MXPA02002208A - Prevencion de la miocarditis, aborto e infeccion intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino. - Google Patents

Abstract

Lo que se describe es un virus recombinante de viruela, tal como el virus de la viruela caracteristico de las aves, que contiene ADN externo del circovirus porcino (2). Lo que tambien se describe son composiciones inmunologicas que contienen al virus de viruela para inducir una respuesta inmunologica en un animal huesped al cual se le administra una composicion inmunologica. Tambien se describen metodos de tratamiento o prevencion de enfermedades provocado por el circovirus (29 porcino al administrar las composiciones inmunologicas de la invencion a un animal que necesita del tratamiento o que es susceptible a la infeccion por el circovirus porcino (2).

Description

Prevención de la miocarditis, aborto e infección intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino. Campo de la Invención La invención se refiere a métodos y/o composiciones para la prevención y/o tratamiento de la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2, asi como a las secuelas patológicas que incluyen pero no se limitan al síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete, y a métodos para la preparación de tales composiciones y a kit para la preparación de tales composiciones o para llevar a cabo tales métodos entre otros . Antecedentes de la Invención . El circovirus-2 porcino (PVC-2) se identificó recientemente como un agente que ha estado asociado consistentemente con el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete (PMWS) en poblaciones de cria de cerdos en diversas partes del mundo (Alian y colaboradores, Ellis y colaboradores, 1998) . Los aislados del PCV-2 obtenidos de cerdos infectados en diversos países son virtualmente idénticos genéticamente y son marcadamente diferentes del PCV(CCL33, PCV-1) que se identificó originalmente en los años 70 como un contaminante no citopático de la linea celular (PK/15) del riñon del cerdo (Meehan y colaboradores, 1998; Ref: 136447 Tischer y colaboradores, 1974) . Los cerdos con infecciones por PCV-2 inducidas experimentalmente o adquiridas naturalmente presentan una pérdida progresiva de peso, taquipnea, disnea, e ictericia (Alian y colaboradores, 1998; Alian y colaboradores, 1999; Ellis y colaboradores, 1998; Ellis y colaboradores, 1999). Los hallazgos patológicos principales que se han asociado directamente con el antigeno del PCV-2 incluyen linfadenopatia, neumonía intersticial, hepatitis y nefritis (Alian y colaboradores, 1998; Alian y colaboradores, 1999; Ellis y colaboradores, 1998; Ellis y colaboradores, 1999). Ver también O-A-99 18214, WO-A-00 01409, O-A-99 29717 Y WO-A-99 29871. El PCV-2 no se ha ligado hasta ahora directamente con el aborto o con lesiones en los cerdos fetales. Asi hasta ahora, no se ha propuesto atender el asunto de la miocarditis, y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2. Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado sorprendentemente que el PCV-2 es una agente provocador de miocarditis, aborto e infección intrauterina, asi como del síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete. Por definición, un inmunógeno de PCV-2 se pretende que abarque el PCV-2 vivo, atenuado o inactivado, o subunidades de PCV-2 obtenidas por una expresión in vi tro o por extracción, o fragmentos que comprenden al menos un epitope de interés, que se puede obtener con síntesis química o por expresión recombinante in vi tro, asi como vectores recombinantes que comprenden y expresan secuencia (s) in vivo o fragmento (s) o epitope (s) de PCV-2 como se describe aqui o como en los documentos citados o referenciados aqui. Una definición similar aplica para un inmunógeno de otro patógeno porcino como se describe aqui. Por definición, una composición inmunogénica obtiene una respuesta inmunogénica-local o sistémica. Una composición de vacuna obtiene una respuesta protectora local o sistémica. El término "composición inmunogénica" incluye una "composición de vacuna" (cuando el término anterior puede ser composición protectora) . Asi, un objeto de la invención puede ser proporcionar métodos y/o composiciones para la prevención y/o tratamiento de la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2, asi como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete, y/o secuelas patológicas que incluyen pero no se limitan al síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y, métodos para la formulación de tales composiciones (las composiciones pueden también incluir , _,____.:_* un inmunógeno del parvovirus porcino (PPV) ) y usos de un inmunógeno para formular tales composiciones. Otro objeto es también el uso de inmunógenos de PCV- 2 para preparar composiciones para la prevención y/o tratamiento de la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2. Otro objeto de la invención, es el aislamiento y caracterización de nuevas cepas de PCV-2 identificadas como 1103 (1103/1 P.2) y 1121 (1121/1 P.l) y sus usos para producir inmunógenos, asi como antigenos y anticuerpos para el diagnóstico, con relación a la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2, asi como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y/o secuencias patológicas asociadas con el mismo. La invención también proporciona la inoculación de cerdos hembras (por ejemplo, puercas, marranas jóvenes) con una composición que comprende un inmunógeno PCV-2 (al menos uno) , (cuya composición puede también incluir un inmunógeno del parvovirus porcino) antes de la cruza; y/o antes de la cubrición o monta, y/o durante la gestación (o preñez) ; y/o antes del periodo perinatal del parto de la marrana; y/o repetidamente durante la vida, para evitar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2; asi como el desgaste multisistémico posterior al destete y/u otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2 u obtener respuesta inmunogénica o protectora contra el PCV-2 con lo cual se evita el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y/o miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino y/u otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2. Ventajosamente, al menos una inoculación se hace antes de la cubrición o monta. También ventajosamente después de una inoculación a llevarse a cabo durante la gestación, por ejemplo a alrededor de la mitad de la gestación (cerca de 6-8 semanas de gestación) y/o a la mitad de la gestación (cera de 11-13 semanas de gestación) . Asi, un régimen ventajoso es una inoculación antes de la cubrición o monta y una inoculación de refuerzo durante la gestación. Y de alli en adelante puede haber reinoculación antes de cada porción de alimento y/o durante la gestación a la mitad de la gestación (cerca de 6-8 semanas de gestación) y/o al final de la gestación (cerca de 11-13 semanas de gestación) . Preferiblemente, la reinoculación puede ser durante la gestación. En