multisistémico de emaciación posdestete; y procedimientos para formular dichas composiciones (las composiciones pueden incluir también un inmunógeno de parvovirus porcino (PPV)) y usos de un inmunógeno de PCV-2 para formular dichas composiciones.

[0017] Los autores de la invención describen el uso de inmunógenos de PCV-2 para preparar composiciones para prevención y/o tratamiento de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2.

[0018] Los autores de la invención describen el aislamiento y caracterización de nuevas cepas 1103 (1103/1 P.2) y 1121 (1121/1 P.1) de PCV-2 identificadas, y sus usos para producir inmunógenos, en relación con miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y/o secuelas patológicas asociadas.

[0019] Los autores de la invención describen la inoculación de cerdas (por ejemplo, cerdas adultas, cerdas jóvenes que no han parido) con una composición que comprende un (al menos uno) inmunógeno de PCV-2 (la composición puede incluir también un inmunógeno de parvovirus porcino) antes de la reproducción y/o antes de la inseminación y/o durante la gestación (o preñez); y/o antes del periodo perinatal o de parto y/o repetidamente a lo largo de la vida, para prevenir miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con PCV-2, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2; o, para desencadenar una respuesta inmunógena o de protección frente a PCV-2 y prevenir con ello síndrome multisistémico de emaciación posdestete y/o miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino y/u otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2.

[0020] Ventajosamente, se realiza al menos una inoculación antes de la inseminación. También se sigue ventajosamente de una inoculación que se realizará durante la gestación, por ejemplo, aproximadamente mediada la gestación (aproximadamente en 6-8 semanas de gestación) y/o al final de la gestación (aproximadamente en 11-13 semanas de gestación). Así, un régimen ventajoso es una inoculación antes de la inseminación y una inoculación de recuerdo durante la gestación. Posteriormente, puede realizarse reinoculación antes de cada inseminación y/o durante la gestación aproximadamente mediada la gestación (aproximadamente en 6-8 semanas de gestación) y/o al final de la gestación (aproximadamente en 11-13 semanas de gestación). Preferentemente, la reinoculación puede realizarse sólo durante la gestación.

[0021] En otra forma de realización preferida, lechones, como lechones de hembras vacunadas (por ejemplo, inoculadas según se expone en la presente memoria descriptiva), son inoculados en las primeras semanas de vida, por ejemplo, inoculación con una y/o dos y/o tres y/o cuatro y/o cinco semanas de vida. Más preferentemente, los lechones son inoculados por primera vez en la primera semana de vida o en la tercera semana de vida (por ejemplo, en el momento del destete). Más ventajoso todavía es que dichos lechones reciban inoculación de recuerdo de dos (2) a cuatro (4) semanas más tarde (después de la primera inoculación). Así, tanto a la progenie como a las cerdas (por ejemplo, cerda adulta, cerda joven que no ha parido) pueden administrarse composiciones de la invención y/o pueden ser objeto del rendimiento de los procedimientos de la invención.

[0022] Los autores de la invención describen composiciones de vacunas o inmunógenas que comprenden inmunógeno(s) de cepa(s) 1103 y/o 1121 de PCV-2, para prevenir o tratar miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2.

[0023] Los autores de la invención describen además usos de un inmunógeno de PCV-2 para formular una composición de vacuna o inmunógena para prevenir o tratar miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2.

[0024] Adicionalmente, los autores de la invención describen una composición de vacuna o inmunógena para la prevención y/o tratamiento de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2 y/o síndrome multisistémico de emaciación posdestete que comprende un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y un inmunógeno de PCV-2.

[0025] Los autores de la invención describen que la composición puede incluir adicionalmente al menos un inmunógeno entre al menos un patógeno de cerdo adicional, por ejemplo: síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, seudorrabia, cólera porcino, gripe porcina, y Parvovirus porcino (PPV). Así, las composiciones basadas en vectores pueden incluir al menos un inmunógeno de al menos un patógeno de cerdo adicional, como, por ejemplo, un vector que expresa una secuencia de este patógeno, en el que el vector puede ser también el vector que expresa el inmunógeno de PCV-2. El vector que expresa una secuencia de PCV-2 puede comprender una secuencia o fragmento de PCV-2; y la invención comprende dichas moléculas de ácidos nucleicos, vectores que los contienen, composiciones que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos o productos de expresión de vectores a partir de dichas moléculas de ácidos nucleicos, composiciones que comprenden dichos productos de expresión, sondas o cebadores para dichas moléculas de ácidos nucleicos, y procedimientos para preparar y usar cualquiera o la totalidad de lo anterior.

[0026] Según la presente invención, el vector comprende un plásmido de vector de ADN. Los autores de la invención describen también los siguientes vectores: una bacteria como E. coli, un virus como baculovirus, un herpesvirus que incluye virus del herpes porcino, que incluye el virus de la enfermedad de Aujeszky, un adenovirus que incluye un adenovirus porcino, un poxvirus, que incluye un virus de vacuna, un virus de viruela aviar, un virus de viruela del canario, un virus de viruela del mapache y un virus de viruela porcina, y similares. Las composiciones basadas en vectores pueden comprender un vector que contiene y expresa un ORF seleccionado entre los ORF 4 y/o 13, de un PCV-2, ventajosamente de una cualquiera de las cepas de PCV-2 identificadas en la presente memoria descriptiva y en particular de cepas 1103 y/o 1121. Y, el inmunógeno en las composiciones (ya sean de PCV-2 y/o de otro patógeno porcino) puede producirse de forma recombinante.

[0027] La palabra plásmido pretende incluir cualquier unidad de transcripción de ADN en la forma de una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de PCV que se expresará. Ventajosamente, el plásmido incluye elementos necesarios para su expresión; por ejemplo, expresión in vivo. La forma de plásmido circular, superhelicoidal u otra, es ventajosa; y, la forma lineal se incluye también dentro del ámbito de la invención. La composición de plásmido de vacuna o inmunógena puede administrarse por medio de un cañón de genes, por vía intradérmica a través de un inyector sin aguja, por vía subcutánea o intramuscular, o por vía mucosa, o por cualquier otro medio que permita la expresión in vivo, y ventajosamente una respuesta inmunógena o de protección.

[0028] Debe observarse que el producto de expresión generado por vectores o recombinantes que describen los autores de la invención puede estar también opcionalmente aislado y/o purificado a partir de células infectadas o transfectadas; por ejemplo, para preparar composiciones para administración a cerdos; sin embargo, en ciertos casos, puede ser ventajoso no aislar y/o purificar un producto de expresión a partir de una célula; por ejemplo, cuando la célula o partes de la misma potencian el efecto inmunógeno del polipéptido.

[0029] Y se conocen y pueden usarse técnicas para purificación y/o aislamiento de proteínas, sin experimentación innecesaria, para purificar y/o aislar productos de expresión de vectores o recombinantes y/o subunidades de PCV-2 y/u otros patógenos porcinos, en la práctica de la invención; dichas técnicas, en general, pueden incluir: precipitación para aprovechar la solubilidad de la proteína de interés a diversas concentraciones de sales, precipitación con disolventes orgánicos, polímeros y otros materiales, precipitación por afinidad y desnaturalización selectiva; cromatografía en columna, que incluye cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad o de ligando colorante; inmunoprecipitación, filtración de gel, procedimientos electroforéticos, ultrafiltración y enfoque isoeléctrico, y sus combinaciones, entre otros.

[0030] Los autores de la invención describen procedimientos para la prevención y/o tratamiento de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por circovirus-2 porcino (PCV-2) y/o síndrome multisistémico de emaciación posdestete y/u otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2 que comprenden la inducción de una respuesta inmunógena o de protección frente a PCV-2 en un cerdo que comprende la administración al cerdo de una composición mencionada anteriormente o desvelada en la presente memoria descriptiva.

[0031] Así, los autores de la invención describen un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por circovirus-2 porcino (PCV-2) y/o síndrome multisistémico de emaciación posdestete y/u otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2 que comprende la inducción de una respuesta inmunógena o de protección frente a PCV-2 en un cerdo que comprende la administración al cerdo de una composición que comprende un soporte o excipiente o vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico o veterinario, preferentemente con un adyuvante, y un agente activo que comprende un inmunógeno de PCV-2. El procedimiento puede ser para la prevención de miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina causados por PCV-2 que comprende la administración de una composición que comprende un soporte aceptable y un inmunógeno de PCV-2. El procedimiento puede implicar una composición que es una composición inmunógena de subunidad. El procedimiento puede implicar la composición que incluye adicionalmente al menos un inmunógeno de al menos un patógeno porcino adicional, que incluye un vector que expresa dicho inmunógeno o epítopo; por ejemplo, el al menos un patógeno porcino adicional puede seleccionarse entre el grupo que consiste en SRRP, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, seudorrabia, cólera porcino, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, gripe porcina y PPV y combinaciones de los mismos. El procedimiento puede implicar un vector que es el plásmido de vector de ADN para su uso en la invención o un vector descrito que es una bacteria como E. coli, un virus como baculovirus, un herpesvirus que incluye virus de la enfermedad de Aujeszky, un adenovirus que incluye un adenovirus porcino, un poxvirus, que incluye un virus de la vacuna, un virus de la viruela aviar, un virus de la viruela del canario y un virus de la viruela porcina, y similares. El procedimiento puede implicar una composición basada en vector adicionalmente que incluye al menos una secuencia, fragmento o epítopo de al menos un patógeno porcino adicional, o un vector que expresa dicha secuencia, fragmento o epítopo, en el que el vector puede ser también el vector que expresa la secuencia, fragmento o epítopo de PCV-2. El procedimiento puede implicar un vector que contiene y expresa un ORF seleccionado entre el grupo que consiste en los ORF 1 a 13, por ejemplo, un ORF seleccionado entre los ORF 4, 7, 10 y 13; preferentemente los ORF 4 y/o 13. El procedimiento puede implicar también una composición de base inmunógena en la que uno o más del o de los inmunógenos se produce recombinantemente En este procedimiento, se inocula preferentemente a las hembras y/o los lechones según se describe anteriormente.

[0032] En otra forma de realización, la invención implica un procedimiento para preparar cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o desveladas en la presente memoria descriptiva que comprende la mezcla del soporte y posiblemente el adyuvante aceptable desde un punto de vista farmacéutico o veterinario, y el vector de plásmido de ADN. Los autores de la invención describen un procedimiento que puede incluir además la transfección o infección de una célula u hospedador con un vector recombinante que contiene ADN que codifica un inmunógeno de PCV-2 y expresa ese inmunógeno; y opcionalmente la purificación y/o el aislamiento del inmunógeno a partir de la célula. Análogamente el procedimiento puede incluir el aislamiento y/o purificación de un inmunógeno de PCV-2 de PCV-2, o el aislamiento de PCV-2 a partir de una muestra.

[0033] Los autores de la invención describen también un kit para preparar cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o desveladas en la presente memoria descriptiva o para realizar cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente o desvelados en la presente memoria descriptiva que comprenden en un primer recipiente el soporte o vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico o veterinario y en un segundo recipiente el agente activo que comprende el inmunógeno de PCV-2, en el que el primer y el segundo recipiente están envasados opcionalmente juntos, y el kit incluye opcionalmente instrucciones para la mezcla de ingredientes de la composición y/o administración de la composición.

[0034] Los autores de la invención describen además la administración de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o desveladas en la presente memoria descriptiva para cerdos machos y/o hembras; para prevenir la transmisión de PCV-2 y prevenir o tratar o controlar miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2.

[0035] La administración se realiza preferentemente según se describe anteriormente.

[0036] El término "que comprende" en esta descripción puede significar "que incluye" o puede tener el significación dado comúnmente al término "que comprende" en la Ley de Patentes de EE.UU.

[0037] Se describen otros aspectos de la invención en, o son evidentes a partir de (y dentro del ámbito de la invención) la siguiente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0038] El circovirus-2 porcino (PCV-2) es un agente asociado con síndrome multisistémico de emaciación posdestete (SMEP) en poblaciones porcinas. Según se muestra en los Ejemplos de referencia 1 y 2, el espectro potencial de enfermedad asociado a PCV-2 se ha ampliado por la evidencia de transmisión vertical y fallo reproductor asociado.

[0039] En particular, el Ejemplo 1 muestra que se aisló PCV-2 a partir de una camada de lechones abortados de una granja que estaba sufriendo abortos a término y mortinatos. En un lechón estaba presente una miocarditis difusa grave asociada con tinción inmunohistoquímica extensa para antígeno de PCV-2. Había también cantidades variables de antígeno de PCV-2 en el hígado, el pulmón y el riñón de múltiples fetos. La presencia de otros agentes que se han asociado con lesiones fetales y abortos en ganado porcino que incluyen parvovirus porcino, virus del síndrome reproductivo respiratorio porcino, virus de encefalomiocarditis y enterovirus no pudo establecerse.

[0040] Más en particular, el Ejemplo de referencia 2 muestra que los tejidos obtenidos de 30 rebaños con buena salud durante un periodo de cuatro años, y sometidos a ensayo en casos rutinarios de aborto o fallo reproductivo, fueron positivos para PCV-2 en dos remisiones que afectaban a varios lechones mortinatos y neonatos no viables que presentaban miocarditis difusa grave, hipertrofia cardiaca y evidencia de congestión crónica pasiva. Las dos remisiones positivas procedían de la misma granja, pero ocurrieron en dos momentos diferentes. La presencia de PCV-2 en los corazones y otros tejidos de lechones afectados se confirmó mediante inmunohistoquímica y aislamiento de virus. La incapacidad de detectar circovirus porcinos en casos de fallo reproductivo antes de 1999 en áreas de infecciones endémicas sustenta la opinión de que la enfermedad reproductiva es una nueva manifestación clínica de infección por PCV-2, y sugiere además que los modos de transmisión sexuales, así como verticales, son responsables para la diseminación vírica en la población porcina.

[0041] En consecuencia, la inoculación de cerdos, por ejemplo, cerdas, como cerdas adultas o cerdas jóvenes que no han parido, con una composición que incluye al menos un inmunógeno de PCV-2 (por ejemplo, entre al menos una cepa elegida entre cepas Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 y 1121) (la composición puede incluir también al menos un inmunógeno a partir de al menos otro patógeno porcino como, por ejemplo, al menos un parvovirus porcino, en la que cuando se usa un vector el vector puede coexpresar tanto el o los inmunógenos de PCV-2 como el al menos un inmunógeno del al menos otro patógeno porcino, por ejemplo, inmunógeno(s) de PPV, entre otros, en particular en un programa de inmunización según se describe anteriormente, puede prevenir la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con PCV-2, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2.

[0042] Así, los autores de la invención describen procedimientos y composiciones que usan inmunógeno de PCV-2 para prevenir miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2. En particular, el inmunógeno de la cepa 1103 y/o la cepa 1121 es útil para procedimientos y composiciones que usan inmunógeno de PCV-2 para prevenir miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino.

[0043] Los autores de la invención describen el uso de cualquier cepa de PCV-2 conocida o inmunógeno del mismo para formular una composición de vacuna o inmunógena para prevenir o tratar miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con PCV-2, así como síndrome multisistémico posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2 (estas cepas incluyen cepas Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 y 1121), en particular cuando la composición está destinada a administrarse a lechones como, por ejemplo, a lechones de hembras vacunadas y más en particular a cerdas, en particular a hembras gestantes o hembras que serán sometidas a inseminación; y más en particular según los programas de inoculación definidos anteriormente.

