HU229195B1

HU229195B1 - Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2

Info

Publication number: HU229195B1
Application number: HU0203834A
Authority: HU
Inventors: John Albert Saskatoon Ellis; Gordon Moore Belfast Allan; Brian Belfast Meehan; Edward Saskatoon Clark; Deborah Saskatoon Haines; Lori Saskatoon Hassard; John Humboldt Harding; Catherine E Charreyre; Gilles Emile Chappuis; George Steven Colombus Krakowka; Jean-Christophe Francis Audonnet; Francis Newtownards Mcneilly
Original assignee: Merial Sas; Univ Saskatchewan Saskatoon; Univ Belfast
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2013-09-30
Also published as: CN102416173B; WO2001016330A2; HUP0203834A3; EP1246920A2; AU782418B2; ATE527361T1; PT1246920E; AU2005220241A1; US6517843B1; JP2003513617A; CN102416173A; BR0014155A; EP1246920B1; CA2383367C; ES2376817T3; WO2001016330A3; KR20020068325A; PL353068A1; PL205130B1; DK1246920T3

Description

A találmány tárgyát eljárások és készítmények képezik PCV-2 által okozott miokardítisz (szívizomgyulladás), abortusz és méhen belüli (intrauterin) fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadási szindróma („post-weaning multisystemic wasting syndrome) patológiás következményeinek prevenciójára és kezelésére; továbbá eljárások a találmány szerinti készítmények előállítására, és reagenskészletek a találmány szerinti készítmények előállítására és a találmány szerinti eljárások végrehajtására.

adat

Seríáseredeíó eírkovfons-3-vel ítsszoeíáb fertőzések prevenciója

A találmány tárgyát sertések hörgőiben ás bélbolyhasbas a virusterhelés csökkentésére szolgáié DNSplazmtdvéktorok és/vagy készítmények képezik. Sertéseredetö ctrkovíra.s-2-ί (PCV-2) a közelmúltban azonosították olyan ágensként, amely következetesen asszociált a világ számos részében található sertáspopdációkbaa előforduló, elválasztás niání, ínttltisztszSémás sorvadást szindrómával (PMWS) (Alisa és mtsai., 1998; .Bilis és mtsai., 1998). Fertőzőit sertésekből származó PCV-2-lzölé.mmok genetikailag gyakorlatilag azonosak, és jól n-egkölöttböztethetők PCV-től (CCL33, PCV-l), amelyeket eredetileg azonosítottak az 1970-es években azonosítottak sem-citopattkos szennyeződésként: sertésveséből származó (PK/15) vese-sejtwnalban (Meeham és mtsai., 199$; Ttscher és mtsai., 1974). Természetesen szerzett vagy kísérletileg indukált PCV~2-fertőzést sertésekben klmikallag előrehaladott tömegveszteség, szapora légvétel, légzési zavarok és sárgaság jellemzik (Alias és mtsai., 199$; Allán és mtsai., 1999; Ellis és mtsai., 1998; Ellis és mtsai,, 1999). PCV-2-asfigénncl közvetlenül asszociált, szabad szemmel megfigyelhető, patológiás jellemzők közé tartozik limfadeuopátía, ínterstteiáiis penumonta, hepatitisz és nefiitísz (Áilart és mtsai., 1998; Allán és mtsai., 1999; Ellis és mtsai,, 1998; Ellis és mtsai., 1999). Lásd még WO-A-99/1E21.4,, WO-A,-00/81409., WO-A-99/297I7. és WO-A-99/29871.. számé nemzetközi közzétételi iratokat. PCV-2-t eddig még nem kapcsolták közvetlenéi abortuszhoz vagy károsodásokhoz vemhes sertésekben.

Tehát, eddig nem vetették tel, hogy a PCV-2. tniokarditlszí és/vagy abortuszt és/vagy méhen belüli fertőzést okoz.

Meglepő módon azt találtok, hogy PCV-2 körokozó ágense miokardftisznek és/vagy abortusznak és/vagy méhen belüli fertőzésnek, valamint elválasztás mást, multiszísztémás sorvadás! szindrómának.

DoSnfoió szerint, PCV-2-immusogétteu értitek élő, legyengített vagy inaktívak PCV~2-t, vagy PCV-2 alegységét (alegységeit), melyhez in vte-o ©xpresszlővai vagy emrskeíóvsl jutunk, vagy legalább egy', kérdéses epítópot tartalmazó fragmenst (frsgmenseket), melyet kémiai szintézissel vagy fo vttro rekombináns expresszióvai, valamfot a leírás szerinti vagy·· az ebben idézett vagy hivatkozásként szereplő közleményekben leírtak szerinti PCV-2-genom ís vivő szekvenciáját (szekvenciáit) vagy·' fragmensét (fragtnenseit) vagy epxtőpjáí (epítópjaít) tartalmazó és expresszálni képes rekontbmáns vektorokkal lehet előállítani.

Hasonló definíció érvényes más, sertéseredetü patogénböi származó immnnog:én.re.

Definíció szerint, ímmnnogen készítmény lokális vagy szisztémás immunválasz képes kiváltani. Vakctnakészíimény lokális vagy szisztémás, protektív választ képes kiváltai}. .Az „immanogétt készítmény” kifejezés jelentése „vakcioakészíttnény” (mint ahogy az első kifejezés jelentése lehet protektív készítmény),

A találmány egy első szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy első UNS-plawidvektor, amely tartalmaz egy olyan első -mkleotid-szekvencíáí, amely legalább 95%-ban azonos az ImplOlö jelű PCV-2 törzs ORJPTS-ával, sertés hörgőiben és bélbolybtubm· a PCV-2 vírasterbelés· csökkentésére történő alkalmazásra.

A találmány egy második szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy immnnogén készítmény, sertés hörgőiben és béibolyhaíban a PCV-2 virusterbelés csökkentésére történő alkaltnazásra, ahol a készítmény tartalmazza a következőket;

a) egy első DNS-plszmidvekíort, amely tartalmaz egy olyan első nukleotid-szekvenciát, amely legalább

95%-ban azonos az ímplölö jelíl PCV -2 törzs öRFIS-ával, és

Aktaszámünk: 96428-14192/PA

5) gyógjáswifog wgy áilaígyógyászstiiag elfogadható hordozót és/vagy vektort és/vagy ezcipienst és/vagy adlnvánst.

A találmány egv harmadik: .sxexapontja szerint a találmány tárgyét képezi

a) egy első DNS-plazmidvektor, amely tartalmaz egy olyan ebé nnkieedid-szekveneiát, amely legalább 95%-baa azonos az ímpl Öld jelé PCV-2 töm ÖRFB-ávak és

h) gyógyászatílag vagy áliatgyőgyészaíliag: elfogadható hordozó és/vagy vektor és/vagy ©sapiens és/vagy adjnváns alkalmazása sertés hörgőiben és bélfeolyhaihan a PCV-2 vímsterhelés csökkentésére történő alkalmazásra szolgáló feraunogén készítmény előállítására.

A találmány egy negyedik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy első DNS-plazmldvektor, amely tartateaz egy olyan első nakleotid-szekverseiát, amely legalább 95%-baa aztrnos· az lm.pl öld jelű PCV-2 törzs ÖRF13-ával, valamint: egy második DNS-plazntídvektor, amely tartalmaz egy olyan második nukleotid* szekvenciát, amely legalább 95%-ban azonos az ImplOlÖ jelű PCV-2 törzs -ORF4-évol, sertés hörgőiben és bélholyh&ihan a PCV-2 virasterhclés csökkentésére történő alkalmazásra.

A találmány egy ötödik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy imsmsnogén készítmény, sertés hörgőiben és béibolyhaiban a PCV-2 virttsterheles csökkentésére történő alkalmazásra, ahol a készítmény tartalmazza a kővetkezőket:

a.) egy első DNS-plazmidvektort, amely tartalmaz egy olyan első nokleotíd-szekvenciát, amely legalább 95%-haa azonos az ImplOlÖ jelű PCV-2 törzs ORf I3~ával,

b) egy második DNS-piazsnidvekror, amely tartalmaz egy olyan második nakleotid-szekveneiát, amely legalább 95%-bnn azonos sz ImplOlö jelű PCV-2 törzs öRF4~évsi, és

«) győgyászaíílag vagy állatgyógyászaiilög elfogadható hordozót és/vagy vektort és/vagy excipienst és/vagy sdjravánst

A találmány egy hatodik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi

a) egy első DNS-plazmídvektor, amely tartalmaz egy olyan első nakleotid-szekveneiát, amely legalább 9574-ban azonos az Impl.ÖKl jelő PCV-2 törzs ORF13~ával,

b) egy második DNS-plszmidvektor, amely tartalmaz egy olyan második .nakleotid-szekveneiát, amely legalább 9574-ban azonos az hnp t Olö jelű PCV-2 törzs ORP4-ével, és

c) gyógyászatílag vagy állatgy'ógyászatilag elfogadható hordozó és/vagy vektor és/vagy exeipiens és/vagy adjijváns alkalmazása sertés hörgőiben és hélb&lyhsihan a .PCV-2 vírtísterheiés: csökkentésére történő alkalmazásra szolgáló immanogérr készítmény előállítására.

A találmány egy hetedik szempontja .szerint a találmány tárgyát képezi az első platinád a találmány első szempontra szerinti alkalmazásra; az imsmnogén készítmény a találmány második szempontja szerinti alkalmazásra;: az első plazmid alkalmazása a találmány harmadik szempontja szerint; az első és második plazmid, a találmány negyedik szempontja szerinti alkalmazásra; az íannnnogén készítmény a találmány ötödik szempontja szerinti alkalmazásra; vagy az első és második plazmid alkalmazása a találmány hatodik szempontja szerint;

ahol az első nnkleolid-szekveneia megegyezik az Implőlö-törzs ORFld-ának szekvenciájával.

A találmány egy nyolcadik szempontja szerint a.talá&náay tárgyát képezi az első és második plazmid, a találmány negyedik vagy hetedik szempontja szerinti alkalmazásra; az immusegén készítmény a találmáuy ötödik vagy hetedik, szempontja szerinti alkalmazásra; vagy az első és második. plazmid alkalmazása a találmány hatodik vagy hetedik szempontja szerint;

ahol a második makieodd-szekvencia megegyezik az ImplölO-tőrzs 0RF4~ének szekvenciájával.

Tehát, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tisztük ki eljárások kidolgozását és/vagy készítmények előállítását PCV-2 által okozod miokardítisz és/v&gy abortusz és/vagy méhen béliül fertőzés, valamint elválasztás ntásü, muíííssísziémás sorvadás! szindróma és/vagy patológiás következményeinek prevenciójára és/vagy kezelésére; és eljárások kidolgozását ilyen készítmények formázására (amely készítmények tártálmázhatnak sertéseredetű parvovírasg száz PPY-t is immunogénként) és PCV-2-íímmmogén alkalmazását ilyen készítmények formázására.

A. találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célai tűztük ki ECV-z-immunegének alkalmazását miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, prevenciójára és/vagy kezelésére szolgáló készítmények előállítására,

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célul tűztük ki új, 1103- (1103/1 P.2) és 1121-jeiö (1121/1 P.i) PCVüörzsek izolálását és jellemzését, és alkalmazásokat immursogének valamint diagnosztikai célokat szolgáló antigének és ellenanyagok előállítására, PCV által okozott miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, nmltiszísztémás sorvadást szindróma és/vagy patológiás következményeivel kapcsolatban.

A találmány tárgyát képezi nőstény sertések (például kocák, emse malacok) beoltása (legalább egy) PCV-2-ímmunogést tartalmazó készítménnyel (amely készítmény tartalmazhat sertéseredetű parvovíhtsMl származó immunogént is) tenyésztés előd; és/vagy hágaíás előli, és/vagy kihordás (vagy vemhességj alatt; és/vagy a születés időszaka vagy elles előtt; és/vagy Ismételten az élet folyamán, PCV-vd asszociált, miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadást szindróma, és PCV-2-vel. asszociált, más patológiai következmény prevenciójára; vagy immunogén vagy protekíív válasz kiváltására PCV-2-vel szemben, és ezáltal elválasztás utáni, maídszíszíémás sorvadás! szindróma és/vagy sertéseredetü cirkovlrus-2-vel asszociált miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, és/vagy PCV-2'vei asszociált, más patológiai következmény prevenciójára.

Előnyösen legalább egy oltást adunk a hágaíás előtt. Ezt előnyösen egy másik oltás követi a kihordás alatt, például a kihordási idő közepe körül (körülbelül ő-S hetes vemhssségnsl) és/vagv a kihordási idő végé» (körülbelül 11-13 hetes vemhességsél). Tehát a találmány szerinti, előnyös rend szerint etek. a hágatás előtt és ismétlő oltást adunk a vemfeesség alatt, Ezután újabb oltást lehet adni minden egyes hágaíás előtt és/vagy a kihordási idő alatt, a kihordási idő közepe kőről (köriüheiül 6-8 hetes vesnhcsségnél) és/vagy a kihordási idő végén (körülbelül 11-13 hetes vemfeességuél), Az újraoitast előnyösen csak a kihordási idő alatt végezzük,

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, malacokat, például oltott nőstényektől (például a leírás szerint tárgyalt módon oltott) származó malacokat oltunk életük első heteiben, például életük első és/vagy második és/vagy harmadik és/vagy negyedik, és/vagy ötödik hetében. Előnyösebben, a malacokat először első hetes korukban vagy háromhetes korukban: (például az elválasztásnál) oltjuk. Sőt, még előnyösebben, ilyen malacoknak azután (az első oltás után) kettő (2) és (4) négy hét közötti időtartam elteltével ismétlő oltást φφ

adunk, Tehát, atód malacot valamint nőstény sertést (például teák, «mse malacok) «gyaíánt be lehel oltási a találmány szerinti készítményekkel és/vagy alá lehet verni a találmány szerinti eljárásoknak.

Tehát a találmány tárgyát képezik 1/IÖ3- ás I121-isid PCV-törzsekböl származó Immnnogéneket tartalmazó Inununogén vagy vakcte-készíimények sertáseredetS cirkovírus-2-vel asszociált, msokarditísz és/vagv abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, rmdíisziszfemás sorvadást szindróma, és PCV-2-vel asszociált, más patológia! következmény prevenciójára és/vagy kezelésére.

Továbbá, a találmány tárgyát képezik PCV-hmmmogéa alkalmazása sertéseredeiu drkovíras-2-vel aszszoeíáh, mfokarditisz és/vagy abortusz és/vagy méhes belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, msklszisztémás sorvadás! szindróma, és PCV«2'-vel asszociált, más patológiai következmény prevenciójára és/vagy kezelésére szolgáló, tmmsmogén vagy vakcmakászímfeny formázására.

Továbbá, a találmány tárgyát képezi még olyan immusngéo vagy vakcina-készítmény PCV-2-áiíal okozott miokardidsz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés és/vagy elválasztás utáni, tnultlszisztémús sorvadás! szindróma prevenciójára és/vagy kezelésére, amely gyógyászatilag vagy állsí-gyógyászatilag elfogadható hordozót és/vagy vivőanyagot és/vagy segédanyagot és/vagy adjuvánsl, és PCV-2-ímmun.ogént tartalmaz.

A készítmény tartalmazhat továbbá legalább egy további sertéseredelu pafogénből, például sertésben előforduló, reproduktív és respirációs szindróma (PKRS) vírusából, Afvcoptema ted’/íesmon/ífehől, dcrtnoóoer/fos j^e»r<^«g«w:cmá3éb6l₅ £. te/ból, Aor/te/fe fomnehhepZícaből, PasteureÍte wa/meteból, Agxfjmfo/bm rtefopmhfoből, Pseodorahies, sertéskölera, seríésinfluenza kórokozójából és sertésben előforduló parvovlrasból származó, iegalább egy hmnanogétJt. Tehát, vektor-alapé készítmények legalább egy további, sertéseredetü pafogénből származó, legalább egy ímmunogént tartalmazhatnak, például ebből a psfogáabői származó szekvenciát expresszáfoi képes vektort, amelyben a vektor lehet FCV-2-immunogént expreszszáloi képes vektor, PCV2-s2Í«v«rtsiát expresszáfei képes vektor tartalmazhat PCV-2-szekvendáí vagy fragmenst;: és a találmány tárgyát képezik Ilyes sukleissavmcdekulák, azokat tartalmazó vektorok, ilyen mskiemsavmoleteáfeú vagy ilyen nuklefosávmoiekalákbóí származó, vektorral expresszált termékeket tartalmazó készítmények, ilyen nukleissavmolekuiáknak megfelelő expressziős termékeket, próbákat vagy* láocindltö öligomskleotidokaí tartalmazó készítmények, és eljárások a fentebb leírtak bármelyikének vsgy valamennyinek előállítására,

A vektor tartalmazhat DNS-vektorpfeznüdoí, baktériumokat, például .£, eo/d, vírust, például baeuiovlrost, herpeszvimst, például sertésből származó herpeszvírusokat, beleértve Aajeszky-féle betegség vírusát, adenovírnst, beleértve sertésből szájmeze aáenovúust, him.íővírnst, beleértve tehénhimlő-virust, madárhiínlő-vfest, kanárihimlö-vírnsí, mosómedve-himlő vírusát és sertéshitniő-virusk és hasonlókat,- A vektor-alapú késziímények tartalmazhatnak olyan vektort, amely FCV-2~bői, előnyösen a leírás szerint azonosított bármelyik PCV-2-törzsbŐl, és különösen a Í1G3- étvágy 1121-jelü törzsből származó, ORFÍ-ÖRFI3 közöl bármelyik ÖRF-et tartalmazza és képes azt expresszálsi, például OR.F4-, GS.F7-, OKFTS- és ÖRFía-st; előnyösen ORF4-et és/vagy ŐRT 13-sí, A készítményekben lévő immunogéuí (PCV-2-ί és/vagy már sertésomdeíő patogént) lehet rekombínánssn termeltetni,

A plazmld kifejezésen a leírásban bármilyen DNS-transzkripcíós egységet, értünk poiínnkfeotídszekveneia formájában, amely az expresszálandő PCV-azekveneíái tartalmazza. A plazmld előnyösen exprossziojához szükséges elemeket tartalmazza; például ó? vivő expressziójához, A cirkuláris plszmid-forma előnyös, szöperheilkáb'ssn vagy másképpen; lineáris fonna is a találmány által igényelt oltalmi körbe tartozik, A

piazmid-immunogén- vagy plszmid-vakema-késjdtoésyt be lehet adni gépágyúval, Intoadertnáksan ttl xsélküli bjektoron kérésztől, szubkutá® vagy mtratnuszkulárisan, vagy mukozáhsao, vsgy bátmllyw más módszerrel, amely lehetővé tesz ót vivő expressziek és előnyösen immnegén vsgy protektív választ.

Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti megoldásban, vektorokkal vagy fekí?mhinánsokkal előállított, expressziős terméket, izolálni és/vagy tisztítani Is lehet fertőzött vagy transzfektált sejtekből; például sertéseknek való beadásra szolgáló készítmények előállítására; azonban bizonyos kőrtilmésvek között előnyös lehel nem izolálni és/vagy iásztlianl az expressziős terméket a sejtből; például, fea a sejt vagy részlete fokozni képes a poHpeptid immunogén hatását. Pehérjefezíitásra és/vagy izolálásra szolgáló technikák jói Ismertek, és a találmány szerint, felesleges kísérletezés nélkül lehet azokat alkalmazni PCV-2 és/vagy más, sertéseredetü patogénbőí származó, rekombiaáus vagy vektorral expresszáit termékek és/vagy alegységeinek tisztítására és/vagy izolálására; .ilyen technikák lehet általában: a kérdéses fehérje különböző sókoncentráciőknál fennálló szohíbilitásájiak előnyét kihasználó kiesapás, kíesapás szerves oldószerekkel, polimerekkel és más anyagokkal, síftnitás-kíusapás és .szelektív denaturáeió: oszlopkrotnalográfta, például nagy hatékonyságú oszlopkromatográfía fHPLC), ioncsere, affinitás-, úmmmoaőimtás- vagy festékhgandajxsot alkalmazó fcronxsiogrsfsa; ímmmunpreoípiíáoiö, gélszSrés, eíektroíoretikas m&teerek, ultraszőrés és izoeíekönmos fókuszálás és kombi· nációik, többek között.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások seríéseredetü elrkovírus-2 (PCV-2) által okozott, miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés és/vagy elválasztás utáni, tnuitiszisrtémás sorvadás! szindróma és/vagy RCV-2-vd asszociált, más patológiai következmény prevenciójára és/Vagy kezelésére, amelyekben irrammogén vagy protekiív választ: indukálunk PCV-2-ve! szemben sertésben, amelynek során beadónk a sertésnek fentebb említett és találmány szerinti készítményt.

Tehát, a, találmány tárgyát képezi eljárás sertéseredető cirkovlrös-2 (PCV-2) által okozott, miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés és/vagy elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadást szindróma és/vagy PCV-2 asszociált, más patológiai következmény prevenciójára és/vagy kezelésére, amelyben imrmmogén vagy proíektív választ indukálunk PCV-2-vei szemben sertésben, amelyben beaáuak a sertésnek gyógyászatliag vagy áiíai-gyógyászsüiag elfogadható hordozót és/vagy wőanyagot és/vagy segédanyagot és/vagy aójovásst es hatóanyagként PCV-x-imsumogést; tartalmazó készítményt Az eljárás szolgálhat PCV-2 által okozott miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés prevenciójára, amelyben beadunk gyógyászatliag vagy· áiiat-gyógyászaíllag elfogadható hordozót és PCV-2~lmmunogéxtt tartalmazó készítményt. A PCV-2-maramogén lehet legyengíteti, élő, teljes PCV-2 vagy maktiváít PCV-2.· Áz eljárásban alkalmazhatunk olyan készítményt, amely uamunegéo- vagy vakeiuskészítmény. Az eljárásban alkalnsuzhatunk olya» készitményt, amely továbbá legalább egy- további ssrtésereöexs patogénbőí származó, legalább egy immunogént tartalmaz, például ilyen immunogént vagy' epitópot expreszszálni képes vektort; a legalább egy további sertéseredetü patogén származhat például RRKS-vírusből, AA-wg/maun /gOn.tteKmosíöbbóí, .rteó«í?öűtt///ns g/evrogoruímomsebói, £. eo/foói, Pseudorabíes, sertéskolera kórokozójából, Sonfeíeüo öronekísgorteöbői, .Piirteaívd/o ííröhöoáíűből, £í;ysw&.őtrtx rw/ogr-tt/rteból, sertésítthuenza kórokozójából vagy·· PPV-ból vagy ezek kombinációjából. Az eljárásban alkalmazhatunk vektort, amely DNS-vektorpíazmld, baktériumokat, például £. ceM, vírust, például baculovsust, herpeszvirust, beleértve Aujoszky-féle betegség vírusát, adenovímst, beleértve sertésből származó sáenovírosf, hbnlövírnsí, beleértve tehénhimlő-vírust, madárhimló-vírust, kanáφ*

rihhnlS-'Vhost vagy sertéshimlö-virust és hasonlókat. Az eljárásba® alkalmazhatunk vektor-alapú készítményt, amely egy további, seríéseredetö patogénből származó, legalább egy szekvenciái, fragmenst vagy epltöpot, vagy ilyen szekvenciát, n'agmensi vagy epitópot expresszaló vektort tartalmaz még, amelyben a vektor lehet« PCV-2ből. származó szekvenciát, fragmenst vagy epítópot expresszálö vektor. Az eljárásban alkalmazhatunk olya® vektort, amely az 1-13. ORF-ek közül, példád a 4., 10. és 13. ORF-ek közül az egyik ORF~et; előnyösen a 4.

és/vagy 13, ORF-eí tartalmazza és képes azt exprcsszáíni. Az eljárásba® aikaimitzbabínk immt:nogés-alapú készíirtteny·, amelybe® egy vagy több ímmunsgén rekornbinánsa® w lenneltelve. Ebben az eljárásban előnyösen kocákat és/vagy malacokat oltenk a fentebb leírtak· szériát.

