KR20020068325A - 돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염, 유산 및 자궁 내감염의 예방 - Google Patents

돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염, 유산 및 자궁 내감염의 예방 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스-2 유래의 외래 DNA를 함유하는 아비폭스 바이러스와 같은 재조합 폭스바이러스를 제시한다. 또한 재조합 폭스바이러스를 함유하는 면역학적 조성물이 투여된 숙주 동물에서 면역학적 반응을 유도하기 위한 조성물을 제시한다. 또한 본 발명의 면역학적 조성물을 돼지 써코바이러스-2에 의해 치료를 필요로 하거나 감염되기 쉬운 동물에게 투여함으로써 돼지 써코바이러스-2에 기인한 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제시한다.

Description

돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염, 유산 및 자궁 내 감염의 예방 {PREVENTION OF MYOCARDITIS, ABORTION AND INTRAUTERINE INFECTION ASSOCIATED WITH PORCINE CIRCOVIRUS-2}
돼지 써코바이러스-2(PCV-2)는 세계의 여러 지역에서 돼지 개체군의 이유 후 전신소모성 증후군(PMWS)과 일관되게 관련되어 온 병원체로서 최근 동정되었다(Allan 외, 1998; Ellis 외, 1998). 여러 나라의 감염된 돼지로부터 수득한 PCV-2의 분리주는 사실상 유전적으로 동일하며, 본래 1970년대에 돼지 신장(PK-15) 세포계의 비세포변성(noncytopathic) 오염균으로서 동정된 PCV(CCL33, PCV-1)와는 명확히 다르다(Meehan 외, 1998; Tischer 외, 1974). 자연 산물로 수득하거나 실험적으로 유도한 PCV-2에 감염된 돼지는 점진적 체중 감소, 빈호흡(頻呼吸), 호흡곤란 및 황달을 나타낸다(Allan 외, 1998; Allan 외, 1999; Ellis 외,1998; Ellis 외, 1999). PCV-2 항원과 직접적으로 관련된 육안 병리학적(gross pathological) 발견에는 림프절 장애, 간질성 폐렴, 간염, 신장염 등이 포함된다(Allan 외, 1998; Allan 외, 1999; Ellis 외, 1998; Ellis 외, 1999). 또한 WO-A-99 18214, WO-A-00 01409, WO-A-99 29717 및 WO-A-99 29871을 참고할 수 있다. PCV-2는 이제까지 유산 또는 태내 돼지의 병변과는 직결되지는 않았다. 따라서 이제까지는 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염에 관한 문제를 본격적으로 다루도록 제안된 바가 없다.
본 발명은 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군(post-weaning multisystemic wasting syndrome)을 비제한적으로 포함하는 병리적 후유증의 예방 및/또는 치료를 위한 방법 및/또는 조성물에 관한 것이고, 또한 특히 그러한 조성물의 제조 방법 및 그러한 조성물을 제조하거나 그러한 방법을 실행하기 위한 키트에 관한 것이다.
도 1은 SEQ ID No.1로서, Imp. 1011-48121 균주의 게놈의 PCV DNA 서열을 나타낸다.
도 2는 SEQ ID No.2로서, Imp. 1011-48285 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다.
도 3은 SEQ ID No.3으로서, Imp. 999 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다.
도 4는 SEQ ID No.4로서, Imp. 1010 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다.
도 5는 SEQ ID No.5로서, PK/15 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다.
도 6은 SEQ ID No.6으로서, 캐나다 앨버타에서 분리한 1103 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다. 여기서 k는 g(G) 또는 t(T)를 의미하고 y는 c(C) 또는 t(T)를 의미한다. 서열의 이러한 변화는 바이러스 개체군에서 관찰되었다.
도 7은 SEQ ID No.7로서, 캐나다 사스카툰에서 분리한 1121 균주의 게놈의 DNA 서열을 나타낸다.
놀랍게도 PCV-2가 이유 후 전신소모성 증후군뿐 아니라 심근염, 유산 및 자궁내 감염의 원인균임이 밝혀졌다.
정의에 따라, PCV-2 면역원은 생균 약독화되거나 불활성화된 PCV-2, 또는 시험관내 발현 또는 추출에 의해 얻어지는 PCV-2 유래의 서브유닛(들), 또는 화학적 합성이나 시험관내 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있는 관심의 대상인 적어도 하나의 에피토프(epitope)를 포함하는 단편(들), 그리고 본 명세서에 제시되거나 인용 또는 참고된 문헌에 제시된 바와 같은 PCV-2 게놈의 생체내 서열(들) 또는 단편(들) 또는 에피토프(들)을 포함하고 발현하는 재조합 벡터(들)을 포괄하는 것이다.
본 명세서에 제시된 바와 같이 또 다른 돼지 병원체의 면역원에 대해서 동일한 정의가 적용된다.
정의에 따라, 면역원 조성물은 국소적 또는 전신의 면역원성 반응을 유도한다. 백신 조성물은 국소적 또는 전신의 보호 반응을 유도한다. "면역원 조성물"이라는 용어는 "백신 조성물"을 포함한다(전자의 용어가 보호성 조성물일 수 있기 때문임).
따라서, 본 발명의 목적은 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군을 비제한적으로 포함하는 병리적 후유증의 예방 및/또는 치료를 위한 방법 및/또는 조성물을 제공하는 것; 또한 그러한 조성물(이들 조성물은 돼지 파보바이러스(PPV) 면역원을 포함할 수도 있음)을 제조하는 방법 및 그러한 조성물을 제조하기 위한 PCV-2 면역원의 용도를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제조하기 위한 PCV-2 면역원의 용도이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1103(1103/1 P.2) 및 1121(1121/1 P.1)로 동정된 새로운 PCV-2 균주를 분리하고 특성화하는 것이며, 또한 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 그와 관련된 병리적 후유증에 대한 면역원과 진단용 항원 및 항체를 제조하기 위해 상기 새로운 PCV-2 균주를 사용하는 것이다.
본 발명은 또한 PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 PCV-2와 관련된 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 병리적 후유증을 예방하기 위해, 또는 PCV-2에 대항하는 면역원성 반응 또는 보호성 반응을 유도함으로써 돼지 써코바이러스-2와 관련된 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁내 감염 및/또는 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방하기 위해, 수정 전; 및/또는 교미 전 및/또는 회임(또는 임신) 기간중; 및/또는 분만 기간 또는 분만 전; 및/또는 생존기간에 걸쳐 반복적으로 PCV-2 면역원(적어도 하나)을 포함하는 조성물(이 조성물은 돼지 파보바이러스 유래의 면역원을 포함할 수도 있음)을 암퇘지(예를 들면 어미 암퇘지, 어린 암퇘지)에게 접종하는 방법을 제공한다.
교미 전에 적어도 1회의 접종을 실시하는 것이 유리하다. 또한 후속 접종을 예를 들면 대략 임신 중기(임신 약 6-8주) 및/또는 임신 말기(임신 약 11-13주)에 실시하는 것이 유리하다. 따라서, 유리한 양생법(regimen)은 교미 전에 접종을 행하고 임신 기간중에 추가자극(booster) 접종을 행하는 것이다. 그 후, 교미 전 및/또는 대략 임신 중기(임신 약 6-8주) 및/또는 임신 말기(임신 약 11-13주)의 임신 기간중에 재접종을 행할 수 있다. 재접종은 임신 기간중에만 행하는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 실시예에서, 백신 접종시킨 암컷(예를 들면 본 명세서에서 언급한 바와 같이 접종시킨 것)이 낳은 새끼 돼지와 같은 새끼 돼지들을 예를 들면 생후 1주일 및/또는 2주일 및/또는 3주일 및/또는 4주일 및/또는 5주일과 같은 생후 초기 수주일 내에 접종시킨다. 더욱 바람직하게는, 생후 1주일 이내 또는 생후 3주 이내에(예를 들면 이유 시기에) 새끼 돼지를 최초 접종시킨다. 보다 더 유리하게는, 이어서 상기 새끼 돼지를 2주 내지 4주 후(최초 접종시킨 후) 추가자극 접종시킨다. 따라서, 암퇘지(예를 들면 어미 암퇘지, 어린 암퇘지)뿐 아니라 그 새끼에게 본 발명의 조성물을 투여할 수 있고/있거나 그것에 본 발명의 방법을 실행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 PCV-2와 관련된 이유 후 전신소모성 증후군 및 다른 병리적 후유증의 예방이나 치료를 위한 PCV-2 균주(들) 1103 및/또는 1121 유래의 면역원(들)을 포함하는 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 PCV-2와 관련된 이유 후 전신소모성 증후군 및 다른 병리적 후유증의 예방 또는 치료용 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 조제하기 위한 PCV-2 면역원의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군의 예방 및/또는 치료용 면역원 조성물 또는 백신 조성물로서, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체(carrier) 및/또는 매개체(vehicle) 및/또는 부형제(excipient) 및/또는 아쥬번트(adjuvant)를 포함하는 조성물 및 PCV-2 면역원을 포함한다.
상기 조성물은 예를 들면 하기와 같은 적어도 하나의 부가적인 돼지 병원체로부터 얻어지는 적어도 하나의 면역원을 추가로 포함할 수 있다: 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae,E. coli, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pseudorabies, 돼지 콜레라(Hog cholera), 돼지 인플루엔자(Swine Influenza) 및 돼지 파보바이러스(PPV). 이와 같이, 벡터를 기재로 한 조성물은 적어도 하나의 부가적 돼지 병원체로부터 유래되는 적어도 하나의 면역원을 포함할 수 있는데, 상기 벡터는 이 병원체 유래의 서열을 발현시키며, 상기 벡터는 또한 PCV-2 면역원을 발현시키는 벡터일 수 있다. PCV-2 서열을 발현시키는 벡터는 PCV-2 서열 또는 단편을 포함할 수 있고; 본 발명은 그러한 핵산 분자, 핵산 분자를 함유하는 벡터, 핵산 분자 또는 그러한 핵산 분자로부터의 벡터 발현 산물을 포함하는 조성물, 그러한 발현 산물을 포함하는 조성물, 그러한 핵산 분자를 위한 프로브 또는 프라이머, 및 이것들 중 일부 또는 모두의 제조 방법 및 사용 방법을 포함한다.
상기 벡터는 DNA 벡터 플라스미드,E. coli와 같은 박테리아, 바큘로바이러스, 돼지 헤르페스 바이러스를 포함하는 헤르페스바이러스, 아우제스키 질병 바이러스, 돼지 아데노바이러스를 포함하는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리아폭스 바이러스, 라쿤폭스 및 돼지폭스 바이러스를 포함하는 폭스바이러스 등을 포함한다. 벡터를 기재로 한 조성물은 PCV-2, 바람직하게는 본 발명에서 동정되는 PCV-2 균주 중 어느 하나, 특히 균주 1103 및/또는 1121의 ORF 1 내지 13, 예를 들면 ORF 4, 7, 10 및 13으로부터 선택되는 ORF; 바람직하게는 ORF 4 및/또는 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ORF를 함유하고 발현시키는 벡터를 포함할 수 있다. 그리고 조성물 내의 면역원(PCV-2 및/또는 다른 돼지 병원체로부터 유래되는 면역원)은 재조합 방식으로 제조할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 플라스미드라는 용어는 발현시키고자 하는 PCV 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 형태의 모든 DNA 전사 단위를 포함하는 것을의미한다. 플라스미드는 그것의 발현, 예를 들면 생체내 발현을 위해 필요한 요소를 포함하는 것이 유리하다. 환형 플라스미드 형태, 슈퍼코일 또는 기타의 형태가 바람직하고, 또한 선형이 본 발명의 범위에 포함된다. 플라스미드 면역원 조성물 또는 백신 조성물은 유전자 총을 통해, 바늘없는 주사기를 통한 피내 방식으로, 피하 또는 근육내 방식으로, 또는 점막 경로로, 또는 생체내 발현 및 유리하게는 면역원성 반응 또는 보호 반응을 일으킬 수 있는 임의의 다른 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 벡터 또는 재조합체에 의해 생성된 발현 산물은 예를 들면, 돼지에게 투여하기 위한 조성물을 제조하기 위해, 선택적으로 감염되거나 트랜스펙션된 세포로부터 분리 및/또는 정제될 수도 있다. 그러나 특정한 경우에는 세포로부터 발현 산물을 분리 및/또는 정제하지 않는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 그 세포 또는 세포의 부분이 폴리펩타이드의 면역원성 효과를 높일 경우가 그러하다. 본 발명을 실시함에 있어서, 재조합체 또는 벡터 발현 산물 및/또는 PCV-2의 서브유닛 및/또는 다른 돼지 병원체를 정제 및/또는 분리하기 위한 단백질의 정제 및/또는 분리 기술이 공지되어 있으며 과도한 실험을 하지 않고 이용할 수 있다. 그러한 기술은 일반적으로 다음을 포함할 수 있다: 변하는 염 농도에서 관심의 대상인 단백질의 용해도를 이용한 침전, 유기 용매, 폴리머 및 다른 물질을 사용한 침전, 친화성 침전 및 선택적 변성(denaturation), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이온교환, 친화성, 면역친화성 또는 염료-리간드 크로마토그래피를 포함하는 칼럼 크로마토그래피; 면역침전, 겔 여과, 전기영동법, 한외여과 및 등전 포커싱(isoelectric focusing), 및 특히 이들의 조합.
본 발명은 또한 돼지 써코바이러스-2(PCV-2) 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 전술한 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하여 돼지에서 PCV-2에 대항하는 면역원 반응 또는 보호 반응을 유발하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 돼지 써코바이러스-2(PCV-2) 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군 및/또는 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 약제학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 또는 매개체와, 바람직하게는 아쥬번트, 그리고 PCV-2 면역원을 포함하는 활성제를 포함하는 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하여 돼지에서 PCV-2에 대항하는 면역원 반응 또는 보호 반응을 유발하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 PCV-2 원인성 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁내 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 약제학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 및 PCV-2 면역원을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 PCV-2 면역원은 약독화된 생균 PCV-2 전체 또는 불활성화된 PCV-2일 수 있다. 상기 방법은 서브유닛 면역원 조성물 또는 백신 조성물인 조성물을 포함할 수 있다. 상기 방법은 적어도 하나의 부가적 돼지 병원체로부터 유래되는 적어도 하나의 면역원을 추가로 포함하는 조성물을 포함할 수 있는데, 그러한 면역원 또는 에피토프를 발현하는 벡터를 포함하고, 상기 적어도 하나의 부가적 돼지 병원체은 PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae,E. coli, Pseudorabies, 돼지 콜레라, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, 돼지 인플루엔자 및 PPV 그리고 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택할 수 있다. 상기 방법은 DNA 벡터 플라스미드,E. coli와 같은 박테리아, 바큘로바이러스, 아우제스키 질병 바이러스를 포함하는 헤르페스바이러스, 돼지 아데노바이러스를 포함하는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리아폭스 바이러스 및 돼지폭스 바이러스를 포함하는 폭스바이러스 등을 포함한다. 상기 방법은 적어도 하나의 부가적 돼지 병원체로부터 유래되는 적어도 하나의 서열, 단편 또는 에피토프, 또는 그러한 서열, 단편 또는 에피토프를 발현하는 벡터를 추가로 포함하는 벡터 기재 조성물을 포함하고, 상기 벡터는 또한 PCV-2 서열, 단편 또는 에피토프를 발현하는 벡터일 수 있다. 상기 방법은 ORF 1 내지 13, 예를 들면 ORF 4, 7, 10 및 13으로부터 선택되는 ORF, 바람직하게는 ORF 4 및/또는 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ORF를 함유하고 발현하는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 하나 이상의 면역원이 재조합 방식으로 생성되는 면역원 기재 조성물을 포함할 수 있다. 이 방법에서 암퇘지 및/또는 어린 돼지를 앞에 기재한 바와 같이 접종하는 것이 바람직하다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 약제학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 및 가능하게는 아쥬번트와 PCV-2 면역원을 혼합하는 단계를 포함하는 전술한 조성물 중 어느 하나를 제조하는 방법을 포함한다. 그 방법은 또한 PCV-2 면역원을코딩하는 DNA를 함유하고 그 면역원을 발현하는 재조합 벡터로 세포 또는 숙주를 트렌스펙션하거나 감염시키는 단계, 및 선택적으로 세포로부터 면역원을 정제 및/또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상기 방법은 PCV-2로부터 PCV-2 면역원을 분리 및/또는 정제하거나, 샘플로부터 PCV-2를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 앞에서 언급하거나 본 명세서에 기재된 조성물 중 어느 하나를 제조하기 위한 키트(kit) 또는 앞에서 언급하거나 본 명세서에 기재된 방법을 실행하기 위한 키트로서, 제1 용기에 약제학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 매개체 또는 부형제를 포함하고, 제2 용기에는 PCV-2 면역원을 포함하는 활성제를 포함하고, 제1 용기 및 제2 용기는 선택적으로 함께 포장되어 있고, 상기 키트는 선택적으로 조성물의 성분들을 혼합하기 위한 지침 및/또는 조성물을 투여하는 지침을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 앞에서 언급하거나 본 명에서에 기재된 조성물 중 어느 하나를 수퇘지 및/또는 암퇘지에게 투여하는 방법으로서, PCV-2의 전파(transmission)를 방지하고 돼지 써코바이러스-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 투여는 앞에서 기재한 바와 같이 행하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "포함하다(comprising)"라는 용어는 "포함하다(including)"를 의미하거나 통상적으로 미국 특허법에서 "포함하다(comprising)"에 대해 부여되는의미를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 양태를 이하의 상세한 설명에서 제기하거나 또는 이로부터(그리고 본 발명의 범위 내에서) 자명하다.
발명의 상세한 설명
돼지 써코바이러스-2(PCV-2)는 돼지 개체군에서의 이유 후 전신소모성 증후군(PMWS)과 관련이 있는 작용물(agent)이다. 실시예 1과 2에 제시된 바와 같이, PCV-2와 관련된 질병의 잠재적 범위는 수직적 전파의 증거에 의해 확대되고 생식 부전에 결부된다.
특히, 실시예 1은 PCV-2가 만기 유산 및 사산을 겪은 농장으로부터의 한 배 새끼 돼지로부터 분리되었음을 나타낸다. PCV-2 항원에 대한 광범위한 면역 조직화학적 염색과 관련하여 새끼 돼지 한 마리에서 심각한 미만성 심근염이 존재하였다. 또한 여러 가지 양의 PCV-2 항원이 여러 마리 태아의 간, 폐 및 신장에 존재하였다. 돼지 파보바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, 뇌심근염 바이러스 및 장바이러스를 포함하는 태아 병변 및 돼지의 유산에 관련된 다른 작용물의 존재는 입증할 수 없었다.
보다 구체적으로, 실시예 2는 30마리의 건강이 매우 양호한 무리로부터 4년에 걸쳐 입수하여 유산 또는 생식 부전의 상용 예에서 시험한 조직이 여러 마리의 사산 돼지 및 심각한 미만성 심근염, 심장 비대증 및 만성적 수동성 충혈(passive congestion)의 증거를 나타내는 생육 불능의 신생아를 포함한 2개의 기탁물에서 PCV-2에 대해 양성이었음을 나타낸다. 두 개의 양성 기탁물은 동일한 농장에서 입수한 것이었으나 서로 다른 시점에 기탁된 것들이다. 감염된 새끼 돼지의 심장 및 다른 조직에 PCV-2가 존재한다는 것은 면역 조직화학 및 바이러스 분리에 의해 확인되었다. 1999년 이전 풍토성 감염 지역에서의 생식 부전 사례에서 돼지 써코바이러스가 검출되지 않았다는 것은 생식기 질병이 PCV-2의 새로운 임상적 증상이라는 견해를 뒷받침하며, 나아가서 성별 및 수직적 전파 형태가 돼지 개체군에서의 바이러스 전염의 원인임을 암시한다.
따라서, 예를 들면 어미 암퇘지 또는 어린 암퇘지에게 PCV-2 면역원(예를 들면 균주 Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 및 1121 중에서 선택되는 적어도 하나의 균주로부터 얻어지는 것) 중 하나를 포함하는 조성물(상기 조성물은 또한 적어도 하나의 돼지 파보바이러스와 같은 다른 돼지 병원체로부터 유래되는 적어도 하나의 면역원을 포함할 수 있고, 벡터를 사용할 경우, 그 벡터는 PCV-2 면역원(들)과 적어도 하나의 다른 돼지 병원체의 적어도 하나의 면역원, 특히 예를 들면 PPV 면역원(들)을 모두 동시 발현시킬 수 있음)을 접종함으로써 PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방하기 위한 PCV-2 면역원을 이용하는 방법 및 조성물을 포함한다. 특히, 균주 1103 및/또는 균주 1121로부터의 면역원이 PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염을 예방하기 위한 PCV-2 면역원을 이용하는 방법 및 조성물에유용하다.
본 발명은 또한 모든 공지의 PCV-2 균주 또는 그로부터의 면역원을 PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염, 그리고 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2(이들 균주는 균주 Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 및 1121를 포함함)와 관련된 다른 병리적 후유증의 예방 또는 치료를 위한 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 조제하는 데 이용하는 용도를 포함하며, 특히 상기 조성물이 백신 접종시킨 암퇘지가 낳은 새끼 돼지 및 보다 구체적으로 암퇘지에게, 특히 회임 암퇘지 또는 교미시키게 될 암퇘지에게 투여하고자 할 경우, 그리고 보다 특별히 앞에서 정의한 접종 계획에 따른 용도를 포함한다.
보다 특별히, 상기 용도는 특히 조성물이 백신 접종시킨 암퇘지가 낳은 새끼 돼지 및 보다 구체적으로 암퇘지에게, 특히 회임 암퇘지 또는 교미시키게 될 암퇘지에게 투여하고자 할 경우, 그리고 보다 특별히 앞에서 정의한 접종 계획에 따른 경우에, PCV-2와 관련된 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염을 예방하거나 치료하기 위한 조성물을 조제하는 것이다.
적어도 하나의 다른 돼지 병원체로부터 유래되는 적어도 하나의 면역원은 공지의 돼지 백신 또는 면역원 조성물, 또는 WO 98/03658에서 이용되는 것일 수 있다.
본 발명에 이용하는 조성물은 수의학 또는 약제학 분야에서 숙련된 사람들에게 잘 알려진 표준 기법에 따라 제조할 수 있다. 그러한 조성물은 나이, 성별, 체중, 돼지의 상태 및 특별한 처치, 그리고 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 수의학 분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려진 투여량 및 기법으로 투여할 수 있다. 조성물은 단독으로 투여하거나, 본 발명의 다른 조성물(예를 들면 PCV-2 면역원을 포함하는 다른 조성물) 또는 다른 예방용 또는 치료용 조성물(예를 들면, 다른 돼지 면역성 조성물 또는 백신 조성물)과 함께 동시 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있다. 본 발명은 또한 다가의(multivalent) 또는 "칵테일(cocktail)" 또는 조합된 조성물 및 그것을 사용하는 방법을 제공한다. 이에 관한 참고자료로는 광견병 조성물 및 조합된 조성물 및 그 용도를 제시하는 미국특허 제5,843,456호가 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 또는 점막 투여용으로 사용할 수 있고, 바람직하게는 피내 경로 또는 근육내 경로로 사용할 수 있다. 특히 피내 경로의 경우에, 주입을 바늘없는 주사기를 사용하여 행할 수 있다. 점막 투여를 사용할 때, 구강, 비강 또는 안구 경로를 이용할 수 있다.