[0044] Más en particular, el uso es para formular dichas composiciones destinadas a prevenir o tratar miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con PCV-2, en particular cuando la composición está destinada a administrarse a lechones como, por ejemplo, a lechones de hembras vacunadas y más en particular a cerdas, en particular a hembras gestantes o hembras que se someterán a inseminación; y más en particular según los programas de inoculación definidos anteriormente.

[0045] El al menos un inmunógeno de al menos otro patógeno porcino puede ser según se usa en vacunas porcinas conocidas o composiciones inmunógenas, o según el documento WO-98/03.658.

[0046] Las composiciones para su uso en la invención pueden prepararse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidos para los expertos en las técnicas veterinarias o farmacéuticas. Dichas composiciones pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas para los expertos en las técnicas veterinarias teniendo en consideración factores como la edad el sexo, el peso, el estado y el tratamiento particular del cerdo, y la vía de administración. Las composiciones pueden administrarse en solitario, o pueden coadministrarse o administrarse en secuencia con otras composiciones descritas en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, otras composiciones que comprenden un inmunógeno de PCV-2) o con otras composiciones profilácticas o terapéuticas (por ejemplo, otras composiciones de vacunas o inmunógenas porcinas). Así, la invención también proporciona composiciones multivalentes o de "cóctel" o en combinación y procedimientos que las emplean. A este respecto, se hace referencia a la patente de EE.UU. nº 5.843.456 dirigida a composiciones de rabia y composiciones de combinación y usos de las mismas.

[0047] Las composiciones para su uso en la invención pueden usarse para administración parenteral o mucosa, preferentemente por vías intradérmica o intramuscular. En particular para vía intradérmica, la inyección puede realizarse usando un inyector sin aguja. Cuando se usa administración mucosa, es posible usar vías oral, nasal u ocular.

[0048] En dichas composiciones el o los inmunógenos pueden estar en una mezcla con un soporte, diluyente o excipiente adecuado como agua estéril, suero fisiológico salino, glucosa o similares y/o preferentemente con un adyuvante. Las composiciones pueden estar también liofilizadas o congeladas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes amortiguadores de pH, adyuvantes, conservantes, excipientes de polímero usados para vías mucosas, y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseadas.

[0049] Pueden consultarse los textos estándar, como "REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17ª edición, 1985, para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentación innecesaria. Las dosificaciones adecuadas pueden basarse también en el texto de la presente memoria descriptiva y los documentos citados en la presente memoria descriptiva.

[0050] Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmunitaria a inmunógenos. Los adyuvantes pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas por ejemplo, Quil A, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquida ligero (tipo Farmacopea Europea); aceite isoprenoide como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más en particular aceites de vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o de alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (por ejemplo oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos de Pluronic®; especialmente L121. Véase Hunter y col., The Theory and Practical Application of Adyuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pág. 51-94 (1995) y Todd y col., Vaccine 15:564-570 (1997).

[0051] Por ejemplo, es posible usar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunity and Adyuvant Approach" editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.

[0052] Por ejemplo la vacuna que contiene adyuvante se prepara de la siguiente forma: el 67% v/v de fase acuosa que comprende el inmunógeno se emulsiona en el 2,3% p/v de oleato de anhidromanitol, el 2,6% p/v de ácido oleico etoxilado con 11 OE (óxido de etileno) y el 28,1% v/v de aceite de parafina líquida ligero (tipo Farmacopea Europea) con la ayuda de un turbomezclador emulsionante.

[0053] Un procedimiento alternativo para preparar la emulsión consiste en emulsión, por pasos a través de un homogeneizador de alta presión, una mezcla del 5% p/v de escualano, el 2,5% p/v de Pluronic® L121, el 0,2% p/v de un éster de ácido oleico y de anhidrosorbitol etoxilado con 20 EO, el 92,3% v/v de la fase acuosa que comprende el inmunógeno.

[0054] También es posible formular con polímeros sintéticos (por ejemplo, homo- y copolímeros de ácido láctico y glicólico, que se han usado para producir microesferas que encapsulan inmunógenos, véase Eldridge y col., Mol. Immunol. 28:287-294 (1993), por ejemplo, microesferas biodegradables), con citocinas como IL-2 y IL-12 (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.334.379), y GMCSF, ventajosamente GMCSF porcino (factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos, véase, generalmente, patentes de EE.UU. nº 4.999.291 y 5.461.663, véase también Clark y col., Science 1987, 230:1229; Grant y col., Drugs, 1992, 53:516), entre otros. Determinados adyuvantes pueden expresarse in vivo con inmunógeno(s) y/o epítopo(s); por ejemplo, citocinas, GMCSF (véase, por ejemplo, Inumaru y Takamatsu, Immunol. Cell. Biol., 1995, 73:474-76 que se refieren a un plásmido que codifica y que expresa GM-CSF porcino).

[0055] Un caso adicional de un adyuvante es un compuesto escogido entre los polímeros de ácido acrílico y metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Los compuestos de adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, nº 2, junio de 1996). Los expertos en la materia pueden referirse también a la patente de EE.UU. nº 2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, estando sustituidos los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener en sí otros sustituyentes, como metilo. Los productos comercializados con el nombre de Carbopolt® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente apropiados. Están reticulados con una sacarosa de alilo o con pentaeritritol de alilo. Entre ellos, puede mencionarse Carbopol® 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, se prefieren los copolímeros EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados con éter divinílico. Puede hacerse referencia a J. Fields y col., Nature, 186: 778-780, 4 de junio de 1960.

[0056] Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros EMA® están formados preferentemente por unidades básicas de la fórmula siguiente:

en la que:

10 R1, y R2, que son idénticos o diferentes, representan H o CH3; x = 0 ó 1, preferentemente x = 1; e y = 1 ó 2, con x + y = 2.

[0057] Para los copolímeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y =1.

15 [0058] La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que será neutralizada, preferentemente a pH fisiológico, con el fin de dar la solución adyuvante en la que se incorporará en sí la composición inmunógena, inmunológica o de vacuna. Los grupos carboxilo del polímero están entonces en parte en la forma COO-. Preferentemente, se prepara una solución de adyuvante según la invención, especialmente de

20 carbómero, en agua destilada, preferentemente en presencia de cloruro de sodio, obteniéndose la solución a pH ácido. Esta solución de reserva se diluye añadiéndola a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, preferentemente suero salino fisiológico (NaCl 9 g/l) todo de una vez en varias porciones con neutralización simultánea o subsiguiente (pH 7,3 a 7,4), preferentemente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se usará tal cual para su mezcla con la vacuna,

25 que puede almacenarse especialmente en forma congelada en seco, líquida o congelada.

[0059] La concentración del polímero en la composición final de vacuna puede ser del 0,01% al 2% p/v, por ejemplo, del 0,06 al 1% p/v, por ejemplo, del 0,1 al 0.6% p/v.

30 [0060] A partir de esta descripción y del conocimiento de la técnica, el experto en la materia puede seleccionar un adyuvante adecuado, si lo desea, y la cantidad del mismo para emplear en una composición inmunógena para su uso en la invención, sin experimentación innecesaria.

[0061] Los autores de la invención describen que las composiciones inmunógenas para su uso en la

35 invención pueden estar asociadas a al menos una vacuna viva atenuada, inactivada o de subunidad, o vacuna recombinante (por ejemplo, poxvirus como plásmido de ADN o vector) que expresa al menos un inmunógeno o epítopo de interés a partir de al menos otro patógeno porcino.

[0062] Se plantean composiciones en formas para diversas vías de administración para su uso en la

40 invención. Y de nuevo, la dosificación eficaz y la vía de administración están determinadas por factores conocidos, como, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso y otros procedimientos de cribado que son conocidos y no requieren experimentación innecesaria. Las dosificaciones de cada agente activo pueden ser como en los documentos citados en la presente memoria descriptiva y/o pueden estar comprendidas entre uno o algunos y varios centenares o miles de microgramos, por ejemplo, de 1 g a 1 mg, para una composición inmunógena de

45 subunidad; y, los autores de la invención describen de 104 a 1010 DICT50 ventajosamente de 106 a 108 DICT50 para una composición inmunógena o de vacuna inactivada (valoración antes de inactivación). Para una composición de vacuna o inmunógena viva atenuada descrita, la dosis puede estar entre 101 y 108 DICT50 ventajosamente de 103 y 106 DICT50.

50 [0063] Los recombinantes o vectores pueden administrarse en una cantidad adecuada para obtener expresión in vivo que corresponde a las dosificaciones descritas en la presente memoria descriptiva y/o en los documentos citados en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, los autores de la invención describen intervalos adecuados para suspensiones víricas que pueden determinarse empíricamente. El recombinante o vector vírico descrito puede administrarse a un cerdo o infectarse o transfectarse en células en una cantidad de aproximadamente al menos 103 ufp; más preferentemente de aproximadamente 104 ufp a aproximadamente 1010 ufp, por ejemplo, de aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 109 ufp, por ejemplo de aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 108 ufp, por dosis, por ejemplo de aproximadamente 2 ml. Y, si se expresa más de un producto génico mediante más de un recombinante, cada recombinante puede administrarse en estas cantidades; o, cada recombinante puede administrarse de manera que existe, en combinación, una suma de recombinantes que comprende estas cantidades.

[0064] En composiciones de plásmido empleadas en la invención, las dosificaciones puede ser según se describe en los documentos citados en la presente memoria descriptiva o según se describe en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, las cantidades adecuadas de cada ADN de plásmido en composiciones de plásmido puede ser de 1 g a 2 mg, preferentemente de 50 g a 1 mg. Los documentos citados en la presente memoria descriptiva en relación con vectores de plásmido de ADN pueden ser consultados por el experto en la materia para determinar otras dosificaciones adecuadas para composiciones de vectores de plásmido de ADN de la invención, sin experimentación innecesaria.

[0065] Sin embargo, la dosificación de la o las composiciones, la concentración de componentes de las mismas y el tiempo de administración de la o las composiciones, que desencadenan una respuesta inmunogénica adecuada, pueden determinarse mediante procedimientos como valoraciones de anticuerpos de sueros, por ejemplo, por ELISA y/o análisis de ensayo de seroneutralización y/o por evaluación de provocación de vacunación en cerdos. Dicha determinación no requiere experimentación innecesaria a partir del conocimiento del experto en la materia, esta descripción y los documentos citados en la presente memoria descriptiva. Y, el momento para administraciones en secuencia puede determinarse análogamente con procedimientos que pueden deducirse a partir de esta descripción, y el conocimiento en la materia, sin experimentación innecesaria.

[0066] El inmunógeno de PCV-2 puede obtenerse a partir de PCV-2 o puede obtenerse a partir de expresión recombinante in vitro de gen(es) de PCV-2 o porciones o epítopos de los mismos. Los procedimientos para preparar y/o usar vectores (o recombinantes) para expresión pueden realizarse por o ser análogos a los procedimientos desvelados en: patentes de EE.UU. nº 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235, 5.756.103, 5.766.599, 6.004.777, 5.990.091, 6.033.904, 5.869.312, 5.382.425, las publicaciones PCT WO-94/16.716, WO-96/39.491, WO95/30.018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update”, PNAS USA 93:11349-11353, octubre de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety”, PNAS USA 93:11341-11348, octubre de 1996, Smith y col., patente de EE.UU. nº 4.745.051 (baculovirus recombinante), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith y col., "Production of Huma Beta Interferon in Insect Células Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, Dic., 1983, Vol. 3, nº 12, p. 2156-2165; Pennock y col., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”, Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, nº 3, p. 399-406; EP-A-0.370.573, solicitud de EE.UU. nº serie 920.197, registrada el 16 de octubre de 1986, publicación de patente EP nº 265.785, patente de EE.UU. nº

4.769.331 (herpesvirus recombinante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: a primer for genetic engineering of novel vectores”, PNAS USA 93:11307-1131. 2 de octubre de 1996, Andreansky y col., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors”, PNAS USA 93:11313-11318, octubre de 1996, Robertson y col., "Epstein-Barr virus vectores for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93:11334-11340, octubre de 1996, Frolov y col., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications”, PNAS USA 93:11371-11377, octubre de 1996, Kitson y col., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patentes de EE.UU. nº 5.591.439, 5.552.143, WO-98/00.166, solicitudes de EE.UU. permitidas nº serie 08/675.556, y 08/675.566 ambas registradas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante), Grunhaus y col., 1992, "Adenovirus as cloning vectors”, Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52,1993, Ballay y col., EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril de, 1990, Prevec y col., J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT WO91/11.525, Felgner y col., (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 y McClements y col., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D o glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93:11414-11420, octubre de 1996, y patentes de EE.UU. nº 5.591.639, 5.589.466 y 5.580.859, así como los documentos WO-A-90/11.092, WO-A-93/19.183, WO-A-94/21.797, WO-A-95/11.307, WO-A-95/20.660, Tang y col., Nature 356, 152-154, 1992, y Furth y col., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992, en relación con vectores de expresión de ADN, entre otros. Véase también el documento WO-98/33.510; Ju y col., Diabetology, 41:736-739, 1998 (expresión y sistema de lentivirus); Sanford y col., patente de EE.UU. nº 4.945.050; Fischbach y col., (Intracel), el documento WO90/01.543; Robinson y col., Seminars in IMMUNOLOGY, vol. 9, pág. 271-283 (1997) (sistemas de vectores de ADN); Szoka y col., patente de EE.UU. nº 4.394.448 (procedimiento de introducción de ADN en células vivas); McCormick y col., patente de EE.UU. nº 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y patente de EE.UU. nº 5.928.913 (vectores para suministro de genes), así como otros documentos citados en la presente memoria descriptiva. Los autores de la invención describen que un vector vírico seleccionado, por ejemplo, a partir de virus de herpes del cerdo, como virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, poxvirus, especialmente virus de vacuna, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario y virus de la viruela porcina, se emplea ventajosamente, así como vectores de plásmido de ADN empleados en la práctica de la invención.

[0067] El producto de expresión a partir del o los genes de PCV-2 o porciones de los mismos puede ser útil para generar anticuerpos como anticuerpos monoclonales o policlonales que son útiles para fines de diagnóstico. Análogamente, el o los productos de expresión a partir del o los genes de PCV-2 o porciones de los mismos pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico.

[0068] Además, el experto en la materia puede determinar un epítopo de interés en un inmunógeno de PCV-2, o en un inmunógeno de otro patógeno porcino, sin experimentación innecesaria, a partir de la descripción de la presente memoria descriptiva y del conocimiento en la materia; véase, por ejemplo, el documento WO98/40.500, en relación con información general para determinar un epítopo o una región epitópica de interés de una proteína, entre otros.

[0069] Los autores de la invención describen que son composiciones de vacuna o inmunógenas ventajosas: un composición de vacuna o inmunógena, reunida a partir de un cultivo celular in vitro que ha sido infectada con una preparación purificada de PCV-2, como, por ejemplo, una preparación purificada de circovirus porcino seleccionada a partir del grupo que consiste en las preparaciones depositadas en la ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, RU), con las siguientes referencias: nº acceso V97100219 (cepa Imp. 1008), nº V97100218 (cepa Imp. 1010) y nº acceso V97100217 (cepa Imp. 999) depositadas el 2 de octubre de 1997, nº acceso V98011608 (cepa Imp. 1011-48285) y nº V98011609 (cepa Imp. 1011-48121) depositadas el 16 de enero de 1998, nº acceso 00012710 (cepa 1103) y nº 00012709 (cepa 1121) depositadas el 2 de febrero de 2000, o una composición de vacuna o inmunógena formada por circovirus porcino producida en, y aislada a partir de cultivo celular in vitro, habiéndose infectado estas células con un circovirus porcino susceptible de ser aislado a partir de una muestra fisiológica o de una muestra de tejido, especialmente lesiones, a partir de un cerdo que tiene el síndrome SMEP, por ejemplo, una composición en la que el circovirus porcino se ha producido en, y aislado a partir de una línea celular de riñón de cerdo, por ejemplo, producido en, y aislado a partir de células PK/15 libres de contaminación con PCV-1; o una composición que comprende o que se prepara a partir de un extracto de cultivo o sobrenadante, recogido a partir de un cultivo celular in vitro que ha sido infectado con dicho circovirus. Así, los autores de la invención describen que el circovirus porcino puede ser un inmunógeno.