A találmány egy másik előnyős megvalósítási módja szerint, a ;aiáir®á®y tárgyát képezi eljárás a fentebb említett vagy találmány .szerinti, bármely készítmény előállítására, amelyben összekeverünk gyógyászaiilag vagy áHat-gyógyászatílag elfogadható hordozót és tehetséges adjavánst a PCV-2-intmunogést. Az eljárásban továbbá sejtet vagy gazdaszervezetet transztektáiunk vagy fertőzünk FCV-2-ííuoumogé®t kódoló DNS-t tartalmazó rekomblnáns vektorral, és expresszijük az hmnanogént; és adott esetben tisztítják és/vagy izoláljak az ímxnunogént a sejtből. Ebhez, hasonlóan, az eljárásban a PCV'-2-imtmmegént FCV-2-ből izolálhatjuk és tisztíthatjuk, vagy egy mintából izolálbatonk PCV-2-t.

Színién a találmány tárgyát képezi reagenskésztet bármely fentebb említett vagy találmány szerinti készítmény előállítására, vagy bármely fentebb említett vagy találmány szerinti eljárás végrehajtására, amely egy·· első edényben győgyászatilag vagy' áilat-győgyászatílag elfogadható hordozót vagy vivőanyagot vagy segédanyagot, és egy második edényben PCV-2-smanogéöt tartalmazó hatóanyagot tartalmaz, ahol az első és a második edényt együtt csomagoljuk, és a reagenskéazlet adott esetben utasításokat tartalmaz a készítmény alkotórészeinek összekeverésével és/vagy a készítméuy beadásával kapcsolatba®.

A találmány tuég egy másik előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás a fentebb említett vagy leírás szerinti bármely készítmény beadására hím és/vagy nőstény sertéseknek; FCV-2 átvitelének prevenciójára, és sertéssreöefú cíífcovíms-2-vel asszociált miokarditisz és/vagy abortusz és/vagy· méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszísztémás sorvadást szindróma és/vagy PCV-2-asszociált, más patológiai következmény prevenciójára -vagy kezelésére vagy leküzdésére. A beadást előnyösen a fentebb leírtaknak megfelelően végezzük.

A. leírásban a „tartalmaz” kifejezés jelentése lehet „beleértve”, vagy lehet az. USA-beli szabadabni törvényében általánosan megadott „tartalma?.” („cnraprising”) kifejezés jelentésével azonos.

A találmány szerinti megoldás más vonatkozásait (melyek szintén as: igényelt olfeksi körébe tartoznak) a leírás további részében ísinerteöük, vagy a?, ismertetettek alapján nyilvánvalókká válnak.

A sertéseredetá cfrfeovlnts-2 (FCV-2) elválasztás utáni, osdtí,szisztémás sorvadást szindrómával (FMWS) asszociált: sertéspopuláclökban. Az 1. és 2, példákban bemutatottak szerint, PCV-2-vel asszociált betegség potenciális spektrumát kiterjeszd a ayílvfevaló vertikális átvitel és a? asszociált reproduktív károsodás.

Az l. példában konkrétan leírjuk PCV-2 izolálását aboriáit malacokból álló csoportból, amelyek olyan farmról származtak, ahol kései abortuszokat és halva születéseket tapasztaltak. Súlyos, diffúz miokarditisz volt jelen az egyik olyan malacban, amely PCV-2-re intenzív ímmunhisztokémiai festéssel volt társítható. Változó mennyiségű P€V~2-aníigén volt több magzat májában, tüdejében és veséjében. Más ágens jelenlétét nem lehe tett kimutatni, amely magzati károsodásokkal és abortusszal asszociált sertésben, például seríéseredetö: parwvlrttst,

sertéseredeíü reproduktív respirációs szindróma vitását enkefalomiokarditisz vírusát és eaterovkast

A 2. példába» koakréta» bemutatjuk, hogy négy év alatt leadod, 39, jó egészségi állapotba® lévő tenyészetből származó, abortusszal vagy reproduktív károsodással asszociált szövet «kín tesztelésének eredménye pozitív volt PCV-2~re két olyan minta esetén, amelyek számos halva született malaccal és életképtelen újszülött malaccal voltak kapcsolatba hozhatók, súlyos, difíöa: mlokardffeszel, szívhipertröfiával és nyilvánvaló krónikus passzív vértofeí Ássál. A két pozitív msittt ugyanarról a farmról származott, de a mintavétel időpontja különböző volt. Az említeti károsodással sújtod malacok szívéből származó és más szövetekben PCV-2 jelenlétét rmmunohisztokémiávai és vlmsizolálással igazolóak, Sertéseredetü elrkovifust nem detektáltunk reproduktív károsodással járó esetekben 1999 előtt endemikus fertőzéssel sújtott területeken, ami alapján feltételezzük, hogy a reproduktív betegség PCV-2-fertŐzés új klinikai megnyilvánulása, és továbbá feltétefezzük, hogy szexuális, valamint vertikális átadás felelős a vírus terjedéséért a sertéspopuláeiőbsn.

Ennek megfelelően, sertések, például nőstény sertések, például kocák vagy emse malacok oltása legalább egy PCV-2-immunogént (például amely az alábbiak közül legalább az egyikből származik: l'mplööS, ImplOlÓ, imp999, Imp I öl I-4&2S5, ímpi9l 1-48121, 1103 és 1121) tartalmazó késziteénsyel (amely készítmény legalább egy immtmogéat tartalmazhat legalább egy másik, sertésben előforduló patogénből is, például legalább egy', sertésben előforduló psrvovúusból, amely esetben, ha vektort alkalmaznak, a vektor mindkét PCV-2-immuoogént koexpresszálhatja, és legalább egy másik, sertésben előforduló patogéoből származó, legalább egy ímmonogént, például többek között PPV-mmumogént tartalmazhat), különösen a fentebb leírt immunizálási rend szerint, képes PCV-2-veí asszociált miokardítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, mtritiszisztémás sorvadást szindróma és PCV-2-asszöc'iáH, más patológiai következmény prevenciójára.

Tehát a találmány tárgyát képezik eljárások ós készítmények PCV-S-lmmusogén alkalmazásával sertéseredetű eirkövfeus-2-vel asszociált míokarditlsz és/vagy abortusz és/vagy métísa beföli fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszisztéiüás sorvadást szindróma és/vagy ECV-2-asszociált, más patológiai következmény prevenciójára, Különösen 1103- és/vagy 1121-törzsből származó tmmunogén megfelelő FCV-2~immunogént alkalmazó eljárásokban és készítményekben sertéseredető eírkovhüS-2-vel asszociált tníöksrdíiisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés prevenciójára,

A találmány tárgyát képezi bármilyen, ismert ECV-2-íörss vagy abból származó tmmunogé® alkalmazása PCV-2-vel asszociált tniofcaráítisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadást- szindróma és/vagy PCV-2-vel asszociált, más patológiai következmény prevenciójára vagy kezelésére szolgáló, immunogén vagy' vakcín&készítntény formázására (ilyen törzs lehet az implöőg, Implölö, b®p999, ImplOl 1-48285, lmplOU-48121, 1103 vagy' 1121), különösen, Ira a készítményt malacoknak, például oltok nőstények malacainak, és még inkább, ha nőstény sertéseknek, különösen vemhes kocáknak, vagy olyan kocáknak tervezzük beadni, amelyek hágatás előtt vannak; és meg inkább a fentebb meghatározott oltási terv' szerint.

Konkrétabban, az alkalmazás ilyen készítmények formázására vonatkozik, amelyeket PCV-2-vei «szociák miokardkisz és/vagy abortusz és/vagy méhen belüli fertőzés, valamint elválasztás utáni, multiszlsztémás sorvadást szindróma és/vag? PCV-2-vei asszociált, más patológiai következmény prevenciójára vagy kexslésére szándékozunk alkalmazni, különösen, ba a készítményt malacoknak, például oltott nőstények malacainak, és « X még inkább, ha nőstény sertéseknek, különösen vemhes kocáknak, vagy olya®: kocáknak tervezzük beadni, amelyek. hágaiás előtt vannak; és még inkább a fentebb definiált oltási terv szerint.

Az említett, legalább egy másik sertéseredetü patogésfeől származó, legalább egy imsnmsögéa lehet olyan, mini amelyeket az ismert, sertéseken alkalmazott vakcinákban vagy immunogén készítményekben vagy a WO- 98/03658, aeáxnó nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint alkalmaznak.

A találmány szerinti készítményeket állatorvos-tudományban és gyógyszerészetbea jártas szakember által jól ismert standard technikák szerint lehet elöáilitam. Ilyen készítményeket dózisokban lehet beadni, állatorvos-tudományban jártas szakember által jól ismert technikákkal, figyelembe véve olyan iáktorokaí, mini kor, nem, tömeg, fej és a sertés állapota és· adott, alkalmazott kezelés és a beadás módja. A készítményeket be leltet adni egyedid., vagy be lehet adni együtt vagy egymás után más, találmány szerinti készítményekkel (például PC V-sntmmogéat tartalmazó, más készsíniényekkel). Tehát szintén a találmány tárgyát képszik mnkivaless vagy „koktél” vagy kombinációs készítmények, és ilyeneket alkalmazó eljárások. Ebben a vonatkozásban hivatkozunk az 5,843,456; számó CSA-belí szabadalmi leírásra, melyet a fcitanttás részének tekintitek, és amelynek tárgya veszettség elleni készítmények és kombinációs készítmények és esek alkalmazásai,

A találmány szerinti készítményeket parenferálls vagy mukozális beadásra lehet alkalmazni, előnyösen hiíradermálísan vagy intrajnoszkrslárisan. intradermáhs beadás különösen injekcióval: történhet, tó nélküli tejektor alkalmazásával. Ha mukozális beadást alkalmazunk, ez lehet orális, nazális vagy okuláris.

ilyen készítményekben az immnnogén(ek) keverve lehetnek alkalmas hordozóval, hígítőszerreí vágj' segédanyaggal, például steril vízzel, fiziológiás náinum-klorid-öldattal, glükózzal és hasonlóval, és/vagv előnyösen. adjövártsssl. A készítményeket lehet iioriiizálm vagy fagyasztani is. A készítmények tartalmazhatnak segédanyagokat, példáid pH-puíTérelö ágenseket, adjuvánsokat, tartósítószereket, polimer-segédanyagokat mukozális beadásra, és hasonlókat, a beadás módjától és a kívánt készítménytől függően.

Standard kézikönyvekben, példán! „EEWHGTONE PHARMACEVTICAL SCIENCE”, 17. kiadásában (1985) lehet tttánanézni atmak, hogy lehet alkalmas készítményeket preparálni felesleges kísérletezés nélkül. Alkalmas dózisok előállítása a lentebb leírtukra és az idézett közleményekben leírtakra is alapulhat.

Az adjuvássok olyan anyagok, amelyek immunogénekre adott ismrmnválaszl képesek fokozni. Adjttváns lehet: például alamininm-líídrosid és ahmuniüra-foszBí, szapomnok, például Qoil-Á, „víz az ólaiban emulzió, „olaj a vízben” emulzió, „vfz-olajbm-vfebeo'' emulzió. Az etnuizíö különösen könnyű, folyékony paraffinolajra alapulhat (European Pharmaeopea típus); ízoprenoldoíaj, például szkvaiáo vagy szkvalés; alkenek öiígomerízáerójsvai keletkezett olaj, knlösósen ízobutén vagy dókén; linerális aikilcsoportot tartalmazó, savak vagy alkoholok észterei, különösen növényi olajok, etil-oleáí, pKg>iiéo-ghkol-di(kaprilátAaprái), giiceriltrifkaprilát/kaprát) vagy propilén-glikol-dioteát; elágazó láncot tartalmazó zsírsavak vagy* alkoholok észterei, különösen izösztearmsav-észíerek. Az olajat kombinációban alkalmazzuk emulgeátorokkai esmdzió kialakítása céljából, Az emulgeátorok előnyösen nem-ionos féiöletoktív anyagok, különösen szorbitán, mausld (például anhidromaonítöl-oleát), glicerin, poliglicerín, propilöo-giikol és olajsav, izosztesrinsav, ricteusolajsav vagy hidroxi-sztearinsav észterei, amelyek adott esetben etoxiláiva lehetnek és poíioxipmpilén~pi>líoxietilénkopolimer-b.lokkok, különösen .Plur00ie@-ter.inek.ek, főleg 1,121. Lásd Hunter és munkatársai, „The Theory and Prsctical Application of Adjnvants” (szerk, Stetvart-Tulí, D.E.S.), John Wifey and Sons, NY, 51-94 (1995) és Todd és munkatársai, Vaccine .15, 564-570 (1997),

Λ*· * »♦ * * *

Φ Φ *·* *

Φφ ♦ « X *

ΦΦΦ

Péidáal lehet SET-emulziót alkalmazni, melyet a „Vaccine Design, The Subánk and Adj avast Approach” eusú könyv (szerk. M, Bovveil és tel, Newtek Elenam Press, 1995) 147. oldalán írnak le, vagy MF59-snmhdót tehet alkalmad, «Ivet ugyanebben a .könyvben, a 183. oldalon imák le.

Az adjuváss-ttatatete vakcinát péidáal; az alábbiak szettet lehet előállítani: az hmmmogént tartalmazó 67 térDte vizes fázist enmlgeáljuk 2,3 vegy«s% 11 EÖ-val (etllén-oxiddal)· -etoxilált olsúsavval és 28,1 térf.% könny» -parafltoelajjsl (Eis-opesm Pharmaeopes típus) enralgeálő ítithoatixer segítségével;

Az emulzió elkészítésére szolgáló, alternatív módszerben nagynyomású bomogenizátoron való kinyomással emulgeálunk 5 vegy«$% szfcvalání, 2,5 vegye.s% Plaronic®L121~et, 0,2 vegyes% olajsav-észtert és 20 EO~val etoxiláií aahidroszorhiteft, 92,3 térf.%. temwnogéníartalmú, vizes fázist tartalmazó keveréket.

Ki lehet szerelni ezeket továbbá szintetikus polimerekkel [például tejsav és glikoisav homo- és kopoiimerjeivel, amelyeket olyan mikrorészecskék előállítására tehet álkateazsn, amelyek kapszulába zárják az ímmsmogéneket, lásd Elridge és mtsai, Moh teananoi 28, 287-294 (1993), például bloiőgisilag lebontható mikrorészecskékbe], cítokínekkel, például ΙΕ-2-vei és lL-12-vel (lásd például az: 5,334,379. számú USA-feeli szabadakra leírást) és GMCSF-d, előnyösen sertésből származó GMCSF-e) [grasulodts íuakroiág-kolóidastimulálö faktorral; lásd általánosságba» a 4,999,291. és 5,401,663, számú ÜSA-beli szabadalmi leírásokat; lásd még Clark és mtsai., Science 236, 1229 (1987); Grant és mtsai., Drugs 53, 516 (1992)], többek közön. Bizonyos aájuvánsokat te vivő lehet expresszáíra únmunogéuBeí (immtmogénekkeí) és/vagy epiíóppal (epltépokkal); például -ciíokihéket, GMCSF-t (lásd például temaru és T&ksmats», Immunoi. Célt Bioi.. 73, 474-76 (1995), amlely sertóseredefü GM-CSF-et kódoló -és expresszátei képes plazmáidra vonatkozik].

További adjuváns lehet például az alábbi vegyületek egyike; akrii- vagy metakrilsav polimerei és maleins&vashidddbö! és alkejól-származékáből álló kopolteierek. Előnyösen alkalmazható adjuváaskomponensek akrii- vagy metakrilsav politeegei, amelyek keresztkötööek, különösen cukrok vagy ponslkoholok polalkej’il-étereível. Ezek a vegyületek „karbomef” néven is ismeretesek (Pharmeuropa 8. kötet, 2. szám, 1996. június). Szakember .számára hivatkozást jelenteni a 2,909,462. számú USA-beli szabadalmi leírás, amelyben leírtak szerint ilyen akríl-pehisereket kereszíköisete olyan polSódroxilált vegyülsitel, amely legalább 3, előnyösen S-nál kevesebb tódroxliesoportel rendelkezik, és legalább három hidroxil bidrogéoatomjsí helyettesítve vaunak legalább 2 saénatomós, telítetlen alifás gyökökkel. Az előnyösen alkalmazott gyökök olyanok, amelyek 2-4 szénatomot tartalmaznak, például νίηίΐ-, aliil- és más, etiten-jeítegto telítetten csoportok· A telítette» gyökök maguk is tartalmazhatnak más szubsztituenseket, például metilesoportot. A CatbopoW (BF Goodrich, Ohio, USA)- néven forgalomba hozott termékek különöseit «gfetelóek. Ezek aliii-szaeitarózzal vagy aliilpentaerittitoilai vannak keresztkötve, Közölök meg lehet említeni a Carhopoí® 974P-t, 934P-t és 971P-1. Malemsavanhíöriöhöl és alteenii-származékáből álló kopoiimerek közöl az EMA® (Monsanto) kopoiimerek előnyösek, amelyek raaleínsavanbidrld és etiléit kopoimterjei, lineárisak. vagy keresztkötötíek, például dívíniléterrei keresztkőíőttek. Hivatkozásként lásd J. Fíelds és munkatársai. Natúré 186.778-786 (1966),

Szerkezetükből kiindulva, akrii- vagy metakrilsav polimetjei és EMA® kopoiimerek előnyösen az alábbi általános képlető alapegységekből épülnek fel;

Κϊ φ* * ♦ φ * * φ φ**φ * «*φ φ *#»

Rt

Rj

C - (CH?

COOH

3ΟΟΗ amely képletben .Rt és K₂ azonos vagy kölőnböző, jelentésük hidrogénatom vagy fnetilcsoport; x ~ 0 vagy- i, előnyösen x - 1; y = 1 vagy 2, ahol x + y ~ 2.

EMA® kopolimerekre χ - Θ és y-2. Karbon-erekre x ··=* y - '1.

Ezea polimerek vízben való oldódása savas oldathoz vezet, amelyet semlegesítsük, előnyösen fiziológiás pH-ra abból s célból, hogy előállítsunk adjuváos-oldatot, amelyhez a tényleges vakcinát hozzáadjuk. A polimer karixmlcsoportjaí azután részben CGO-tatában vaunak..

A találmány szerinti adjuváos-oídatot, különösen karbontsr esetés,, előnyösen desztillált vízben készítjük el, előnyösen nátrium-klorid jelenlétébe», az így kapott oldat savas pH-jű. Ezt a törzsoídatot hígítjuk ügy, hogy hozzáadjuk azt kívánt mennyiségű (s kívánt végkoncesffácló elérése céljából) NaCI-ot tartalmazó vízhez, vagy annak lényegi részéhez, előnyösen fiziológiás náírium-kloriá-oldatboz ($ g/1 bíaCI), egyszerre vagy néhány adagban, egyidejűleg vagy azt követően semlegesítjük (pH 7,3-7,4-re), előnyösen NaOH-val Ezt az oldatot fiziológiás pH-η. alkalmazzuk úgy, hogy a vokoit-ával összekeverjük, melyet foieg Uoftlizait, folyékony vagy fagyasztott formában lehet tárolni

A végső vakcrnakésziösényben a polimer-koncentráció 0,01.% és 2 vegyes% között van, példán! 0,06 és 1 vegyes% között: van, úgymint 0,1% és 0,6 vegy«s% között vas.

Kívánt esetben, a leírás és a technika jelenlegi állásának ismeretében szakember képes megfelelő adjuvánst, és annak alkalmazható mennyiségét megválasztani a találmány szerinti, Immunológiai, hmmmogéo vagy vakcínakészltménybe, felesleges kísérletezés nélkül.

A találmány szerinti ímmunogés vagy vakctnakészfímények. társítva lehetnek legalább egy, élő, gyengített, tnaktiváh vagy alegységvakclnávai vagy rekombínáns vakcinával (például vektorként bimlővlmssal vagy DNS-piazmiddai), amely legalább egy másik, sertéseredetű patogénböi származó, legalább egy, kérdéses hmrsnsmgént vagy epitópot képes expresszáfoi.

A találmány szerinti megoldás ládölgozása során célul tűztük ki a készítmények különböző beadási módszerekre alkalmas formák előállítását Ismét megemlltjhk, hogy a beadás hatásos dózisát és módját ismeri faktorok, például kor, nem, tömeg és ínás, olyan szkrínefo eljárások alapján lehet meghatározni, amelyek ismertek és nem Igényeinek felesleges kísérletezést. Az egyes hatóanyagok dózisai lehetnek akkorák, mint amelyeket a idézett közleményekben leírnak és/vagy aíegyxég-immonogén vagy vakemakészftményben egy vagy néhány száz. vagy ezer gg-tól, például I ug~tól 1 mg-lg terjedő tartományban lehet; és inaktivált (liter inaktiválás előtt) imatunogón vagy vakeinakeszttoésyhen IO'^: es lö‘^á TCiD_5ö között, előnyösen ÍÖ* és ld^s TCIDjo között lehet, Éió, legyengített unntuöogén vagy v&keinakészitotényhen a dózis iík és 10* TCIDjo között lehet, előnyösen lő’ és KÉ TCiD® között lehet.

- II ♦ φ « φφ X : .. % ΦΦΦ;

* *ΧΦ φ φ φφ φ φφ

RekomfemÍmsokat vagy vektorokat be lehet adni megfelelő mennyiségbesi ahhoz, hogy a leírásban ős/vagy az idézett közleményskben közölt dózisoknak megfelelő mértékű m vmo expressziót kapjunk. Például vírtts-sznszpenziók esetén az alkalmas tartományt empirikusan lehet fóeghatározni, A találmány szerinti, vírusvektort vagy rekomblnáast be lehet .adni sertésnek, vagy iafektáhti vagy trauszfektální lehet sejtekbe kőrüibeliU legalább 10’ pfu mennyiségben; előnyösebben körülbelül lö* pfü és körülbelül 10^s“ pfu közötti mennyiségben, példáid körülbelül 10' pfu és körülbelül I0⁹ pfe közeid mennyiségben, például körülbelül 10^ft pfe és körtllbelól 1 píu közötti mennyiségben, dózisonként, például körülbelül 2 ml-ben. És ha. egynél több génísrméket expresszáíunfc egynél több rekombinánssa!, minden egyes rekorubinánsbói ekkora mennyiséget adunk be: vagy az egyes rekomhísánsokat be lehet adni ahogyan vannak, kamhxnáeíőbaa, és a rekembinánsok összesen ebben a mennyiségben vannak jelen.

A találmány szerinti plazmidkéssftményekbes alkalmazott dózisok lehetnek a leírásbati és/vagy az. idézed: közleményekben közöltek. Például a plazntidkészínnényekben az egyes pfazmid-DNS-ek mennyisége 1 ug és 2. ing között, előnyösen 50 pg és 1 mg között lehet DNS-plazmidvektorok vonatkozásában szakember képes tanulmányozni a leírásba» idézeti közleményeket abból a célból, hogy megállapítson más dózisokat a DNSplazmidből, a találmány szerinti készítményekben való alkalmazásra, felesleges kísérletezés nélkül.

Azonban a fcészhméxiyíek) dózisát, az abban lévő komponensek konsentrádóját és a készitmény(ek) beadásának időzítését (amely megfelelő mértékű testtnváfeszt képes kiváltani) különféle eljárások alkalmazásával lehet meghatározni, mini példán! a szérumban lévő ellenanyag bírálásával, például ELISÁ-val és/vagy szeroneutralizáclós vizsgálati eljárás alkalmazásával és/vagy sertésben vakcináeiöt fertőzés alkalmazásával értékeljük ki, A dózis meghatározásához nincsen szükség felesleges kísérletezésre, szakember tudása, a leírás és a benne idézett közlemények alapján elvégezhető. Az egymás követő beadások ideiét ebhez hasonlóan lehet meghatározni, a leírás és szakember által ismert eljárások alkalmazásával.