그러한 조성물에서 면역원(들)은 적합한 멸균수, 생리 식염수, 글루코오스 등의 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물 상태 및/또는 바람직하게는 아쥬번트와의 혼합물 상태로 있을 수 있다. 조성물은 또한 냉동건조 또는 동결시킬 수 있다. 조성물은 pH 완충제, 아쥬번트, 방부제, 점막 경로를 위해 사용되는 폴리머 부형제 등의 보조 물질을 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 함유할 수 있다.
과도한 실험없이 적합한 제제를 제조하기 위해 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 1985년도 제17판과 같은 표준 텍스트를 참조할 수 있다. 또한 적합한 투여량은 상기 텍스트 및 인용된 문헌을 기초로 할 수 있다.
아쥬번트는 면역원에 대한 면역 반응을 높여주는 물질이다. 아쥬번트는 수산화알루미늄과 인산알루미늄, Quil A와 같은 사포닌류, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 워터-인-오일-인-워터 에멀전 등을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 액상 파라핀 경유(유럽 약전형); 스쿠알란이나 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히 이소부텐이나 데센을 올리고머화함으로써 얻어지는 오일; 산 또는 선형 알킬기를 함유하는 알콜, 특히 식물유, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트의 에스터; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스터, 특히 이소스테아르산 에스터를 기본으로 할 수 있다. 상기 오일은 에멀젼을 형성하기 위해 유화제와 혼합하여 사용된다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄의 에스터, 만나이드의 에스터(예를 들면 무수 만니톨 올레에이트), 글리세롤의 에스터, 폴리글리세롤의 에스터, 프로필렌 글리콜의 에스터, 그리고 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스터가 바람직하며, 이들은 선택적으로 에톡시화되고, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 Pluronic(R)제품, 특히 L121 등이다. 참고자료로는 Hunter 외, The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, pp51-94(1995) 및 Todd 외, Vaccine 15:564-570(1997) 등이 있다.
예를 들면, M. Powell과 M. Newman 편저, Plenum Press 1995년 간행 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"의 147쪽에 기재된 SPT 에멀젼 및 동서의 183쪽에 기재된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다.
예를 들면 아쥬번트 함유 백신은 다음과 같이 제조된다: 면역원을 포함하는 수상 67% v/v를 2.3% w/v의 무수 만니톨 올레에이트, 11 EO(에틸렌 옥사이드)로 에톡시화된 2.6% w/v의 올레산 및 28.1% v/v의 액상 파라핀 경유(유럽 약전형) 중에서 유화용 터보믹서를 사용하여 에멀젼화시킨다.
에멀젼을 제조하기 위한 다른 방법은 스쿠알란 5% w/v, Pluronic(R) L121 2.5% w/v, 올레산의 에스터 및 20 EO로 에톡시화된 무수 소르비톨의 에스터 0.2% w/v, 그리고 면역원을 포함하는 수상 92.35 v/v로 이루어진 혼합물을 고압 호모게나이저로 통과시킴으로써 유화시키는 것이다.
또한, 합성 폴리머[예를 들면, 면역원을 캡슐화하는 미소 구체, 예를 들면 생분해성 미소 구체의 제조에 사용되어 온 락트산과 글리콜산의 호모- 및 공중합체, 참고자료: Eldridge 외, Mol. Immunol. 28:287-294(1993)], IL-2, IL-12와 같은 사이토카인(참고자료: 미국특허 제5,334,379호), 및 GMCSF, 특히 유리하게는 돼지 GMCSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; 일반적 참고자료; 미국특허 제4,999,291호 및 제5,461,663호, Clark 외, Science 1987, 230:1229; Grant 외, Drugs, 1992, 53:516)를 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들면 사이토카인, GMCSF(참고자료 예; Inumaru 및 Takamatsu, Immunol. Cell. Biol., 1995, 73:474-76 돼지 GM-CSF의 플라스미드 코딩 및 발현에 관하여)과 같은 특정 아쥬번트는 면역원(들) 및/또는 에피토프(들)과 함께 생체내 발현시킬 수 있다.
그 밖의 아쥬번트의 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 바람직한 아쥬번트화합물은 특히 당이나 폴리알콜의 폴리알케닐 에스터로 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 용어로 알려져 있다(Phameuropa Vol.8, No.2, June 1996). 당업자는 또한 미국특허 제2,909,462호를 참고할 수 있는데, 여기에는 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이상의 수산기를 가진 폴리하이드록시화 화합물로 가교결합된 아크릴 폴리머로서, 적어도 3개의 상기 수산기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 가진 불포화 지방족 라디칼로 치환되어 있는 것이 제시되어 있다. 바람직한 라디칼은 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌과 같은 불포화기와 같이 2개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것이다. 상기 불포화 라디칼은 그 자체가 메틸과 같은 다른 치환기를 함유할 수 있다. Carbopol(R)(미국 오하이오주 소재 BF Goodrich사)라는 상품명으로 판매되는 제품이 특히 적합하다. 그것은 알릴 수크로오스 또는 알릴 펜타에리스리톨로 가교결합되어 있다. 그 중에서 언급할만한 제품은 Carbopol(R)974P, 934P 및 971P이다. 무수 말레산과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 무수 말레산과 에틸렌의 공중합체이고 선형 또는 예를 들면 디비닐 에테르로 가교결합된 공중합체 EMA(R)(Monsanto사)가 바람직하다. J. Fields 외, Nature, 186:778-780, 1960년 6월 4일 간행본을 참고할 수 있다.
구조적 관점에서, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 공중합체 EMA(R)는 하기 식으로 표기되는 기본 단위로 형성되는 것이 바람직하다:
상기 식에서,
R1및 R2는 동일하거나 상이하며, H 또는 CH3를 의미하고,
x = 0 또는 1, 바람직하게는 x = 1이고,
y = 1 또는 2이고, 여기서 x + y = 2임.
공중합체 EMA(R)에 있어서, x = 0이고 y = 2이다. 카보머에 있어서는 x = y = 1이다.
이들 폴리머를 물에 용해시키면 산성 용액이 되며, 이 산성 용액은 면역학적 조성물 또는 백신 조성물이 혼합되는 아쥬번트 용액을 얻기 위해 생리 pH로 중화되는 것이 바람직하다. 면역원성, 그 경우에 폴리머의 카복시기들은 부분적으로 COO-형태이다.
본 발명에 따른 아쥬번트의 용액, 특히 카보머 용액은 증류수 중에서, 바람직하게는 염화나트륨 존재 하에 제조하는 것이 바람직하고, 얻어지는 용액은 산성 pH를 가진다. 이 보존 용액을 요구량(원하는 최종 농도를 얻기 위해), 또는 실질적인 부분의 NaCl 함유수, 바람직하게는 생리 식염수(NaCl 9g/l)에 첨가하여 희석하되, 여러 개의 분획으로 한꺼번에 동시에 또는 후속하여 바람직하게는 NaOH로 중화(pH 7.3 내지 7.4)하는 방식으로 희석한다. 이 용액은 생리 pH에서 백신, 특히 동결건조된 상태, 액체 상태 또는 결빙 상태로 저장되는 백신과 혼합하기 위해 그 자체로 사용된다.
최종 백신 조성물의 폴리머 농도는 0.01% 내지 2% w/v, 특히 0.06% 내지 1% w/v, 바람직하게는 0.1% 내지 0.6% w/v일 수 있다.
본 설명과 당 분야의 지식으로부터 당업자는 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명에 따른 면역학적 조성물, 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 도입하기 위해, 원할 경우 적합한 아쥬번트와 그 양을 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원 조성물 또는 백신 조성물은 적어도 다른 하나의 돼지 병원체로부터 관심의 대상인 적어도 하나의 면역원 또는 에피토프를 발현시키는 적어도 하나의 생균 약독화되거나 불활성화되거나 서브유닛인 백신 또는 재조합 백신(예를 들면, 벡터 또는 DNA 플라스미드로서 폭스바이러스)에 혼합할 수 있다.
본 발명에 의해 여러 가지 투여 경로를 위한 형태의 조성물이 설계된다. 또한, 유효 투여량 및 투여 경로는 나이, 성별, 체중 및 다른 공지의 선별 절차와 같은 공지의 인자에 의해 결정되며 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 각 활성 성분의 1회 투여량은 본 명세서에 인용된 문헌과 같을 수 있고/있거나 1㎍ 또는 수㎍ 내지 수백이나 수천 ㎍의 범위일 수 있는데, 예를 들면, 서브유닛 면역원 조성물 또는 백신 조성물의 경우 1㎍ 내지 1mg; 불활성화된(불활성화 전의 역가) 면역원성 또는 백신 조성물의 경우 104내지 1010TCID50, 유리하게는 106내지 108TCID50일 수있다. 생균 약독화된 면역원성 또는 백신 조성물의 경우, 1회 투여량은 101과 108TCID50사이, 유리하게는 103과 106TCID50사이이다.
재조합체 또는 벡터는 생체내 발현을 얻기 위해 본 명세서 및/또는 인용 문헌에 기재된 투여량에 대응하는 적합한 양으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 현탁액에 대한 적합한 범위는 실험적으로 결정할 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터 또는 재조합체는 예를 들면 약 2ml의 1회 투여량에 대해 약 103pfu 이상, 더욱 바람직하게는 약 104pfu 내지 약 1010pfu, 예를 들면 약 105pfu 내지 약 109pfu, 다른 예로는 약 103pfu 내지 약 103pfu의 양으로 돼지에 투여하거나 세포에 감염 또는 트랜스펙션시킬 수 있다. 또한, 하나 이상의 유전자 산물이 하나 이상의 재조합체에 의해 발현될 경우, 재조합체 각각은 이러한 양으로 투여할 수 있고; 또는 재조합체 각각은 이들 양을 포함하는 재조합체 전체가 혼합되어 있도록 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 플라스미드 조성물에서, 1회 투여량은 인용 문헌 또는 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 조성물 중의 플라스미드 DNA 각각의 적합한 양은 1㎍ 내지 2mg일 수 있고, 바람직하게는 50㎍ 내지 1mg이다. 당업자는 과도한 실험을 하지 않고 본 발명의 DNA 플라스미드 벡터 조성물을 위한 다른 적합한 투여량을 확인하려면 DNA 플라스미드 벡터에 관하여 본 명세서에서 인용한 문헌을 참조할 수 있다.
그러나, 적합한 면역원성 반응을 유도하는 조성물(들)의 투여량, 그 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기는 예를 들면 돼지에서의 효소결합 면역흡착검사(ELISA)와 같은 혈청의 항체 적정 및/또는 혈청중화 분석법 및/또는 백신접종 공격감염 평가와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다. 그러한 결정은 당업자의 지식, 본 명세서 및 인용 문헌을 통해 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 또한 순차적인 투여 시기도 마찬가지로 본 명세서로부터 확인할 수 있는 방법 및 당업자의 지식으로 과도한 실험을 하지 않고 확인할 수 있다.
PCV-2 면역원은 PCV-2로부터 얻을 수 있고, 또는 PCV-2 유전자(들)나 그것의 일부 또는 그것의 에피토프의 시험관내 재조합 발현으로부터 얻을 수 있다. 발현을 위한 벡터(또는 재조합체)의 제조 방법 및/또는 사용 방법은 다음 자료에 제시된 방법에 의하거나 그와 유사한 것일 수 있다: 미국특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 제5,174,993호, 제5,505,941호, 제5,338,683호, 제5,494,807호, 제4,722,848호, 제5,942,235호, 제5,364,773호, 제5,762,938호, 제5,770,212호, 제5,942,235호, 제5,756,103호, 제5,766,599호, 제6,004,777호, 제5,990,091호, 제6,033,904호, 제5,869,312호, 제5,382,425호, PCT 공개공보 WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update," PNAS USA 93:11349-11353, October 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93:11341-11348, October 1996, Smith 외, 미국특허 제4,745,051호(재조합 바큘로바이러스), Richardson, C.D.(편집자),Methods in Molecular Biology39, "Baculovirus Expression Protocols"(1995 Humana Press Inc.), Smith 외, "Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector," Molecular and Cellular Biology, Dec. 1983, Vol.3, No.12, p.2156-2165; Pennock 외, "Strong and Regulated Expression ofEscherichia coliB-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector," Molecular and Cellular Biology, Mar. 1984, Vol.4, No.3, p.399-406; EPA 0 370 573, 미국특허 출원번호 920,197, 출원일 1986년 10월 16일, 유럽특허 공보 제265785호, 미국특허 제4,769,331호(재조합 헤르페스바이러스), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996, Andreansky 외, "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93:11313-11318, October 1996, Robertson 외, "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes," PNAS USA 93:11334-11340, October 1996, Frolov 외, "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93:11371-11377, October 1996, Kitson 외, J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; 미국특허 제5,591,439호, 제5,552,143호, WO 98/00166, 허여된 미국특허 출원번호 08/675,556 및 08/675,566, 출원일 1996년 7월 3일(재조합 아데노바이러스), Grunhaus 외, 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology(Vol.3) p.237-52, 1993, Ballay 외, EMBO Journal,vol.4, p.3861-65,Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec 외, J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT WO 91/11525, Felgner 외(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 및 McClements 외, "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease," PNAS USA 93:11414-11420, October 1996, 및 미국특허 제5,591,639호, 제5,589,466호, 제5,580,859호 및 WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797, WO-A-95 11307, WO-A-95 20660, Tang 외, Nature 356, 152-154, 1992, 및 특히 DNA 발현 벡터에 관한 Furth 외, Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992. 그 밖의 참고자료로서 WO 98/33510; Ju 외, Diabetologia, 41:736-739, 1998(레티바이러스 발현 시스템); Sanford 외, 미국특허 제4,945,050호; Fischbach 외(Intracel), WO 90/01543; Robinson 외, seminars in IMMUNOLOGY, vol.9, pp.271-283(1997)(DNA 벡터 시스템); Szoka 외, 미국특허 제4,394,448호(DNA를 생체 세포에 삽입하는 방법); McCormick 외, 미국특허 제5,677,178호(세포변성 바이러스의 용도); 미국특허 제5,928,913호(유전자 전달용 벡터), 및 본 명세서에 인용된 다른 문헌이 포함된다. 예를 들면 아우제스키병 바이러스, 돼지 아데노바이러스, 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리아폭스 바이러스 및 돼지마마 바이러스와 같은 돼지 헤르페스 바이러스로부터 선택된 바이러스 벡터 및 DNA 벡터(DNA 플라스미드)는 본 발명의 실시에서 유리하게 사용된다.
PCV-2 유전자(들) 또는 그의 부분으로부터의 발현 산물은 진단용으로 유용한단일 클론 또는 다중 클론 항체와 같은 항체를 생성하는 데 유용할 수 있다. 마찬가지로, PCV-2 유전자(들) 또는 그의 부분으로부터의 발현 산물(들)은 진단 용도에 유용할 수 있다.
또한, 당업자는 PCV-2 면역원 또는 다른 돼지 병원체의 면역원에 있는 관심의 대상인 에피토프를 과도한 실험을 하지 않고도 본 명세서에 개시된 내용 및 당 분야의 지식으로부터 결정할 수 있다; 참고자료로 예를 들면 WO 98/40500에 특히 관심의 대상인 에피토프 또는 단백질의 에피토프 영역을 결정하는 일반적 정보에 관해 제시되어 있다.
본 발명에 따르면, 유리한 면역원성 또는 백신 조성물은: ECACC(European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology % Research, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)에 다음 관리번호로 기탁된 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 돼지 써코바이러스의 정제된 제제와 같은 PCV-2의 정제된 제제로 감염시킨 생체내 세포 배양균으로부터 수집한 면역원성 또는 백신 조성물: 기탁일자 1997년 10월 2일인 수탁번호 V97100219(균주 Imp.1008), 수탁번호 V97100218(균주 Imp.1010) 및 수탁번호 V97100217(균주 Imp.999), 기탁일자 1998년 1월 16일인 수탁번호 V98011608(균주 Imp.1011-48285) 및 수탁번호 V98011609(균주 Imp.1011-48121), 기탁일자 2000년 2월 2일인 수탁번호 00012710(균주 1103) 및 수탁번호 00012709(균주 1121); 또는 시험관내 세포 배양균에서 산출되어 분리시킨 돼지 써코바이러스로 이루어지는 면역원성 또는 백신 조성물로서, 이들 세포는 PMWS 증후군을 가진 돼지로부터의 생리적 샘플 또는 조직 샘플, 특히 병변 부위의샘플로부터 분리될 수 있는 돼지 써코바이러스로 감염시킨 것이며, 예를 들면, 상기 돼지 써코바이러스가 PCV-1이 오염되지 않은 PK/15 세포와 같은 돼지 신장 세포계에서 산출되어 분리된 조성물; 또는 그러한 써코바이러스로 감염시킨 시험관내 세포 배양균으로부터 수집한 배양 추출물 또는 상청액을 포함하거나 그로부터 제조된 조성물 등이다. 따라서, 돼지 써코바이러스는 면역원이 될 수 있다. 예를 들면, 상기 백신 또는 면역원 조성물은 유리하게 수의학적 또는 약제학적으로 허용되는 매개체 또는 희석제 및, 선택적으로, 수의학적 또는 약제학적으로 허용되는 아쥬번트, 그리고 선택적으로 냉동건조 안정화제 내에 약독화된 생균 면역원(예를 들면 바이러스)를 포함할 수 있다. 상기 면역원(예를 들면 바이러스)은 불활성화 처리될 수 있고, 상기 백신 또는 면역원 조성물은 추가로 및/또는 선택적으로 수의학적 또는 약제학적 허용가능한 매개체 또는 희석제 및 선택적으로 수의학적 또는 약제학적 허용가능한 아쥬번트를 포함할 수 있다. 상기 백신 또는 면역원 조성물은 PCV-2 면역원 및/또는 여러 종의 돼지 써코바이러스(PCV-2 또는 여러가지 PCV-2 균주 및 PCV-1 포함)의 면역원, 그리고 선택적으로 또 다른 돼지 병원체 유래의 부가적 면역원을 포함할 수 있고; 그 예를 들면, PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae,E. coli, Pseudorabies, Hog cholera, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Swine Influenza, PPV 등이 있다(참고: WO-A-00 01409).
써코바이러스 항원 제제를 제조하기 위해, 써코바이러스를 세포, 특히 예를 들면 PK/15 세포계와 같은 세포계 상에서 통과시킨 후 얻을 수 있다. 배양 상청액또는 추출물은 선택적으로 표준 기법에 의해 정제된 것이 사용될 수 있다.
약독화 PCV에 관련하여, 약독화는 종래의 방법에 따라, 예를 들면 세포 상, 바람직하게는 돼지 세포 상, 특히 PK/15 세포와 같은 세포계를 통과시킴으로써(예를 들면 20 내지 150, 특히 40 내지 100 레벨의 통과) 행할 수 있다.
불활성화 백신에 관련하여, 존재할 수 있는 분획과 함께 PCV는 당업자에게 알려진 기법에 따라 불활성화된다. 불활성화는 예를 들면 항원을 포름알데히드(포르말린), 파라포름알데히드, β-프로피오락톤 또는 에틸렌이민이나 그 유도체와 같은 화학적 작용물에 노출시키는 화학적 처리 및/또는 물리적 처리에 의해 행하는 것이 바람직하다. 바람직한 불활성화 방법은 화학적 작용물, 특히 에틸렌이민 또는 β-프로피오락톤에 노출시키는 것이다.
백신 조성물 또는 면역원 조성물 내의 면역원은 예를 들면 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, 그리고 SEQ ID No:6 및 SEQ ID No:7(도 1-4 및 도 6-7)로 지정된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 PCV-2 뉴클레오디트 서열 또는 그 단편(유리하게는 적어도 하나의 에피토프를 코딩하는)을 함유하는 DNA 단편으로부터 발현시킬 수 있다. 백신 조성물 또는 면역원 조성물 내의 면역원은 ORF 4, 7, 10 및 13과 같은 ORF 1 내지 13,, 바람직하게는 ORF 4 및/또는 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ORF를 함유하는, PCV-2균주의 DNA 단편, 특히 앞에 제시한 균주(WO-A-99 18214에 표기된 바와 같음, 또한 이하의 표 1 참조) 중 하나의 DNA 단편으로부터 발현시킬 수 있다. 따라서, 관심의 대상인 에피토프와 같은 면역원 또는 그것의 부분은 재조합체 또는 벡터로부터 시험관내 발현에 의해 얻을수 있다. 면역원은 종래의 방법에 의해 추가로 정제 및/또는 농축할 수 있다.
백신 조성물 또는 면역원 조성물 내의 면역원은 예를 들면 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, 그리고 SEQ ID No:6 및 SEQ ID No:7(도 1-4 및 도 6-7)로 지정된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 PCV-2 뉴클레오디트 서열 또는 그 단편(유리하게는 적어도 하나의 에피토프를 코딩하는)을 함유하는 DNA 단편을 포함하는 발현 벡터에 의해 생체내 발현시킬 수 있다. 마찬가지로, 백신 조성물, 면역원 조성물 또는 면역학적 조성물 내의 면역원은 ORF 4, 7, 10 및 13과 같은 ORF 1 내지 13, 바람직하게는 ORF 4 및/또는 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ORF를 함유하는, PCV-2균주의 DNA 단편, 특히 앞에 제시한 균주 중 하나의 DNA 단편을 포함하는 발현 벡터에 의해 생체내 발현시킬 수 있다. 즉, 백신 조성물 또는 면역원 조성물은 관심의 대상인 에피토프와 같은 면역원 또는 그것의 부분을 생체내 발현시키는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
발현 벡터는 특히 DNA 플라스미드,E. coli와 같은 박테리아, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, 아우제스키 질병 바이러스와 같은 헤르페스바이러스, 돼지 아데노바이러스를 포함하는 아데노바이러스, 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리아폭스 바이러스 및 돼지마마 바이러스로부터 선택되는 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터일 수 있다[당업자는 또한 Audonnet 외 및 Bublot 외의 미국특허 출원번호 각각 60/138,352 및 60/138,478(모두 1999년 6월 10일에 출원)을 참고할 수 있고, 특히 상세한 설명, 그 중에도 실시예를 참조할 수 있다. 상기 발명의 명칭은 각각 "DNA VACCINE-PCV" 및 "PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANTPOXVIRUS VACCINE"이고 본 명세서에 부록으로서 첨부되어 있다].