[0070] Los autores de la invención describen que la composición de vacuna inmunógena puede comprender inmunógenos de PCV-2 y/o inmunógenos de varios circovirus porcinos (que incluyen PCV-2 o varias cepas de PCV-2, y que incluyen PCV-1), así como opcionalmente inmunógenos adicionales de otro patógeno porcino; por ejemplo, SRRP, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, seudorrabia, cólera porcino, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, gripe porcina, PPV (véase también documento WO-A-00/01.409).

[0071] Los autores de la invención describen que el inmunógeno en la composición inmunógena para su uso en la invención puede expresarse a partir de un fragmento de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos de PCV-2 o fragmento de los mismos (que codifica ventajosamente al menos un epítopo), seleccionada por ejemplo a partir del grupo que consiste en las secuencias designadas por las referencias SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, así como SEQ ID No: 6 y SEQ ID No: 7 (fig. 1-4 y 6-7). El inmunógeno en la composición inmunógena puede expresarse a partir de un fragmento de ADN que contiene un ORF seleccionado entre los ORF 4 y/o 13, de una cepa de PCV-2, en particular de una de las cepas identificadas anteriormente (según se designa en el documento WO-A-99/18.214-véase también tabla 1 a continuación). Así, los autores de la invención describen que el inmunógeno o una porción del mismo, por ejemplo, un epítopo de interés puede obtenerse por expresión in vitro del mismo a partir de un recombinante o un vector. El inmunógeno puede purificarse y/o concentrarse adicionalmente mediante los procedimientos convencionales.

[0072] Los autores de la invención describen que el inmunógeno en la composición inmunógena para su uso en la invención puede expresarse in vivo mediante un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos de PCV-2 o un fragmento de la misma (ventajosamente que codifica al menos un epítopo), seleccionada por ejemplo entre el grupo que consiste en las secuencias designadas por las referencias SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 6, así como SEQ ID No: 6 y SEQ ID No: 7 (fig. 1-4 y 6-7). Análogamente, el inmunógeno en la composición inmunógena puede expresarse in vivo mediante un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que contiene un ORF seleccionado entre los ORF 4 y/o 13, de una cepa de PCV-2, en particular de una de las cepas identificadas anteriormente. Es decir, los autores de la invención describen que la composición inmunógena puede comprender un vector de expresión que expresa el inmunógeno o una porción del mismo, por ejemplo, un epítopo de interés,

in vivo.

[0073] Según la invención el vector de expresión es un vector seleccionado a partir de plásmidos de ADN. Los autores de la invención describen también los siguientes vectores: bacterias como E. coli, virus como baculovirus, herpesvirus como virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus que incluye adenovirus porcinos, poxvirus, especialmente virus de vacuna, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario y virus de la viruela porcina, entre otros. (El experto en la materia puede referirse también a las solicitudes EE.UU. de Audonnet y col., y Bublot y col., nº serie 60/138.352 y 60/138.478, respectivamente, las dos registradas el 10 de junio de 1999, en particular a la descripción detallada y más en particular a los ejemplos (se proporcionan extractos de los cuales en "VACUNA DE ADN-PCV Ejemplo 12", y "VACUNA DE POXVIRUS RECOMBINANTE DE CIRCOVIRUS PORCINO Ejemplo 13", respectivamente).

[0074] En consecuencia, la invención incluye vectores de plásmido de ADN que contienen moléculas de ácidos nucleicos. Los autores de la invención describen también productos de expresión de los mismos, composiciones que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos y/o vectores y/o productos de expresión, así como procedimientos para preparar y usar cualquiera o la totalidad de estas formas de realización. Los autores de la invención describen en la presente memoria descriptiva ORF y/o fragmentos que codifican un inmunógeno o epítopo, así como moléculas de ácidos nucleicos de cepas 1103 y/o 1121, en particular sus ORF 1 a 13, como, por ejemplo, los ORF 4, 7, 10 y 13, preferentemente los ORF 4 y/o 13, y fragmentos de los mismos, así como vectores que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos, composiciones que comprenden estas moléculas nucleicas, vectores, o productos de expresión de las mismas, composiciones que comprenden dichos productos de expresión, cebadores o sondas para dichas moléculas de ácidos nucleicos, y usos o procedimientos que afectan a estas formas de realización, por ejemplo, para detectar, diagnosticar, someter a ensayo para PCV2, para inducir una respuesta inmunógena o de protección, y similares.

[0075] Los autores de la invención describen también sondas o cebadores a partir de las cepas 1103 y/o 1121 de PCV-2 que pueden ser útiles, para amplificar ADN de PCV-2, por ejemplo, para preparar un vector de expresión. Una sonda o cebador puede ser cualquier extensión de al menos 8, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 12, 13, 14, ó 15, por ejemplo, al menos 20, por ejemplo, al menos 23 ó 25, por ejemplo al menos 27 ó 30 nucleótidos en el genoma de PCV-2 o un gen de PCV-2 que son únicos para PCV-2, y posiblemente para estas cepas, o que están en PCV-2 y están menos conservados entre la familia de PCV o circovirus. En cuanto a cebadores o sondas de hibridación o de PCR y longitudes óptimas de los mismos, se hace referencia también a Kajimura y col., GATA 7 (4): 71-79 (1990). La hibridación se realiza ventajosamente en condiciones de gran fidelidad, en el sentido en que debe entenderse el término "gran fidelidad" entre los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Hames y Higgins, eds., 1985, Nucleic Acid Hybridización, IRL Press, Oxford, RU). Se entenderá que la hibridación se realiza usando técnicas bien establecidas, que incluyen pero no se limitan a hibridación por transferencia Southern, hibridación por transferencia Northern, hibridación in situ y, ventajosamente, hibridación Southern para fragmentos de ADN amplificados por PCR.

[0076] Como sondas o cebadores, se describen péptidos que no son de proteínas de PCV-2 de longitud completa y pueden ser cualquier extensión de al menos 8, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 12, 13, 14 ó 15, por ejemplo, al menos 20, por ejemplo, al menos 23 ó 25, por ejemplo al menos 27 ó 30 aminoácidos en PCV-2 que son únicos para PCV-2, y posiblemente para esas cepas, o que están en PCV-2 y están menos conservados entre la familia de PCV y/o circovirus. Alternativa o adicionalmente, los aminoácidos que no son proteínas de PCV-2 de longitud completa pueden ser una región epitópica de una proteína de PCV-2.

[0077] Las secuencias de PCV-2 se desvelan en Meehan y col., 1998 (cepa Imp. 1010; ORF1 nucleótidos 398-1342; ORF2 nucleótidos 1381-314; y corresponden respectivamente a ORF4 y ORF13 en la terminología de la invención (véase tabla 1), en la solicitud de EE.UU. nº serie 09/161.092 de 25 de septiembre de 1998 y a COL4 y COL13 en el documento WO-A-99/18.214). En la presente memoria descriptiva se desvelan varias cepas de PCV-2 y sus secuencias y se denominan ImplO08, Imp999, ImplO11-48285, Imp1011-48121, 1103 y 1121. Se desvelan otras cepas en A. L. Hamel y col., J. Virol. junio de 1998, vol. 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) y en I. Morozov y col., J. Clinical Microb. Sept 1998 vol. 36, 9: 2535-2541, así como GenBank AF086834, AF086835 y AF086836. Los autores de la invención describen el uso de estas secuencias, o de ORF de las mismas, o de regiones de las mismas que codifican un antígeno o inmunógeno o epítopo de interés.

[0078] La invención también comprende las secuencias equivalentes a las usadas o mencionadas en la presente memoria descriptiva y en documentos citados en la presente memoria descriptiva; por ejemplo, secuencias que son susceptibles de hibridación a la secuencia de nucleótidos en condiciones de gran fidelidad (véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989)).

[0079] Entre las secuencias equivalentes, pueden mencionarse también los fragmentos génicos que conservan la inmunogenicidad de la secuencia completa, por ejemplo, un epítopo de interés.

[0080] La homología entre el genoma completo de PCV tipos 1 y 2 es aproximadamente del 75%. Pero

5 dentro del tipo 2, la homología es generalmente superior al 95%. Así, en la práctica de la invención, el uso de cualquier cepa de PCV-2 está comprendido por equivalencia. Un criterio puede ser que la cepa es de tipo 2, por ejemplo que la homología en el nivel de nucleótido del genoma completo es igual o mayor que el 85%, ventajosamente el 90% o más, más ventajosamente el 95% o más, preferentemente el 97, el 98 o el 99% o más, con las cepas desveladas en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, la cepa Imp1010.

[0081] Los límites de los ORF de la cepa Imp1010 se dan en la siguiente tabla 1:

Nombre: Inicio Fin Hebra Tamaño de ORF (nucleótidos (nt)) Tamaño de proteína (aminoácidos (aa))

ORF1: 103 210 Codificante 108 nt 35 aa

ORF2: 1180 1317 Codificante 138 nt 45 aa

ORF3: 1363 1524 Codificante 162 nt 53 aa

ORF4: 398 1342 Codificante 945 nt 314 aa

ORF5: 900 1079 Codificante 180 nt 59 aa

ORF6: 1254 1334 Codificante 81 nt 26 aa

ORF7: 1018 704 No codificante 315 nt 104 aa

ORF8: 439 311 No codificante 129 nt 42 aa

ORF9: 190 101 No codificante 90 nt 29 aa

ORF10: 912 733 No codificante 180 nt 59 aa

ORF11: 645 565 No codificante 81 nt 26 aa

ORF12: 1100 1035 No codificante 66 nt 21 aa

ORF13: 314 1381 No codificante 702 nt 213 aa

[0082] Los ORF se definen con respecto a la cepa Imp1010. La invención también comprende el uso de

15 los ORF correspondientes en cualquier otra cepa de PCV-2, y cualquiera de las cepas de PCV-2 según se define en la presente memoria descriptiva o en documentos citados en la presente memoria descriptiva. Así, a partir de la secuencia genómica de nucleótidos, es una técnica rutinaria la determinación de los ORF que usan un software estándar, por ejemplo, MacVector®. Además, la alineación de los genomas con los de la cepa 1010 y la comparación con los ORF de la cepa 1010 permite al experto en la materia determinar fácilmente los ORF en el

20 genoma para otra cepa (por ejemplo, los desvelados en el documento WO-A-99/18.214, es decir, ImpI008, ImpI011-48121, ImpI011-48285, Imp999, así como las nuevas cepas 1103 y 1121). El uso del software o la realización de la alineación no es experimentación innecesaria y proporcionan directamente acceso a estos ORF.

[0083] Por ejemplo, en referencia a las fig. 6 y 7, los ORF correspondientes de las cepas 1103 y 1121 son 25 según se indica en la siguiente Tabla 2:

ORF1: 1524 1631 Codificante 108 nt 35 aa

ORF2: 833 970 Codificante 138 nt 45 aa

ORF3: 1016 1177 Codificante 162 nt 53 aa

ORF4: 51 995 Codificante 945 nt. 314 aa

ORF5: 553 732 Codificante 180 nt 59 aa

ORF6: 907 987 Codificante 81 nt 26 aa

ORF7: 671 357 No codificante 315 nt 104 aa

ORF8: 92 1732 No codificante 129 nt 42 aa

ORF9: 1611 1522 No codificante 90 nt 29 aa

ORF10: 565 386 No codificante 180 nt 59 aa

ORF11: 298 218 No codificante 81 nt 26 aa

ORF12: 753 688 No codificante 66 nt 21 aa

ORF13: 1735 1037 No codificante 702 nt 213 aa

[0084] También son equivalentes y útiles en la práctica de la invención las secuencias de nucleótidos que no cambian la funcionalidad ni la especificidad de la cepa (es decir, de la cepa de tipo 2) del gen considerado o de 30 los de los polipéptidos codificados por este gen. Naturalmente, las secuencias que difieren a través de la degeneración del código están incluidas en la práctica de la invención.

[0085] Para ORF4, la homología entre PCV-1 y PCV-2 es de aproximadamente el 86%, y para ORF13, la homología entre PCV-1 y PCV-2 es aproximadamente del 66%. Así, son también secuencias equivalentes útiles en la práctica de la presente invención, para ORF4, aquellas secuencias que tienen una homología del 95% o más homología con ORF4 de la cepa Imp1010, y para ORF13, aquellas secuencias que tienen una homología del 95% o más que ORF13 de cepa Imp1010 (usando la terminología de la tabla 1).

[0086] Para homología relativa a los otros ORF, que se describen en la presente memoria descriptiva, se pueden determinar aquellas secuencias que provienen de una cepa de PCV que tiene un ORF4 y/o un ORF13 que tienen una homología según se define anteriormente con el ORF correspondiente de la cepa 1010. Para ORF7, los autores de la invención describen secuencias que tienen una homología que es ventajosamente igual o superior al 80%, más ventajosamente del 85% o más, preferentemente del 90% o el 95% o más con ORF7 de cepa Imp1010. Para ORF10, los autores de la invención describen secuencias que tienen una homología que es ventajosamente igual o superior al 86%, más ventajosamente el 90% o más, preferentemente del 95% o más con ORF10 de cepa Imp1010 (usando la terminología de la tabla 1).

[0087] También, son secuencias equivalentes útiles en la práctica de la presente invención, para ORF4 aquellas secuencias que tienen una homología del 95% o más con ORF4 de la cepa Imp1010, y para ORF13, aquellas secuencias que tienen una homología del 95% o más con ORF13 de cepa Imp1010.

[0088] ORF4 y ORF13 tienen el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares predichos de 37,7 kD y 27,8 kD respectivamente. ORF7 y ORF10 (corresponden a ORF3 y ORF4 en Meehan y col., 1998) tienen el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares predichos de 11,9 y 6,5 kD respectivamente. Las secuencias de estos ORF están disponibles también en Genbank AF 055392. Los autores de la invención describen que pueden incorporarse también en plásmidos y usarse de acuerdo con la invención en combinación con ORF4 y/o ORF13.

[0089] Los otros ORF 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 desvelados en la tabla anterior (COL 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 en el documento WO-A-9918214), o región o regiones de los mismos que codifican un antígeno o epítopo de interés se describen, por ejemplo, en solitario o en combinación o de otro modo entre sí o con los ORF 4 y/o 13 o región

: o regiones de los mismos que codifican antígeno(s) o epítopo(s). Análogamente, para homología, se puede determinar que existen secuencias equivalentes que provienen de una cepa de PCV que tiene un ORF13 y/o un ORF4 que tienen una homología según se define anteriormente con el ORF correspondiente de la cepa 1010 según se define en la presente memoria descriptiva o en Meehan y col., 1998. Para ORF7, una secuencia equivalente tiene una homología de la misma que es ventajosamente, por ejemplo, igual o superior al 80%, por ejemplo el 85% o más, preferentemente el 90% o el 95% o más con ORF7 de cepa Imp1010. Y, para ORF10, ventajosamente una secuencia equivalente tiene homología que es igual o superior al 86%, ventajosamente el 90% o más, preferentemente que el 95% o más con ORF10 de cepa Imp1010.