otra modalidad preferida, los lechones, como los lechones de hembras vacunadas (por ejemplo inoculados como se discuten aqui), se inoculan dentro de la primeras semanas de vida, por ejemplo, la inoculación a la una y/o dos y/o tres y/o cuatro y/o cinco semanas de vida. Más preferiblemente, los lechones se inoculan primero dentro de la primera semana de vida o dentro del tercera semana de vida (por ejemplo, al momento del destete) . Aún más ventajosamente, a tales lechones se les aplica una inyección de refuerzo después de (2) a (4) semanas posteriores (después de inocularse por primera vez). Asi, a ambas progenies, asi como la cerda hembra (por ejemplo puerca, marrana joven) , se le pueden administrar composiciones de la invención y/o se pueden someter a la ejecución de los métodos de la invención. Asi, la invención abarca composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden inmunógenos de las cepas PCV-2 1103 y/o 1121, para evitar o tratar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino, asi como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2. Y la invención comprende además los usos del inmunógeno PCV-2 para formular una composición inmunogénica o de vacuna para evitar o tratar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino, de desgaste m» >J*» multisistémico posterior al destete y/o otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2. Todavía además, la invención comprende una composición de vacuna o inmunogénica para la prevención y/o tratamiento de la miocarditis, y/o aborto y/o infección intrauterina provocada por el PCV-2 y/o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete que comprende un portador aceptable farmacéutica o veterinariamente y/o vehículo y/o excipiente y/o adyuvante y un inmunógeno del PCV-2. La composición puede incluir adicionalmente, al menos un inmunógeno de al menos un patógeno adicional de los cerdos, por ejemplo: síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRS), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Bordetella brochiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusopathiae, pseudo rabia, cólera del cerdo, influenza porcina, y parvovirus porcino (PPV) . Asi, las composiciones basadas en el vector pueden incluir al menos un inmunógeno de al menos un patógeno adicional del cerdo, tal como un vector que expresa una secuencia de este patógeno, en donde el vector puede también ser el vector que expresa el inmunógeno PCV-2. El vector que expresa una secuencia PCV-2 puede comprender una secuencia o fragmento PCV-2; y la invención abarca las t_t ? - ••-• f fJliíiBlí - - ' - •*" - moléculas de ácido nucleico, vectores que la contienen composiciones que comprenden tales moléculas de ácido nucleico o productos de expresión del vector de tales moléculas de ácido nucleico, composiciones que comprenden 5 tales productos de expresión, sondas o cebadores para tales moléculas de ácido nucleico y métodos para elaborar y usar cualquiera o todos los anteriores. El vector puede comprender un plásmido vector de ADN, una bacteria tal como una E. coli, un virus tal como 10 el baculovirus, un virus del herpes que incluye virus del herpes de cerdos, incluyendo el virus de la enfermedad Aujezky, un adenovirus que incluye un adenovirus porcino, un virus de erupciones pustulosas, incluyendo un virus de vacuna, un virus de la viruela característico de las 15 aves, un virus de la viruela del canario, un virus de la viruela del mapache, y un virus de la viruela del cerdo y similares. Las composiciones basadas en el vector pueden comprender un vector que contiene y expresa un ORF seleccionado del grupo que consiste de los ORF 1 al 13, 20 tal como un ORF seleccionado de los ORF 4, 7, 10 y 13; preferiblemente los ORF 4 y/o 13, de un PCV-2, ventajosamente de cualquiera de la cepas de PCV-2 aqui identificadas y en particular de las cepas 1103 y 1121. Y el inmunógeno en las composiciones (ya sea PCV-2 y/o de ^át aa-^-otro patógeno del cerdo) se puede producir recombinantemente . La palabra plásmido, pretende incluir cualquier unidad de la transcripción de ADN en la forma de una secuencia de polinucleótido que comprende la secuencia PCV a ser expresada. Ventajosamente, el plásmido incluye los elementos necesarios para su expresión, por ejemplo, expresión in vivo. La forma de plásmido circular, en sobre espiral o de otra manera, es ventajosa y la forma lineal también se incluye dentro del alcance de la invención. El plásmido inmunogénico o la composición de vacuna se pueden administrar por medio de una pistola de genes intradermalmente por medio de un inyector Ubre de aguja, subcutáneamente o intramuscularmente o por via mucosa, o por cualquier otro medio que permita la expresión in vivo, y ventajosamente una respuesta protectora o inmunogénica. Se observa que el producto de expresión generado por los vectores o recombinantes en esta invención, puede también aislarse opcionalmente y/o purificarse de células infectadas o transfectadas; por ejemplo, para preparar composiciones para la administración a cerdos; sin embargo en ciertos casos, puede ser ventajoso no aislar y/o purificar un producto de expresión de una célula; por ejemplo, cuando la célula o porciones de la misma «..J-!*» enriquecen el efecto inmunogénico del polipéptido. Y, se conocen técnicas para la purificación de proteínas y/o aislamiento y se pueden usar, sin experimentación indebida, para purificar y/o aislar los productos de expresión recombinantes o del vector y/o subunidades del PCV-2 y/u otros patógenos del cerdo en la práctica de la invención; tales técnicas en general pueden incluir: precipitación por el aprovechamiento de la solubilidad de la proteina de interés a concentraciones variables de sal, precipitación con solventes orgánicos, polímeros y otros materiales, precipitación de afinidad y desnaturalización selectiva, cromatografia en columna, incluyendo cromatografia liquida de alto desempaño (HPLC) , intercambio de iones, afinidad, inmunoafinidad o cromatografia ligando-pigmento; inmunoprecipitación, filtración por gel, métodos electroforéticos, ultrafiltración y focalización isoeléctrica, y sus combinaciones, entre otros. La invención vislumbra además métodos para la prevención y/o tratamiento, de la infección intrauterina y/o aborto y/o miocarditis provocada por el circovirus-2 porcino (PCV-2)y o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y/u otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2 que comprende inducir una respuesta inmunogénica o protectora contra el PCV-2 en un cerdo, que comprende administrar el cerdo una composición aqui descrita o antes mencionada. Asi, la invención comprende un método para la prevención y/o tratamiento del la infección intrauterina y/o aborto y/o miocarditis provocada por el circovirus-2 (PCV-2) y/o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y/u otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2, que comprende inducir