따라서, 본 발명은 또한 핵산 분자 및 그를 함유하는 벡터 및 그것에 유래하는 발현 산물, 그러한 핵산 분자 및/또는 벡터 및/또는 발현 산물을 포함하는 조성물을 포함하고, 본 발명은 또한 이들 예의 일부 또는 전부를 제조하고 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 특히 면역원이나 에피토프를 코딩하는 ORF 및/또는 단편, 및 균주 1103 및/또는 1121의 핵산 분자, 특히 ORF 4, 7, 10 및 13과 같은 그것들의 ORF 1 내지 13 및 그들의 단편, 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이들 핵산 분자, 벡터 또는 그들 유래의 발현 산물을 포함하는 조성물, 그러한 발현 산물, 그러한 핵산 분자용 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물, 및 이들 예를 포함하는 용도나 방법, 예를 들면 PCV-2에 대한 검출, 진단, 분석, 면역원성 반응이나 보호 반응을 유도하는 용도나 방법을 포괄한다.
앞에서 언급한 바와 같이 본 발명의 실시예는 항체를 포함할 수 있다. 그러한 항체는 다중 클론 또는 단일 클론 항체일 수 있고, 예를 들면 전술한 써코바이러스로부터 제조되는 것, 또는 예를 들면 SEQ ID NO.1, 2, 3, 4, 6, 7(도 1-4 및 도 6-7)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 PCV-2 서열을 갖는 DNA 단편에 의해 코딩되는 폴리펩타이드로부터 제조되는 것, 또는 SEQ ID NO.1, 2, 3, 4, 6, 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 PCV-2 서열을 포함하는 벡터에 의한 발현으로 얻어지는 폴리펩타이드로부터 제조되는 것, 또는 ORF 1 내지 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ORF를 포함하는 DNA를 포함하는 벡터에 의한 발현으로 얻어지는 폴리펩타이드로부터 제조되는 것 등이다. 당업자는 공지의 기술을 이용하여 항체를 유도하고 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체를 생성시킬 수 있다. 항체 및 항원은 진단 분야에 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 특히 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염에 관련된 PCV-2 DNA의 검출 및 예를 들면 발현 벡터를 제조하기 위해 PCV-2 DNA를 증폭시키는 데 유용한 PCV-2 DNA의 검출에 유용할 수 있는 PCV-2 균주 1103 및/또는 1121유래의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 PCV-2 및 가능하게는 이들 균주에 특이적이거나 PCV-2 내에 있으며 PCV 또는 써코바이러스과 중에서 가장 적게 보존된 PCV-2 게놈 또는 PCV-2 유전자에 있는 뉴클레오타이드의 범위(stretch)가 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 20개와 같이 적어도 12, 13, 14 또는 15개, 예를 들면 적어도 23개 또는 25개, 또는 예를 들면 적어도 27개 또는 30개인 것일 수 있다. PCR 또는 혼성화(hybridization) 프라이머 또는 프로브 및 그의 최적 길이에 관해서 Kajimura 외, GATA 7(4):71-79(1990)을 또한 참고할 수 있다. 혼성화는 "하이 스트린전시(high stringency)"라는 용어가 당업자에게 이해되는 바와 같이, 하이 스트린전시 조건 하에 있는 것이 유리하다(참고자료로 예를 들면 Sambrook 외, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Hames 및 Higgins 편저, 1985, Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K.). 혼성화는 비제한적으로 PCR-증폭된 DNA 단편에 대한 서던 블롯(Southern blot) 혼성화, 노던 블롯(Northern blot) 혼성화, 원 위치에서의 혼성화 및 유리하게는 서던 혼성화를 포함하는 이미 정립된기술을 이용하여 달성되는 것으로 이해될 것이다.
프로브 또는 프라이머와 마찬가지로, 전체 길이의 PCV-2 단백질이 아닌 펩타이드는 본 발명에 속하며, PCV-2 및 가능하게는 이들 균주에 특이적이거나 PCV-2 내에 있으며 PCV 및/또는 써코바이러스과 중에서 가장 적게 보존된 PCV-2 게놈 또는 PCV-2 유전자에 있는 아미노산의 범위가 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 20개와 같이 적어도 12, 13, 14 또는 15개, 예를 들면 적어도 23개 또는 25개, 또는 예를 들면 적어도 27개 또는 30개인 것일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 전체 길이의 PCV-2 단백질이 아닌 본 발명의 아미노산은 PCV-2 단백질의 에피토프 영역일 수 있다.
PCV-2 서열은 1998년에 Meehan 등에 의해 설명되었다[균주 Imp.1010; ORF1 뉴클레오타이드 398-1342; ORF2 뉴클레오타이드 1381-314; 본 발명의 용어 중 ORF4(표 1 참조)에 상응하고, 미국특허 출원번호 09/161,092(출원일 1998년 9월 25일)에서의 ORF13에 상응하며, WO-A-9918214에서의 COL4 및 COL13에 대응함]. 여러 개의 PCV-2 균주와 그 서열이 본 명세서에 제시되어 있으며 Imp1008, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103, 1121로 불리운다. 다른 균주가 A.L. Hamel 외, J.Virol. June 1998, vol.72,6:5262-5267(GenBak AF027217) 및 I. Morozov 외, J.Clinical Microb. Sept.1998 vol.36,9:2535-2541, 및 GenBank AF086834, AF086835, AF086836에 제시되어 있다. 이들 서열 또는 그로부터의 ORF, 또는 항원, 면역원 또는 관심의 대상인 에피토프를 코딩하는 영역도 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서와 인용 문헌에서 이용되거나 언급된 것과 등가인 서열; 예를 들면, 하이 스트린전시 조건 하에 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함한다(참고자료 예, Sambrook 외, 1989). 등가 서열 가운데, 또한 언급할 수 있는 것은 완전한 서열의 면역원성을 보존하는 유전자 단편, 예를 들면 관심의 대상인 에피토프이다.
PCV 1형 및 2형의 전체 게놈 사이의 상동성(homology)은 약 75%이다. 그러나 2형 내에서, 상동성은 일반적으로 95% 이상이다. 이와 같이 본 발명의 실시에 있어서, 모든 PCV-2 균주를 사용하는 것은 등가로 포함된다. 기준은 균주가 2형이고, 예를 들면 상기 균주가 본 명세서에 기재된 균주 Imp1010인 상태에서 전체 기놈의 뉴클레오타이드 레벨에서의 상동성이 85% 이상, 유리하게는 90% 이상, 더욱 유리하게는 95% 이상, 바람직하게는 97%, 98% 또는 99% 이상인 것일 수 있다.
균주 Imp1010의 ORF의 한계를 하기 표 1에 제시한다.
[표 1]
이름 시작 끝 가닥(strand) ORF의 크기[뉴클레오타이드(nt)] 단백질 크기[아미노산(aa)]
ORF1 103 210 센스 108nt 35aa
ORF2 1180 1317 센스 138nt 45aa
ORF3 1363 1524 센스 162nt 53aa
ORF4 398 1342 센스 945nt 314aa
ORF5 900 1079 센스 180nt 59aa
ORF6 1254 1334 센스 81nt 26aa
ORF7 1018 704 안티센스 315nt 104aa
ORF8 439 311 안티센스 129nt 42aa
ORF9 190 101 안티센스 90nt 29aa
ORF10 912 733 안티센스 180nt 59aa
ORF11 645 565 안티센스 81nt 26aa
ORF12 1100 1035 안티센스 66nt 21aa
ORF13 314 1381 안티센스 702nt 213aa
ORF는 균주 Imp1010에 관하여 정의된다. 본 발명은 또한 임의의 다른 PCV-2 균주에서의 대응하는 ORF의 용도 및 본 명세서 또는 인용된 문헌에 정의된 임의의 PCV-2 균주의 용도를 포함한다. 따라서 게놈의 뉴클레오타이드 서열로부터, MacVector(R)와 같은 표준 소프트웨어를 이용하여 ORF를 결정하는 것은 통상의 기술이다. 또한, 균주 1010의 정렬과 함께 게놈을 정렬시키고 균주 1010 ORF와 비교함으로써 당업자는 다른 균주에 대한 게놈 상의 ORF를 바로 결정할 수 있다(예를 들면, WO-A-99 18214에 기재된 것, 소위 Imp1008, Imp1011-48121, Imp1011-48285, Imp999, 및 새로운 균주 1103 및 1121). 소프트웨어의 사용이나 정렬시키는 일은 과도한 실험이 아니며 곧바로 이들 ORF로의 접근을 제공한다.
예를 들면, 도 6 및 도 7을 참고하여, 균주 1103 및 1121의 대응하는 ORF를 하기 표 2에 제시한다.
[표 2]
이름 시작 끝 가닥(strand) ORF의 크기[뉴클레오타이드(nt)] 단백질 크기[아미노산(aa)]
ORF1 1524 1631 센스 108nt 35aa
ORF2 833 970 센스 138nt 45aa
ORF3 1016 1177 센스 162nt 53aa
ORF4 51 995 센스 945nt 314aa
ORF5 553 732 센스 180nt 59aa
ORF6 907 987 센스 81nt 26aa
ORF7 671 357 안티센스 315nt 104aa
ORF8 92 1732 안티센스 129nt 42aa
ORF9 1611 1522 안티센스 90nt 29aa
ORF10 565 386 안티센스 180nt 59aa
ORF11 298 218 안티센스 81nt 26aa
ORF12 753 688 안티센스 66nt 21aa
ORF13 1735 1037 안티센스 702nt 213aa
또한 본 발명에서 등가이며 유용한 것은 고려 대상인 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 기능성 및 균주 특이성(이른바 균주 2형의)을 변화시키지 않는 뉴클레오타이드 서열이다. 코드의 퇴화를 통한 서열의 차이는 물론 본 발명의 실시에 포함된다.
ORF4에 대해 PCV-1과 PCV-2 사이의 상동성은 약 86%이고, ORF13에 대해 PCV-1과 PCV-2 사이의 상동성은 약 66%이다. 따라서, 본 발명의 실시에서 유용한 등가 서열은, ORF4의 경우에 균주 Imp1010의 ORF4에 대해 88% 이상, 유리하게는 90% 이상, 바람직하게는 92% 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열이고, ORF13의 경우에 균주 Imp1010의 ORF13과 비교 시 80% 이상, 유리하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열이다.
다른 ORF에 관한 상동성에 있어서, 앞에서 정의한 바와 같이 균주 1010의 대응하는 ORF와의 상동성을 갖는 ORF4 및/또는 ORF13을 가진 PCV 균주로부터 유래하는 서열을 결정할 수 있다. ORF7의 경우에, 본 발명의 실시에 유용한 서열은 앞에서 정의한 바와 같은 상동성이 균주 Imp1010의 ORF7에 대해 유리하게는 80% 이상, 더욱 유리하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상인 서열을 포함한다. ORF10의 경우에, 본 발명의 실시에 유용한 서열은 앞에서 정의한 바와 같은 상동성이 균주 Imp1010의 ORF10에 대해 유리하게는 86% 이상, 더욱 유리하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상인 서열을 포함한다(표 1의 용어 사용).
또한, 본 발명의 실시에서 유용한 등가 서열은, ORF4의 경우에 균주 Imp1010의 ORF4에 대해 88% 이상, 유리하게는 90% 이상, 바람직하게는 92% 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열이고, ORF13의 경우에 균주 Imp1010의 ORF13에 대해 80% 이상, 유리하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열이다.
ORF4 및 ORF13은 각각 예상 분자량이 37.7 kD 및 27.8 kD인 단백질을 코딩하는 잠재력을 가진다. ORF7 및 ORF10(Meehan 외 1998에서의 ORF3 및 ORF4에 대응함)은 각각 예상 분자량이 11.9 kD 및 6.5 kD인 단백질을 코딩하는 잠재력을 가진다. 이들 ORF의 서열은 또한 GenBank AF 055392에서 얻을 수 있다. 그것들은 또한 플라스미드 내에 결합될 수 있고 본 발명에 따라 단독으로 사용하거나 예를 들면 ORF4 및/또는 ORF13과 조합하여 사용할 수 있다.
상기 표에 제시된 다른 ORF 1-3 및 5, 6, 9, 11-12(WO-A-99 18214에서 행 1-3, 5, 6, 8-9, 11-12), 또는 항원 또는 관심의 대상인 에피토프를 코딩하는 그것들의 영역(들)은 본 발명의 실시에서 예를 들면 단독으로 사용하거나, ORF4 및/또는 13 또는 항원(들) 또는 에피토프(들)을 코딩하는 그것들의 영역(들)과 조합하여 사용할 수 있다. 마찬가지로, 상동성에 대하여, 본 명세서 또는 1998에 Meehan 등에 의해 정의된 균주 1010의 대응 ORF에 대한 앞에서 정의한 바와 같은 상동성을 갖는 ORF13 및/또는 ORF4를 가진 PCV 균주 유래의 등가 서열이 있음을 결정할 수 있다. ORF7의 경우에, 등가 서열은 균주 Imp1010의 ORF7에 대해 유리하게는 예를 들어 80% 이상, 예를 들면 85% 이상, 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 그리고 ORF10의 경우에, 등가 서열은 균주 Imp1010의 ORF10에 대해 86% 이상, 유리하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다.
뉴클레오타이드 서열 상동성은 Myers 및 Miller("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988)의 "정렬(align)" 프로그램을 이용하여 결정할 수 있고 NCBI에서 구할 수 있다. 대안적 또는 부가적으로, 예를 들면 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 관한 "상동성" 또는 "동일성(identity)"이라는 용어는 두 서열간 상동성의 정량적 평가를 나타낼 수 있다. 서열 상동성의 백분율은
(Nref- Ndif)*100/Nref
로 계산할 수 있다. 상기 식에서 Ndif는 정렬 시 두 서열에서의 동일하지 않은 잔기의 총수이고, Nref는 서열 중 하나에서의 잔기의 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC(Nref=8; Ndif=2)에 대해 75%의 서열 유사성을 가질 것이다.
대안적 또는 부가적으로, 서열에 관한 "상동성" 또는 "동일성"은 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 갖는 위치의 수를 두 서열 중 짧은 서열의 뉴클레오타이드나 아미노산의 수로 나눈 값을 가리키며, 여기서 두 서열의 정렬은 예를 들면 20 뉴클레오타이드의 윈도우 크기, 4 뉴클레오타이드의 단어 길이 및 갭 페널티(gap penalty) 4를 사용하여 Wilbur 및 Lipman 연산법(Wilbur 및 Lipman, 1983, PNAS USA 80:726)에 따라 결정될 수 있고, 상용화된 프로그램(예를 들면 IntelligeneticsTMSuite, 미국 캘리포니아주 Intelligenetics Inc.)을 이용하여 정렬을 포함하는 서열 데이터의 컴퓨터에 의한 분석 및 해석을 편리하게 실행할 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하거나 어느 정도의 서열 동일성 또는 상동성을가질 경우, DNA 서열 중의 티미딘(T)은 RNA 서열에 있는 우라실(U)과 동등한 것으로 간주된다.
본 발명의 범위에 포함되는 RNA 서열은 RNA 서열에 있는 우라실(U)과 동등한 것으로 간주되는 DNA 서열 내의 티미딘(T)에 의해 DNA 서열로부터 유도될 수 있다.
부가적 또는 대안적으로, 아미노산 서열 유사성, 동일성 또는 상동성은 BlastP 프로그램(Altschul외, Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402)를 이용하여 결정될 수 있고 NCBI에서 구할 수 있다. 하기의 참고자료는 두 가지 단백질의 아미노산 잔기의 상대적인 동일성 또는 상동성을 비교하기 위한 연산을 제공하고, 부가적 또는 대안적으로 전술한 바에 관하여, 이들 참고자료는 상동성 또는 동일성 백분율을 결정하는 데 이용할 수 있다: Needleman SB 및 Wunsch DC, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins,"J. Mol. Biol.48:444-453(1970); Smith TF 및 Waterman MS. "Comparison of Bio-sequences,"Advances inApplied Mathematics2:482-489(1981); Smith TF, Waterman MS 및 Sadler JR, "Statistical characterization of nucleis acid sequence functional domains,"Nucleic Acids Res., 11:2205-2220(1983); Feng DF 및 Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees,"J. of Molec. Evol., 25:351-360(1987); Higgins DG 및 Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer,"CABIOS, 5:151-153(1989); Thompson JD, Higgins DG 및 Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice,Nucleic Acid Res., 22:4673-480(1994); 및 Devereux J, Haeberlie P 및 Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX,"Nucl. Acids Res., 12:387-395(1984).
본 발명은 또한 PCV-2 면역원을 단독으로 또는 다른 돼지 병원체의 면역원과 조합하여 예를 들면 성분들을 혼합하여 본 발명에 따른 조성물을 생성하기 위한 PCV-2의 용도를 포함하며, 따라서 본 발명은 성분들이 개별적으로 함유되어 있고 선택적으로 용기들이 혼합 및/또는 투여를 위해 함께 포장되어 있는 키트를 포함하며, 그 키트는 또한 선택적으로 혼합 및/또는 투여에 대한 지침을 포함할 수 있다.
본 발명이 PCV-2 면역원을 포함하는 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 암퇘지에게 투여하는 것에 관하여 논의되었지만, 본 발명은 또한 그러한 조성물을 본 명세서에 제시한 바와 같은 어미 암퇘지 또는 어린 암퇘지 및/또는 수퇘지(boar)에 투여하는 것도 포함한다. 따라서 어미와 자손(예를 들면 어미 암퇘지, 어린 암퇘지) 및 수퇘지에게 본 발명의 조성물을 투여할 수 있고/있거나 본 발명의 방법을 적용할 수 있다. 따라서, 돼지의 개체군들에 대해 본 발명의 조성물을 투여할 수 있고/있거나 본 발명의 방법을 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 면역원 조성물 및 백신 조성물은 1종 이상의 PCV-2 균주로부터 얻어지는 면역원을 포함할 수 있다. 예를 들면 균주 1121 및 1103으로부터 얻어지는 면역원들, 이들 균주 중의 하나 또는 모두와 본 명세서에 제시된 적어도 1종의 다른 균주로부터 얻어지는 면역원, 또는 임의의 다른 조합물로부터 얻어지는면역원을 조합할 수 있다.
본 발명은 당업자로 하여금 PCV-2에 대항하는 백신의 효능을 평가할 수 있도록 하는 방법을 제공한다. 제1의 방법은 ELISA법 또는 혈청중화를 이용하는 방법이다. 제2의 방법은 백신 접종에 이어서 본 명세서에 제시된 균주 중의 하나인 바이러스성 PCV-2 균주로 공격감염시키는 것이다. 다시 말하면, 본 발명에 의해 PCV-1 면역원을 포함하는 PCV 면역원에 대해 PCV-2에 대항하는 면역원성 반응 또는 보호 반응을 유도할 수 있는지 체크할 수 있다. 그러한 PCV 면역원은 PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염에 대항하여, 그리고 PMWS 및/또는 그와 관련된 다른 병리적 후유증에 대항하여 보호 또는 치료하는 데 유용하다.
이와 같이 본 발명의 일 양태는 PCV 면역원을 포함하고 PCV-2에 대항하여 면역원성 반응 또는 보호 반응을 유도할 수 있는 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 그러한 면역원을 이용한 면역화 또는 백신 접종의 방법, 그리고 그러한 면역원 조성물 또는 백신 조성물을 생성하기 위해 그러한 면역원을 이용하는 용도에 관한 것이다.
이하의 실시예 및 결과를 통해 본 발명을 더욱 설명하는데, 이들 실시예 및 결과는 예시의 목적으로 제공된 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 간주되어서는 않된다.
실시예 및 결과
실시예/결과 1: PCV-2와 관련된 심근염, 유산 및 자궁 내 감염
새로 지은 450마리의 암퇘지 사육 설비에서 생산을 착수하였을 때 말기 유산 및 사산과 미라화된 새끼 돼지의 분만이 발생하였다. 또한 여러 마리의 어린 암퇘지에서 가임신이 관찰되었다. 어린 암퇘지는 수정되기 전에 파보바이러스 및 렙토스피라의 면역원을 함유하는 불활성화 백신을 2회 접종시켰다.
검시용으로 수용한 한 배의 새끼는 다양한 임신 단계에서 죽은 것으로 보이는 9마리의 태아로 이루어졌다. 그중 2마리는 미라화되고, 2마리는 침연(浸軟)되었고, 3마리는 자가분해되었으며 2마리는 생생한 상태로 사산된 새끼 돼지였다. 육안 병리학적 검사에서 1마리의 부분적으로 자가분해된 태아에서만 병변이 관찰되었다. 이 태아에서 두개의 심실이 모두 팽창되어 있었고 간은 확장되고 굳어 있었으며 수흉증(水胸症)과 복수(腹水)가 있었다. 조직병리학적으로, 넓은 면적에 걸쳐 심근 퇴화 또는 수종과 약간의 섬유증을 수반한 괴사가 있었고, 림프구 및 대식세포의 산재성 보통의 침윤(infiltration)이 있었다. 일반화된 간의 충혈(congestion) 및 간세포 손상이 나타났다. 또한 비장과 신장이 충혈되었다. 다른 태아들에서는 유의적인 조직학적 병변이 검출되지 않았다.
포르말린으로 고정시키고 통상적으로 처리하여 포매(包埋)한 조직의 절편 상에서 앞에서 기재한 바와 같이 토끼 다중 클론성 항혈청 및 PCV-2에 대항하도록 한 단일 클론성 항체를 사용하여 PCV-2에 대한 면역화학적 염색을 행하였다(Ellis 외, 1998년; Ellis 외, 1999년). 팽창형 심근장애를 가진 태아에서 손상된 심근 전체에 걸쳐 PCV-2에 대한 강한 염색이 있었다. 염색은 괴사 영역에서 가장 심하였고 주로 근세포가 내포된 것으로 보였다. 세포질 염색과 핵 염색이 모두 존재하였다. 여러 마리의 태아에서 간에 심한 염색이 있었다. 일부 절편에서는 주로 동양혈관 내피(sinusoidal endothelium) 및 쿠퍼 세포(Kupher cell)가 내포된 것으로 나타난 반면, 심근염을 가진 것을 포함한 다른 태아에서는 간세포의 핵 염색 및 세포질 염색도 있었다. 양성 염색된 세포들이 폐 전체에 퍼져 있었고 신장에서는 다병소성으로 퍼져 있었다. 앞에 기재한 바와 같이, 냉동시킨 조직을 사용하여 PCV-2에 대한 폴리머라제 사슬 반응을 실시하였다(Ellis 외, 1999년). PCV-2에 대한 예상된크기의 PCR 산물을 태아 조직으로부터 증폭시켰다. 심근염을 가진 태아로부터 PCV-2를 분리하고, 조직 균등물을 PCV 없는 PK-15 세포에 접종함으로써 한 배의 새끼 중 다른 태아로부터 조직을 분리하였다.
