CN102416173B - 预防与猪环状病毒-2相关的心肌炎、流产和宫内感染 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了含有来自猪环状病毒(2)的外源DNA的重组痘病毒,例如禽痘病毒。也描述了含有该重组痘病毒的免疫组合物,该免疫组合物被用于在施用了该免疫组合物的宿主动物体内诱导免疫应答。还描述了通过将本发明的免疫组合物给予需要治疗或对猪环状病毒(2)的感染敏感的动物,来治疗或预防猪环状病毒(2)引起的疾病的方法。
Description
发明领域
本发明涉及预防和/或治疗PCV-2引起的心肌炎、和/或流产和/或宫内感染、以及病理学后遗症(包括但不限于断奶后多系统萎缩综合征)的方法和/或组合物;并且尤其涉及制备这些组合物的方法和制备这些组合物或实施这些方法的试剂盒。
发明背景
猪环状病毒-2(PCV-2)是最近确认的一贯与世界几个地方的猪群断奶后多系统萎缩综合征(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)有关的病因(Allan等,1998;Ellis等,1998)。从几个国家的受染猪身上获得的PCV-2分离株实际上在遗传上是一致的,但与20世纪70年代最初作为猪肾细胞系(PK/15)的非致细胞病变污染物而鉴定的PCV(CCL33,PCV-1)明显不同(Meehan等,1998;Tischer等,1974)。患有天然获得的或实验诱导的PCV-2感染的猪表现出进行性的体重降低、呼吸急促、呼吸困难和黄疸(Allan等,1998;Allan等,1999;Elllis等,1998;Ellis等,1999)。直接与PCV-2抗原有关的宏观病理学研究结果包括淋巴结病、间质性肺炎、肝炎和肾炎(Allan等,1998;Allan等,1999;Elllis等,1998;Ellis等,1999)。也参见WO-A-9918214、WO-A-0001409、WO-A-9929717和WO-A-9929871。在此之前,并没有将PCV-2直接地与流产或胎猪的损伤联系起来。因此,迄今还没有人想解决有关PCV-2引起的心肌炎、和/或流产和/或宫内感染的问题。
发明目的和概述
令人惊奇的是我们发现PCV-2是导致心肌炎、流产和宫内感染、以及断奶后多系统萎缩综合征的原因。
关于定义,正如本文或本文引用或参考的文献中所公开的,PCV-2免疫原旨在包括减毒活PCV-2或灭活PCV-2、或通过体外表达或通过提取获得的PCV-2亚单位、或能够通过化学合成或体外重组表达获得的含有至少一个目的表位的片段、以及包含并体内表达PCV-2基因组的序列或片段或表位的重组载体。
类似的定义也适用于本文公开的其它猪病原体的免疫原。
关于定义,免疫原性组合物引起-局部的或系统的-免疫原性应答(immunogenicresponse)。疫苗组合物引起局部的或系统的保护性应答。术语“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(因为前一术语可以是保护性组合物)。
因此,本发明的一个目的可以是提供预防和/或治疗PCV-2引起的心肌炎、和/或流产和/或宫内感染、以及断奶后多系统萎缩综合征和/或病理学后遗症(包括但不限于断奶后多系统萎缩综合征)的方法和/或组合物;并提供配制这些组合物(该组合物还可以包括猪细小病毒(PPV)免疫原)的方法和PCV-2免疫原在这些组合物的配制中的用途。
另一目的是PCV-2免疫原在制备用于预防和/或治疗PCV-2引起的心肌炎、和/或流产和/或宫内感染的组合物中的用途。
本发明的另一目的是分离和表征标识为1103(1103/1P.2)和1121(1121/1P.1)的新PCV-2毒株,以及它们在制备免疫原、以及用于诊断的抗原和抗体中的用途,该用途与PCV-2引起的心肌炎、和/或流产和/或宫内感染、以及断奶后多系统萎缩综合征和/或相关的病理学后遗症有关。
本发明还提供了在繁殖前;和/或配种前、和/或妊娠(或怀孕)期间;和/或围生期或产仔前;和/或在一生中反复地,采用含有(至少一种)PCV-2免疫原的组合物(该组合物还可以包括猪细小病毒的免疫原)接种雌猪(例如母猪(sow)、小母猪(gilt))的方法,以便预防与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症;或,以便引起抵抗PCV-2的免疫原性或保护性应答并籍此预防与猪环状病毒-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和/或心肌炎和/或流产和/或宫内感染和/或其它与PCV-2相关的病理学后遗症。
有利地,在配种前至少接种一次。而且有利地,随后在妊娠期间,例如大约妊娠中期(妊娠约6-8周时)和/或妊娠末期(妊娠约11-13周时)进行一次接种。因此,有利的方案是在配种前接种一次然后在妊娠期间作一次加强接种。其后,可以在每次配种前和/或妊娠期间约妊娠中期(妊娠约6-8周时)和/或妊娠末期(妊娠约11-13周时),再次接种。优选地,可以仅在妊娠期间再次接种。
在另一优选实施方案中,小猪,例如来自接种过(例如按此处所讨论的方式接种)的雌猪的小猪,在出生后的第头几周中接受接种,例如在出生后第一和/或二和/或三和/或四和/或五周时接种。更优选地,小猪在出生后的第一周内或出生后的第三周内(例如在断奶期)接受第一次接种。甚至更有利的是,然后(第一次接种后)二(2)至四(4)周后给予这些小猪加强接种。因此,仔猪和雌猪(例如母猪、小母猪)均可以施用本发明组合物和/或可以是本发明方法的实施对象。
因此,本发明包括含有PCV-2毒株1103和/或1121来源的免疫原、用于预防或治疗与猪环状病毒-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症的免疫原性或疫苗组合物。
本发明还包括PCV-2免疫原在配制用于预防或治疗猪环状病毒-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症的免疫原性或疫苗组合物中的用途。
再有,本发明还包括用于预防和/或治疗PCV-2引起的心肌炎和/或流产和/或宫内感染和/或断奶后多系统萎缩综合征、含有药学上或兽医学上可接受载体和/或赋形药(vehicle)和/或赋形剂(excipient)和/或佐剂、及PCV-2免疫原的免疫原性或疫苗组合物。
此外,组合物还可以包括来自至少一种其它猪病原体的至少一种免疫原,例如:猪繁殖和呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、假狂犬病病毒(Pseudorabies)、猪霍乱病毒(Hogcholera)、猪流感病毒(SwineInfluenza)、和猪细小病毒(PorcineParvovirus)(PPV)。因此,基于载体的组合物可以包括来自至少一种其它猪病原体的至少一种免疫原,例如表达来自该病原体的序列的载体,其中载体也可以是表达PCV-2免疫原的载体。表达PCV-2序列的载体可以包含PCV-2的序列或片段;并且本发明包括这些核酸分子、含有它们的载体、含有这些核酸分子或载体的组合物、来自这些核酸分子的表达产物、含有这些表达产物的组合物、针对这些核酸分子的探针或引物、和制备和使用前述任一个或所有的方法。
载体可以包含DNA载体质粒、细菌如大肠杆菌、病毒如杆状病毒、疱疹病毒(包括猪疱疹病毒,包含奥耶斯基病病毒(Aujeszky’sdiseasevirus))、腺病毒(包括猪腺病毒)、痘病毒(包括痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、浣熊痘病毒和猪痘病毒)等。基于载体的组合物可以包含如下载体,所述载体含有并表达选自PCV-2的ORF1-13的ORF、例如选自ORF4、7、10和13的ORF、优选ORF4和/或13,有利地所述PCV-2是本文确定的PCV-2毒株之任一种、尤其是毒株1103和/或1121。而且,组合物中的免疫原(PCV-2和/或来自其它猪病原体的免疫原)可以通过重组方式产生。
质粒这个词旨在包括以含有待表达的PCV序列的多核苷酸序列形式存在的任何DNA转录单位。有利地,质粒包括对于其表达(例如体内表达)必需的元件。超螺旋的或其它形式的环状质粒形式是有利的;线性形式也包括在本发明的范围之内。质粒免疫原性或疫苗组合物可以通过基因枪、借助无针头注射器(needlelessinjector)通过皮内途径、通过皮下或肌内途径、或通过粘膜途径、或通过允许实现体内表达以及有利地实现免疫原性或保护性应答的任何其它手段,进行给药。
应注意,还可以任选地从感染或转染的细胞中分离和/或纯化本发明载体或重组体产生的表达产物;以便,例如,制备给猪施用的组合物;然而,在某些情况下,不从细胞中分离和/或纯化表达产物可能是有利的;例如当细胞或其部分可以增强该多肽的免疫原性作用时。而且,蛋白质分离和/或纯化的技术是已知的,而且无需过多实验即能够在本发明的实施中用于纯化和/或分离重组体或载体的表达产物、和/或PCV-2的亚单位和/或其它猪病原体;一般地,这些技术可以包括:利用目的蛋白质在变化的盐浓度下的溶解度进行的沉淀、采用有机溶剂、聚合物和其它物质进行的沉淀、亲和沉淀和选择性变性;柱层析,包括高效液相层析(HPLC)、离子交换层析、亲和层析、免疫亲和层析或染料-配体层析;免疫沉淀、凝胶过滤、电泳方法、超过滤和等电聚焦,尤其是它们的组合。
本发明还设想了预防和/治疗猪环状病毒-2(PCV-2)引起的心肌炎和/或流产和/或宫内感染和/或与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和/或其它病理学后遗症的方法,该方法包括通过给猪施用前述或本文公开的组合物在猪身上诱导对抗PCV-2的免疫原性或保护性应答。
因此,本发明包括预防和/或治疗猪环状病毒-2(PCV-2)引起的心肌炎和/或流产和/或宫内感染和/或与PCV-2有关的断奶后多系统萎缩综合征和/或其它病理学后遗症的方法,该方法包括通过给猪施用如下组合物在猪身上诱导对抗PCV-2的免疫原性或保护性应答,所述组合物包含药学上或兽医学上可接受载体或赋形剂或赋形药(优选地还包含佐剂)和含有PCV-2免疫原的活性剂。该方法可以用于预防PCV-2引起的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,包括施用包含药学上或兽医学上可接受载体和PCV-2免疫原的组合物。PCV-2免疫原可以是活的减毒全PCV-2或灭活PCV-2。该方法可以涉及是亚单位免疫原性或疫苗组合物的组合物。该方法可以涉及此外还包括来自至少一种其它猪病原体的至少一种免疫原(包括表达该免疫原或表位的载体)的组合物;例如,该至少一种其它猪病原体可以选自PRRS、猪肺炎支原体、大叶性肺炎放线杆菌、大肠杆菌、假狂犬病病毒、猪霍乱病毒、支气管炎博德特氏菌、多杀巴斯德氏菌、猪红斑丹毒丝菌、猪流感病毒、和PPV、以及它们的组合。该方法可以涉及载体,该载体是DNA载体质粒、细菌如大肠杆菌、病毒如杆状病毒、疱疹病毒(包括奥耶斯基病病毒)、腺病毒(包括猪腺病毒)、痘病毒(包括痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒)等。该方法可以涉及基于载体的组合物,该组合物此外还包括来自至少一种其它猪病原体的至少一个序列、片段或表位,或表达该序列、片段或表位的载体,其中该载体也可以是表达PCV-2序列、片段或表位的载体。该方法可以涉及如下载体,该载体含有并表达选自ORF1-13的ORF,例如选自ORF4、7、10和13的ORF;优选ORF4和/或13。该方法还可以涉及基于免疫原的组合物,其中一或多个免疫原是通过重组方式产生的。在此方法中,优选地按上述方式接种雌猪和/或小猪。
在另一实施方案中,本发明涉及制备上述或本文所公开任一种组合物的方法,包括将药学上或兽医学上可接受载体和可能的佐剂,与PCV-2免疫原混合。该方法还可以包括采用含有编码PCV-2免疫原的DNA并表达该免疫原的重组载体转染或感染细胞或宿主;以及任选地包括从该细胞纯化和/或分离该免疫原。类似地,该方法可以包括从PCV-2分离和/或纯化PCV-2免疫原、或从样品中分离PCV-2。
本发明还提供用于制备上述或本文所公开任一种组合物、或实施上述或本文所公开任一种方法的试剂盒,其包含置于第一容器中的药学上或兽医学上可接受载体或赋形药或赋形剂和置于第二容器中的含有PCV-2免疫原的活性剂,其中任选地可以将该第一和第二容器包装在一起,并且任选地该试剂盒可以包括有关该组合物成分的混合和/或该组合物的施用方式的说明书。
在再一实施方案中,本发明涉及给雄性和/或雌性猪施用上述或本文所公开任一种组合物;以便预防PCV-2的传播、和预防或治疗或控制与猪环状病毒-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症。施用优选按上述方式进行。
术语“包含”在本公开中可以指“包括”或可以具有美国专利法中术语“包含”所通常被赋予的意义。
通过以下公开,本发明的其它方面得到了描述或是明显的(并且属于本发明范围内)。
发明详述
猪环状病毒-2(PCV-2)是与猪群中断奶后多系统萎缩综合征(PMWS)有关的病因。正如实施例1和2中所显示的,PCV-2相关疾病的可能范围由于垂直传播得以扩大并与繁殖失败相关。
具体地,实施例1显示,从来自经历后期流产和死产的农场的一窝流产小猪中分离出PCV-2。在一头出现PCV-2抗原的广泛免疫组织化学染色的小猪中,有严重的弥散性心肌炎。并且在多头胎猪的肝、肺和肾中也有不同数量的PCV-2抗原。与胎猪损伤和猪的流产有关的其它因素,包括猪细小病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒和肠道病毒,的存在没能得到证实。
更具体地,实施例2显示,四年内从30个高度健康猪群获得的、并在流产或繁殖失败的常规病案中测试过的组织,在两个涉及几头出现弥散性心肌炎、心脏肥大和慢性被动充血迹象的死产小猪和不能存活新生猪的提交物中为PCV-2阳性。这两个阳性提交物来自同一农场,但发生在两个不同的时间。通过免疫组织化学和病毒的分离证实了染病小猪的心脏和其它组织中存在PCV-2。1999年之前在出现地方性感染的区域的繁殖失败病案中没有检测到猪环状病毒,这支持了繁殖性疾病是PCV-2感染的新临床表现,而且还提示性交和垂直模式的传递负责病毒在猪群中的传播。
因此,给猪,例如雌猪(如母猪或小母猪)接种包括至少一种PCV-2免疫原(例如来自至少一个选自病毒株Imp1008、Imp1010、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1003和1121的病毒株)的组合物(尤其是,该组合物还可以包括来自至少一种其它猪病原体(例如至少一种猪细小病毒)的至少一种免疫原,其中当采用载体时,载体可以共同表达PCV-2免疫原和至少一种其它猪病毒体的至少一种免疫原(例如PPV的免疫原),尤其是当按上述的免疫进度进行接种时,可以预防与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症。
因此,本发明涉及采用PCV-2免疫原预防与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症的方法和组合物。尤其是,对于采用PCV-2免疫原预防与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2相关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症的方法和组合物,来自1103株和/或1121株的免疫原是有用的。
本发明还涉及任何已知PCV-2株或来自它们的免疫原在配制如下免疫原性或疫苗组合物中的用途,所述组合物被用于预防或治疗与PCV-2有关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染、以及与PCV-2有关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症(这些病毒株包括病毒株Imp1008、Imp1010、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1103和1121),尤其是当该组合物旨在被施用给小猪例如来自经过接种的雌猪的小猪,更具体地施用给雌猪,尤其是怀孕雌猪或将要接受配种的雌猪时;更特别地是根据以上定义的接种方案进行施用时。
更具体地,该用途是配制如下组合物,该组合物旨在预防或治疗与PCV-2有关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,尤其是当该组合物旨在施用给小猪例如来自经过接种的雌猪的小猪,更特别地施用给雌猪,尤其是怀孕雌猪或将要接受配种的雌猪时;更特别地是根据以上定义的接种方案进行施用时。
所述来自至少一种其它猪病原体的至少一种免疫原可以是在已知猪疫苗或免疫原性组合物中使用的、或在WO98/03658中描述的那些。
在本发明中使用的组合物可以根据兽医或制药领域的技术人员熟知的标准技术来制备。这些组合物可由兽医领域的技术人员在考虑了如猪的年龄、性别、体重、身体状况和具体治疗方案以及给药途径这些因素之后,按其熟知的剂量和技术给药。这些组合物可单独给药,或可以与本发明的其它组合物(例如含有PCV-2免疫原的其它组合物)或与其它预防或治疗性组合物(例如其它猪免疫原性或疫苗组合物)共同给药或顺序给药。由此,本发明还提供多价或“鸡尾酒式”或联合的组合物和使用它们的方法。在这一方面,请参考涉及狂犬病毒组合物和联合组合物及其使用的美国专利5,843,456。
本发明的组合物可以用于肠胃外或粘膜给药,优选通过皮内或肌内途径给药。具体地,对于皮内途径,可以采用无针头注射器进行注射。当采用粘膜给药时,可以使用口、鼻或眼途径。
在这些组合物中,可以将免疫原与适合的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等,和/或优选地与佐剂混合。这些组合物也可被冻干或冷冻。这些组合物根据给药途径和预期的制品可以含有辅助物质如pH缓冲剂、佐剂、防腐剂、用于粘膜途径的聚合物赋形剂等。
可参考标准文献如“REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCICNCE”第17版,1985,来制备适当的制品,而无需过多实验。合适的剂量也可以以本文和本文引用的文献作为基础。
佐剂是增强针对免疫原的免疫应答的物质。佐剂可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂角苷如QuilA、油包水型乳剂、水包油型乳剂、水包油包水型(water-in-oil-in-water)乳剂。乳剂可以基于尤其是轻液体石蜡油(欧洲药典类型);类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯;链烯,尤其是异丁烯或癸烯,低聚化产生的油;含有直链烷基的酸或醇的酯,更具体地是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸脂;分枝脂肪酸或醇的酯,尤其是异硬脂酸酯。油与乳化剂联合使用以形成乳剂。优选地,乳化剂是非离子表面活性剂,尤其是山梨聚糖、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选地该酯可以乙氧基化),和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物,尤其是产品、特别是L121。见Hunter等,有关佐剂的理论和实际应用(TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants)(Stewart-Tull,D.E.S.编),JohnWileyandSons,NY,第51-94页(1995)和Todd等,疫苗(Vaccine)15:564-570(1997)。