una respuesta protectora o inmunogénica contra el PCV-2 en un cerdo, que comprende administrar al cerdo una composición que comprende un portador o excipiente o vehículo farmacéutica y veterinariamente aceptable, con preferiblemente un adyuvante, y un agente activo que comprende un inmunógeno PCV-2. El método puede ser para la prevención de la infección intrauterina y/o aborto y/o miocarditis provocada por el PCV-2, que comprende administrar una composición que comprende un portador farmacéutica o veterinariamente y un inmunógeno del PCV-2. El inmunógeno del PCV-2 puede ser un PCV-2 entero, vivo, atenuado o un PCV-2 inactivado. El método puede involucrar una composición que es una subunidad inmunogénica o composición de vacuna. El método puede involucrar adicionalmente una composición incluyendo al menos un inmunógeno de al menos un patógeno adicional de cerdo, incluyendo un vector que expresa tal inmunógeno o . . . __. . , . _ ,_. b,- t tj-L . , , « __*_U— i?.. i . . . .. . • ._ _.. __._*. i . «tt-if—-a-epitope, por ejemplo, el al menos patógeno adicional de cerdo se puede seleccionar del grupo que consiste de PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobaccillus pleuropneumoniae, E. coli, pseudorabia, cólera del cerdo, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, influenza del cerdo, y PPV y combinaciones de los mismos. El método puede involucrar un vector que es un plásmido de un vector de ADN, una bacteria tal como un E. coli, un virus tal como el Baculovirus, un virus del herpes incluyendo el virus de la enfermedad de Aujeszky, un adenovirus que incluye un adenovirus porcino, un virus de erupciones pustulosas, incluyendo un virus de vacuna, un virus de la viruela característico de las aves un virus de la viruela del canario, un virus de la viruela del cerdo y similares. El método puede involucrar una composición basada en el vector que incluye adicionalmente una secuencia, fragmento o epitope, de al menos un patógeno adicional del cerdo, o un vector que expresa tal secuencia, fragmento o epitope, en donde el vector puede ser el vector que expresa la secuencia PCV-2, fragmento o epitope. El método puede involucrar un vector que contiene y expresa un ORF seleccionado del grupo que consiste de los ORF 1 a 13; por ejemplo, un ORF seleccionado de los ORF 4, 7, 10 y 13; preferiblemente los ORF 4 y/o 13. El método puede también involucrar una composición basada en un inmunógeno en donde uno o más de los inmunógenos se produce recombinantemente. En este método, las hembras y/o lechones se inoculan preferiblemente como se describe arriba. En otra modalidad, la invención involucra un método para la preparación de cualquiera de las composiciones descritas o antes mencionadas, que comprende mezclar el portador farmacéutica o veterinariamente aceptable y posiblemente el adyuvante, y el inmunógeno PCV-2. El método puede además incluir la transfección o infección de una célula o huésped con un vector recombinante que contiene ADN que codifica un inmunógeno PCV-2 y expresa ese inmunógeno; y purificar y/o aislar opcionalmente al inmunógeno de la célula. Similarmente, el método puede incluir ei aislamiento y/o purificación de un inmunógeno PCV-2 del PCV-2, o aislar el PCV-2 de una muestra. La invención también proporciona un kit para la preparación de cualquiera de las composiciones aqui descritas o antes mencionadas o para llevar a cabo cualquiera de los métodos aqui descritos o antes mencionados que comprende en un primer recipiente, al portador farmacéutica o veterinariamente aceptable o un vehículo o excipiente, y en un segundo recipiente el agente activo que comprende al inmunógeno PCV-2, en donde el primero y segundo recipientes se empacan opcionalmente juntos y el kit incluye opcionalmente instrucciones para la mezcla de los ingredientes de la composición y/o administración de la composición. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona la administración de cualquiera de las composiciones antes mencionadas y aqui descritas a cerdos machos y/o hembras, para evitar la transmisión del PCV-2 y evitar o tratar o controlar la infección intrauterina y/o miocarditis y/o aborto asociado con el circovirus-2 porcino, asi como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2. La administración se hace preferiblemente como se describe arriba. El término "comprende" en esta descripción, puede significar "incluye'O puede tener el significado comúnmente dado al término "comprende" en la Ley de patentes de los Estados Unidos. Otros aspectos de la invención se describen o están en forma obvia de la siguiente descripción (y dentro del ámbito de la invención) . Descripción detallada de la Invención El circovirus-2 porcino (PCV-2) es un agente asociado con el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete (PMWS) en poblaciones de cerdos.

Como se muestra en los ejemplos 1 y 2, el espectro potencial de la enfermedad asociado con el PCV-2, se expande por la evidencia de la transmisión vertical y la falla reproductiva asociada. En particular, el ejemplo 1 muestra que el PCV-2 se aisla de una carnada de lechones abortados de una granja que experimenta abortos tardíos y partos de fetos muertos. La miocarditis difusa severa se presenta en un lechón, asociada con la tinción inmunohistoquimica ampliada del antigeno PCV-2. También están presentes cantidades variables del antigeno PCV-2 en el higado, pulmón, y riñon de los fetos múltiples. No se pudo establecer la presencia de otros agentes que se han asociado con lesiones fetales y el aborto en cerdos, que incluyen el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio reproductor porcino, virus de la encefalomiocarditis, y enterovirus. Más en particular, el ejemplo 2 muestra que los tejidos obtenidos de 30 manadas altamente saludables durante un periodo de 4 años, y probado en casos de rutina de aborto o falla en la reproducción, fueron positivas para el PCV-2 en dos remisiones que involucraban varios lechones de parto muerto y neonatos no viables, que presentaban miocarditis severa difusa, hipertrofia cardiaca y evidencia de una congestión pasiva crónica. Las dos remisiones positivas fueron de la misma granja, pero se presentaron en dos tiempos diferentes. La presencia del PCV-2 en los corazones y otros tejidos de los lechones afectados se confirmó por inmunohistoquimica y aislamiento del virus. La falla para detectar el circovirus porcino en los casos de falla reproductora antes de 1999 en áreas de la infección endémicas, soporta la visión de que la enfermedad reproductora es una nueva manifestación clínica de la infecciór por PC -2, y sugiere además que los modos de trasmisión sexual, asi como vertical son responsables de la diseminación viral en la población de cerdos. De esta manera, la inoculación de cerdos, por ejemplo cerdas hembra tales como, puercas o marranas jóvenes, con una composición que incluye al menos un inmunógeno PCV-2 (por ejemplo de al