또한 돼지 파보바이러스(PPV), 돼지 생식 및 호흡기 질환 증후군 바이러스(PRRSV), 뇌심근염 바이러스(EMCV) 및 엔테로바이러스를 포함하는, 돼지에서의 태아 손상 및 유산과 관련된 다른 바이러스 병원균에 관하여 태아 조직을 검사하였다. 미라화되거나 사산된 태아로부터의 폐, 간 및 비장의 냉동 절편에 대해 형광 항체 시험(fluorescent antibody testing; FAT)에 의해 PPV 항원은 검출되지 않았다. 또한 유산된 태아로부터의 간, 폐 및 비장의 균등물도 PCV 없는 PK-15 새포, 1차 돼지 나팔관 세포 및 베로 세포(Vero cell)의 배양물 속에 접종하였다. 세포변성 바이러스는 3회 통과(passage) 후에도 검출되지 않았다. 조직은 PCR을 이용하여 PPV에 대해 음성이었다. PRRSV 항원은 면역조직화학적 염색에 의해 검출되지 않았다.
이와 같이 PCV-2와 직접 관련된 태아 병변 및 유산이 있었다. 이들 결과는 또한 바이러스의 수직 전파를 나타낸다.
선행 연구에서, PCV-1은 실험대상인 160마리 돼지 태아 중 2마리에서 분리되었는데, 이는 이 바이러스군이 수직 전파될 수 있음을 의미하지만, PCV-1 항원은 조직 내의 어느 병변과도 관련될 수 없었다(Allan 외, 1995년). 돼지에서 태아 병변 및 유산과 관련된 다른 병원체, 즉 PPV(Bolt 외, 1997년; Molitor 외, 1991년), PRRSV(Lager 외, 1996년), EMCV(Kim 외, 1989년) 및 엔테로바이러스(Molitor 외,1991년)를 포함하는 병원체가 제외된다는 것은 PCV-2가 심각한 태아 질병 및 이어지는 유산을 야기할 수 있음을 나타낸다.
그러나, PCV-1 면역원(여전히 서두에 제시한 일반적 정의에 따름)은 이유 후 전신소모성 증후군을 비롯하여 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염에 대항하여 면역원성 반응 또는 보호 반응을 유도할 수 있으며, 따라서 PCV-1 면역원도 본 발명의 실시(예를 들면, 방법, 조성물, 용도 등)에 사용될 수 있는데, 그 방식은 단독으로 또는 PCV-2 면역원과 함께(벡터는 PCV-1 면역원 및/또는 에피토프 및 PCV-2 면역원 및/또는 에피토프 모두에 관해 코딩하는 DNA를 함유하고 발현할 수 있음) 및/또는 단독으로 또는 면역원 및/또는 다른 돼지 병원체의 에피토프와 함께(벡터가 사용될 경우, 그 벡터는 PCV-1 면역원 및/또는 에피토프 그리고 다른 돼지 병원체의 면역원 및/또는 에피토프 모두에 대해 코딩하거나, 또는 PCV-1 면역원 및/또는 에피토프 그리고 PCV-2 면역원 및/또는 에피토프 그리고 다른 돼지 병원체의 면역원 및/또는 에피토프에 관해 코딩하는 DNA를 함유하고 발현할 수 있음) 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 실시에서 과도한 실험을 하지 않고도 대안적 또는 부가적으로 PCV-1 면역원 및/또는 에피토프 및/또는 그러한 면역원 및/또는 에피토프를 코딩하는 벡터를 사용할 수 있는데, 예를 들면 그렇게 하기 위해서는 본 실시예 앞 부분 및 본 실시예(후)의 결론 부분의 텍스트를 읽고 교시된 내용을 기초로 임의의 작은 변형과 함께 --PCV-1--을 "PCV-2"로 치환하기만 하면 된다.
PCV-2 감염과 관련된 소모성 증후군은 생후 5-12주의 돼지에게서 가장 흔히발생된다(Allan 외, 1998년; Ellis 외, 1998년). 새로 태어난 돼지를 실험적으로 감염시키면 PCV-2와 관련된 감염과 임상적 증후의 발전 사이에 상대적으로 긴 전구 증상 기간이 나타난다(Allan 외, 1999년; Ellis 외, 1999년). 여기서의 발견은 바이러스가 수직적으로 또는 분만 기간에 전파되는 것을 나타낸다. PCV-2의 자궁 내 수직 전파가 유산을 초래할 수 있을 뿐 아니라 치사량에 가깝게 자궁내 감염된 돼지는 계속해서 PMWS가 발전되는 동물들일 수 있다.
또한, 이들 결과가 나타내는 바는, 수정이나 교미 전, 또는 분만기 전 및/또는 임신 기간중 PCV-2 면역원을 포함하는 조성물(상기 조성물은 또한 돼지 파보바이러스와 같은 다른 돼지 병원체을 포함할 수 있음)을 암퇘지에게 접종하는 것이 PCV-2에 대항하는 면역원성 반응 또는 항체를 유도함으로써 PCV-2와 관련된 이유후 전신소모성 증후군 및 기타 병리학적 후유증뿐 아니라 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염을 예방할 수 있다는 것이다.
본 발명의 조성물, 방법 및 다른 양태는 예를 들면 양, 들소, 소, 멧돼지와 같은 돼지 이외의 동물들에게도 예를 들면 PCV-2가 그러한 동물에 감염된 경우 사용되거나 실시될 수 있음은 물론이다.
실시예/결과 2: PCV-2와 관련된 심근염, 유산 및 자궁 내 감염
신생 새끼 돼지에 PCV-2가 존재한다는 것은 수직 전파가 바이러스 전파의 중요한 수단일 수 있음을 암시한다. 이 전파 형태는 생식 부전(reproductive failure)에 관련될 뿐 아니라 추후의 생존중 전신성 질환의 발전에 관련될 수 있다. 이전에 검출되지 않았던 PCV-2(및 PCV-1)가, PCV-2 감염 확대에 의해, PMWS가적어도 수년간 풍토병이었던 돼지고기 생산 지역에서 수직적으로 전파되었는가를 판정하는 것은 흥미있는 일이다.
캐나다 사스카툰 소재 유니버시티 오브 사스카치완의 Western College of Veterinary Medicine(WCVM)에 있는 진단 실험실에서 총 30개의 매우 건강한 돼지떼로부터 4년간에 걸쳐 접수한 생식 부전을 포함하는 38개의 기탁물을 평가하였다. 샘플이 입수된 5개의 농장은 PMWS의 사례를 진단하였다. 38개 기탁물 중 27개(71%)는 유산으로 분류되었고; 이들 중 5개(13%)는 적어도 하나의 미라화 태아를 포함하였다. 나머지 10개의 사례 중에서, 5개는 생존 불능의 새끼 돼지를 비롯하여 사산된 새끼 돼지를 포함하였고(13%); 2개는 사산 및 하나 이상의 미라화 태아(5%); 2개는 모두 사산된 새끼 돼지(5%); 그리고 1개는 미라화 태아(2.5%)였다. 써코바이러스를 제외한 병원균에 관하여 통상적인 진단을 한 결과, 4 사례(11%)는 병인학적으로 돼지 파보바이러스인 것으로 판정되었고, 2 사례(5%)는 병인학적으로 세균성 기원인 것으로 판정되었다. 육안 검시를 행하고 조직을 채취하여 완충시킨 포르말린 중에 고정하였으며(고정화 시간: 24-72시간), 대부분의 사례에서 신선한 조직을 통상의 미생물학적 평가에 회부하였다. 이들 사례는 모두 PCV-2에 관하여 이전에 시험된 바 없었다.
PCV-1 및 PCV-2의 검출에 이용한 PCR 기법을 앞에 기재한 바와 같이 실행하였다(Tischer 외, 1974년). 4년의 기간으로부터 생식 부전을 포함하는 어느 기탁물에서도 PCR에 의해 PCV-1이 검출되지 않았다. 4년 기간 중 1999년 봄에 두번의 별도 시기에 동일한 다지점 돼지고기 생산 유닛으로부터 유래하는 두 개의 상이한기탁물에서 PCR에 의해 PCV-1이 검출되었다. 이들 기탁물 중 첫번째는 심근염, 심장 비대 및 만성 수동성 출혈의 육안 증거가 있는 한 배의 새끼 돼지를 포함하였다.
조직내 PCV-2의 면역조직화학적 동정을 앞에 기재한 바와 같이 행하였다(Tischer 외, 1974년). PCV-2에 대한 면역조직화학적 염색(IHC)은 기탁된 6마리의 새끼 돼지 모두의 심장에서 양성인 반면, 6마리 중 4마리는 PCV-2 PCR에 의해 양성이었다(하기 표 참조).
표: 심근염을 가진 돼지의 포르말린 고정 심장에서 PCR, IHC 및 세포 배양균에서 바이러스 분리에 의한 PCV-2의 검출
PCV-2 양성 조직 PCR IHC 바이러스 분리
고정된 것 5/6 6/6 N/A
냉동된 것 4/4 N/A 2/4
동일한 농장 유래의 제2 기탁물은 4마리의 한 배 새끼 돼지로 이루어졌는데 그중 2마리는 사산된 것이고 다른 2마리는 출생 후 곧 죽은 것이었다. 또한 4마리의 새끼 돼지는 모두 심한 산재성 심근염, 심장 비대증 및 만성 수동성 출혈의 육안 증거가 있었다. 신선한 냉동 심장 및 조합된(pooled) 폐/비장 조직만을 분석용으로 기탁하였다. 4마리의 새끼 돼지 중 2마리의 심장에서, 그리고 4마리 모두의 조합된 폐와 비장의 조직에서 PCV-2 PCR이 양성이었다. 영향을 받은 심장 및/또는 조합된 폐와 비장 조직으로부터의 PCV-2 분주는 PCR에 의해 PCV-2 양성인 4 사례 중 2 사례에서 양성이었다. 혈청시험 및/또는 PCR을 기초로, 돼지 생식 및 호흡기질환 증후군 바이러스 및 돼지 파보바이러스를 포함하여, 돼지의 생식 부전과 관련된 다른 병원체는 사육하는 가축 무리에서 순환하는 것으로 나타났다. 그러나 이들 병원체가 감염된 새끼 돼지에서의 심한 심장(또는 그 밖의) 병변에 관련된 것으로 나타낼 수는 없었으나, PMWS에는 기여할 수 있다.
4년 기간 중 초기 3년 기간중에 기탁된 생식 부전의 모든 대표적 사례에서 PCV-2는 PCR 또는 IHC에 의해 검출되지 않았다(4년 기간 중 마지막 해에 기탁된 생식 부전 사례에서는 검출되었음). PCR에 의한 PCV-2를 검출할 수 있는 능력을 제한하는 있을 수 있는 반대 인자로서 포르말린 고정에 기인한 DNA에 대한 손상을 배제하기 위해, PCR은 이유 직후의 PMWS를 가진 새끼 돼지로부터 채취한 조직에 실행하였고, 모든 4 개체로부터 폐, 간, 신장 및 기관지 림프를 포함하는 시험 대상인 모든 고정된 조직에서 PCV-2 DNA를 증폭시켰다. 또한, PCR PCV-2의 민감성은 각각의 조직을 포르말린 중에 고정시키는 시간과 무관하였다.
이들 결과는 PCV-2가 수직적으로 전파될 수 있고 자궁내 감염된 새끼 돼지로부터의 병변 범위에 다량 존재할 수 있다는 이전의 고찰(West 외, 1999년)을 확인하는 동시에 확장시킨다. PCV-2 바이러스의 수직 전파 및 그에 따른 심근염과 같은 태아의 손상은 PCV-2의 부가적인 질환 징후이다. 또한, PCV-2 감염의 풍토병적 지역으로부터 4년 기간 중 마지막 해 이전에 생식 부전을 나타내는 사례에서 PCV-2를 검출하지 못했다는 것은 바이러스 감염의 초기 전염의 원인인 1차 메커니즘이 아니었음을 가리킬 수도 있다. 수직형 전파뿐 아니라 성간(sexual) 전파가 돼지에서의 PCV-2의 확산에 기인할 수 있다.
실시예/결과 3: 돼지 써코바이러스 균주의 배양 및 분리
J. Ellis 외 Can. J. Vet. 1998, vol39, 44-51에 기재된 방법에 따라, 유산 사례로부터 캐나다 앨버타와 사스카툰에서 바이러스 1103 및 1021을 각각 분리하였다.
돼지 써코바이러스(PCV), 페스티바이러스, 돼지 아데노바이러스 및 돼지 파보바이러스로 오염되지 않은 것으로 공지된 PK-15 세포 배양균에 대해 바이러스 배양을 실시하였다(Allan G 외, Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995,44, 49-64).
PK/15 세포의 단일층은 트립신 처리(트립신-베르센 혼합물 사용)를 통해 융합 배양균으로부터 분리하고, 페스티바이러스에 의해 오염되지 않은 태아 소 혈청을 15% 함유하는 MEM-SA 배지(= MEM-G 배지) 중에 최종 농도가 ml당 약 400,000세포인 상태로 넣었다. 이어서 이 세포 현탁액의 10ml 분획을 앞에 기재한 접종물의 2ml 분획과 혼합하고, 최종 혼합물을 25㎠의 Falcon 플라스크 2개에 6ml씩 등분한다. 이어서 이들 배양균을 10% CO2함유하는 분위기 하에 18시간 동안 +37℃에서 배양한다.
배양 후, 상기 반융합성 단일층의 배지를 300mM D-글루코사민(Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, 영국 Poole 소재)으로 처리한 후(Tischr I. 외, Arch. Virol., 19879639-57), +37℃에서 추가로 48-72시간 동안 배양을 계속하였다. 이와 같은 마지막 배양에 이어서, 각 접종물이 담긴 두 Falcon 플라스크 중 하나를 3회의 냉동/해빙 사이클 처리하였다. 남아 있는 Falcon의 PK-15 세포는 트립신-베르센 용액으로 처리하고, 20ml의 MEM-G 배지에 재현탁한 후, 400,000세포/ml의 농도에서 75㎠의 Falcon 속으로 접종하였다. 이어서 상기 새로 접종된 플라스크를 상기 냉동/해빙 사이클 후 얻어진 대응하는 용해물 5ml를 첨가함으로써 "중복감염(superinfection)"시켰다.
실시예/결과 4: 면역형광법에 의한 PCV의 검출 기법
어른 돼지 혈청의 풀(pool)을 1/100로 희석하여 간접 면역형광 기법(IIF)에 의해 아세톤으로 고정시킨 모든 세포 배양 제제의 초기 선별을 행하였다. 이 혈청의 풀은 25마리의 북아일랜드산 어른 암퇘지에서 채취한 혈청을 포함하고, PCV, 돼지 파보바이러스, 돼지 아데노바이러스 및 PRRS 바이러스를 포함하는 매우 다양한 돼지 바이러스에 대항하는 항체를 함유하는 것으로 알려져 있다. 상기 IIF 기법은 혈청(PBS에 희석한 것)을 +37℃에서 1시간 동안 세포 배양균과 접촉시킨 후, PBS 중에서 2회 세척하여 행하였다. 다음에 세포 배양균을 1시간 동안 플루오레세인 이소티오시아네이트와 접합시킨 토끼 항-돼지 면역글로불린 항체를 PBS 중 1/80으로 희석하여 염색하고, 이어서 PBS로 세척하고 자외선 하에 현미경 관찰에 앞서 글리세롤 완충액 중에 장입하였다.
실시예/결과 5: 시험관내 배양에 의한 PCV 항원의 제조
오염되지 않은 PK-15 세포의 배양균 및 바이러스 증식을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 실행하였다. 감염된 세포들을 37℃에서 4일간 배양한 다음 트립신 처리한 후 수확하고 목록화한다. 그 다음 통과는 ml당 400,000개의 감염 세포로 접종된다.
예를 들면 균주 1103 및 1121과 같은 본 명세서에 제시된 여러 가지 PCV-2 균주가 이와 같이 배양된다.
실시예/결과 6: PCV-2의 적정
96-웰 마이크로 플레이트에서 적정을 행한다. 먼저 PK/15 세포의 현탁액(150,000세포/ml)을 주입한다(하나의 웰당 100㎕). 다음에 바이러스 배양균을 희석하고 그것의 100㎕를 웰에 주입한다. CO2를 사용하여 37℃에서 배양한다. 24시간 후, 37℃에서 30분간 글루코사민으로 처리한다(그 조건에 관해서는 실시예 3을 참조할 것). 이어서 배지를 제거하고 새로운 배지를 주입한다. 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 항 PCV-2 단일 클론 항체 및 FITC 표지된 마우스 접합체를 사용하여 병소를 노출시킨다.
이 방법은 생체 및 불활성화된 약독화 PCV-2를 제조하기 위한 적정에 사용될 수 있다.
실시예/결과 7: 바이러스 항원의 불활성화
바이러스 배양의 종료 시점에, 감염된 세포를 수확하고 초음파(Branson Sonifier)를 사용하거나 회전자-고정자형 콜로이드 밀(Ultra Turrax, IKA)을 사용하여 용해시킨다. 이어서 현탁액을 3700g의 원심력으로 30분간 원심분리한다. 상기 바이러스 현탁액을 0.1% 에틸렌이민을 사용하여 +37℃에서 18시간 동안, 또는0.5% 베타-프로피오락톤을 사용하여 +28℃에서 24시간 동안 불활성화한다. 불활성화 전에 바이러스 역가가 부적합하면, 바이러스 현탁액을 300kDa 컷오프의 멤브레인(Millipore PTMK300)을 사용하여 한외여과에 의하여 농축한다. 불활성화 바이러스 현탁액을 +5℃에 보관한다.
실시예/결과 8: 미네랄 오일을 기재로 한 에멀젼 형태의 백신 제조
하기 처방에 따라 백신을 제조한다:
- 불활성화 돼지 써코바이러스의 현탁액:250ml
- Montanide(R)ISA 70(SEPPIC):750ml
수상(水相) 및 유상(油相)을 각각 여과하여 무균처리한다. 상기 성분들을 Silverson 터빈 유화기를 이용하여 혼합 및 균질화하여 에멀젼을 제조한다.
백신 1회 투여량은 약 107.5TCID50을 함유한다. 백신 1회 투여량의 체적은 피내 경로에 의한 투여의 경우에 0.5ml이고, 근육내 경로에 의한 투여의 경우에 2ml이다.
이 백신은 Parvovax(R)백신과 함께 전신소모성 증후군에 대한 백신 접종 프로그램에서 사용된다.
실시예/결과 9: 대사가능형 유계(油系) 에멀젼 형태의 백신 제조
하기 처방에 따라 백신을 제조한다:
- 불활성화 돼지 써코바이러스의 현탁액: 200ml
- Dehymuls HRE 7(Henkel): 60ml
- Radia 7204(Oleofina):740ml
수상 및 유상을 각각 여과하여 무균처리한다. 상기 성분들을 Silverson 터빈 유화기를 이용하여 혼합 및 균질화하여 에멀젼을 제조한다.
백신 1회 투여량은 약 107.5TCID50을 함유한다. 백신 1회 투여량의 체적은 근육내 경로에 의한 투여의 경우에 2ml이다.
이 백신은 Parvovax(R)백신과 함께 전신소모성 증후군에 대한 백신 접종 프로그램에서 사용된다.
실시예/결과 10: DNA(플라스미드) 벡터를 가진 새끼 돼지의 백신 접종
제왕절개하여 얻은(caesarian-derived) 0일차 3 또는 4마리의 새끼 돼지군을 격리기에 넣는다. 새끼 돼지들에 대해 (A) ORF 13을 포함하는 플라스미드와 (B) 이 플라스미드와 ORF 4를 포함하는 또 하나의 플라스미드의 혼합물 중 어느 하나를 2일차에 백신 접종하고, 대조군에 대해 생리 식염수를 투여한다. 각각의 플라스미드를 멸균 생리 식염수(NaCl 0.9%)로 희석하여 최종 농도를 250㎍/㎕가 되도록 한다. 2ml를 근육내 경로로 2개 지점에 1ml씩(목의 양측에 1개소씩) 주사한다. 백신 또는 플라시보의 2차 주사를 14일차에 투여한다. DNA를 사용한 백신 접종에 대해 새끼 돼지가 좋은 내성을 보이며 백신 접종에 대한 역반응의 증거는 나타나지 않는다. 상기 새끼 돼지들을 21일차에 PCV-2 바이러스 현탁액의 구비(oronasal) 투여를 통해 공격감염(challenge)시킨다. 공격감염 후 새끼 돼지들의 체중을 1주일 간격으로 측정한다. 직장의 온도를 17일, 21일, 22일, 24일, 27일, 29일, 31일, 34일, 37일, 41일, 44일차에 기록한다. 44일차에 PCV-2 배출에 관하여 새끼 돼지 각각으로부터 분변 스웹(fecal swab)을 수집한다. 정량적 PCR에 의해 바이러스를 검출하고 정량한다. 45일차에 부검을 실시하고 바이러스 분리를 위해 조직 샘플을 수집한다.
ㆍ 임상적 증세:
시험군 사이에 평균 체중 증가 또는 평균 체온에 대한 유의적 차이가 없다.
ㆍ 부검 병변:
종결 시 돼지에서 유일하게 육안으로 발견된 것은 기관지 림프절장애이다. 병변을 하기와 같은 기준으로 평점한다.
0 = 림프절의 확대가 보이지 않음
1 = 약간의 림프절 확대가 있으나 기관지 림프절에 국한됨
2 = 보통의 림프절 확대가 있으나 기관지 림프절에 국한됨
3 = 심한 림프절 확대가 있고, 기관지 하악골하의 전견갑골 및 서혜부 림프절까지 퍼져 있음
std는 표준편차의 약어이다.
군 림프절 장애 평점 N
평균 std
(A) 1.2 1.3 4
(B) 2.0 1.7 3
대조군 3.0 0.0 3
N = 각 군의 새끼 돼지의 수
(A)를 사용하여 면역화시킨 새끼 돼지 4마리 중 3마리에서, 그리고 (B) 혼합물을 사용하여 면역화시킨 새끼 돼지 3마리 중 1마리에서 림프절 병변의 감소가 관찰된다. 이 차이는 표준편차의 값이 크기 때문에 유의수준이 아니다(p＞0.05).
ㆍ 림프절 조직에서의 바이러스 부하(load)
기관지 림프절 및 장간막 림프절로부터 제조된 조직 균등물 상에서 정량적 바이러스 재분리를 행한다.
이하에 제시된 데이터는 상용대수(log10)로 변환한 후의 조직 균등물 내의 바이러스 역가이다.
군 PCV-2 역가 N
기관지 림프절 장간막 림프절
평균 std 평균 std
(A) 0.9 0.8 0.9 0.8 4
(B) 0.7 0.6 0.2 0.2 3
대조군 2.0 1.1 1.8 1.1 4
기관지 림프절은 대부분의 전염성 바이러스를 함유하는 것으로 생각된다. (A)와 (B) 혼합물 중 어느 하나로 면역화시킨 새끼 돼지로부터 기관지 및 장간막 림프절에서 바이러스 부하의 감소가 관찰된다. 이 감소는 플라스미드 혼합물에 있어서 유의수준이다(p ≤0.05).