A PCV-2-imnmnogént előáilúhaíjak PCV-2-böí, vagy előállíthatjuk #? vázo PCV-2-géo(nk) vagy részleteinek vagy epitöpjamak rekombináns expresszsögívak Expresszíóra szolgáló vektorok (vagy reköm.bínán»ok) előállítására és alkalmazására szolgáló eljárásokat vagy analóg eljárásokat leírnak az alábbi hivatközásokbam

4.603.112., 4,769,330., 5,174,993., 5,505,941., 5,328,683,, 5,494,§07,, 4,722,848,, 5,942,235., 5,264,773.,

5.762.938., 5,770,212., 5,942,235., 5,756,105., 5,760,599., 6,094,777., 5,990,091., 6,933,994., 5,869,312., 5,382,425. számú VSA-heli szabadalmi leírások; WO 94/167 ló., WO 96/3949!. és WO 95/30018. száma nemzetközi közzétételi iratok; Psolettí, PNAS USA 93, 11349-11353 (1996); Moss, ENAS USA 93, 1134!-11348 (1996); Smíth és munkatársai, 4,745,951, számú VSA-bell szabadalmi leírás (rekombináns baouiovirus); szerk, Richardsoo, C.D., Methods ia Molecular Biology 39, „Saouiovirus Expressíon Protoeols” (1995 Humana Press &«.);: Srniih és munkatársa!, Mól. Cell Bioi. X 2156-2165 (1983); .Peonenk és munkatársai, Mól, Cell Bioi, 4, 399-406 (1984); EPA ö 370 573, számú európai szabadalmi bejelentés; 920,197, sorozatszámú VSA-beii szabadalmi bejelentés (benyújtva 1996. október 16.); EP No. 265785. számú közzétételi irat; 4,769,331. számú VSAbeli szabadalmi leírás (rekombináns herpeszvirus); Rotzmsn, PNAS VSA 93, 11307-11312 (1996); Andre&ssky és munkatársai, PiMAS USA 93, 11313-11318 (1996); Rohcrtson és munkatársai, PNAS VSA 93, 11334-11340 (1996); Frolov és munkatársai, PfíAS VSA 93, 11371-11377 (1996); Kutson és munkatársai, .1. Virok 65, 3968-3075 (1991); 5,591,439., 5,552,143. számú USA-beli szabadalmi leírások; 5VÖ 98/00166. számú nemzetközi közzétételi irat, amelyek megadott 08/675,556. ás OS/675,566. sorozatszámú USA-beli szabadalmi bejelen** issek (mindkettőt 1996. július 3-áe nyújtották be) (rekomfemáes adenovíros); önmhaas és mwkatársai, Sewin&rs in Víralogy 3, 237-52 (1993); Balfey és mtsal,, EMBÖ Journal, 4, 3861-65 (1993); örahsm, Tibfecb 8, 85-8? (1990); Rrevec és munkatársai, 3. Geo. Várót 70. 429*434; PCT WO 91/11525. számú nemzetközi közzétételi árat Felgner és mtsai,, J. Biot Chern, 269, 2550-2561 (1994); Science 258, 1745-49 (1993); MeCIetaeaís és munkatársak PNAS USA. 93, Π414-Π420 (1996); 5,591,639., 5,589,466, és 5,580,859, számú USA-beli szabadalmi leírások; WO-A-90/11892., WO-A-93/:i9183., WO-A-94/217977., WO-.A-95/I13Ö7, és WO-A-95/20660. számé nemzetközi közzétételi itatok; Taag és munkatársai, Natúré 356, 152-154 (1992); Fűrth és tnurikatársal, Anal, Eioehetn, 203, 365-368 (1992) (DNS-expressziós vektorokra vonatkozik, többek között). Lásd naég WO 98/33510. számú neíazeifcözí közzétételi iratot; Ja és munkatársai, Diabetología 41, 736-739 (1998) (lentiviráiis expresszlós rendszer); Sanford és munkatársai, 4,394,448, szánté USA-beli szabadalmi leírást (eljárás DNS inszertáiására élő sejtekbe); McCornúck és munkatársai, 5,677,178, számú USA-beli szabadalmi leírást (eitopatikus vírusok); 5,928,913. számú USA-beli szabadalmi leírást (vektorok gén célba juttatására); valamint az ezekben idézett közlex»éuyek.«4- A találmány szerinti megoldásban alkalmazott vírusvektor származhat például sertésből származó herpeszvírusból, például Anjeszky-féle betegség vírusából, sertésből származó adenovírusból, himlővirusból, fcttlönösen tehénhimlő-vírusból., madátiámiö-vfru^óJ, kauárihimióvírasból vagy sertésbímlö-vlrusból, valamint D&S-vektorokból (DNS-plaznddokfeól),

PCV-2-géa<ek)ből vagy részleteiből származó expresszlós termék hasznosan alkalmazható ellenanyagok, például monok lörsálís: vagy poliklonális ellenanyagok előállítására, amelyek diagnosztikai célokra hasznosak. Ehhez hasonlóan, PCV~2-gén(ek)b6i vagy részleteiből száímazó expresszlós fermékfek) hasznosan felhasználhatók diagnosztikai alkalmazásokban.

Továbbá, szakember képes meghatározni egy kérdéses PCV-2-immunogénen vagy egy másik, sertéseredetű patogénböl származó önmunogénen lévő epitópot felesleges kísérletezés nélkül, a leírás és szakember számára nyilvánvaló ismeretek alapján; lásd például a WO 98/4Ö5ÖÖ. számú nemzetközi közzétételi iratot, kérdéses: epitopot vagy egy fehérje epitóprégíójának meghatározására szolgáló általános információk vonatkozásában, többek közöd.

A találmány szerint előnyösen alkalmazható ímmunogén vagy' vakeinakészlíméuyek az. alábbiak lehetnek: hnmunogén vagy vakemakészítmény, amelyet tisztított PCV-2~preparátommai, például az alábbi nyilvántartási számon, az ,ECACC-nél. (Eumpeaa Collseöon of Celi Cultures, Centre fór Applied. Microbíölogy & Research, Salisbury, Wíltshbc S.P4 OJG, UK) deponált törzsek közöl származó, tisztított, sertéseredetü cirkovíraspreparáíummai fertőzött, r« v/íro sejítenyészeíből nyerőnk ki: No. V97190219. (Imp. 1008-törzs), No. ¥9710021.8. (fmp. 1010-törzs) és No. ¥97180217. (hnp.999~törzs) nyilvántartási számmal rendelkező törzsek, melyek 1997. október 2-án lettek deportálva, No. ¥98911608. M8285-törss) és No. ¥98011609, (imp, 1011-48121-törzs) nyílváutertást számmal rendelkező törzsek, melyek 1998. január 16-án lettek deponálva, és No. 00812709. fi iÖ3-rörzs) és No. 80812710. (1121-törzs) nyilvántartási számmal rendelkező törzsek, melyek 2008. február 2-án lettek deponálva; vagy immanogén vagy vakciaakészíímény olyan, sertéseredetü ctrkovlrast tartalmaz, amelyet 6; vfe-o seitteayészeten termeltettünk és abból izoláltuk, ezek s sejtek olyan seríéseredetd eirkovirassal leltek fertőzve, amelyeket fiziológiai mintából vagy sziivatmmiábói. lehet izolálni, különösen PMWS-szindrómában szenvedő sertés károsodott szöveteiből, például olyan készítmény, amelyhez a sertéseredetű církovírast sertésvese-sejtvonalon, például FCV-Uszeanyezóáéstől mentes PR/lS-sejtékea termeltetjük és abból izoláljuk: vagy olyan készítmény, amely ilyen eirkovirasssl fertőzött, /» vtox> sejttenyészethől származó exiráktosnot vagy annak fckdúszóját íatáaimazza, vagy abból preparáltok. Tehát hntnunogénként alkalmazhatnak sertéseredető ctrko vírust, A vakcina vagy hsmunogén készítmény tórtaisnazha? például legyengített,. él§. teljes tamunogení (például virnst), előnyösen áliat-gyógyászatiiag vagy gyógvászalliag elfogadható segédanyagban vagy feígítószerbea, és áll&t-gyógyászadlas vagy gyógyászatiig ellbgsdhatö adjuvánst valamint, adott esetben stabiiizátört liofílizálásboz. Az iswtoogént (például vírust) lehet inaktiválva, és a vakcina vagy ammmogén készítmény tartalmazhat továbbá és/vagy adott esetben áilat-győgyászstllag vagy gyógyászatiig elfogadható segédanyagot vagy hlgitószert, és adott esetben állat-ayógyászafilag vagy gyógyászatiiag elfogadható adjnvánst A vakcina vagy íutrmtnogén készíteény tartalmazhat FCV-2-immunogéneket és/vagy számos .sertéseredetű ehkovtrushól (beleértve PCV-2-t vagy számos· PCV-2-törzset, és beleértve PCV-i-el) származó mmmnogénekeí» valamint adott -esetben más, sertéseredetö. patogéabóí, például FRRS vírusából, A/vcop/tow fjyűp«cító«oNíaeböi, Acvtoctoeto/íus' /j/e^ropnemoníaeból, £. co/íből Pseudorabsss, sertéskoíera kórokozójából Bordeíeöa· őroavró/s-epí/cízből, P«wA wx/fáacJaból Entope/tófrrix rhus/opezhiébóí, sertéslníbenza kórokozójából vagy PPV-böl származó származó immunogéneket (lássl még WO-Á-öi3./i)14ö9, szám ú nemzetközi közzétételi iratot).

Ctrkovirusból származó antigenífcus készítmény előállítására, a ciAovireshóz. sejteken, különösen sejtvonalakon, például PR/ló-sejtekgs való passzálással juthatunk. A tenyészet .tólülúszóit vagy exíraknanaií adott esetben standard technikákkal tisztítva alkalmszbatjuk.

gyengíteti: PCV-vd kapcsolatban megjegyezzük, hogy a gyengítést általánosan elterjedt módszerekkel végezhetjük, például sejteken való passzálással előnyösen sertésereŐetŐ sejteken, különösen sejtvonalaken, például PK715-sejteken valópasszáiással (például 28-150, különösen 48- 180 passzáiással).

Az ioaáctíváit vakcinával, a PCV-vel és az esetleg jelen lévő frakciókkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy az. inaktiválást szakember által ismert technikák szerint végezhetjük,. Az Inaktiválást előnyösen kémiai módszerrel végezzük, példán! úgy, hogy az antigént kémiai ágens, példán! formaldehid (fbnsalis), paraformaldehid, b-proplolaktos vagy ethénintin vagy származékaik hatásának tesszük ki, és/vagy fizikai kezeléssel A találmársy szerint előnyösen alkalmazott inakti válási módszer kémiai ágenssel különösen etiiémminsei vagy B-proplolaktoíintsl való kezelés.

A vakcinában vagy' smrnmogén készítményben lévő immanogént PCV-S-nukleotidszekveneiát vagy fragmenséi tartalmazó DNS (amely előnyőse» legalább egy epitőpot kódol) alkalmazásával lehet expresszátei, például az L, 2,, 3., 4. valamint 6. vagy 7. assnositószámú szekvenciával rendelkező DNS-eí-(1.-4,. és-6-7. ábrák), A vakcinában vagy ímttwogés készííxséayben lévő jmmnsogént olyan DNS-fragmeris alkalmazásával lehet expresszalni, amely egy PCV-2-tttesból származó, 1-13. ORiF-ek közöl, például a 4,, ?., 10, és 13. Ö.RP-ék közöl az egyik ORF-et, előnyöseit a 4. és/vagy 13, ORF-eí tartateazza, különösen olyat, amely a· (fentebb betonalt törzsekből származik (a WÖ-A-99/18214. szánts nemzetközi közzétételi irat jelölése szerint, lásd lentebb az 1, táblázatot is). Tehát az immunogénhez vagy egy részletéhez, például egy kérdéses spitóphöz to vüAv expresszióval juthatunk, egy rekombináns vág' vektor alkalmazásával Áz ümrnmegétrt tovább lehet tisztítani és/vagy tötnénytei hagyományos módszerekkel

A vakcinában vagy immuxsagén készítményben lévő Immunogént PCV-ó-nukleotídszekvenciát vagy fragmestsét tartalmazó DNS-t (amely előnyösen legalább egy epitőpot kódol) tartalmazó expresszíós vektor al·♦·* kalmazásával lehet ó; v/vo expresszátteú például aa L, 2., 3., 4. valamint b. vagy 7, azonosítószámú szekvenciával rendelkező DNS-el (1.-4. és 6-7. ábrák). Ehhez hasonlóan, a vakcinában, tmmunogéo vagy immunológiai készítmértybetí lévő immurtogént olyas expresszíós vektor alkalmazásával lehet i« vivő expresszáhú, amely egy FCV-2-tÖrzsből származó, 1-13, ORF-ek közül, például s 4,, ?., lö. és 13. QRF-ek közül az egyik ÖRF-et, előnyösen a 4. és/vagy 13, O8F-et tartalmazó üNS-iragmeost tartatom, különösen olyat, amely a fentebb deíuuáli törzsekből származik. Tehát a vakcina vagy untntMaögés készítmény tartalmazhat expresszíós vektort, amely az Immaöogéat vagy egy részletét, példáéi egy kérdéses epltőpot képes rk viva expreszszáfei.

Az· expresszíós vektor leket bármilyen alkalmas vektor, például DNS-plazmidokból. bahtérhsmöbből, példáid £. uoúból, vírusokból, például baeufevírusbői, herpeszvirusból, például Áujeszky-fSle betegség vírusából, adenoviresból, beleértve sertéseredetö aáetmvírust, hírnlövirusból, különösen tehénhimlő-vírusból, madárhúaiő-vírosből, kanárihimlö-vírusból és sertéshimló-vlrusbói, többek közöd (szakember számára hivatkozásként szolgálhat Audosnet és mtsai. és Sublót és mtsai. által benyújtott 6©/í 38,352., és 60/138,478, számú, USA-helí szabadalmi bejelentés, svsrreudben, mindkettőt 1999. június 1 ö-én nyújtották be, különösen a találmány szerinti megoldás részletes leírása és még inkább a példák, „DNA VACCINE-RCV' és „FORCÍNE CíRCOVíRVS REC0M8INAKT POXVIRÜS VACCINE” címmel, sorrendben, melyeket mellékletként csatoltak).

Ennek megfelelően, szintén a találmány tárgyát képezik nukleinsavmolekulák és azokat tartalmazó vektorok, valamint ezek alkalmazásával előállított expresszíós termékek, ilyen nukleinsavmolekulákat és/vagy vektorokat és/vagy expresszíós termékeket tartalmazó készítmények, valamint ezek bármelyikének vagy mindegyüknek előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások. A találmány tárgyát különösen ímmuoogénl vagy epltőpot kódoló OR.F-ek és/vagy úagmensek, valamint 1103- és/vagy 1121-jelű törzsekből származó nukleinsavmoiekulák, különösen 1-13, ORF-ek, például a 4,, 7., 10. és 13. ÖRF, előnyösen a 4. és/vagy 13. ŐRE, és ezek íragtneasei·, valamint ezeket a nukleinsavmosekaiákat tartalmazó vektorok, ezeket a nukleinsavmotekulákat, vek* torokat vagy alkalmazásukkal előállított expressziős termékeket tartalmazó készítmények, ilyen nukfeinssvmolskuiáknnk. megfelelő expresszíós termékeket, lánciudtíó olígonukleoiidokat vagy próbákat tartalmazó készítmények,, valamint a találmány említett előnyős megvalósítási .módjai szerinti alkalmazások és eljárások, például PCV-2 detektálására, diagnózisára, vizsgálatára, tmmunogén vagy' protektiv válasz, és hasonlók indnkálása céljából.

,4 fentebb említettek szerint, a találmány előnyös megvalósítási módja szerint ellenanyagokat Is alkalmazhatunk. Ilyen ellenanyagok lelteinek pohklnnális vagy moooklotíá'is ellenanyagok:; például amelyeket a fentebb említeti cirkovírusökból, vagy amelyeket RCV-2-szokvenciával, például az 1,, 2., 3., 4., ő. vagy 7. azonosítószámú szekvenciával (1-4. és 6-7. ábrák) rendelkező DNS-ftagmens által kódolt polípeptidfeöl áilifetttusk elő, vagy' ?CV-2-szekve:nciát, például az 1., 2., 3,, 4., 6. vagy 7, azonos kószámé szekvenciát tartalmazó vektor expresszlójából származó polípepttdbők vagy az 1-13, ŐRE egyikét tartalmazó DNS-t tartalmazó vektor expressziójáböi származó pohpeptidböl állítottunk elő. Szakember alkalmazhat olyan technikákat, amelyek ellenanyagok termeltetésére, és monoklonáiis vagy' polikionálls ellenanyagok előállítására szolgálnak·. Ellenanyagokat és. antigéneket diagnosztiküniokbstj lehet alkalmazni.

A találmány tárgyát képezik 1103- és/vagy 11.21 jelit, P€V-2~törzssfchől származó próbák és láncindltő <sligounkl.eotid.ok is, amelyeket például PCV-2-DNS detektálására hasznosak, különösen miokaröllisz és/vagy abortusz és'vagy' ménen belüli fertőzés vonatkozásában, valamint FCV-2-DNS amplifikálására, például

4». »φ

-15»

Φ Φφφφ φφ * ♦ φ

Φ ·χ· φ φφφ φφ

Φ φ .♦ φ χ»φ φφφ * φφ

Φ X 9 ΦΦΦ

X « φφφ φ* expressziós vektor előállítása céljából. Egy próba vagy ífecíaditő oligonukleotid lehet bármilyen kiterjedésű, amely legalább 8, előnyösen legalább lö, előnyösebben iegaláhb 12, 13, 14 vagy’ 15, például legalább 29, például legalább 23 vagy 25, például legalább 2? vagy 30 olyan nukleotídot tartalmaz a PCV-2-g«nömból vagy’ PCY2-génból, amely egyed; PCV-2-re, és valószínűleg ezekre a törzsekre nézve, vagy amely előfordul PÜV-2-ben és legalább konzervatív a PCV- vagy' clrkovírus-csáládbao, PCR vagy hibridizációs; láocindltö oligonukleoddok vagy’ próbák, és ezek optimális; bosszúsága tekintetében hivatkozásként lásd K&jtmura ós munkatársai, GATA 7_f71-79 (199Ö). Hibridizációt előnyösen nagymértékben sztríngens körülmények között végzőnk, amelyben a „nagymértékben sztrisgens” kifejezés jelentése szakember számára nyilvánvaló (lásd például Sambrook és misak, „Molecnlar Cloning; .A Laboraíory MarmaT’, Cold Spriág. Harbor Lahoratory Press, Colá Sprrng Hatbor, N.Y., 1989; és szerk. Hatnes és I-Iígghx, „Nucleic Acíd Hybridizatiojr' IRL Éress, Oxford, UK, 1985). Nyilvánvaló, hogy hibridizációt jói kidolgozott technikákban végzünk, például Ssauthem-blot-hibridizáció, Northern» blot-hibridizáeió, in sitit hibridizáció és előnyösen Soutbent-hibridizáclö PCR-amplifikák DNS-ffeagjnensekhsz.

Próbákhoz vagy lánc-indító oligonakleotídokhoz hasonlóan, a találmány tárgyát képezik olyan peptidek, amelyek nem teljes hosszúságú PCY-2-iehégék, és lehetnek hámtílyea kíterjedésűek, amelyek legalább 8, eió» nyösen legalább 10, előnyösebben legalább 12, 13, 14 vagy 15, például legalább 20, például legalább 23 vagy 25, például legalább 27 vagy 30 olyan amisosavat tartalmaznak a ECV-2-hől, amely egyedi PCV-2-re, és valőszfndleg ezekre a törzsekre nézve, vagy amelyek előfordulnak PCV-2-ben és legalább konzervatívak a PCVvagy eírkovírus-családban. Alternatív módon vagy továbbá, a nem teljes hosszúságú PCV-2-fehérje laláímány szerinti atnlnosavai megfelelhetnek PCV-2-fehérje ep stop-régiójának.

A példákban tdk&lmuzoít PCV-2-szekveneiák Meeham és mmskatárstb [mint fent} által lein szekvenciákból származtak ÍORF1, 398-1342. rsókleotidok; ÖRP2, 1381-314. mrkleotidok; és amelyek megfelelnek az US 09/161,092, szántó ÜSA-beli szabadalmi bejelentésben (1998, szeptember 25.) leírt ORFd-nek és ORF 13-nak, sorrendben, és a WÖ-A-9918214. számú nemzetközi közzétételi iratban leírt COL4-sek és COLI3-nak, sorrendben], Más PCV-2«sxekveneí^cat is közöllek a WO-A-9918214, számú nemzetközi közzétételi iratban, melyek jelölése ImplőÖS, lmp999, Jmplűí 1-48282 és IrnplÖl 1-48Í21; valamint A. L, Hamui és saaiáísíársst (1 Virol. 72, 5202-5267 (1998)] (GeaBank AFÖ27217) és· k Motozov és trttH&atáisaí ÍJ, ülhieaí Microb, 36, 2535-2541 (1998)] írtak le ilyen szekvenciákat, valamint ÁFD86834., AFD86835. és AFÖS6836, számú OenBank szekvenciák, és hozzáférhetővé tesznek ekvivalens ORF-szckvenciáRaí.

A találmány tárgyát képezik ekvivalens szekvenciák Is abban az. értelemben, hogy a kérdéses gén uukísöíidszekveneiájához képesek kibndrtdlódal n&gysnériékbsn saárágeas körülmények között. Ezek között az ekvivalens szekvenciák között megemlíthetjük azokat a géníragmenseket, amelyek megtartották s teljes szekvencia immtmogemíásáí, például a kérdéses epiiópokst.

Az l, és 2, típusú PCV teljes geoomj&i közötti horaoíőgía körülheíúí 75%. De a 2. típuson beiül a homológja 95% lelett van. Tehát a találmány szerinti megoldásban bármilyen P€Y~2-törzset ekvivalensen aikahnazhstunk. Egy feltétel az lehet, hogy a 2, típusú törzs, például a teljes gettómra vonatkozó homológra nuklootid-szinten 85% vagy nagyobb mértékű, előnyösen 90% vagy nagy obb mértékű, előnyösebben 95% vagy nagyobb mértékű, kedvezően 97, 98 vagy 99% vagy nagyobb mértékű legyen a találmány szerinti törzsekkel, például az linp 1819-iörzzsel,

Az iBwiöKhjetü törzs ORF-jeinek határait megadjak az: alábbi 3. táblázatba»:

Név	Start	Vége	Szál	ORF mérete (nnkientidok, nf)	Fehérje mérete Ússínosavak)
ORFi	303	230	szsnsz	308 nt	35 aa
ORF.2	1 ISO	331?	ssensz	338 nt	45 aa
ORF3	1363	1524	szensz	362 nt	53 aa
ORF4	398	1342	szensz	94 5 nt.	314 fia
ORF5	900	1079	szánsz	i 80 nt	59 aa
ORF6	1254	1334	szensz	81 ni	26 aa
ORF7	3018	704	antiszensz	335 nt	104 aa
ÖRF8	439	313	antiszensz	129 nt	42 sa
ORF9	190	Töl	andszensz	90 nt	29 sa
ORPIÖ	912	723	astíszeasz	ISO nt	59 aa
ORFi 3:	645	565	antíszensz	81 nt	26 aa
ORF12	1100	1035	antiszensz	66 nt	21 aa
ORFI 3	334	13SI	antiszensz	702 nt	213 aa

Az ORF-eket Implölö-törzs vonatkozásában defíníáljnk- Szinten a találmány tárgyát képezik bármilyen más PCV-2-tÖrzsből származó, megfelelő ORF-ek alkalmazása, és bármilyen más PCV-2-tSirzs alkaimsalsa a leírás szerint és a benne idézett közleményekben leírtak szerint. Tehát, genomi nnkleötídszskvendáböl rutinszerűen meg. tehet határozni az ORF-eket standard szoftver, például MaeVecíor® alkalmazásával. Tehát gesotttok egymás alá rendezése 1010-tőrzs3?ői származó genomekkai, és összehasonlításuk lölö-tőrzsból származó ORF-ekkei szakember számára lehetővé teszi más törzsek (például a WO-A-99/1 8214, számú nemzetközi közzétételi iratban leírt törzsek, konkrétan ImplOOS, !mplÖli-48i21, ímpl 011-48282, lmp999, valamint -az ái 1103- és 1121-törzsek) genomjában lévő ÖRF-ek könny» meghatározását. Szoftver alkalmazása és az egymás alá rendezés nem igényel felesleges kísérletezést, és ezáltal közvetlenül hozzáférhetőek ezek azORF-ek.