[0090] La homología de la secuencia de nucleótidos puede determinarse usando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, y disponible en NCBI). Alternativa

: o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos

: o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. La homología de secuencia porcentual puede calcularse como (Nref -Ndif) * 100/Nref, en la que Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que Nref es el número de residuos en una de las secuencias. De ahí que la secuencia de ADN AGTCAGTC tenga una semejanza de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2).

[0091] Alternativa o adicionalmente, la "homología" o "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en la que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, 1983 PNAS USA 80: 726), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización de hueco de 4, y puede realizarse convenientemente análisis asistidos por ordenador e interpretación de los datos de secuencias que incluyen alineación usando programas disponibles comercialmente

(por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA.). Cuando se dice que las secuencias de ARN son

similares, o tienen un grado de identidad u homología de secuencias con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.

[0092] Las secuencias de ARN dentro del ámbito de la invención pueden obtenerse a partir de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0093] Adicional o alternativamente, la semejanza o identidad u homología de las secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el programa BlastP (Altschul y col., Nucl. Acids Res. 25,3389-3402) y disponible en NCBI. Las siguientes referencias proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de residuos de aminoácidos de dos proteínas, y adicional o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas en estas referencias pueden usarse para determinar la homología o identidad porcentual: Needleman SB y Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins”, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y Waterman MS, "Comparison of Biosequences". Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS y Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains”, Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct philogenetic trees”, J.

of Molec. Evol., 25:351-360 (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and peso matrix choice, Nucleic Acid Res., 22:4673-480 (1994); y, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX". Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984).

[0094] Los autores de la invención describen además usos de un inmunógeno de PCV-2, ya sea en solitario o en combinación adicional con un inmunógeno de otro patógeno porcino para generar composiciones según la invención, por ejemplo, mezcla de los ingredientes; y, la invención comprende también por tanto kits en los que los componentes se contienen individualmente y opcionalmente los recipientes se envasan juntos para mezcla y/o administración, en la que el kit puede incluir también opcionalmente instrucciones para mezcla y/o administración.

[0095] Aunque la invención se ha expuesto en términos de administración a composiciones inmunógenas de cerdas que comprenden un inmunógeno de PCV-2, la invención puede comprender también la administración de dichas composiciones a una cerda adulta o cerda joven que no ha parido y/o a una jabalina según se describe en la presente memoria descriptiva. Así, pueden administrarse composiciones de la invención a la madre y la progenie (por ejemplo, cerda adulta, cerda joven que no ha parido) y las jabalinas. En consecuencia, en poblaciones de cerdos pueden administrarse composiciones para su uso en la invención.

[0096] Los autores de la invención describen que las composiciones de vacuna e inmunógenas pueden comprender inmunógenos de más de una cepa de PCV-2. Por ejemplo, es posible combinar inmunógenos de las cepas 1121 y 1103, a partir de una o las dos de estas cepas con al menos otra cepa desvelada en la presente memoria descriptiva, o cualquier otra combinación.

[0097] Los autores de la invención describen procedimientos que permiten al experto en la materia evaluar la eficacia de las vacunas frente a PCV-2. Un primer procedimiento es un procedimiento ELISA o con seroneutralización. Un segundo procedimiento es una vacunación seguida de prueba de provocación con una cepa de PCV-2 virulenta, por ejemplo una de las cepas desveladas en la presente memoria descriptiva. En otras palabras, la invención permite verificar inmunógenos de PCV, que incluyen inmunógenos de PCV-1, susceptibles de desencadenar una respuesta inmunógena o de protección frente a PCV-2. Dichos inmunógenos de PCV son útiles entonces para prevenir o tratar a cerdos en particular frente a miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con PCV-2, así como frente a SMEP y/u otras secuelas patológicas asociadas con los mismos.

[0098] Los autores de la invención proporcionan composiciones de vacuna o inmunógenas que comprenden un inmunógeno de PCV y susceptibles de desencadenar una respuesta inmunógena o de protección frente a PCV-2. La invención se refiere también a procedimientos de inmunización o vacunación que usan dicho inmunógeno, así como al uso de dicho inmunógeno para producir dicha composición inmunógena o de vacuna.

[0099] La invención se describirá adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos de referencia, Ejemplo y resultados, proporcionados con fines de ilustración y que no deben considerarse una limitación de la invención.

La fig. 1 representa SEQ ID No. 1, la secuencia de ADN de PCV del genoma de la cepa Imp. 1011-48121;

la fig. 2 representa SEQ ID No. 2, la secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1011-48285;

la fig. 3 representa SEQ ID No. 3, la secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 999;

la fig. 4 representa SEQ ID No. 4, la secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1010;

la fig. 5 representa SEQ ID No. 5, la secuencia de ADN de referencia del genoma de la cepa PK/15; la fig. 6 representa SEQ ID No. 6, la secuencia de ADN del genoma de la cepa 1103, aislada en Alberta, Canadá. k significa g (G) o t (T), y significa c (C) o t (T). Estas variaciones de secuencia se observaron en la población vírica;

la fig. 7 representa SEQ ID No. 7, la secuencia de ADN del genoma de la cepa 1121, aislada en Saskatoon, Canadá;

las fig. 1.1 a 1.5 se describen en el Ejemplo 12;

las fig. 2.1 a 2.6 se describen en el Ejemplo de referencia 13.

EJEMPLO Y RESULTADOS

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 1: MIOCARDITIS, ABORTO E INFECCIÓN INTRAUTERINA ASOCIADOS CON PCV-2

[0100] Se produjeron abortos a término y partos con mortinatos y lechones momificados en una nueva instalación porcina de 450 cerdas que se puso en producción.

[0101] También se observó seudogestación en varias cerdas jóvenes que no habían parido. Las cerdas jóvenes que no habían parido recibieron dos dosis de una vacuna inactivada que contenían parvovirus e inmunógenos de leptospiras antes de la reproducción.

[0102] Una camada recibida para examen post-mórtem consistía en nueve fetos que parecieron haber muerto en diversas fases de la gestación. Había 2 lechones momificados, 2 macerados, 3 autolíticos y 2 mortinatos recientes. Se observaron lesiones en un examen patológico general sólo en un feto autolítico parcialmente. En este feto los dos ventrículos del corazón estaban dilatados, el hígado mostraba hipercrecimiento y estaba firme y había hidrotórax y ascitis. Histopatológicamente, había áreas extensas de degeneración o necrosis miocárdica con edema y fibrosis leve, y una infiltración difusa moderada de linfocitos y macrófagos. Existía congestión hepática generalizada marcada y pérdida hepatocelular. El bazo y los riñones también estaban congestionados. No se detectaron lesiones histológicas importantes en los demás fetos.

[0103] La tinción inmunohistoquímica para PCV-2 se realizó según se ha descrito anteriormente usando un antisuero policlonal de conejo y un anticuerpo monoclonal que se produjo frente a PCV-2 en secciones de tejido procesado y embebido rutinariamente fijado en formalina (Ellis y col., 1998; Ellis y col., 1999). En el feto con cardiomiopatía dilatada había tinción extensa para antígeno de PCV-2 en todo el miocardio afectado. La tinción era más extensa en áreas de necrosis y parecía afectar principalmente a miocitos. Existía tinción citoplásmica y nuclear. En múltiples fetos había tinción extensa en el hígado. En algunas secciones parecía afectar principalmente al endotelio sinusoidal y las células de Kupfer, mientras que en otros fetos, que incluyen el de miocarditis, había también tinción nuclear y citoplásmica de hepatocitos. Las células con tinción positiva estaban dispersas en todo el pulmón, y multifocalmente en el riñón. La reacción en cadena de la polimerasa para PCV-2 se realizó según se describe anteriormente usando tejido congelado (Ellis y col., 1999). El producto de PCR del tamaño esperado para PCV-2 se amplificó a partir de tejido fetal. El PCV-2 se aisló del feto con miocarditis y una reserva de tejidos de otros fetos en la camada inoculando homogeneizados de tejido en células PK-15 libres de PCV.

[0104] Los tejidos fetales se examinaron también para otros patógenos víricos que se han asociado con lesión fetal y abortos en ganado porcino, entre ellos parvovirus porcino (PPV), virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), encefalomiocarditis (EMCV) y enterovirus. El antígeno de PPV no se detectó mediante pruebas de anticuerpos fluorescentes (FAT) en secciones congeladas de pulmón, hígado y bazo a partir de los fetos momificados o mortinatos. Los homogeneizados de hígado, pulmón y bazo de los fetos abortados se inocularon también en cultivos de células PK-15 libres de PCV, células de trompa de Falopio porcina primarias y células Vero. Los virus citopáticos no se detectaron después de tres pasadas. Los tejidos dieron resultado negativo para PPV usando PCR. El antígeno de PRRSV no se detectó por tinción inmunohistoquímica.

[0105] Así, hubo lesiones fetales y abortos asociados directamente con PCV-2. Estos resultados muestran también transmisión vertical del virus.

[0106] En un estudio anterior, se aisló PCV-1 de 2 de 160 fetos de cerdos examinados, lo que implica que este grupo de virus puede transmitirse verticalmente; sin embargo, el antígeno de PCV-1 no podría asociarse con ninguna lesión en el tejido (Allan y col., 1995). La exclusión de otros agentes que se han asociado con lesiones fetales y abortos en ganado porcino, entre ellos, PPV (Bolt y col., 1997; Molitor y col., 1991), PRRSV (Lager y col., 1996), EMCV (Kim y col., 1989) y enterovirus (Molitor y col., 1991) indican que el PCV-2 puede causar patología fetal importante y aborto posterior.

[0107] El síndrome de emaciación asociado con infección por PCV-2 se produce con la máxima frecuencia en cerdos de 5-12 semanas de vida (Allan y col., 1998; Ellis y col., 1998). La infección experimental de ganado porcino neonatal indica un periodo prodrómico relativamente largo entre la infección y el desarrollo de signos clínicos asociados con PCV-2 (Allan y col., 1999; Ellis y col., 1999). Los hallazgos de la presente memoria descriptiva muestran que el virus se transmite verticalmente o en el periodo perinatal. No sólo la transmisión vertical intrauterina de PCV-2 puede terminar en aborto, sino que es posible que los lechones infectados subletalmente in utero sean animales que desarrollen posteriormente SMEP.

[0108] Además, estos resultados muestran que la inoculación de cerdas con una composición que comprende un inmunógeno de PCV-2 (la composición puede incluir también un inmunógeno de otro patógeno porcino, por ejemplo, parvovirus porcino), antes de la reproducción o la inseminación, o antes del periodo perinatal y/o durante la gestación puede prevenir miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociados con circovirus-2 porcino, así como síndrome multisistémico de emaciación posdestete y otras secuelas patológicas asociadas con PCV-2, al desencadenar una respuesta inmunológica o anticuerpos frente a PCV-2.

[0109] Los autores de la invención describen que, por supuesto, pueden usarse o aplicarse composiciones, procedimientos y otros aspectos de la invención en animales distintos de los cerdos, por ejemplo, ovejas, bisontes, ganado vacuno, jabalíes salvajes, por ejemplo, si el PCV-2 infectara a estos animales.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 2: MIOCARDITIS, ABORTO E INFECCIÓN INTRAUTERINA ASOCIADOS CON PCV-2

[0110] La presencia de PCV-2 en lechones neonatales sugiere que la transmisión vertical puede ser un medio importante de transmisión vírica. Este modo de transmisión puede estar relacionado no sólo con fallo reproductivo, sino también con el desarrollo de enfermedad multisistémica más adelante en la vida. Es de interés determinar si el PCV-2 previamente indetectado (y el PCV-I) se ha transmitido verticalmente en áreas de producción porcina en las que el SMEP, y por extensión la infección por PCV-2, ha sido endémico durante al menos varios años.

[0111] Se evaluaron 38 remisiones que afectaban a un fallo reproductivo recibidas en el laboratorio de diagnóstico en el Western College of Veterinary Medicine (WCVM), Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Canadá, durante un periodo de cuatro años de un total de 30 rebaños de alto nivel de salud en Canadá. Cinco de las granjas de las que se obtuvieron las muestras habían diagnosticado casos de SMEP. Veintisiete de las 38 remisiones (71%) se clasificaron como abortos; cinco de ellas (13%) afectaron también a al menos un feto momificado. De los 10 casos restantes: 5 afectaron a lechones mortinatos junto con lechones no viables (13%); 2 con mortinatos y uno o más fetos momificados (5%); 2 con sólo lechones mortinatos (5%); y uno con sólo fetos momificados (2,5%). Los diagnósticos rutinarios para patógenos distintos de circovirus revelaron 4 casos (11%) en los que se determinó que la etiología era de parvovirus porcino y 2 casos (5%) en que los que se determinó que la etiología era de origen bacteriano. Se realizaron necropsias generales y se recogieron tejidos y se fijaron en formalina con tampón (tiempo de fijación 24-72 h) y, en la mayoría de los casos, se remitieron también tejidos recientes para evaluación microbiológica rutinaria. Ninguno de estos casos se sometió a prueba previamente para PCV-2.

[0112] La técnica de PCR usada para la detección de PCV-1 y PCV-2 se realizó según se describió anteriormente (Tischer y col., 1974). PCV-1 no se detectó por PCR en ninguna remisión que comprendiera fallo reproductivo del periodo de cuatro años, PCV-2 se detectó mediante PCR en dos remisiones diferentes que tenían su origen en la misma unidad de producción de cerdos multiinstalación en dos ocasiones separadas en la primavera del último año en el periodo de cuatro años. La primera de estas remisiones comprendía una camada de lechones con evidencia general de miocarditis, hipertrofia cardiaca y congestión pasiva crónica.

[0113] La identificación inmunohistoquímica de PCV-2 en tejidos se realizó según se describe anteriormente (Tischer y col., 1974). La tinción inmunohistoquímica (IHC) para PCV-2 fue positiva en los corazones de los seis lechones que fueron remitidos, mientras que 4 de 6 dieron resultados positivos por PCR de PCV-2 (véase la Tabla siguiente).

Tabla: Detección de PCV-2 en los corazones fijados con formalina de cerdos con miocarditis por PCR, IHC y aislamiento vírico en cultivo celular.

Tejidos positivos para PCV-2: PCR IHC Aislamiento de virus

Fijados: 5/6 6/6 N/D

Congelados: 4/4 N/D 2/4

[0114] La segunda remisión de la misma granja consistía en una camada de cuatro lechones en la que 2 fueron mortinatos y otros 2 murieron poco después de nacer. Los cuatro lechones también mostraron evidencia general de una miocarditis difusa grave, hipertrofia cardiaca y congestión pasiva crónica. Sólo se remitieron tejidos de corazón congelados recientes y de pulmón/bazo en reserva para su análisis. La PCR de PCV-2 fue positiva en los corazones de 2 de los 4 lechones y en los tejidos de pulmón y bazo en reserva de 4 de los 4 lechones. El aislamiento de PCV-2 de corazones afectados y/o tejido de pulmón y bazo en reserva fue positivo en 2 de los 4 casos que fueron positivos para PCV-2 por PCR. Basándose en la serología y/o en la PCR, otros agentes asociados con fallo reproductivo en ganado porcino, que incluye virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y parvovirus porcino, estaban circulando aparentemente en el rebaño de reproducción. Sin embargo, no pudo demostrarse que estos agentes estuvieran asociados con las lesiones cardiacas graves (u otras) en los lechones afectados; pero, pueden contribuir a SMEP.