ㆍ 바이러스 배설:
공격감염 후 PCV-2 ORF 13의 증폭을 기초로 하는 PCR에 의해 PCV-2 배설에 대해 분변 스웹을 평가한다. 각각의 분석은 샘플 2ml에 대해 3회 실시한다. 백신 접종하지 않은 대조군은 공격감염 전 PCV-2에 대해 음성이고, 공격감염 후에는 양성이며, 이는 PCR 분석의 유효성을 입증한다.
수치는 log10(샘플 2㎕ 중 PCV-2 DNA의 분자수)로 표현된다.
군 log10(PCV-2 DNA의 분자수) N
평균 std
(A) 3.3 0.3 4
(B) 2.9 0.7 3
대조군 3.6 0.6 4
각 군 사이의 차는 유의수준이 아니다(p＞0.05).
실시예/결과 11: 카나리아폭스(canarypox) 생 벡터를 가진 새끼 돼지의 백신 접종 및 그 결과
제왕절개하여 얻은 0일차 3 또는 4마리의 새끼 돼지군을 격리기에 넣는다. 2일차에 새끼 돼지들을 1ml의 PBS 중에 108pfu의 (C) ORF 13을 포함하는 카나리아폭스 또는 (D) ORF 13 및 ORF 4를 포함하는 카나리아폭스, 또는 선조 카나리아폭스를 근육내 경로로 목의 측면에 접종한다. 백신 또는 플라시보의 2차 주사를 14일차에 투여한다. 카나리아폭스의 백신 접종에 대해 새끼 돼지가 좋은 내성을 보이며 백신 접종에 대한 역반응의 증거는 나타나지 않는다. 상기 새끼 돼지들을 21일차에 PCV-2 바이러스 현탁액을 코구멍마다 1ml씩 구비 투여함으로써 공격감염시킨다. 45일차에 부검을 실시하고 바이러스 분리를 위해 조직 샘플을 수집한다.
부검 결과:
ㆍ PMWS는 일반적으로 림프절 장애를 특징으로 하고 드물게 간염이나 신염을 나타낸다. 따라서 림프절에 대한 육안 검사를 하기 방식으로 새끼 돼지 각각에 대해 평점한다: 0 = 림프절의 확대가 보이지 않음; 1 = 약간의 림프절 확대가 있으나기관지 림프절에 국한됨; 2 = 보통의 림프절 확대가 있으나 기관지 림프절에 국한됨; 3 = 심한 림프절 확대가 있고, 기관지 하악골하의 전견갑골 및 서혜부 림프절까지 퍼져 있음.
군 평점
(C)평균표준편차 0.50.00.01.00.380.48
(D)평균표준편차 0.00.50.51.00.50.41
대조군평균표준편차 2.02.52.52.52.380.25
PCV-2에 대한 기관지 림프절 장애가 육안검사 결과 두드러지게 나타났다. 대조군에 비하여 (C) 및 (D)를 사용한 면역처리 후에 림프절 병변의 유의수준의 감소가 관찰된다(p ≤0.05).
이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하였는데, 본 발명의 사상이나 범위를 벗어나지 않고 상기 명세서에 제시된 특정한 상세사항에 대한 많은 명백한 변경이 이루어질 수 있으므로 첨부하는 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명은 그러한 특정 사항에 한정되어서는 안됨을 이해해야 할 것이다.
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[첨부 1]
발명의 명칭
DNA 백신-PCV {DNA VACCINE-PCV}
관련 출원:
본 발명에 대하여 1998년 5월 21일자 미국특허 출원번호 09/082,558 및 출원번호 09/082,558의 부분 계속 출원인 1998년 9월 25일자 출원번호 09/161,092를 참고하였으며, 상기 본 명세서에 인용된 각 문헌은 참고자료로 결합되어 있다(1998년 5월 21일 출원된 미국특허 출원번호 09/082,558의 CIP 출원으로서 1998년 9월 25일 출원된 출원번호 09/161,092는 출원일이 각각 1997년 10월 3일, 1998년 1월 22일 및 1998년 3월 20일인 프랑스 출원번호 97/12382, 98/00873 및 98/03707를 우선권으로 주장하였으며 본 명세서에 참고자료로 결합되어 있다).
본 발명은 돼지 전신소모성 증후군(Porcine Multisystemic Wasting Syndrome: PMWS), 즉, 이유 후 전신소모성 증후군(Pos-Weaning Multisystemic Wasting Syndrom: PMWS)을 초래하는 돼지 써코바이러스(PCV: Porcing CircoVirus) 면역원을 코딩하고 발현시키는 플라스미드 구조체, 및 백신접종 방법과 DNA 백신, 그리고 이들 백신의 제조 및 제형화 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌 및 인용된 문헌 내에 인용된 모든 문헌은 본 명세서에서 참고자료로서 인용된다.
PCV는 원래 돼지 신장 세포주 PK/15에서 비세포병원성 오염물질로 검출되었다. 이 바이러스는 닭 빈혈 바이러스(CAV: Chicken Anaemia Virus)와 PBFDV 바이러스(Pscittacine Beak and Feather Disease Virus)와 함께Circoviridae과로 분류된다. 이것들은 1.76 내지 2.31 킬로베이스(kb)의 원형 단일-가닥(single-stranded) DNA 형태의 게놈을 포함하는 공통 특징을 가진 소형(15 내지 24nm)의 비봉합 바이러스(nonenveloped virus)이다. 본래 이 게놈은 약 30 kDa의 폴리펩타이드를 코딩한다고 생각되었다(Todd 외, Arch. Virol. 1991, 117; 129-135). 그러나 최근의 연구에서는 보다 복잡한 전사가 알려졌다(Meehan B. M. 외, J.Gen.Virol., 1997, 78; 221-227). 또한 공지된 3 종류의 써코바이러스간에 뉴클레오타이드 서열 또는 일반 항원성 결정인자에서의 현저한 상동성이 밝혀지지 않았다.
PK/15 세포에서 유래된 PCV는 병원성이 아닌 것으로 여겨지고 있으며, 이 서열은 B.M. Meehan 등의 J. Gen. Virol. 1997(78) 221-227에 공지되어 있다. 최근에 와서야 일부 학자들이 PCV의 균주가 병원성일 수 있으며 PMWS 증후군과 관련되어 있을 수 있다고 생각하게 되었다(G.P.S. Nayar 외, Can.Vet.J., 1997, 38; 385-387 및 Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501). Nayar 등은 PCR 기술을 이용하여 PMWS 증후군을 가진 돼지에서 PCV DNA를 검출하였다.
PMWS 증후군을 가진 돼지에서 발견된 써코바이러스에 대항하기 위한 단일클론 항체 및 다중클론 항체는 이들 써코바이러스와 PK-15 세포의 배양물로부터 분리한 돼지 써코바이러스 사이의 차이를 입증할 수 있었다(Allan G.M. 외, Vet Microbiol., 1999, 66: 115-123).
캐나다, 미국 및 프랑스에서 검출된 PMWS 증후군은 점진적인 체중의 감소 및 빈호흡, 호흡곤란 및 황달과 같은 임상적 증상을 특징으로 한다. 병리학적 관점에서 보면, 림프세포 또는 육아종의 침윤, 림프절증 및 드물게 간염 및 림프구 또는 육아종 신염과 같은 증상을 동반한다(Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501; La Semaine Veterinaire No. 26, supplement to La Semaine Veterinaire 1996(834); La Semaine veterinaire 1997(857): 54; G.P.S. Nayar 외, Can. Vet. J. 1997, 38; 385-387).
북아메리카와 유럽에서 입수한 이들 써코바이러스는 그것들의 뉴크레오타이드 서열간에 96% 이상의 동질성을 가지는 것으로 밀접하게 관련되어 있지만, PK-15 세포로부터 분리한 돼지 써코바이러스와 이들 써코바이러스의 뉴클레이타이드 서열을 비교하면 그 동일성이 80% 미만이다. 따라서, 두 가지 바이러스의 서브그룹, 즉, PMWS 증후군에 관련된 써코바이러스에 대한 PCV-2 및 PK-15 세포로부터 분리한 써코바이러스에 대한 PCV-1이 제안되었다(Meehan B.M. 외, J. Gen. Virol., 1998, 79: 2171-2179; WO-A-9918214).
본 출원인은 PCV-2 면역원을 코딩하고 발현시키는 플라스미드 구조체가 PMWS 증후군에 대하여 돼지에게 면역성을 부여하는 데 이용될 수 있음을 발견하였다.
PCV-2 면역원은 또한 PCV-1 면역원과 조합하여 PCV-2에 대한 이들 동물들에게 면역성을 부여하는 데 이용될 수 있다.
바람직한 모드에는 미흡하지만, 상기 PCV-1 면역원을 단독으로 사용할 수 있다.
본 발명은 PCV-1 또는 PCV-2 면역원을 코딩하고 발현시키는 플라스미드 구조체, 특히 PCV-1에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frames: ORFs) 1 및/또는2, 및 PCV-2에 대한 ORFs 1 및/또는 2이다.
본 발명은 동등한 뉴클레오타이드 서열, 즉, 고려 대상인 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 기능성이나 균주 특이성을 변화시키지 않는 서열을 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 자동적으로 포괄함은 물론이다. 코드의 변성(degeneracy)에 의한 서열의 상위도 물론 포함된다.
실시예에서 사용되는 PCV-2 서열은 Meehanet al. supra(ORF1 nucleotides 398-1342; ORF2 nucleotides 1381-314; 및 1998년 9월 25일부 U.S. 09/161,092에서의 ORF4 및 ORF13, WO-A-9918214에서의 COL4 및 COL13에 각각 대응함)로부터 유래된다. 다른 PCV-2 균주 및 그들의 서열은 WO-A-9918214에서 공개된 것으로 Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 및 Imp1011-48121라 칭하는 것; A.L. Hamel at al., J. Virol. June 1998, vol 72, 6: 5262-5267(GenBank AF027217) 및 I. Morozov et al., J. Clinical Microb. Sept. 1998, vol. 36, 9: 2535-2541; GenBank AF086834, AF086835에서도 등가의 ORF 서열에 접할 수 있다.
본 발명은 또한 매우 가혹한 조건 하에서 고려 대상인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있다는 점에서 등가의 서열을 포함한다. 등가의 서열 중에서, 완전한 서열의 면역원성을 보존하는 유전자 단편을 언급할 수도 있다.
그 밖에 1998년 9월 25일 출원한 US 09/161,092에 제시된 ORF 1-3, 및 5-12(WO-A-9918214에서의 COL 1-3, 및 COL 5-12), 특히 ORF 7 및 10을 이하에 제시하는 조건 하에서, 조합하여 사용하거나 그것들끼리, 또는 본 명세서에서 정의하는 ORF 1 및 2와 함께 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 플라스미드라는 용어는 발현시키고자 하는 PCV 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 형태의 모든 DNA 전사 단위 및 그것을 생체내 발현시키는 데 필요한 요소를 의미한다. 원형 플라스미드 형태, 고차코일 또는 기타의 형태가 바람직하다. 또한 직선형이 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은, 보다 구체적으로, pJP109(PCV-2의 ORF2 유전자 함유, 도 1 참조), pJP111(PCV-2의 ORF1 유전자 함유, 도 2 참조), pJP120(PCV-1의 ORF2 유전자 함유, 도 3 참조), 및 pJP121(PCV-1의 ORF1 유전자 함유, 도 4 참조)로 호칭되는 플라스미드이다.
각 플라스미드는 그것의 제어 하에 숙주 세포 내에서 삽입 유전자를 확실히 발현시킬 수 있는 프로모터(promoter)를 포함한다. 그것은 일반적으로 강력한 진핵세포 프로모터이고, 특히 인간 또는 쥐과를 기원으로 하거나, 선택적으로 래트나 모르모트와 같은 다른 동물 기원의 세포 확대 바이러스 조기 프로모터 CMV-IE이다. CMV-IE 이외의 바이러스 프로모터로서, SV40 바이러스 조기 또는 후기 프로모터, 또는 Rous Sarcoma 바이러스 LTR 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 그것은 유전자가 유래되는 바이러스로부터 얻어지는 프로모터, 예를 들면, 당해 유전자에 특이적인 프로모터일 수 있다. 세포 프로모터로서, 예를 들면 데스민 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 세포 골격 유전자의 프로모터를 언급할 수 있다. 동일 플라스미드 내에 여러 개의 유전자가 존재할 경우, 그 유전자들은 동일한 전사 단위 또는 두 개의 상이한 단위 내에 제공될 수 있다.
플라스미드는 또한, 예를 들면, 인트론 유형, 바람직하게는 토끼 β-글로빈유전자의 인트론 II(van Ooyen 외, Science, 1979, 206: 337-344)의 안정화 서열, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 신호 서열(tPA; Montgomery 외, Cell. Mol. Biol. 1997, 43: 285-292), 및 특히 소 성장 호르몬(bGH) 유전자(US-S-5,122,458) 또는 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리아데닐화 신호(polyA)와 같은 다른 전사 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 PCV-1 또는 PCV-2 면역원 중 하나, 바람직하게는 앞에서 언급한 ORF 중의 하나를 코딩하고 발현시키는 본 발명에 따른 적어도 하나의 플라스미드를 포함하고, 추가로 수의학적으로 수용가능한 비히클 또는 희석제, 선택적으로 추가의 수의학적으로 수용가능한 면역보강제(adjuvant)를 포함하는 면역원 제제 및 DNA 백신이다.
본 발명은, 보다 구체적으로, PCV-1 또는 PCV-2 면역원 중 하나를 코딩하고 발현시키는 적어도 하나의 플라스미드를 함유하는 면역원 제제 및 백신, 특히 4급 암모늄염, 예를 들면, 바람직하게 DMRIE[N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판암모늄; WO-A-9634109]이고, 바람직하게는 예를 들면 DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민)과 같은 중성 지질과 결합하여 DMRIE-DOPE를 형성하는 4급 암모늄염을 함유하는 양이온성 지질인 면역보강제를 포함하는 조성물이다. 바람직하게, 이 면역보강제와의 플라스미드 혼합물은 사용 직전, 바람직하게는 동물에 투여하기 전에 제조하는 것이 바람직하며, 제조된 혼합물은, 예를 들면 10분 내지 60분 범위의 시간, 특히 30분 정도의 시간에 복합체를 형성하도록 한다.
DOPE가 존재할 경우, DMRIE:DOPE 몰비는 바람직하게는 95:5 내지 5:95의 범위, 더욱 구체적으로는 1:1이다.
중량비로 플라스미드:DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 면역보강제는 특히 50:1 내지 1:10의 범위, 보다 구체적으로는 10:1 내지 1:5의 범위, 바람직하게는 1:1 내지 1:2의 범위일 수 있다.
본 발명의 다른 유리한 형태에 따르면, 면역보강제로서 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 무수 말레산의 공중합체, 및 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 아쥬번트 화합물을 사용할 수 있다. 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐에테르와 가교결합을 이룬 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체가 바람직하다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)(Pharmeuropa vol.8, No.2, June 1996)라는 호칭으로 알려져 있다. 또한 당업자는 적어도 3개의 하이드록시기, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록시기―여기서, 적어도 3개의 하이드록시기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 가진 불포화 지방족 라디칼로 치환되어 있음―를 가진 폴리하이드록시화 화합물과 가교결합을 이룬 아크릴 폴리머가 기재되어 있는 US-A-2,909,462(참고자료로 본 명세서에 인용됨)을 참고할 수 있다. 바람직한 라디칼은, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화된 기와 같이 2개 내지 4개의 탄소 원자를 함유한 것이다. 불포화 라디칼은 그 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. Carbopol(R)(미국 오하이오주 소재 GF Goodrich사)이란 상품명으로 판매되는 제품이 특히 적합하다. 그것들은 알릴 사카로오스 또는 알릴펜타에리스리톨과 가교결합을 이룬다. 그 중에 Carbopol(R)974P, 934P 및 971P를 언급할 수 있다.
무수 말레산의 공중합체 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 무수 말레산과 에틸렌의 공중합체로서 선형이거나 예를 들면 디비닐에테르와 가교결합을 이룬 EMAs(R)(Monsanto사)가 바람직하다. 참고자료로 J. Fields 외, Nature, 186: 778-780, 4 June 1960(본 명세서에 참고자료로 인용됨)을 들 수 있다. 그것들의 구조에 따른 관점에서, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 EMAs(R)은 하기 식으로 표면되는 기본 단위로 구성되는 것이 바람직하다:
상기 식에서,
R1및 R2는 동일하거나 상이하며, H 또는 CH3를 의미하고,
x = 0 또는 1, 바람직하게는 x = 1,
y = 1 또는 2이고, 여기서 x + y = 2임.
EMAs(R)에 있어서, x = 0 및 y = 2이다. 카보머에 있어서는 x = y = 1이다.
이들 폴리머를 물에 용해시키면 산성 용액이 되며, 이 산성 용액은 바람직하게는 생리 pH로 중화하여 실제로 백신이 혼합되는 아쥬번트 용액을 제공하게 된다. 그 경우에 폴리머의 카복시기들은 부분적으로 COO-형태이다.
이 형태의 면역보강제에 관하여, 증류수 중에서, 바람직하게는 염화나트륨 존재 하에 면역보강제의 용액, 특히 카보머 용액을 제조하는 것이 바람직하고, 얻어지는 용액은 산성 pH를 가진다. 이 보관 용액을 요구량(원하는 최종 농도를 얻기 위해), 또는 실질적인 부분의 NaCl 함유수, 바람직하게는 생리 식염수(NaCl 9g/l)에 첨가하여 희석하되, 일부분 또는 그 이상을 바람직하게는 NaOH로 동시에 또는 후속하여 중화(pH 7.3 내지 7.4)하는 방식으로 희석한다. 이 용액은 생리 pH에서 플라스미드, 특히 동결건조된 상태, 액체 상태 또는 결빙 상태로 저장되는 플라스미드와 혼합되도록 그 자체로 사용된다.
최종 백신 조성물의 폴리머 농도는 0.01 내지 2% w/v, 특히 0.06 내지 1% w/v, 바람직하게는 0.1 내지 0.6% w/v일 것이다.
특정 실시예에서, 면역원성 또는 백신 제제는 PCV-2 ORF1 및 ORF2를 코딩하고 발현시키는 플라스미드 또는 플라스미드의 혼합물을 포함한다.
본 발명은 또한 돼지 써코바이러스에 대한 백신 접종을 다른 돼지 병원체, 특히 PMWS 증후군에 관련되는 병원균에 대항하는 백신 접종에 결합하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 본 발명에 따른 적어도 하나의 플라스미드 및 돼지 면역원을 코딩하고 발현시키는 적어도 다른 하나의 플라스미드를 함유하는 플리스미드의 혼합물로서, 예를 들면, 아우제스키병 바이러스의 당단백질 gB 및 gD[의사광견병(pseudorabies) 바이러스 또는 PRV], 돼지 인플루엔자 바이러스 H1N1의 혈구응집소 및 핵단백질, 돼지 인플루엔자 바이러스 H3N2의 혈구응집소 및 핵단백질, Leystad 및 USA 균주의 PRRS 바이러스의 ORF5 및 ORF3 유전자, 돼지 콜레라 바이러스(HCV)의 E1 및 E2 단백질,Actinobacillus pleuropneumoniae유래의 결실된 apxI, apxII 및 apxIII 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 혼합물이다(상기 플라스미드에 관하여 예를 들면 WO-A-9803658 참조).
이들 플라스미드의 혼합물은, 추가로 전술한 수의학적으로 수용가능한 면역보강제와 함께 수의학적으로 수용가능한 비히클 또는 희석제에 담겨짐으로써, 면역원성 제제 또는 다가 염색체 DNA 백신을 형성한다. 이들 제제 또는 다가 염색체 백신은 특히 앞서 설명한 바와 같이 양이온성 지질, 특히 DMRIE와 함께 조제되는 것이 유리하며, 중성 지질인 DOPE와 결합하여 DMRIE-DOPE를 형성하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같은 면역보강제를 포함하거나 포함하지 않고 조제된 본 발명에 따른 제제나, 1가 또는 다가 DNA 백신은 또한 바람직하게는 돼지 유래의 사이토카인, 특히 돼지 GM-CSF로 보충하는 것이 유리하다. 이러한 돼지 GM-CSF의 첨가(과립성 대식세포 - 콜로니 자극 인자; Clark S.C. 외, Science 1987, 230: 1229; Grant S.M. 외, Drugs, 1992, 53: 516)는 특히 상기 제제 또는 백신 내부에 돼지 GM-CSF 단백질 또는 돼지 GM-CSF 유전자를 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 결합함으로써 이루어질 수 있다(Inumaru S. 및 Takamatsu H., Immunol. Cell. Biol., 1995, 73: 474-476). 상기 돼지 GM-CSF 유전자를 PCV 면역원 또는 다른 돼지 면역원을 코딩하는 플라스미드와는 다른 플라스미드 내에 삽입하는 것이 바람직하다.
특히, 돼지 GM-CSF를 코딩하고 발현시키는 플라스미드는 pJP058 플라스미드(도 5)일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 제제 및 1가 또는 다가 DNA 백신은 상이하거나 동일한 적어도 하나의 돼지 병원체에 대항하기 위한 적어도 1종의 종래 백신(약독화된 생 백신, 불활성화된 백신 또는 서브유닛 백신) 또는 재조합 백신과 결합시킬 수 있다. 본 발명은, 특히, 면역보강제를 함유하는 종래의 백신(약독화 생 백신, 불활성화된 백신 또는 서브유닛 백신)과의 조합을 제공한다. 불활성화 또는 서브유닛 백신에 관하여, 특히 알루미나 겔만을 함유하거나 면역보강제로서 사포닌과 혼합한 것, 또는 유-수 에멀젼(oil-in-water emulsion) 형태로 조제된 것 등을 언급할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 써코바이러스에 대한 돼지의 면역 반응(immune response)을 유발할 수 있도록 하는 면역화 방법이다. 본 발명의 요지는 특히 돼지에서 효과적인 백신 접종 방법이다. 이들 면역 방법 및 백신 접종 방법은 전술한 바와 같은 제제 중의 1종, 또는 1가 또는 다가 DNA 백신 중의 1종을 투여하는 단계를 포함한다. 이들 면역화 방법 및 백신 접종 방법은 이들 제제 또는 DNA 백신의 1회 또는 그 이상의 연속적인 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 이들 제제 및 DNA 백신은 본 발명의 면역화 방법 또는 백신 접종 방법에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 백신 접종을 위한 종래에 제안되어 있는 다양한 투여 경로, 특히 근육내 및 피내 경로로, 그리고 공지되어 있는 투여 기술, 특히 바늘을 구비한 주사기를 사용한 주사, 액체 제트(Furth 외, Analytical Bioch., 1992, 205: 365-368) 또는 DNA로 코팅된 금 입자의 투사(Tang 외, Nature, 1992, 356: 152-154)에의해 투여될 수 있다.
이 방법은 어른 돼지에 투여할 수 있게 할 뿐 아니라, 어린 돼지 및 임신중인 암퇘지에도 투여 가능하며, 후자의 경우에, 특히 신생 돼지에 대한 수동면역(passive immunity)의 부여를 가능하게 한다(모계 항체).