menos una cepa elegida entre la cepas Imp 1008, Imp 1010, Imp 999, Imp 1011-48285, Imp 1011-48121, 1103 y 1121) (cuya composición puede también incluir al menos un inmunógeno de al menos otro patógeno porcino tal como al menos parvovirus porcino, en donde cuando se usa el vector, el vector puede co-expresar los inmunógenos PCV-2 y el al menos un inmunógeno de al menos otro patógeno porcino, por ejemplo, el inmunógeno de PPV entre otros) , en particular, en un programa de inmunización como se describe arriba se puede evitar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2, asi como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuencias patológicas asociadas con el 5 PCV-2. Asi, la invención involucra métodos y composiciones que usan al inmunógeno PCV-2 para evitar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino, asi como el síndrome de desgaste 10 multisistémico posterior al destete y otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2. En particular, el inmunógeno de la cepa 1103 y/o cepa 1121 son útiles para los métodos y composiciones que usan el inmunógeno de PCV-2 para evitar la miocarditis y/o aborto y/o infección 15 intrauterina asociada con el circovirus-2 porcino. La invención también involucra el uso de cualquier cepa conocida de PCV-2 ó inmunógeno de la misma para formular una composición de vacuna o inmunogénica para evitar o tratar la miocarditis y/o aborto y/o infección 20 intrauterina asociada con el PCV-2, asi como el síndrome multisistémico posterior al destete y otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2 (estas cepas incluyen las cepas Imp 1008, Imp 1010, Imp 999, Imp 1011-48285, Imp 1010-48121, 1103 y -1121), en particular cuando la 25 composición se pretende administrar a lechones tales como _. fajt^^^..£^ ^^fc&.- . .„> . . -- - . ...— _. ; ,.«£-a ? .», lechones de hembras vacunadas, más particularmente a puercas hembras, en particular a hembras preñadas o hembras que se someterán a darle alimento; y más particularmente según los esquemas de inoculación arriba definidos. Más particularmente, el uso es formular tales composiciones pretendidas para evitar o tratar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2, en particular cuando la composición se pretende administrar a lechones tales como lechones de hembras vacunadas y más particularmente a puercas hembras, en particular a hembras preñadas o hembras que se someterán a la cubrición o monta; y más particularmente según los esquemas de inoculación arriba definidos. En al menos un inmunógeno de al menos otro patógeno porcino, puede ser como el que usa en vacunas porcinas conocidas o composiciones inmunogénicas o como en WO 98/03658. Las composiciones para su uso en la invención se pueden preparar por las técnicas estándar bien conocidas por aquellos con habilidad en el arte veterinario o farmacéutico. Tales composiciones se pueden administrar en dosis y por técnicas bien conocidas por aquellos con habilidad en las artes veterinarias, tomando en cuenta factores como la edad, sexo, peso, condición y tratamiento particular del cerdo y la via de administración. Las composiciones se pueden administrar solas, o se pueden co-administrar o administrar 5 secuencialmente con otras composiciones de la invención (por ejemplo, otras composiciones que comprenden el inmunógeno PCV-2) o con otras composiciones profilácticas o terapéuticas (por ejemplo, otras composiciones de vacunas o inmunogénicas porcinas). Asi, la invención 10 también proporciona composiciones de combinación o "de cóctel" o multivalentes y métodos para emplearla. A este respecto, se hace referencia a la patente U.S. número 5,843,456 dirigida a composiciones de la rabia y composiciones de combinación y usos de las mismas. 15 Las composiciones de la invención se pueden usar para administración parenteral o mucosa, preferiblemente por vias intradermales o intramusculares. En particular para la via intradermal, se puede hacer la inyección usando un inyector sin aguja. Cuando se usa la 20 administración mucosa, es posible usar vias orales, nasales u oculares. En tales composiciones, los inmunógenos pueden estar en una mezcla con un portador apropiado, diluyente o excipiente tal como agua estéril, solución salina 25 fisiológica, glucosa o similares, y/o preferiblemente con A^ . ^ A & i^Ü==É un adyuvante. Las composiciones pueden también estar liofilizadas o congeladas. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares tales como agentes amortiguadores del pH, adyuvantes, conservadores, excipientes de polímeros usados para vias mucosas y similares dependiendo de la via de administración y la preparación deseada. Los textos estándar tal como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", edición 17 de 1985, se pueden consultar para preparar preparaciones apropiadas sin experimentación indebida. Las dosis apropiadas también se pueden basar en este texto y los documentos alli citados.

Los adyuvantes son substancias que enriquecen la respuesta inmune a los inmunógenos. Los adyuvantes pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, emulsión agua en aceite, emulsión aceite en agua, emulsión agua en aceite y en agua. La emulsión se puede basar en particular en aceite de parafina liquida ligera (tipo Farmacopea Europea) ; aceite de isoprenoides tal como el escualano o el escualeno; aceite que resulta de la oligomerización de alquenos, en particular del isobuteno o deceno; esteres de ácidos ó de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceite de plantas, oleato de etilo, di (caprilato/caprato) de propilenglicol, tri (caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; esteres de ácidos o alcoholes grasos ramificados, en particular esteres de ácidos isoesteáricos . El aceite se usa en combinación con emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes son preferiblemente tensoactivos no iónicos en particular esteres de sorbitan de derivados del manitol (por ejemplo, oleato de anhidromanitol) , de gliceroi, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico ó hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic®, especialmente L121. ver Hunter y colaboradores, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.). John Willey and Sons, NY, pp 51-94 (1995) y Todd y colaboradores, Vaccine 15:564-570 (1997) . Por ejemplo, es posible usar la emulsión STP descrita en la página 147 DE "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press. 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro. Por ejemplo, la vacuna que contiene adyuvante se prepara de la manera siguiente: 67% v/v de fase acuosa que comprende el inmunógeno se emulsifica en 2.3% p/v de oleato de anhidromanitol, 2.6 % p/v de ácido nucleico etoxilado con EO 11 (óxido de etileno) y 28.1 % v/v de aceite de parafina liquida ligero (tipo Farmacopea Europea) con la ayuda de un turbomezclador emulsificante. 