[0115] PCV-2 no se detectó mediante PCR o IHC en ningún caso representativo de fallo reproductivo remitido durante los tres primeros años del periodo de cuatro años (se detectó en casos de fallo reproductivo remitidos durante el último año del periodo de cuatro años). Con el fin de descartar daños en el ADN debidos a fijación en formalina como un posible factor adverso que limite la capacidad de detectar PCV-2 mediante PCR, la PCR se realizó en tejidos recogidos de cuatro lechones en destete con SMEP, Se amplificó el ADN de PCV-2 en todos los tejidos fijados sometidos a ensayo, entre ellos: pulmón, hígado, riñón y ganglios linfáticos bronquiales, de los cuatro individuos. Por otra parte, la sensibilidad del PCV-2 por PCR fue independiente de la duración de tiempo en la que se fijó cada tejido en formalina.

[0116] Estos resultados confirman y extienden la observación anterior (West y col., 1999) de que PCV-2 puede transmitirse verticalmente y puede estar presente en grandes cantidades dentro de lesiones de lechones infectados in utero. La transmisión vertical de virus PCV-2 y el daño fetal resultante, por ejemplo, miocarditis, es una manifestación de enfermedad adicional de PCV-2. Además, el fallo en la detección de PCV-2 en casos de fallo reproductivo antes del último año del periodo de cuatro años de un área endémica de infección por PCV-2 puede indicar que la transmisión vertical no fue el mecanismo primario responsable para la diseminación inicial de infección vírica. Los modos de transmisión sexual, así como la vertical, pueden atribuirse a la difusión de la infección por PCV-2 en cerdos.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 3: CULTIVO Y AISLAMIENTO DE LAS CEPAS DE CIRCOVIRUS PORCINO

[0117] Los virus 1103 y 1021 se aislaron respectivamente en Alberta, respectivamente en Saskatoon, Canadá, a partir de casos de abortos según el procedimiento descrito en J. Ellis y col., Can. J. Vet, 1998, vol. 39, 44-51.

[0118] El cultivo vírico se efectúa en cultivos celulares de PK/15, de los que se sabe que no están contaminados con el circovirus porcino (PCV), pestivirus, adenovirus porcinos y parvovirus porcinos (Allan G. y col., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64).

[0119] Las monocapas de células PK/15 se disocian por tripsinización (con una mezcla de tripsinaverseno) a partir de cultivos confluentes, y se toman en medio MEM-SA que contiene suero de ternera fetal al 15% no contaminado por pestivirus (= medio MEMG) en una concentración final de aproximadamente 400.000 células por ml. A continuación se mezclan 10 ml de fracciones alícuotas de esta suspensión celular con fracciones alícuotas de 2 ml de los inóculos descritos anteriormente, y las mezclas finales se reparten en forma alícuota en volúmenes de 6 ml en dos matraces Falcon de 25 cm2. Estos cultivos se incuban a continuación a +37°C durante 18 horas en una atmósfera que contiene CO2 al 10%.

[0120] Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semiconfluentes se trató con Dglucosamina 300 mM (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, RU) (Tischr I. y col., Arch. Virol., 1987 96 39-57), a continuación se prosiguió con la incubación durante un periodo adicional de 48-72 horas a +37°C. Después de esta última incubación, uno de los dos Falcons de cada inóculo se sometió a 3 ciclos sucesivos de congelación/descongelación. Las células PK/15 del Falcon restante se trataron con una solución de tripsina-verseno, se volvió a suspender en 20 ml de medio MEM-G, y a continuación se inoculó en 75 cm2 de Falcons a una concentración de 400.000 células/ml. Los matraces recién inoculados se sometieron a continuación a "superinfección" por adición de 5 ml del lisado correspondiente obtenido después de los ciclos de congelación/descongelación.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 4: TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE PCV POR INMUNOFLUORESCENCIA

[0121] El cribado inicial de todas las preparaciones de cultivos celulares fijadas con acetona se efectuó mediante una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IIF) usando una dilución 1/100 de una reserva de sueros de cerdos adultos. Esta reserva de sueros comprende sueros de 25 cerdas adultas de Irlanda del Norte y se sabe que contiene anticuerpos frente a una amplia variedad de virus porcinos, que incluye PCV: parvovirus porcino, adenovirus porcino y virus de SRRP. La técnica IF se realizó poniendo el suero (diluido en PBS) en contacto con los cultivos celulares durante una hora a +37°C, seguido de dos lavados en PBS. A continuación se tiñeron los cultivos celulares con una dilución 1/80 en PBS de un anticuerpo de inmunoglobulina anti-cerdo de conejo conjugada con isotiocianato de fluoresceína durante una hora, y a continuación se lavó con PBS y se montó en tampón de glicerol antes de la observación microscópica con luz ultravioleta.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 5: PRODUCCIÓN DE ANT�?GENOS DE PCV POR CULTIVO IN VITRO

[0122] El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación vírica se realizaron según los mismos procedimientos que en el Ejemplo de referencia 1. Las células infectadas se recogen después de tripsinización después de 4 días de incubación at 37°C y se enumeran. El siguiente paso se inocula con 400.000 células infectadas por ml.

[0123] Las diversas cepas de PCV desveladas en la presente memoria descriptiva, por ejemplo cepas 1103 y 1121, se cultivan así.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 6: VALORACIÓN DE PCV-2

[0124] La valoración se realiza en microplacas de 96 pocillos. Primero se introduce una suspensión de células PK/15 (150.000 células por ml) (100 l por pocillo). A continuación se realizan diluciones del cultivo vírico y se introducen 100 l de las mismas en los pocillos. Se realiza incubación a 37°C con CO2. Después de 24 h, se realiza un tratamiento con glucosamina media hora a 37°C (para las condiciones véase ejemplo 3). A continuación se retira el medio de cultivo y se introduce medio nuevo.

[0125] La incubación se realiza 72 h a 37°C. La revelación de los focos se realiza usando un anticuerpo monoclonal anti-PCV-2 y un conjugado de ratón marcado como FITC.

[0126] Este procedimiento puede usarse en valoración para preparar PCV-2 inactivado así como vivo atenuado.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 7: INACTIVACIÓN DE LOS ANT�?GENOS V�?RICOS

[0127] Al final del cultivo vírico, las células infectadas se recogen y se lisan usando ultrasonidos (Branson Sonifier) o con la ayuda de un rotor-estator tipo molino coloidal (UltraTurrax, IKA). A continuación se centrifuga la suspensión a 3700 g durante 30 minutos. La suspensión vírica se inactiva con etilenimina al 0,1% durante 18 horas a +37°C o con beta-propiolactona al 0,5% durante 24 horas a +28°C. Si la valoración del virus antes de la inactivación es inadecuada, la suspensión vírica se concentra por ultrafiltración usando una membrana con un corte da 300 kDa (Millipore PTMK300). La suspensión vírica inactivada se almacena a +5°C.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 8: PREPARACIÓN DE LA VACUNA EN FORMA DE UNA EMULSIÓN BASADA EN ACEITE MINERAL

[0128] La vacuna se prepara según la fórmula siguiente:

-: suspensión de circovirus porcino inactivado: 250 ml

-: Montanide® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml

[0129] La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado por filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogeneizando los ingredientes con la ayuda de un emulsionante de turbina Silverson.

[0130] Una dosis de vacuna contiene aproximadamente 107,5 DICT50. El volumen de una dosis de vacuna es de 0,5 ml para administración por la vía intradérmica, y 2 ml para administración por la vía intramuscular.

[0131] Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome multisistémico de emaciación en combinación con la vacuna Parvovax®.

EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 9: PREPARACIÓN DE LA VACUNA EN FORMA DE UNA EMULSIÓN METABOLIZABLE CON BASE DE ACEITE

[0132] La vacuna se prepara según la fórmula siguiente:

-: suspensión de circovirus porcino inactivado 200 ml

-: Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml

-: Radia 7204 (Oleofina): 740 ml

[0133] La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado por filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogeneizando los ingredientes con la ayuda de un emulsionante de turbina Silverson.

[0134] Una dosis de vacuna contiene aproximadamente 107,5 DICT50. El volumen de una dosis de vacuna es 2 ml para administración por la vía intramuscular.

[0135] Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome multisistémico de emaciación en combinación con la vacuna Parvovax®.

EJEMPLO/RESULTADO 10: VACUNACIÓN DE LECHONES CON VECTOR (DE PL�?SMIDO) DE ADN (según la invención)

[0136] Los grupos de 3 o 4 lechones, alumbrados por cesárea en el día 0 se colocan en aisladores. Los lechones son vacunados en el día 2 con (A) un plásmido que comprende ORF 13 o con (B) una mezcla de este plásmido y otro plásmido que comprende ORF 4, y con una solución fisiológica para el grupo de control. Cada plásmido se diluye en solución fisiológica estéril (NaCl al 0,9%) a 250 g/ l de concentración final. Se inyecta un volumen de 2 ml por vía intramuscular en dos puntos de 1 ml (1 punto a cada lado del cuello). Se administra una segunda inyección de vacuna o placebo en el día 14. La vacunación con ADN es bien tolerada por lechones y no se observa evidencia de reacción adversa a la vacunación. Los lechones se someten a prueba de provocación en el día 21 por administración oronasal de suspensión vírica de PCV-2, 1 ml en cada orificio nasal. Después de la prueba de provocación se pesan los lechones una vez por semana. Se registran las temperaturas rectales en los días 17, 21, 22, 24, 27, 29, 31, 34, 37, 41, 44. En el día 44 se recogen hisopos fecales de cada lechón para deposición de PCV-2. El virus se detecta y se cuantifica mediante PCR cuantitativa. En el día 45 se realizan necropsias y se recogen muestras de tejidos para aislamiento del virus.

· Síntomas clínicos:

No existen diferencias significativas en cuanto a ganancias de peso corporal medio o temperaturas corporales medias entre los grupos.

· Lesiones en la necropsia:

El único hallazgo general observado en cerdos en la terminación es linfadenopatía bronquial. Las lesiones se puntúan según los siguientes criterios.

0 = sin crecimiento visible de ganglios linfáticos 1 = crecimiento leve de ganglios linfáticos, restringido a ganglios linfáticos bronquiales 2 = crecimiento moderado de ganglios linfáticos, restringido a ganglios linfáticos bronquiales 3 = crecimiento intenso de ganglios linfáticos, extendido a ganglios linfáticos precapsulares submandibulares bronquiales e inguinales.

dvtp es una abreviatura de desviación típica N = número de lechones en cada grupo

Puntuaciones de linfadenopatías

Grupos: media dvtp N

(A): 1,2 1,3 4

(B): 2,0 1,7 3

controles: 3,0 0,0 3

[0137] Se observa una reducción de las lesiones en los ganglios linfáticos en 3 de los 4 lechones 5 inmunizados con (A) y de 1 de los 3 lechones inmunizados con mezcla (B). Esta diferencia no es significativa (p > 0,05) debido al alto valor de las desviaciones típicas (dvtp).

· Carga viral en tejidos de ganglios linfáticos:

10 Se realiza reaislamiento vírico cuantitativo en homogeneizados de tejidos preparados a partir de ganglios linfáticos bronquiales y mesentéricos.

[0138] Los datos presentados corresponden a valoraciones de virus en homogeneizados de tejidos después de transformación en log10. 15 Valoraciones de PCV-2

Grupos: GL bronquiales GL mesentéricos

media: dvtp media dvtp N

(A): 0,9 0,8 0,9 0,8 4

(B): 0,7 0,6 0,2 0,2 3

Controles: 2,0 1,1 1,8 1,1 4

[0139] Los ganglios linfáticos bronquiales parecen contener el virus más infeccioso. Se observa una reducción de la carga viral en ganglios linfáticos bronquiales y mesentéricos a partir de lechones inmunizados con mezcla (A) o (B). Esta reducción es significativa (p 0,05 para la mezcla de plásmidos).

· Excreción vírica:

Se valoran hisopos fecales después de prueba de provocación para deposición de PCV-2 por PCR basándose en amplificación de ORF 13 de PCV-2. Cada ensayo se realiza por triplicado en 2 ml de

25 muestra. Los controles no vacunados son negativos para PCV-2 antes de la prueba de provocación y positivos después de la prueba de provocación, lo que confirma la validez del ensayo de PCR.

[0140] Los valores se expresan como log10 (número de moléculas de ADN de PCV-2 en muestra de 2

Número log10 de moléculas de ADN de PCV-2

Grupos: media dvtp N

(A): 3,3 0,3 4

(A): 2,9 0,7 3

Controles: 3,6 0,6 4

[0141] Las diferencias entre grupos no son significativas (p > 0,05).

35 EJEMPLO DE REFERENCIA/RESULTADO 11: VACUNACIÓN DE LECHONES CON VECTOR VIVO DE VIRUELA DEL CANARIO Y RESULTADOS

[0142] Los grupos de 3 ó 4 lechones, obtenidos por cesárea en el día 0 se colocan en aisladores. El día 2

los lechones son vacunados con 108 ufp de (C) una viruela del canario que comprende ORF 13, o (D) una viruela 40 del canario que comprende ORF 13 y ORF 4, o una viruela del canario parental, en 1 ml de PBS, por vía

intramuscular en el lateral del cuello. Se administra una segunda inyección de vacuna o placebo en el día 14. La

vacunación con viruela del canario es bien tolerada por lechones y no se observa evidencia de reacción adversa a

la vacunación. Los lechones se someten a prueba de provocación en el día 21 por administración oronasal de una

suspensión vírica de PCV-2, 1 ml en cada orificio nasal. En el día 45 se realizan necropsias y se recogen 45 muestras de tejidos para aislamiento de virus.

Resultados de la necropsia: [0143] · SMEP se caracteriza generalmente por linfadenopatía y más raramente por hepatitis o nefritis. Así, se puntúan los hallazgos generales en los ganglios linfáticos para cada lechón de la siguiente forma: 0 = sin crecimiento visible de ganglios linfáticos; 1 = crecimiento leve de ganglios linfáticos, restringido a ganglios linfáticos bronquiales; 2 = crecimiento moderado de ganglios linfáticos, restringido a ganglios linfáticos bronquiales; 3 = crecimiento intenso de ganglios linfáticos, extendido a ganglios linfáticos bronquiales, submandibulares preescapulares e inguinales.

Grupos Puntuaciones

(C): 0,5 0,0 0,0 1,0

media 0,38

(D): 0,0 0,5 0,5 1,0

media 0,5

desviación típica 0,41

Controles 2,0

2,5

media 2,38 desviación típica 0,25

[0144] La linfadenopatía bronquial para PCV-2 es un hallazgo general destacado. Se observa una reducción importante de la lesión de los ganglios linfáticos en relación con el grupo de control después de inmunización con (C) y (D) (p 0,05).

PCV vacuna ADN EJEMPLO 12

[0145] Los siguientes pasos son extractos de la solicitud provisional de EE.UU. 60/138.352.

[0146] Las secuencias de PCV-2 usadas en estos ejemplos se obtienen de Meehan y col., ver anteriormente (ORF1 nucleótidos 398-1342; ORF2 nucleótidos 1381-314; y corresponden respectivamente a ORF4 y ORF13 en el documento US-09/161.092 del 25 de septiembre de 1998 y a COL4 y COL13 en el documento WO-A-99/18.214).

[0147] La palabra plásmido pretende aquí cubrir cualquier unidad de transcripción de ADN en la forma de una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de PCV que se expresará y los elementos necesarios para su expresión in vivo. Se prefiere la forma de plásmido circular, superhelicoidal o de otro tipo. La forma lineal se incluye también dentro del ámbito de la invención.