例如,可以使用“疫苗设计,亚单位和佐剂方法”(VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach),M.Powell和M.Newman编,PlenumPress,1995,第147页上描述的SPT乳剂,和同一本书第183页上描述的MF59乳剂。
例如,含有佐剂的疫苗可以按以下方式制备:借助乳化涡轮混合器,将67%v/v含有免疫原的水相在2,3%w/v脱水甘露醇油酸酯、2,6%w/v11EO(环氧乙烷)乙氧基化的油酸和28,1%v/v轻液体石蜡油(欧洲药典类型)中乳化。
制备乳剂的另一种方法是将5%w/v角鲨烷、2.5%w/vL121、0.2%w/v20EO乙氧基化的油酸和脱水山梨糖醇的酯、92.3%v/v含有免疫原的水相混合,然后使之通过一个高压匀浆器来乳化。
尤其是,还可以与合成聚合物(例如乳酸和乙醇酸的同聚物和共聚物,它们已经被用于制备包被免疫原的微球,见Eldridge等,Mol.Immunol.28:287-294(1993),例如生物可降解微球)、与细胞因子如IL-2和IL-12(见例如美国专利5,334,379)和GMCSF,有利的是猪的GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;一般参见美国专利4,999,291和5,461,663,也参见Clark等,科学(Science)1987,230:1229;Grant等,药物(Drugs),1992,53:516),一起配制。某些佐剂可以和免疫原和/或表位一起在体内表达;例如细胞因子、GMCSF(见例如,有关编码和表达猪GM-CSF的质粒的文献:Inumaru和Takamatsu,Immunol.Cell.Biol.,1995,73:474-76)。
佐剂的再一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和顺丁烯二酸酐与链烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,尤其与糖或多元醇的多聚链烯基醚交联。这些化合物称为术语carbomer(Phameuropa第8卷第二期,1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利号2909462,该专利描述了与多羟基化合物交联的这类丙烯酸聚合物,该多羟基化合物含有至少3个羟基,优选不超过8个羟基、其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团所取代。优选基团是那些含有2-4个碳原子的基团,如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。这些不饱和基团本身可以含有其它取代基,如甲基。以名称(BFGoodrich,俄亥俄州,美国)出售的产品特别适合。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中可以提及的有974P、934P和971P。在顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物中,优选顺丁烯二酸酐和乙烯的线性或交联的共聚物(Monsanto),例如与二乙烯基醚交联的共聚物。可参考文献J.Fields等,自然(Nature),186:778-780,1960.6.4。
从其结构来看,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物优选由下式的基本单位形成:
其中:
R1和R2相同或不同,代表H或CH3;
x=0或1,优选x=1;且
y=1或2,且x+y=2。
对于共聚体,x=0,y=2。对于carbomer,x=y=1。
这些聚合物溶解于水产生酸性溶液,将其中和,优选中和至生理pH,以便制备将要掺入免疫原性、免疫学或疫苗组合物的佐剂溶液。此聚合物的羧基部分地为COO-形式。
优选地,根据本发明的佐剂溶液,尤其是carbomer溶液,用蒸馏水制备,优选有NaCl的蒸馏水,获得的溶液为酸性pH。将该储备液加入到预定量(用来获得预定终浓度),或其相当大部分,的含有NaCl的水、优选生理盐水(NaCl9g/l)中来稀释,在几个步骤中都立刻同时或随后进行中和(pH7.3-7.4),优选用NaOH中和。使用生理pH的该溶液与疫苗混合,该溶液特别可以以冻干、液体或冰冻的形式贮藏。
在最后的疫苗组合物中聚合物浓度可以为0.01%-2%w/v,例如0.06-1%w/v,如0.1-0.6%w/v。
从本公开和本领域的知识,如果需要的话,技术人员可以选择适合的佐剂和其量用于根据本发明的免疫的、免疫原性的或疫苗组合物中,而无需过多实验。
根据本发明的免疫原性或疫苗组合物可以与至少一种其它猪病原体的至少一种减毒活疫苗、灭活疫苗、或亚单位疫苗、或表达至少一种免疫原或目的表位的重组疫苗(如作为载体的痘病毒或DNA质粒)关联。
本发明设想了用于各种施用途径的组合物形式。此外,有效剂量和施用途径可以由已知因素如年龄、性别、体重和其它已知筛选程序来确定,而无需过度实验。每一种活性剂的剂量都可以与本文所引用文献中的相同,和/或可以在一或几个至几百或几千个微克的范围内变动,例如对于亚单位免疫原性或疫苗组合物在1μg至1mg;对于灭活免疫原性或疫苗组合物为104-1010TCID50,有利地106-108TCID50(灭活前的滴度)。对于减毒活免疫原性或疫苗组合物,剂量可以为101-108TCID50,有利地103-106TCID50。
可以按适合的量施用重组体或载体,以便体内获得相应于此处所述和/或本文引用文献中所述剂量的表达。例如,对于病毒悬浮液,可以经验地确定适合的范围。在本发明中可以按每剂(例如约2ml)约至少103pfu;更优选约104pfu-约1010pfu,例如约105pfu-约109pfu,如约106pfu-108pfu的量,给猪施用病毒载体或重组体,或用病毒载体或重组体感染或转染细胞。而且,如果有一个以上的重组体表达一个以上的基因产物时,每个重组体均可以按这些量进行施用;或者,可以这样施用各重组体,以便组合起来产生包含这些量的重组体总量。
在本发明所用质粒组合物中,剂量可以与本文引用文献中所述的或本文所述的相同。例如,质粒组合物中每种质粒DNA的适合量可以为1μg-2mg,优选地50μg-1mg。技术人员可以参考本文引用的有关DNA质粒载体的文献确定本发明DNA质粒载体组合物的其它适合剂量,而无需过多实验。
然而,引起适合免疫应答的组合物剂量、其中成分的浓度和施用组合物的时间选择可以通过以下方法确定,例如:血清的抗体滴定,如ELISA和/或血清中和测定分析,和/或在猪身上作接种攻击评价。根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文献,这些确定并不需要过多的试验。而且,顺序给药的时间安排同样可以采用从本公开和本领域知识可确定的方法来确定,而无需过多实验。
PCV-2免疫原可以从PCV-2获得,或可以从PCV-2基因或其部分或表位的体外重组表达获得。制备载体(或重组体)和/或使用它们进行表达的方法可以参照或类似于以下文献中公开的方法,尤其是有关DNA表达载体的方法:美国专利4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、5,756,103、5,766,599、6,004,777、5,990,091、6,033,904、5,869,312、5,382,425;PCT公开文本WO94/16716、WO96/39491、WO95/30018;Paoletti,“痘病毒载体在接种中的应用:新信息”,PNASUSA93:11349-11353,1996年10月;Moss,“用于重组基因表达的遗传工程化痘病毒、接种和安全性”,PNASUSA93:11341-11348,1996年10月;Smith等,美国专利4,745,051(重组杆状病毒);Richardson,C.D.(编),分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)39,“杆状病毒表达的实验操作”(1995HumanaPress公司);Smith等,“在感染了杆状病毒表达载体的昆虫细胞中制备人β干扰素”,分子和细胞生物学(MolecularandCellularBiology),1983年12月,第3卷第12期第2156-2165页;Pennock等,“用杆状病毒载体在感染细胞中有调节地强表达大肠杆菌β半乳糖苷酶”,分子和细胞生物学,1984年3月,第4卷第3期第399-406页;EPA0370573;1986年10月16提交的美国申请920,197;EP专利公开文本265785;美国专利4,769,331(重组疱疹病毒);Roizman,“单纯疱疹病毒基因的功能:遗传改造新载体的一个引子”,PNASUSA93:11307-11312,1996年10月;Andreansky等,“遗传工程化单纯疱疹病毒在治疗实验性脑肿瘤中的应用”,PNASUSA93:11313-11318,1996年10月;Robertson等,“用于向B淋巴细胞递送基因的埃-巴病毒载体”,PNASUSA93:11334-11340,1996年10月;Frolov等,“基于α病毒的表达载体:策略和应用”,PNASUSA93:11371-11377,1996年10月;Kitson等,J.Virol.65,3068-3075,1991;美国专利5,591,439、5,552,143;WO98/00166;1996年7月3日同时提交的获得承认的美国申请08/675,556、和08/675,566(重组腺病毒);Grunhaus等,1992,“作为克隆载体的腺病毒”,专题讨论,病毒学(Virology)(第3卷),第237-52页,1993;Ballay等,EMBOJournal,第4卷,第3861-65页;Graham,Tibtech8,85-87,1990年4月;Prevec等,J.GenVirol.70,429-434;PCTWO91/11525;Felgner等(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561;科学259:1745-49,1993;和McClements等,“采用编码糖蛋白D或糖蛋白B的DNA疫苗单独或组合免疫,在患有2型单纯疱疹病毒疾病的动物模型中诱导保护性免疫”,PNASUSA93:11414-11420,1996年10月;和美国专利5,591,639、5,589,446和5,580,859;以及WO-A-9011092、WO-A-9319183、WO-A-9421797、WO-A-9511307、WO-A-9520660;Tang等,自然(Nature)356,152-154,1992;和Furth等,AnalyticalBiochemistry205,365-368,1992。也参见WO98/33510;Ju等,Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统);Sanford等,美国专利4,945,050;Fishbach等(Intracel),WO90/01543;Robinson等,专题讨论,IMMUNOLOGY,第9卷,第271-283页(1997)(DNA载体系统);Szoka等,美国专利4,394,448(在活细胞中插入DNA的方法);McCormick等,美国专利5,677,178(致细胞病变病毒的用途);和美国专利5,928,913(基因递送载体);以及这里引用的其它文献。例如,在本发明的实施中,采用选自猪疱疹病毒如奥耶斯基病病毒、猪腺病毒、痘病毒(尤其是痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒)的病毒载体、以及DNA载体(DNA质粒)是有利的。
来自PCV-2基因或其部分的表达产物可以用于制备在诊断目的中有用的抗体如单克隆或多克隆抗体。类似地,来自PCV-2基因或其部分的表达产物可以在诊断应用中使用。
而且,根据此处的公开和本领域的知识,无需过多试验,本领域技术人员可以确定PCV-2免疫原中的或其它猪病原体免疫原中的目的表位;见,例如WO98/40500,尤其是有关测定目的表位或蛋白质表位区域的一般信息。
根据本发明,有利的免疫原性或疫苗组合物是:从感染了PCV-2纯化制品的体外细胞培养物中收集的免疫原性或疫苗组合物,其中所述PCV-2纯化制品的例子有选自保藏在ECACC(欧洲动物细胞保藏中心,应用微生物学和研究中心,Salisbury,WiltshireSP40JG,UK)、具有如下参考信息的制品的猪环状病毒纯化制品:1997年10月2日保藏的具有保藏号V97100219(Imp.1008株)、V97100218(Imp.1010株)和V97100217(Imp.999株)的制品,1998年1月16日保藏的具有保藏号V98011608(Imp.1011-48285株)和V98011609(Imp.1011-48121株)的制品,2000年2月2日保藏的具有保藏号00012710(1103株)和00012709(1121株)的制品;或包含自体外细胞培养物产生并分离的猪环状病毒的免疫原性或疫苗组合物,其中这些细胞已感染了能够从患有PMWS综合征的猪的生理样品或组织样品,尤其是损伤处,分离出来的猪环状病毒,例如其中的猪环状病毒产生并分离自猪肾细胞系,如产生并分离自没有PCV-1污染的PK/15细胞的那些组合物;或含有从感染了该环状病毒的体外细胞培养物收集的培养物提取物或上清液,或从这些培养物提取物或上清液制备的那些组合物。因此,猪环状病毒可以是免疫原。例如,有利地,疫苗或免疫原性组合物可以在兽医学上或药学上可接受赋形药或稀释剂和任选的兽医学上或药学上可接受佐剂、以及任选的冻干稳定剂中包含减毒的活的全免疫原(例如病毒)。免疫原(例如病毒)可以是灭活的,并且疫苗或免疫原性组合物可以还和/或任选地含有兽医学上或药学上可接受赋形药或稀释剂和任选地含有兽医学上或药学上可接受佐剂。疫苗或免疫原性组合物可以含有PCV-2免疫原和/或几种猪环状病毒(包括PCV-2或PCV-2的几个株,并包括PCV-1)的免疫原,以及任选地含有来自其它猪病原体的其它免疫原;例如PRRS、猪肺炎支原体、大叶性肺炎放线杆菌、大肠杆菌、假狂犬病病毒、猪霍乱病毒、支气管炎博德特氏菌、多杀巴斯德氏菌、猪红斑丹毒丝菌、猪流感病毒、PPV(也参见WO-A-0001409)的免疫原。
为了制备环状病毒抗原制品,环状病毒可以在细胞,尤其是细胞系如PK/15细胞上传代后获得。可以采用培养物上清液或提取物,它们可以任选地通过标准技术纯化。
对于减毒PCV,可以根据通常的方法,例如在细胞上传代、优选在猪细胞(尤其是细胞系如PK/15细胞)上传代(例如20-150代,尤其是大约40-100代),进行减毒。
对于灭活疫苗,可以根据本领域技术人员已知的技术灭活PCV-2,以及可能存在的部分。优选地,通过化学途径,例如将抗原暴露于化学试剂如甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、β-丙醇酸内酯或乙烯亚胺或其衍生物,和/或通过物理处理,进行灭活。灭活的优选方法在本文中是暴露于化学试剂,尤其是乙烯亚胺或β-丙醇酸内酯。
疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以从如下DNA片段表达,该DNA片段含有PCV-2核苷酸序列或其(有利地编码至少一个表位的)片段,例如选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:7(图1-4和6-7)中所示序列的那些。疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以从含有选自PCV-2株的ORF1-13,例如ORF4、7、10和13的ORF,优选ORF4和/或13的DNA片段表达,其中的PCV-2株尤其是指以上定义的病毒株之一(与WO-A-9918214中的命名相同,也参见下文表1)。因此,免疫原或其部分,例如目的表位,可以通过从重组体或载体体外进行表达来获得。免疫原还可以通过常规方法进行纯化和/或浓缩。
疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以通过含有如下DNA片段的表达载体进行体内表达,所述DNA片段含有PCV-2核苷酸序列或其片段(有利地编码至少一个表位),例如选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、以及SEQIDNO:6和SEQIDNO:7(图1-4和6-7)中所示序列的那些。类似地,疫苗或免疫原性或免疫组合物中的免疫原可以通过含有如下DNA片段的表达载体进行体内表达,所述DNA片段含有选自PCV-2株,尤其是以上定义的毒株之一,的ORF1-13,例如ORF4、7、10和13的ORF,优选ORF4和/或13。也就是说,疫苗或免疫原性组合物可以含有可体内表达免疫原或其部分(例如目的表位)的表达载体。
表达载体可以是任何适合的载体,例如尤其是选自DNA质粒、细菌如大肠杆菌、病毒例如杆状病毒、疱疹病毒(如奥耶斯基病病毒)、腺病毒(包括猪腺病毒)、痘病毒(尤其是痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒)的载体(本领域技术人员也可以参考Audonnet等和Bublot等分别于1999年6月10日同时提交的美国申请60/138,352和60/138,478,尤其是参考详述、更尤其是参考实施例(分别是作为附录的“DNA疫苗-PCV”和“猪环状病毒重组痘病毒疫苗”))。
因此,本发明还包括核酸分子和含有它们的载体、以及由此而来的表达产物、含有这些核酸分子和/或载体和/或表达产物的组合物,以及制备和使用任一个或所有这些实施方案的方法。本发明尤其包括本文中编码免疫原或表位的ORF和/或片段;以及1103和/或1121株的核酸分子,尤其是它们的ORF1-13,例如ORF4、7、10和13,优选ORF4和/或13,和其片段;以及含有这些核酸分子的载体,含有这些核酸分子或载体的组合物,来自它们的表达产物,含有这些表达产物的组合物,针对这些核酸分子的引物或探针,和涉及这些实施方案的用途或方法,例如用于检测、诊断、测定PCV-2、用于诱导免疫原性或保护性应答、等。
正如之前提出的,本发明实施方案可以包括抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体;例如,从上述环状病毒、或从具有例如选自SEQIDNOS1、2、3、4、6和7(图1-4和6-7)的PCV-2序列的DNA片段编码的多肽、或从含有例如选自SEQIDNOS1、2、3、4、6和7的PCV-2序列的载体所表达的多肽、或从含有包括了选自ORF1-13的ORF在内的DNA的载体所表达的多肽,制备的抗体。本领域技术人员可以采用本领域已知的技术诱发抗体和制备单克隆或多克隆抗体。抗体和抗原可以用于诊断中。