본 발명에 따른 백신에 사용되는 DNA의 양은 약 10㎍ 내지 약 2000㎍, 바람직하게는 약 50㎍ 내지 약 1000㎍이다. 당업자는 각각의 면역화 또는 백신 접종 프로토콜에 사용되는 DNA의 유효한과적인 투여량을 정밀하게 정의할 수 있는 능력을 가질 것이다.
그 1회분 투여 용량을 0.5㎖ 내지 5㎖, 바람직하게는 2㎖ 내지 3㎖로 할 수 있다.
면역화 또는 백신 접종의 바람직한 방법은 본 발명에 따른 DNA 백신을 근육내 경로로 투여하는 것이다.
이하에서, 도면을 참고하여, 비제한적으로 예시하는 실시예와 함께 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 플라스미드 pJP109.
도 2는 플라스미드 pJP111.
도 3은 플라스미드 pJP120.
도 4는 플라스미드 pJP121.
도 5는 플라스미드 pJP058.
서열 목록 SEQ ID
SEQ ID No.1: 올리고뉴클레오타이드 JP779
SEQ ID No.2: 올리고뉴클레오타이드 JP780
SEQ ID No.3: 올리고뉴클레오타이드 JP781
SEQ ID No.4: 올리고뉴클레오타이드 JP782
SEQ ID No.5: 올리고뉴클레오타이드 JP783
SEQ ID No.6: 올리고뉴클레오타이드 JP784
SEQ ID No.7: 올리고뉴클레오타이드 JP785
SEQ ID No.8: 올리고뉴클레오타이드 JP786
실시예
실시예 1: 플라스미드 pJP109의 제작
EcoRI 단편 형태로 PCV-2 바이러스의 게놈을 함유하는 플라스미드 pGEM7Z-Imp1010 Stoon-EcoRI No.14(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1998, 79: 2171-2179)를, 아가로스 겔 전기영동 후에, 1768 염기 쌍(base pair: bp)의 EcoRI-EcoRI 단편을 분리하기 위해 EcoRI를 사용하여 분해시켰다(digested). 이 단편은 자가 결찰(self-ligate)되었다.
730 bp PCR 단편을 제조하기 위해, PCV-2 바이러스 균주 1010-Stoon의 ORF2 유전자(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1998, 79: 2171-2179; GenBank 서열 수탁번호 AF055392)를 자가 결찰된 EcoRI-EcoRI 단편으로 이루어진 템플레이트를 사용하고 하기 올리고뉴클레오타이드와 함께 폴리메라제 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 증폭시켰다:
JP779(SEQ ID No.1) (35 mer):
5'CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3'
및 JP780(SEQ ID No.2) (36 mer):
5'TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3'
이 단편을, 아가로스 겔 전기영동 후에, 715 bp SalI-BglII 제한 단편을 분리하기 위해 SalI 및 BglII를 사용하여 분해시켰다. 이어서 이 단편을 사전에 SalI 및 BglII로 분해시킨 플라스미드 pVR1012(Hartikka J. 외, Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217)와 결찰함으로써 플라스미드 pJP109(5567 bp)(도 1)를 제조하였다.
실시예 2: 플라스미드 pJP111의 제작
PCV-2 바이러스의 ORF1 유전자를 함유하는 970 bp PCR 단편을 제조하기 위해, 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon(실시예 1 참조)(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1998, 79: 2171-2179) 및 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응을 행하였다:
JP781 (SEQ ID No.3) (35 mer):
5'CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3'
및 JP782 (SEQ ID No.4) (36 mer):
5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3'
이 단편을, 아가로스 겔 전기영동 후에, 955 bp SalI-BglII 제한 단편을 분리하기 위해 SalI 및 BglII를 사용하여 분해시켰다. 이어서 이 단편을 플라스미드pVR1012(실시예 1)과 결찰함으로써 플라스미드 pJP111(5810 bp)(도 2)를 제조하였다.
실시예 3: 플라스미드 pJP120(PCV-1 ORF2)의 제작
PCV-1 바이러스(PK-15 균주, GenBank 서열 수탁번호 U49186)의 ORF2 유전자를 함유하는 730 bp PCR 단편을 제조하기 위해, 플라스미드 pPCV1(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1997, 78: 221-227) 및 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응을 행하였다:
JP783 (SEQ ID No.5) (35 mer):
5'CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3'
및 JP784 (SEQ ID No.6) (40 mer):
5'TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3'
아가로스 겔 전기영동 후에, 715 bp의 SalI-BglII 제한 단편을 분리하기 위해 이 단편을 SalI 및 BglII를 사용하여 분해시켰다. 이어서 이 단편을 플라스미드 pVR1012(실시예 1)과 결찰함으로써 플라스미드 pJP120(5565 bp)(도 3)를 생성하였다.
실시예 4: 플라스미드 pJP121(PCV-1 ORF1)의 제작
PstI 단편 형태로 PCV1 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드 pPCV1(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1997, 78: 221-227)을, 아가로스 겔 전기영동 후에, 1759 bp의 PstI-PstI 단편을 분리하기 위해 PstI를 사용하여 분해시켰다. 이 단편은 자가 결찰되었다.
PCV-1 바이러스(균주 PK-15)의 ORF1 유전자를 함유하는 965 bp우ㅏ PCR 단편을 제조하기 위해, PCV-1 바이러스 균주 PK-15의 ORF1 유전자(B. Meehan 외, J. Gen. Virol. 1997, 78: 221-227; GenBank 서열 수탁번호 U49186)를 자가 결찰된 PstI-PstI 단편으로 이루어진 템플레이트를 사용하여 하기 올리고뉴클레오타이드와 함께 폴리메라제 연쇄반응(PCR) 기술로 증폭시켰다:
JP785(SEQ ID No.7) (35 mer):
5'CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3'
및 JP786(SEQ ID No.8) (36 mer):
5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3'
아가로스 겔 전기영동 후에, 946 bp의 SalI-BglII 제한 단편을 분리하기 위해 이 단편을 SalI 및 BglII를 사용하여 분해시켰다. 이어서 이 단편을 플라스미드 pVR1012(실시예 1)과 결찰함으로써 플라스미드 pJP121(5804 bp)(도 4)를 제조하였다.
실시예 5: 플라스미드 pJP058(돼지 GM-CSF의 발현)의 제작
EDTA가 담겨있는 튜브에 돼지의 경정맥으로부터 채혈하여 담았다. 피콜 구배(Ficoll gradient) 상에서 원심분리에 의해 단핵 세포를 수확하고, 이어서 RPMI 1640 배지(Gibco-BRL사)에서 시험관내 배양하고, 배양액 중에 최종 농도가 약 5㎍/㎕가 되도록 콘카나발린 A(Sigma사)를 첨가하여 자극하였다. 자극을 주고 72시간 후에 림프아구(lymphoblast)를 수확하고, 추출 키트 "Micro-Scale Total RNA Separator Kit"(Clontech사)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 이들 세포의 총 RNA를 추출하였다. "1st-Strand cDNA Synthesis Kit"(Perkin Elmer사) 키트를 이용하여 역전사 반응을 행하고, 이어서 약 450 염기 쌍(bp)의 PCR 단편을 제조하기 위해, 하기 올리고 뉴클레오타이드를 가진 이들 돼지 림프아구로부터 추출한 총 RNA에 대해 폴리메라제 연쇄반응을 행하였다:
RG972 (33 mer)
5'TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3'
및 RG973 (34 mer)
5'TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3'
아가로스 겔 전기영동 후에 450 bp의 NotI-NotI 단편을 분리하기 위해 이 단편을 NotI를 사용하여 분해시켰다. 이어서, 이 단편을 플라스미드 pVR1012(실시예 1)와 결찰시키고, 바람직하게는 NotI과 결찰시키고 탈인산화(dephosphorylate)하여 플라스미드 pJP058(5405 bp)(도 5)를 얻었다. 플라스미드 pJP058 내에 클로닝된 pGM-CSF 유전자의 서열을 검사하여 GenBank 데이터베이스(수탁번호 D21074)에서 얻을 수 있는 것과 동일함을 확인하였다.
실시예 6: 돼지의 백신접종을 위한 정제된 플라스미드의 제조
Escherichia coliK12 박테리아(균주 DH10B 또는 SCS1)를 상기 실시예 1 내지 5의 플라스미드 pJP109, pJP111, pJP058, pJP120 및 pJP121을 사용하여 형질전환시켰다. 이들 5개의 플라스미드를 사용하여 얻어진 다섯개의 형질전환 클론을 각각 별도로 Luria-broth(LB) 배지 중에 +37℃의 온도에서 교반하면서 배양하였다. 지수기(exponential phase)의 말기에 박테리아 배양균을 수확하고 알칼리 용균 기법에 따라 플라스미드를 추출하였다. 이어서, 추출된 플라스미드를 Sambrook 등에 의한 방법(Molecular Biology: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)에 따라 염화세슘 구배 상에서 정제하였다. 에티듐 브로마이드를 최종적으로 추출하고 무수 에탄올 존재 하에 침전시킨 후, ml당 2mg의 플라스미드를 함유하는 보관 용액을 얻기 위해, 상기 정제된 플라스미드를 TE 완충용액(1 mM Tris/EDTA, pH 8.0) 중에 현탁시켰다. 이 보관 용액을 사용 시까지 -20℃에 저장한다.
실시예 7: PCV-2 바이러스의 ORF 1 및 ORF 2의 발현 조절
플라스미드 pJP109 및 pJP111 내에 각각 클로닝된 PCV-2 ORF2 및 PCV-2 ORF1 유전자의 발현 산물을 조절하기 위해, Lipofectamine Plus(R)트랜스펙션(transfection) 키트(Gibco-BRL, 캐털로그 번호 10964-013)를 사용하여 키트 제조사의 권장 사용법에 따라 이들 플라스미드를 CHO-K1(Chinese Hamster Ovary) 세포(ATCC No. CCL-61) 내에 트랜스펙션시켰다. 트랜스팩션하고 48시간 경과 후, 트랜스팩션된 세포를 세척하고 95% 빙초산 용액으로 실온에서 3분간 고정하였다. PCV-2 ORF1 단백질(F199 1D3GA 및 F210 7G5GD) 및 ORF2 단백질(F190 4C7CF, F190 2B1BC 및 F190 3A8BC)를 제1 항체로서 사용하였다. Cy3로 표지된 안티-마우스 IgG 접합체(conjugate)를 사용하여 특정 표지를 표시하였다. 플라스미드 pJP109가 트랜스펙션된 세포 내에서 PCV-2 특이적 형광이 세개의 PCV-2 ORF2 단일 클론으로서 관찰되었으나, 플라스미드 pJP111가 트랜스펙션된 것에서는 관찰되지않았다. 대조적으로, 플라스미드 pJP111가 트랜스펙션된 세포 내에서 PCV-2 특이적 형광이 두 개의 PCV-2 ORF2 단일 클론으로서 관찰되었으나, 플라스미드 pJP109가 트랜스펙션된 것에서는 관찰되지 않았다. 플라스미드 pVR1012 단독이 트랜스펙션된 CHO 세포 또는 트랜스펙션되지 않은 CHO세포에서는 PCV-2 단일 클론으로서 형광이 검출되지 않았다.
PCV-2 바이러스에 특이적인 폴리클로날 혈청으로는 동일한 발현 결과가 얻어졌다. 이 경우에, 플루오레세인-표지된 안티-피그 IgG 접합체를 특정 형광을 검출하는 데 사용하였다. 플라스미드 pVR1012 단독이 트랜스펙션된 CHO 세포 또는 트랜스펙션되지 않은 CHO 세포에서는 이 폴리클로날 혈청으로써 형광이 검출되지 않았다.
실시예 8: 나출(裸出) DNA를 이용한 돼지의 백신 접종
8.1. 생후 1일된 새끼 돼지
프로토콜의 D0기에 제왕절개에 의해 얻은 새끼 돼지군을 분리 유닛에 수용하였다. 이들 새끼 돼지를 생후 2일째에 여러 가지 플라스미드 용액으로 근육내 경로로 백신 접종하였다. 백신 용액은 멸균 생리 식염수(0.9% NaCl) 중에 상기 보관 용액을 희석하여 제조한다.
새끼 돼지에게 다음 중 하나로 백신 접종한다:
플라스미드 pJP109 단독,
플라스미드 pJP109와 pJP111의 혼합물,
플라스미드 pJP109와 pJP058의 혼합물,
플라스미드 pJP109, pJP111 및 pJP058의 혼합물. 또는
백신 용액은 각 플라스미드를 500㎍ 포함한다.
용량: 백신 용액은 총 용량 2ml을 근육내 경로로 주사한다. 실제로, 백신 접종시 새끼 돼지의 나이가 주어지면 목의 양측에 1회 주사당 1ml(= 2 x 1ml)로 투여한다.
2회의 백신 주사를 2주일 간격으로, 즉, 프로토콜의 D2 및 D14인 날에 실행한다.
접종(challenge)은 바이러스성 PCV-2 균주의 바이러스 현탁액을 구비(oronasal) 투여하는 방법으로 프로토콜 D21인 날에 행한다. 그 다음, 새끼 돼지에서 이유 후 전신소모성 증후군의 특유의 임상적 징후가 나타나는지에 관하여 새끼 돼지를 3주일간 모니터한다. 모니터되는 징후는 다음과 같다:
직장(直腸) 온도: 초기 14일간 매일 측정하고, 이어서 접종 후 제3주 동안 2회 측정함.
체중: 접종 직전에 새끼 돼지의 체중을 달고, 이후 접종 후 제3주 동안 1주에 1회 측정함.
바이러스 혈증 및 항체의 시험을 위해 혈액 시료 채취: D2, D14, D21, D28, D35 및 D42에 채혈함.
부검(剖檢): D42인 날에 생존한 돼지를 인위적으로 죽이고, 해부병리학적 병변에 관해 조사하고 간, 임파절, 비장, 신장 및 흉선으로부터 조직 표본을 만들어 이들 조직 내의 병변에 관해 조사하기 위해 부검을 실시함.
8.2. 생후 5 내지 7주인 새끼 돼지
PCV-2 바이러스에 특이적 모계 항체를 더 이상 갖지 않는 생후 5주 내지 7주된 새끼 돼지에게 근육내 경로를 통해 다음 중 하나로 백신 접종을 하였다:
플라스미드 pJP109 단독,
플라스미드 pJP109와 pJP111의 혼합물,
플라스미드 pJP109와 pJP058의 혼합물, 또는
플라스미드 pJP109, pJP111 및 pJP058의 혼합물.
백신의 투여량은 실시예 8.1에 예시된 것과 동일하였다(플라스미드당 500㎍). 백신 용액은 2ml의 양으로 근육내 경로로 주사한다(목 근육 내부로 2ml의 양을 1회 투여함).
2회의 백신 접종을 21일 간격으로 실시한다(D0 및 D21). 마지막 백신 접종 후 14일 경과 시(D35), 바이러스성 PCV-2 균주의 현탁액을 근육내 투여함으로써 접종을 행한다.
다음에, 8주일 동안 새끼 돼지에서 이유 후 전신소모성 증후군 특유의 임상적 징후가 나타나는지에 관하여 모니터한다. 접종 후 새깨 돼지의 임상적 모니터링은 총 관찰기간이 8주일인 것을 제외하고는 실시예 8.1에 기재된 것과 동일하다.
실시예 9: DMRIE-DOPE와 함께 제형화한 DNA를 사용한 돼지의 백신 접종
실시예 8에 기재된 나출 플라스미드 DNA 용액 대신에 DMRIE-DOPE를 사용하여 제형화한 플라스미드 DNA 용액을 이용할 수 있다. DNA 용액(실시예 6에 따른 플라스미드를 1종 이상 함유함)을 1mg/ml의 농도로 0.9% NaCl 중에 제조한다. 적당한양의 멸균 증류수 중에 DMRIE-DOPE의 동결건조물을 용해시킴으로써 0.75mM의 DMRIE-DOPE 용액을 제조한다.
플라스미드 DNA-양이온성 기질 복합물의 형성은 0.75mM의 DMRIE-DOPE 용액을 0.9% NaCl 중에 1mg/ml인 동일한 양의 DNA 용액으로 희석함으로써 이루어진다. 상기 DNA 용액은 26G 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 양이온성 기질 용액이 담긴 유리병의 벽을 따라 기포가 형성되지 않도록 서서히 주입한다. 두 용액을 혼합한 즉시 부드럽게 흔들어준다. 최종적으로 0.375mM DMRIE-DOPE 및 500㎍/㎕의 DNA를 포함하는 조성물이 얻어진다.
사용되는 모든 용액을 전술한 모든 조작에서 실온이 되도록 하는 것이 바람직하다. DNA/DMRIE-DOPE 복합물의 형성은 돼지의 면역화를 행하기 전 30분 동안 실온에서 이루어진다.
그런 다음 실시예 8.1 및 8.2에 기재된 조건에 따라 돼지의 백신 접종을 행한다.
첨부한 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명은 전술한 명세서 기재의 특정 실시예에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 범위와 사상을 벗어남이 없는 여러 가지 변형을 포괄함을 이해해야 할 것이다.
청구의 범위
1. PCV-2의 ORF1, PCV-2의 ORF2, PCV-1의 ORF1 및 PCV-1의 ORF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 포함하는 동시에,
상기 유전자 발현의 산물에 대항하는 면역 반응을 증대시킬 수 있는 요소를 포함하는 면역원성 제제 또는 백신.
2. 제1항에 있어서, 면역 반응을 증대시킬 수 있는 상기 요소가 DMRIE를 면역보강제(adjuvant)로서 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
3. 제3항에 있어서, 상기 DMRIE가 중성 지질에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
4. 제3항에 있어서, 상기 DMRIE가 DOPE에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
5. 제1항에 있어서, 면역 반응을 증대시킬 수 있는 상기 요소가 면역보강제로서 카보머(carbomer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
6. 제1항에 있어서, 면역 반응을 증대시킬 수 있는 상기 요소가 돼지 사이토카인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
7. 제6항에 있어서, 상기 돼지 사이토카인이 GM-CSF인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 돼지 사이토카인을 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
9. 제1항에 있어서, 면역 반응을 증대시킬 수 있는 상기 요소가, 면역보강제로서, DMRIE, DMRIE/DOPE 및 카보머로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 및 돼지 사이토카인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 돼지 면역원을 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제 또는 백신.
[도 1]
[도 2]
[도 3]
[도 4]
[도 5]
[첨부 2]
발명의 명칭
돼지 써코바이러스의 재조합 폭스바이러스 백신 {PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVIRUS VACCINE}
관련 출원의 교차 인용
1998년 5월 21일 출원된 미국특허 출원번호 09/082.358, 출원번호 09/082,558의 부분 계속출원인 1998년 9월 25일 출원된 출원번호 09/161,092가 인용되며, 이들은 각각 인용된 문헌과함께 참고자료로 본 명세서에 결합되어 있다.
기술분야
본 발명은 변형된 폭스바이러스 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2(PCV2)의 유전자 산물을 발현하는 재조합 폭스바이러스, 및 PCV2 유전자 산물에 관한 면역반응 유도하고, 또한 항 PCV 감염의 방어 면역을 제공하는 면역학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다.
몇몇 공보는 본 명세서에서 인용되고 있다. 이들 문헌에 대한 완전한 문헌 정보는 명세서 상세한 설명 말미에서 특허청구의 범위 전에 기재되어 있다. 이들 문헌은 본 발명의 기술분야에 속하는 것으로, 본 출원에 인용되고 참조된 각각의 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
배경기술
이유기 후의 전신성 소모성 증후군(PMWS)은 어린 돼지의 질병으로 최근 인정되고 있다. PMWS는 점진적인 체중의 감소 및 빈호흡, 호흡곤란 및 황달과 같은 기타 증상을 임상적인 특징으로 한다. 병인학적으로는 림프구성 및 육아종성 침윤, 림프절 병증, 및 드물게는 림프구성 및 육아종성 간염 및 신장염이 관찰되었다(Clark, 1997; Harding, 1997).
이 질병은 북미뿐 아니라 다른 유럽 국가에서도 보고된 적이 있다. 이 질병의 치료 및 예방은 현재로서는 가능하지 않다.
PMWS의 병인학적 약제로서 돼지 써코바이러스에 대한 몇 가지 분명한 점이 있다(Elliset al., 1998). PMWS에 걸린 돼지에서 써코바이러스가 회수되었고, 돼지 써코바이러스에 대한 항체가 그 병에 걸린 돼지에서 검출되었다.
써코바이러스는 동물과 식물 종의 범주에서 발견되는 단쇄의 환형 DNA 바이러스이다. 돼지 써코바이러스는 원래 무한증식성 돼지의 신장 세포주로부터 오염물로 분리되었다. 이 세포 배양 분리물은 PK-15로 지정되었다(Meehanet al., 1997). 최근, PMWS에 걸린 돼지로부터 얻은 돼지 써코바이러스를 PK-15와 비교하였다. 이러한 바이러스는 뉴클레오타이드 및 단백질 서열 수준에서 PK-15와 실질적으로 다르고, PCV2로 지정되었다(Meehanet al., Hamelet al., 1998).
13개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 PCV2 게놈에서 동정되었다(프랑스 특허 출원 제98 03707호의 COL1 내지 COL13). 이들 ORF 중 4개는 PK-15의 게놈내의 유사한 ORF과 실질적인 상동성을 가진다. ORF1(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL4에 해당)은 nt 398-1342(GenBank 수탁번호 AF055392)를 포함하며, 37.7 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF2(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL13에 해당)는1-314에 연결된 nt 1381-1768(GenBank 수탁번호 AF055392)을 포함하며, 27.8 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF3(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL7에 해당)은 nt 1018-704(GenBank 수탁번호 AF055392)를 포함하며, 11.9 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF4(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL10에 해당)는 nt 912-733(GenBank 수탁번호 AF055392)을 포함하며, 6.5 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다.
PCV2의 ORF1은 PK15 분리물의 ORF1(Meehanet al., 1998)과 높은 상동성(86% 동일)이 있다. PK-15의 ORF1 단백질은 부분적으로 밝혀졌다(Meehanet al., 1997; Mankertzet al., 1998a). 이것은 바이러스 복제를 위한 필수성분으로 알려져 있고, 아마도 바이러스성 DNA 복제에도 관여할 것이다.
각 ORF2들간의 단백질 서열의 상동성은 ORF1 들의 상동성보다 낮지만(66% 동일), ORF2 각각은 조류의 써코바이러스인 닭 빈혈 바이러스(CAV)의 주된 구조 단백질의 N-말단 부위에서 발견되는 것과 유사한 잘 보존된 염기성 N-말단 영역을 공유하고 있다(Meehanet al., 1998). 최근, Mankertzet al.(1998b)은 PK-15 분리물의 ORF2(Mankertzet al., 1998b에서 ORF1로 설정)가 캡사이드 단백질을 코딩한다고 제안한 바 있다.