Például a 6. és 7. ábrára hivatkozva, a 3 103-jein és 1121-jelö törzs· megfelelő ORF-jeínek határait megadjuk az alábbi 2,: táblázatban:

Név	Start	Vége	Szál	ÖRF mérete Cmddeottdok, at)	Fehérje mérete fatnínosavák)
ORFi	1524	3631	szensz	308 nt	35 as
ORF2	§33	970	szensz	338 nt	45 as
ORF3	3016	1177	szensz	3 62 nt	53 as
ORF4	51	995	szensz	945 nt	314 as
OK.FS	553	732	szesrsz	180 ni	59 ss
ÖRP6	907	987	szensz	81 nt	26 as
ORF7	671	357	antiszensz	315 nt	1Ö4 as
ORF8	92	1732	antiszensz	329 nt	4 2 ss
ORF9	1613	1522	antiszensz	90 nt	29 ss
ORF 10	565	386	antiszensz	380nt	59 as
ORF11	298	218	astisasusz	81 nt	26 ss
ORFI 2	753	688	antiszensz	66 sí	23 as
ORFI 3	1735	1037	antiszensz	702 nt	213 as

X»

A találmány szerinti megoldásban ekvivalens módon alkalmazhatjuk azokat a njáleotidszekvencíátet is, amelyekben a kérdéses génnek sem feskctöja, sw szővetspeeífiiása (2. típusú törzs), vagy a gén által .kódok pelipepddek nem vákortak mg, Természetesen a köd degeneráltsága miatt különböző szekvenciák is a találmány tárgyát képezik.

ÖRF4 esetén, PCV-1 és PCV-2 közötti teológia körülbelül 86%, és ÖRF13 esetén PCV-I és FCV-2 közötti homológra körülbelül 66%, Tehát, a találmány saensti megoldásban ekvivalensen alkalmazhatók ÖBP4 esetén olyan szekvenciák, amelyek 95% vagy nagyobb mértékű homológiával rendelkeznek ImplÖ fÖ-tőrssbol származó ORF4-ei, és ORF13 esetén olyan szekvenciák, amelyek 95% vagy nagyobb mértékű homológjával rendelkeznek ImplÖlÖ-törzsből .származó ÖRF13-al (az 1, táblázatban megadott terminológia alkalmazásával).

Más ORF-ekre vonatkozó homolőgia tekinteíébeu, meghí-tározlratjuk azokat a szekvenciákat, amelyek ORí'4-ei és/vagy ORF13-al rendelkező PCV-törzsből származnak, és amelyek a fentebb definiáltak szerint homológok íőlő-lőrzsböl származó, megfelelő ÖRF-el, ORF7 esetén, a találmány szerinti megoldásban ekvivalensen alkalmazhatók olyan szekvenciák, amelyek előnyösen 80% vagy nagyobb mértékű, előnyösebben 85% vagy nagyobb mértékű, kedvezően 90% vagy 95% vagy nagyobb mértékű homoiógíával rendelkeznek Implölötörzsből -származó ÖRF7-ek CW 10 esetén, a találmány szerinti megoldásban ekvivalensen alkalmazhatók olyan szekvenciák, amelyek előnyösen 86% vagy nagyobb mértékű, előnyösebben 90% vagy nagyobb mértékű, kedvezően 95% vagy nagyobb mértékű homoiógíával rendelkeznek implölö-törzsböl származó OSFíÖ-el (az 1. táblázatban megadott termmolögia alkalmazásával),

A találmány szerinti megoldásban ekvivalensen alkalmazhatók olyan szekvenciák, amelyek 95% vagy nagyobb mértékű homoiógíával rendelkeznek ImplOIő-törzsbói származó ÖRF4-el, és CW'13 esetén olyan szekvenciák, amelyek 95% vagy' nagyobb mértékű hotnolégiával rendelkeznek ImplölŐ-törzsböl származó QRP13~al.

ÖRF4 és ORF13 potenciálisan 37,7 kí> és 27,8 kik sorrendben, várható molekulatömeggel rendelkező fehérjéket kódol, ÖRF'7 és ORFlö (megfelel ORF3-nak és ÖRF4~nek Mfoehan és munkatársai által leírtak szerint, 1998} potenciálisan 11,9 kD és 6,5 kö, sorrendben, várható molekulatömeggel rendelkező fehérjéket kódol. Ezen ORF-ek szekvenciái rendelkezésre állnak a Genbank A.F 055392-ben. Beépíthetők pl&zmidokba, és a telálmány szerinti megoldásban lehet azokat egyedül vagy kombinációban alkalmazni, például ORP4~el és/vagy ORF13-al.

Á fenti táblázatban felsorolt többi, 1-3, és 5., 6., S-9... 11-12. ÖRF-et (a WÖ-A-99/18214. számú nemzetközi közzétételi irat szerint GÓL 1-3. és 5., £>., 8-9., 11-12.}, vagy régióját (régtóit), amelyek ide vonatkozó antigént vagy¹ epstöpot .kódolnák, lehet, alkalusazrű a találmány szerinti megoldásban, például egymagában vagy kombinációban vagy másképpen, egymással vagy a 4. és/vagy 13, ORF-el vagy régiójával {régióival}, amely(ek) antsgén{eke}t vagy epilöpo(fcs)t kódolnak, Ehhez hasonlóén, homológja vonatkozásába» meg lehet határozni ekvivalens szekvenciákat amelyek ORF13-al és/vagy ORF4-el rendelkező PCY-törzshöl származnak, és a fentebb definiáltak szerint homológok a leírás szerinti vagy Meshan és munkatársai által leírt (1998) 10ló-törzsből származó, megfelelő ORF-eh ORF7 esetés,, egy ekvivalens szekvencia például 80% vagy nagyobb mértékű, például 85% vagy nagyobb mértékű, kedvezően 99% vagy 95% vagy nagyobb mértékű homológjával rendelkezik Implölő-törzsből származó ORF7-el, -ORFlö' esetén előnyösen alkalmazható ekvivalens szekvencia 86% vagy nagyobb mértékű, előnyösen 90% vagy nagyobb mértékű, kedvezően 95% vagy nagyobb mértékű homológjával »♦’· ,í S > *<? ♦ «»;*

- 18rendelkezik ImpiCSIö-törzshöl származó O.RE!0-el,

Nokleotldszekveacia-hetsíológiát Myers és Miller által leírt (CABíOS 4, 11-17 (1988)], „Akgn”program alkalmazásával lehet meghatározni, amely az NCBl-n-ál áll rendelkezésre, Alternatív módosa vagy továbbá, a „homológja vagy „azonosság” kifejezések nukleoíid- vagy ammossv-szekvcnciák vonatkozásában két szekvencia .közöld homológja kvantitatív mértékét telezheti. A százalékos homológját az alábbiak szeriírt lehet kiszámítani: (N_ref--· ahol N&r jelentése a· két szekvenciáim a írem-azosos csoportok száma egymás alá rendezéskor, és ahol N,„_{ jelentése az összes csoport száma az egyik szekvenciában. Ennélfogva, az ÁOTCAGTC DKS-szekvencia 75%-os· azonossággal rendelkezik az AÁTCAA'rC-szekverieíaval = 8;

^::: 2).

Alternatív· módon vagy továbbá, a „homológja” vagy „azonosság” kifejezések szekvenciák vonatkozásában azt. jelentik, .hogy a megegyező nukleotidok vagy arniuosavak pozícióinak számát elosztjuk a két szekvencia közöl a rövídehbikbea lévő nukleotidok vagy nmlnossvak számával, ha a kát szekvencia egymás alá rendezését Wilbur- és Lippmann-féle algoritmus [Wílbor és Liprnann, Proc, Kati. Acad, Sci, USA 80, 72ó (1983)] határozza meg, például az alábbi beállítással:: 20 srsfcleiasavból álló ablak-méret, 4 mskleoíM “word iesgth {szóhossz} és a “gap penslty”: 4, a szekvenciaadatok számitógépes analízisét és leírását, beleértve az. egymás alá rendezést, kereskedelemben hozzáférhető programok (Intelligenetíes™ So.be. intelligenetics Inc,, CA) alkalmazásával végezhetjük «I kényelmesen, .Ha az WS-szekyenciákat hasonlónak mondjuk, vagy bizonyos mértékű, szekvencia-azonosságot vagy homológját mutatnak a DNS-szekveneíákkaí, akkor a ONS-szekvenciábatt lévő tínndínt (T) egyenlőnek tekintjük az RNS-szekveneiábsu uraddal (U>.

A találmány által igényelt oltalmi kikbe tartozó RNS-szekvenciák DNS-azekvencrákból származnak ágy. hogy a DNS-szekvenciában lévő timidínt (Tj egyenlőnek tekintjük az RNS-szekvenciában uraeillal (U).

Továbbá vagy alternatív módos, antínosav-szekvenciában. lévő hasonlóságot vagy azonosságot vagy homológiát BlastP-program alkalmazásával lehet meghatározni [Alisokul és mtsai,, Nueterc Aeíds Rés. 25, 3389-3402], amely az NCBÍ-nál áll rendelkezésre, .Az alábbi hivatkozásokban olyan algoritmusokat írnak le, amelyek képesek összehasonlítani két fehérjében lévő aminosavak relatív azonosságát vagy homológiáját, és továbbá vagy alternatív módon, a fentebb leírtakat figyelembe véve, s hivatkozások. kltaaítását lehet alkalmazni százalékos homoiőgia vagy azonosság meghatározására: Needleman és Wunsch, í. Moh Bioi, 48, 443-453 (1970); Smith, T.F, és Waterman, M.S',, Advauees in Applied Mathesnaiíes 2, 482-489 0981): Smith, T.F. és Waterman, M.S. és Sadler ÍR., „Statístíeal charaetcrízatkm of nnclele acid sequence functlonal domatns”, Nueieic Acids Rsx, Π, 22Ö5--2220 (1983); Feag D,F. és Dolittle, R.F., „Progressive sequence ahgnmení as a prerequisite to correct phyiogenetic írees, ,1. ofMol. Evői. 25, 351-360 (1987);: Higgins, D.G. és Sharpé F.M., „Fást and se.nsidve .mnltiple sequence alígnment on a mierocompnter CASIOS 5, 151-153 (1989); 3'hompsors, ÍD„ Higgins DG és öífeson T.í, „Clusíer W: improviug the sensítivíty o-f progressíve maltlpie sequence alígnment through sequence weíghing, posítions-speesfe gap penaities and vveight mátrix chotce, Ntseleic Aeíds Rés. 22, 4673-480 (1994); és Deveteux, X, Haebetüe P és Smiíhies O, ,A eomprehensive set of sequence analysís program ibr the VAX”, Nucl. Aeíds Research 12, 387-395 (1984),

A találmány tárgyát képez: továbbá PCV-2-ímmunogén alkalmazása, egymagában vagy kombinációban másik sertéseredetü patogénbSl származó immunogénnel a találmány szerinti készítmények előállítására, például az alkotórészek összekeverésével; és ennélfogva a. találmány tárgyát képezik reagenskészletek, amelyben szak «φ *♦ « φ χ ♦ χ » » φ χ «ΦΦ ΦΧ ΦΦΦ «φφ φ* kotórészek küíön-külős, egy edileg vannak tárolva, és adott esetben az edényeket együtt csomagoljuk az összekeveréshez és/vagy beadáshoz, amelyben a reageaskészlet adott esetben utasításokat tartalmaz az összekeveréshez és/vagy beadáshoz.

Míg a. találmány szerinti megoldást PCV-2-ím.mnsogésí tartalmazó irmmmngén vagy vakcmakészltmenyek nőstény sertéseknek való beadás vonatkozásában tárgyaljuk, szinten a találmány tárgyát képezi ilyen készítmények beadása kocáknak vagy emse malacoknak és/vagy kanok a leírás szerint Tehát miad anya, mind utód (például koca, emse), mind kan sertéseknek be lehet adni a találmány szerinti készítményeket, és/vagy lehet ezeken alkalmazni a találmány szennti eljárásokat. Ennek megfelelően, sertéspopuiáeióknak be lehet adni s találmány szerinti készítményekéi és/vagy alkalmazni lehet rajtuk a találmány szerinti eljárásokat.

A találmány szerinti: ímmtmogén vagy vakeisrakészíteények tartalmazhatnak egynél több PCV-2lőrzsból származó immonogéneket. Például 1121- és 1103-törzsből származó inantmogéneket leltet kombinálni (egyik vagy mindkét említett törzsből) legalább egy másik, találmány szerinti törzsből származó mnnunogénnel, vagy bármilyen más kombinációt létre lehet hozni.

A találmány tárgyát képező eljárások szakember számára lehetővé teszik PCV-2-vel szemben, alkalmazott vakcinák hatékonyságának kiértékelését. Az egyik eljárás ELlSA-t vagy szeroneutralizációt alkalmazunk. Egy másik eljárásban vakcinádé atán virulens PCV-2-tőrzzseí fertőzünk, például az egyik találmány szerinti törzzsel. Másképpen kifejezve, a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi olyan PCV-hnmunogének, beleértve PCV-l -immunogének ellenőrzését, amelyek tanunváhszt vagy projektív választ képesek kiváltani PCV-2 ellet!, ilyen PCV-hmnnnogések azután sertésekbe hasznosak prevencióra vagy kezelésre, különösen PCV-2-vel aszszöciáit miokardítisszei és/vagy abortusszal és/vagy méhen belüli fertőzéssel szemben, valamint PMWS-vel és/vagy ezzel asszociált, más patológiai következménnyel szemben.

A találmány tárgyát képezik egyik vonatkozásában immunogén vagy vakesnakészitményok, amelyek PCV-ímmusogéHt tartalxnaaasafc és képesek immtmogén vagy projektív választ kiváltani PCV-2-vel szemben, A találmány tárgyát képezik hmmmszáciős és vakcinációs eljárások is ilyen immunogén alkalmazásával, valamint ilyen immunogén alkalmazása immunogén vagy vakclnakésziőnény előállítására.

A találmány szerinti' megoldást az alábbi példák és ereásnények segítségével ismertetjük tovább, amelyek szetnlélteíés célját szolgálják, és amelyekre nem kívánjuk korlátoznia találmány által igényelt oltalmi kört.

Az, 1. ábrán az í. azonosítószámú szekvencia látható, amely az imp, 1Ő1M8121-törzs genomjáböl származó PCV-DN S-szekvenciája.

A 2. ábrán a 2. szonosftósrámú szekvencia látható, amely az Imp. 101 MOS-törzs genomlából származó DNS~szekvencia.

A 3. ábrán a 3. azonosítószámú szekvencia látható, amely az Imp, 999-törzs gesomjából származó

DNS-szekveseia.

A 4. ábrát! a 4, azonosítószámú szekvencia látható, amely az. Imp, lölö-törzs genomjáböl származó D'NS-szekven.cia.

Az 5. ábrán az 5. azonosítószámú szekvencia látható, ameiy ΡΚ/15-íörzs genomjáböl származó DNSszekvencia.

A 6. ábrán a 6, azonosítószámú szekvencia látható, amely A.lberíahan (Kanada) izolált, imp. 1103-törzs genomjáböl származó DNS-szekvencia; k jelentése g(G) vagy t(T), y jelentése c(C) vagy t(T). Ezeket a *φ* φ χ Φ φ χ » φ * »* * X φ φ, φ * φ *♦ φ ♦**

ΦΦΧ « ΦΦΦ X Φ φ Φ *

-2Q- ”* ·* “** * *’ *** ^>,κ szekvenelavaríáeiőkat figyeltük mag a viruspöpuláelőhan,

A 7. ábrán a 7. azonosítószámú szekvencia látható, amely Saskaíoonban (Kanada) izolált, top.

1121 -törzs genomjából származó DNS-szekveneia.

Az 1.1-1.5 ábrák a 12. példában, szerepeinek,

A 2, l ~2.é példák a 13. refereneiapéldáte szerepeinek,

PÉLDAA ÉS DPDDMÉNYEK

L refergfwsspD'dii

PCV-2-vel asszociált mlnk&rOisz, abortusz és méhen belüli fertőzés

Új, 450 kocával rendelkező sertéstelepen a tenyésztés beindulásakor kései abortuszok és halva született vagy mumifikálődott malacokat egyaránt eredményező ellesek fordultak elő. Néhány kocánál álterhességet: Is megfigyeltünk, A kocák a pátosodás előd 2 dózis parvovlrusbói származó és ieptospirális immunogént tartalmazó, insktíváli vakcinát kaptak.

Az egyik alomból származó állat posztmortális vizsgálata során kilenc magzatot találtunk, amelyekről úgy tat, hogy a vemhexség különböző fázisaiban elptiszdtltak. Keltő mumifikálódott, 2 maceráit, 3 autolizálí és 2 frissen, halva született volt. Makfoszkópfat patológiai vizsgálat során csak az egyik, részlegesen aatolízálí magzatnál figyeltünk meg károsodást. Ebben a ntagzaíbtm a szív mindkét kannája kitágult, a máj megnagyobbodott és megszilárdult, valamint hyárothoraxnt (mellüregi folyadékot) és sszeiteszt (hasvizet) egyaránt láthattunk, Hisztopatoíógí&ilag, kiterjedt területeken lehetett megfigyelni szlvizomdegeserációt vagy nekrózist ödémával és enyhe fibrózissál, valamint limfocíták és makrefágok diffúz, •«érsekeit ínStráeiójáí, Feltűnő volt az általánosan kiterjedt máj vértolulás és hepatocelluláris (májsejt)· veszteség. A lép és a vese szintén vértoiuláaos volt. A többi magzatnál nem detektáltunk jelentős szövettani károsodást.

PCV-2 kimutatására szolgáló immimblsztokémiai festést korábban leírtuk szerint, nyúibtm termeltetett pöliklonáiis antiszénmnntd éx monoklonalís, PCV-2-vel szemben termeltetett ellenanyaggal végeztünk, formálómat fixáit, szokásos módon kezelt és beágyazott szövetmetszeíeken (Bilis és mtsai., 1998; Bilis és mtsai,, 1999), A dílatált kardiomsopátiávai rendelkező magzat szívizmának érintett része PCV-2-antígénre mindenhol intenziven megfésíődötí. A festodés a nekrözis területén volt a legintenzívebb, és ágy ttot, hogy elsősorban a sníociSákat érintette. Cttoplaztnafikus és nukleáris festődért egyaránt tapasztaltunk, több magzatnál a. májban volt Intenzív festődés. Úgy tűnt, hogy néhány metszeten a festodés főleg a szinuszoid endotéliumra és a Rnnfersejtekre terjedt ki, míg más magzatok esetén, például msokardítíszes magzat esetén a nukleáris és eiíoplazmatikus festődés a hepatocitákrs is kiterjedt. Pozitívan íestődöű sejték elszórtan voltak a tüdőben és müiűfokállsan a vesében. Polímeráz láncreakciót (PCR) PCV-2-re korábban leírtak szerint (Bilis és mtsai,, 1999) végeztük, lagyasztott szövet alkalmazásával. A várakozásnak megfelelő méretű PCR-terméket: ansplífikáltuk PCV-2~re a magzati szövetből. PCV-2-t izoláltunk a miokardíílszes magzatból, és az alomban léséi többi állat magzatának egyesített szövetkészletéből ügy, hogy xzövethomogenlzátymokat oltottak PCV-mentes ΡΚ-15-sejtekbe.

Magzati szöveteket sertésekben előforduló, magzati károsodással és: abortusszal asszociált, más virális patogénekre, például sertésben előforduló parvovirusra (PPV), sertésben előforduló, reproduktív és respirációs szindróma vírusára (PRRSV), enkefaíomiokarásttszre (BMCV) valamint esiorovírasokra is vizsgáltuk. PPVantigént nem detektáltak fluoreszcens ellenanyaggal végzett teszt (FAT) alkalmazásával mumiűkálódoít vagy halva született magzatokból származó, tagysszíott tüdő-, mái- és lepmstszeteken, Az elvetélt magzatok mái-, tö♦ «φφ« φ φφ φ φ»

- * « φ

ΧΦ φφφ ΦΦ dő-, és iéphomogemzátamait szintén PCV-mentes PK-lS-sejtíenyészetekbe oltottuk, főleg sertésből szártnazó petevezeték-sejtekbe és Verő-sejtekbe, Ciíopaíikus vírusokat nem doíekáltunk három pzsszálás után. A szövetek negatívak voltak PPV-re PCR-f a&atoazva, Immnrfeiszíokésmai festéssel séta áetektáhunk PRRSV-antigént.

Tehát, a magzati, károsodások és az abortasz közvetlenül asszociált PCV-2-virussai, Ezek az eredmények a vírus vertikális átvitelét is mutatják.

Egy régebben végzett kísérletben i őö vizsgált magzat közöl kettőből izoláltak PC V-bet, ami arra utal, hogy ehhez a csoporthoz tartozó vírusokat vertikálisan leltei átvinni; azonban PCV-1-antigént nem lehetett a szövet egyetlen károsodásával se» társítani (Aiiaa és mtsai,. 1995). Sertésben magzati károsodással és abortuszszol asszociált, más ágensek, például PPV (Bolt és mtsai., 1997; Meliíor és rntsaí., 1991), PPV (Láger és mtsai., I99ő), EMCV (Kim és mtsai., 1989) és enterovínas (Mólkor és mtsai., 1991) kizárása azt mutatja, hogy PCV-2 szignifikáns magzati patológiát és azt követő abortuszt képes okozni.

PCV-2-fertőzésseÍ asszociált sorvadás; szindróma leggyakrabban 5-12 hetes malacoknál fordul elő (Aiián és mtsai., 1998; ElUs és míx&L, 1998). Újszülött sertések kísérleti fertőzése art mutatja, hogy viszonylag hosszú. predromáhs (a betegség kezdetét jelző) időszak van a fertőzés és a PCV-2-vel asszociált klinikai jelek kifejlődése között (Allan és mised., 1999; Bilis és mtsai., 1999). Khuutahuk, hogy a vírus vertikálisan vivődik át vagy a születés körüli időszakban. Nemcsak a méhen belüli, vertikális PCV-2-átvitel eredményezhet abortuszt., hanem az is lehetséges, hogy sznbletálisan te «tere» fertőzött malacok olyan állatok lehetnek, amelyekben később kifejlődik a PMW'S.

Az eredmétiyek továbbá azt mutatják, hogy tenyésztés vagy hágaíás előtt vagy születés körüli időszak előtt és/vagy a vemhesség alatt a kocák beoltása PCV-2-lmm.nnogém·. tartalmazó készítménnyel (amely készítmény sertésből származó, másik patogén, például sertéseredetö parvovírusbél származó imtnumgóut Is tártáltn&zhat) képes megelőzni imökatdídsA és/vegy abortuszt és/vagy sertésereetetö cirkovirus-2-νεΙ asszociált, méhen belüli fertőzést, valamint az elválasztás utáni ntultisziszférsás sorvadást szlndrótnát. és PCV-2-vel asszociált, más patológiás következményeket azáltal, hogy immunreakcibt vagy ellenanyagok termelődését váltja ki PCV-2vei szemben.

Természetesen a készítményeket, eljárásokat és a találmány szedeti, megoldás más vonatkozásait sertéseken kívül ntás állatokra is lehet alkalmazni, például birkára, bölényre, szarvasmarhára, vaddisznóra; például akkor, ha a PCV-2 ilyen más si latokat megfertőz.

2. rsfgreííet’apé&ftí gCV-2-ye[,im^ájtmtokstűiíisrt,abpnuszjb^gn.beí§h^^

PCV-2 újszülött malacokban való· jelenlété alapjóa feltételezzük, hogy a vírus átadásának fontos módja a vertikális átadás. Az átadás ilyen módja nemcsak reproduktív károsodással hozható kapcsolatba, hanem a későbbi életszakaszban kifejlődő muhísziszíétnüs betegség, kifejlődésével is. Célul főztük ki annak meghatározását, hogy vajon a korábban nem detektált PCV-2 (és PCV-1) vertikálisai) adódik-e át olyat) sertéstenyésztő területeken, ahol FMWS a PCV-2 fertőzés elterjedésével már legalább néhány éve endemikus.

üniversiíy of Sasksíhetvan (Kanada, Sáskámon), “WesternCollege of Veterinary Medícine” (WCVM) diagnosztikai laboratóriumába négy év alatt leadott, jő egészségi állapotban lévő, összesen 39 kanadai tenyészetből származó, 38 mintát elemsztünk, amelyek között reproduktív károsodással sújtott állatokból származó minták is voltuk. Öt olyan farmról származtak minták, amelyekben PMWS-essteket diagnosztizáltak. A 38 min-22 ♦ β«Φ* » Φ ♦· * X * * * * * · ♦ * Φ » * *Φ ♦ Φ 9 Φ ΦΦ*Φ ♦ Φ « * * «» 9 9 4 Φ Φ* «Φ* * iából huszonhét (? 1 %) abortusszal társait; ezek közöl öt (í3%) legalább egy mnmí.fikáiódott magzattal Is· társult. A fennmaradó KI esetből:: 5 halva születeti maiséból vagy életképtelen tusiadból származott (13%); .2 halva születeti .malacból, és egy vagy több mumítlkálőáoít magzatból származott (5%X 2 csak halva született malacból származott (5%); és egy csak mumiídrálődött malacból származott. Církovírusiöl. különböző pstogénakre végzett rutin diagnosztikával kimutattok, hogy 4 esetben (11%) az etíolőgia settéseredetíi parvovkttském volt meghatározható, és 2 esetben az etíolőgia baktérlumerededíként volt meghatározható. Teljes nekropszáákat végeztünk, szövetmintákat vettünk, és pnűsrolt tórmaiinbsn fixáltúk azokat (fixálási kló 24-72 óra); az eseték többségében friss szöveteket is alávetettük rutin mikrobiológiai elemzésnek. Ezt megelőzően egyik esetben sem teszteltünk PCV-2-re.