本发明还包括来自PCV-2的1103和/或1121株的探针或引物,它们可以用于例如检测PCV-2DNA,尤其是与心肌炎和/或流产和/或宫内感染有关的PCV-2DNA,以及扩增PCV-2DNA以便例如制备表达载体。探针或引物可以是PCV-2基因组或PCV-2基因中的任何一段至少8个、优选至少10个、更优选至少12、13、14或15,例如至少20个如至少23个或25个,例如至少27或30个核苷酸的序列,而且这些序列对于PCV-2,可能地对于这些病毒株,是独特的,或是PCV-2中至少对于PCV或环状病毒家族而言保守的序列。对于PCR或杂交的引物或探针以及它们的最适长度,也可以参考Kajimura等,GATA7(4):71-79(1990)。杂交有利地在高严紧性条件下进行,术语“高严紧性”将为本领域技术人员所理解(见例如Sambrook等,1989,分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;和Hames和Higgins(编),1985,核酸杂交(NucleicAcidHybridization),IRLPress,Oxford,UK)。应理解,杂交可以采用成熟技术进行,这些技术包括但不限于Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交和,有利地,针对PCR扩增的DNA片段进行的Southern杂交。
与探针或引物一样,非全长PCV-2蛋白质的肽也是本发明的部分,其可以是PCV-2中的任何一段至少8个、优选至少10个、更优选至少12、13、14或15个、例如至少20个如至少23或25个、例如至少27或30个氨基酸的序列,而且该序列是PCV-2、可能地这些毒株所独特的,或是PCV-2中至少对于PCV和/或环状病毒家族而言保守的序列。作为替代或此外,非全长PCV-2蛋白质的本发明氨基酸可以是PCV-2蛋白质的表位区。
Meehan等,1998公开了PCV-2序列(Imp.1010株;ORF1为第398-1342位核苷酸;ORF2为第1381-314位核苷酸;分别相应于本发明术语(见表1)和1998年9月25日提交的美国申请09/161,092中的ORF4和ORF13,以及相应于WO-A-9918214中的COL4和COL13)。本文公开了几个PCV-2株和它们的序列,并将它们称作Imp1008、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1103和1121。其它病毒株公开于A.L.Hamel等,J.Virol.,1998年6月,第72卷,6:5262-5267(GenBankAF027217)和I.Morozov等,J.ClinicalMicrob.,1998年9月,第36卷,9:2535-2541,以及GenBankAF086834、AF086835和AF086836。这些序列、或来自它们的ORF、或它们的编码抗原或免疫原或目的表位的区域也可以用于实施本发明。
本发明还包括本文和本文引用文献中所用或提及的那些核苷酸序列的等同序列;例如,能够在高严紧性条件下与该核苷酸序列杂交的序列(见例如Sambrook等,(1989))。在这些等同序列中,还可以提及的有保留了完整序列的免疫原性的基因片段,例如目的表位。
PCV1型和2型的全基因组之间同源性大约为75%。但在2型中,同源性通常高于95%。因此,在本发明的实施中,等同地包括了任何PCV-2株的使用。一个标准可以是该病毒株是2型的,例如在全基因组的核苷酸水平上与本文公开的病毒株如Imp1010株的同源性等于或大于85%、有利地90%或更高,更有利地95%或更高、优选97、98、或99%或更高。
下表1中给出了Imp1010株的ORF的界限:
名称 | 起始 | 终止 | 链 | ORF大小(核苷酸(nt)) | 蛋白质大小 (氨基酸(aa)) |
ORF1 | 103 | 210 | 有义 | 108nt | 35aa |
ORF2 | 1180 | 1317 | 有义 | 138nt | 45aa |
ORF3 | 1363 | 1524 | 有义 | 162nt | 53aa |
ORF4 | 398 | 1342 | 有义 | 945nt | 314aa |
ORF5 | 900 | 1079 | 有义 | 180nt | 59aa |
ORF6 | 1254 | 1334 | 有义 | 81nt | 26aa |
ORF7 | 1018 | 704 | 反义 | 315nt | 104aa |
ORF8 | 439 | 311 | 反义 | 129nt | 42aa |
ORF9 | 190 | 101 | 反义 | 90nt | 29aa |
ORF10 | 912 | 733 | 反义 | 180nt | 59aa |
ORF11 | 645 | 565 | 反义 | 81nt | 26aa |
ORF12 | 1100 | 1035 | 反义 | 66nt | 21aa |
ORF13 | 314 | 1381 | 反义 | 702nt | 213aa |
这些ORF是相对Imp1010株定义的。本发明还包括任何其它PCV-2株和本文或本文引用文献中定义的任何PCV-2株的相应ORF的使用。因此,从该基因组核苷酸序列,采用标准软件例如确定这些ORF是常规技术。而且,基因组与1010株基因组的比对以及与1010株ORF的比较使得本领域技术人员可以容易地确定另一毒株(例如公开于WO-A-9918214中的那些,如Imp1008、Imp1010-48121、Imp1011-48285、Imp999、以及新毒株1103和1121)的基因组上的ORF。采用软件或进行比对,无需过多实验就可直接地找到这些ORF。
例如,参照图6和7,下表2中给出了毒株1103和1121的相应ORF:
名称 | 起始 | 终止 | 链 | ORF大小 (核苷酸(nt)) | 蛋白质大小 (氨基酸(aa)) |
ORF1 | 1524 | 1631 | 有义 | 108nt | 35aa |
ORF2 | 833 | 970 | 有义 | 138nt | 45aa |
ORF3 | 1016 | 1177 | 有义 | 162nt | 53aa |
ORF4 | 51 | 995 | 有义 | 945nt | 314aa |
ORF5 | 553 | 732 | 有义 | 180nt | 59aa |
ORF6 | 907 | 987 | 有义 | 81nt | 26aa |
ORF7 | 671 | 357 | 反义 | 315nt | 104aa |
ORF8 | 92 | 1732 | 反义 | 129nt | 42aa |
ORF9 | 1611 | 1522 | 反义 | 90nt | 29aa |
ORF10 | 565 | 386 | 反义 | 180nt | 59aa |
ORF11 | 298 | 218 | 反义 | 81nt | 26aa |
ORF12 | 753 | 688 | 反义 | 66nt | 21aa |
ORF13 | 1735 | 1037 | 反义 | 702nt | 213aa |
而且,不改变所讨论基因或该基因编码的多肽的功能性和毒株特异性(如2型毒株的特异性)的核苷酸序列,是等同的并且在本发明的实施中是有用的。由于密码子简并性而不同的序列当然包括在本发明的实施中。
对于ORF4,PCV-1和PCV-2间的同源性为约86%;对于ORF13,PCV-1和PCV-2间的同源性为约66%。因此,对于ORF4,在本发明实施中也有用的等同序列是与Imp1010株的ORF4有等于或大于88%、有利地90%或更高、优选地92%或95%或更高同源性的那些序列;而对于ORF13,是与Imp1010株的ORF13有等于或大于80%、有利地85%或更高、优选地90%或95%或更高同源性的那些序列(采用表1的术语)。
对于其它ORF的同源性,可以从具有ORF4和/或ORF13的PCV毒株确定与1010株的相应ORF有上述定义的同源性的那些序列。对于ORF7,在本发明实施中有用的序列包括与Imp1010株的ORF7有同源性的那些序列,其中所述同源性有利地等于或大于80%、更有利地85%或更高、优选90%或95%或更高。对于ORF10,在本发明实施中有用的序列包括与Imp1010株的ORF10有同源性的那些序列,其中所述同源性有利地等于或大于86%、更有利地90%或更高、优选95%或更高(采用表1的术语)。
同样,对于ORF4,在本发明实施中有用的等同序列是与Imp1010株的ORF4有等于或高于88%、有利地90%或更高、优选地90%或95%或更高同源性的那些序列,而对于ORF13是与Imp1010株的ORF13有等于或高于80%、有利地85%或更高、优选地90%或95%或更高同源性的那些序列。
ORF4和ORF13可能分别编码预期分子量为37.7kD和27.8kD的蛋白质。ORF7和ORF10(相应于Meehan等,1998中的ORF3和ORF4)可能分别编码预期分子量为11.9kD和6.5kD的蛋白质。这些ORF的序列也可以在GenbankAF055392中获得。也可以将它们掺入质粒中并根据本发明单独地或联合如ORF4和/或ORF13一起使用。
上表中公开的其它ORF1-3和5、6、8-9、11-12(WO-A-9918214中的COL1-3和5、6、8-9、11-12)、或它们的编码抗原或目的表位的区域,也可以用于本发明实施中,例如单独地或彼此联合地或联合ORF4和/或13或它们的编码抗原或表位的区域一起使用。类似地,对于同源性,可以从具有ORF13和/或ORF4的PCV病毒株中确定与本文或Meehan等(1998)中定义的1010株的相应ORF有以上定义的同源性的等同序列。对于ORF7,等同序列与Imp1010株ORF7有同源性,该同源性有利地是例如等于或高于80%、例如85%或更高、优选地90%或95%或更高。而对于ORF10,有利地等同序列与Imp1010株ORF10有等于或高于86%、有利地90%或更高、优选地高于95%或更高的同源性。
核苷酸序列同源性可利用Myers和Miller(“线性空间的最佳比对”,CABIO4,11-17,1988)和NCBI提供的“比对(Align)”程序来测定。作为替代或此外,术语“同源性”或“一致性”,例如关于核苷酸序列或氨基酸序列的“同源性”或“一致性”,可指两个序列间同源性的定量测量值。序列同源性百分率可用(Nref-Ndif)*100/Nref来计算,其中Ndif是比对的两序列中非相同残基的总数,Nref是其中一个序列的残基数。因此,DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC的序列相似性为75%(Nref=8;Ndif=2)。
作为替代或此外,关于序列的“同源性”或“一致性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两序列中较短序列的核苷酸或氨基酸数,其中两序列的比对可按照Wilbur和Lipman的算法(Wilbur和Lipman,1983PNAS美国80:726)来确定,例如使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长、缺口罚分为4来确定,并且包括比对在内的计算机辅助分析及序列数据解释可以方便地使用商业化程序进行(如IntelligeneticsTMSuite,IntelligeneticsInc.CA)。当认为RNA序列与DNA序列相似、或有一定程度的序列一致性或同源性时,那么DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
通过将DNA序列中的胸腺嘧啶(T)认同为RNA序列中的尿嘧啶(U),本发明范围内的RNA序列可由DNA序列衍生而来。
此外或作为替代,氨基酸序列相似性或一致性或同源性可使用BlastP程序(Altschul等,Nucl.AcidsRes.25,3389-3402)和NCBI提供的程序来测定。后面的参考文献提供了算法用于比较两个蛋白氨基酸残基的相对一致性或同源性,此外或作为替代,关于前述问题,这些文献中的指导可用来测定同源性或一致性百分率:NeedlemanSB和WunschCD“适用于搜索两个蛋白氨基酸序列相似性的普通方法”J.Mol.Biol.48:444-453(1970);SmithTF和WatermanMS,“生物序列比较,”应用数学进展(AdvancesinApplied Mathematics)2:482-489(1981);SmithTF,WatermanMS和SadlerJR,“核酸序列功能域的统计学表征,”NucleicAcidsRes.,11:2205-2220(1983);FengDF和DolittleRF,“作为修正进化系统树前提条件的渐进序列比对,”J.ofMolec.Evol.,25:251-360(1987);HigginsDG和SharpPM,“在微型计算机上快速灵敏的多重序列比对,”CABIOS,5:151-153(1989);TompsonJD,HigginsDG和GibsonTJ,“ClusterW:通过序列加权、位置特异性缺口罚分和权重矩阵选择提高渐近多重序列比对的灵敏度,NucleicAcidsRes.,22:4673-480(1994);和DevereuxJ、HaeberlieP和SmithiesO,“用于VAX的一套综合性序列分析程序,”NucleicAcidsRes.,12:387-395(1984)。
本发明还包括PCV-2免疫原单独地或进一步联合其它猪病原体的免疫原在制备根据本发明的组合物中的用途,例如将这些成分混合;因此,本发明还包括试剂盒,该试剂盒中各成分单独容纳并任选地为了混合和/或施用将这些容器包装在一起,其中该试剂盒还可以任选地包括混合和/或施用的说明书。
尽管本发明已在给雌猪施用含有PCV-2免疫原的免疫原性或疫苗组合物方面进行了讨论,但本发明还可以包括按本文所述的方法给母猪或小母猪和/或给公猪施用这些组合物;因此,母猪和仔猪(例如母猪、小母猪)以及公猪均可以被给予本发明组合物和/或均可以是本发明方法的实施对象。
根据本发明,免疫原性组合物和疫苗组合物可以含有来自一种以上PCV-2株的免疫原。例如,可以将来自1121和1103株,来自这两个毒株之一或两者的免疫原,与本文公开的至少一种其它毒株的免疫原组合起来,或任何其它组合。
本发明为本领域技术人员能够评价PCV-2疫苗的有效性提高了方法。一个方法是ELISA法或采用血清中和。再一方法是疫苗接种后采用强毒性PCV-2株,例如本文公开的其中一个毒株进行攻击。换言之,本发明使得可以检测能够引起针对PCV-2的免疫原性或保护性应答的PCV免疫原,包括PCV-1的免疫原。这些PCV免疫原然后可以用于预防或治疗猪,以抵抗尤其是与PCV-2有关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,以及抵抗与PCV-2有关的PMWS和/或其它病理学后遗症。
因此,本发明一方面提供能够引起针对PCV-2的免疫原性或保护性应答的、含有PCV免疫原的免疫原性或疫苗组合物。本发明还涉及采用这些免疫原进行免疫或接种的方法,并涉及该免疫原在制备该免疫原性或疫苗组合物中的用途。
本发明将通过以下“实施例和结果”作进一步描述,提供它们是为了说明而不应被认为是本发明的限制。
图1描述了SEQIDNO.1,Imp.1011-48121株的PCV基因组DNA序列。
图2描述了SEQIDNO.2,Imp.1011-48285株的基因组DNA序列。
图3描述了SEQIDNO.3,Imp.999株的基因组DNA序列。
图4描述了SEQIDNO.4,Imp.1010株的基因组DNA序列。
图5描述了SEQIDNO.5,PK/15株的基因组DNA序列。
图6描述了SEQIDNO.6,在加拿大Alberta分离的1103株的基因组DNA序列。k是指g(G)或t(T),y是指c(C)或t(T)。在该病毒群体中观察到这些序列变异。
图7描述了SEQIDNO.7,在加拿大Saskatoon分离的1121株的基因组DNA序列。
实施例和结果
实施例/结果1:与PCV-2有关的心肌炎、流产和宫内感染
当开始投入生产时一个具有450头雌猪的新猪圈中发生了后期流产和死产及干化小猪的分娩。在几头小母猪中还观察到假孕。在繁殖前小母猪接种了两剂含有细小病毒和钩端螺旋体免疫原的灭活疫苗。
接受尸体检查的一窝猪仔由9头表现出死于妊娠不同阶段的胎猪组成。其中2头是干化的、2头是浸软的、3头发生自体溶解、2头是新鲜的死产小猪。在仅一个部分自体溶解的胎猪的大体病理学检查中观察到损伤。在此胎猪中心脏的两个心室均被扩大,肝脏出现增大并且坚硬,有胸膜积水和腹水。组织病理学检查,有大面积的心肌退化或坏死,伴有水肿和轻度纤维化,以及弥散性中度淋巴细胞和巨噬细胞浸润。有明显的普遍化肝充血和肝细胞损失。脾和肾也出现充血。在其它胎猪中没有检查到显著的病理学损伤。
PCV-2的免疫组织化学染色按先前所述采用针对PCV-2产生的兔多克隆抗血清和单克隆抗体,在福尔马林固定常规处理和包埋的组织切片上进行(Ellis等,1998;Ellis等,1999)。在患有扩大的心肌病的胎猪中,整个患病心肌有大范围对PCV-2抗原的染色。在坏死区域染色更为显著,并表现出涉及主要是心肌细胞。细胞质和细胞核染色均存在。在多个胎猪中肝内有广泛染色。在一些切片中,似乎涉及主要是窦状隙内皮和Kupfer细胞,而在其它胎猪中(包括患有心肌炎的一头胎猪)还有肝细胞的细胞核和细胞质染色。阳性染色细胞分散在整个肺中,而在肾中出现多个病灶的阳性染色。针对PCV-2的聚合酶链式反应按前人所述采用冰冻组织进行(Ellis等,1999)。从胎猪中扩增出针对PCV-2的具有预期大小的PCR产物。从患有心肌炎的胎猪和来自此窝的其它胎猪的组织库中,通过将组织匀浆物接种在无PCV的PK-15细胞上,分离PCV-2。
此外,针对其它与胎猪损伤和猪的流产相关的病毒病原体,例如猪细小病毒(PPV)、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、和肠道病毒,检测了胎猪组织。通过荧光抗体检测(FAT)在干化或死产胎猪的肺、肝、和脾的冰冻切片上没有检测到PPV抗原。我们还将流产胎猪的肝、肺和脾的匀浆物接种在无PCV的PK-15细胞、原代猪输卵管细胞和Vero细胞的培养物中。三代后没有检测到致细胞病变病毒。采用PCR检测组织的PPV为阴性。通过免疫组织化学染色没有检测到PRRSV抗原。
因此,胎猪的损伤和流产与PCV-2有直接关系。这些结果还显示了该病毒的垂直传播。
在以前的研究中,从160头受检胎猪的2头中分离出PCV-1,提示该组病毒能够进行垂直传播;然而,PCV-1抗原不可能与组织中的任何损伤有关(Allan等,1995)。其它与胎猪的损伤和猪流产有关的病因,包括PPV(Bolt等,1997;Molitor等,1991)、PRRSV(Lager等,1996)、EMCV(Kim等,1989)、和肠道病毒(Molitor等,1991),的排除表明,PCV-2能够引起显著的胎猪病变和随后的流产。