5 Un método alternativo para la preparación de la emulsión consiste de la emulsificación, por pasos a través de un homogenizador de alta presión, de una mezcla de escualano 5% v/v , Pluronic® L121 2.5 % v/v, 0.2 v/v de un éster de ácido oieico y de anhidrosorbitol 10 etoxilado con EO 20, 92.3 % v/v de la fase acuosa que comprende al inmunógeno. También es posible formular un polimero sintético (por ejemplo homo- y copolimeros de ácido láctico y glicólico, que se han usado para producir microesferas 15 que encapsulan inmunógenos, ver Eldridge y colaboradores, Mol. Immunol. 28:287-294 (1993), por ejemplo microesferas biodegradables), con citosinas tales como la IL-2, y IL- 12 (ver por ejemplo, patente U.S. No. 5,334,379), y GMCSF, ventajosamente GMCSF porcino (factor estimulante 20 de la colonia de macrófagos de granulocitos; ver generalmente las patentes U.S. Nos. 4,999,291 y 5,461,663 Ver también Clark y colaboradores, Science 1978, 230:1229; Grant y colaboradores, Drugs, 1992, 53:516) entre otros. Ciertos adyuvantes pueden expresar in vivo 25 inmunógenos y/o epitopes; por ejemplo citosinas, GMCSF ( ^g¡j^g^j^^¡^gÉss &^^^i¿^^.^jA¿^^^ ver por ejemplo, Inumaru and Takamatsu, Immunol . Cell. Biol., 1995, 73:474-76 que se refieren a un plásmido que codifica y expresa GM-CSF porcino) . Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido de los polímeros de ácido acrilico o metacrilico y los copolimeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrilico o metacrilico que están reticulados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, No. 2, junio 1996) . Las personas habilitadas en el arte se pueden referir también a la patente U.S. No. 2,909,462 que describe tales polímeros acrilicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos se reemplazan por radicales alifáticos, saturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos, y otros grupos etilénicamente no saturados. Los radicales no saturados pueden contener en si mismos otros sustituyentes tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente adecuados. Se reticulan con una sacarosa de alilo o con pentaeritritol de alilo. Entre ellos, debe mencionarse el Carbopol® entre los copolimeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, los copolimeros EMA® (Monsanto) son copolimeros del anhídrido maleico y el etileno; lineales o reticulados, por ejemplo reticulados con éter de divinilo se prefieren. Se hace referencia a J. Fields y colaboradores, Nature, 186: 778-780, 4 junio 1960. Desde el punto de vista de su estructura, los 10 polímeros de ácido acrilico o metacrilico y los copolimeros EMA® se forman preferiblemente de unidades básicas de la fórmula siguiente: Ri R2 en la cual Ri y R2 son idénticos o diferentes, representan H o CH3: 20 X=0 ó 1, preferiblemente X=l; y Y= 1 ó 2, con X+Y= 2. Para los copolimeros EMA®, X=0 y Y=2. para los carbómeros, X=Y=1. La disolución de estos polímeros en agua, conduce a 25 una solución acida que se neutralizará, preferiblemente hasta un pH fisiológico con objeto de dar la solución adyuvante dentro de la cual la composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna misma se incorporará. Los grupos carboxilo del polimero están entonces parcialmente en la forma COO". Preferiblemente, una solución de un adyuvante de conformidad con la invención especialmente de un carbómero, se prepara en agua destilada, preferiblemente en presencia de cloruro de sodio, la solución obtenida tiene un pH ácido. Esta solución de materias primas se diluye al agregarle la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada) o una parte substancial de la misma, de agua cargada con NaCl, preferiblemente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l) todo a la vez en diversas porciones con neutralización concomitante o subsecuente (pH 7.3 a 7.4), preferiblemente con NaOH. Esta solución a un pH fisiológico se usará como es, para mezclado con la vacuna que puede almacenarse especialmente en forma congelada o liquida secada por congelación. La concentración de polimero en la concentración final de la vacuna puede ser 0.01 % a 2% p/v, por ejemplo 0.06 a 1% p/v , tal como 0.1 a 0.6 % p/v. De esta descripción y del conocimiento en el arte, el técnico habilitado puede seleccionar un adyuvante apropiado, si se desea, y la cantidad del mismo para emplear una composición de vacuna o inmunogénica, inmunológica, de conformidad con la invención sin experimentación indebida. 5 Las composiciones de vacuna inmunogénicas de conformidad con la invención se pueden asociar con al menos una subunidad de vacuna, inactivada, atenuada viva, o una vacuna recombinante (por ejemplo virus de erupciones pustulosas como un vector o un plásmido de 10 ADN) que exprese al menos un inmunógeno o epitope de interés desde al menos otro patógeno de cerdo. Las composiciones para diversas vias de administración se vislumbran por la invención y nuevamente la dosis efectiva y via de administración se 15 determinan por factores conocidos tales como edad, sexo, peso y otros procedimientos de selección que se conocen y no requieren experimentación indebida. Las dosis de tales agentes activos pueden ser como se mencionan aqui en los documentos y/o pueden estar en el intervalo desde una o 20 unas cuantas hasta unos cuantos cientos o miles de microgramos, por ejemplo 1 µg a 1 mg, para una subunidad de una composición de vacuna inmunogénica; y 104 a 1010 TCID50 ventajosamente 106 a 108 TCID50 para una composición de vacuna o inmunogénica inactivada (inactivación antes 25 de la titulación) . Para una composición de vacuna o ¿^^£^2^*^^ inmunogénica o atenuada viva, la dosis puede estar entre 101 y 108 TCID50 ventajosamente 103 y 106 TCID50. Los vectores o recombinantes se pueden administrar en una cantidad apropiada para obtener una expresión in vivo que corresponde a las dosis aqui descritas y/o en los documentos aqui citados. Por ejemplo los intervalos apropiados para suspensiones virales se pueden determinar empíricamente. El vector viral o recombinante en la invención se puede administrar a un cerdo o infectarse o transfectarse dentro de células en la cantidad de alrededor de 103 pfu; más preferiblemente de 104 pfu hasta 1010 pfu, por ejemplo alrededor 105 pfu hasta alrededor de 109 pfu, por ejemplo alrededor de 106 pfu hasta alrededor de 108 pfu por dosis, por ejemplo de alrededor de 2ml . Y si más de un producto de gen se expresa por más de un recombinante, cada recombinante se puede administrar en estas cantidades; o cada recombinante se puede administrar tal que haya en combinación, una suma de recombmantes que comprenden estas cantidades. En las composiciones de plásmidos empleadas en la invención, las dosis pueden ser como se describen en los documentos ahi citados o como se describen aqui. Por ejemplo, las cantidades apropiadas de plásmido en composiciones de plásmido pueden ser 1 µg a 2mg, preferiblemente 50 µg hasta 1 mg. Los documentos aqui citados referentes a los vectores de plásmido de ADN se pueden consultar