PCV-1 és PCV-2 detektálására PCR-techníkát alkalmaztok korábban leírtak szerint (Tischer és mtsai., 1974). A. négyéves időszakból szártnazó, reproduktív károsodással társult mintákat is tartalmazó, egyik mintában sem detektáltunk PCV-l-et PCR-el, PCV-2-t két különböző mintában detektáltunk PCR-el, melyek ágyasabból a több telepből: állő tenyésztő egységből származtak, két külön alkalommal véve, a négyé ves időszak utolsó évének tavaszán. Ezen minták közül az első olyan malacokból származott, amelyekben szabad szemmel látható jelek utaltak míokardítiszre, szívhipertrófiára és krónikus passzív vértolulásra.

PCV-2 szövetekben: való ímmunhíszfiskémiai azonosítását korábban leírtak szerint végeztük (Tischer és mtsai., 1974).. Az irarnunfeisztokénnai festödés ÍIHC) FCV-2-re pozitív volt mind a hat vizsgált malac szivéből sztornó- mintán, mis 6 malacból 4 eset pozitív volt PCV-2-re, PCR-el vizsgálva (lásd az alábbi táblázatot).

Táblázni: PCV-2 detektálása formaimban fixált miokarditíszes seríésszivekfeen, PCR, 1HC és sejttenyészetből való vírusizolálás alkalmazásával.

PCV-2 pozitív szövetek	PCR	1HC	VfrusMsoIáiás
Fixált	5/ő	ö/ó	N/A
Fagyasztott	4/4	N/A	2/4

A második minta ugyanarról a teleptől, négy malacból álló olyan csoportból származott, amelyben 2 malac halva születeti, és másik kettő röviddel a születés után elpusztult. Mind a négy malacnál szabad .szemmel érzékelhető, nyilvánvaló jeleit tapasztaltuk súlyos, diffúz miokardítbznek, szsvhipertófiának és krónikus passzív vértolulásnak, Csák a frissen fagyasztott szivet és a tüdöből/lépből származó, egyesített szöveteket analizáltuk, PC V-2-re végzett PCR poztíi'v volt a 4 malac közöl 2 szivében, és 4 malacból 4 esetben az egyesített íSdö- és lépszövetben. .Az érintett szivekből ás/vagy az egyesített tüdő- és lépszövetbői PCV-2-t lehetett izolálni 4-ből 2 esetben, amelyek FC V-2-re pozitívak voltak PCR-el Szerológia és/vagy PCR alapján, reproduktív rendellenességgel asszociált, más égessek, például sertésben előforduló, reproduktív és respirációs szindróma vírusa és sertésben előforduló parvovirns látszólag jelen voltak és átadódtak a tenyésztett állatokban. Azonban ezekről az ágensekről nem. mutatták még ki, hogy ax érintett malacokfe;m súlyos szív- (vagy más) károsodással feméssek asszociáltak; de szerepet játszhatnak PMWS kifejlődésében,

PCR-el vagy íHC-vel nem defekíáituak PCV-2~t reproduktív rendellenességekkel társítható, egyetlen reprezentatív mintában sem, amelyeke; a négy éves időszak első három evében adtak le (a négy éves időszak utolsó óvében leadott mintákban detektáltunk PCV-2-1 a reproduktív rendellenességekkel összefüggő esetekben).

A DNS-károsodás formalinos: fixálás miatt hekövetkező károsodásának kizárása céljából (egy lehetséges olyan

Ót

XX káros faktor, amely korlátozza PCV-2 PCR-el való detekiáibstóságát), PCR~t végeztünk olyan szöveteken, melyeket négy, PMWS-ben szenvedő, elválasztott malacból vettünk. PCV-2-DNS-t amplifikáilnök valamennyi tesztelt, líráit szövetből, példáid tüdőből, májból, veséből és bronchiális oyirókmirtgyből származó szövetből, mind a négy .«gyedben. Továbbá, a PCV-2-PCk érzékenysége független vök az egyes szövetek lőrmalínban való fixálásának időtartamától

Ezek az eredmények megerősítik és kiterjesztik azt a régebben leirí megfigyelést, (West és társát, 1999) amely szerint PCV-2-t át lehet vinni vertikálisan, és nagy·' mennyiségben jelen lobéi tn víero fertőzöd malacok károsodod részeiben. PCV-2-vírus vertikális átvitele és ennek eredményeként kialakult magzati károsodás, például a míokardítisz, PCV-2 egy további, betegség formájában megjelenő megnyilvánulása. Továbbá az a tény, bogy PCV~2-í: nem detektáltunk reproduktív rendellenességgel társítható esetekben a négy éves időszak utolsó éve előtt PCV-2-veí esdémikussn fertőződ területeken, arra utalhat, hogy a vertikális átvitel nem az elsődleges meciianizmus, amely a vírusfertőzés kezdeti elterjedéséért felelős. Szexuális, valamint vertikális átvitelnek egyaránt tulaldeaitható a PCY-2-íertőzés terjedése sertésekben.

d, ze/ewícrápté&íb

Az 1103-virast Albertéban, és az lOSí-vírust Saskatoonban (Kanada) abortusszal járó esetekből izolálták, I. Ellis és munkatársai által leírt eljárás szerint [Cső. ,i. Vet. 39, 44-51 (1998)].

A vírus tenyésztését PK/15-sejitertyészeteken végeztük, amelyekről ismert volt, hogy íefe sertéseredetS oirkovtrussai (PCV), peshvtresökkal, sertéseredetü adenovirusokkal és sertéseredetű parvovirusokkal [Alisa G. és mtsai,. „Püthogersesis of perelne circovirus experímental ísfectíons of coiostrutndeprived pigiets and examínation ofpig fosta! matériái*', Vet. M'ierobtoi. 44,49-64 (1995)),

Egyrétegű PK/'I5-sejtíenyészeíet tripszínes kezeléssel (tripszln-verzéu-keverékkei) leválasztottunk konflusns tenyészetekről, és felvettünk pesti vírussal nem szennyezett, 15% magzati borjúszérumot -tartalmazó MEM-SA-íápkőzegben í^MEM-G-tápközegben). körülbelül 4Ö0.ÖÖÖ sejttel végkoseentráelóra. Azután ebből a sejtszöszpenzioből Iö mi-es abkvotokat összekevertünk 2 mi, fentebb leírt oltóanyss-alikvotokkáS, és a végső keverékből 6-6 mi-es alikvotokat osztottuk két, 25 enV-es Falcön-Iombikokba. Ezeket a tenyészeteket azatáo 3?'^sC-bn, 18 óra hosszáig Ínkubáltuk 19%-os arán-dioxidot tartalmazó atmoszféra alatt.

Az ínkubáíás után a félig kontinens, egyrétegű tenyészetek íápkőzegét 300 mM· D-glükóz-amínnal (Cátii G48 l.?S, Sígma-Aldríeb Compaay Limited, Pooíe, UK) kezeltük [Tischr, 1. és mtsai., Arch. Virol, 96, 3957 (1987) j, majd folytattuk az ínfcubálást további 48-72 óra hosszáig, 37°€-«m, Az utolsó inkubálást követően, az egyes oltóanyagoknak megfelelő, két Faicon-lombik közül az egyiket 3 egymást követő fagyasztásEíéíoívasztási ciklusnak vetettük alá. A többi Falkon-Iombíkban lévő ΡΚ-15-sejteket tripszin-verzéo oldattal kezeltük, felszöszpendáiütk 20 ml MEM-G-tápközeggel, és azután 75 cnrt-es Faikos-lombikokha oltottak 4ÖÖ.ÖÖŐ sejttel koncentrációban, A frissen beoltott lombikokat ezután “szuperfertőztük” a fstgysszütsi/olvasztásí-ciklnsokbéd származó, 5 ml megfelelő lizáhsm hozzáadásával.

4. rtyfezeneAyráófe

PÜV deíektására szolgáló technika immuno^uoreszecin alkahisarásával

Valamennyi aeetonoal fixáit sejttenydszet-preparátum kezdeti szkrloelését közvetett Immunofluoreszcens technikával (HF) végeztük, kifejlett sertésekből származó, egyesített, 1/100: hígításé szérum aSsal* * + ♦ ♦ * Ο * **

X X > « * * * * * * * * » V Λ X· Φ 9 Η * «' ψ <. Λ *»«« ♦ Λ- ♦ ♦ _Μ 74 ~ ♦** ** ^{φφχ χ} *♦ ’^η *’ wazAsával, Ez az egyesített szérum 25, Észak-írországból származó kocából származott, amelyekről tudtuk, hogy igen sokféle sertá,«eredetű vírusra, például ECV-re, sertésből származó parvovfessra, sertésből származó adesovírwa és PRRS-vfrusra tartalmazott specifikus ellenajtyagot. Az HE-technikáí úgy végeztük, hogy a (PBS-ben hígított) szérumot egy órást keresztöl, 37°C-on érinikezsetíük a sejttenyészetekkel, azután kétszer mostuk PBS-et Ezután a sejttenyészeteket .tluoreszcein-ÍzoiioeiouáÍíal konjugált, nyálban termeltetett, ESS-ben I/Sö-arányban hígított, aatí-sertés immuuoglobnlin-elfenauyaggsl testetek egy órán keresztül, ezután FBS-el mostok, és a mintákat glicerines pufferben előkészítettük mikroszkópos megfigyelésre, amit UV-fény alatt végeztünk, & fi/sreaesapéiaa

PCV-aatigének termeltetése m u&w tenyészetben

Nem szennyezett EK/lS-sejteket tenyésztünk, és « vírust felszaporítjak az 1, példában leírt eljárás szerint. A fertőzött sejteket 4 napos, .TTX-öü végzett inkubálás után tripszines kezelés után elkülönítjük és megszámoljak, A kővetkező passzáíásnál -400.000 sejbml alkalmazásával oltunk.

A találmány szerinti különböző PCV-2-íüras^teí, például az 11Ö3- és az 1121-törzset tenyésztjük eszerint.

ő, rc/ére«cmpáteb

A. bírálást 9ö tenyésztöheíyet tartalmazó tálcán végezzük. Először bemérünk tenyésztöbeiyenként 100 pl, PK/lS-sejtszuszpenzíát (150,000 sejl/ml). Ezótán hígítjuk a vírustenyészelet, és ebből. 100 pl-t bemérünk a. tenyésztőbelyekre. Az mkufeálást szén-áioxid jelenlétében, 37*€-öo végezzük. 24- óra elteltével glökózaminna.1 kezeltük léi éra hosszáig., 37“C-en (a körülményeket lásd a 3. példában, leírtaknál). Azután eltávolítjuk a tenyészet tápközesét, és friss tápközegeí adunk a mérőhelyekre. Majd 72 óra hosszáig, 3?°C-on IskuMtak. A gócpontokat «att-ECV-2 monoklonáiis ellenanyaggal és FÍTC-ve-I jelölt, egéreredetű konjugátummal jelenítjük meg.

Ezt az eljárást inaktív-ált és élő gyengített FCV-2 előállítására lehet alkalmazni.

7, pefereneiapélilii

A vlrustesyészíés végén a fertőzött sejteket elkülőniljilk, és ultrahang (Brnuson Somtler). vagy rotorsztaíor típusú, kolloid majom (IJlírs'l'urmx, 1KA) alkalmazásával lizísnek vetjük alá. Ezután a szuszpenzdóí 3700 g-n centrifugáhnk 3Ö percig. A vírusszuszpenzlói Ö,í%~os ebiénimi&stel, IS óra hosszáig, 37^isC-on vagy 0,5%~os héta-proplolaktöimal 24 óra hosszáig, 21TC-on- motiváljuk. Ha a vírus títere az inaktiválás előtt nem megfelelő, akkor a vírussznszpeazlőt uitraszűréssol tőméoyltiük, Áz uhroszőrést 306 kDa tnoiekufeíörnegnél visszatartó metnbrát? (Miliipore .PTMOÖÖ) alkalmazásával végezzük. Az inaktiv&lt vírusszöszpenrióí 5°C-on tároljuk.

& rg/ürencífipé/dií

A vakcina előállítása ásványi ólaira alapé emulzió formájában

A vakcinát az alábbiak szerint állítjuk elő;

- sertésből származó imtku vált eirkovírus-szoszpsnzió: 2.50 ml

- Mcsntaoldedú ISA 70 (SEBElCj; 75Ö ml « »#«χ * Φ «4 Φ *Χ *

Φ Φ φφφ « φ -X Φ ♦*·«· φΧΦ ΦΦ XX φ Φ ·-» *

A vizes és az utejus fázist szűréssel küiön-kslön sterilizáljuk, Áz. emulziót ögv áillíjuk elő, hogy az alkotórészeket Si{vemö-brMaaem»tgeáló segítségével összekeverjük és homogenizáljuk.

Egy vakcínadőzis körülbelül lö''⁵ TCíDSO-et tartalmaz, Az irsradensáíistm beadott vákeinadózis térfogata 0,5 ml, az. mtmmuszkulsrisan beadott vakcinadózis térfogata 2 ml.

Ezt a vakcinát alkalmazzuk a vakelnációs programban mnítlszisztémás: sorvadást szindróma ellen a Pm-o¥ax®-vakciaával kombinációban,

9,

A vakcina eiőáhftása mmhoíizólható eiaf-aiapő emuteió formá jában

A vakcinát az alábbiak szerint állítjuk elő:

-sertésből származó inaktlváls ckkovlrus szuszpenziója: 206 tnl

- Dehytnuls HRE 7 (Henkel): ő6 ml

-Radía 7204 (Oleofína); 740 tál

A vizes és tsz olajos fázist szűréssel külífo-kölöa sterilizáljuk. Az emulziói úgy állítjuk elő, hogy az alkotórészeket Siíverston-ítubiusemuigeálő segítségével összekeverjök és homogenizáljuk.

Egy vakeinadózís: körülbelül lö'·⁵ TCl.DSö-et tartalmaz. Az iníramuszkulárísan beadott vakcínadőzis térfogata 2 ml.

Ezt a vakcinát alkalmazzuk a vakelnációs programban a mnltisziszíéuiás sorvadást szindróma elten a Parv<sva>:?®-vakciuával kombinációban.

J&pék&t

Malacok oltása DNS- {plazsrid-) vektorral

Császármetszéssel világra hozott, 3 vagy 4 malacból álló csoportokat a ö, napon izolátorokba helyezünk. A malacokat a 2. napon beoltjuk (A) OR.F-i.3~at tartalmazó plazmiddal vagy (B) az említett plazmidot és egy másik. ORF-4-et tartalmazó plazmld keverékével, és a kontroll csoportban lévő malacokat fiziológiás nátrium-klorid-oklattai. Az egyes plazmidokat steril, fiziológiás oldattal (0,9%~ös NstCI) hígítjuk 256 pg/pl végkoncenfrácíóra. Intransuszkulárisas injektáltuk. 2 mi térfogatban két helyre, egyenként 1 -1 ml~t (a nyak mindkét oldalán, egy-egy helyre). A második vakcinát vagy piacéból tartalmazó injekciót a .14, -napon adjuk be. A malacok jól törték a DNS-el való vakelnácíói, és a vaksmáoiönak sem voltak érzékelhető: mellékhatásai. A malacokat a 21. napon fertőzzük PCV-2-vírusszuszpeszsó oronazáils, orrlyukanként 1-1 ml beadásával. A fertőzés után: a malacok testtömegét hetente lemérjük. A 17„ 21., 22., 24,, 27., 29., 31., 34., 37., 41., 44, napokon rektálís hőmérsékletet mérünk. A 44. napos minden malactól ürülékkeneteí veszünk PCV-2 tegedésések meghatározása céljából. A. vírus detektálását és kvantitatív meghatározását kvantitatív PCR-el végezzük, A 45.. napon nekropssiát végzünk, és szövetmintákat veszünk vírnslzoláiás céhából.

^&akALItÉífipiónte;

Mincs szignifikáns különbség a tesiiönmg-gy&mpodás középértéke és a testhőmérséklet átlagértéke tekintetében az egyes csoportok között.

Nekropszikas károsodások:

A kísérlet végén szabad szemmel látható elváltozás a sertésekben csak a bronchiálís limf&denopátia volt. A károsodásokat az alábbi kritériumok szerint értékeltük (ponttszással).:

™ nem látható oyirokmirlgy-megnagyobbodás χ * ♦-«

ΦΦ φ 9 Λ * *

Φ φ Φ Φ *

χ. χ φ « Φ»ΦΧ «

ΦΦ X X* *Φ * * **

Λ Λ 9 «·« ~26·

1. ~ enyhe nyirokmitigy-megnagyobbodás, amely· a broncbiáiís nyirokmirigyekre korlátozóik ~ mérsékelt nyirekmirigy-megnagyObbodás, amely a broncbiáiís nyirokmirigyekre korlátozódik

- súlyos nyirokntírigy'-megrÍSgyssbbodás. mely lílteriedt a bronchiábs, submnndibuiaris (állkapocs alatti), preszkapszoláris és lágyéki syirokmirigyekre, síd: standard deviáció rövidítése

Csoportok	Limfedeeopásört jellemző p· átlag síd	N
(A)	1,2 1.3	4
(8;	2,0 1,7	.3
kontrollok	3,0 0,0	Ύ

N ·= az egyes csoportokba» lévő malacok száma

A sydrokmírigy-káríísodásoktnértékének csökkenéséi 4-böl 3, (A)-v»l immatózált malactsál, míg 3-bőí 1, (B)-keverékkel immunizált malacnál figyeltük meg. Ez a különbség nem volt szignifikáns (p>0,Ö5) a standard deviáció (síd)· magas értéke miatt.

A vírus kvantitatív újraízoiálását bronehíáhs és mszentérikus nyirokmirigyekböi preparált szövethomogemzátumokból végeztsk.

A bemutatott adatok a szövethomogemzátmookban lévő virustítereknek felelnek meg logjy-é átalakítva,

PCV-2-iiterek

Csoportok	Bnmcbíál középért.	is ny, mirigy std,	Mezentédkus ny.msrigy
fcözepértstd.	síd. N
(A)	0,9	ÖA	0,9	0,8	4
(B)	0,7	0,6	0,2	0,2	3
Kontroli	2,0	1,1	1,8	U	.<

Úgy tűnik, 'hogy a broncbiáiís nyirokmsrígyefc tartalmazzák a legfertőzőbb vírust Megfigyelhető & vb rusterbelés csökkenése az (A> vagy (S)-keverékkel immunizált malacok bronehiális és tsezemériku» nylrokmirígyeíben. Ez a csökkenés szignifikáns φ<0,05) plazmidkeverék alkalmazása eseté».

Vjfus^exkréciő;

A fertőzés márt vett ürűlékksnelben meghatároztuk a FCV-2 elterjedését, PCV-2-feői származó CRP-1.3 PCR-ampblíkáciéjávat. Az «gyes vizsgálati eljárásokat 2 mi mintán, bárom párhuzamossal végeztük. Vakcinát nem kapott kontroli csoport a fertőzés elölt negatív volt ECV-2-re, fertőzés után azonban pozitív lett, ami megerősíti a PÜR vizsgálati eljárás hitelességét.

Az értékek iog_!s~kést vasnak kifejezve (PCV-2-DNS-smlékölák száma 2 pl mintában).

	-27 -	♦ Φ se * « Φ ΦΦΦ
FCV-2-DNS-molekulák száma híg;.,-kém: kifejezve
Csoport	Kőzépérték	std	N
(A)	3,3	0,3	4
(A)	2,9	0,7	Ύ
Kontrollok	3,6	0,0	4

Az egyes csoportok közötti különbségek ne® szignifikánsak (p>ö,O5), //, ze/k«®vmpdká?

Malacok vakcinádéin kanáriblmlo-vírasból származó, élő vektorral, és eredmények

Császármetszéssel világra hozott, 3 vagy 4 malacból álló csoportokat a 0. napon izolátorokba helyezünk. A malacokat: a 2, napon beoltjuk (C)-ielü, ORF-13-at tartalmazó kanárlhimlő-virusssl, vagy (Dkjeiü, ORF-13-at és ORíM-et tartalmazó kanárfeimlő-vímssal, vágj' szólót kanárihimlö-virussal, 1 ml P8S~hen, IstramKSzkuiárísan a nyakon lévő- helyekre, A második: vakcinát vagy piacebot tartalmazó injekciót a 14,, .napon adjuk be. A malacok jól törték a ,k;márihimiövel való v&kelaáeiót, és a vakcmácsénak nem voltak érzékelhető mellékhatásai, A malacokat a 21, napon fertőzzük PCV-2-virasszöSzpenziö csronazális^ orrlyukanként M ml beadásával. A 45. napon nekropsziákat végzőnk, és szövetmintákat veszünk viruslzoiáiás céljából,

NSfeSÜSSaej^dmén^i:

PMWS-t· általában limfadenopátia, ritkábban hepatitisz vagy nelfltísz jellemzi, igy a nyirokmirígyekben szabad szemmel látható károsodásokat az alábbi kritériumok szerint értékeltük (pontozással):: 0 - nem látható nyifoktnirigy-megnagyobbodás; 1 - enyhe nyirokntirigy-ínegpagyobbodás, amely a bronehlális nyirokmirigyekre korlátozódik; 2 = mérsékelt nyiroktnlrigy-reegnagyobbodás, amely a bfoncbiális nykokmirigyekre korlátozódik; 3 ~ súlyos nyirokmirigy-megnagjObbodds, amely kiterjedt a bronchiáhs, snbmandibularis (állkapocs: alatti), pteszkapsznláris és lágyéki nytroknririgyekre.

Csoportok Fontok

IC) 0,5

0,0

1,0 középérték S,3S standard deviáció 0,48 (D) 0,0

0,5

1,0 középérték 0,5 standard deviáció 0,41

Komroiio.k 2,0

2,5

2,5 középerték 2,38 standard deviáció 0,25 ··*'»♦ *·*· * φ Φ * Φ φ Φ *-κ φ φ χ ♦ Φ<·9 ΦΦΦ φΦΦ ΦΦ ί»ί * ♦♦ **Φ ΦΦ

Bronehiálís llmfadcuopátia FCV-2 szesnbetenö, makroszkőpikussn látható megnyilvánulása. Nyirokmirigy-károsodások mértékének stegni&áss csökkenéséi figyeltek meg a kontroll csoporthoz viszonyítva <C>vel és (D)-vei való itetnuoaálás után (p<Ö,ö5).

/Apd/dn

A következő szakaszokat a ($9/138.352 sz, US ideiglenes szabadalmi bejelentésből idéztek.

A példákban alksl;nazotí FCV-2-szckvenciák Meeham és munkatársai [mist lenti által leirt szekvenciákból származtak (ORF1, 398-1342. nukieotidok; ORF2, 1381-314. nakientidök; és amelyek megfelelnek az VS 09/161,992, számú USA-beil .szabadalmi bejelentésben (1998. szeptember 25.) leírt ORF4-sek és OKF 13-nak, sorrendben, és a WO-A-99I82M. számú nemzetközi, közzétételi iratban leírt €GL4-nek és COL 13-nak, sorrendbeaj.

A plazmid kifejezésen a. leírásban bármilyen DNS-transzkripcíós egységet értünk pofinukleotidszekvencia formájában, amely az expresszálandó FCV-szekveneiát és ín vivő expresxziójához szükséges elemeket tartalmaz, A cirkuláris plazmídforma előnyős, szuperhellkálisan vagy másképpen, A lineáris forma is a találmány által igéiméit oltalmi körbe tartozik.