然而,PCV-1免疫原(仍根据开头给出的一般定义)可以引起抵抗心肌炎和/或流产和/或宫内感染以及断奶后多系统萎缩综合征的免疫原性或保护性应答,因此也可以采用PCV-1免疫原实施本发明(例如实施本发明的方法、组合物、应用等)-它们可以单独地或与PCV-2免疫原联合(该载体可以含有并表达编码PCV-1免疫原和/或表位及PCV-2免疫原和/或表位的DNA)和/或单独地或与其它猪病原体的免疫原和/或表位联合(如果采用载体,则该载体可以含有并表达编码PCV-1免疫原和/或表位及其它猪病原体的免疫原和/或表位的DNA,或编码PCV-1免疫原和/或表位及PCV-2免疫原和/或表位及其它猪病原体的免疫原和/或表位的DNA)。因此,作为替代或此外,本领域技术人员无需任何过多实验可以在本发明实施中采用PCV-1免疫原、和/或表位、和/或编码该免疫原和/或表位的载体;例如,为此,仅需要阅读本实施例之前的本文文本,和在本实施例(后面)结论处的文本,可以基于此处的讲授进行任何小的改动以实现PCV-1对PCV-2的替代。
与PCV-2感染有关的萎缩综合征最通常发生在5-12周龄的小猪身上(Allan等,1998;Ellis等,1998)。对新生猪的实验感染说明在感染和PCV-2有关临床症状出现之间有一个相对长的前驱期(Allan等,1999;Ellis等,1999)。此处的这些发现显示了,该病毒为垂直传播或在围生期中传播。PCV-2的子宫内垂直传播不仅导致流产,而且可能宫内感染的亚致死小猪会成为随后发生PMWS的动物。
而且,这些结果显示,采用含有PCV-2免疫原的组合物(该组合物还可以包括其它猪病原体的免疫原,例如猪细小病毒)在繁殖或配种前、或在围生期前和/或妊娠期间接种雌猪,通过引起针对PCV-2的免疫应答或抗体,可以预防与猪环状病毒-2有关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,以及与PCV-2有关的断奶后多系统萎缩综合征和其它病理学后遗症。
当然,本发明的组合物、方法和其它方面可以在非猪的其它动物,例如绵羊、野牛、牛、野猪中使用或实施;例如,如果PCV-2感染这些其它动物。
实施例/结果2:与PCV-2有关的心肌炎、流产和宫内感染
新生小猪中PCV-2的存在提示垂直传播可能是病毒传播的一个重要手段。这种传播模式可能不仅与繁殖失败有关,还与生命后期出现的多系统疾病有关。在PMWS和延伸的PCV-2感染成为地方性疾病至少几年的猪肉生产区域中确定以前未检测到的PCV-2(和PCV-1)是否是垂直传播的,是有意义的。
Saskatchewan大学西兽医学院(WCVM)诊断实验室(Saskatoon,加拿大)在4年期间从加拿大的总共30个高度健康猪群接受了涉及繁殖失败的38例提交物,并对它们进行了评价。获取这些样品的农场中5个诊断出了PMWS病案。38例提及物中27例(71%)被定性为流产;其中5例(13%)还涉及至少一个干化胎猪。剩余10例中:5例涉及死产小猪和不可存活小猪(5%);2例涉及死产和一或多个干化胎猪(5%);2例仅涉及死产小猪(5%);1例仅涉及干化胎猪(2.5%)。对非环状病毒的病原体的常规诊断揭示,有4例(11%)的病因被确定为猪细小病毒,有2例(5%)的病因被确定为细菌来源的。我们进行了大体尸体解剖,并收集了组织,将其固定在缓冲福尔马林中(固定时间24-72个小时),在大多数情况下,还提交了新鲜组织用于常规微生物学评价。这些病案没有一个先前检测过PCV-2。
按前人所述实施用于检测PCV-1和PCV-2的PCR技术(Tischer等,1974)。在4年期间收集的包含繁殖失败的所有提交物中均没有检测到PCV-1。在两个不同提交物中,通过PCR检测到PCV-2,其中所述两个提交物来源于同一个多点猪肉生产单位,它们是在4年期的最后一年春天于两个不同时候采取的。这两个提交物中第一个包括一窝有明显心肌炎、心脏肥大、和慢性被动充血迹象的小猪。
按前人所述(Tischer等,1974)在组织中进行PCV-2的免疫组织化学鉴定。在提交的所有6头小猪中心脏的PCV-2免疫组织化学染色(IHC)为阳性,而通过PCV-2PCR检测6头中有4头为阳性(见下表)。
表:在福尔马林固定的患有心肌炎的猪心脏中通过PCR、IHC和从细胞培养物中作病毒分离检测PCV-2。
PCV-2阳性组 织 | PCR | IHC | 病毒分离 |
固定的 | 5/6 | 6/6 | N/A |
冰冻的 | 4/4 | N/A | 2/4 |
来自同一个农场的第二个提交物由一窝4头小猪组成,其中2头死产、另2头在出生后很快死亡。所有4头小猪也出现严重弥散性心肌炎、心脏肥大和慢性被动充血的明显迹象。仅提交了新鲜冰冻心脏和混合的肺/脾组织进行分析。4头小猪中2头的心脏和4头小猪中4头的混合肺和脾组织,PCV-2PCR为阳性。在PCR检测为PCV-2阳性的4例中2例,从患病的心脏和/或混合的肺和脾组织分离的PCV-2为阳性。基于血清学和/或PCR,与猪繁殖失败相关的其它病因,包括猪繁殖和呼吸综合征病毒和猪细小病毒,似乎在该繁殖猪群中传播。然而,这些没能表现出与患病小猪中的严重心脏(或其它)损伤有关;但它们可能促进了PMWS。
通过PCR和IHC,4年期间的头3年中提交的任何繁殖失败代表性病案中均未检测到PCV-2(在此4年期间的最后一年提交的繁殖失败病案中检测到了PCV-2)。为了排除由于福尔马林固定引起的DNA损伤,该损伤是限制PCR检测PCV-2的能力的一个可能不利因素,对收集自患有PMWS的4头断奶小猪的组织进行PCR,在从来自所有4个个体的所有测试的固定组织,包括:肺、肝、肾和支气管淋巴结中,扩增出PCV-2DNA。而且,PCV-2PCR的灵敏度与每种组织在福尔马林中的固定时间长度无关。
这些结果证实并扩充了以前的观察(West等,1999):PCV-2能够垂直传播并能够大量存在于子宫内受感染小猪的损伤处。PCV-2的垂直传播和导致的胎儿损伤如心肌炎是PCV-2的另一疾病表现。而且,4年期间的最后一年之前在来自PCV-2感染的地方性区域的繁殖失败病案中没有检测到PCV-2,可能说明垂直传播不是负责病毒感染最初传播的主要机制。性交和垂直模式的传播都能够引起PCV-2感染在猪中的扩散。
实施例/结果3:猪环状病毒株的培养和分离
根据J.Ellis等(Can.J.Vet.1998,第39卷,44-51)所述方法,在加拿大的Alberta和Saskatoon分别从流产的病案中分离了1103和1021病毒。
在已知没有被猪环状病毒(PCV)、瘟病毒(pestivirus)、猪腺病毒和猪细小病毒感染的PK/15细胞培养物上培养病毒(AllanG.等,剥夺了初乳的小猪的猪环状病毒感染的发病机制和猪胚物质的检测,Vet.Mirobiol.1995,44,49-64)。
通过胰蛋白酶消化(采用胰蛋白酶-versene混合物)从汇合的培养物分散单层PK/15细胞,并吸取放入含有15%胎牛血清、未被瘟病毒污染的MEM-SA培养基(=MEM-G培养基)中,终浓度为每ml约400,000个细胞。然后将此细胞悬浮液的10ml等分试样组分与上述接种物的2ml等分试样组分混合,最后的混合物按6ml的体积等分在两个25cm2的Falcon瓶中。然后于+37℃在含有10%CO2的空气中孵育这些培养物18小时。
孵育后,用300mMD-葡糖胺(Cat#G48175,Sigma-AldrichCompanyLimited,Poole,UK)处理半汇合单层细胞的培养基,然后于+37℃再继续孵育48-72小时。该最后孵育后,对每个接种物的两个Falcon瓶中的一个实施3个连续冻/融循环。剩余Falcon瓶中的PK/15细胞用胰蛋白酶-versene溶液处理,重悬在20mlMEM-G培养基中,然后按400,000个细胞/ml的浓度接种在75cm2Falcon瓶中。然后通过加入5ml从该冻/融循环获得的相应裂解物,“超感染”这些新鲜接种的瓶。
实施例/结果4:通过免疫荧光检测PCV的技术
采用1/100稀释的成年猪血清库,通过间接免疫荧光技术(IIF),对丙酮固定的所有细胞培养物制品作初筛。该血清库包含来自北爱尔兰的25头成年母猪的血清,并已知含有抵抗多种猪病毒,包括PCV、猪细小病毒、猪腺病毒、和PRRS病毒的抗体。IFF技术的实施过程是:于+37℃用该血清(稀释在PBS中)接触这些细胞培养物1小时,随后在PBS中洗涤两次。然后用1/80稀释在PBS中的偶联了异硫氰酸荧光素的兔抗猪免疫球蛋白对这些细胞培养物进行1小时染色,然后用PBS洗涤,并放入甘油缓冲液中,之后在紫外光下作显微镜观察。
实施例/结果5:通过体外培养制备PCV抗原
根据实施例1所述相同方法进行未被污染的PK/15细胞的培养和病毒的增殖。37℃孵育4天后胰蛋白酶消化以收集感染的细胞并计数。按每ml400,00个感染细胞接种下一代。
本文公开的各种PCV-2毒株,例如1103和1121株,也如此进行培养。
实施例/结果6:PCV-2的滴定
在96孔微量培养板中进行滴定。首先引入PK/15细胞悬浮液(每ml150000个细胞)(每孔100μl)。然后稀释病毒培养物,将其100μl加入这些孔中。于37℃存在CO2时进行孵育。24小时后,用葡糖胺37℃处理半小时(条件见实施例3)。然后去除此培养基,并加入新鲜培养基。37℃孵育72小时。采用抗PCV-2单克隆抗体和FITC标记的小鼠偶联物显示病灶。
该方法可以用于滴定以制备灭活和减毒活PCV-2。
实施例/结果7:病毒抗原的灭活
在病毒培养结束时,收获感染细胞,并超声(Branson超声仪)破碎或借助转子-定子型胶体磨(UltraTurrax,IKA)裂解。然后3700g离心此上清液30分钟。采用0.1%乙烯亚胺37℃18小时、或采用0.5%β-丙醇酸内酯28℃24小时,灭活病毒悬浮液。如果灭活前病毒滴度不足,则采用具有300kDa截断值的膜(MilliporePTMK300)通过超过滤浓缩病毒悬浮液。将灭活的病毒悬浮液储存在+5℃。
实施例/结果8:将疫苗制备成基于矿物油的乳剂形式
根据以下配方制备疫苗:
-灭活猪环状病毒的悬浮液:250ml
ISA70(SEPPIC):750ml
此水相和油相分别通过过滤除菌。借助于Silverson涡轮乳化器将这些成分混合并匀浆,以制成乳剂。
一剂疫苗含有约107.5TCID50。一剂疫苗的体积对于皮内途径给药为0.5ml,对于肌内途径给药为2ml。
该疫苗与疫苗联合用于抵抗多系统萎缩综合征的疫苗接种计划。
实施例/结果9:将疫苗制成基于油的可代谢乳剂形式
根据以下配方制备疫苗:
-灭活猪环状病毒的悬浮液200ml
-DehymulsHRE7(Henkel):60ml
-Radia7204(Oleofina):740ml
将此水相和油相分别通过过滤除菌。借助于Silverson涡轮乳化器将这些成分混合并匀浆,以制成乳剂。
一剂疫苗含有约107.5TCID50。一剂疫苗的体积对于肌内途径给药为2ml。
该疫苗与疫苗联合用于抵抗多系统萎缩综合征的疫苗接种计划。
实施例/结果10:用DNA(质粒)载体接种小猪
将第0天剖腹产获得的几个具有3或4头小猪的组置于隔离室中。在第2天给小猪接种(A)含有ORF13的质粒或(B)该质粒与含有ORF4的另一质粒的混合物,并以接种生理盐水的小猪作为对照组。所有质粒均稀释在无菌生理盐水(0.9%NaCl)中,终浓度为250μg/μl。通过肌内途径注射2ml体积,两针各1ml(颈两侧每一边各1针)。第14天再次注射疫苗或安慰剂。小猪对DNA接种有很好的耐受性,没有注意到对接种有不良反应的迹象。第21天通过口鼻施用PCV-2病毒悬液(每个鼻孔给予1ml),攻击小猪。攻击后,一周一次称重小猪。在第17、21、22、24、27、29、31、34、37、41、44天记录直肠温度。第44天从每头小猪收集粪便拭子以检测PCV-2的泄出。通过定量PCR检测并定量该病毒。第45天进行尸体剖检,并收集组织样品用于病毒分离。
·临床症状:
各组间平均体重增加或平均身体温度没有显著差异。
·尸体剖检损伤:
结束时在猪身上注意到的仅有的大体发现是支气管淋巴结病。该损伤根据以下标准计分。
0=没有可见的淋巴结增大
1=轻微淋巴结增大,局限于支气管淋巴结
2=中度淋巴结增大,局限于支气管淋巴结
3=严重淋巴结增大,扩展至支气管、下颌下prescapsular和腹股沟的淋巴结。
std是标准差的缩写
N=每组的小猪数量
我们观察到用(A)免疫的4头小猪中3头小猪和用(B)免疫的3头小猪中1头小猪出现淋巴结损伤减轻。由于高数值的标准差(std),该差异没有显著性(p>0.05)。
·淋巴结组织中的病毒负载量
在制备自支气管和肠系膜淋巴结的组织匀浆物上进行定量病毒再分离。
给出的数据相应于组织匀浆物中的病毒滴度,表示为log10。
PCV-2的滴度
支气管淋巴结似乎含有感染性最强的病毒。在(A)或(B)免疫的小猪的支气管和肠系膜淋巴结中观察到病毒负载量的下降。对于质粒混合物这种下降是显著的(p≤0.05)。
·病毒的排出
攻击后通过基于PCV-2ORF13的PCR扩增在粪便拭子上评价PCV-2的排出。所有测定均在2ml的样品上重复3次。未接种的对照在攻击前PCV-2为阴性,在攻击后为阳性,这证实了该PCR测定的有效性。
数值表示为log10(2μl样品中PCV-2DNA分子的数量)。
组间差异不显著(p>0.05)。
实施例/结果11:用金丝雀痘病毒活载体接种小猪和结果
将具有第0天剖腹产获得的3或4头小猪的几个组置于隔离室中。在第2天给小猪接种1mlPBS中的108pfu(C)含有ORF13的金丝雀痘病毒或(D)含有ORF13和ORF4的金丝雀痘病毒、或亲本金丝雀痘病毒,通过肌内途径在颈侧进行接种。第14天再次注射疫苗或安慰剂。小猪对金丝雀痘病毒接种有很好的耐受性,没有注意到对接种有不良反应的迹象。第21天通过口鼻施用PCV-2病毒悬液(每个鼻孔给予1ml),攻击小猪。第45天进行尸体剖检,并收集组织样品用于病毒分离。
尸体剖检结果:
·PMWS的一般特征是淋巴结病,较为罕见的是肝炎或肾炎。因此按以下方式对在淋巴结中的大体观察结果为每头小猪评分:0=无可见淋巴结增大;1=轻微淋巴结增加,局限于支气管淋巴结;2=中度淋巴结增大,局限于支气管淋巴结;3=严重淋巴结增大,扩展至支气管、下颌下prescapsular和腹股沟的淋巴结。
PCV-2的支气管淋巴结病的大体观察结果是显著的。采用(C)和(D)免疫后观察到相对于对照组,淋巴结损伤有显著下降(p≤0.05)。
***
因此根据本发明优选实施方案的详细描述,应当理解由所附权利要求书规定的本发明不应受到以上描述中给出的具体细节的限制,因为其可以有许多明显的变化而不偏离本发明的精神或范围。
参考文献
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附录1
DNA疫苗-PCV
相关申请:
参考1998年5月21日提交的美国申请系列号09/082,558和作为09/082,558的部分延续的1998年9月25日提交的美国申请系列号09/161,092,这些申请以参考文献方式并入本文,而且在本申请中引用的每篇文献也以参考文献方式并入本文。(参考作为1998年5月21日提交的美国申请系列号09/082,558的CIP于1998年9月25日提交的美国申请系列号09/161,092,该申请要求法国申请97/12382、98/00873和98/03707(提交日期为1997日10月3日、1998年1月22日和1998年3月20日)的优先权;所有这些申请,以及其中所引用的每篇文献均并入本文作为参考)。
本发明涉及编码和表达猪环状病毒免疫原(猪环状病毒,PCV)的质粒构建体,猪环状病毒免疫原与PMWS综合症(猪多系统萎缩综合征或断奶后多系统萎缩综合征)有关,也涉及免疫接种的方法和DNA疫苗,还涉及生产和制备这些疫苗的方法。本文引用的所有文献,以及本文引用的文献中引用的所有文献特此并入本文作为参考。
PCV最初作为猪肾细胞系PK/15中非细胞病原性污染物被检测到。这种病毒与鸡贫血症病毒(鸡贫血症病毒CAV)和PBFDV病毒(鹦鹉喙和羽毛疾病(PscittacineBeakandFeatherDisease)病毒)一起分在CircoViridae中。这些是小的无包膜病毒(15至24nm),其共同特征是含有一种1.76至2.31千碱基对(kb)的环形单链DNA形式的基因组。开始认为这一基因组编码大约30kDa多肽(Todd等,Arch.Virol.,1991,117:129-135)。然而最近的工作显示存在更复杂的转录(MeehanB.M.等,J.Gen.Virol.,1997,78:221-227)。此外,在三种已知的环状病毒种间,已知在核苷酸序列或共同抗原决定簇中没有明显的同源性。
来源于PK/15细胞的PCV被认为不是致病性的。从B.M.Meehan等J.Gen.Virol.1997(78)221-227已知其序列。仅在最近一些作者认为PCV毒株可能是病原性的,并且与PMWS综合症有关(G.P.S.Nayar等,Can.Vet.J.,1997,38:385-387和ClarkE.G.,Proc.Am.Assoc.SwinePrac.1997:499-501)。Nayar等利用PCR技术在患有PMWS综合症的猪中已检测到PCVDNA。
针对具有PMWS综合症症状的猪中所发现的环状病毒e的单克隆和多克隆抗体能够说明这些环状病毒和从PK-15细胞培养物分离的猪环状病毒之间的区别(AllanG.M.等VetMicrobio1.,1999,66:115-123)。
在加拿大,美国和法国所发现的PMWS综合症以重量逐渐丧失和以例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸表现为临床特征。根据病理观点,它由淋巴细胞或肉芽肿渗入,淋巴结病,少数情况下由肝炎和淋巴细胞或肉芽肿肾炎证明(ClarkE.G.,Proc.Am.Assoc.SwinePrac.1997:499-501;LaSemaineVeterinaireNo.26,LaSemaineVeterinaire1996(834)增刊;LaSemaineVeterinaire1997(857)54;G.P.S.Nayer等,Can.Vet.J.,1997,38:385-387)。
从北美和欧洲获得的这些环状病毒非常近缘相关,它们的核苷酸序列具有96%的等同程度,而当这些环状病毒的核苷酸序列与从PK-15细胞分离的猪环状病毒比较时,等同性程度不到80%。因此,有人提出了两个病毒子群,PCV-2是与PMWS综合症相关的环状病毒,PCV-1用于从PK-15细胞分离的环状病毒(MeehanB.M.等,J.Gen.Virol.,1998,79:2171_2179;WO-A9918214)。
申请人已发现编码和表达PCV-2免疫原的质粒构建体可以用来针对PMWS综合症免疫猪。
PCV-2免疫原可以与PCV-1免疫原结合使用,也针对PCV-2免疫这些动物。
根据不太优选的方式,PCV-1免疫原可以单独地使用。
本发明的主题是编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原,特别是PCV-1的开放读框(ORFs)1和2,PVC-2的ORFs1和2的质粒构建体。
不言而喻,本发明自动覆盖编码和表达等同核苷酸序列的质粒,所说的等同核苷酸序列是这样的序列:既非改变所考虑的基因或这一基因编码的多肽的功能性,也非改变它们的毒株特异性。当然会包括因密码子简并性产生的不同的序列。
用于实施例的PCV-2序列来源于Meehan等,同上(ORF1核苷酸398-1342;ORF2核苷酸1381-314;分别符合1998年9月25日的US09/161,092中的ORF4和ORF13和WO-A-9918214中的COL4和COL13)。其它PCV-2序列在以下文献中已出版:WO-A-9918214(称为Imp1008,Imp999,Imp1011-48285和Imp1011-48121);A.L.Hamel等J.