por el técnico habilitado para asegurar otras dosis apropiadas para las composiciones del vector plásmido de ADN de la invención sin experimentación indebida. Sin embargo, la dosis de la(s) composición (es) , concentración de componentes en ellas y tiempo de administración de la(s) composición (es) , que obtienen una respuesta inmunogénica apropiada, se pueden determinar por métodos tales como titulaciones de suero y de anticuerpos, por ejemplo por ELISA y/o un análisis de ensayo de seroneutralización y/o por una evaluación de la aplicación de pruebas inmunogénicas en la vacunación en cerdos. Tales determinaciones no requieren experimentación indebida a partir del conocimiento dei técnico habilitado, esta descripción y los documentos solicitados. Y, el tiempo para las administraciones en secuencia puede similarmente determinarse con métodos determinables de esta descripción, y el conocimiento en el arte sin experimentación indebida. El inmunógeno PCV-2 se puede obtener del PCV-2 o se puede obtener de una expresión recombinante in vitro de los genes PCV-2 o epitopes de los mismos. Los métodos para hacer y utilizar vectores (o recombinantes) para la expresión, pueden ser análogos a los métodos descritos en: patentes U.S. Nos. 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 5,756,103, 5,766,599, 6,004,777, 5,990,091, 6,033,904, 5,869,312, 5,382,425, publicaciones PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update" PNAS USA 93:11349-11353, Octubre 1996, Moss "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93:11341-11348, Octubre 1996, Smith y colaboradores, U.S. Patent No. 4,745,051 (recombinant baculovirus), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith y colaboradores, "Production of Human Beta Inferieron in Insect Cell Infected with a Baculovirus Expression Vector," Molecular and Cellular Biology, Dic, 1983, Vol.3 , No. 12, p. 2156-2165; Pennock y colaboradores, "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406; EPA 0 370 573, solicitud de patente U.S. Serial No. 920,197, presentada en Octubre 16, 1986, publicación de patente EP NO. 265785, patente U.S. No. 4,769,331 (recombinant herpesvirus), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, octubre 1996, Andreansky y colaboradores, "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93:11313-11318, octubre 1996, Robertson y colaboradores, "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes, " PNAS USA 93:11334-11340, octubre 1996, Frolov y colaboradores, "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93:11371-11377, octubre 1996, Kitson y colaboradores, J. Virol. 65,3068-3075, 1991; patentes U.S. Nos. 5,591,439, 5,552,143, WO 98/00166, solicitudes de patente concedidas U.S. Nos. 08/675,556, and 08/675,566 ambas presentadas en julio 3, 1996 (recombinant adenovirus) , Grunhaus y colaboradores, "Adenovirus as cloning vectors, "Seminars in Virology (Vol.3) p. 237-52, 1993, Ballay y colaboradores, EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril, 1990, Prevec y colaboradores, J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT WO 91/11525, Felgner y colaboradores, (1994), J. Bio. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 y McClements y colaboradores, "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces a«5&¡> protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2, disease," PNAS USA 93:11414-11420, octubre 1996, y patentes U.S. Nos. 5,591,639, 5,589,466, y 5,580,859, asi como WO-A-990 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797, WO-A-95 11307, WO-A-95 20660, Tang y colaboradores, Nature 356, 152-154, 1992, y Furth y colaboradores, Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992, relacionada con vectores de expresión de ADN, entre otros. Ver también WO98/33510; Ju y colaboradores, Diabetologia, 41:736-739, 1998 (sistema de expresión lentiviral) ; Sanford y colaboradores, patente U.S. No. 4,945,050; Fischbach y colaboradores, (Intracel), WO 90/01543; Robinson y colaboradores, seminarios en IMMUNOLOGY, vol. 9, pp. 271-283 (1997) (sistemas vectores de ADN); Szoka y colaboradores, patente U.S. No. 4,394,448 (método de inserción de ADN dentro de células vivas) ; McCormick y colaboradores, patente U.S. No. 5,677,178 (uso de virus citopáticos) ; y patente U.S. No. 5,928,913 (Vectores para entrega de genes), asi como otros documentos aqui citados. El vector viral por ejemplo, seleccionado del virus del herpes de los cerdos, tal como el virus de la enfermedad de Aujesky, adenovirus porcino, virus de erupciones pustulosas, especialmente virus de vacuna, virus de la viruela característico de las aves, virus de la viruela del canario y virus de la viruela de los cerdos, asi como vectores de ADN (plásmidos de ADN) son ventajosamente empleados en la práctica de la invención. Los productos de expresión de los genes PCV-2 o porciones de los mismos pueden ser útiles para generar 5 anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales o policlonales que son útiles para propósitos de diagnóstico. Similarmente, los productos de expresión de los genes PCV-2 o porciones de los mismos pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. 10 Además, alguien con habilidad en el arte, puede determinar un epitope de interés en un inmunógeno PCV-2, o en un inmunógeno de otro patógeno porcino, sin experimentación indebida, a partir de la descripción de aqui y el conocimiento en el arte, ver por ejemplo WO 15 98/40500, referente a la información general para determinar un epitope de interés o una región epitópica de una proteina entre otras. De conformidad con la invención, las composiciones de vacuna o inmunogénicas ventajosas son: una composición 20 de vacuna o inmunogénica recolectada de un cultivo de células in vi tro que ha sido infectado con una preparación purificada de PCV-2, tal como una preparación purificada de circovirus porcino seleccionado del grupo que consiste de las preparaciones depositadas en el ECACC 25 (Colección Europea de Cultivos de Células, Centro para la Microbiología Aplicada e Investigación, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK) , bajo las siguientes referencias: Número de acceso V97100219 (cepa Imp.1008), No. V97100218 (cepa Imp. 1010) y número de acceso V97100217 (cepa Imp.999) depositada el 2 de Octubre 1997, número de acceso V98011608 (cepa Imp. 1011-48285) y No. V98011609 (cepa Imp. 1011-48121) depositada el 16 de Enero 1998, número de acceso 00012710 (cepa 1103) y No. 00012709 (cepa 1121) depositada el 2 de Febrero 2000, o una composición de vacuna o inmunogénica que comprende un circovirus porcino, producido y aislado de cultivos celulares in vi tro, estas células han sido infectadas con un circovirus porcino capaz de aislarse a partir de una muestra fisiológica o de una muestra de tejidos, especialmente lesiones, a partir de un cerdo que tiene un síndrome PMWS, por ejemplo, tal composición en donde el circovirus porcino se produce de, y se