A találmány tárgyát képezik konkrétabban p3PlO9- (amely PCV-2-böi származó ORF2~gént tartalmaz,

1.1 ábra), pJPl 11- (amely FCV-2-höl származó ORFl-géot tartalmaz, 1.2 ábra). p5F12O~ (mely PCV-l-bőí származó ÖRF2-gém tartalmaz, 1.3 ábra) és pJP 12.1- (amely PCV-í-bőí származó ORFi-gént tartalmaz, 1,4 ábra) piazmidok.

Minden egyes plazmid tartabnaz promóterí abból a célból, hogy a gazdasejtekbeo az inszertált gén expressziója ennek szabályzásával legyen biztosítva. Ez általában erős eukarióta promóter, és különösen eítorneg&íovirushóí származó, CMV-iE-jefö korai prorttéler, amely humán vagy jágcsáióeredetü, vagy adott esetben más fajból, például patkányból vagy tengeri malacból származik, Áltslánossbban, a promóter vírusból származó vagy eeiltdárís eredete. CMV-ÍE-n kívül más vírusból származó promóterként megemlíthetjük az. SV4Ö vírusból származó korai vagy késői promótert vagy Rous Sarcomé vírusból szártsazó UTR-protnótert. Abból a vírusból szártsazó promótert is aikahtíazhaíunk, amelyből a gén származik, például a géme specifikus promóterí. Celluláris prömóterkéní megemlíthetjük oitoszke.iefon-génhöl származó protnótert, például dezminpromótert, vagy ezzel alternatív módon aktis-promóíert. Ha több, néhány gén van jelen ugyanabban a piartuidbau, akkor azok lehetnek ugyanabban a transzkripciós egységben vagy lehetnek két különböző egységben.

A plazmidök tartalmazhatnak más transzkripciós szabályzó elemei, például az iníroa, előnyösen nyálból származó β-glebío-géun.ek. megfelelő .11 tspnsú iníren stabilizáló szekvenciáit (vau Ooyen és mtsai., Science 206, 337-344 (1979)], szöveti, plszmmogéa-ahlí.vátor génje által kódolt fehérje szsgnálszdkveneugát [íPA; Mönígotnery és mtsai., Cell. Mól. Bioi. 43, 285-292 (1997)] és pofiadén Hálás! szignált (polyA), különösen tsarhaeredetú növekedési hormon (bGH) génjéből (>,122,458. számú USA-beli: szabadalmi leírás) vagy nyúleredete β-globm-génjéből származót

Most & találmány szennti megoldási részletesebben ismertetjük a találmány előnyős megvalósítási módját szemléltető példák segítségével, amelyekkel sem kívánjuk az Igényeit oltalmi kört: korlátozol, és tanelyekben az alábbi ábrákra hivatkozunk;

- 2.9 « 44X4 * * .,.. * * *«

4 « »4 4 « 44 » 4 4

V « V Λ * *4 * 44«

X « 4 * 4444 4*4 4

44« »* 44« 4 4 4 4X0 X»

Irt ábra:píPlOS-plaztnid

1.2 ábra; pJPI 11-plazmid

1.3 ábra: pJP120~plazmid

1.4 ábra: pl P I 21 -plazmid

1.5 ábra: pJPÖSS-plazmid

Saekvencialista:

27. azonosítószámú szekvencia: JP779. számú csligonukleotld

28. azonosítószámú szekvencia: JP780. számó oligonukleotid

29. azonosítószámú szekvencia: 3P781. számú oíigonnkleodd

30. azonosítószámú szekvencia: JP7S2, számú eligonukleobd

31. azonosítószámú szekvencia: JP783. számú oligonukleotid .32. azonosítószámú szekvencia.: JP784. számó oligonukleotid

33. azonosítószámú szekvencia: JP785. számú oligonukleotid

34. azonosítószámú -szekvencia; JP7S6, számé oligonukleotid ./2,/páFifo

A oJPtgfr-nlazsgKÍ előállítása

A ,,pGExM72-ImplölÖ Stoon-EeoRJ No. 14?’ plazmidoí, amely a PCV-2-vihts genomjúi tartalmazta EeoRl-Ragmens formájába® (B, Msehan és mtsai., J. Gsn. Virol. 79, 2171-2179 (1998)]. emésztettük EcoRIenzimmel abból a célból, hogy agaróz-géietektrolórézis után izoláljunk 1768 bázispár (bp) méreté EcoRldícűRl-fragmens® Ezt a Íragmensí öréígálásnak vetettük alá.

PGV-2-vlrus 1010-Stoon-ttoéböl [B. Meehan és mtsai., 1 öen, Virol. 79, 2171-2179 (1998); GenBank szekvencia nyilvántartási szánta: No. APÖ55392] származó, 0RF2-gé®t ampliSkáltuk polimeráz láncreakciót alkalmazó technikával (PCR), templátbém az önligálódoít EcoRldSeoRJ-fragmens, és az alábbi

JP779 (27. azonosítószámú szekvencia) (35 tagú):

- -GATGATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG--3' és 3P78Ö (28. azonosítószámú szekvencia) (36 tagú);

5' ~TAGTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC~3^f

730 bp mérető PCR-ftagmens előállítása céljából. Ezt a Ragmenst SallZRgllI-enzimekkel emésztettük abból a célból, hogy agaroz-gélelektroibrézís után izolállak a 715 bp méreté SalEBglIl-jelü restrikciós .íragmensí. Ezt a fmgxnenst azután pVR1012-plazmiddal. [Plartikkn .1. es mtsai., Humán Öeae Therapy 7, 1205-1217 (199Ó)] ligáitok, melyet előzőleg SalPBgin-enzánskkel emésztettünk, így jutottunk a pJP109-piazmidhoz (5567 bp) (.1,1 ábra).,

AJidUMí™

Polimeráz láncreakciót végeztünk a pGem72-lmpl819>-Stoon-plazmiddal (lásd 12.1 példát) [13, Meehan és mtsai., 1. Gon. Virol. 79,2171-2179 (1998)] és az alábbi oíígOHakieotídbkkal:

JP781 (29. azonosítószámú szekvencia) (35 tagú):

5·' •-CATGA7CATGTCGACA7GGCCAGGAAGAAGAA7GG-3^Í «Γ Φ ««« <««

-3Ö« « « χ* Φ ίχ * Φ X « Φ* ♦ 9 χ X * «♦ * **♦ φ * X »♦ « « » * * ««« X XX ·«« XX

ΙΡ782 (30, azonosítószámú szekvencia) (36 tagú):

5' ~TACTAC'TACAGA.TCTTCAGTAATTTA7TT'CAW'GG~3 ' abból & célból, hogy elóállltsök a ECV~2-víras GRFl-génjét tartalmazó, 970 bp mérete E€R-fragmensf. Ezt a (ragmesst Sall/Bglíl-en>z!mekkei emésztettek abból a célból, hogy agaróz-gélelekíroforézis után izoláljuk a 955 bp méretű SalEBgEl-jelö restrikciós ftagaseost Ezt a fragmensí azután pYRlÖlS-plszmíddal ligálmk (12,1 példa), melyet előzőleg SísIl/BgilI-et-zimekkel emésztettünk, igy jutottunk a píPl 11 -plazmidhos (5810 bp) (1,2 ábra).

Rolimetez láncreakciót végeztünk a pPCVi-plazmlddál ÍB. Meehan és mtsai,, J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997)), és az alábbi oiigosnkleotídokkal:

JP783 (31 azonosítószámú szekvencia) (35 tagú):

5^f -CATCA3^:CATG7CGAGATGACGTGGCCAAGGAGGCG--3'

JP784 (32. azonosítószámú szekvencia) (40 tagú):

S‘ - TACTACTACAGATCTTTATTTA7TTAGAGGGTCTTTTAGG--3' abból a célból, hogy előállítsak a BCV-l-víras ORR2-génjét tartalmazó,, 73Ő bp mérető PCR-rfagmcnst (PK-15~törzs, GenB&nk szekvencia nyilvántartási száma: No.. 1149186). Ezt a fragmensí SalYBglIí-enzlmekkel emésztettük abból a célból, hogy agaróz-gélalekíroíbrázis «ián izoláljuk a 715 bp mérető SaJí/Bglfí-jolS restrikciós ffagmssst. Ezt a feagraenst azután pVR1012-plazmidda! lígáltek (12,1 példa), melyet előzőleg Sall/Bglllenzimekkel emésztettünk, ígyjutotemk a p.íPi2Ö~piazmídboz (5565 bp) (1.3 ábra),

22,4 «'/k'míc/upd/dff

Á pJEíSl-olazinid (FCV-l-GRFi i előállítása

A pPCVl-plazmídot, amely a FGVl-víras genomjáí. tartalmazta Psíi-frsgmens formájában {&. Meehan és mtsai., .1. Gon. Virol. 78, 22.1-227 (1997)], emésztettük Esti-enzimmel abból a célból, hogy agarözgéielekírofórézis után izoláljuk a 1759 házaspár (bp) mérető PstlAVtl-Sagmenst. Ezt a fmgmenst önllgálásnak vetettük alá.

ECV-1-vlrys PK-ÍS-tÖrzséböi (B. Meehan es mtsai., I Gén, Virol. 78, 221-22? (1997); GeuBat?k szekvencia nyilvántartási száma: No. ΐ.149186] származó, ŐRE 1 -gént ímsplirikáltak polimeráz láncreakciót alkalmazó technikával (PCR), tempiátként az önligálódott Pstl/Fstl-lragmens, sz az alábbi öllgonakleoíidok á&ataazásával:

JP7S5 (33, azonosítószámú szekvencia) (35 tagú):

5^f-CATCATCATGTCGAGAYGCCAaGGAAGAAAAGCGG-3^fés JP7&6 (34. azonosítószámú szekvencia) (36 tagú):

5' ~?ACTACTACAGA^!rCTTCAGTAA2^!:rTATTTTATATGG- 3^f a POM «vírus (ΕΚ.-15-törzs) ŐREI-génjét tartalmazó, 965 bp mérete ECR-fragmens előállítása céljából Ezt a riagmeasí Sail/BgíIl-enzámekkel emésztettük abból a célból, hogy ngarőz-gélelektroíbrézís után izoláljuk a 946 bp méretű Sall/BglII-jelő restrikciós íragmensk Ezt a úragmenst azután pVK.i0!2-plazmíddsl 02.1 példa) lígáltek, ígyjutotemk a píPI2l-píazmidbez (5804 bp) (1.4 ábra).

φφφφ

« Φ 9 ΦΧ» ΦΦ φ φ * Φ Φ φ X Φ Φφ φ 9 Φ » Φ Φ Φ Φ 9 φφ *» *

ΦΦΦ

ΦΦ

A oTPŐSP-nlazinid (sertésből származó GM-CSF-et ss^ressaál) előáHltása

Sertésből EDTÁ4 tiMalmazó csőbe vettünk vért, a jugularis vénából. A mortosmkfesrfe .sejteket cetdrifugálássai elkülönítettük Fleoll-grsdhmses, és azután út v/rro tenyésztettük RPMÍ lő4Ö-tápközegbes (öibooBRL), és koakítnavaltn-Á (Sigma) hozzáadásával stimuláltak, amelynek végkottoentráelója a tenyésztési tápközeg kőtülbeb'j.15 ugdnl volt. 72 órás stimulálás után, a liomfobiasztökat etelönöettök, és ezekből a sejtekből totál RNS-t extraháltunk „Miero-Seaíe Totál RNA Separ&tor Kit (Clontech) aikalntazásával, a gyártó utasításai szerbit. Revem transzkripciós reakciót „l^-Sü&nd cDNA Syx-thesis Kit (Perkín-Eimer) reagenskészlet segítségévei, azt követően polimeráz láncreakciói végeztünk a sertésből származó tímíoblasztokhól extrahált RNS-eo, az alábbi ollgonukleoíldok alkalmazásával:

RÖ972 (33 tagú):

5’ TATGCGGCeGCCACGA2^<GTGGCTGCAGAACCTG3^í és RÖ973 (34 tagú):

5' TATGGGGCCGCTACG?A7CAGTTGTGGGC7^:GGTT3^f abból a célból, hogy' előállítsunk körülbelül 450 bázispár (bp) méretű PCR-fetgmsnst. Ezt a feagmensí Noíl-enzimmcl emésztettük abból a célból, hogy a 450 bp mérető NothTlotl-feagmensí agarőz-gélelektroforézissei izoláljuk. Ezt a íragmensi azután pVRIÖIG-píaxmíddal (12. i példa) ligáitok, melyet előnyösen Notlenzimmel emésztettünk és defeszforilálíunk, így jutottunk a p.TPö58-piazmidhoz (54Ö5 bp) (1.5 ábra). A pGMCSE-gérs pJFŐők-plazmídba klóttszolt szekvenciáját: ellenőriztük, és azt találtuk, hogy azonos a GenÖankadatbazlsban (B21Ö74. nyilvántartási, számon) rendelkezésre álló szekvenciával.

Tiszt itatt;

íáhstása sertések va

Escherfohi#· oo.'/ K12 baktériumokat ÍDHlöB vagy SCS1 -törzseket) transzfermálhink a 12.1 példában.

fentebb leirt pJF 1Ö9-, p,lp 111 -, pJP058-, pJP 120- és píF 121 -plaztnldokkal, Áz így kapott, öt plazmiddal transzformált klánokat azután külön-külön tenyésztettük 37Χ-οη razatva, Usia-Broöt-fóle (Lö) tápközegben, A báktérinmok tenyésztését az exponenciális fázis végén íeáílítettnk, és a plazmidokat alkaiikus iizist alkalmazó technika szerint extraháltuk. Az extrahált plazmidokat azután cézium-kiorid-gradlensen tlsHitottuk Sambrook és munkatársai által leírt (“Moleeular Biology: A Labor&íory Marasd, 2.. kiadás, 1989, Cold Sprisg Harbor Laboratory, Cold Sprlng Harbor, NY) technika szerint. Az etídíum-hromid utolsó extrakelöja és abszolát etanoiban jelenlétében v&ió kícsapás után, a tisztítót! plazmidokat félszuszpenőáiíuk TE-puiferben (1 mM Tris/EDTÁ, pH 8,0) abból a célból, hogy előállítsunk 2 mg/ml piazmidot tartalmazó törzse Idátokat. Ezeket a törzsoldatokaí -2Ö*C-on tároltuk felhasználás előtt.

FCV-2-yírnshóí.szármgzó<)BF;l,ésORFy2,^gr^sglójtek^gM>vgá§a

Abból a célból, hogy a pIP109~ és pJRll 1-plazmídokba klónozott, PCV-2-ORE2- és PCV-2-ORP1génsk termékeinek expresszióját szabályozzuk, ezeket a píazntídokat CHO-KI-sejtekbe (kínai hörcsög petefészkéből száramé sejtek, ATOC No, CCL~ól) transzfekzáitnk Lípoíectamín Plus^ transzfekcíós reagenskészlet (Gíhco-BRL, Kat.sz, 1Ő9Ő4-Ö13) alkalmazásával a gyártó használati utasításai! köveivé.

A transzfekciö mán 48 órával a tomszfskfált sejteket mostuk és 95%-os jégaceton-oldattal fixáltuk 3 * Χ*ΦΦ » * ^Λ ** φ φ.« φ * . *

Φ- ♦ » * φ *χ * ♦♦♦ φ Φ ¢. » ΦΦΦ* Φ χ Φ * •Χ··γ ΦΦΧ #φ ΦΦ* * ΦΦ β$Χ X* percig, szobahőmérsékleten. .PCV-l-OFl-fehéíjto? <fl99 1D3GA és E21Ö 7ÖSGD) és ÖRF2-fehériékre (Pl90 4C7CP, F190 281BC és P19Ö 3A8BC) specifikus, öt mosoklonáhs ellenanyagot alkalmaztunk első ellenanyagként. Cy3-al jelölt, arüi-egér-IgG-konjngáturnoi atobaazttmk a specifikus jelölödés megjelenítése céljából. PCV-2-speeifskus fluoreszeenciáí 3 PCV-2~ORf2-monoklonálissai azokban a sejtekben Sgyeltösk meg, amelyeket a pJPlö9-plazmiddaí tmaszfektáhunk, de azokban nem, amelyeket a pTFill-plaznndds! transzfektáitunk. Ezzel ellentétben,. PCV-2-specifikas Euoreszceuciát 2 PCV-2-öRH-nmok1oaá1issal azokban a sejtekben ügyeltünk meg, amelyeket a pJPII Ϊ-plazmidda! transzlektáltunk, de azokban nem, amelyeket a p3Píö9~ pktxmiddal transzísktáltunk. Nem detektáltunk Suoreszeenciát a PCV~2-mosoklouállsokka! pVR!öi2plassriddai egyedül transzfektált CHO-sejtekben vagy' nem-transzfektáh COO-sejtekben.

Ugyanazt az expressziós eredményt kaptuk PCV-2-vlrusra specifikus, poiiklonális szérummal. Ebben az esetben Suoreszceinnel jelölt, anti-sertés igG-konjugáítanoí alkalmaztunk a specifikus fluoreszcencia detektálására, Nem detektáltunk fluoreszcenciát ezzel a pollkfonáils szérummal olyan CHO-sejtekbea, amelyeket pVR.10!2~pl3zs»íödal egyedül iranszfekíáítenk vagy nem-transzfekíált CHO-sejtekben, /3.9 peá/a

12,8.1 Egynapos malacok

Izolációs egységbe helyeztünk az elj árás DÖ. napján császármetszéssel világra jött malacokból álló csoportokat. Ezeket a malacokat 2 napos korukban öltöttük intmmnszkuiárisan különböző, vakcinaként működő plazmid-oldatokkai, A vakcinaként működő oldatokat forzsoidat hígításával állítottuk elő steril, fiziológiás nátrium-klorid-oldatban (ö,9% NaCI),

A malacokat az alábbiakkal oltottuk:

p.?P 109-plazmiddal egymagában vagy p/P 109- és pJFi 1 1-plazmidokből álló keverékkel vagy pj ί·η 09- és píPÖSS-plszmídokból álló keverékkel vagy pJP 109- pJPl 11 - és píPÖ58~pkizuudokböf álló keverékkel.

A vakcinaként működő oldatok 5ÖÖ pg plazmídot tartalmaztak. Térfogat; A vakcinaként működő oldatokat imrámuszkulárisan oltottuk 2 ml össztérfogatban. A gyakorlatban, a malacok életkorát {1-2 napos) alapul véve a vakcinádékor, 1 ml térfogatú, 1 injekciót adtunk a nyakba, mindkét oldalra (” 2 χ 1 ml).

Két vakc-ina-bjekciöt adtunk be két hét idókölönbséggel, azaz az eljárás D2, és D14. napján.

Az eljárás D21. napján fertőztünk virulens FCV-2-törzsböl készült víms-szuszpenzlö oronazális beadásával. A malacokat azután 3 hétig Egyeltük, hogy megjelennek-e az elválasztás utáni, mnkíszisztémás sorvadás! szindróma specifikus klinikai jellemzői a malacokban. A vizsgált j ellemzők az alábbiak voltak:

Rektálís hőmérséklet: naponta mértük az első 14 napon, majd két mérést végeztünk a fertőzés utáni 3, hétsn.

Tömeg: a malacokat lemértük közvetlenül a fertőzés után, azután hetente egyszer a fertőzés követő 3 héten keresztül.

Vérminták vétele virémla és ellenanyagok jelenléte céljából; vérmintákat vettunk a D2,, D!4„ D2L,

D28., D35 és D42. napon.

Autopszís: a D42. napon a túlélő sertéseket humánusan elpusztítottuk, és autopsziának vetettük alá ana- .73 * ««««

Φ« Λ * 0 « Φ X *'*-♦. φφ <r « ·,· * Φ ΦΦ ψί φ χ' * *Φ Φ φ ♦ Φ * *« * *«Φ

Φ Φ*Φ» β * « *

ΛΚΦ Φ «X «ΦΦ ΦΦ íőmias-pstolőglat károsodások keresése céljából, és májból, pylrokm-lrigyekből, lépből, vesékből és csecsemőmirigyből származó, hisztoiőgiaí preparátumok készítése céljából, ezen szövetekbe» előforduló károsodások keresése céljából.

12.8,2 S~? hetes malacok

PCY-2~vírosra specifikus, anyai ellenanyagokkal már nem rendelkező 5-7 hetes malacokat oltottunk intramuszkulárfean:

pJP 109-plazmiddal egymagában vagy pIPÍ 09« és pJPl1 l-plazmidokból álló keverékkel vagy pJPl09- és p.lP0S8-plazmídokból álló keverékkel vagy ρ JP 109- ρ JP 111 - és p.lFÖ5 Ő-pluznsidokból álló keverékkel,

A vakéba dózisai ugyanakkorák voltak, mint' a 12.8,1 példában leírt dózisok:.-(500 ggZplwtód). A vakcinaként működő oldatokból 2 rrd-t injektáltunk íntrarnnszkuíárisan (2 ml egyszeri beadása a nyakizmokha).

Két vakcina-injekciót adtunk be 21 nap ídőkülönbséggeí (DÖ. és !>21, napon). Az utolsó vakcinámé után 14, napest (D35) fertőztünk virulens P€V~2~törzxből készült víras-szuszposmíó intramnszkaláris beadásával,

A malacokat azután 8 hétig ügyeltük, hogy előfordulnak-e az elválasztás utáni, muíöszisztémás sorvadás! szfedrásna specifikus klinikai jellemzői a malacokban, A malacok klinikai kővetése a fertőzés süán megegyezett a 12.8.1 példában. leírtakkal, kivéve art, hogy a- megfigyelés teljes időtartama 8 hét veit.

/2,9 referencíopd/úő

Sertések vakdnáelófe IlMRIE-DOFE-val fnrmázort RNS-sel

A 12,8 példában leirt, csupasz plazmid-DNS-oldat helyett DMRIE-DOPE-ban formázott plazmid-DNSoldaíot is lehet alkabnaztri. 1 mg-'ml-es DNS-oldatot készítünk 0,9%-os NaCl-beu (amely a 12.6 példában leírt egy ^VW löbh ptenídoí tartalmaz). 0,75 tuM DMRIE-LWE-oláaíoí készítünk úgy, hogy DMRJ&DGPEd felvessünk alkalmas térfogatú steril, desztillált vízben,

A plazndd-DNS.Őmfionos llpid komplex kialakulását hígítással érjük el úgy, hogy a ö,7S m'M DMR1EDÖRE-oldatot hígítjuk azonos részben az 1 mg/ml-es, 0,9%-os NaCl-ban lévő DNS-oldattaí, A DNS-oldatot fokozatosan adagoljuk be 2őG tővel felszerelt fecskendő segítésé vek a kalionos lipld-oldaíoí tartalmazó edény fala mentén úgy, hogy slkerüijük a habosodért. Enyhén mzogstjuk, mihelyt a két oldatot összekevertük. Végül 0,375 mM DMRIB-DOFE-t és 500 pg/ml DNS-oldatot tartalmazó készítményt kapunk.

Kívánatos, hogy valamennyi oldat szobahőmérsékleten legyen a fentebb leírt valamennyi müvelefhez. A DNS/DMRlE-DÖFE-kompiex kialakítását szobahőmérsékleten végezzük, 30 perccel a sertéseknek való beoltás előtt.

A sertéseket azutánii 12.8.1 és 12.8,2 példában leírt föltételek szerint oltjuk.

A következő szakaszokat a őö/' l 38 352 sz. US ídeigle-nes szabadalmi bejelentésből idéztük.

Az ÖRF1 (Meefaaa és mtsai., 1998; megfelel a 98 Ő37Ő7. számú francia szabadalmi bejelentésben leirt

COL4-nek) a 398-1342. sukleotidokat tartalmazza (GettBank nyilvántartást száma: AFÖ55392), és potenciálisan

37,7 kD előre jelzett molékulatömegü feltétjét kódol. Az ORE2 (Médium és mtsai,, 1998; megfelel a 98 037Ő7.

számú francia szabadalmi bejelentésben leírt COLI 3-nak) az 1381-1768, nukföotidokáí az 1-314.

f· 00

- 34<0 * * «* » «*«ι* 0 X *ί » ** * 0 ««« «X nukleötldokhoz kapcsolva tartalmazza (GenBank nyilvántartási száma: AF055392),. és 27,8 kD előre jelzett nmlekulstömegú fehérjéi kódolhat

A találmány szerinti megoldás jobb megértése céljából & csatolt ábrákra hivatkozunk, amelyekben:

A 2.1 ábrán (lé. azonosítószámú szekvencia) bemutatjuk a G6 nyitott leolvasási fázist tartalmazó ALVAC-DNS 3,7 kiiebázispár méreté iragmensének mtkleoíiászekvenc iáját.