Virol.June1998,vo172,6:5262-5267(GenBankAF027217);I.Norozov等J.ClinicalMicrob.Sept.1998vol.36,9:2535-2541;以及GenEankAF086834,AF086835和AF086836,并且给出等同的ORF序列索取号。
本发明也覆盖了这种意义上的等价序列,它们在高严格条件下能够与所考虑的基因的核苷酸序列杂交。在所说的等价序列中,也可以是所提到的基因的保留完整序列免疫原性的片段。
1998年9月25日的US09/161,092中的其它ORFs1-3和5-12(WO-A-9918214中的COLs1-3和5-12),尤其是ORFs7和10,在这里所描述的条件下,可以组合或相互或与这里定义的ORFs1和2一起使用。
术语质粒在这里意欲包括多核苷酸序列形式的任何DNA转录单位,包含待表达的PCV序列和其体内表达必需的元件。环形质粒形式,超卷曲的或其它方式的,是优选的。线性形式也包括在本发明的范围之内。
本发明的主题更具体地说是被称为pJP109(包含PCV-2的ORF2基因,图8),pJP111(包含PCV-2的ORF1基因,图9),pJP120(包含PCV-1的ORF2基因,图10)和pJP121(包含PCV-1的ORF1基因,图11)的质粒。
每一质粒包含能够确保在其控制下的插入基因在宿主细胞中表达的启动子。一般来说它是一个强大的真核启动子,特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE,人或鼠源的,也可以是其它来源的,如大鼠或天竺鼠。更一般地,启动子或是病毒来源的或是细胞来源的。作为非CMV-IE的病毒启动子,可以提及的是SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。它也可以是基因所来源的病毒的启动子,例如,对基因特异的启动子。作为细胞启动子,可以提及的是细胞支架基因启动子,例如结蛋白启动子或肌动蛋白启动子。当几个基因在相同的质粒中存在时,它们可以在相同的转录单位或两个不同的转录单位中提供。
质粒也可以包含其它转录调节元件,例如,内含子型的稳定序列,优选的是兔β-珠蛋白基因的内含子II(vanOoyen等科学,1979,206:337-344),由组织纤溶酶原活化基因编码的蛋白质的信号序列(tPA;Montgomery等,Cell.Nol.Biol.1997,43:235-292),以及多聚腺苷酸化信号(polyA),特别是牛生长激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)的或兔β-珠蛋白基因的。
本发明的主题也是免疫原性制剂和DNA疫苗,它们包含至少一种根据本发明的编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原中的一个,优选地是以上提到的ORFs之一的质粒,以及兽医学上可接受的载体或稀释剂,可以也可以不包含兽医学上可接受的佐剂。
本发明的主题更具体地说是包含至少一种编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原的质粒的免疫原性制剂和疫苗,与佐剂配制的组合物,所说的佐剂特别是含有季铵盐的阳离子脂,优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵(WO-A-9634109),最好与中性脂,例如优选的是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)连接,形成DMRIE-DOPE。优选的,与这一佐剂的质粒混合物就在使用之前制成,最好是在施用于动物之前制成。由此产生的混合物使得可以形成复合物,例如在10至60分钟,特别是30分钟时间内。
当DOPE存在时,DMRTE∶DOPE摩尔比例优选的范围是95∶5到5∶95,更优选的是1∶1。
质粒:DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比范围是50∶1到1∶10,优选的是10∶1到1∶5,更优选的是1∶1到1∶2。
根据另一个本发明的有利的方式,可能的是利用作为佐剂的佐剂化合物,其选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物。特别是与糖的或多元醇的聚链烯基醚连接的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物是优选的。这些混合物被称作carbomer(Pharmeuropavol.8,No.2,June1996)。本领域技术人员也可以参考US-A-2,909,462(本文一并参考),该文献描述了与聚羟基化的化合物交联的这样的丙烯酸聚合物,所说的化合物具有至少3个羟基,优选地不多于8个羟基,至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选的基团是那些包含2至4个碳原子的基团,例如乙烯基,丙烯基和其它烯键不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其它取代基,如甲基。以名称(GFGoodrich,俄亥俄,美国)出售的产品特别适当。它们与丙烯基蔗糖或者与丙烯基季戊四醇交联,在它们中,可以提到的是974P,934P和971P。
在顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物中,(Monsanto)是优选的,它是顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物,线性或交联的,例如与二乙烯基醚交联的,可以参见J.Fields等,自然,186:778-780,4June1960(本文一并参考)。从它们的结构的观点看,丙烯酸或甲基丙烯酸和的聚合物优选地含有下式的基本单位:
其中
-R1和R2,相同或不同,代表氢或甲基。
-X=0或1,优选的X=1
-Y=1或2,当X+Y=2时
对于X=0,Y=2。对carbomers,X=Y=1。
这些聚合物在水中的分解形成酸性溶液,其会被中和,优选的是至生理pH,以给出佐剂溶液,实际的疫苗将掺入其中。聚合物的羧基部分以COO-形式。
对于这种类型的佐剂,较好的是制备佐剂,特别是carbomer在蒸馏水中的溶液,优选的是氯化钠存在下,所获得的溶液在酸性pH下。通过添加至所需数量的(由此获得所需的最终浓度)、或相当大部分的有氯化钠的水,优选生理盐水(NaC19g/1)中,稀释该储备溶液,以一或多个部分进行伴随的或后续的中和(pH7.3至7.4),优选的是用氢氧化钠中和。当其与质粒,特别是以冷冻干燥,液体或冻结形式贮存的质粒,混合时,就使用这种在生理pH下的溶液。
在最终疫苗组合物中的聚合物浓度将是0.01%至2%w/v,特别是0.06至1%w/v,优选的是0.1至0.6%w/v。
在一特定的实施方案中,免疫原性或疫苗制剂包含一种质粒或编码和表达PCV-20RF1和ORF2的质粒的混合物。
本发明也提供了将针对猪环状病毒的免疫接种和针对其它猪病原体的免疫接种联合的方法,所说的病原体特别是可能与PMWS综合症相关的那些。
因此,本发明的主题也是含有至少一种按照本发明的质粒和至少另一种编码和表达猪免疫原的质粒的质粒混合物,所说的免疫原选自,例如,奥耶斯基氏病病毒(假狂犬病毒或PRV)的糖蛋白gB和gD,猪流感病毒H1N1的血细胞凝集素和核蛋白,猪流感病毒H3N2的血细胞凝集素和核蛋白,Lelystad与美国毒株的PRRS病毒的ORF5和ORF3基因,猪细小病毒的VP2蛋白质,猪霍乱病毒(HCV)的E1和E2蛋白质,从大叶性肝炎的线杆菌缺失的apxI,apxII以及apxIII基因(参见例如WO-A-9803658的质粒)。
这些质粒混合物夹带在兽医学上可接受载体或稀释剂,可有可无的前面描述的兽医学上可接受的佐剂中,由此形成免疫原性制剂或多价DNA疫苗。这些免疫原性制剂或多价疫苗用DMRIE,最好是与中性脂DOPE连接形成的DMRIE-DOPE,配制可以特别有利。
所配制的或者用以上描述的佐剂配制的根据本发明的制剂或单价或多价DNA疫苗用细胞因子(优选的是猪来源的,特别是猪GM-CSF)补充也可以是有利的。这种猪GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;ClarkS.C.等科学1987,230:1229;GrantS.TA.等药物,1992,53:516)的添加可以通过将猪GN-CSF蛋白质或是编码和表达猪GN-CSF基因的质粒掺入到制剂中或者掺入到疫苗中实现(InumaruS.和TakamatsuH.免疫细胞生物学,1995,73:474-476)。尤其是,编码和表达猪GM-CSF的质粒可以是质粒pJP058(图12)。
根据本发明的免疫原性制剂和单价或多价DNA疫苗也可以与针对至少一种不同的或相同的猪病原体的至少一种常规疫苗(减毒活疫苗,灭活疫苗或亚单位疫苗)或重组疫苗(病毒载体)组合使用。本发明特别提供了与含佐剂的常规疫苗(减毒的活疫苗,灭活的疫苗或亚单位疫苗)组合的方法。对于灭活疫苗或亚单位疫苗,可以提到特别包含单独的或与作为佐剂的皂角甙混合的氧化铝凝胶的那些,或者以水包油乳剂形式配制的那些。
本发明的主题也是免疫方法,其使得可能在猪中针对按照本发明的环状病毒诱导免疫反应。其主题具体地说是在猪中有效的免疫接种的方法。这些免疫和免疫接种的方法包括施用以上描述的制剂的一种或者单价或多价DNA疫苗的一种。这些免疫和免疫接种的方法包括施用一个或多个这些制剂或DNA疫苗的后续剂量。在这种免疫或免疫接种方法的上下文中,可以通过现有技术中提出的用于多核苷酸免疫接种的各种施用路线施用所说的制剂和DNA疫苗。特别是肌内和真皮内路线,并且借助已知的施用技术,特别是使用有针的注射器进行液体推注式的注射(Furth等,分析生物化学,1992,205:365-368)、或者通过涂布有一层DNA的金微粒投射注射(Tang等,自然,1992,356:152-154)。
这种方法不仅使得可以施用到成年猪,而且也可以施用到幼年和怀孕猪;在后一种情况下,其使得可以,尤其是,将被动免疫赋予新生猪(母性的抗体)。
用于根据本发明的疫苗的DNA的数量在约10μg和约2000μg之间,优选的约50μg和大约1000μg之间。本领域技术人员有能力精确限定用于每一免疫或免疫接种方案的DNA的有效剂量。
剂量体积可以在0.5和5ml之间,优选的在2和3ml之间。
免疫和免疫接种的优选方法包括通过肌内路线施用根据本发明的DNA疫苗。
现在将参照附图,借助非限制性例证性实施方案更为详细地描述本发明。在附图中:
图8:质粒pJP109
图9:质粒pJP111
图10:质粒pJP120
图11:质粒pJP121
图12:质粒pJP058
序列表SEQID
SEQIDNO:1:寡核苷酸JP779
SEQIDNO:2:寡核苷酸JP780
SEQIDNO:3:寡核苷酸JP781
SEQIDNO:4:寡核苷酸JP782
SEQIDNO:5:寡核苷酸JP783
SEQIDNO:6:寡核苷酸JP784
SEQIDNO:7:寡核苷酸JP785
实施例
SEQIDNO:8:寡核苷酸JP786
实施例1构建质粒pJP109
用EcoRI消化含有EcoRI片段形式的PCV-2病毒基因组的质粒pGEM7Z-Imp1010Stoon-EcoRINo.14(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.792171-2179),以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离1768碱基对(bp)的EcoRI-EcoRI片段。这一片段是自连接的。
用由自连接的EcoRI-EcoRI片段组成的模板,以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-2病毒株1010-Stoon的ORF2基因(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179;GenBank序列登记号AF055392):
Jp779(SEQIDNO1)(35聚体):
5′CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3′
JP780(SEQIDNO2)(36聚体):
5′TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3′
以产生730bpPCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离715bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与事先用SalI和BglII消化的质粒pVR1012(HartikkaJ.等,人类基因治疗,1996.7.1205-1217)连接,给出质粒pJ109(5567pb)(图8)。
实施例2:构建质粒pJP111
使用质粒pGem7Z-Imp1010-Stoon(参见实施例1)(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179)和下列寡核苷酸进行聚合酶链反应:
Jp781(SEQIDNO3)(35聚体):
5′CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3′
JP782(SEQIDNO4)(36聚体):
5′TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3′
以产生含有PCV-2病毒ORF1基因的970bpPCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离955bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,以便给出质粒pJP111(5810bp)(图9)。
实施例3:构建质粒pJP120(PCV-1ORF2)
使用质粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997.78.221-227)和下列寡核苷酸进行聚合酶链反应:
JP783(SEQIDNO5)(35聚体):
5′CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3′
JP784(SEQIDNO6)(40聚体):
5′TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3′
以产生含有PCV-1病毒(PK-15毒株,GenBank登记号U49186)ORF2基因的730bpPCR片段。将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离715bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,以便给出质粒pJP120(5565bp)(图10)。
实施例4:构建质粒pJP121(PCV-1ORF1)
用PstI消化含有PstI片段形式的PCV-1病毒基因组的质粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997,78,221-227),以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离1759碱基对(bp)的PstI-PstI片段。这一片段是自连接的。
用由自连接的PstI-PstI片段组成的模板,以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-1病毒株PK-15(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997,78,221-227;GenBank序列登记号U49186)的ORF1基因:
JF785(SEQIDNO7)(35聚体):
5′CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3′
JP786(SEQIDNO8)(36聚体):
5′TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3′
以产生包含PCV-1病毒(毒株PK-15)的ORF1基因的965bpPCR片段。
将该片段以SalI与BglII消化,以便在琼脂糖凝胶电泳后,分离946bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,给出质粒pJP121(5804bp)(图11)
实施例5:构建质粒pJP058(表达猪GM-CSF)
通过从颈静脉采血,用含有EDTA的管子收集猪血液。经Ficoll梯度离心收获单核化的(mononucleated)细胞,然后在RPMI1640培养基(Gibco-BRL)上体外培养,通过以5μg/ml终浓度在培养基中添加伴刀豆球蛋白A(Sigma)进行刺激。在刺激72小时之后,收获成淋巴细胞,用抽提试剂盒″小量总RNA分离试剂盒″(Clontech),按照制造商推荐的办法抽提这些细胞的总RNA。借助“第1链cDNA合成试剂盒”(PerkinElmer),进行反转录反应,接着采用下列寡核苷酸,对从这些猪成淋巴细胞抽提的总RNA进行聚合酶链反应:
RG972(33聚体)(SEQIDNO:9)
5′TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3′
RG973(34聚体)(SEQIDNO:10)
5′TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3′
以产生约450碱基对(bp)的PCR片段。将这一片段以NotI消化以便琼脂糖凝胶电泳后分离450bpNotI-NotI片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接,优选地是以NotI消化并去磷酸化的质粒pVR1012,给出质粒pJP058(5405bp)(图12)。检查克隆进质粒pJP058的pGM-CSF基因的序列,发现与GenBank数据库中(登记号D21074)获得序列相同。
实施例6:产生免疫接种猪的纯化的质粒
用以上实施例1到5的质粒pJP109,pJP111,pJP058,pJP120和pJP121转化大肠杆菌K12细菌(菌株DH10B或SCS1)。然后分开在Luria-Broth(LB)培养基中振荡培养(37℃)用这五种质粒分别获得的五种转化克隆。在指数阶段的末期收获细菌培养物。根据碱性溶胞技术提取质粒。然后根据由Sambrook等描述的技术(分子生物学:实验室手册,第2版,1989,冷泉港实验室,冷泉港,NY)在氯化铯梯度上纯化所提取的质粒。在溴化乙锭最终抽提和在无水乙醇存在下沉淀后,将纯化的质粒重悬于TE缓冲液(1mMTris/EDTApH8.0)中,以获得含每毫升2毫克质粒的贮存液。
使用前将该贮存液贮存在-20℃下。
实施例7:控制PCV-2病毒ORFs1和2的表达
为了控制分别克隆进质粒pJP109和pJP111的PCV-2ORF2与PCV-2ORF1基因表达的产物,按照制造商推荐的使用方法,采用Lipofectamine转染试剂盒(Gibco-BRL,目录:10964-013)将这些质粒转染进CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞(ATCC号CCL-61)。转染后48小时,洗涤转染的细胞,在室温以95%的冰丙酮溶液固定3分钟。将对PCV-2ORF1蛋白质(F1991D3CA和F2107G5GD)与ORF2蛋白质(F1904C7C,F1902B1BC和F1903A8BC)特异性的五种单克隆抗体用作第一抗体。Cy3标记的抗小鼠IgG缀合物用来揭示特定标记。采用3种PCV-2ORF2单克隆在质粒pJP109转染的细胞中观察到一种PCV-2特定荧光,而用质粒pJP111转染的细胞中没有。相反采用2种PCV-2ORF1单克隆在质粒pJP111转染的细胞中观察到一种PCV-2特定荧光,而用质粒pJP109转染的没有。采用PCV-2单克隆在质粒pVR1012单独转染的CHO细胞或未转染的CHO细胞中检测不到任何荧光。
采用对PCV-2病毒特异性的多克隆血清观察到相同的表达结果。在这种情况下,荧光标记的抗-猪IgG缀合物用于检测特定荧光。采用这种多克隆血清在质粒pVR1012单独转染的CHO细胞或未转染的CHO细胞中检测不到任何荧光。
实施例8:用裸DNA免疫接种猪
8.11天龄小猪
通过D0天剖腹产方案获得的几组小猪置于分开的单位中,用各种质粒疫苗溶液经肌内路线在2天时接种这些小猪。经用无菌生理盐水(0.9%NaC1)稀释贮存液制备疫苗溶液。
小猪用单独的质粒pJP109或质粒pJP109与pJP111的混合物或质粒pJP109与pJP058的混合物或质粒pJP109,pJP111和pJP058的混合物接种。
疫苗溶液含有每一质粒500μg。
体积:疫苗溶液经肌内路线以2ml总体积注射。在实施中,给定接种小猪的年龄(1-2天),在颈两侧的每一边给予1毫升的一次注射(=2×1ml)。
两次疫苗注射在两周间隔进行,这就是说在方案的D2天和D14天进行。
在方案的D21天用口鼻施用毒性PCV-2毒株病毒悬液进行激发。然后监测小猪三周,观察小猪断奶后多系统萎缩综合征的特定临床征候的出现。观测到的症候是:
直肠温度:头14天每日测量,然后,在激发后的第三周测量两次。
重量:就在激发之前称量小猪,在激发后的3周期间每周称量一次。
试验病毒血症和抗体之血样的收集:在D2,D14,D21,D28,D35和D42天采集血样。
尸体解剖:在D42天,温和地处死存活的小猪,进行尸体解剖,以研究病理解剖学损伤,并从肝脏,淋巴结,脾,肾以及胸腺进行组织学制备,以研究在这些组织中的损伤。
8.2.5-7周大猪崽