aisla de una linea celular de riñon de cerdo, por ejemplo, producida de y aislada de células PK/15 libres de contaminación con PCV-1; o tal composición que comprende o se prepara de un extracto de cultivo o sobrenadante, recolectado de un cultivo celular in vi tro que se ha infectado con tal circovirus. Asi, el circovirus porcino puede ser un inmunógeno. Por ejemplo, la composición de vacuna o inmunogénica puede comprender el inmunógeno completo US-- ¿ atenuado vivo (por ejemplo, virus), ventajosamente en un vehículo o diluyente farmacéutica o veterinariamente aceptable y opcionalmente, un adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable, asi como opcionalmente, un estabilizador de secado por congelación. El inmunógeno (por ejemplo, virus) se puede inactivar y la composición de vacuna o inmunogénica puede adicionalmente y/u opcionalmente comprender, un vehículo o diluyente veterinaria o farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante veterinaria o farmacéuticamente aceptable. La composición de vacuna o inmunogénica puede comprender inmunógenos PCV-2 y/o inmunógenos de diversos circovirus porcinos (incluyendo PCV-2 o diversas cepas de PCV-2 e incluyendo PCV-1), asi como inmunógenos adicionales opcionalmente de otro patógeno del cerdo, por ejemplo PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Pseudorabia, cólera de los cerdos, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Influenza de los cerdos, PPV (ver también WO-A-00 01409) . Para la producción de preparaciones antigénicas del circovirus, los circovirus pueden obtenerse después de un paso sobre las células, en particular lineas celulares por ejemplo células PK/15. Se pueden usar los sobrenadantes o extractos del cultivo, opcionalmente purificados por técnicas estándar. En el contexto del PCV atenuado, la atenuación se puede llevar a cabo según los métodos convencionales, por ejemplo, al pasar en las células, preferiblemente por el paso en células de cerdos, especialmente lineas celulares tales como células PK/15 (por ejemplo, desde 20 a 150, especialmente del orden de 40 a 100 pasos) . En el contexto de la vacuna inactivada, el PCV, con las fracciones que pueden estar presentes, se inactiva de conformidad con las técnicas conocidas por las personas hábiles en el arte. La inactivación se llevará a cabo preferiblemente por la via química por ejemplo, al exponer el antigeno a un agente químico tal como formaldehido (formalina), paraformaldehido, ß- propiolactona o etilenimina o sus derivados, y/o por tratamiento fisico. El método preferido de inactivación será aqui, la exposición a un agente químico y en particular a la etilenimina o a la ß-propiolactona. El inmunógeno en la vacuna o en la composición inmunogénica, se puede expresar a partir de un fragmento de ADN que contiene una secuencia de nucleótido PCV-2 o fragmento de la misma (ventajosamente codificando al menos un epitope) , por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de las secuencias designadas por las referencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, asi como la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, (figuras 1-4 y 6-7). El inmunógeno en la composición inmunogénica o de vacuna, se puede expresar de un fragmento de ADN que contiene un ORF seleccionado del grupo que consiste de los ORF 1 al 13, tal como el ORF 4, 7, 10 y 13, preferiblemente el ORF 4 y/o 13, de una cepa PCV-2 en particular de una de las cepas arriba identificadas (como se designan en WO-A-99 18214- ver también tabla 1 y posteriormente) . Asi, el inmunógeno o una porción del mismo tal como un epitope de interés, se puede obtener por la expresión in vi tro del mismo a partir de un recombinante o un vector. El inmunógeno puede además purificarse y/o concentrarse por métodos convencionales. El inmunógeno en la composición inmunogénica o de vacuna, se puede expresar in vivo por un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que contiene una secuencia de nucleótido de PCV-2 o fragmento de la misma (codificando ventajosamente al menos un epitope), por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de la secuencias designadas por las referencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, asi como la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, (figuras 1-4 y 6-7). Similarmente, el inmunógeno en la vacuna, composición inmunogénica o inmunológica se puede expresar in vivo por un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que contiene un ORF seleccionado del grupo que consiste de los ORF 1 a 13, tal como los ORF 4, 5 7, 10 y 13, preferiblemente los ORF 4 y/o 13, de una cepa PCV-2, en particular de una de las cepas arriba identificadas. Esto es, la composición inmunogénica o de vacuna puede comprender un vector de expresión que expresa el inmunógeno o una porción del mismo, por 10 ejemplo, un epitope de interés in vivo . El vector de expresión puede ser cualquier vector apropiado tal como un vector seleccionado de los plásmidos de ADN, bacterias tales como E. coli, virus tales como el baculovirus, virus del herpes, tal como el 15 virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus incluyendo el adenovirus porcino, virus de erupciones pustulosas, especialmente virus de vacuna, virus de la viruela característico de las aves, virus de la viruela del canario, y virus de la viruela del cerdo entre otros 20 (aquel con habilidad en el arte puede también referirse a las solicitudes U.S. de Audonnet y colaboradores, y Bublot y colaboradores, Nos. de serie 60/138,352 y 60/138, 478, respectivamente, ambas presentadas el 10 Junio 1999, en particular a la descripción detallada y 25 más particularmente a los ejemplos ("vacuna de ADN-PCV", y "vacuna del virus recombinante de erupciones pustulosas para el circovirus porcino", respectivamente anexadas como apéndices). De conformidad, la invención también comprende moléculas de ácido nucleico y vectores que las contienen, asi como los productos de expresión de las mismas, composiciones que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y/o vectores y/o productos de expresión, asi como métodos para elaborar y usar alguna o todas estas modalidades. La invención abarca aqui especialmente ORF y/o fragmentos que codifican un inmunógeno o epitope, asi como moléculas de ácido nucleico de las cepas 1103 y/o 1121 en particular sus ORF 1 al 13, tal como los ORF 4, 7, 10, y 13, preferiblemente los ORF 4 y/o 13 y fragmentos de los mismos, asi como vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, composiciones que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, vectores o productos de expresión de las mismas, composiciones que comprenden tales productos de expresión, cebadores o sondas para tales moléculas de ácido nucleico, y usos o métodos que involucran estas modalidades, por ejemplo, para la detección, diagnóstico, ensayo para PCV-2, para inducir una respuesta protectora o inmunogénica y similares.