[0148] Las Figuras muestran los plásmidos denominados pJP109 (que contienen el gen ORF2 de PCV-2, fig. 1.1), pJP111 (que contiene el gen ORF1 de PCV-2, fig. 1.2) y el plásmido de referencia pJP120 (que contiene el gen ORF2 de PCV-1, fig. 1.3) y el plásmido de referencia pJP121 (que contiene el gen ORF1 de PCV-1, fig. 1.4).

[0149] Cada plásmido comprende un promotor capaz de asegurar, en las células del hospedador, la expresión del gen insertado bajo su control. En general es un fuerte promotor eucariota y en particular un promotor temprano de citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, u opcionalmente de otro origen como, por ejemplo, rata o cobaya. Más generalmente, el promotor es de origen vírico o de origen celular. Como promotor vírico distinto de CMV-IE, puede mencionarse el virus promotor temprano o tardío de virus SV40 o el promotor LTR de virus de sarcoma de Rous. También puede ser un promotor del virus del cual procede el gen, por ejemplo el promotor específico para el gen. Como promotor celular, puede mencionarse el promotor de un gen de citoesqueleto, como, por ejemplo, el promotor de desmina, o alternativamente el promotor de actina. Cuando están presentes varios genes en el mismo plásmido, pueden proporcionarse en la misma unidad de transcripción

o en dos unidades diferentes.

[0150] Los plásmidos pueden comprender también otros elementos de regulación de transcripción como, por ejemplo, secuencias de estabilización del tipo intrón, preferentemente intrón II del gen -globina de conejo (van Ooyen y col., Science, 1979,206: 337-344), secuencia de señal de la proteína codificada por el gen activador de plasminógeno de tejido (tPA; Montgomery y col., Cell. Mol. Biol. 1997, 43: 285-292), y la señal de poliadenilación (poliA), en particular del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (documento US-A 5.122.458) o del gen de -globina de conejo.

[0151] A continuación se describen formas de realización de plásmidos ilustrativas no limitativas útiles en la invención y ejemplos, tomados con referencia a los dibujos, en los que:

Fig. 1.1: plásmido pJP109 Fig. 1.2: plásmido pJP111 Fig. 1.3: plásmido de referencia pJP120 Fig. 1.4: plásmido de referencia pJP121 Fig. 1.5: plásmido de referencia pJP058

Listado de secuencias SEQ ID

SEQ ID No. 27 oligonucleótido JP779 SEQ ID No. 28 oligonucleótido JP780 SEQ ID No. 29 oligonucleótido JP781 SEQ ID No. 30 oligonucleótido JP782 SEQ ID No. 31 oligonucleótido JP783 SEQ ID No. 32 oligonucleótido JP784 SEQ ID No. 33 oligonucleótido JP785 SEQ ID No. 34 oligonucleótido JP786

Ejemplo 12.1 Construcción del plásmido pJP109

[0152] El plásmido pGFM7Z-lmp1010 Stoon-EcoRI nº 14 que contiene el genoma del virus PCV-2 en forma de un fragmento EcoRI (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1998. 79 2171-2179) fue digerido con EcoRI con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-EcoRI de 1.768 pares de bases (pb). Este fragmento estaba autoligado.

[0153] El gen ORF2 del virus PCV-2 cepa 1010-Stoon (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1998; 79:21712179; secuencia GenBank nº acceso AF055392) se amplificó, usando la plantilla consistente en el fragmento EcoRI-EcoRI autoligado, por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los siguientes oligonucleótidos: JP779 (SEQ ID NO 27) (35 mer):

5’CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3’

y JP780 (SEQ ID NO 28) (36 mer):

5TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3’

con el fin de generar un fragmento de PCR de 730 pb Este fragmento fue digerido con SalI y BglII con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 715 pb A continuación, este fragmento se ligó con el plásmido pVR1012 (Hartikka J. y col., Human Gene Therapy. 1996; 7:1205-1217), digerido de antemano con SalI y BglII, para dar el plásmido pJP109 (5.567 pb) (fig. 1.1).

Ejemplo 12.2: Construcción del plásmido PJ111

[0154] Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con el plásmido pGem7Z-Imp1010-Stoon (véase Ejemplo 12.1) (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1998. 79. 2171-2179), y los siguientes oligonucleótidos:

JP781 (SEQ ID NO 29) (35 mer):

5’CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3’

y JP782 (SEQ ID NO 30) (36 mer):

5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3’

con el fin de generar un fragmento de PCR de 970 pb que contenía el gen ORF1 gene del virus PCV-2. Este fragmento fue digerido con SalI y BglII con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 955 pb. A continuación este fragmento se ligó con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 12.1) para dar el plásmido pJPIII (5810 pb) (fig. 1.2).

Ejemplo de referencia 12.3: Construcción del plásmido pJP120 (PCV-1 ORF2)

[0155]

Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con el plásmido pPCV1 (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1997. 78.221-227), y los siguientes oligonucleótidos; JP783 (SEQ ID NO 31) (35 mer):

5’CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3’

y JP784 (SEQ ID NO 32) (40 mer):

5’TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3’

con el fin de generar un fragmento de PCR de 730 pb que contenía el gen ORF2 del virus PCV-1 (cepa PK-15, secuencia de GenBank nº acceso U49186). Este fragmento fue digerido con SalI y BglII con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 715 pb. A continuación este fragmento se ligó con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 12.1) para dar el plásmido pJP120 (5565 pb) (fig. 1.3).

Ejemplo de referencia 12.4: Construcción del plásmido pJP121 (PCV-1 ORF1)

[0156] El plásmido pPCV1 que contenía el genoma del virus PCV-1 en forma de un fragmento PstI (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 19, 78:221-227) fue digerido con PstI con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento PstI-PstI de 1.759 pares de bases (pb). Este fragmento estaba autoligado.

[0157] El gen ORF1 del virus PCV-1 cepa PK-15 (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227; secuencia de GenBank, nº acceso U49186) se amplificó, usando la plantilla consistente en el fragmento PstI-PstI autoligado, por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los siguientes oligonucleótidos:

JP785 (SEQ ID NO 33) (35 mer):

5’CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3’

y JP786 (SEQ ID NO 34) (36 mer):

5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3’

con el fin de generar un fragmento de PCR de 965 pb que contenía el gen ORF1 del virus PCV-1 (cepa PK-15). Este fragmento fue digerido con SalI y BglII con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 946 pb. A continuación este fragmento se ligó con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 12.1) para dar el plásmido pJP121 (5804 pb) (fig. 1.4).

[0158] Ejemplo de referencia 12.5: Construcción del plásmido pJP058 (que expresa GM-CSF porcino)

[0159] Se recogió sangre de cerdo en un tubo que contenía EDTA tomando sangre de la vena yugular. Se recogieron las células mononucleadas por centrifugado en un gradiente Ficoll y a continuación se cultivaron in vitro en medio RPMI 1640 (Gibco-BRL) y se estimularon mediante la adición de concanavalina A (Sigma) a una concentración final de aproximadamente 5 g/ml en el medio de cultivo. Después de 72 horas de estimulación, se recogieron los linfoblastos y se extrajo el ARN total de estas células con el kit de extracción "Micro-Scale Total RNA Separator Kit" (Clontech) siguiendo las recomendaciones del fabricante Se realizó una reacción de transcripción inversa, realizada con ayuda del kit "1st-Strand cDNA Synthesis Kit" (Perkin Elmer), seguido de una reacción en cadena de la polimerasa, en el ARN total extraído a partir de estos linfoblastos porcinos con los siguientes oligonucleótidos:

RG972 (33 mer):

5’TATGCGGCCGCCAGCATGTGGCTGCAGAACCTG3’

y RG973 (34 mer):

5’TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3’

con el fin de generar un fragmento de PCR de aproximadamente 450 pares de bases (pb). Este fragmento fue digerido con NotI con el fin de aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento NotI-NotI de 450 pb. A continuación este fragmento se ligó con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 12.1), preferentemente digerido con NotI y desfosforilado, para dar el plásmido pJP058 (5405 pb) (fig. 1.5). Se verificó la secuencia del gen pGM-CSF clonado en el plásmido pJP058 y se encontró que era idéntica a la disponible en la base de datos GenBank (nº acceso D21074).

Ejemplo 12.6: Producción de los plásmidos purificados para la vacunación de cerdos

[0160] Se transformaron bacterias K12 de Escherichia coli (cepas DH10B o SCS1) con los plásmidos pJP109, pJP111, pJP058, pJP120 y pJP121 de los Ejemplos 12.1 a 12.5 anteriores. A continuación se cultivaron por separado los cinco clones transformados obtenidos respectivamente con estos cinco plásmidos, con agitación a +37°C, en medio de cultivo Luria (LB). Se recogieron los cultivos bacterianos al final de la fase exponencial y se extrajeron los plásmidos según la técnica de lisis alcalina. A continuación se purificaron los plásmidos extraídos en un gradiente de cloruro de cesio según la técnica descrita por Sambrook y col., (Molecular Biology: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Después de extracción final de bromuro de etidio y precipitación en presencia de etanol absoluto, se volvieron a suspender los plásmidos purificados en tampón TE (Tris/EDTA 1 mM, pH 8,0) con el fin de obtener soluciones de reserva que contuvieran 2 mg de plásmido por ml. Estas soluciones de reserva se almacenan a -20°C antes de su uso.

Ejemplo 12.7: Control de la expresión de los ORF 1 y 2 del virus PCV-2

[0161] Con el fin de controlar los productos de expresión de los genes ORF2 de PCV-2 y ORF1 de PCV-2 ORF1, clonados respectivamente en los plásmidos pJP109 y pJP111, estos plásmidos se sometieron a transfección en células CHO-K1 (ovario de hámster chino) (ATCC nº CCL-61) con Lipofectamine Plus®; kit de transfección (Gibco-BRL, Catálogo 10964-013), siguiendo las recomendaciones del fabricante para su uso.

[0162] 48 horas después de la transfección, las células transfectadas se lavan y se fijan con una solución de acetona glacial al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se usaron cinco anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas ORF1 de PCV-2 (F199 1D3GA y F210 7G5GD) y proteínas ORF2 (F190 4C7CF, F190 2B1BC y F190 3A8BC) como primeros anticuerpos. Se usó un conjugado IgG antirratón, marcado con Cy3, para revelar el marcado específico. Se observó una fluorescencia específica de PCV-2 con los 3 monoclonales ORF2 de PCV-2 en las células transfectadas con el plásmido pJP109, pero no en las transfectadas con el plásmido pJP111. En cambio, se observó una fluorescencia específica de PCV-2 con los dos monoclonales ORF1 de PCV-2 en las células transfectadas con el plásmido pJP111, pero no en las transfectadas con el plásmido pJP109. No se detectó fluorescencia con los monoclonales de PCV-2 en células CHO transfectadas con el plásmido pVR1012 en solitario o en las células CHO no transfectadas.

[0163] Se obtuvo el mismo resultado de expresión con un suero policlonal específico para el virus PCV-2. En este caso, se usó un conjugado IgG anti-cerdo marcado con fluoresceína para detectar la fluorescencia específica. No se detectó fluorescencia con este suero policlonal en células CHO transfectadas con el plásmido pVR1012 en solitario o en las células CHO no transfectadas.

Ejemplo de referencia 12.8: Vacunación de cerdos con ADN desnudo

12.8.1. Lechones de un día de vida

[0164] Los grupos de lechones obtenidos por cesárea en DO del protocolo se colocan en una unidad de aislamiento. Estos lechones son vacunados a la edad de 2 días por la vía intramuscular con varias soluciones de vacuna de plásmido. Las soluciones de vacuna se preparan diluyendo las soluciones de reserva en suero salino fisiológico estéril (NaCl al 0,9%).

[0165] Los lechones son vacunados:

con el plásmido pJP109 en solitario

: o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y pJP111

: o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y el plásmido de referencia pJP058

: o con la mezcla de los plásmidos pJP109, pJP111 y el plásmido de referencia pJP058

[0166] Las soluciones de vacuna comprenden 500 g de cada plásmido. Volumen: Las soluciones de vacuna se inyectan por la vía intramuscular en un volumen total de 2 ml. En la práctica, dada la edad de los lechones en la vacunación (1-2 días), se administra 1 inyección de 1 ml en cada lado del cuello (= 2 x 1 ml).

[0167] Se aplican dos inyecciones de vacuna en un intervalo de dos semanas, es decir, en los días D2 y D14 del protocolo.

[0168] Se realiza una prueba de provocación en D21 del protocolo por administración oronasal de una suspensión vírica de una cepa virulenta de PCV-2. A continuación se vigilan los lechones durante 3 semanas para observar la aparición de signos clínicos específicos de síndrome multisistémico de emaciación posdestete en los lechones. Los signos que se vigilan son:

temperatura rectal: medida diaria durante los primeros 14 días, y después dos medidas durante la 3ª semana después de la prueba de provocación.

Peso: se pesan los lechones justo antes de la prueba de provocación y después una vez por semana durante las 3 semanas después de la prueba de provocación. Recogida de muestras de sangre para analizar: viremia y anticuerpos: muestras de sangre tomadas en D2, D14, D21, D28, D35 y D42. Autopsia: en D42, se da muerte humanamente a los cerdos supervivientes y se someten a autopsia para buscar lesiones anatomopatológicas y para hacer preparados histológicos del hígado, los ganglios linfáticos, el bazo, los riñones y el timo en busca de lesiones en estos tejidos.

12.8.2. Lechones de 5-7-semanas

[0169] Se vacuna a los lechones de 5 a 7 semanas de vida, que ya no tienen anticuerpos maternos específicos para el virus PCV-2, por la vía intramuscular:

con el plásmido pJP109 en solitario,

: o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y pJP111

: o con la mezcla de los plásmidos pJP109, pJP111 y el plásmido de referencia pJP058 las dosis de vacuna son las mismas que las indicadas en el Ejemplo 12.8.1 (500 g por plásmido). Las soluciones de vacuna se inyectan por la vía intramuscular en un volumen de 2 ml (una única administración de 2 ml, en los músculos del cuello).

[0170] Se realizan dos vacunaciones en un intervalo de 21 días (DO y D21). Se realiza una prueba de provocación 14 días después de la última vacunación (D35) por administración intramuscular de una suspensión vírica de una cepa virulenta de PCV-2.

[0171] A continuación se vigila a los cerdos durante 8 semanas para observar la aparición de signos clínicos específicos del síndrome multisistémico de emaciación posdestete en lechones. La vigilancia clínica de los lechones después de la prueba de provocación es idéntica a la descrita en el Ejemplo 12.8.1 con la excepción de que la duración total de observación es esta vez de 8 semanas.

Ejemplo de referencia 12.9: Vacunación de cerdos con ADN formulado con DMRIE-DOPE

[0172] Es posible usar, en lugar de las soluciones de ADN de plásmido desnudo descritas en el Ejemplo 12.8, soluciones de ADN de plásmido, formuladas con DMRIE-DOPE. Se prepara una solución de ADN (que contiene uno o más plásmidos según el Ejemplo 12.6) a 1 mg/ml en NaCl al 0,9%. Se prepara una solución DMRIE-DOPE a 0,75 mM mediante captación de un liofilizado de DMRIE-DOPE en un volumen adecuado de agua destilada estéril.

[0173] La formación de los complejos de ADN de plásmido-lípido catiónico se consigue diluyendo, en partes iguales, la solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM con la solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl al 0,9%. La solución de ADN se introduce gradualmente, con la ayuda de una jeringa montada con una aguja 26G, a lo largo de la pared del vial que contiene la solución de lípido catiónico de manera que se evite la formación de espuma. Se realiza agitación suave en cuanto las dos soluciones se hayan mezclado. Finalmente se obtiene una composición que comprende DMRIE-DOPE 0,375 mM y 500 g/ml de ADN.