不再具有对PCV-2病毒特异性的母性抗体的5-7周大猪崽经肌内路线接种单独质粒pJP109,或者质粒pJP109与pJP111的混合物,或者质粒pJP109与pJP058的混合物或者质粒pJP109,pJP111和pJP058的混合物。
接种剂量与实施例8.1中所指出的那些相同(每个质粒500μg)。以2ml体积经肌内路线注射疫苗溶液(一次施用2ml到颈肌肉)。
两次免疫接种间隔21天(D0和D21)。通过肌内施用毒性PCV-2毒株的病毒悬液,在最后一次接种后的14天(D35)进行激发。
监测小猪八周,观察小猪断奶后多系统萎缩综合征的特定临床征候的出现。激发后小猪的临床监测与实施例8.1中描述的相同,只是总的观察期这次是8周。
实施例9:用以DMRIE-DOPE配制的DNA免疫接种小猪
替代实施例8中所描述的裸质粒DNA溶液,使用以DMRIE-DOPE配制的质粒DNA溶液是可能的。用0.9%NaCl制备1mg/ml的DNA溶液(含有根据实施例6的一种或多种质粒)。通过将DMRIE-DOPE的冻干物吸收进合适体积的无菌蒸馏水中制备0.75mMDMRIE-DQPE溶液。
通过用0.9%NaCl中的1mg/mlDNA溶液等份稀释0.75mMDMRIE-DOPE溶液,形成质粒DNA-阳离子脂复合物。借助装有26G针的注射器,沿着包含阳离子脂溶液的药瓶的壁,慢慢引入DNA溶液,避免形成泡沫。两种溶液混合,迅速轻轻振荡。最终获得包含0.375mMDMRIE-DOPE和500μg/mlDNA的组合物。
对在以上描述的所有操作,在室温下使用溶液是合乎需要的。在免疫猪之前30分钟,在室温下形成DNA/DMRIE-DOPE复合物。
然后根据实施例8.1和8.2中描述的条件接种猪。
应当清楚地理解,由本所附权利要求定义的本发明不受以上说明书中指出的具体实施方案的限制,但包括不偏离本发明范围和精神的变体。
权利要求书
1.一种免疫原性制剂或疫苗,它们一方面包含编码和表达选自PCV-2的ORF1、PCV-2的ORF2、PCV-1的ORF1以及PCV-1的ORF2的基因的质粒,另一方面包含能够增强针对所说基因表达产物之免疫反应的元件。
2.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于能够增强免疫反应的元件包含作为佐剂的DMRIE。
3.根据权利要求2的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于DMRIE连接到一中性脂上。
4.根据权利要求3的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于DMRIE连接到DOPE上。
5.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于能够增强免疫反应的元件包括作为佐剂的carbomer。
6.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于能够增强免疫反应的元件包括猪细胞因子。
7.根据权利要求6的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于其中所说的猪细胞因子是GM-CSF。
8.根据权利要求6或7的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于其包含编码和表达猪细胞因子的质粒。
9.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于能够增强免疫反应的元件包括作为佐剂的猪细胞因子和选自由DMRIE,DMRIE/DOPE和carbomer组成的组的化合物。
10.根据权利要求1到10之任一的免疫原性制剂或疫苗,其特征在于其包含编码和表达另一个猪免疫原的质粒。
附录2
发明名称
猪环状病毒重组痘病毒疫苗
相关申请的交叉文献
参考美国系列号09/082,358(申请日1998年5月21日)和作为系列号09/082,558的部分延续的美国系列号09/161,092(申请日1998年9月25日),所有这些申请和其中引用的每篇文献均特此并入本文作为参考。
本发明涉及修饰的痘病毒和制备及使用它们的方法。更具体地,本发明涉及重组ALVAC,该病毒表达猪环状病毒(环状病毒)2(PCV2)的基因产物,并涉及诱导针对PCV2基因产物的免疫应答并赋予抵抗PCV2感染的保护性免疫的免疫组合物或疫苗。
本申请参考了几篇出版物。在权利要求说明书之前具体描述的结尾处可找到所有这些文献的引用处。这些文献属于本发明的领域;并且本申请参考的每篇文献和所有这些文献中引用的每篇文献均特此并入本文作为参考。
发明背景
断奶后多系统萎缩综合征(PMWS)是近来在仔猪中发现的一种疾病。PMWS的临床症状为逐渐的体重降低和其它症状如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。病理上可观察到淋巴细胞和肉芽肿性浸润液、淋巴结病,和更罕见的淋巴细胞和肉芽肿性肝炎及肾炎(Clark,1997;Harding,1997)。
在不同的欧洲国家以及北美都描述了该疾病。目前该疾病还不能得到预防和治疗。
有几条证据指出猪环状病毒是PMWS的病原体(Ellis等,1998)。已从患有PMWS的猪身上获得了环状病毒,而且已经证明患有该疾病的猪有猪环状病毒的抗体。
环状病毒是在某些动物和植物种属中发现的单链环状DNA病毒。猪环状病毒最初作为污染因子从猪肾传代细胞系分离。该细胞培养分离株曾被命名为PK-15(Meehan等,1997)。最近,比较了获自患有PMSW的猪的猪环状病毒与PK-15。这类病毒与PK-15在核苷酸和蛋白序列水平上有实质性不同,已被命名为PCV2(Meehan等,1998;Hamel等,1998)。
在PCV2基因组中鉴定了多达13个开放读码框(ORF)(法国专利申请9803707中的COL1-COL13)。这些ORF中的四个与PK-15基因组的类似ORF基本同源。含有nt398-1342(GenBank登录号AF055392)的ORF1(Meehan等,1998;相应于法国专利申请9803707中的COL4),可能编码预期分子量为37.7kD的蛋白。含有nt1381-1768且与1-314连接(GenBank登录号AF055392)的ORF2(Meehan等,1998;相应于法国专利申请9803707中的COL13),可能编码预期分子量为27.8kD的蛋白。含有nt1018-704(GenBank登录号AF055392)的ORF3(Meehan等,1998;相应于法国专利申请9803707中的COL7),可能编码预期分子量为11.9kD的蛋白。含有nt912-733(GenBank登录号AF055392)的ORF4(Meehan等,1998;相应于法国专利申请9803707中的COL10)可能编码预期分子量为6.5kD的蛋白。
PCV2的ORF1与PK-15分离株的ORF1(Meehan等,1998)高度同源(86%的一致性)。已部分表征了PK-15的ORF1蛋白((Meehan等,1997;Mankertz等,1998a)。已知它是病毒复制所必需的,并且可能参与病毒DNA的复制。
各个ORF2的蛋白序列一致性比ORF1要低,但,每个ORF2共有一个高度保守的碱性N末端区,与禽环状病毒鸡白血病病毒(CAV)(Meehan等,1998)的主要结构蛋白的N末端区相似。近来,Mankertz等(1998b)提出PK-15分离株的ORF2(在Mankertz等,1998b中命名为ORF1)编码衣壳蛋白。
在PK-15分离株和PCV2各自的ORF3和ORF4中观察到了更大差别。在每种情况下,与PK-15分离株基因组中存在的相应ORF相比,PCV2ORF4和ORF3的C末端区有缺失。在ORF3和ORF4的N末端区都观察到了最高的蛋白序列一致性(Meehan等,1998)。
还没有发表对PCV2基因组的转录分析。从PK-15分离株获得的近期数据表明ORF2转录物被剪接(在Mankertz等,1998b)。
痘苗病毒已成功用于免疫预防天花,在1980年的世界根除天花运动中达到极点。随着天花的根除,痘病毒作为表达外源基因的遗传工程化载体(Panicali和Paoletti,1982;Paoletti等,1984)的新作用变得很重要。编码异源性抗原的基因已在痘苗中表达,常常导致抵抗相应病原体攻击的保护性免疫(综述Tartaglia等,1990)。命名为MVA的高度减毒疫苗株也已被作为基于痘病毒的疫苗载体。美国专利号5185146中描述了MVA的应用。
另外两个疫苗载体系统涉及天然宿主限制的痘病毒禽痘病毒的应用。家禽痘病毒(FPV;Taylor等,1998a,b)和金丝雀痘病毒(CPV;Taylor等,1991&1992)都已被改造用来表达外源基因产物。家禽痘病毒(FPV)是痘病毒家族禽痘病毒属的原型病毒。该病毒引发经济上重要的家禽患疾病,该疾病自从1920年以来通过减毒活疫苗的使用得到了很好控制。禽痘病毒的复制仅限于禽类(Matthews,1982),文献中没有关于禽痘病毒在任何非禽类(包括人类)中引起繁殖性感染的报道。这种宿主局限性提供了一道固有的安全屏障,防止该病毒传播到其它物种,并使得在脊椎动物和人类应用中使用基于禽痘病毒的疫苗载体的建议很吸引人。
已利用FPV作为载体表达来自禽病原体的抗原。在FPV重组体中表达了强致病性禽流感病毒的血凝素蛋白(Taylor等,1988c)。重组体接种小鸡和火鸡后,诱导了抵抗同源或异源的强致病性流感病毒攻击的保护性免疫应答(Taylor等,1988c)。也已建立了表达新城疫病毒表面糖蛋白的FPV重组体(Taylor等,1990;等,1990)。
通过基因修饰野生型病毒株制备了其它减毒的痘病毒载体。已经证明,通过缺失痘苗病毒哥本哈根株(Tartaglia等,1992)的特异性毒力基因和宿主范围基因而衍生的NYVAC载体可作为重组载体,引发针对所表达外源抗原的保护性免疫应答。
另一个改造的痘病毒载体为ALVAC,来自金丝雀痘病毒。ALVAC在非禽类宿主中没有繁殖性复制,据信该特征改进了其安全谱(Taylor等,1991&1992)。ALVAC和NYVAC都是BSL-1载体。
发展亚单位PCV2疫苗的一种方法是使用活病毒载体来表达相关的PCV2ORF。可用本领域熟知的两个步骤和美国专利号4769330、4722848、46003112、5110587、5174993、5494807和5505941(这些专利的公开并入本文作为参考)所描述的产生痘病毒(如痘苗病毒和禽痘病毒)的合成重组体的类似方法构建重组痘病毒。因此提供PCV2重组痘病毒及其组合物和产物,特别是基于ALVAC的PCV2重组体及其组合物和产物,尤其是含有PCV2的ORF1和/或2的重组体及其组合物和产物,将是本领域技术现状的期望进展。
发明目的和概述
因此本发明一个目的是提供治疗和预防PCV2感染的组合物和方法。另一个目的是提供治疗和预防PMWS的工具。
本发明一方面涉及用于在接种了该组合物的宿主动物中诱导抗原性或免疫应答的抗原性、免疫性组合物或疫苗组合物或治疗性组合物,所述疫苗包括载体和修饰的重组病毒,该重组病毒具有灭活的非必需病毒编码遗传功能以致其毒性降低而安全性提高。在根据本发明的组合物中使用的病毒有利地为痘病毒、特别是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒和金丝雀痘病毒),更有利地为ALVAC。修饰的重组病毒可在病毒基因组的非必需区中包括编码抗原性蛋白(如来自PCV2的ORF如PCV2ORF1和/或2)的异源DNA序列。
另一方面,本发明涉及免疫原性组合物,其含有的修饰重组病毒具有灭活的非必需病毒编码遗传功能,所以重组病毒毒性降低而安全性提高。修饰的重组病毒包括在病毒基因组非必需区内编码抗原性蛋白(如来自PCV2的ORF尤其是ORF1和/或2)的异源DNA序列,其中该组合物给予宿主后能够诱导抗原特异的免疫应答。
再一方面,本发明涉及修饰的重组病毒,该病毒具有灭活的非必需病毒编码遗传功能,所以该病毒的毒性降低,并且其中修饰的重组病毒还在该病毒基因组的非必需区内含有异源DNA。该DNA可编码PCV2基因如任一个或所有的PCV2ORF1、ORF2、ORF3或ORF4(Meehan等,1998)。具体地,通过缺失编码毒力因子的开放读码框或通过利用天然宿主限制性病毒,灭活这些遗传功能。根据本发明使用的病毒有利地为痘病毒,尤其是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒或金丝雀痘病毒)。有利地,所述开放读码框选自J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7LK1L和14L(Goebel等报道的术语学,1990)及其组合。在这一方面,该开放读码框含有一个胸腺嘧啶激酶基因、一个出血性区域、一个A型包涵体区、一个血凝素基因、一个宿主范围基因区或一个大的亚单位、核糖核苷酸还原酶;或它们的组合。一个适当修饰的痘苗病毒哥本哈根株被鉴定为NYVAC(Tartaglia等,1992),或一种痘苗病毒,其中缺失了J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7LK1L和14L或一个胸腺嘧啶激酶基因、一个出血性区域、一个A型包涵体区、一个血凝素基因、一个宿主范围基因区和一个大的亚单位、核糖核苷酸还原酶(也见美国专利号5364773)。优选地,痘病毒载体为ALVAC或金丝雀痘病毒(Rent8chler疫苗株),金丝雀痘病毒为减毒的,例如通过在鸡胚成纤维细胞上连续传200代以上,它们的主种子经过琼脂糖连续四次噬斑纯化,其中一个克隆通过5次额外传代来扩增。
本发明再一方面还涉及发明的重组痘病毒的表达产物及其用途,例如形成用于治疗、预防、诊断或测试的抗原性、免疫的或疫苗的组合物;并涉及来自重组痘病毒,在构建DNA探针和PCR引物时有用的DNA。
一方面,本发明涉及重组痘病毒,其中在痘病毒基因组的非必需区内含有来自PCV2的一段DNA序列。痘病毒有利地为禽痘病毒,例如家禽痘病毒,尤其是减毒家禽痘病毒,或金丝雀痘病毒,尤其是减毒金丝雀痘病毒如ALVAC。
根据本发明,重组痘病毒表达外源PCV2基因的基因产物。PCV2的特定ORF插入到痘病毒载体,产生的重组痘病毒用来感染动物。在动物中PCV2基因产物的表达导致动物对PCV2的免疫应答。因此,本发明的重组痘病毒可能用于免疫组合物或疫苗,来提供诱导可能(但不需要)是保护性的免疫应答的方法。
重组痘病毒PCV2或其表达产物即本发明的组合物如免疫的、抗原性组合物或疫苗组合物或治疗性组合物的给药方式可以是经肠胃外的途径(皮内、肌肉或皮下)。这种免疫方式可引起系统性免疫应答、或体液或细胞介导的应答。
更通常地,本发明的痘病毒PCV2重组体、抗原性、免疫性或疫苗痘病毒PCV2组合物或治疗性组合物,可按照药学或兽医领域的技术人员所熟知的标准技术来制备。这些组合物可由医学或兽医领域的技术人员在考虑了如年龄、性别、体重、种族和特定患者的情况以及给药途径这些因素之后,按其熟知的剂量和技术给药。这些组合物可单独给药,或可以与组合物,例如与“其它”免疫的、抗原性或疫苗或治疗性组合物共同施用或顺序施用,由此提供本发明的多价或“鸡尾酒”或联合组合物和使用它们的方法。同样,可在考虑了如年龄、性别、体重、种族和特定患者的情况以及给药途径这些因素之后来确定给药的成分、方式(顺序或同时给药)和剂量。在这一方面,请参考并入本文作为参考的关于狂犬病毒组合物和联合组合物及其使用的美国专利号5843456。
本发明组合物的实例包括用于各入口的液体制品,如口的、鼻的、肛门的、阴道的、经口的、胃内的等,给药方式如悬液、糖浆或酏剂;和用于肠胃外的、皮下、皮内、肌内或血管内(如可注射的给药)的制品如无菌悬液或乳剂。在这些组合物中,重组痘病毒或抗原可能与合适的载体、稀释物或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等形成混合物。这些组合物也可被冻干。这些组合物根据给药途径和预期的制品可含有辅助物质如保湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝剂或粘性促进添加剂、防腐剂、香精、色素等。可参考标准原文如“REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCICNCE”第17版,1985(在此并入本文作为参考),来制备适当的制品,以避免不适当的实验。合适的剂量也可根据下面的实施例。
这些组合物可含有选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和顺丁烯二酸酐与链烯衍生物的共聚体的至少一种佐剂化合物。
优选的佐剂化合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,尤其与糖或多元醇的多聚链烯基醚交联。这些化合物称为术语carbomer(Phameuropa第8卷第二期,1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利号2909462(在此并入本文作为参考),该专利描述了与多羟基化合物交联的这类丙烯酸聚合物,该多羟基化合物含有至少3个羟基优选不超过8个羟基、其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的非饱和脂肪酸基团所取代。优选基团是那些含有2-4个碳原予的,如乙烯基、丙烯基和其它乙烯基非饱和基团。这些非饱和基团本身可含有其它取代基,如甲基。以名称(BFGoodrich,俄亥俄州,美国)出售的产品特别好。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基戊赤藓糖醇交联。其中可能提及974P、934P和971P。
在顺丁烯二酸酐和链烯衍生物的共聚体中,优选顺丁烯二酸酐和乙烯线性或交联的共聚体(Monsanto),例如与二乙烯醚交联的共聚体。可参考并入本文的文献J.Fields等,自然(Nature),186:778-780,1960.6.4。
从其结构来看,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚体优选由下面公式中的基本单位形成:
其中:
-R1和R2相同或不同,代表H或CH3
-x=0或1,优选x=1
-y=1或2,且x+y=2
对于共聚体x=0,y=2。对于carbomer,x=y=1。
这些聚合物溶解于水产生酸性溶液,其将被中和,优选中和至生理pH,以便制备将要掺入疫苗的佐剂溶液。聚合物的羧基部分为COO-形式。
优选地,根据本发明的佐剂溶液,尤其是carbomer溶液,用蒸馏水制备,优选有NaCl的蒸馏水时制备,获得的溶液为酸性pH。该储备液加入到预定量(用来获得预定终浓度)或其实际比例的含有NaCl的水中、优选生理盐水(NaCl9g/l)来稀释,几步中都立刻同时或随后中和(pH7.3-7.4),优选用NaOH中和。将生理pH的该溶液与疫苗混合,特别可以冻干、液体或冰冻的形式贮藏。
在最后的疫苗组合物中聚合物浓度为0.01%-2%w/v,更特别为0.06-1%w/v,优选0.1-0.6%w/v。根据本发明的免疫组合物可与至少一种减毒活疫苗、灭活疫苗、或亚单位疫苗、或表达至少一种其它猪病原体免疫原的重组疫苗(如痘病毒作为载体或DNA质粒)关联。
这些和其它实施方案由下面的详细描述公开或变得显而易见并包含于其中。
附图简述
通过查阅所附图表将更好地理解本发明,其中:
●图13(SEQIDNO:1)显示了ALVACDNA含有C6开放读码框的3.7千碱基对片段的核苷酸序列。
●图14显示了pJP102供体质粒图。
●图15(SEQIDNO:8)显示了pJP102供体质粒从KpnI(653位)到SacI(3166位)限制酶位点的2.5千碱基对片段的核苷酸序列。
●图16显示了pJP105供体质粒图。
●图17显示了pJP107供体质粒图。
●图18(SEQIDNO:11)显示了pJP107供体质粒从KpnI(653位)到SacI(4255位)限制酶位点的3.6千碱基对片段的核苷酸序列。
发明详述
本发明涉及在痘病毒基因组的非必需区含有来自PCV2的DNA序列的重组痘病毒。重组痘病毒表达外源PCV2基因的基因产物。特别分离并表征了编码PCV2蛋白的ORF1和ORF2基因,并将其插入ALVAC重组体(金丝雀痘病毒载体)。使用的分子生物学技术是Sambrook等所描述的那些(1989)。
细胞系和病毒株。命名为Imp.1010-Stoon的PCV2毒株先前已有描述(Meehan等,1998)。它从来自加拿大的一头病猪的肠系膜淋巴结组织中分离。Meehan等(1998)描述了PCV2基因组的克隆。质粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRINo.14含有作为EcoRI片段插入质粒pGem-7Z(Promega,Madison,WI)EcoRI位点的PCV2基因组。Imp.1010-StoonPCV2毒株的全核苷酸序列已由Meehan等(1998)测定,并可由GenBank登录号AF055392获得。
亲本金丝雀痘病毒(Rentschler毒株)是用于金丝雀的疫苗株。疫苗株获自野生分离株,并通过在鸡胚成纤维细胞上连续传200代以上而减毒。主毒种用琼脂经连续四次噬斑纯化,并且其中一个克隆再通过五次传代扩增,然后用该病毒库作为体外重组试验的亲本病毒。噬斑纯化的金丝雀痘病毒分离株被命名为ALVAC。ALVAC于1996年12月14日按照布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心,ATCC登录号为VR-2547。
重组痘病毒的产生包括几步:(1)构建一个插入质粒,含有痘病毒基因组中插入位点两侧的序列(“臂”),和位于两侧臂之间的多克隆位点(MCS)(例如见实施例1);(2)构建供体质粒,该质粒由已将外源基因表达盒插入其MCS的插入质粒组成(例如见实施例2-5);(3)供体质粒的两臂和亲本痘病毒的基因组在细胞培养物中的体外重组,使外源基因表达盒插入痘病毒基因组的合适位点,和噬斑纯化重组病毒(例如见实施例6)。