PK-15 분리물과 PCV2의 ORF3들 및 ORF4들 사이에서는 더욱 큰 차이가 발견되었다. 각각의 경우에, PK-15 분리물의 게놈에 존재하는 해당 ORF과 비교하면 PCV2의 ORF4 및 ORF3의 C-말단 부위가 결실되어 있었다. 가장 높은 단백질 서열상동성은 ORF3 및 ORF4의 N-말단 부위에서 관찰되었다(Meehanet al., 1998).
PCV2의 게놈의 전사 분석값은 아직 공개되지 않았다. PK-15 분리물에서 얻은 최근의 자료에서는 ORF2 전사체가 스플라이싱되어 있다는 것이 밝혀졌다(Mankertzet al., 1998b).
백시니아 바이러스는 1980년대에 천연두를 세계적으로 박멸하는 것을 최고점으로 하여 천연두를 성공적으로 면역하는 데 사용되고 있다. 천연두의 박멸 외에, 폭스바이러스의 새로운 역할은 외래 유전자의 발현을 유전자적으로 조작된 벡터로서 주요한 역할이 대두되고 있다(Panicadi and Paoletti, 1982; Paolettiet al., 1984). 이질 항원을 코딩하는 유전자를 백시니아에서 발현시키면, 종종 해당 병원체에 의한 접종에 대해 방어 면역이 이루어진다(Tartagliaet al., 1990). MVA로 명명된 고도로 약독화된 백신 균주도 폭스바이러스계 백신을 위한 벡터로 사용되고 있다. MVA의 용도는 미국 특허 제5,185,146호에 기재되어 있다.
2가지의 추가적인 백신 벡터 시스템은 천연 숙주-제한된 폭스바이러스, 아비폭스 바이러스의 사용을 포함한다. 파울폭스바이러스(FPV; Tayloret al., 1988a,b) 및 카나리폭스바이러스(CPV; Tayloret al., 1991 % 1992)는 모두 외래 유전자 산물을 발현시키도록 조작되었다. 파울폭스 바이러스(FPV)는 Poxvirus 과의 Avipox 속의 원형(prototypic) 바이러스이다. 이 바이러스는 약독화된 생백신을 사용하여 1920년대 이후 잘 방제되고 있는 가금류의 경제적으로 중요한 질병을 일으킨다. 아비폭스 바이러스의 복제는 조류 종에 한정되는 것으로(Matthews, 1982) 인간을 포함하는 비조류 종에서 생산성 감염을 일으키는 아비폭스바이러스에관한 보고는 없다. 이러한 숙주 제한은 다른 종으로 바이러스가 전파되는 것에 대한 고유하고 안정한 장벽으로 제공되어 아비폭스 바이러스 계통의 백신 벡터를 수의학 및 인간에게 적용하는 데 매력적인 제안이 되고 있다.
FPV는 가금류의 병원체에서 유래한 항원을 발현시키는 벡터로서 유용하게 사용되어 왔다. 독성의 조류 인플루엔자 바이러스의 적혈구 응집소 단백질은 FPV 재조합체에서 발현시켰다(Tayloret al., 1988c). 닭 및 칠면조에 재조합체를 접종한 후, 동질 또는 이질의 독성 인플루엔자 바이러스 접종 중 하나에 대해 방어적인 면역반응이 유도되었다. 뉴캐슬병 바이러스의 표면 당단백질을 발현시키는 FPV 재조합체도 개발되었다(Tayloret al., 1990; Edbaueret al., 1990).
다른 약독화된 폭스바이러스 벡터는 바이러스의 야생형 균주의 유전자 변형에 의해 제조되었다. 백시니아의 코펜하겐 균주(Copenhagen strain) 유래의 특정 독소 및 숙주 범주의 유전자의 결실에 의해 유도된 NYVAC 벡터(Tartagliaet al., 1992)는 발현된 외래 항원에 대한 방어적 면역 반응을 일으키는 재조합 벡터로 유용하다는 것이 검증되었다.
다른 조작된 폭스바이러스 벡터로는 카나리폭스 바이러스로부터 유래된 ALVAC가 있다. ALVAC는 비조류 숙주에서 생산적인 복제를 하지 않고 안전성 프로필을 향상시킨다고 고려된다(Tayloret al., 1991 %1992). ALVAC 및 NYVAC는 BSL-1 벡터이다.
서브유닛 PCV2 백신의 개발을 위한 하나의 방안은 생 바이러스 벡터를 관련 PCV2 ORF를 발현시키는 데 사용하는 것이다. 재조합 폭스바이러스는 본 명세서에서 인용되고 있는 미국 특허 제4,769,330; 4,722,848; 4,603,112; 5,110,587; 5,174,993; 5,494,807; 및 5,505,941호에서 기재된 백시니아 바이러스 및 아비폭스 바이러스와 같은 폭스바이러스의 합성 재조합체를 제조하는 방법과 유사한 종래의 2단계 방법으로 제작될 수 있다. PCV2 재조합 폭스바이러스 및 이로부터 이루어진 조성물 및 산물, 특히 ALVAC 계통의 PCV2 재조합체 및 이로부터의 조성물 및 산물, 특히 PCV2의 ORF1 및/또는 2를 함유하는 재조합체 및 이로부터 이루어진 조성물 및 산물은 현재의 기술에 대비해 매우 바람직한 이점이 있을 것이다.
본 발명의 목적 및 개요
따라서, 본 발명의 목적은 PCV2에 의한 감염의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공하고자 하는 것이다. 또한, PMWS를 치료하거나 예방하기 위한 수단을 제공하고자 한다.
본 발명의 한 특징은 항원 조성물, 면역학적 조성물, 또는 백신 조성물 또는 이 조성물로 접종된 숙주 동물에서 항원 반응, 또는 면역학적 반응을 일으키기 위한 치료제 조성물에 관한 것으로, 상기 백신은 담체 및 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 불활성화하여 그 재조합 바이러스가 약화된 독성 및 개선된 안전성을 가지도록 한 변형된 재조합 바이러스를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용된 바이러스는 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스 또는 아비폭스 바이러스, 예를 들면 파울폭스바이러스 또는 카나리폭스 바이러스가 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 ALVAC이다. 변형된 재조합 바이러스는 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수 부위 내에 항원성 단백질, 예를 들면 PCV2 ORF1 및/또는 2와 같은 PCV2 ORF로부터 유래된 항원성 단백질을 코딩하는 이질 DNA 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 재조합 바이러스가 약화된 독성 및 개선된 안전성을 가지도록 불활성화된 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 가지는 변형된 재조합 바이러스를 함유하는 면역원 조성물에 관한 것이다. 이 변형된 재조합 바이러스는 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수 부위 내에 항원 단백질(예를 들면 PCV2 ORF 특히 ORF1 및/또는 2에서 유래됨)을 코딩하는 이질 DNA 서열을 포함한다. 이때 조성물을 숙주에 투여하는 경우, 이 조성물은 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 특징은 바이러스가 약화된 독성을 가지도록 불활성화된 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 가지는 변형된 재조합 바이러스에 관한 것이다. 이때, 변형된 재조합 바이러스는 이질의 공급원, 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수적인 부위에 이질의 공급원으로부터 유래된 DNA를 추가로 포함한다. DNA는 PCV2 ORF1, ORF2, ORF3, 또는 ORF4(Meehanet al., 1998)의 일부 또는 전부와 같은 PCV2 유전자를 코딩할 수 있다. 특히, 유전자 기능체는 독성 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 결실시키거나 또는 천연적인 숙주-제한적 바이러스를 이용함으로써 불활성화할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 폭스바이러스, 예를 들면 백시니아 바이러스 또는 파울폭스 바이러스 또는 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스 바이러스가 바람직하다. 바람직하게, 폭스바이러스 또는 바이러스 게놈에서 결실된 오픈 리딩 프레임 은 J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, 및 I14L과 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다(이들 용어는Goebelet al., 1990에 보고된 것임). 이점에서, 오픈 리딩 프레임은 티미딘 키나제 유전자, 출혈 부위, A형 봉입체 부위, 적혈구 응집 유전자, 숙주 범위 유전자 부위 또는 대형 서브유닛, 리보뉴클레오타이드 환원효소; 또는 이들의 조합을 포함한다. 백시니아 바이러스의 적합한 변형된 코펜하겐 균주는 NYVAC(Tartagliaet al., 1992) 또는 J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1l 및 I4L 또는 티미딘 키나제 유전자, 출혈 부위, A형 봉입체 부위, 적혈구 응집소 유전자, 숙주 범위 부위 및 대형 서브 유닛, 리보뉴클레오타이드 환원 효소가 결실된 백시니아 바이러스로 확인되었다(미국 특허 제5,364,773호 참조). 바람직하게, 폭스바이러스 벡터는 ALVAC 또는 예를 들면 병아리 태아의 섬유아세포를 200회 이상 연속 통과시켜 약독화된 카나리폭스 바이러스(Rentschler 백신 균주)로서, 이로부터 얻은 마스터 시드를 아가 하에서 플라크 클론을 5회의 추가 통과를 통해 증폭시킨 4연속 플라크 정제를 실시하였다.
본 발명의 또 다른 특징은 또한 재조합 폭스바이러스의 발현 산물 및 치료, 예방, 진단 또는 테스트를 위한 그의 항원 조성물, 면역학적 조성물, 또는 백신 조성물의 용도 및 DNA 프로브 및 PCR 프라이머를 제작하는 데 유용한 재조합 폭스바이러스로부터 유래된 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 한 특징은 폭스바이러스 게놈의 비필수 부위에 PCV2로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스와 같은 재조합 바이러스에 관한 것이다. 이 폭스바이러스는 파울폭스 바이러스, 특히 약독화된 파울폭스 바이러스, 또는 ALVAC와 같은 카나리폭스바이러스, 특히 약독화된 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스 바이러스가 바람직하다.
본 발명에 따르면, 재조합 폭스바이러스는 외래의 PCV2 유전자의 유전자 산물을 발현시킨다. PCV2의 특정 ORF를 폭스바이러스 벡터에 삽입하고 얻어진 재조합 폭스바이러스를 사용하여 동물에 감염시켰다. PCV2 유전자 산물을 동물에서 발현시킨 결과 그 동물은 PCV2에 대해 면역반응을 일으켰다. 따라서 본 발명의 재조합 폭스바이러스를 면역학적 조성물 또는 백신에 사용하면 이것으로 한정되지는 않지만 방어적인 면역반응을 일으키는 수단을 제공하게 된다.
재조합 폭스바이러스-PCV2 또는 그의 발현 산물, 면역학적 조성물, 항원 조성물, 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 같은 본 발명의 조성물 또는 치료제 조성물의 투여 방법은 비경구 경로(피부하, 근육내, 또는 피하)를 통한 것일 수 있다. 이러한 투여로 전신 면역 반응 및 체액성 또는 세포-매개된 반응이 일어난다.
더욱 일반적으로, 본 발명의 폭스바이러스-PCV2 재조합체, 항원, 면역학 또는 백신 폭스바이러스-PCV2 조성물 또는 치료제 조성물을 제약 기술 분야 및 수의학 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 함량은 의학 기술 분야 또는 수의학 기술분야의 당업자들이 특정 대상의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 예를 들면 "다른" 면역학적, 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속하여 투여하여 다중 또는 "칵테일" 또는 조합 조성물 및 그의 채용되는 방법을 제공할 수 있다. 또한 투여 성분 및 방식(후속 또는 공동-투여) 및 투여량도 특정 대상의 연령, 성별, 체중, 종족, 및 상태 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 결정할 수 있다. 이점에 대해, 본 명세서에서 인용되는 광견병 조성물, 조합 조성물 및 이의 용도에 관한 미국 특허 제 5,843,456호를 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위내 등과 같은 구멍용의 현탁액, 시럽, 또는 보형제와 같은 액상 제제 및 비경구, 피하, 피부내, 근육내, 또는 정맥내 투여(예를 들면 주사 투여)용의 멸균 현탁 또는 에멀젼 제제를 포함한다. 이러한 조성물에서, 재조합 폭스바이러스 또는 항원은 멸균수, 생리 식염수, 글루코스 등과 같은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제와 미리 혼합될 수도 있다. 조성물을 동결건조시킬 수도 있다. 조성물은 습윤제, 에멀젼화제, pH 완충제, 면역보강제, 겔화제, 또는 증점제, 방부제, 향미제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 소망의 투여 경로 및 제형에 따라 함유할 수 있다. 본 명세서에 인용된 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE" 17판, 1985와 같은 교과서를 참조하여 곤란함 없이 적합한 제형을 제조할 수 있을 것이다. 적합한 용량을 이하의 실시예에 따를 수도 있다.
조성물은 아크릴산 또는 메타크릴산의 폴리머 및 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 코폴리머에서 선택된 적어도 하나의 면역 보강제 화합물을 포함할 수 있다.
면역 보강제 화합물은 특히 당 또는 다가알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 폴리머가 바람직하다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)의 용어로 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, 1999년 6월).당업자는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록시기를 가지고, 적어도 3개의 하이드록시기의 수소 원자는 적어도 2개의 탄소원자를 가지는 불포화된 지방족 라디칼로 치환되는 폴리하이드록시화된 화합물과 가교결합된 아크릴 폴리머를 개시한 미국 특허 제2,909,462호(본 명세서에서 인용됨)를 참조할 수도 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것으로, 예를 들면 비닐, 알릴, 및 기타 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 것이다. 불포화된 라디칼은 자체적으로 메틸과 같은 다른 치환기를 포함할 수도 있다. Carbopol(R)(BF Goodrich, Ohio, USA)의 제품명으로 시판되는 제품이 특히 바람직하다. 이 제품은 알릴 슈크로즈 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된 것이다. 이들 중, Carbopol(R)974P, 934P 및 971P를 예로 들 수가 있다.
말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 코폴리머 중에서, 선형 또는 가교결합된 말레산 무수물과 에틸렌의 코폴리머, 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 선상 또는 가교결합된 코폴리머인 EMA(R)(Monsanto)가 바람직하다. 본 명세서에서 인용되고 있는 1960년 6월 4일자의 J. Fieldset al., Nature,186: 778-780을 참조할 수도 있다.
이들 구조의 관점에서, 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머 및 EMA(R)코폴리머는 다음의 식의 기본 단위체로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 식에서,
R1및 R2는 상이하거나 동일한 것으로 H 또는 CH3를 의미하고,
x = 0 또는 1, 바람직하게 x = 1이고,
y = 1 또는 2이고, x + y =2임.
코폴리머 EMA(R)에서, x = 0이고 y = 2이다. 카보머에서는 x = y = 1이다.
이들 폴리머를 물에 용해시켜 산용액을 제조하여 백신 자체가 혼입될 면역 보강제 용액을 제공하도록 바람직하게는 생리적인 pH로 중화시켰다. 폴리머의 카르복시기는 부분적으로 COO-형태가 될 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따르는 면역 보강제 용액, 특히 카보머는 바람직하게 염화나트륨의 존재하에서 증류수 내에서 제조하여 산성 pH의 용액을 얻었다. 이 저장 용액을 NaCl이 첨가된 물을 원하는 함량(소망의 최종 농도를 얻도록) 또는 실질적으로 그의 일부, 바람직하게 생리 식염수(NaCl 9 g/ℓ)를 한번에 또는 여러번 첨가하여 희석하고 함께 또는 이어서 바람직하게 NaOH로 중화(pH 7.3 내지 7.4)시켰다. 생리 pH의 용액은 특히 동결건조하여 저장되는 백신 액 또는 동결된 형태와 혼합하기 위한 것이다.
최종 백신 조성물에서 폴리머의 농도는 0.01% 내지 2 w/v%, 바람직하게 0.06 내지 1 w/v%, 더욱 바람직하게 0.1 내지 0.6w/v%가 될 것이다. 본 발명의 면역학적 조성물은 다른 돼지 병소로부터 유래된 적어도 하나의 면역원을 발현하는 적어도 하나의 약독화된, 불활성화된 또는 서브유닛의 생백신 또는 재조합 백신(예를 들면, 폭스바이러스의 벡터 또는 DNA 플라스미드)과 회합될 수 있다.
이하의 상세한 설명에서 이들 및 기타 실시예가 기재되어서 이들로부터 본 발명을 보다 분명하게 이해할 수 있을 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 다음의 첨부 도면을 참조하여 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1(SEQ ID NO:1)은 C6 오픈 리딩 프레임을 함유한 ALVAC DNA의 3.7 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 pJP102 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 3(SEQ ID NO:8)은KpnI(위치 653)으로부터SacI(위치 3166) 제한 자리까지의 pJP102 도너 플라스미드로부터 얻은 2.5 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도면이다.
도 4는 pJP105 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 5는 pJP107 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 6(SEQ ID NO:11)은KpnI(위치 653)으로부터SacI(위치 4255) 제한 자리까지의 pJP107 도너 플라스미드로부터 얻은 3.6 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도면이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 폭스바이러스 게놈의 비필수 영역에서 PCV2로부터 유래한 DNA 서열을 함유하는 재조합 폭스바이러스에 관한 것이다. 재조합 폭스바이러스는 외래의 PCV 유전자의 유전자 산물을 발현시킨다. 특히, PCV2 단백질을 코딩하는 ORF2 및 ORF1 유전자가 분리되고, 특정화되고, ALVAC(카나리폭스 벡터) 재조합체에 삽입되었다. 사용된 분자 생물학 기술은 Sambrooket al.(1989)에 기재된 것이다.
세포주 및 바이러스 균주
Imp1010-Stoon으로 지정된 PCV2 균주는 이미 개시되어 있다(Meehanet al., 1998). 이것은 캐나다산의 병에 걸린 돼지로부터 장간막의 림프구 조직에서 분리하였다. PCV2 게놈의 클로닝법은 Meehanet al.(1998)에 의해 개시되었다. 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14는 플라스미드 pGem-7Z(Promega, Madison, WI)의EcoRI 자리에 삽입된EcoRI 단편으로 PCV2 게놈을 함유한다. Imp.1010 PCV2 균주의 완전 뉴클레오타이드 서열은 Meehanet al.(1998)에 의해 결정되고 GenBank 수탁번호 AF055392로 구입할 수 있다.
부모의 카나리폭스 바이러스(Rentschler 균주)는 카나리의 백신 균주이다. 백신 균주는 야생형 분리물로부터 얻어지는 것이고 닭의 태아 섬유아세포 상에서 200회 이상 연속 통과하여 약독화시켰다. 아가 하에서 마스터 바이러스 시드에 4회 연속 플라크 정제를 실시하였다. 보존 바이러스를 시험관 내 재조합 테스트에서 부모의 바이러스로 사용한 후 5회의 부가적 통과를 통해 하나의 플라크 클론을 증폭시켰다. 카나리폭스 분리물이 정제된 플라크를 ALVAC로 지정하였다. ALVAC는부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection에 ATCC 수탁 번호 VR-2547로 1996년 11월 14월에 기탁되었다.
폭스바이러스 재조합체의 생성은 상이한 단계를 포함한다: (1) 폭스바이러스 게놈 내의 삽입 자리 측면의 서열("아암") 및 2개의 측면 아암 사이에 위치한 다수의 클로닝 자리(MCS)을 포함하는 삽입 플라스미드의 제작(예를 들면 실시예 1 참조); (2) 외래 유전자 발현 카세트가 삽입된 MCS 내에 삽입 플라스미드로 이루어진 도너 플라스미드의 제작(예를 들면 실시예 2 내지 5 참조); (3) 폭스바이러스 게놈의 적절한 위치 내에 외래 유전자 발현 카세트의 삽입 및 재조합 바이러스의 플라크 정제를 가능하게 하는 부모의 폭스바이러스의 도너 플라스미드 및 게놈의 아암 사이의 세포 배양물내에서의 시험관 내 재조합체(예를 들면 실시예 6 참조).
PCV2 재조합 면역원은 PCV1 면역원과 회합하여 동물을 항PMWS 면역화하는 데 사용할 수도 있다. 덜 바람직한 방식에서, PCV1 면역원은 PCV2 면역원없이 사용할 수도 있다.
본 발명은 이하의 예시적이고 비제한적인 실시예를 통해 부가적으로 설명된다.
실시예 1: C6 자리에서 카나리폭스 삽입 플라스미드의 제작
도 1(SEQ ID NO:1)은 카나리폭스 DNA의 3.7 kb 단편의 서열이다. 서열의 분석에서 C6L로 지정된 ORF이 377번 위치에서 시작되어 2254번 위치에서 종결된다는 것이 나타나 있다. 하기에는 C6 ORF를 결실시키고 이것 대신 번역 및 전사 종결 신호가 측면에 연결된 다중 클로닝 자리(MCS)를 삽입하여 제작된 C6 삽입 플라스미드가 기재되어 있다. 380 bp의 PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6A1(SEQ ID NO:2) 및 C6B1(SEQ ID NO:3)을 이용하여 게놈의 카나리폭스 DNA로부터 증폭시켰다. 1155 bp의 PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6C1(SEQ ID NO:4) 및 C6D1(SEQ ID NO:5)을 이용하여 게놈의 카나리폭스 DNA로부터 증폭시켰다. 380 bp 및 1155 bp의 단편을 주형으로 함께 첨가하고 1613 bp PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6A1(SEQ ID NO:2) 및 C6D1(SEQ ID NO:3)을 이용하여 증폭하여 융합시켰다. 이 단편을SacI 및KpnI로 분해하고SacI/KpnI로 분해된 pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla, Ca, USA)로 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드인 pC6L을 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 이것은 C6의 카나리폭스 DNA 상류의 370 bp("C6 좌측 아암"), 백시니아의 초기 종결 신호, 6개의 리딩 프레임 내의 번역 종결 코돈,SmaI,PstI,XhoI 및EcoRI 자리로 이루어진 MCS, 백시니아의 초기 종결 자리, 6개 리딩 프레임 내의 번역 종결 코돈 및 1156 bp의 하류 카나리폭스 서열("C6 우측 아암")로 이루어진다.
외래 유전자와 결합된 백시니아 H6 프로모터를 포함하는 카세트(Tayloret al.(1988c), Guoet al.(1989), 및 Perkuset al.(1989))를 pC6L의SamI/EcoRI 자리 안으로 결찰시켜 pC6L로부터 플라스미드 pJP099를 유도하였다. 이 플라스미드 pJP099는 유일한EcoRV 자리 및 H6 프로모터의 3' 말단에 위치한 유일한NruI 자리 및 외래 유전자의 STOP 코돈과 C6 좌측 아암 사이에 위치한 유일한SalI 자리를 함유한다. 따라서 pJP099로부터 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 또는NruI/SalI 단편은 플라스미드 서열(pBluescript SK+; Stratagene, La Jolla, CA, USA),EcoRV 또는NruI 자리까지 H6 프로모터의 5' 말단 및 2개의 C6 아암을 포함한다.