[0174] Es deseable que las dos soluciones usadas estén a temperatura ambiente durante todas las operaciones descritas anteriormente. La formación de complejo ADN/DMRIE-DOPE se realiza a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la inmunización de los cerdos.

[0175] A continuación se vacuna a los cerdos según las condiciones descritas en los Ejemplos 12.8.1. y

12.8.2.

Vacuna de poxvirus de recombinante de circovirus porcino Ejemplo de referencia 13

[0176] Los siguientes pasos son extractos de la solicitud de EE.UU. nº 60/138.478.

[0177] Este ejemplo se refiere a ORF1 (Meehan y col., 1998; correspondiente a COL4 en la solicitud de patente francesa 98/03.707), que comprende nt 398-1342 (GenBank número de acceso AF055392), tiene el potencial de codificar una proteína con un peso molecular predicho de 37,7 kD. ORF2 (Meehan y col., 1998; correspondiente a COL13 en la solicitud de patente francesa 98/03.707), que comprende nt 1381-1768 unido a 1314 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular predicho de 27,8 kD.

[0178] Se logrará una mejor comprensión de este ejemplo haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La fig. 2.1 (SEQ ID NO: 16) muestra la secuencia de nucleótidos de referencia de un fragmento de 3,7 pares de kilobases de ADN de ALVAC que contiene el marco de lectura abierta C6; la fig. 2.2 muestra el mapa de plásmido de donador pJP102; la fig. 2.3 (SEQ ID NO: 8) muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 2,5 pares de kilobases a partir del plásmido de donador pJP102 desde los sitios de restricción KpnI (posición 653) a SacI (posición 3166); la fig. 2.4 muestra el mapa de plásmido de donador pJP 105; la fig. 2.5 muestra el mapa de referencia de plásmido de donador pJP 107; la fig. 2.6 (SEQ ID NO: 11) muestra la secuencia de nucleótidos de referencia del fragmento de 3,6 pares de kilobases del plásmido de donador pJP107 desde los sitios de restricción KpnI (posición 653) a SacI (posición 4255).

[0179] Los autores de la invención describen poxvirus recombinantes que contienen en sí una secuencia de ADN de PCV2 en una región no esencial del genoma del poxvirus. Los poxvirus recombinantes expresan productos génicos del gen PCV2 extraño. En particular, se aislaron genes ORF2 y ORF1 que codifican proteínas de PCV2, se caracterizaron y se insertaron en recombinantes de ALVAC (vector de virus de la viruela del canario). Las técnicas biológicas usadas son las descritas por Sambrook y col., (1989). Cell Lines and Virus Strains. La cepa de PCV2 designada como Imp. 1010-Stoon ha sido descrita anteriormente (Meehan y col., 1998). Se aisló a partir de tejidos de ganglios linfáticos mesentéricos de un cerdo enfermo originario de Canadá. La clonación del genoma de PCV2 genoma fue descrita por Meehan y col., (1998). El plásmido pGem7Z-1mp1010- Stoon-EcoRI nº 14 contiene el genoma de PCV2 como un fragmento EcoRI introducido en el sitio EcoRI del plásmido pGem-7Z (Promega, Madison, WI). La secuencia de nucleótidos completa de la cepa de PCV2 Imp. 1010-Stoon ha sido determinada por Meehan y col., (1998) y está disponible con el número de acceso de GenBank AF055392.

[0180] El virus de la viruela del canario parental (cepa Rentschler) es una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna se obtuvo a partir de un aislado de tipo genéticamente intacto y se atenuó a través de más de 200 pasos en serie en fibroblastos de embriones de pollo. Se sometió una semilla vírica madre a cuatro purificaciones en placa sucesivas en agar y se amplificó un clon de placa a través de cinco pasos adicionales después de los cuales el virus de reserva se usó como virus parental en pruebas de recombinación in vitro. El aislado de viruela del canario purificado en placa se designa como ALVAC. ALVAC se registró el 14 de noviembre de 1996 según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, ATCC número de acceso VR-2547.

[0181] La generación de recombinantes de poxvirus implica diferentes pasos: (1) construcción de un plásmido de inserción que contiene secuencias ("brazos") que flanquean los locus de inserción en el genoma del poxvirus, y sitio de clonación múltiple (MCS) localizado entre los dos brazos de flanqueo (por ejemplo, véase Ejemplo de referencia 13.1); (2) construcción de plásmidos de donador consistentes en un plásmido de inserción en el MCS del que se ha insertado una casete de expresión de gen extraño (por ejemplo véase Ejemplos 13.2 a 13.5); (3) recombinación in vitro en cultivo celular entre los brazos del plásmido de donador y el genoma del poxvirus parental que permite la inserción de la casete de expresión del gen extraño en el locus apropiado del genoma del poxvirus, y purificación en placa del virus recombinante (por ejemplo, véase Ejemplo 13.6).

Ejemplo de referencia 13.2 - CONSTRUCCIÓN DE PL�?SMIDO DE INSERCIÓN DE VIRUELA DEL CANARIO EN LOCUS C6

[0182] La fig. 2.1 (SEQ ID NO: 16) es la secuencia de un segmento de 3,7 kb de ADN de viruela del canario. El análisis de la secuencia reveló un ORF designado como C6L iniciado en la posición 377 y terminado en la posición 2254. A continuación se describe un plásmido de inserción C6 construido por deleción del ORF C6 y su sustitución por un sitio de clonación múltiple (MCS) flanqueado por señales de terminación de transcripción y traducción. Se amplificó un fragmento de PCR de 380 pb a partir de ADN genómico de viruela del canario usando cebadores de oligonucleótidos C6A1 (SEQ ID NO: 21) y C6B 1 (SEQ ID NO: 22). Se amplificó un fragmento de PCR de 1155 pb a partir de ADN genómico de viruela del canario usando cebadores de oligonucleótidos C6CI (SEQ ID NO: 23) y C6D1 (SEQ ID NO: 24). Los fragmentos de 380 pb y 1155 pb se fusionaron conjuntamente mediante su adición conjunta como plantilla y amplificación de un fragmento de PCR de 1613 pb usando cebadores de oligonucleótidos C6A1 (SEQ ID NO: 21) y C6D1 (SEQ ID NO: 24). Este fragmento fue digerido con SacI yKpnI, y se ligó en pBluescript SK+ (Stratazene, La Jolla, CA, EE.UU.) digerido con SacI/KpnI. El plásmido resultante, pC6L fue confirmado por análisis de secuencia de ADN. Consiste en 370 pb de ADN de viruela del

canario en la dirección 5’ de C6 ("brazo izquierdo de C6"), señal de terminación temprana de vacuna, codones de

terminación de traducción en seis marcos de lectura, un MCS que contiene sitios SmaI, PstI, XhoI y EcoRI, señal de terminación temprana de vacuna, codones de terminación de traducción en seis marcos de lectura y 1156 pb

de secuencia de viruela del canario en la dirección 3’ ("brazo derecho de C6").

5 [0183] El plásmido pJP099 se obtuvo de pC6L ligando una casete que contenía el promotor H6 de vacuna (descrito en Taylor y col., (1988c), Guo y col., (1989), y Perkus y col., (1989)) acoplado con un gen extraño en los sitios SmaI/EcoRI de pC6L.

[0184] Este plásmido pJP099 contiene un único sitio EcoRV y un único sitio NruI situado en el extremo 3’

10 del promotor H6, y un único sitio SalI situado entre el codón de TERMINACIÓN del gen extraño y el brazo izquierdo de C6. El fragmento EcoRVISalI o NruISalI de 4,5 kb de pJP099 contiene por tanto la secuencia de plásmidos (pBluescript SK+; Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), los 2 brazos C6 y el extremo 5’ del promotor H6 hasta el sitio EcoRV o Nrul.

15 [0185] Secuencias de los cebadores:

Cebador C6A1 (SEQ ID NO: 21)

ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT

20 Cebador C6B1 (SEQ ID NO: 22)

Cebador G6C1 (SEQ ID NO: 23)

Cebador C6D1 (SEQ ID NO: 24) GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG

Ejemplo 13.2 - CONSTRUCCIÓN DE PL�?SMIDO DE DONADOR DE ALVAC PARA ORF2 DE PCV2

[0186] El plásmido pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRINo. 14, que contiene el genoma PCV2 como un fragmento EcoRI en plásmido pGem-7Z, fue digerido con EcoRI, y se aisló y ligó un fragmento de 1.768 pb.

[0187] Con el fin de insertar el ORF 2 de PCV2 en un vector de inserción de ALVAC apropiado: se usaron cebadores JP760 (SEQ ID NO: 25) y JP773 (SEQ ID NO: 26) para amplificar ORF 2 de PCV2 a partir del fragmento EcoRI ligado de 1.768 pb (véase anteriormente) que da como resultado PCR J1304. El cebador JP760 (SEQ ID NO: 25) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de EcoRV y el extremo 5’ de ORF 2 de PCV2. El cebador 40 JP773 (SEQ ID NO: 26) contiene el extremo 3’ de ORF 2 de PCV2 seguido por un sitio SalI. A continuación el producto de PCR J1304 fue digerido con EcoRV/SalI y se clonó como un fragmento de 750 pb en un fragmento EcoRV/SalI de 4,5 kb de pJP099 (véase anteriormente en el Ejemplo 13.1). El plásmido resultante se confirmó por análisis de secuencias y se designó como pJP102 (véase el mapa de pJP102 en la fig. 2.2 y la secuencia (SEQ ID NO: 8) en la fig. 2.3). La secuencia de ORF2 se corresponde con la secuencia disponible en GenBank, número

45 de acceso AF055392. El plásmido de donador pJP102 (linealizado con NotI) se usó en una prueba de recombinación (IVR) in vitro para generar recombinante de ALVAC vCP1614 (véase Ejemplo 13.6).

[0188] Secuencia de los cebadores:

50 JP760 (SEQ ID NO: 25) JP773 (SEQ ID NO: 26)

TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC

Ejemplo de referencia 13.3 - CONSTRUCCIÓN DE UN PL�?SMIDO DE DONADOR DE ALVAC PARA ORF2 Y ORF1 DE PCV2

[0189] Se amplificó ORF 1 de PCV2 mediante PCR usando cebadores JP774 (SEQ ID NO: 9) y JP775 (SEQ ID NO: 10) en el plásmido pGem 7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI nº 14 para dar como resultado PCR J1311. El cebador JP774 (SEQ ID NO: 9) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de NruI y el extremo 5’ de ORF1 de PCV2. El cebador JP775 (SEQ ID NO: 10) contiene el extremo 3’ de ORF1 de PCV2 seguido por un sitio SalI. El producto de PCR J1311 (-1 Kb) se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue confirmado por análisis de secuencias y se designó como pJP104. La secuencia de ORF1 se corresponde con la secuencia disponible en GenBank, número de acceso AF055392. Se aisló un fragmento de NruI/SalI de 970 pb a partir de pJP104 y se clonó en un fragmento NruI/SalI de 4,5 kb a partir de pJP099 (véase Ejemplo 13.1), para dar como resultado un plásmido que se confirmó por análisis de restricción y se designó como pJP105 (véase fig. 2.4). El plásmido de donador pJP105 podría usarse en una prueba de recombinación in vitro (descrita en el Ejemplo 13.6) para generar recombinante de ALVAC que expresa el ORF1 de PCV2.

[0190] Se hizo romo un BamHI/SalI de 838 pb de pJP102 (véase Ejemplo 13.2) usando el fragmento Klenow de ADN polimerasa, y se clonó en el sitio EcoRI romo por Klenow de pJP105. Se verificaron los clones en relación con la orientación del inserto por análisis de restricción y se escogió una orientación cabeza-cabeza. Este plásmido se confirmó por análisis de secuencias y se designó como pJP107 (véase el mapa de pJP107 en la fig.

2.5 y la secuencia (SEQ ID NO: 11) en la fig. 2.6). El plásmido de donador pJP107 (linealizado con NotI) se usó en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el recombinante de ALVAC vCP1615 (véase Ejemplo 13.6).

[0191] Secuencia de los cebadores.

JP774 (SEQ ID NO: 9)

JP775 (SEQ ID NO: 10)

TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG

Ejemplo de referencia 13.4 - CONSTRUCCIÓN DE PL�?SMIDO DE DONADOR DE ALVAC PARA ORF2 DE PCV1

[0192] El plásmido pPCV1 (B. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1997.78.221-227), que contiene el genoma de PCV1 como un fragmento PstI en plásmido pGem-7Z, se usó como plantilla para amplificar el ORF2 de PCV1.

[0193] Para insertar ORF 2 de PCV2 en un vector de inserción de ALVAC apropiado: se usaron cebadores JP787 (SEQ ID NO: 12) y JP788 (SEQ ID NO: 13) para amplificar ORF 2 de PCV1 del plásmido pPCV1 (véase

anteriormente) para dar como resultado PCR J 131.5. El cebador JP787 (SEQ ID NO: 12) contiene el extremo 3’

del promotor H6 de EcoRV y ORF 2 seguido por un sitio SalI. A continuación el producto de PCR J1315 fue digerido con EcoRV/SalI y clonado como un fragmento de 750 pb en un fragmento EcoRV/SalI de 4,5 kb de pJP099 (véase anteriormente en el Ejemplo 13.1). El plásmido resultante fue confirmado por análisis de secuencias y se designó como pJP 113. La secuencia de ORF 2 se corresponde con la secuencia disponible en GenBank, número de acceso U49186. El plásmido de donador pJP113 (linealizado con NotI) se usó en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar vCP1621 recombinante de ALVAC (véase Ejemplo 13.7).

[0194] Secuencia de los cebadores.

JP787 (SEQ ID NO: 12) JP788 (SEQ ID NO: 13)

TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G

Ejemplo de referencia 13.5 - CONSTRUCCIÓN DE UN PL�?SMIDO DE DONADOR DE ALVAC PARA ORF2 Y ORF1 DE PCV1

[0195] El plásmido pPCV1 (véase Ejemplo 13.4 anteriormente), que contenía el genoma de PCV1 como un fragmento PstI en plásmido pGem-7Z, fue digerido con PstI, y se aisló un fragmento de 1.759 pb y se ligó.

[0196] Se usaron los cebadores JP789 (SEQ ID NO: 14) y JP790 (SEQ ID NO: 15) para amplificar ORF1 de PCV1 del fragmento PstI ligado de 1.759 pb (véase anteriormente), para dar como resultado PCR J1316. El cebador JP789 (SEQ ID NO: 14) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de NruI y el extremo 5’ de ORF1 de PCV

15 1. El cebador JP790 (SEQ ID NO: 15) contiene el extremo 3’ de ORF1 de PCV1 seguido por un sitio SalI. El producto de PCR J1316 (-1 Kb) se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante se confirmó mediante análisis de secuencias y se designó como pJP114. La secuencia de ORF1 se corresponde con la secuencia disponible en GenBank, número de acceso U49186. Se aisló un fragmento NruI/SalI de 970 pb de pJP114 y se clonó en un fragmento NruI/SalI de 4,5 kb de pJP099 (véase Ejemplo 13.1), para dar como resultado un plásmido que se confirmó por análisis de restricción y se designó como pJP115. El plásmido de donador pJP115 podría usarse en una prueba de recombinación in vitro (descrita en el Ejemplo 13.7) para generar recombinante de ALVAC que expresa el ORF1 de PCV 1.