PCV2重组免疫原可能与PCV1免疫原联合使用,用于免疫动物预防PMWS。在最末优选的方法中,可能单独使用PCV1免疫原,而不与PCV2免疫原一起使用。
此外本发明通过下面说明性而非限制性的实施例来描述。
实施例1在C6位点构建金丝雀痘病毒插入质粒
图13(SEQIDNO:1)为金丝雀痘病毒DNA的3.7kb片段的序列。序列分析表明存在一个从377位起始并在2254位终止的命名为C6L的ORF。下面描述了C6插入质粒的构建,通过缺失C6ORF并用两侧为转录和翻译终止信号的多克隆位点(MCS)取代。使用寡核苷酸引物C6A1(SEQIDNO:2)和C6B1(SEQIDNO:3)从金丝雀痘病毒基因组DNA扩增了380bp的PCR片段。使用寡核苷酸引物C6C1(SEQIDNO:4)和C6D1(SEQIDNO:5)从金丝雀痘病毒基因组DNA扩增了1155bp的PCR片段。将380bp和1155bp的片段融合在一起,融合方法为将二者一起加入作为模板,使用寡核苷酸引物C6A1(SEQIDNO:2)和C6D1(SEQIDNO:5)扩增了1613bp的PCR片段。该片段用SacI和KpnI消化,并连接到用SacI/KpnI消化的pBluescriptSK+(Stratagen,La,Jolla,CA,美国)中。产生的质粒pC6L通过DNA序列分析证实。它由C6上游370bp的金丝雀痘病毒DNA(“C6左臂”)、痘苗病毒早期终止信号、6个读码框中的翻译终止子、含有SmaI、PstI、XhoI和EcoRI位点的MCS、痘苗病毒早期终止信号、6个读码框中的翻译终止子和1155bp的下游金丝雀痘病毒序列(“C6右臂”)组成。
质粒pJP099由pC6L衍生而来,将含有连接了外源基因的痘苗病毒H6启动子(在Taylor等(1988c)、Guo等(1989)和Perkus等(1989)有描述)连接到pC6L的SmaI/EcoRI位点。质粒pJP099在H6启动子3′端含有一个独特的EcoRV位点和一个独特的NruI位点,在外源基因的终止密码和C6左臂之间有一个独特的SalI位点。因此来自pJP099的~4.5kbEcoRV/SalI或NruI/SalI片段含有质粒序列(pBluescriptSK+;Stratagene,LaJolla,CA,USA)、两个C6臂和H6启动子5′端到EcoRV和NruI位点的序列。
引物序列
引物C6Ai(SEQIDNO:2)
ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT
引物′C6B1(SEQIDNO:3)
GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA
引物C6C1(SEQIDNO:4)
CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA
引物C6D1(SEQIDNO:5)
GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG
实施例2-构建PCV2ORF2的ALVAC供体质粒
用EcoRI消化质粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRINo.14(含有在质粒pGem7Z中作为EcoRI片段的PCV2基因组),分离1768bp的片段并连接。
为了将PCV2ORF2插入合适的ALVAC插入载体:使用引物JP760(SEQIDNO:6)和JP773(SEQIDNO:7)从1768bp连接的EcoRI片段(见上文)扩增PCV2ORF2,产生PCRJ1304。引物JP760(SEQIDNO:6)含有从EcoRV开始的H6启动子3′端和PCV2ORF2的5′端。引物JP773(SEQIDNO:7)含有PCV2ORF2的3′端,后跟一个SalI位点。然后用EcoRV/SalI消化PCR产物J1304,并作为~750bp的片段克隆到来自pJP099的~4.5kb的EcoRV/SalI片段(见上文实施例1)。产生的质粒通过序列分析证实并命名为pJP102(见图14的pJP102图和图15的序列(SEQIDNO:8))。ORF2序列与GenBank提供的序列匹配,登录号为AF055392。供体质粒pJP102(用NotI线性化)用于体外重组试验(IVR),产生ALVAC重组体vCP1614(见实施例6)。
引物序列:
JP760(SEQIDNO:6)
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-AGG-AGG-CG
JP773(SEQIDNO:7)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC
实施例3构建PCV2ORF2和ORF1的ALVAC供体质粒
用引物JP774(SEQIDNO:9)和JP775(SEQIDNO:10)在质粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRINo.14上通过PCR扩增PCV2ORF1,产生PCRJ1311。引物JP774(SEQIDNO:9)含有从NruI到H6启动子的3′端和PCV2ORF1的5′端。引物JP775(SEQIDNO:10)含有PCV2ORF1的3′端,后跟一个SalI位点。PCR产物J1311(~1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen,Carsbad,CA)。产生的质粒通过序列分析证实并命名为pJP104。ORF1序列与GenBank提供的序列匹配,登录号为AF055392。将从pJP104分离的~970bp的NruI/SalI片段克隆到来自pJP099的~4.5kb的NruI/SalI片段(见实施例1),产生的质粒用限制酶切分析并命名为pJP105(见图16)。供体质粒pJP105(用NotI线性化)用于体外重组试验(实施例6有描述),产生表达PCV2ORF1的ALVAC重组体。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平来自pJP102的~838bp的BamHI/SalI片段,并克隆到Klenow削平的pJP105的EcoRI位点。通过限制酶切分析检查插入片段的方向并选择头对头的方向。该质粒用序列分析证实并命名为pJP107(见图17的pJP107图和图18的序列(SEQIDNO:11))。供体质粒pJp107(用NotI线性化)用于体外重组5(IVR)试验,产生ALVAC重组体vCP1615(见实施例6)。
引物序列:
JP774(SEQIDNO:9)
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGG
JP775(SEQIDNO:10)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG
实施例4-构建PCV1ORF2的ALVAC供体质粒
质粒pPCV1(B.Meehan等,J.Gen.Virol.1997.78.221-227)含有在质粒pGem7Z中作为PstI片段的PCV1基因组,作为模板用来扩增PCV1ORF2。
为了将PCV1ORF2插入合适的ALVAC插入载体:使用引物JP787(SEQIDNO:12)和JP788(SEQIDNO:13)从质粒pCV1扩增PCV1ORF2(见上文),产生PCRJ1315。引物JP787(SEQIDNO:12)含有从EcoRV到H6启动子的3′端和ORF2,后跟一个SalI位点。然后用EcoRV/SalI消化PCR产物J1315并克隆到来自pJP099的~4.5kb的EcoRV/SalI片段(见上文实施例1)。产生的质粒通过序列分析证实并命名为pJP113。ORF2序列与GenBank提供的序列匹配,登录号为U49186。供体质粒pJP113(用NotI线性化)用于体外重组试验(IVR),产生ALVAC重组体vCP1621(见实施例7)。
引物序列:
JP787(SEQIDNO:12)
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CG
JP788(SEQIDNO:13)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G
实施例5构建PCV1ORF2和ORF1的ALVAC供体质粒
用PstI消化质粒pPCV1(见产施例4),该质粒含有在质粒pGem-7Z中作为PstI片段的PCV1基因组。分离1759bp的片段并连接。
使用引物JP789(SEQIDNO:14)和JP790(SEQIDNO:15)从连接的1759bpPstI片段扩增PCV1ORF1,产生PCRJ1316。引物JP789(SEQIDNO:14)含有从NruI到H6启动予的3’端和PCV1ORF1的5’端。引物JP790(SEQIDNO:15)含有PCV1ORF1的3’端,后跟一个SalI位点。PCR产物J1316(~1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen,Carsbad,CA)。产生的质粒通过序列分析证实并命名为pJP114。ORF1序列与GenBank提供的序列匹配,登录号为U49186。从pJP114分离的~970bp的NruI/SalI片段克隆到来自pJP099的~4.5kb的NruI/SalI片段(见实施例1),产生的质粒用限制酶切分析并命名为pJP115。供体质粒pJP105(用NotI线性化)用于体外重组试验(实施例6有描述),产生表达PCV1ORF1的ALVAC重组体。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平来自pJP113的~838bp的BamHI/SalI片段,并克隆到Klenow削平的pJP115的EcoRI位点。通过限制酶切分析检查插入片段的方向,选择头对头的方向。该质粒通过序列分析证实并命名为pJP117。供体质粒pJP117(用NotI线性化)用于体外重组(IVR)试验,产生ALVAC重组体vCP1622(见实施例7)。
引物序列:
JP789(SEQIDNO:14)
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-AAG-CAA-GAA-AAG-CGG
JP790(SEQIDNO:15)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG
实施例6-ALVAC-PCV2重组体的产生
质粒pJP102(见实施例2和图14)和pJP107(见实施例3和图17)用NotI线性化,并使用先前描述的磷酸钙沉淀法转染ALVAC感染的原代CEF细胞(Panicali和Paoletti,1982;Piccini等,1987)。根据与放射性标记的特异性PCV2探针杂交选择阳性噬斑,进行连续四轮噬斑纯化,直到获得纯的噬斑。然后扩增每个IVR的一个代表性噬斑,产生的ALVAC重组体命名为vCP1614和vCP1615。vCP1614病毒是ALVAC和供体质粒pJP102重组的结果,它含有插入到ALVACC6位点的PCF2ORF2。vCP1615病毒是ALVAC和供体质粒pJP107重组的结果,它含有以头对头方向插入到ALVACC6位点的PCV2ORF2和ORF1。
以相似的方式,用实施例3描述的供体质粒pJP105可产生仅表达PCV2ORF1的ALVAC重组体。
免疫荧光.为了确定感染了ALVAC重组体的Vero细胞是否表达PCV2蛋白,进行了免疫荧光分析(IF)。感染的Vero细胞(m.o.i.大约为10)在感染24小时后用PBS洗涤,并用95%冷丙酮室温固定3分钟。对PCV2ORF1(PCV21991D3GA&PCV22107G5GD)或ORF2(PCV21904C7CF、PCV21902B1BC&PCV21903A8BC)特异的五种单克隆抗体(Mab)制品(杂交瘤上清)用作第一抗体。这些特异的单克隆抗体获自Merial-Lyon。单克隆抗体也可按照此处引用文献中的指导来获得,例如并入本文作为参考的美国系列号09/082,358和09/161,092。IF反应按照Taylor等描述的进行(1990)。
使用三个ORF2特异性抗体的PCV2特异的免疫荧光可以在感染了vCP1614的细胞和感染了vCP1615的细胞中检查到。使用两个ORF1特异性抗体的PCV2特异的免疫荧光只能在感染了vCP1615的细胞中检查到。这些结果表明,如预料的那样,vCP1614只表达ORF2,而vCP1615表达ORF1和ORF2。在亲本ALVAC感染的Vero细胞和未感染的Vero细胞中都没有检查到荧光。
实施例7-ALVAC-PCV1重组体的产生
质粒pJP113(见实施例4)和pJP117(见实施例5)用NotI线性化,并使用先前描述的磷酸钙沉淀法转染ALVAC感染的原代CEF细胞(Panicali和Paoletti,1982;Piccini等,1987)。根据与放射性标记的特异性PCV1探针杂交选择阳性噬斑,进行四轮连续噬斑纯化,直到获得纯的噬斑。然后扩增每个IVR的代表性噬斑,产生的重组体命名为vCP1621和vCP1622。vCP1621病毒是ALVAC和供体质粒pJP113重组的结果,它含有插入到ALVACC6位点的PCV1ORF2。vCP1622病毒是ALVAC和供体质粒pJP117重组的结果,它含有以头对头方向插入到ALVACC6位点的PCV1ORF2和ORF1。
以相似的方式,用实施例5描述的供体质粒pJP115可产生只表达PCV1ORF1的重组体ALVAC。
免疫荧光.为了确定感染了ALVAC重组体的Vero细胞是否表达PCV1蛋白,进行了免疫荧光分析(IF)。感染的Vero细胞(m.o.i.大约为10)在感染24小时后用PBS洗涤,并用95%冷丙酮室温固定3分钟。特异的抗PCV1的猪多克隆血清(AllanG等.Vet.Microbiol.1999,66:115-123)用作第一抗体。IF反应按照Taylor等描述的进行(1990)。
PCV1特异的免疫荧光可以在感染了vCP1621的细胞和感染了vCP1622的细胞中检查到。这些结果表明,如预料的那样,vCP1621和vCP1622表达PCV1特异的产物,用PCV2特异的猪多克隆血清在vCP1621感染的Vero细胞和vCP1622感染的Vero细胞中都没有检查到荧光。在亲本ALVAC感染的Vero细胞和未感染的Vero细胞中都没有检查到荧光。
实施例8用Carbopol
TM
974P配制重组金丝雀痘病毒
为了制备疫苗,重组金丝雀痘病毒vCP1614和vCP1615(实施例6)可与carbomer溶液混合。以同样的方式,重组金丝雀痘病毒vCP1621和vCP1622(实施例7)可与carbomer溶液混合。用于根据本发明来免疫猪的carbomer成分为BFGoodrich公司制造的CarbopolTM974P(分子量为3,000,000)。首先用含有1g/l氯化钠的蒸馏水制备1.5%CarbopolTM974P储备液。然后用该储备液制备4mg/mlCarbopolTM974P的生理盐水溶液。在一个步骤或几个连续步骤中,储备液与所需体积的生理盐水混合,每一步用1N(或更浓的)氢氧化钠溶液调整pH值,使最终pH值为7.3-7.4。这种最终的CarbopolTM974P溶液可立即用于复制冻干重组病毒或用于稀释浓缩的重组病毒储备液。例如,为了获得每2ml剂量含有10e8pfu的最终病毒悬液,可将0.1ml10e9pfu/ml储备液加入到立即可用的1.9ml上述4mg/mlCarbopolTM974P溶液中稀释。以相同的方式,也可制备立即可用的2mg/mlCarbopolTM974P溶液。
实施例9免疫猪及以后的攻击
9.1.免疫1日龄小猪
将一组在第0天来自caesarian的小猪放入隔离器。在第2天用各种疫苗溶液通过肌肉途径接种小猪。用无菌生理盐水(NaCl0.9%)稀释重组病毒储备液制备疫苗病毒悬液。病毒悬液的合适范围可根据经验确定,但通常范围在106-1010,优选大约1010pfu/剂量。疫苗溶液也可通过将重
组病毒悬液与CarbopolTM974P溶液混合来制备,如实施例8中所述。
免疫小猪用任一种:
重组病毒vCP1614(实施例2);
重组病毒vCP1615(实施例3);
与Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重组病毒vCp1614;或
与Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重组病毒vCP1615。
每个剂量病毒悬液含有108噬斑形成单位(pfu)。通过肌肉途径注射每种病毒悬液1ml。肌肉注射是注射颈部肌肉。
在实验第2天和第14天注射2针病毒悬液。在第21天用PCV-2强毒株培养物制备的病毒悬液经口鼻攻击。攻击后,监视小猪断奶后多系统综合征的临床体征3周。记录以下体征:
直肠温度:攻击后每天监视持续2周,然后在第3周测量2次直肠温度。
体重:临攻击前称量小猪体重,然后在攻击后前3周每周称一次体重。
在实验的第2、14、21、28、35和42天采集血样,来监测病毒血症水平和抗-PCV-2特异性抗体滴度。
尸体剖检:在第42天所有存活的小猪被处以人道安乐死并进行尸体剖检,观察特异的PWMS肉眼损害。从肝脏、淋巴结、脾、肾和胸腺制备组织样品以观察特异性组织学损害。
9.2免疫5-7周龄小猪
无抗PCV-2特异性母体抗体的5-7周龄小猪通过肌肉途径接种各种疫苗溶液。用无菌生理盐水(NaCl0.9%)稀释重组病毒储备液制备疫苗病毒悬液。疫苗溶液也可通过将重组病毒悬液与CarbopolTM974P溶液混合来制备,如实施例8中所述。
免疫小猪用任一种:
重组病毒vCP1614(实施例2);
重组病毒vCP1615(实施例3);
与Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重组病毒vCP1614;或
与Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重组病毒vCP1615。
病毒悬液每剂量含有108噬斑形成单位(pfu)。通过肌肉途径注射每种病毒悬液1ml。肌肉注射是注射到颈部肌肉。
在实验第0天和第21天注射2针病毒悬液。在第35天用PCV-2强毒株培养物制备的病毒悬液经口鼻攻击。攻击后,监视小猪断奶后多系统综合征的临床体征8周。监测的临床体征与实施例9.1中描述的相同。只是总监视时间为8周而非3周。
在整个实验过程中对攻击后死亡的小猪及实验结束时(第97天)所有存活的小猪进行尸体剖检。组织样品与实施例9.1中描述的相同。
参考文献
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权利要求书
1.一种含有来自猪环状病毒2的DNA的重组病毒。
2.根据权利要求1的重组病毒,其为痘病毒。
3.根据权利要求2的重组痘病毒,其为禽痘病毒。
4.根据权利要求3的重组禽痘病毒,其为ALVAC。
5.根据权利要求4的重组ALVAC病毒,其中来自猪环状病毒2的DNA编码并表达为猪环状病毒的主要衣壳蛋白。
6.根据权利要求4的重组ALVAC病毒,其中来自猪环状病毒2的DNA含有猪环状病毒2的开放读码框2(ORF2)。
7.根据权利要求4的重组ALVAC病毒,其中来自猪环状病毒2的DNA含有猪环状病毒2的开放读码框1(ORF1)。
8.根据权利要求4的重组ALVAC病毒,其中来自猪环状病毒2的DNA含有猪环状病毒2的开放读码框1和2(ORF1和2)。
9.根据权利要求4的重组ALVAC病毒,其为vCP1614和vCP1615。
10.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有一种载体和根据权利要求1的重组病毒。
11.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有载体和根据权利要求5的重组病毒。
12.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有载体和根据权利要求6的重组病毒。
13.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有载体和根据权利要求7的重组病毒。
14.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有载体和根据权利要求8的重组病毒。
15.一种用于在接种了该免疫组合物的宿主内诱导免疫应答的免疫组合物,该免疫组合物含有载体和根据权利要求9的重组病毒。
16.一种用于在宿主内诱导免疫应答的方法,其包括给予宿主根据权利要求11的免疫组合物。
17.一种用于在宿主内诱导免疫应答的方法,其包括给予宿主根据权利要求12的免疫组合物。
18.一种用于在宿主内诱导免疫应答的方法,其包括给予宿主根据权利要求13的免疫组合物。
19.一种用于在宿主内诱导免疫应答的方法,其包括给予宿主根据权利要求14的免疫组合物。
20.一种用于在宿主内诱导免疫应答的方法,其包括给予宿主根据权利要求15的免疫组合物。
附件2的序列表
(1)一般信息:
(i)申请人:
Bublot,Michel
Perez,JenniferM
Charreyre,CatherineE
(ii)发明名称:猪环病毒2重组痘病毒
(iii)序列数目:13
(iv)联系地址
(A)收件人:VirogeneticsInc.
(B)街道:465JordanRoad
(C)城市:Troy
(D)州:NY
(E)国家:美国
(F)邮政编码:12180
(v)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBMPC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatnetInRelease#1.0Version#1.25
(viii)代理人/代理机构数据
(A)姓名:Howe,TimothyR.