A 2.2: ábrán bemutatjuk a pJPlOz-donotplazmid íétképét.

A 2.3 ábrán (8, asososhőszámú szekvencia) bemutatjuk a pIP ÍÖ2-do»orplazmtdfoől származó, Kpnlhasítőhelytől (ő53. helyzet) Sacl-jslö restrikciós hasííóbeiyig (3166. helyzet) terjedő, 2,5 kíloházispár méretű fragmens nuklerstidszekvencíáját.

A 2.4 ábrán bemutatjuk a píPíöó-dunorplazHüd térképét.

A 2,5 ábrán besnntaljuk a pJPlö?-döwpteaíd térképét,

A 2.6 ábrán (11. azonosítószámú szekvencia) bemutatjuk a p.iP107-donorplaznrldból származó, Rpnlhasítőhelytöi (653. helyzet) Sací-jelü restrikciós basitóhelyíg (4255. helyzet) terjedő, 3,6 küobázispár méreté íragmens nukleetidszekvenc iáját,

A találmány tárgyát képezik rekombináns himlővsrtíSök, amelyek PCV2-ból származó DNSszekvenciákat tartalmaznak a hímlövírus-geuomjásnk nem-esszeneiálís régiójában. A rekombináns himióvífusok idegen PCV2-gén géniensékes képesek expresszálni. Különösen PCV2-fehérjéket expresszáló ÖRF2- és ÖRF1généket izoláltunk és inszertáltunk ÁLYAC-rekombinánsokba (kanárihimiő-vektor). Sarabrook és munkatársai (1989) által leírt molekuláris biológiai technikákat alkalmaztunk.

Seltvonalak és vírustörzsek. ..Imp.lÖlO-Stoori’-jelÚ PCV2~tőrzxei korábban már leírták (Meefeaa és mtsai,, 199S). Kfezentérikus nyúotairigy-szSvetökböl izolálták, Kanadából származó, beteg sertésekből A P€Y2-genom klónozását Meefean és munkatársai Írták le (1998). A ,,pGesn?Z4mpIöÍ8-SíOGB-EcoRI No. 14 plazmid EcoRl-fragmenskétó tartalmazza a PCV2~genomot, a pGem-7Z-plazmid (Promega, Maáison, Wl) EcoRI-hasltóbelyébs iuszertálva. Az Í!»p.lÖlö-St<íi?n-PCV2rtörzs teljes nukleotidszekveaeiáját Meenan és munkatársai (1998) határozták meg, és rendelkezésre áll AFÖ55392. GenBaoh nyilvántartás) számon.

A szülői kanárihimlo-vírus (Rentséhier-törzs) kanárikban alkalmazott vakcínatörzs. ?k vakcínatörzset vad típusú izolátumok nyertük ki, és le volt gyengítve több, mint 2QÖ egymás utáni passzáiással csirkeembriőből származó fíbroblasztokon. Egy mintaoltást négy, egymást követő plakk-íísztításnak vetettünk alá agaron, amelyből egy piakk-klőot őt további passzáiással ampliitkáiítmh, utána a viruskészletet alkalmaztuk szülői vírusként to vto'ö rekombinációs tesztekben. A plakk-tisztított kanáríhirnlö-lzolátenoí ALV.AC-nak jelöltük. ALVAC-ot 1996. november 14-én deportáltuk a Budapesti Szerződés szerint az „Ámericaa Type Cukoré Colleedon~nál, VR-2547. ATGC-nyíivántartásí szám alatt.

Kanáríbímlő rekombinássok előállítása különböző lépésekből áll: (1) mszercíós plazmid előállítása, amely a hlntlővt'rus-geaomban lévő, átszerelés lókuszt szegélyező szekvenciákat („srtns”) és többszörös klónozó helyet (M€S> tartalmaz a két szegélyező kar között (lásd például a 13.1 példákat! leírtakat); (2) dnaorpiazmidok előállítása, amely mszemiós piazmidot tartalmaz, amelynek MCS-jébe idegen gén expressziős kazettája vau iuszertálva (lásd például a 13.2-13.5 példákban leírtakat); (3) ö? rrtro rekombináció sejtíenyészetben a donorplazmkl karjai és a szülői himlovíms genomja között, lehetővé téve az idegen gén expresszíós kazettájának inszercióját & himlővírus genontiának megfelelő lókuszába, és .a rekombináns vírus piakk-iisztitása (lásd példán!

* * » * *·♦ a 13.6 példát), /5.3 reféreríNupd&ás

A 2.1 ábrán bemutatja kanárikímlő-DNS 3,7 kb méretű szegmensének szekvenciáját (16, .azososítószámú szekvencia), A szekvencia analízisével kimutattunk egy ORF-et, melyet CóL-kéni jelőitötxk, és amely a 377. helyzetben kezdődött és a 2254, helyzetben végződöd. Az. alábbiakban leírjuk egy C6 kiszerelés piamid előállítását, amelyben deietáljuk a Cő-ORP-et és helyetlesítjök transzkripciós és transzlációs szignálokkal szegélyezett, többszörös klónozó hellyel (MGS-vel). 388 fen mérető PCR-&agmes»t amplífikúlhitik genomí kamárshnnio-DNS-bők C6 A1- (21. azonosítószámú szekvencia) és CöBí-jelő (22. azonosítószámú szekvencia) láneináiié oiigrtnükieotídok aOtalntazásávak 1155 bp mérető PCR-fragtnenst ampliSkáhnnk genoini kanáribimlö-DNS-bói, C6CÍ- (23. azonosítószámú szekvencia) és CóDl-jelú (24. azonosítószámú szekvencia) láncrndííó öiígonokleoíidok alkalmazásával. A. 380 bp és a 1155 bp mérető PCR-fragmenst egymáshoz fuzionáltuk, terápiáiként egymáshoz adva azokat, és .1613 bp mérető PCR-fragmenst amplífíkáihtnk C6A1- (21. azonosiiószémú szekvencia) és CöDl-jeiő (24. azonosítószámú szekvencia) lástóndító oligonnkleotidok alkalmazásával. Ezt a iragmenst Sacl/Kpn.l-enzímekkei emészíettök, és Sacb'Kpnl-erszímekkel emésztett, pBhtescript SK+ vektorba ligáitok (Stratagene, La Jolla, CA, USA), Az eredményűi kapott pCSL-píazmíd szerkezetét DNSszekverseiaanaiízissel igazoltak. Felépítése; 370 bp méretű kanárihlmiő-DNS Có-tól (,,Có bal kar”) szintézisiránnyal szemben, tehénlúmlö-vírusbóí származó korai tertninációs szignál, transzlációs stop-kódosok hat leolvasási fázisban és Smai~_s Psí.1-, Xttol- és EcoRl-hasítöhelyekkel rendelkező MOS, íeiíéshtmlő-vírasböl származó korai termináciős szignál, transzlációs stop-kódosok hat leolvasási fázisban és 1.156 bp méretű, 3'-végi kanáribintíö-szekveneiá (,,C6 jobb kar”).

A p3Pö99-plazmid p€6L«hői szfenazotk pC6L Smal/EcoRÍ-hasitóhelyében lévő idegen génhez kapcsolt, tehénbirniő-eredetű Hó-pramotert tartalmazó kazetta ;[Tayior és mtsai,, 1988c; Guo és mtsai., 1989; és Perkns és mtsak, 1989] ligáíásával.

A pJPÖ99-pÍ3Zírdd egyedi EcoRV-hasiíóheíyei: és: egyedi Nrul-hasítóbelyet tartalmazott a Hó-promótor S’-végénéi, és egyedi SaH-hasítöbelyei tartalmazod az idegen gén STOP-kódonja és a Có bal karja közöd. A pJPO99-böí származó, kb. 4,5 kb méretű EeoRV/Ssil- vagy NroESali-Ragmens tehát tartalmazta a piaztoidszekveneiát (pBhtescript SK.+; Síraíagene, La Jolla, CA, USA), a 2 db Có-kart és -a Hő-promóter 5’~ végét az EeoRV- vagy Nrul-hasiíébelyig.

C6A1 (21. azonosítószámú szekvencia) ítfecíudító olígonukleotid:

ATCATCGAGCTCGGGGŐiCGCCTATCAAAAGTCTCAATGAGTT

CóBl (22, azonosítószámú szekvencia) láncmdltó olígonnkleotid:

GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTCACAGCTAATTAGTCATTTTTTC

GTAAGTAAGTATCTTTACCTAA

C6C1 (23, azonosítószámú szekvencia) fáncíndító oiigomikleotid:

GCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTAJTGATTAACrAGirCAAATGAG

TATATATAATTGAAAAAGTAA

- 36 * φ φφ φ _κ * *ϊ φ »««

Φφ Φ X * « * * Φ ΦΦΦ φφ φ*

0501 (24. azonosítószámú szekvencia) lánciudltó oligonukleotid: GATGATGGTACCTTCATAAATACAASTTTGATTAAACTTAAGTPG

ALVAC-danornlaznissí előállítása P€¥2-ORF2-re

A „pGEM7Z-ííspi9iÖ-Stoon-£ooRÍ No, 14,” piazmidot, amely a PCY2-gsnomot tartalmazta EeoPJfragtsens formájában pGera-72-píazmídban, emésztettük EeoRI-enzimmei, és 1768 bázíspár (fep) tnémíS íragmersst izoláltunk és tíszhiníinnk.

PCV2-ORF2 megfelelő ALVAC inszerciós vektorba való mszertálása céljából, 3P768-jeiü <25. azonosítószámú szekvencia) és JP7?3-jeífi (26.. azonosítószámú szekvencia) láncmditó oligonukleotidokat alkalmaztuk PCV2-ORF2 ampbftkáiása céljából az 1768 fep méretű, ligáit EcoRI-rragínensből (lásd fentebb), így J13Ö4-hez jutottunk. A ,5P7őÖ-jelü láneindító oligonukleotid (25. azonosítószámú szekvencia) tttriaimazza a Hő-promóter 3’-végét EcoRV-basítőhelytől, és az PCV2-ORF2 5’-végét, A jP773-íeiü iásesndító olígonnkleobd (26. azonosítószámú szekvencia) tartalmazza a PCY2-ORE2 3’~végét, melyet Sall-hasitóhely követ, A PCR terméke J13Ö4 volt, amelyet azután EcoRVíSaií-enzimekkei emésztettünk, és körülbelül 75(1 bp méretű Sapiensként klónoztuk pJPÖ99~plaznüdfeól származó, körülbelül 4,5 kb méretű EcoKV/Sali-fimgmensbe (lásd lentebb a 13.1 példában). Az eredményül kapott plazmid szerkezetét szekvencla^an&lizíssel Igazoltak, és pIP102-fiek jelölőik (p3'PlÖ2 térképét lásd a 2.2 ábrán, és szekvenciáját 8. azonosítószámú szekvenciaként a 2,3 ábrán). Az ORP2 szekvenciája egyezik a GenBank-ban található, AFÖS5392. nyilvántartási számon rendelkezésre álló szekvenciával. A pJlÖ3öönorplazsnkloí (N'otl-el lísearizálva) űr vitro rekombinációs (ÍVR) tesztben alkalmaztak vCPiől4-jelü ALVAC-rekotnbínáns előállítására (lásd 13.6 példa),

JP76Ö (25,. azonosítószámú szekvencia):

CAT-CAT-CAT-GAT'-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCAAGG “· AiGG —CG

1P773 (2ó. azonositószámü szekvencia):

TAC~?AC“TAC~GTC-GAC-TTA-.GG.Ö~TTT--AAG-'TGG“GGG-GTC /3.3 refereociepéí&jt

PCV2-ORFl-et PCR-rel antplifikálfemk, .íP774-jelö (9, azonosítószámú szekvencia) és 3P775-ielű (l ö. azonosítószámú szekvencia) lánc'mdiíó oiigonnkloötídok alkalmazásával a ,,pfíEM723ímpí0iö-Síööo~BeoRI No, 14,” plazmidon, így PCR .1131 i-hez jutottunk, A <ÍP?74-jeÍü láncinditó oligonukleotid (9, azonosítószámú szekvencia) tartalmazza a Hó-promoter 3'-végét birul-hasítófeeiytól, és az PCV2-0RFI 5’-végét. A 3P775-jelü lántíndítö olígöbükisotid (10, azonosítószámú szekvencia) tartalmazza a PCY2-ORFI d’-végét, melyei SsHhasítóhely követ, A PCP. terméke .11311 volt (körülbelül 1 kb méretű), amelyet klónozűtk p€R2. í-phzmidbs (InYÍirogen, Carlsbad, CA), Az eredményül kapott plazmid szerkezetét szekvencia-analízissel igazoltuk, és pJPÍö4-nek jelöltük. Áz. ORF1 szekvenciája egyezik a GenBank-ban található, A.F855392. nyilvántartási számon rendelkezésre álló szekvenciával. Körülbelül 97S bp tnéretü Nnrl/Sall-fregmenst izolálínnk pJPb94-höl, és píP099phztnídhól származó, körülbelül 4,5 kb méretű NrnPSaÜ-frugmenshe (lásd fentebb az 13.1 péídábttn) klónoztuk, az eredményül kapott plazmid szerkezetét restrikciós analízissel igazoltuk, és pJPl 85-nek jelöltük * » *

-37(lásd .2,4 ábrái:). A pJPIöő-donorplazmídoi ;« rtó-o rekombinációs (a I3,ő példában leírtak szerint) tesztben tehet alkalmazni RCV2-ORF-I-et expresszátei képes, ÁLVAC-rekombináns előállítására.

A p)P 102-piazmidból származó, körőibelúi 838 bp mérető RamHI/Sail-el (lásd 13.2 példát) tompa vésővé alakítottuk BNS-polimeréz Kíermrv-feagmenséveh és pJPlöő EeoRI-basitófeeiyébe klónoztok, amely {Clenow-frsgfaeassel volt tompa végűvé alakítva. A klóitokat restrikciós analízissel ellenőriztük az inszert orientációjára, és a fej-fej orientációi kiválasztották. A plazmid szerkezetét szekvencia-analízissel igazoltak, és pJIG Ö?-nek jelöltök (pIPÍö? térképét lásd a 2.5 ábrán, ás szekvenciáját II, azonosríószámú szekvenciaként a 2.ő ábrán), A p.lp ÍÖ7-donofpla;nnidot: (Nbtí-el linesrizálva) fe v;W rekombinációs 5 (ÍVR) tesztben alkalmaztuk vCPIóLÓ-jelűÁLVAC-rekotnbmáns előállítására (lásd 1:3.0 példa),

JP774 (9. azonosítószámú szekvencia);

'CZ^T-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CGG—TT'A-ACT-TTC-'TAT-CGT-AAT-GCCCAG-CAA-GAA-GAA-TGG

7P775 (10. azonosítőszáms szekvencia);

TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TGA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG

33,7 ze/breneröpe/ds

ALVÁOáoaorptazmld előállítása PCVl-ORF2-rc

A pPCVI-plazmídot, amely a PCVI-genetnot Rsű-feagmens formájában tartalmazta a pGem-7Zplazmidhan [B. Mádba és mtsai,, ,1, Gén, Virol. 78, 221-227 (1997)}, alkalmaztuk terápiáiként FCVI-0RF2 amplifikálására,

RCV2-ORF2 megfelelő ÁL VÁC inszerciós vektorba való ínszertálása céljából; jP787-jelő (12, szonoslíőszárnú szekvencia) és JP7S8-jelő (13. azonosítószámú szekvencia) láneíndltó oligonukteotidokat alkalmaztuk PCV1ORP2 amplírikálásána pPCV í-pfezndbből (lásd fentebb), igy' PCR 71315-hez joíothmk. A 7P?8?-jelű lánclnditó oligonufcteotid (12. azonosítószámú szekvencia) tartalmazza a Hő-promóter 3’-végét EeoRVhanitóhclyíbl és az 0RJF2-1, melyet Sail-basstóhely követ. A PCR. 713154 azután EcoRV/Sall -enzimekkel emésztettünk, és kórSlbeiüi 750 bp méretű fragmansként klónoztak pjP099-plazmidl>ó|: származó, körijíbelöl 4,5 kb mérető EcoRV/Sail-Ragnrensbe (lásd fentebb a 13.1 példában). Az eredményöl kapott plazmid szerkezetét szekvencia-analízissel igazoltuk, és pJPI 13-nak jelöltök. Az 0S.P2 szekvenciája egyezik a GenSank-ban található, U49I86. nyilvántartási számon rendelkezésre álló szekvenciával. A pJID-áonorplazmidot (Noti-ei imearizálva) ót vbro rekombinációs (ÍVR) tesztben alkalmaztuk vCPlő2I-jelö ALVAC-rekombináns előállítására (lásd 13.7 példa).

tánernöito oligonahleötldök szekvenciája:

JP78? (12, azonosítószámú szekvencia);

CAT-CAT-CAT-GAT - ATC-CGT ~TAA~ GTT-TGT-ATG-GTA-ATC-AGG-TGG-C C AAGG-AGG-CG

JP788 (13. azonosítószámú szekvencia):

TAG-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G

-38φ* ** X V φ φ φ φ φφ φ «φφφ « φ *Φ* » ίν «♦ » X :* » 9 9

Φ X φφφ φφ

I4. 5 rej&exefep&fa

A pPCVl-plaamídöi (lásd 13,4 példát fentebb), amely a 'PCVI-genotnoí Psti-fragmens formájában tartalmazta a pGem~?Z-piazmidháa, Esti-enzimmel emésztettük és 1759 bp méretű fragmensként izoláltuk és ligábak,

JP7S9-jelS (14, azonosítószámú szekvencia) és jP790-jelő (15. azonosítószámú szekvencia) láncmdltó oiigottukleotidokat alkalmaztok PCVi-ORPí amplífrkálásám, a ligáit, 1759 bp mérető Pstl-lragmensből (lásd téntebb), igy PCR M 316-hez jutottunk, A jP789~jeiü iássinditó olígottakleotld (14, azonosítószámú szekvencia) tartalmazza aHó-promóter 3’-végét Nrol-baslíóbelytői és a PCVl-ÖRFl 5’-végét, melyet S&ll-hssitóhely követ. A 3P790-jelö láneinditő oligunakieotid (15. azonosltöszáínú szekvencia) tartalmazza a PCVÍ Q&Fl 3'~végét, melyet SaH-feasítőhely követ, A 11316-jelö FCR-ternséket (körülbelül 1 Kb méretű) azután pCR2, J-be klónoztok (Invítrogen, Carlsbad, CA), Az eredményűi kapott plazmid szerkezetét szekvencia-analízissel igazoltuk, és p3Pl!4-nek jelöltük. Az ORF1 szekvenciája egyezik a GeoSunk-bao található Ü49186. nyilvántartási számon rendelkezésre álló szekvenciával, Körülbelül 97ö bp méretű Nroi/Sail-kagmeost izoláltunk pJPUA-böl, és p,iF099~plazmídból származó, körülbelül 4,5 kb méretű N'ruI/Sali-lragmettsbe (lásd fentebb a 13.1 példában) klónoztuk, az eredményül kapott plazmid szerkezetét restrikciós analízissel igazoltuk, és pJPl 15-nek jelöltük, A plPl 15-donorpiazmídöt in vón-o rekombinációs tesztben lehet alkalmazói FCVl-ORFl-et espresszálni képes, ÁLVÁC-refcombioáns előállítására (lásd a 13.7 példában leírtakat),

A pJPl 13-plazmidhól származó, körülbelül 838 bp méretű BamHl/SalI-et (lásd a 2.4 példát) tompa végűvé alakítottuk DNS-polimeráz Kleoevv-íragmensével, és pJPUS BeoRI-hasitóhelvébe klónoztuk, amely Klertow-fragmenssel volt tompa végűvé alakítva. A klóitokat restrikciós analízissel ellenőriztük az lőszert orientációjára, és a fej-fej orientációt kiválasztottak, A plazmid szerkezetét szekvencia-analízissel igazoltuk, és pJF 117-nek jelöltük. A ρ,ΙΡΙ IT-donerplazmidöt (Nótl-el llnearizálva) ó? váw rekombinációs (fVR) tesztben alkalmaztuk vCP 1622-jelü ALYAC-rekombútáns előállítására (lásd 13.7 példa).

5P789 (14. azonosítószámú szekvencia):

CAT-CAT-CA'i^,-TCG-GGA”TAT-CCG--TTA-AGT-TTG--TAT-GGT-AA5^:-GGC“AAG~

GAA-GAA-AAG-CGG

J.P790 (3.5. azonosítószátnó szekvencia):

TAG-TAG-”TAe-~GTC~GAC~TGA--GGA~AT?-?AT-TTT-ATA-TGG

2<ó re/ereuempcMí

Á^VAC-FCV2, rekombiuártsokelőállto

A pJPlOG- (lásd 13,2 példát és 2.2 ábrát) és pJPIÖ7-plazmtdokaí (lásd 13.3 példát és 2,5 ábrát) Notl-el linearizáhuk, és ALVAC-al fertőzőn, printer CEF-sejtekhe trausz&ktáltuk korábban már leírt (Panieall és Paoleúi, 1982; Picéim és mtsai., 1987) kalcium-foszfátot alkalmazó, kícsapásos módszerrel. Pozitív plskkokat PCV2~re specifikus, rediotíktlvan jelölt próbákhoz való hibridizációra alapozva, szelektáltalak, és négy, egymást követó plakk-tisztltasi ciklusnak vetettük alá, amíg tiszta populációt elértünk, Azután az egyes IVR-ekből egyegy reprezentatív plakkot amplifikáltur-k, és az eredményül kapott ÁLVAC-rekornbáiáosokai vCFló 14-nek és vCPlól 5-nek jelöltük, A vCP1614-vírus ÁL VÁC és a p3'P;Ö2-donorplazmidók közötti rekombinációs esemeX ♦ * «Φ«Χ « ♦* ♦ »Λ * X φ * * » ♦ »«ΦΦ 9 ' ' Φ ϊ *** *·' *** * ** *»* »* nyék eredménye, és a PCY2-QRF2«t tartalmazza az ALVAC-Có-lőkuszha ínszsrtáíva. A vCFiőíS-vfeus ALVAC és s pJPlö7-donorplazmidök közötti rekombinációs események eredménye, és & PCV2-ÖRF24 és ÖRF1 -et tartalmazza az ALVAC-Cő-lókuszba mszcrtálva, fej-fej orientációban.

Hasonló módon, elő lehet altosai csak PCV2-ÖRFl-et expresszáloí képes, rekombínáns ÁLVAC-ot, a 13,3 példában leírtak szerint előállított píPí05-dono:tplaz3nid alkalmazásával.

tmmnnfluoresz.eenclg. Annak meghatározása céljából, hogy PCV2-febé:rjék expresszalédoak-e ALVAC-rekombinánssal fertőzött Verő-sejtekben, nn-mmföoreszcenciás (ÍF) analízist végeztünk, Fertőzött Verő-sejteket PBS-sel mostunk 24 órával a fertőzés (körülbelül 19 m.o.i.) után, és 9554-os jéghideg aeetonnal fixátok? percig, szobahőmérsékleten. Öt, PCV'2-ORFi-re (PCV2 199 1D3GA & PCV2 216 7Ö5GD) vagy 0RF2-ÍS (PCV2 190 4C7CF, FCV2 199 28i.BC <&: PCV2. 190 3A.8BC) specifikus, monoklonáiis (hibridőmafeiülúszóböl származó) elienanyag-prspsrátumot (Mab-preparáhmsot) ídkalmaztunk első eUemmyagkéoí. Ezeket a specifikus monoklonáiis ellenanyagokat Merial-Lyon-tól szereztük be. Monoklonáiis ellenanyagokhoz juthatunk úgy is, hogy a leírásban idézett közlemények, például az U.S. 09/082,358, és 1)9/1 ól,992. sorozatszámú USA-beli szabadalmi bejelentés kiiamtását követjük, melyeket a kitanitús részének tekintünk, Az IF-reakciót Tayiorés munkatársai (1990) által leírtak szerint végeztük.