프라이머의 서열:
프라이머 C6A1 (SEQ ID NO:2)
프라이머 C6B1 (SEQ ID NO:3)
프라이머 C6C1 (SEQ ID NO:4)
프라이머 C6D1 (SEQ ID NO:5)
실시예 2: PCV2 ORF2용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
PCV2를 포함하는 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14를EcoRI로 분해하고 1768 bp의 단편을 분리하고 결찰하였다.
적절한 ALVAC 삽입 벡터 내에 PCV2 ORF2를 삽입하기 위해, 프라이머 JP760(SEQ ID NO:6) 및 JP773(SEQ ID NO:7)을 사용하여 1768 pb의 결찰된EcoRI 단편(상기 참조)은 PCV2 ORF2를 증폭하여 PCR J1304를 얻었다. 프라이머 JP760(SEQ ID NO:6)은EcoRV로부터 H6 프로모터의 3'말단 및 PCV2 ORF2의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP773(SEQ ID NO:7)은 PCV2 ORF2의 3' 말단에 이어SalI 자리를 포함한다. PCR J1304의 산물은 이후EcoRV/SalI로 분해한 후 ∼750bp 단편을 pJP099 (실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 단편으로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드는 서열분석으로 확인하고 pJP102(도 2의 pJP02의 지도 및 도 3의 서열(SEQ ID NO:8) 참조)로 지정하였다. ORF2의 서열은 Gen Bank에서 수탁 번호 AF055392로 구입할 수 있는 서열과 매치된다. 도너 플라스미드인 pJP102(NotI로 선형화됨)를 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1614(실시예 6 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열:
JP760(SEQ ID NO:6)
JP773(SEQ ID NO:7)
실시예 3: PCV2 ORF2 및 ORF1용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
프라이머 JP774(SEQ ID NO:9) 및 JP775(SEQ ID NO:10)를 이용하여 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI NO.14 상에서 PCV2 ORF1을 PCR에 의해 증폭시켜서 PCR J1311을 얻었다. 프라이머 JP774(SEQ ID NO:9)는NruI 유래의 H6 프라이머의 3' 말단 및 PCV2 ORF1의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP775(SEQ ID NO:10)는 PCV2 ORF1의 3' 말단에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1311의 산물(∼1 Kb)을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP104로 지정하였다. ORF1의 서열을 GenBank에서 수탁번호 AF055392로 구입가능한 서열과 매치하였다. ∼940 pbNruI/SalI 단편을 pJP104로부터 분리하고 pJP099(실시예 1 참조)로부터 ∼4.5 kbNruI/SalI 단편으로 클로닝하여 제한 분석에 의해 확인된 플라스미드를 얻고 이것을 pJP105(도 4 참조)로 지정하였다. 도너 플라스미드인 pJP105를 사용하여 시험관 내 재조합 테스트(실시예 6에 설명되어 있음)에 사용하여 PCV2 ORF1을 발현시키는 ALVAC 재조합체를 제조할 수 있다.
pJP102(실시예 2 참조)로부터 얻은 ∼838 bpBamHI/SalI을 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편을 이용하여 평체화시키고(blunted) pJP105의 Klenow-평체 EcoRI 자리에 클로닝하였다. 클론을 제한 분석에 의해 삽입 방향을 확인하고 헤드-투-헤드 배열을 선택하였다. 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고 pJP107(도 5의 pJP107의 지도 및 도 6의 서열(SEQ ID NO: 11) 참조)을 지정하였다. 도너 플라스미드 pJP107(NotI로 선형화됨)를 시험관 내 재조합 5(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1615(실시예 6 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열:
JP774(SEQ ID NO:9)
JP775(SEQ ID NO:10)
실시예 4: PCV1 ORF2용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
플라스미드 pGem-7Z 내에PstI 단편으로서 PCV1 게놈을 포함하는 플라스미드 pPCV1(B. Meehanet al., J. Gen. Virol, 1997, 78, 221-227)을 PCV1 ORF2를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다.
적절한 ALVAC 삽입 벡터 내에 PCV2 ORF2를 삽입하기 위해, 프라이머 JP787(SEQ ID NO:12) 및 JP788(SEQ ID NO:13)을 사용하여 플라스미드 PCV1(상기 참조)로부터 PCV1 ORF1을 증폭시켜 PCR J1315을 얻었다. 플라스미드 JP787(SEQ ID NO:2)은EcoRV 유래의 H6 프로모터의 3'말단 및 ORF2에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1315의 산물은 이후EcoRV/SalI로 분해한 후 ∼750bp 단편으로서 pJP099 (실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 단편으로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP113으로 지정하였다. ORF2의 서열은 Gen Bank에서 수탁 번호 U49186으로 구입할 수 있는 서열과 매치된다. 도너 플라스미드인 pJP113(NotI로 선형화됨)을 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1621(실시예 7 참조)을 생산하였다.
프라이머의 서열
JP787(SEQ ID NO:12)
JP788(SEQ ID NO:13)
실시예 5: PCV1 ORF2 및 ORF1용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
플라스미드 pGem-7Z 내에PstI 단편으로서 PCV1 게놈을 포함한 플라스미드 pPCV1(상기 실시예 4 참조)을PstI로 분해시키고 1759 bp 단편을 분리하여 결찰시켰다.
프라이머 JP789(SEQ ID NO:14) 및 JP790(SEQ ID NO:15)을 이용하여 1759 bp의 결찰된 PstI 단편(상기 참조)으로부터 PCV1 ORF1을 PCR에 의해 증폭시켜서 PCR J1316을 얻었다. 프라이머 JP789(SEQ ID NO:14)는NruI유래의 H6 프라이머의 3' 말단 및 PCV1 ORF1의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP790(SEQ ID NO:15)은 PCV1 ORF1의 3' 말단에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1316의 산물(∼1 Kb)을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP114로 지정하였다. ORF1의 서열은 GenBank에서 수탁번호 AF49186으로 구입가능한 서열과 매치하였다. ∼970 pbNruI/SalI 단편을 pJP114로부터 분리하고 pJP099(실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbNruI/SalI 단편으로 클로닝하여 제한 분석에 의해 확인된 플라스미드를 얻고 이것을 pJP115로 지정하였다. 도너 플라스미드인 pJP115를 사용하여 시험관 내 재조합 테스트(실시예 7에 설명되어 있음)에 사용하여 PCV1 ORF1을 발현하는 ALVAC 재조합체를 제조할 수 있다.
pJP113(실시예 4 참조)로부터 얻은 ∼838 bpBamHI/SalI을 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편을 이용하여 평체화시키고 pJP115의 Klenow-평체EcoRI 자리에 클로닝하였다. 클론을 제한 분석에 의해 삽입 배향을 확인하고 헤드-투-헤드 배열을 선택하였다. 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고 pJP117에 지정하였다. 도너플라스미드 pJP111(NotI로 선형화됨)을 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1622(실시예 7 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열:
JP789(SEQ ID NO:14)
JP790(SEQ ID NO:15)
실시예 6: ALVAC-PCV2 재조합체의 제조
플라스미드 pJP102 (실시예 2 및 도 2 참조) 및 pJP107 (실시예 3 및 도 5 참조)을NotI으로 선형화하여서 이전에 기재된 인산칼슘 침전 방법(Panicali and Paoletti, 1982; Picciniet al., 1987)을 이용하여 ALVAC가 감염된 1차 CEF 세포로 트랜스펙션시켰다. 양성 플라크를 특정 PCV2 방사능 표지된 프로브에 대한 혼성화를 기준으로 선택하고 순수 군집이 얻어질 때까지 4회의 후속 플라크 정제를 실시하였다. 각각의 IVR 유래의 대표적인 플라크를 증폭시키고 얻어진 ALVAC 재조합체를 vCP1614 및 vCP1615로 지정하였다. vCP1614 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP102 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리내에 삽입된 PCV2 ORF2를 함유한다. vCP1615 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP107 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리 내에 삽입된 PCV2 ORF1을 헤드-투헤드 방향으로 함유한다.
유사한 방식으로, PCV2 ORF1만을 발현하는 재조합 ALVAC는 실시예 3에 기재된 도너 플라스미드 pJP 105를 사용하여 제조할 수 있다.
면역형광법
PCV2 단백질이 ALVAC 재조합체가 감염된 Vero 세포에서 발현되는 지를 결정하기 위해, 면역현광(IF) 분석을 실시하였다. 감염된 Vero 세포를 감염(약 10의 m.o.i.) 24시간 후에 PBS로 세척하였고, 실온에서 3분간 95%의 차가운 아세톤으로 고정하였다. PCV2 ORF1(PCV2 199 1D3GA % PCV2 210 7G5GD) 또는 ORF2(PCV2 190 4C7CF, PCV2 190 2B1BC % PCV2 190 3A8BC)에 특이적인 5개의 단클론성 항체(MAb) 제제(하이브리도마 상층액)를 제1 항체로 사용하였다. 이들 특이적인 단클론성 항체를 Merial-Lyon으로부터 얻었다. 단클론성 항체를 본 명세서에서 인용된 다음의 문헌의 교시로부터 얻을 수도 있다: 본 출원서에서 참고로 인용되는 미국 특허출원 제09/082,358 및 09/161,092호. IF 반응은 Tayloret al.(1990)에 의해 기재된 바와 같이 실시되었다.
3가지의 ORF2-특이 항체에 대한 PCV2 특이적 면역형광을 vCP1614로 감염된 세포 및 vCP1615로 감염된 세포에서 측정하였다. 2가지의 ORF1-특이 항체에 대한 PCV2 특이적 면역형광을 vCP1615 만으로 감염된 세포에서 측정하였다. 결과에서는 기대한 바와 같이, vCP1614는 ORF2만을 발현시키지만, vCP1615는 ORF1 및 ORF2모두를 발현시키는 것으로 나타났다. ALVAC 감염된 Vero 세포와 감염되지 않은 Vero 세포 모두에서 형광이 검출되지 않았다.
실시예 7: ALVAC-PCV1 재조합체의 제조
플라스미드 pJP113 (실시예 4 참조) 및 pJP117 (실시예 5 참조)을NotI으로 선형화하여서 이전에 기재된 인산칼슘 침전 방법(Panicali and Paoletti, 1982; Picciniet al., 1987)을 이용하여 ALVAC로 감염된 1차 CEF 세포로 트랜스펙션시켰다. 양성 플라크를 특정 PCV1 방사 표지된 프로브에 대한 혼성화를 기준으로 선택하고 순수 군집이 얻어질 때까지 4회의 후속 플라크 정제를 실시하였다. 각각의 IVR 유래의 대표적인 플라크를 증폭시키고 얻어진 ALVAC 재조합체를 vCP1621 및 vCP1622로 지정하였다. vCP1621 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP113 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리내에 삽입된 PCV1 ORF2를 함유한다. vCP1622 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP117 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리 내에 삽입된 PCV1 ORF2 및 ORF1을 헤드-투-헤드 방향으로 함유한다.
유사한 방식으로, PCV1 ORF1만을 발현하는 재조합 ALVAC는 실시예 5에 기재된 도너 플라스미드 pJP 115를 사용하여 제조할 수 있다.
면역형광법
PCV1 단백질이 ALVAC 재조합체가 감염된 Vero 세포에서 발현되는 지를 결정하기 위해, 면역현광(IF) 분석을 실시하였다. 감염된 Vero 세포를 감염(약 10의 m.o.i.) 24시간 후에 PBS로 세척하였고, 실온에서 3분간 95%의 차가운 아세톤으로 고정하였다. 특이적인 항-PCV1 돼지 다중클론성 혈청(Allan G.et al., Vet. Mirobiol., 1999, 66:115-123)을 제1 항체로 사용하였다. IF 반응은 Tayloret al.(1990)에 의해 기재된 바와 같이 실시되었다.
PCV1 특이적 면역형광을 vCP1621로 감염된 세포 및 vCP1622로 감염된 세포에서 측정하였다. 결과에서는 기대한 바와 같이, vCP1621 및 vCP1622는 PCV1-특이적 산물을 발현시키는 것으로 나타났다. ALVAC 감염된 Vero 세포와 감염되지 않은 Vero 세포 모두에서 형광성이 측정되지 않았다.
실시예 8: CARBOPOL™974P를 가진 재조합 카나리폭스 바이러스의 제조
백신의 제조를 위해 재조합 카나리폭스 바이러스 vCP1614 및 vCP1615(실시예 6)를 카보머 용액과 혼합할 수 있다. 동일한 방식으로, 재조합 카나리폭스 바이러스 vCP1621 및 vCP1622(실시예 7)를 카보머 용액과 혼합할 수 있다. 본 발명에 따르는 돼지의 백신화에 사용된 카보머 성분은 BF Goodrich사에서 제조된 Carbopol™974P(분자량 #3,000,000)이다. 먼저, 1.5% Carbopol™974P 보존 용액은 염화나트룸 1 g/ℓ을 함유한 증류수에서 제조하였다. 보존 용액을 4 ㎎/㎖의 Carbopol™974P 용액을 제조하는 데 사용하였다. 이 보존 용액을 필요한 양의 생리수와 단일 단계 또는 여러 연속 단계로 혼합하여 각 단계에서 pH 값을 1N(그 이상의 농도)의 수산화 나트륨 용액으로 조정하여 7.3-7.4의 최종 pH값을 얻었다. 이 최종 Carbopol™974P 용액은 동결건조된 재조합 바이러스를 재조성하거나 농축된 재조합 바이러스 모액을 희석하기에 용이한 용액이다. 예를 들면 2 ㎖의 용량당 10e8 pfu를 함유하는 최종 바이러스 현탁액을 얻기 위해, 10e9 pfu/㎖ 보존 용액 0.1㎖를 상기 Carbopol™974P 4 ㎎/㎖의 사용에 용이한 용액 1.9 ㎖로 희석할 수 있다. 동일한 방식으로 Carbopol™974P 2 ㎎/㎖의 사용에 용이한 용액을 제조할수 있다.
실시예 9: 돼지의 면역전종 및 재접종
9.1 생후 1일령의 새끼 돼지의 면역접종
제왕절개로 유도된 0일된 새끼 돼지의 군을 분리시켜 놓았다. 새기 돼지를 2일째에 다양한 백신 용액으로 근육내 경로에 의해 면역접종시켰다. 재조합 바이러스 모액을 멸균 식염수(NaCl 0.9%)로 희석시켜서 백신 바이러스의 현탁액을 제조하였다. 바이러스 현탁액을 위한 적합한 범위는 106내지 1010범위이고 바람직하게는 약 1010으로 결정될 수 있다. 실시예 8에 기개된 바와 같이 Carbopol™974P의 용액과 혼합하여 백신 용액을 제조할 수도 있다.
새끼 돼지는 다음 중 하나로 면역접종된다:
재조합 바이러스 vCP1614(실시예 2);
재조합 바이러스 vCP1615(실시예 3);
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1614(4 ㎎/㎖ 용액); 또는
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1615(4 ㎎/㎖ 용액).
바이러스 현탁액은 1회 분량당 108플라크 형성 단위(pfu)를 함유한다. 각 바이러스 현탁액은 1 ㎖의 용량으로 근육내 경로로 투여한다. 근육내 주사는 목의 근육으로 투여된다.
바이러스 현탁액의 2회 주사는 실험 2일째와 4일째에 투여된다. 접종은 PCV-2 독성 균주의 배양물로부터 얻은 바이러스 현탁액을 비구강 투여에 의해 21일째에 실시하였다. 접종 후, 3주 동안 이유후 전신성 소모성 증후군의 특징적인 새끼 돼지의 임상적 징후를 감시하였다. 다음의 징후에 대해 점수를 매겼다.
직장 온도: 접종후 2주 동안 매일 조사한 후, 3주째 직장 온도를 2회 측정.
체중: 접종 직전에 돼지의 무게를 재고 재접종 후 처음 3주동안 주마다 무게를 쟀다.
혈액 샘플을 실험 2일, 14일, 21일, 28일, 35일, 및 42일째에 채취하여 바이러스 혈중 수치를 조사하고 항 PCV-2 특이적 항체의 타이터를 조사하였다.
부검: 42일째, 모든 생존하고 있는 새끼 돼지를 인도적으로 안락사시키고 특정 PMWS의 거시적 병변을 관찰하기 위해 부검하였다. 간, 림프절, 비장, 신장, 및 흉선으로부터 조직 샘플을 준비하여 특정 조직학적 병변을 관찰하였다.
9.2 생후 5-7주령의 새끼돼지의 면역접종
항 PCV-2 특이적 모계 항체가 없는 5-7주령의 새끼 돼지를 다양한 백신 용액으로 근육내 경로에 의해 면역접종하였다. 백신 바이러스 현탁액은 멸균 생리수(NaCl 0.9%)내에 재조합 바이러스물을 희석하여 제조하였다. 백신 용액은 재조합 바이러스 현탁액을 실시예 8에 기재된 바와 같이 Carbopol™974P 용액과 혼합하여 제조할 수도 있다.
새끼 돼지는 다음 중 하나로 면역 접종된다:
재조합 바이러스 vCP1614(실시예 2);
재조합 바이러스 vCP1615(실시예 3);
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1614(4 ㎎/㎖ 용액); 또는
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1615(4 ㎎/㎖ 용액)
바이러스 현탁액은 1회분량당 108플라크 형성 단위체(pfu)를 함유한다. 각 바이러스 현탁액은 2 ㎖의 용량으로 근육내 경로로 투여한다. 근육내 주사는 목의 근육으로 투여되는 것이다. 바이러스 현탁액의 2회 주사는 실험 0일째와 21일째에 투여된다. 접종은 PCV-2 독성 균주의 배양물로부터 얻은 바이러스 현탁액을 비구강 투여에 의해 35일째에 실시하였다. 접종 후, 8주 동안 이유 후 전신성 소모성 증후군의 특징적인 새끼 돼지의 임상적 징후를 감시하였다. 총 관찰 기간이 3주가 아니고 8주인 것을 제외하고 임상적 관찰은 실시예 9.1에 기재된 바와 동일하다.
부검은 재접종에 의해 죽은 돼지에 대해서는 실험 기간 내에 실시하고 생존한 돼지는 실험이 종료된 시점(97일째)에 실시하였다. 조직 샘플은 실시예 9.1에 기재된 바와 동일하다.
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청구의 범위
1. 돼지 써코바이러스 2에서 유래한 DNA를 포함하는 재조합 바이러스
2. 제1항에 있어서, 폭스바이러스인 재조합 바이러스.
3. 제2항에 있어서, 아비폭스 바이러스인 재조합 바이러스.
4. 제3항에 있어서, ALVAC인 재조합 바이러스.
5. 제4항에 있어서, 돼지 써코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 써코바이러스의 주요 캡사이드 단백질을 코딩하고 발현하는 재조합 바이러스.
6. 제4항에 있어서, 돼지 써코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 써코바이러스의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2)를 포함하는 재조합 바이러스.
7. 제4항에 있어서, 돼지 써코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 써코바이러스의 오픈 리딩 프레임 1(ORF1)을 포함하는 재조합 바이러스.
8. 제4항에 있어서, 돼지 써코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 써코바이러스의 오픈 리딩 프레임 1 및 2(ORF1 및 2)를 포함하는 재조합 바이러스.
9. 제4항에 있어서, vCP1614 또는 vCP1615인 재조합 바이러스.
10. 제1항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
11. 제5항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
12. 제6항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
13. 제7항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
14. 제8항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
15. 제9항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
16. 제11항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
17. 제12항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
18. 제13항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
19. 제14항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
20. 제15항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
[도 1a]
[도 1b]
[도 1c]
[도 2]
[도 3]
[도 4]
[도 5]
[도 6a]
[도 6b]
[도 6c]

Claims (15)

  1. PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염을 예방 또는 치료하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier), 부형제(excipient) 또는 매개체(vehicle)를 포함하는 백신 조성물을 조제하기 위한 PCV-2 면역원의 용도.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역원이 생균 약독화(live attenuated) PCV-2, 또는 불활성화 PCV-2, 또는 PCV-2 서브유닛 또는 그 단편, 또는 PCV-2의 서열, 단편 또는 에피토프를 함유하고 생체내 발현시키는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 PCV-2 면역원의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 PCV-2 균주가 Imp999, Imp1010, Imp1011-48121 또는 Imp1011-48285인 것을 특징으로 하는 PCV-2 면역원의 용도.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 PCV-2 균주가 균주 1103 또는 1121인 것을 특징으로 하는 PCV-2 면역원의 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역원이 아쥬번트와 함께 조제되는 것을 특징으로 하는 PCV-2 면역원의 용도.
  6. ECACC에 수탁번호 V00012710으로 기탁된 균주 1103의 배양균.
  7. ECACC에 수탁번호 V00012709로 기탁된 균주 1121의 배양균.
  8. 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매개체, 및 PCV-2 면역원을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 PCV-2 면역원이 균주 1103 면역원 또는 균주 1121 면역원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 PCV-2 면역원이 생균 약독화 PCV-2, 또는 불활성화 PCV-2, 또는 PCV-2 서브유닛 또는 그 단편, 또는 PCV-2의 서열, 단편 또는 에피토프를 함유하고 생체내 발현시키는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. SEQ ID NO: 6을 포함하는 DNA 단편.
  11. SEQ ID NO: 7을 포함하는 DNA 단편.
  12. PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방 또는 치료하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매개체를 포함하는 백신 조성물을 조제하기 위한 PCV-2 면역원의 용도로서,
    상기 백신 조성물은 암퇘지에게 교미 전에 적어도 1회 접종시키고, 바람직하게는 이어서 임신 기간중에, 바람직하게는 임신 후 약 6-8주째에, 및/또는 이어서 임신 말기에, 바람직하게는 임신 후 약 11-13주째에 투여하도록 계획되어 있는 PCV-2 면역원의 용도.
  13. PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방 또는 치료하기 위한 돼지의 백신 접종 방법으로서,
    약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매개체를 포함하는 백신 조성물을 암퇘지에게 교미 전에 적어도 1회 접종시키고, 바람직하게는 이어서 임신 기간중에, 바람직하게는 임신 후 약 6-8주째에, 및/또는 이어서 임신 말기에, 바람직하게는 임신 후 약 11-13주째에 투여하는 돼지의 백신 접종 방법.
  14. PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염 및/또는이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방 또는 치료하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매개체를 포함하는 백신 조성물을 조제하기 위한 PCV-2 면역원의 용도로서,
    상기 백신 조성물은 새끼 돼지에게 생후 제1주 또는 생후 제3주 이내, 바람직하게는 이어서 2 내지 4주 후에 추가자극(booster) 접종하도록 계획되어 있는 PCV-2 면역원의 용도.
  15. PCV-2와 관련된 돼지의 심근염 및/또는 유산 및/또는 자궁 내 감염 및/또는 이유 후 전신소모성 증후군 및 PCV-2와 관련된 다른 병리적 후유증을 예방 또는 치료하기 위한 돼지의 백신 접종 방법으로서,
    약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매개체를 포함하는 백신 조성물을 새끼 돼지에게 생후 제1주 또는 생후 제3주 이내, 바람직하게는 이어서 2 내지 4주 후에 추가자극 접종하여 투여하는 돼지의 백신 접종 방법.
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