(B)登记号:39,228
(C)文档号:TH0125
(ix)通讯信息:
(A)电话:(570)586-1022
(B)传真:(570)895-2702
(2)SEQ.ID.NO.1的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:3701个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述:
AAGCTTCTATCAAAAGTCTTAATGAGTTAGGTGTAGATAGTATAGATATTACTACAAAGG
60
TATTCATATTTCCTATCAATTCTAAAGTAGATGATATTAATAACTCAAAGATGATGATAG
120
TAGATAATAGATACGCTCATATAATGACTGCAAATTTGGACGGTTCACATTTTAATCATC
180
ACGCGTTCATAAGTTTCAACTGCATAGATCAAAATCTCACTAAAAAGATAGCCGATGTAT
240
TTGAGAGAGATTGGACATCTAACTACGCTAAAGAAATTACAGTTATAAATAATACATAAT
300
GGATTTTCTTATCATCAGTTATATTTAACATAAGTACAATAAAAAGTATTAAATAAAAAT
360
ACTTACTTACGAAAAAATGTCATTATTACAAAAACTATATTTTACAGAACAATCTATAGT
420
AGAGTCCTTTAAGAGTTATAATTTAAAAGATAACCATAATGTAATATTTACCACATCAGA
480
TGATGATACTGTTGTAGTAATAAATGAAGATAATGTACTGTTATCTACAAGATTATTATC
540
ATTTGATAAAATTCTGTTTTTTAACTCCTTTAATAACGGTTTATCAAAATACGAAACTAT
600
TAGTGATACAATATTAGATATAGATACTCATAATTATTATATACCTAGTTCTTCTTCTTT
660
GTTAGATATTCTAAAAAAAAGAGCGTGTGATTTAGAATTAGAAGATCTAAATTATGCGTT
720
AATAGGAGACAATAGTAACTTATATTATAAAGATATGACTTACATGAATAATTGGTTATT
780
TACTAAAGGATTATTAGATTACAAGTTTGTATTATTGCGCGATGTAGATAAATGTTACAA
840
ACAGTATAATAAAAAGAATACTATAATAGATATAATACATCGCGATAACAGACAGTATAA
900
CATATGGGTTAAAAATGTTATAGAATACTGTTCTCCTGGCTATATATTATGGTTACATGA
960
TCTAAAAGCCGCTGCTGAAGATGATTGGTTAAGATACGATAACCGTATAAACGAATTATC
1020
TGCGGATAAATTATACACTTTCGAGTTCATAGTTATATTAGAAAATAATATAAAACATTT
1080
ACGAGTAGGTACAATAATTGTACATCCAAACAAGATAATAGCTAATGGTACATCTAATAA
1140
TATACTTACTGATTTTCTATCTTACGTAGAAGAACTAATATATCATCATAATTCATCTAT
l200
AATATTGGCCGGATATTTTTTAGAATTCTTTGAGACCACTATTTTATCAGAATTTATTTC
1260
TTCATCTTCTGAATGGGTAATGAATAGTAACTGTTTAGTACACCTGAAAACAGGGTATGA
1320
AGCTATACTCTTTGATGCTAGTTTATTTTTCCAACTCTCTACTAAAAGCAATTATGTAAA
1380
ATATTGGACAAAGAAAACTTTGCAGTATAAGAACTTTTTTAAAGACGGTAAACAGTTAGC
1440
AAAATATATAATTAAGAAAGATAGTCAGGTGATAGATAGAGTATGTTATTTACACGCAGC
1500
TGTATATAATCACGTAACTTACTTAATGGATACGTTTAAAATTCCTGGTTTTGATTTTAA
1560
ATTCTCCGGAATGATAGATATACTACTGTTTGGAATATTGCATAAGGATAATGAGAATAT
1620
ATTTTATCCGAAACGTGTTTCTGTAACTAATATAATATCAGAATCTATCTATGCAGATTT
1680
TTACTTTATATCAGATGTTAATAAATTCAGTAAAAAGATAGAATATAAAACTATGTTTCC
1740
TATACTCGCAGAAAACTACTATCCAAAAGGAAGGCCCTATTTTACACATACATCTAACGA
1800
AGATCTTCTGTCTATCTGTTTATGCGAAGTAACAGTTTGTAAAGATATAAAAAATCCATT
1860
ATTATATTCTAAAAAGGATATATCAGCAAAACGATTCATAGCTTTATTTACATCTGTCGA
1920
TATAAATACGGCTGTTGAGTTAAGAGGATATAAAATAAGAGTAATAGGATGTTTAGAATG
1980
GCCTGAAAAGATAAAAATATTTAATTCTAATCCTACATACATTAGATTATTACTAACAGA
2040
AAGACGTTTAGATATTCTACATTCCTATCTGCTTAAATTTAATATAACAGAGGATATAGC
2100
TACCAGAGATGGAGTCAGAAATAATTTACCTATAATTTCTTTTATCGTCAGTTATTGTAG
2160
ATCGTATACTTATAAATTACTAAATTGCCATATGTACAATTCGTGTAAGATAACAAAGTG
2220
TAAATATAATCAGGTAATATATAATCCTATATAGGAGTATATATAATTGAAAAAGTAAAA
2280
TATAAATCATATAATAATGAAACGAAATATCAGTAATAGACAGGAACTGGCAGATTCTTC
2340
TTCTAATGAAGTAAGTACTGCTAAATCTCCAAAATTAGATAAAAATGATACAGCAAATAC
2400
AGCTTCATTCAACGAATTACCTTTTAATTTTTTCAGACACACCTTATTACAAACTAACTA
2460
AGTCAGATGATGAGAAAGTAAATATAAATTTAACTTATGGGTATAATATAATAAAGATTC
2520
ATGATATTAATAATTTACTTAACGATGTTAATAGACTTATTCCATCAACCCCTTCAAACC
2580
TTTCTGGATATTATAAAATACCAGTTAATGATATTAAAATAGATTGTTTAAGAGATGTAA
2640
ATAATTATTTGGAGGTAAAGGATATAAAATTAGTCTATCTTTCACATGGAAATGAATTAC
2700
CTAATATTAATAATTATGATAGGAATTTTTTAGGATTTACAGCTGTTATATGTATCAACA
2760
ATACAGGCAGATCTATGGTTATGGTAAAACACTGTAACGGGAAGCAGCATTCTATGGTAA
-2820-
CTGGCCTATGTTTAATAGCCAGATCATTTTACTCTATAAACATTTTACCACAAATAATAG
2880
GATCCTCTAGATATTTAATATTATATCTAACAACAACAAAAAAATTTAACGATGTATGGC
2940
CAGAAGTATTTTCTACTAATAAAGATAAAGATAGTCTATCTTATCTACAAGATATGAAAG
3000
AAGATAATCATTTAGTAGTAGCTACTAATATGGAAAGAAATGTATACAAAAACGTGGAAG
3060
CTTTTATATTAAATAGCATATTACTAGAAGATTTAAAATCTAGACTTAGTATAACAAAAC
3120
AGTTAAATGCCAATATCGATTCTATATTTCATCATAACAGTAGTACATTAATCAGTGATA
3180
TACTGAAACGATCTACAGACTCAACTATGCAAGGAATAAGCAATATGCCAATTATGTCTA
3240
ATATTTTAACTTTAGAACTAAAACGTTCTACCAATACTAAAAATAGGATACGTGATAGGC
3300
TGTTAAAAGCTGCAATAAATAGTAAGGATGTAGAAGAAATACTTTGTTCTATACCTTCGG
3360
AGGAAAGAACTTTAGAACAACTTAAGTTTAATCAAACTTGTATTTATGAACACTATAAAA
3420
AAATTATGGAAGATACAAGTAAAAGAATGGATGTTGAATGTCGTAGTTTAGAACATAACT
3480
ATACGGCTAACTTATATAAAGTGTACGGACAAAACGAATATATGATTACTTATATACTAG
3540
CTCTCATAAGTAGGATTAATAATATTATAGAAACTTTAAAATATAATCTGGTGGGGCTAG
3600
ACGAATCTACAATACGTAATATAAATTATATAATTTCACAAAGAACAAAAAAAAATCAAG
3660
TTTCTAATACCTTATAGATAAACTATATTTTTTACCACTGA
3701
(2)SEQ.ID.NO.2的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:42个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述:
ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT
42
(2)SEQ.ID.NO.3的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:73个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述:
GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAG
60
TATTTTTATTTAA
73
(2)SEQ.ID.NO.4的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:72个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述:
CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAA
60
TTGAAAAAGTAA
72
(2)SEQ.ID.NO.5的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:45个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述:
GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG
45
(2)SEQ.ID.NO.6的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:53个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述:
CATCATCATGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGACGTATCCAAGGAGGCG
53
(2)SEQ.ID.NO.7的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:36个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述:
TACTACTACGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC
36
(2)SEQ.ID.NO.8的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:2520个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述:
GGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTGTTCTAAAGTTCTTTCCTCCGA
60
AGGTATAGAACAAAGTATTTCTTCTACATCCTTACTATTTATTGCAGCTTTTAACAGCCT
120
ATCACGTATCCTATTTTTAGTATTGGTAGAACGTTTTAGTTCTAAAGTTAAAATATTAGA
180
CATAATTGGCATATTGCTTATTCCTTGCATAGTTGAGTCTGTAGATCGTTTCAGTATATC
240
ACTGATTAATGTACTACTGTTATGATGAAATATAGAATCGATATTGGCATTTAACTGTTT
300
TGTTATACTAAGTCTAGATTTTAAATCTTCTAGTAATATGCTATTTAATATAAAAGCTTC
360
CACGTTTTTGTATACATTTCTTTCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTTT
420
CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCA
480
TACATCGTTAAATTTTTTTGTTGTTGTTAGATATAATATTAAATATCTAGAGGATCCTAT
540
TATTTGTGGTAAAATGTTTATAGAGTAAAATGATCTGGCTATTAAACATAGGCCAGTTAC
600
CATAGAATGCTGCTTCCCGTTACAGTGTTTTACCATAACCATAGATCTGCCTGTATTGTT
660
GATACATATAACAGCTGTAAATCCTAAAAAATTCCTATCATAATTATTAATATTAGGTAA
720
TTCATTTCCATGTGAAAGATAGACTAATTTTATATCCTTTACCTCCAAATAATTATTTAC
780
ATCTCTTAAACAATCTATTTTAATATCATTAACTGGTATTTTATAATATCCAGAAAGGTT
840
TGAAGGGGTTGATGGAATAAGTCTATTAACATCGTTAAGTAAATTATTAATATCATGAAT
900
CTTTATTATATTATACCCATAAGTTAAATTTATATTTACTTTCTCATCATCTGACTTAGT
960
TAGTTTGTAATAAGGTGTGTCTGAAAAAATTAAAAGGTAATTCGTTGAATGAAGCTGTAT
1020
TTGCTGTATCATTTTTATCTAATTTTGGAGATTTAGCAGTACTTACTTCATTAGAAGAAG
1080
AATCTGCCAGTTCCTGTCTATTACTGATATTTCGTTTCATTATTATATGATTTATATTTT
1140
ACTTTTTCAATTATATATACTCATTTGACTAGTTAATCAATAAAAAGAATTCCTGCAGCC
1200
CTGCAGCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAACTAATTA
1260
ATTAAGGATCCCCCAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTT
1320
CTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGAT
1380
ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACAC
1440
CGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGC
1500
CACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTC
1560
GGATATACTGTCAAGCGTACCACAGTCACAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGA
1620
TTTAAAATTGACGACTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTT
1680
GAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCCATCACCCAG
1740
GGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCC
1800
ACAGCCCTAACCTATGACCCATATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCC
1860
TTCTCCTACCACTCCCGTTACTTCACACCCAAACCTGTTCTTGACTCCACTATTGATTAC
1920
TTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGACTACAAACCTCTGGAAATGTG
1980
GACCACGTAGGCCTCGGCGCTGCGTTCGAAAACAGTAAATACGACCAGGACTACAATATC
2040
CGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCC
2100
TAAGTCGACCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTAT
2160
TTAATACTTTTTATTGTACTTATGTTAAATATAACTGATGATAACAAAATCCATTATGTA
2220
TTATTTATAACTGTAATTTCTTTAGCGTAGTTAGATGTCCAATCTCTCTCAAATACATCG
2280
GCTATCTTTTTAGTGAGATTTTGATCTATGCAGTTGAAACTTATGAACGCGTGATGATTA
2340
AAATGTGAACCGTCCAAATTTGCAGTCATTATATGAGCGTATCTATTATCTACTATCATC
2400
ATCTTTGAGTTATTAATATCATCTACTTTAGAATTGATAGGAAATATGAATACCTTTGTA
2460
GTAATATCTATACTATCTACACCTAACTCATTAAGACTTTTGATAGGCGGCCGCGAGCTC
2520
(2)SEQ.ID.NO.9的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:57个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述:
CATCATCATTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAGCAAGAAGAATGG
57
(2)SEQ.ID.NO.10的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:36个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述:
TACTACTACGTCGACTCAGTAATTTATTTCATATGG
36
(2)SEQ.ID.NO.11的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:3609个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述:
GGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTGTTCTAAAGTTCTTTCCTCCGA
60
AGGTATAGAACAAAGTATTTCTTCTACATCCTTACTATTTATTGCAGCTTTTAACAGCCT
120
ATCACGTATCCTATTTTTAGTATTGGTAGAACGTTTTAGTTCTAAAGTTAAAATATTAGA
180
CATAATTGGCATATTGCTTATTCCTTGCATAGTTGAGTCTGTAGATCGTTTCAGTATATC
240
ACTGATTAATGTACTACTGTTATGATGAAATATAGAATCGATATTGGCATTTAACTGTTT
300
TGTTATACTAAGTCTAGATTTTAAATCTTCTAGTAATATGCTATTTAATATAAAAGCTTC
360
CACGTTTTTGTATACATTTCTTTCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTTT
420
CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCA
480
TACATCGTTAAATTTTTTTGTTGTTGTTAGATATAATATTAAATATCTAGAGGATCCTAT
540
TATTTGTGGTAAAATGTTTATAGAGTAAAATGATCTGGCTATTAAACATAGGCCAGTTAC
600
CATAGAATGCTGCTTCCCGTTACAGTGTTTTACCATAACCATAGATCTGCCTGTATTGTT
660
GATACATATAACAGCTGTAAATCCTAAAAAATTCCTATCATAATTATTAATATTAGGTAA
720
TTCATTTCCATGTGAAAGATAGACTAATTTTATATCCTTTACCTCCAAATAATTATTTAC
780
ATCTCTTAAACAATCTATTTTAATATCATTAACTGGTATTTTATAATATCCAGAAAGGTT
840
TGAAGGGGTTGATGGAATAAGTCTATTAACATCGTTAAGTAAATTATTAATATCATGAAT
900
CTTTATTATATTATACCCATAAGTTAAATTTATATTTACTTTCTCATCATCTGACTTAGT
960
TAGTTTGTAATAAGGTGTGTCTGAAAAAATTAAAAGGTAATTCGTTGAATGAAGCTGTAT
1020
TTGCTGTATCATTTTTATCTAATTTTGGAGATTTAGCAGTACTTACTTCATTAGAAGAAG
1080
AATCTGCCAGTTCCTGTCTATTACTGATATTTCGTTTCATTATTATATGATTTATATTTT
1140
ACTTTTTCAATTATATATACTCATTTGACTAGTTAATCAATAAAAAGAATTTCGACTTAG
1200
GGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGG
1260
ATATTGTAGTCCTGGTCGTATTTACTGTTTTCGAACGCAGCGCCGAGGCCTACGTGGTCC
1320
ACATTTCCAGAGGTTTGTAGTCTCAGCCAAAGCTGATTCCTTTTGTTATTTGGTTGGAAG
1380
TAATCAATAGTGGAGTCAAGAACAGGTTTGGGTGTGAAGTAACGGGAGTGGTAGGAGAAG
1440
GGTTGGGGGATTGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATATGGGTCATAGGTTAGGGCTGTG
1500
GCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCACTCCCCTATCACCC
1560
TGGGTGATGGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTCTGTAGTATTCA
1620
AAGGGTATAGAGATTTTGTTGGTCCCCCCTCCCGGGGGAACAAAGTCGTCAATTTTAAAT
1680
CTCATCATGTCCACCGCCCAGGAGGGCGTTGTGACTGTGGTACGCTTGACAGTATATCCG
1740
AAGGTGCGGGAGAGGCGGGTGTTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAACGGTAGCGGTGG
1800
CGGGGGTGGACGAGCCAGGGGCGGCGGCGGAGGATCTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGG
1860
TGTCTTCTTCTGCGGTAACGCCTCCTTGGATACGTCATTACGATACAAACTTAACGGATA
1920
TCGCGATAATGAAATAATTTATGATTATTTCTCGCTTTCAATTTAACACAACCCTCAAGA
1980
ACCTTTGTATTTATTTTCACTTTTTAAGTATAGAATAAAGAAGCTGGGGGATCAATTCCT
2040
GCAGCCCTGCAGCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAAC
2100
TAATTAATTAAGGATCCCCCAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACA
2160
AAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTAT
2220
CGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGACCC
2280
CAACCACATAAAAGGTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCGAAGACGAGCGCAAGAAA
2340
ATACGGGAGCTCCCAATCTCCCTATTTGATTATTTTATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAG
2400
GAAGGACGAACACCTCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCAAACTTTTAAT
2460
AAAGTGAAGTGGTATTTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCCAAAGGAACTGATCAG
2520
CAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTTATTGAATGTGGAGCTCCTCGA
TGATGATTAAAATGTGAACCGTCCAAATTTGCAGTCATTATATGAGCGTATCTATTATCT
3480
ACTATCATCATCTTTGAGTTATTAATATCATCTACTTTAGAATTGATAGGAAATATGAAT
3540
ACCTTTGTAGTAATATCTATACTATCTACACCTAACTCATTAAGACTTTTGATAGGCGGC
3600
CGCGAGCTC
3609
(2)SEQ.ID.NO.12的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:53个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述:
CATCATCATGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGACGTGGCCAAGGAGGCG
53
(2)SEQ.ID.NO.13的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:40个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述:
TACTACTACGTCGACTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG
40
Claims (8)
1.(a)PCV-2免疫原和(b)药学可接受载体、赋形剂或赋形药在配制组合物中的用途,所述组合物用于预防或治疗猪的与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,其中,所述PCV-2免疫原是含有并体内表达PCV-2ORF13的第一DNA质粒载体。
2.根据权利要求1的用途,其特征在于该PCV-2是保藏在ECACC并具有保藏号V97100217的Imp999、保藏在ECACC并具有保藏号V97100218的Imp1010、保藏在ECACC并具有保藏号V98011609的Imp1011-48121或保藏在ECACC并具有保藏号V98011608的Imp1011-48285。
3.根据权利要求1的用途,其特征在于该PCV-2是保藏在ECACC并具有保藏号00012710的1103或保藏在ECACC并具有保藏号00012709的1121。
4.根据权利要求1-3之任一项的用途,其特征在于该免疫原与佐剂一起进行配制。
5.(a)PCV-2免疫原和(b)药学可接受载体、赋形剂或赋形药在配制组合物中的用途,所述组合物用于预防或治疗猪的与PCV-2相关的心肌炎和/或流产和/或宫内感染,其中所述PCV-2免疫原是含有并体内表达PCV-2ORF13的第一DNA质粒载体和含有并体内表达PCV-2ORF4的第二DNA质粒载体。
6.根据权利要求5的用途,其特征在于该PCV-2是保藏在ECACC并具有保藏号V97100217的Imp999、保藏在ECACC并具有保藏号V97100218的Imp1010、保藏在ECACC并具有保藏号V98011609的Imp1011-48121或保藏在ECACC并具有保藏号V98011608的Imp1011-48285。
7.根据权利要求5的用途,其特征在于该PCV-2是保藏在ECACC并具有保藏号00012710的1103或保藏在ECACC并具有保藏号00012709的1121。
8.根据权利要求5-7之任一项的用途,其特征在于该免疫原与佐剂一起进行配制。
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