PCV2-speeifskus inmnmfiuoreszcenciát a bárom: ORF2-specífíkus ellenanyaggal vCP1614-al fertőzött sejtekben és v€Ptő!5-ei fertőzött sejtekben lehetett detektálni, PCV2-specifikus tonranfluoreszesneiáí a két ORF1 -specifikus ellenanyaggal csak vCP1615-el fertőzött sejtekben lehetett detektálni. Ezek az eredmények azt mulatják, hogy a várakozásnak megfelelően, vCPióH csak OIU'2-t expresszáL mig vCPlólS ORFÍ-et és ÖRF2-1 egyaránt expresssál. Nem detektáltunk flonrsszcesciát szőlői ALVAC-al fertőzött Vero-sojíekben, sem oem-fertözött Verő-sejtekben, /3,7 r<?ymoíí.'mpé/to

Ay/AC^Vlrgk^uto^kelöQRása

A p,lEÜ3- (lásd 13.4 példát) és pJPl 17-plazmláokat (lásd 13.5 példát) Notl-el hnearizáltak, és ALVAC-al fertőzött, primer CFF-sejfekbe iranszfekíátok korábban: már leírt (Faoiealí és Paoletti, 19S2; Picéim és mtsai,, 198?) kalcium-foszfátot alkalmazó, kiesapásos módszerrel. Pozitív plakkokat PCV 1-re specifikus, :radíosfeiva» jelölt próbákhoz való hibridizációra alapozva szelektáltunk, és négy, egymást kővető píakk-tisztitási ciklusnak vetettük alá, amíg tiszta populációt elértünk. Azután az egyes 1YR-ekből egy-egy reprezentatív piákkor amplififcákunk, és; az eredményül kapott ALVAC-rekömbiaássokat vCPlő2l-nek és vCPló22~nek jelöltük. A v€P 1621-vírus ALVAC ás a pJPl IS-donorplazsnídok közötti rekombinációs események eredménye, és a PCVíÖRF2-t tartalmazza az ALVAC-Códókuszba inszertúlva, A vCPló22-virus ALVAC és a pIFl 17-donorpíazmidok közötti rekombinációs események eredménye, és a PCV ?-0RF2-t és ORFÍ-et tartalmazza az ALVAC-CŐ-ÍÓteaha. inszertálva, fej-fej orientációban.

Hasonló módon, elő lehet állítani csak PCVl-ORFl-ei expresssál® képes, rekombínáns ,ALVÁC-ot, a 13,5 példában leírtak szerint előállított píPi 1 S-donorpiszmid alkalmazásával, immnnfltsnreszconcia. Annak tneghatározása céljából, hogy PCV 1 -fehérjék expresszáiódnak-e

ALVAC-rekombinánssal fertőzött Verő-sejtekben, immtatilüoreszcenciús (IP) analízist végeztünk. Fertőzőit

Verő-sejteket PBS-el mostunk 24 órával a fertőzés (körülbelül 10 m.o.L) után, és 95%-es jéghideg aeetonnal .fixáltuk 3 percig, szobahőmérsékleten. Specifikus, arsti-PCVl, sertésben termeltetett, poliklonálís szérumot [Al·

-40♦·*'* φφ lan, G. és mtsai.. Vet, Microhioi 66, 115-123 (1999)] alkalmaztunk első ellenanyagként Ás íF~reakciőt Taylot Ős munkatársai (1990) által leírtak szerint végeztük.

PCV1 -specifikus ímmunrtaoreszcendát vCP162Í-e; fertőzött sejtekben és vCP 1622-vel fertőzött sejtekben lehetett detektálni. Ezek az. eredmények azt mutatják, hogy a várakozásnak megfelelően, -vCFl$21 és vCP 1622 PGV1 -specifikus termékeket expresszál. Nem detektáltunk flouresseeneiát PC V2~speeií)kus, sertésben termeltetett, poliklostális szérummal vCP1621-el fertőzött sejtekben és vCPlŐ22-vel fertőzött sejtekben. Nem detektáltunk, lloureszeexiciát szőlői ALVÁC-ai fertőzőit Vero-sejtekben, sem nem-fertözötí : Verő-sejtekbe».

73.6 re/émíriupé/da

Vakcinák előállítására, vCP1614- és vCPlőí 5-jelü, rekombináns kanáríhímíő-viriíso.kat (13,6 példa) össze lehet keverni karhömer-oidatokkal. Ugyanígy, vCPlőzi- és vCP1622-iehl, rekombináns kanárifeimiovírusokat (13,7 példa) össze lehet keverni karbomer-oldatokkal, Á találmány szerinti megoldásban, sertések vakuináeiójára alkalmazott karbomer-komponens üarbopoi^TO974P vek, melyet a. BF Goodrich cég gyári (molekuiatömege #3,000..000), Először elkészítjük Carbopol^ÍM974P 1,5%-os· törzsoldatát 1 g/i «áiríum-klorkiol tartalmazó, desztillált vízben. Azután a förssoldatot használtuk 4 rng/ml C3rbopol™974.P-oldatok előállítására fiziológiás vízben. A íörzsoidatokat összekevertük a kívánt térfogatú fiziológiás vízzel, egy lépésben, vagy néhány egymást követe lépésben, minden egyes lépésnél beállítottuk a pH-t 1 N (vagy töményebb) sátrium-hidroxidoldsital, igy végül 7,3-7,4 végső pH-órtéket kaptunk. Ez a végső Carb»poi™974P-oldst felhasználásra kész állapotban van liofilizáh, rekombináns vírus feloldására vagy tömény, rekombináns viroskésziet hígítására. Például lö* p.fu/2 ml dózist tartalmazó, végső vlrus-szuszpenziö előállítása céljából, 0,1 ml 1Ö^? píu/ml tőrzsoldatot hígítunk 1,9 ml, fentebb leiri, 4 mg/mí Carbopo.l^!M974P felhasználásra kész oldartal. Ugyanígy, 2 mg/ml-es Oarh©poi^t3M974P felhasználásra kész oldatot is lehel készíteni.

33,9 referetteiapéida

13,9,1 1 nupos malacok iffimtsöízáfess

Izolátorukba helyeztünk az eljárás Dö, napján császármetszéssel világra jött malacokból álló csoportokat. A malacokat 2 napos korukban oltottuk Intramuszktdáríssu különböző vakcina-oldatokkal. A vakcinaként műkőd» virss-szuszpenziékaí rekombináns víruskészlefek hígításával állítottuk elő steril, fiziológiás nátríumklorid-oldaiban (0,954 NaCi). A virns-sznszpeszíók alkalmas tartományait empirikusan határoztuk meg, de általába» 10“ és 1Ő^!O pfu közötti tartományban volt, ás előnyösen körülbelül 1δ^ϊ0 piű-t tartalmazott dózisonként. Vakcina-oldatokat úgy is elő lehet állítani, hogy a rekombináns víms-szuszpenziét összekeverjük Carb»ööl^^s974p-vel, a 13,8 példásait leírtak szerint.

A malacokat beoltottak;

vCP 1614 rekombináns vírussal (13.2 példa) vCP 161.5 rekoinhináns vírussal (13.3 példa)

Caröopoiial kevert vCF1614 rekombináns vírussal (4 mg/ml oldat)

Curbopohal keveri v€Pló 15 rekombitráos vírussal (4 mg/mí oldat),

A virus-szuszpeüziók 10* plakkiortnáíö egységet (piu) lariahnttziak dózisonként. Az egyes vírusszuszperiziókat ítdmnmszkniárissn oltottuk, 1 ml-oél kisebb térfogatban. Az istramnszkuláris injekciót a nyak- 41 -

Izmokba adtuk.

Két, vlros-szuszpenziót tartalmazó tejekelót adtunk be a kísértet 2, és 14. napján. A fertőzést a 21. napon végeztük, virulens PCV-2-törzs tenyészetéből készüli virss-szuszpenzió oronazális beadásával. A fertőzés után a malacokat 3 hétig figyeltük elválasztás utáni, rauitiszísztémás sorvadás! szindrómám speciSktrs klinikai jellemzőkre. Az alábbiakat értékeltük:

Rektálís hőmérséklet: aaposta mértük a fertőzés után két hétig, majd két mérést végeztünk a fertőzés utáni 3. héten.

Tömeg: a malacokat temértük közvetlenül a fertőzés előtt, azután hetente egyszer a fertőzés kővető- első 3 héten keresztül.

Vérminták vétele vírénfia és ellenanyagok jelenléte céljából: vértsuntákaí vettünk a .kísérlet 2„ 14., 21.., 28,, 35 és 42, napján a virémfe-szint és antt-fiCV-2, specifikus ellenanyag-ikerek követése céljából.

Nekropszíák: a 42. napon valatnennyt túlélő sertéseket humánusan elpusztítottunk, és nekropszíának vetettük alá PWMS-re specifikus, makroszköpíkus károsodások keresése céljából,. Szövetmintákat preparáltunk májból, nydrokmirigyekből, lépfeől, vesékből és csecsemőmirigyből, ezen szövetekben előforduló, specifikus feisztológim károsodások keresése céljából.

13,9,2 5-7-betcs malacok immsmzáláss

PCV-2-vírasra specifikus, anyai ellenanyagokkal már nem rendelkező S-7 hetes malacokat öltöttünk intramusskulárisan különböző vakcina-oldatokkal, A vakcinaként mükődő virus-szuszpenziókat rekerabináas víruskssz.letek hígításával áHítottuk elő steril, fiziológiás náteium-klorid-oldaíbat! (0,9% NaCl). Vakcina-oldatokat ügy is elő lehet állítani, hogy a rekombináns vlms-szaszpenziót összekeverjük Carbopol^!M974P~veí, a 13,8 példában leírtak szerint.

A malacokat beoltottuk:

vCFlől 4 rekombínáns vírussal (13,2 példa) vCPÍ őlS rekosnbmáns vírussal (13.3 példa)

Carbopoll&l kevert vCPlő 14 rekomfeisáns vírussal (4 mg/mí oldat)

C&rbopollal kevert vCPlólő rekombínáns vírussal (4 mg/ml oldat).

A vtrus-szuszpenzíók lö^s piakkfermálő egységet (pfu) tartalmaztak dózisonként .Az. egyes vírusszuszpenziőkat intramuszkulárlsan oltottuk, 2 ad-nél kisebb térfogatban. Az intramuszkuláris injekciót a nyakizmokba adtuk.

Két, vírus-szuszpenziót tartalmazó injekciót adtunk be a kísérlet 0. és 21. napiján. A fertőzést a 35. napon végeztük, virulens PCV-2-forzs tenyészetéből készült vírua-szuszpmrzíő oronazális beadásával. Á fertőzés után a malacokat 8 hétig figyeltük elválasztás utáni, nrulfsszlsztémás sorvadás! szindrómára specifikus klinikai jeltemzőkte. A klinikai követés megegyezett & 13.9.1 példában leírtakkal, kivéve azt, hogy a megfigyelés teljes időtartama 8 hét volt 3 hét helyett.

Nekropsziákaí végeztünk a kísérlet közben olyas malacokon, amelyek elpusztultak a fertőzéstől, és a kísérlet végén (97. napon) a túlélt malacokon. A szövetminták ugyanazok voltak, mint a 13.9.1 példában teirtok.

φ

-42Hivatkozások jegyzéke

Claims

««Γ*

1. Clark, Ε. G, Proc. Amer. Asssc. Swine Pract, pp. 499-501 (1997).
2. Edbatter, C, R. Weiaberg, X Taylor, A. Rey-Senelonge, X F. Beaquek P. Destnetíre and E, Paolctti, Vírology 179,901-904(1990),
3. Ellis, A, !.,. .Hassard, E. Clark, X Haráíng, <X Adás, P. Wlllsoo, X Strakappe, K. Martja, F. MeNeiily, B. Medián, D. Tedd, D. Hsines, Cm.. Vet 3. 3$, 44-51 (1998).
4. Goebe.1, S. X. G. P. Johnson, Μ. E. Fejte, S. W. Davis, X P. Winsfow, E.. Paoletti, Vtrologv 179,247-266, 517-563 (1990).
5. Guo, P., S. Goebei, S. Davis, Μ. E. Perkas, B. Laoguet P. Desmet&e, G. Allén, and E. Paoletii, X Virol. 03, 4189-4198 (1989).
6. Hamei, A, t,₅L, L. Lm and G. P, S. Nayar, 3. Virol. 72, 5202-5267 (1998),
7. Hardiag X C., Proc. Aa. Assoc. Swíae Prad 28, 503 (1997).
8. Mankem, A., X M&nksrtz, K. Wolf, H.-X Buhk, Gén. Virol. 79, 381-384 (1998a).
9. Mankertz, 3., 1L-A Buhk, G. Slaess, A. Masikeitz, Vírus Gene 16,267-276 (1998b).
10. Mattbews, R, E, F., Jstervirology 17,42-94 (1982).
11. Meefern, Β. Μ., X L, Cteeíaa, M. S. McNuÜy, D. Todd, X δα. Virol, 78,221 -227 (1997).
12. Meohsn, 8. M., E. MeNeilly, D. Todd, S. Kennedy, V. A. Jewtarst, X. A.. Bilis, L. E. Hassard, E, G. Clark,

D. M. Hafees, G. M. Alim, 3. δα Virol. 79,2i71-2179 (1998).
13. Nayar, G. P. A. Hantéi and L. Lirs. Cas. Vet. X 38,385-380 (1997),
14. Pmieali, D. and E. Paoletd, Proc. Nstl, Acad. Set USA 79, 4927-4931 (1982).
15. Paolettí, E.< 8. R. Llpiaskalcs, C. SamsoneiT, S. Meroer. and £>. PanicaB, Proc. Mail. Acad. Set Ü.S.A. 81, 193-19? (1984).
16. Férte, Μ. E., K. Limbach, aad £, Faotetti,.3. Virol. 03,3829-3836 (1989).
17. Pieclrd. A., M..E. Perkus, and E, Paolettí, ifi Methods írt Eítzymology, Vol, 153. eds. Wa, R,_f and Grossmaq,

L. , (Ac&demíe Press) pp. 545-563 (1987).
18. Sambrook, A, E. F. Frítseb, aod T. Maníatís, fe Moiecular c-íoning: A laboratory·' maim!, 2nd edidos, (Cold Spríng Harbor Press, NY) (1989)..
19. Tartaglta, 1, 3.. Winsfow,-S,GoebeLG. P. jebtíson,A Taylor, and E, Paoleíd, X Ga VíroL?!, I517-1524 (1990).
20. Tartaglía, 3.,_; Perkas ME, Tayte J, Noitoa EK, Aadoanet JC, Cox Wl, Davis SW, van dér Hoeven ), Meigaier 8, Riviéra M, and E. Paolettí, Vírology 188,2.17-232 (1992).
21.. Taylor, X, R., Weirtherg, 8.. Lasguet Ph. Desuiettre and E. P&olettí, Vaccíne 6,497- 503 (1988a),
22. Taylor, X and E. Paoletii, Vaccfee 6,466-408 (1988ο).
23, Taylor» X, R. Weinberg, Y. Kawaoka, R Webster and E. Paoleöt. Yácefee 6,504-5ÖS (1988c).
24, Taylor, A, C. Edbaner, A. Rey-SefielQftge, 3. E. B©u<pet» E, Norton, S. Goebel, P. Desmettee and E, Paoletii,

3. Virol, 64, 1441-1450 (1990).
25. Taylor, X, C. Trimarohí, R. Weinberg, 8. Pangóét, F. Guíltoia, P. Desmettre and E. Pttolerti, Vaccíne 9,190-193 (1991).
26. Tayler .1, Wenihorg R, Tarlttglsa X Riehardso·! C, Álkbstib G, Briedis D, Áppel M, Norton B, Pasiéit! E.,

Vírology 187,32 s -328 (1992), '
27, Todd, D., F. D. Níagro, B, W. Rltebse, W. Cukron, G. M. Állam P. & Lakért, K. S. Latíroer, W. L. StefFeas,

M. S. McNniiy, Areh. Virol, 117, 129-135 (1991).

* φ φ Jt φ

-43A találmány előnyös megvalósítási módjainak ezen részletes leírása alapján nyilvánvaló, hogy a csatölt szabadalmi igénypontok által definiált, találmány szerinti megoldás nem korlátozódik 3 fenti leírásban ismertetett konkrét részletekre, mivel ssnak számos, nyilvánvaló variációja létezhet anélkül, hogy eltérnénk a találmány által igényelt oltalmi körtől.

- 44 «Ο* «*** χ » ψ * ** **χ ** * Λ »

Hivatkozások;

1 - Alias! GM, MeNeiíly F, C&ssady Jp. et sí: 1995, Ifoihogesssis of pereme ckeovlms; experiraestei mteetrons of coiesínan deprived plgiets aad exsmisaiion of psg foeial matériái. Vet Mbrobíol 44; 49-641,

2. AHan CM, MoHbilly F, Kennedy S, et al.;· I99S, Isolatlos ef porcine circovirss-like vsuses ίϊΌϊΊΏ pi g5í?í- s wifh a wasting dísease m the United States o£ America and Europe, J Vet Diag levest lö: 3-10,

3. Allan GM; Kennedy S, Mcbíeíily F, et al,: 1999, Bxperlmsnta; reproeactiss! of vrasdog disease and deash by ooisfeciion of pigs vBih porcine eireovtras and perelne paryovirus, J CompFatb 121: 1-11 (July 1999),

4. Bolt DM, Hasri H, Maller E, and Waídvogel AS: 1997, Honsnppuraiive myocardkis m pigiets assoeiaíed wtth porcine parvo-váus infecdon. J Consp Path 117: 107-1 IS.

5', Ellls, JA, Hassard L, Clark EG, et al.: 1998, Isolatíon of eircoviras Stsn lesioiss of pigleís wlth postsveaníog tniiliiaystsmic wastíng syndrowe. Can Vet J 39: 44-51

6. Ellís JA, Krakewka S, Lairroere M, et al.: 1999, Reproductíon of tetőm of posriveatsing nsuítisystetnic wastíng syndrosne ín gnotobíotic pigleís, .1 Vet Díag ínyest 1I: 3 -14.

7. Kim BS, <lo BS and Bergetad ME: 19119, Serologte, vírologte, and hístopathologíc obsetvaflons of encephalosnyocarditis vírus infeetíon ín nsuonntfsed aad stíllbons pigs- 3 Vet Diag Invest 1: ΗΠ-Ϊ04.

8. Láger KM and lislbuf PG: 1996, Gross and trsicroscopic íesions ín porcine fetnses mfected wiíh porcine reproduetive and respiratory syadwné vírns. J Vet. Diag Invest 8; 275-282,

9. Meebaa BM, MoNeiily F, Todd D, et al,: 199S, Charscterizaíion of növel circovirus DNA’s 3ssociated wastíng öisease synöromes ín pigs. J Gén Viroi 79: 2171 -2179.

lö. Mengeltng WL 1992, Porctne parvovirns. ín: Dísesses oíswine. ed. Lesnan AD, 7íh ed-, pp, 299-31 1. lowa. State University Press, Atrses, 1A, í 1. Molitor TW, Orveerakul K, Zhang ZZ, et alt 1991, Polymejrase ehain rcactíon (ÉRC) sanplífication for detection of perelne parvovsras. 1 Viroi Meth 32:201-211

12. PesrsaertMand DeMemichyW: 1973,Aporomé enterovirns caosing fetal death aad mmmrnficatiös. Experbnental infeetíon of pregnant femaie pigs. Zenírslbi Vetermaermed Beih 11: 2Ö25.

13. Tiscber 1, Rsscb R and Toehíennaon G; 1974, Characterizaíiot! of papovavims-and picomavíms-líke paríiclesin peonaneni piglet ktdney coll Itnes. Zentralbl-Bakertioi-örg-A 226: 353-167.

14. WestKH, Rystí'ont, JM, Wöjoa-Owícz C, eta!.: 1999. Myocarditis and aborílon assocíated with intrsníerine infootion of sows wíth porcine csreovírus-2. j Vet Diag invest L

4 4 ♦ 4 ♦4«

4«

-45 Szabadalmi igénypontok *4 4

4« * 4

XX

1. Egy első DNS-pbzaüávekíor, amely tartalmaz egy olyan első stdkleoöd-szekveneiát, amely legalább 95%-ban azonos: az Impiölö jelű PCV-2 törzs ÖRFld-ával, sertés hörgőiben és bélbolyhatban a PCV-2 vírusterhslás csökkentésére történő alkalmazásra.

2. temwogén készítmény, sertés hörgőiben és bélholyfeafoan a .PC-V-2 vínssterhelés csökkentésére történő alkalmazásra, ahol a készítmény tartalmazza a. következőket:

a) egy első DNS-plaztnidvektorí, amely tartalmaz egy olyan első nnkleotld-szekvencíát, amely legalább 95'%-baa azonos az InmlÖIÖ johi.PCV-2 törzs ORPtfoávah és bi gyógyászatiéig. vagy áilsígyógyászatilag elfogadható- hordozót és/vagy vektort és/vagy excipiénst és/vagy adjovánst,

3. A kővetkezők alkalmazása:

a) egy első DNS-plaxsnidvektor, amely tartalmaz egy olyan első nukleotid-szekvesciát, amely legalább 95%-baa azonos az ImplÖlő jelö PCV-2 törzsGRFÍ3-ával, és

b) gyégyászatilag vagy állsígyógyászstilag elfogadható hordozó és/vagy vektor és/vagy excipiens és/vagy adjováas, sertés hörgőiben és hélhoíyhaíban a PCV-2 vlrasterhelés csökkentésére történő alkalmazásra szolgáló immanogén készítmény előállítására.

4. Egy első DNS-píazmiávektor, amely tartalmaz egy olya® első imkleoíid-szekvesoiák amely legalább 95%-ban azonos az. Implö fö jelű PCV-2 törzs ORFö-ával, valamint egy második DNS-plazmidvekíor, amely tartalmaz egy olyan második nukleotiá~szekvenclát_s amely legalább 95%-ban azonos az ímplölö jelű PCV-2 törzs ORP4-éveL sertés hörgőiben és béíboiyhaiban a PCV-2 vírasíerhelés: esőkkestésére történő alkalmazásra,

5. ímnmaogén készítmény, sertés hörgőiben és bélbolyhatban a PCV-2 vírosíerlrelés csökkentésére történő alkalmazásra, ahol a készítmény tartalmazza s következőket:

a) egy első DNS-píasmlövektort, amely tartalmaz egy olyan első nokieotid-szek vese iát, amely legalább 95%-ban azonos az Ímplölö jelű PCV-2 törzs ÖRFlo-ával,

b) egy második El'NS-p&zmidvekfor, amely tartalmaz -egy olyan második nnkleotid-szekveneiát, amely legalább 95%-han azonos az ImplQlÖ jelű PCV-2 törzs OE;F4-ével, és

c) gyógyászatliag vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozót és/vagy vektort és/vagy excipiénst és/vagy aájuvánst,

ó. A kővetkezők alkalmazása:

a) egy első DNS-plazundvekter, amely tartalmaz egy olyan első nríkieotld-szekveneiát, amely legalább 95%-hsn azonos az Ímplölö jelű PCV-2 törzs ÖRFí3-ával,

b) sgy második DNS-plazmidvektor, amely tartalmaz egy olyan második mtkieotid-szekveoeiát, amely legalább 95%-ba» azonos az Imnlölö jelű PCV-2 törzs ÖRF4-ével, és

c) gyógyászati! ag vagy állaígyógyászatfsag elfogadható hordozó és/vagy vektor és/vagy excipiens és/vagy adirsváns.

-46»* * *

4 4 « ·♦ **♦« » ** * Λ» »4 *** sertés hörgőiben és béibolyhaiban a PCV-2 vimsterhelés csökkentésére történő alkalmazásra szolgáló imnr>mogéu készítmény előállítására.

7, Az első plazmid az 1. igénypont szerinti alkalmazásra; az immnnogén készítmény a 2. igénypont szerinti alkalmazásra;, az első plazmid alkalmazása a 3, Igénypont szerint; az. első és második plazmid, a 4. igénypont szerinti alkalmazásra; az immusogén készítmény az 5, igénypont szerinti alkalmazásra; vagy az első és második plazmid alkalmazása a §. igénypont szerint;

ahol az első nukiéotid-szekveneia megegyezik az ImplÖ 1 Ö-tőrzs ORFi3-ának szekvenciájával.

8, Az első és második plazmid, a 4. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazásra; az immunogén készítmény az 5, vagy 7. igénypont szerinti alkalmazásra; vagy az első és második plazmád alkalmazása a ó. vagy 7, igénypont szerint;

ahol a második auldeodd-szekvencía megegyezik az Implöl O-tdrzz ÖRF4-ének szekvenciájával.

A meghatalmazott: DANUBIA

Szabadalmi és Jogi Iroda Kft.

Árpád szabadalmi Ügyvivő