[0197] Se hizo romo un BamHI/SalI de 838 pb de pJP 113 (véase Ejemplo 2.4) usando fragmento de

25 Klenow de ADN polimerasa, y se clonó en el sitio EcoRI romo por Klenow de pJP115. Se verificaron los clones en relación con la orientación del inserto por análisis de restricción y se eligió una orientación cabeza-cabeza. Este plásmido se confirmó por análisis de secuencias y se designó como pJP117. El plásmido de donador pJP117 (linealizado con NotI) se usó en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el vCP1622 recombinante de ALVAC (véase Ejemplo 13.7).

[0198] Secuencia de los cebadores.

JP789 (SEQ ID NO: 14)

JP790 (SEQ ID NO: 15)

TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT TAT-TTT-ATA-TGG

Ejemplo de referencia 2.6 - GENERACIÓN DE RECOMBINANTES DE PCV2-ALVAC

[0199] Los plásmidos pJP102 (véase Ejemplo 13.2 y fig. 2.2) y el plásmido de referencia pJP107 (véase Ejemplo 13.3 y fig. 2.5) se linealizaron con NotI y se sometieron a transfección en células CEF primarias infectadas con ALVAC usando el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio descrito anteriormente

45 (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini y col., 1987). Se seleccionaron placas positivas sobre la base de la hibridación a sondas radiomarcadas de PCV2 específicas y se sometieron a cuatro tandas en secuencia de purificación de placa hasta que se obtuvo una población pura. A continuación se amplificó una placa representativa de cada IVR y los recombinantes de ALVAC resultantes se designaron como vCP1614 y vCP1615. El virus vCP1614 es el resultado de episodios de recombinación entre ALVAC y el plásmido de donador pJP 102, y contiene el ORF2 de PCV2 insertado en el locus C6 de ALVAC. El virus vCP1615 es el resultado de episodios de recombinación entre ALVAC y el plásmido de donador pJP107, y contiene los ORF2 y ORF1 de PCV2 insertados en el locus C6 de ALVAC en una orientación cabeza-cabeza.

[0200] De una forma similar, puede generarse un recombinante de ALVAC que expresa sólo ORF1 de 55 PCV2 usando el plásmido de donador pJP105 descrito en el Ejemplo 13.3.

[0201] Inmunofluorescencia. Con el fin de determinar si las proteínas de PCV2 se expresaron en células Vero infectadas con recombinante de ALVAC, se realizó análisis de inmunofluorescencia (IF). Las células Vero infectadas se lavaron con PBS 24 h después de la infección (m.o.i. de aprox. 10) y se fijaron con acetona fría al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se usaron cinco preparados de anticuerpos monoclonales (AcM) (sobrenadante de hibridoma) específicos para ORF1 de PCV2 (PCV2 199 1D3GA y PCV2 210 7G5GD) u ORF2 (PCV2 190 4C7CF, PCV2 190 2B1BC y PCV2 190 3A8BC) como primer anticuerpo. Estos anticuerpos monoclonales específicos se obtuvieron de Merial-Lyon. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse siguiendo las enseñanzas de los documentos citados en la presente memoria descriptiva, por ejemplo documentos de EE.UU. nº serie 09/082.358 y 09/161.092, incorporados en la presente memoria descriptiva como referencia. La reacción de IF se realizó según se describe en Taylor y col., (1990).

[0202] La inmunofluorescencia específica de PCV2 con los tres anticuerpos específicos de ORF2 podría detectarse en células infectadas con vCP1614 y células infectadas con vCP1615. La inmunofluorescencia específica de PCV2 con los dos anticuerpos específicos de ORF1 podrían detectarse en células infectadas sólo con vCP1615. Estos resultados indicaron que, según lo esperado, vCP1614 expresa sólo ORF2, mientras vCP1615 expresa ORF1 y ORF2. No se detectó fluorescencia en células Vero infectadas con ALVAC parentales, ni en células Vero no infectadas.

[0203] Ejemplo de referencia 13.7 - GENERACIÓN DE RECOMBINANTES DE ALVAC PCV1 Los plásmidos pJP113 (véase Ejemplo 13.4) y pJP117 (véase Ejemplo 13.5) se linealizaron con NotI y se sometieron a transfección en células CEF primarias infectadas con ALVAC usando el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio descrito anteriormente (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini y col., 1987). Se seleccionaron placas positivas sobre la base de hibridación para sondas radiomarcadas con PCV1 específicas y se sometieron a cuatro tandas en secuencia de purificación de placa hasta que se obtuvo una población pura. A continuación se amplificó una placa representativa de cada IVR y los recombinantes de ALVAC resultantes se designaron como vCP1621 y vCP1622. El virus de vCP1621 es el resultado de episodios de recombinación entre ALVAC y el plásmido de donador pJP113, y contiene el ORF2 de PCV1 insertado en el locus C6 de ALVAC. El virus de vCP1622 es el resultado de episodios de recombinación entre ALVAC y el plásmido de donador pJP 117, y contiene el ORF2 y el ORF1 de PCV1 insertados en el locus C6 de ALVAC en una orientación cabeza-cabeza.

[0204] De una forma similar, puede generarse un ALVAC recombinante que expresa sólo ORF1 de PCV1 usando el plásmido de donador pJP 15 descrito en el Ejemplo 13.5.

[0205] Inmunofluorescencia. Con el fin de determinar si las proteínas de PCV1 se expresaron en células Vero infectadas con recombinante de ALVAC, se realizó un análisis de inmunofluorescencia (IF). Las células Vero infectadas se lavaron con PBS 24 h después de la infección (m.o.i. de aprox. 10) y se fijaron con acetona fría al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se usó un suero policlonal de cerdo anti-PCVI específico (Allan

G. y col., Vet Microbiol. 1999.66: 115-123) como primer anticuerpo. La reacción de IF se realizó según se describe en Taylor y col. (1990).

[0206] La inmunofluorescencia específica de PCV1 podría detectarse en células infectadas con vCP1621 y células infectadas con vCP1622. Estos resultados indicaron que, según lo esperado, vCP1621 y vCP1622 expresan productos específicos de PCV1. No se detectó fluorescencia con un suero policlonal de cerdo específico de PCV2 en células infectadas con vCP1621 y en células infectadas con vCP1622. No se detectó fluorescencia en células Vero infectadas con ALVAC parentales, ni en células Vero no infectadas.

Ejemplo de referencia 13.8: FORMULACIÓN DE VIRUS RECOMBINANTES DE LA VIRUELA DEL CANARIO

CON CARBOPOL™974P

[0207] Para la preparación de vacunas, pueden combinarse los virus recombinantes de la viruela del canario vCP1614 y vCP1615 (Ejemplo 13.6) con soluciones de carbómero. De la misma forma, los virus recombinantes de la viruela del canario vCP1621 y vCP1622 (Ejemplo 13.7) pueden mezclarse con soluciones de carbómero. El componente de carbómero usado para vacunación de cerdos según la presente invención es

Carbopol™ 974P fabricado por la empresa BF Goodrich (peso molecular de #3.000.000). Primero se prepara una solución de reserva de Carbopol™ 974P al 1,5% en agua destilada que contiene 1 g/l de cloruro de sodio. Esta solución de reserva se usa a continuación para fabricar 4 mg/ml de solución Carbopol™ 974P en agua fisiológica. La solución de reserva se mezcla con el volumen de agua fisiológica requerido, ya sea en una etapa o en varias etapas sucesivas, ajustando el valor de pH en cada etapa con una solución de hidróxido de sodio 1 N (o más concentrada) para obtener un valor de pH final de 7,3-7,4. Esta solución final de Carbopol™ 974P es una solución lista para usar para reconstituir un virus recombinante liofilizado o para diluir una reserva concentrada de virus recombinante. Por ejemplo, para obtener una suspensión vírica final que contiene 108 ufp por dosis de 2 ml, se puede diluir 0,1 ml de una solución de reserva de 109 ufp/ml en 1,9 ml de la solución lista para usar anterior de 4 mg/ml de Carbopol™ 974P. De la misma forma, pueden prepararse también soluciones listas para usar de 2 mg/ml de Carbopol™ 974P.

Ejemplo de referencia 13.9 - INMUNIZACIÓN DE CERDOS Y POSTERIOR PRUEBA DE PROVOCACIÓN

13.9.1. INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 1 D�?A

[0208] Los grupos de lechones, producidos por cesárea en el Día 0, se colocan en aisladores. Los lechones son vacunados por vía intramuscular en el Día 2 con varias soluciones de vacunas. Las suspensiones víricas de vacunas se preparan por dilución de reservas de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl al 0,9%). Pueden determinarse empíricamente intervalos adecuados para suspensiones víricas, pero en general estarán comprendidos entre 106 y 1010 y preferentemente aproximadamente 1010, ufp/dosis. Las soluciones de vacunas pueden prepararse también mezclando la suspensión del virus recombinante con una solución de

Carbopol™ 974P, según se describe en el Ejemplo 13.8.

[0209] Los lechones son vacunados con:

Virus recombinante vCP1614 (Ejemplo 13.2)

Virus recombinante vCP1615 (Ejemplo 13.3)

Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (4 mg/ml de solución)

Virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (4 mg/ml de solución).

[0210] Las suspensiones víricas contienen 108 unidades de formación de placas (ufp) por dosis. Cada suspensión vírica se inyecta por vía intramuscular por debajo de un volumen de 1 ml. La inyección intramuscular se administra en los músculos del cuello.

[0211] Se administran dos inyecciones de suspensiones víricas en el Día 2 y el Día 14 del experimento. Se realiza una prueba de provocación en el Día 21 mediante una administración oronasal de una suspensión vírica preparada a partir de un cultivo de cepa virulenta de PCV-2. Después de la prueba de provocación, se vigila a los lechones durante 3 semanas en busca de signos clínicos específicos del síndrome multisistémico posdestete. Se puntúan los signos siguientes:

Temperatura rectal: monitorización diaria durante 2 semanas después de la prueba de provocación, y después 2 medidas de temperatura rectal durante la tercera semana. Peso: se pesan los lechones justo antes de la prueba de provocación, y después semanalmente durante las 3 primeras semanas después de la prueba de provocación. Se toman muestras de sangre en el Día 2, el Día 14, el Día 21, el Día 28, el Día 35 y el Día 42 del experimento con el fin de vigilar los niveles de viremia y las valoraciones de anticuerpos específicos anti-PCV-2. Necropsias: en el Día 42, todos los lechones supervivientes se someten humanamente a eutanasia y a necropsia en busca de lesiones macroscópicas específicas de SMEP. Se preparan muestras de tejido del hígado, los ganglios linfáticos, el bazo, los riñones y el timo con el fin de buscar lesiones histológicas específicas.

13.9.2. INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 5-7 SEMANAS

[0212] Se vacunan lechones de 5-7 semanas de vida, libres de anticuerpos maternos específicos anti-PCV-2, por vía intramuscular con varias soluciones de vacunas. Las suspensiones víricas de las vacunas se preparan por dilución de reservas de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl al 0,9%). Las soluciones de vacunas pueden prepararse también mezclando la suspensión de virus recombinantes con una

solución de Carbopol™ 974P, según se describe en el Ejemplo 13.8.

[0213] Los lechones se vacunan con:

Virus recombinante vCP1614 (Ejemplo 13.2)

Virus recombinante vCP1615 (Ejemplo 13.3)

Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (4 mg/ml de solución)

Virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (4 mg/ml de solución)

[0214] Las suspensiones víricas contienen 108 unidades de formación de placas (ufp) por dosis. Cada suspensión vírica se inyecta por vía intramuscular por debajo de un volumen de 2 ml. La inyección intramuscular se administra en los músculos del cuello.

[0215] Se administran dos inyecciones de las suspensiones víricas en el Día 0 y el Día 21 del experimento. Se realiza una prueba de provocación en el Día 35 por una administración oronasal de una suspensión vírica preparada a partir de un cultivo de cepa virulenta de PCV-2. Después de la prueba de provocación, se vigila a los lechones durante 8 semanas en busca de signos clínicos específicos del síndrome multisistémico posdestete. La vigilancia clínica es idéntica a la descrita en el Ejemplo 13.9.1 con la salvedad de que la duración total de la vigilancia es de 8 semanas en lugar de 3 semanas.

[0216] Se realizan necropsias durante todo el experimento para lechones que mueren por la prueba de provocación y al final del experimento (Día 97) para todos los lechones supervivientes. Las muestras de tejido son las mismas que se describen en el Ejemplo 13.9.1.

REFERENCIAS [0217]

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21.: Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, Ph. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 6, 497- 503 (1988a).

22.: Taylor, J. and E. Paoletti, Vaccine 6, 466-468 (1988b).

23.: Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R Webster and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988c).

24.: Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J. F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre and E. Paoletti,

J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

25.: Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 9, 190193 (1991).

26.: Taylor J, Weinberg R, Tartaglia J, Richardson C, Alkhatib G, Briedis D, Appel M, Norton E, Paoletti E., Virology 187, 321-328 (1992).

27.: Todd, D., F. D. Niagro, B. W. Ritchie, W. Curran, G. M. Allan, P. D. Lukert, K. S. Latimer, W. L. Steffens, M. S. McNulty, Arch. Virol. 117, 129-135 (1991).

[0218] Habiendo descrito así en detalle formas de realización preferidas de la presente invención, debe entenderse que la invención definida por las reivindicaciones adjuntas no se limitará a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior, ya que son posibles muchas variaciones evidentes de los mismos sin apartarse del ámbito de las reivindicaciones.

Referencias [0219]

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3.: Allan GM, Kennedy S, McNeilly F, y col.: 1999, Experimental reproduction of wasting disease and death by coinfection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J Comp Path 121: 1-11 (July 1999).

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8.: Lager KM and Halbur PG: 1996, Gross and microscopic lesions in porcine fetuses infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Vet Diag Invest 8: 275-282.

9.: Meehan BM, McNeilly F. Todd D, y col.: 1998, Characterization of novel circovirus DNA’s associated wasting

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13.: Tischer I, Rasch R and Tochtermann G: 1974, Characterization of papovavirus-and picomavirus-like particles in permanent piglet kidney cell lines. Zentralbl-Bakertiol-Org-A 226: 153-167.

14. West KH, Bystrom, JM, Wojnarowicz C, y col.: 1999, Myocarditis and abortion associated with intrauterine 10 infection of sows with porcine circovirus-2. J Vet Diag Invest 1.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.
2.

Una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo, en la que dicha composición comprende: a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, y b) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.
3.

Uso de: a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2 y b) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario en la preparación de una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.
4.

Un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, y un segundo vector de plásmido de ADN que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2, para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.
5.

Una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo, en la que dicha composición comprende: a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, b) un segundo vector de plásmido de ADN que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2, y c) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.
6.

Uso de: a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF13 de cepa Imp1010 de PCV-2, b) un segundo vector de plásmido de ADN que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2, y c) un soporte y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario en la preparación de una composición inmunógena para su uso en la reducción de la carga viral de PCV-2 en los ganglios bronquiales y mesentéricos de un cerdo.
7.

El primer plásmido para su uso según la reivindicación 1; o la composición inmunógena para su uso según la reivindicación 2; o el uso del primer plásmido según la reivindicación 3; o los plásmidos primero y segundo para su uso según la reivindicación 4; o la composición inmunógena para su uso según la reivindicación 5; o el uso de los plásmidos primero y segundo según la reivindicación 6; en el que dicha primera secuencia de nucleótidos es ORF13 de la cepa Imp1010 de PCV-2.
8.

Los plásmidos primero y segundo para su uso según la reivindicación 4 ó 7; o la composición inmunógena para su uso según la reivindicación 5 ó 7; o el uso de plásmidos primero y segundo según la reivindicación 6 ó 7; en los que dicha segunda secuencia de nucleótidos es ORF4 de la cepa Imp1010 de PCV-2.