Como se mencionó previamente, las modalidades de la invención pueden incluir anticuerpos. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales; por ejemplo, preparados a partir del circovirus arriba mencionado o de un polipéptido codificado por un fragmento de ADN que tiene una secuencia PCV-2, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 6, y 7, (figuras 1-4 y 6-7) o de un polipéptido de la expresión por un vector que comprende una secuencia PCV-2, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 6, y 7; o de un polipéptido de la expresión por un vector que comprende ADN incluyendo un ORF seleccionado del grupo que consiste de los ORF 1 al 13. El técnico habilitado puede usar las técnicas conocidas en el arte para obtener anticuerpos y generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos o antigenos se pueden usar en diagnóstico. La invención también abarca sondas o cebadores de las cepas PCV-2 1103 y/o 1121, que pueden ser útiles por ejemplo en la detección del ADN del PCV-2, en particular con respecto a la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina, asi como para la amplificación del ADN PCV-2, por ejemplo para preparar un vector de expresión. Una sonda o cebador puede ser cualquier extensión de al menos 8, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 12, 13, 14, ó 15, tal como al menos 20, por ejemplo, al menos 23 ó 25, por ejemplo al menos 27 ó 30 nucleótidos en el genoma del PCV-2 o un gen PCV-2 que es particular al PCV-2, y posiblemente a estas cepas, o que 5 están en PCV-2 y son al menos conservados entre el PCV o la familia de circovirus. En cuanto a la PCR o los cebadores o sondas de hibridación y las longitudes óptimas para los mismos, se hace también referencia a Kajimura y colaboradores, GATA 7(4):71-79 (1990). La 10 hibridación es ventajosamente bajo condiciones de alta severidad, como se entenderla el término "alta severidad" por aquellos con habilidad en el arte (ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15 Cold Spring Harbor, N.Y. y Hames and Higgins, eds., 1985, Nucleic Acid Hybridazation, IRL Press, Oxford, U.K.). La hibridación se entenderá que se lleva a cabo usando técnicas bien establecidas incluyendo pero no limitadas a la hibridación por manchado Southern. La hibridación por 20 manchado Northern, hibridación in situ y ventajosamente, la hibridación Southern a fragmentos de ADN amplificados por PCR. Como las sondas o los cebadores, los péptidos que no son proteínas PCV-2 de longitud completa, son parte de la 25 invención y pueden ser cualquier extensión de al menos 8, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 12, 13, 14, ó 15, tal como al menos 20, por ejemplo, al menos 23 ó 25, por ejemplo al menos 27 ó 30 aminoácidos en PCV-2 que son particulares al PCV-2 y posiblemente a estas cepas, o que están en PCV-2 y se conservan al menos entre el PSV y la familia de circovirus. Alternativamente o adicionalmente, los aminoácidos de la invención que son proteínas PCV-2 de longitud completa, pueden ser una región epitópica de una proteina PCV-2. Las secuencias de PCV-2 se describen en Meehan y colaboradores, 1998 (cepa Imp.1010; nucleótidos ORFl 398- 1342; nucleótidos ORF2 1381-314; y corresponden respectivamente al ORF4 y ORF13 en la terminología de la invención (ver tabla 1), en la solicitud U.S. número de serie 09/161,092 del 25 de Septiembre de 1998 y a COL4 y COL13 en WO-A-9918214 ) . Diversas cepas de PCV-2 y sus secuencias se describen aqui y se denominan Impl008, Imp999, ImplOll-48285, ImplOll-48121, 1103 y 1121. Otras cepas se describen en A.L. Hamel y colaboradores, J. Virol. Junio 1998, vol. 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) y en I . Morozov y colaboradores, J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol. 36, 9: 2535-2541, asi como GenBank AF086834, AF086835 y AF086836. Estas secuencias o los ORF de las mismas o regiones de las mismas que _^|fi .. ¡f ?_¿-jaja-á-iiAJS=ta ¡___;¿^ ^^£^^? ^^^¡^ codifican un antigeno o inmunógeno o epitope de interés, se pueden también usar en la práctica de esta invención.

La invención también abarca las secuencias equivalentes a aquellas usadas o mencionadas aqui, y en los documentos aqui citados; por ejemplo, las secuencias que son capaces de hibridizar a la secuencia de un nucleótido bajo condiciones de alta severidad (ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989). Entre las secuencias equivalentes, se pueden también mencionar los fragmentos de genes que conservan la inmunogenicidad de la secuencia completa por ejemplo un epitope de interés.

La homología entre el genoma entero de los tipos 1 y 2 del PCV es alrededor de 75%. Pero dentro del tipo 2, la homología es generalmente arriba de 95%. Asi, en la práctica de la invención, el uso de cualquier cepa PCV-2 se abarca por equivalencia. Un criterio puede ser que la cepa es de tipo 2, por ejemplo, que la homología al nivel de nucleótido del genoma entero es igual o mayor al 85%, ventajosamente 90% o superior, más ventajosamente 95% o superior, preferiblemente 97, 98 ó 99% o superior, con las cepas aqui descritas, por ejemplo, cepa ImplOlO. Los limites de los ORF de la cepa ImplOlO se dan en la siguiente tabla 1: Los ORF se definen con respecto a la cepa ImplOlO. La invención también abarca el uso de los ORF correspondientes en cualquier otra cepa PCV-2, y cualquiera de las cepas PCV-2 como se definen aqui o en los documentos citados en la presente. Asi, de la secuencia de nucleótido genómica, es arte de rutina Í ft.1_^^.i __tík^__?i____ t__.^. ,. ,^<J?aM ..?¡*_*_,_ *____,.lh. -fat-^t-WK determinar los ORF usando un paquete de cómputo estándar tal como el MacVector®. También, la alineación de los genomas con aquella de la cepa 1010 y la comparación con los ORF de la cepa 1010, permite que alguien con habilidad en el arte determine fácilmente los ORF en el genoma para otra cepa (por ejemplo, aquella descrita en WO-A-99 18214, es decir Impl008, ImplOll-48121, ImplOll- 48285, Imp999, asi como las cepas nuevas 1103 y 1121) . El uso de un paquete de cómputo o la elaboración de la alineación no es experimentación indebida y proporciona acceso directamente a estos ORF. Por ejemplo, con referencia a las figuras 6 y 7, los ORF correspondientes de las cepas 1103 y 1121 son como se dan en la siguiente tabla 2: *««-***-*-*» También equivalente y útil en la práctica de la invención, son las secuencias de nucleótidos que no cambian la funcionalidad ni la especificidad de la cepa (es decir, de la cepa de tipo 2) del gen considerado o de aquellos de los polipéptidos codificados por este gen.

Las secuencias que difieren a través de la degeneración del código son por supuesto incluidas en la práctica de la invención. Para el 0RF4, la homología entre el PCV-1 y PCV-2 es de alrededor de 86%, y para el 0RF13, la homología entre PCV-1 y PCV-2 es de alrededor del 66%. Asi, también las secuencias equivalentes son útiles en la práctica de la presente invención para el ORF4 , como son aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 88%, ventajosamente 90% o más, preferiblemente 92% ó 95% o mayor homología con el ORF4 de la cepa ImplOlO, y para el ORF13, aquellas secuencias que tienen una homología &..__.^ ^Efc^a^-a igual o superior al 80%, ventajosamente 85% o superior, preferiblemente 90% ó 95% o superior al ORF13 de la cepa ImplO10 (usando la terminología de la tabla 1). Para la homología referente a los otros ORF, se pueden determinar aquellas secuencias que vienen de una cepa de PCV que tiene un ORF4 y/o ORF13 que tiene una homología como se definió arriba con el ORF correspondiente de la cepa 1010. Para el ORF7, las secuencias útiles en la práctica de la invención, incluyen aquellas secuencias que tienen una homología que es ventajosamente igual a, o mayor al 80%, más ventajosamente 85% o más, preferiblemente 90% ó 95% o mayor con ORF7 de la cepa IMP1010. Para el ORF10, las secuencias útiles en la práctica de la invención incluyen aquellas secuencias que tienen una homología que es ventajosamente igual a o superior al 86%, más ventajosamente 90% o más, preferiblemente 95% o más con el ORF10 de la cepa ImplOlO (usando la terminología de la tabla 1) . También, Las secuencias equivalentes útiles en la práctica de la presente invención, para el ORF4 , son aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 88%, ventajosamente 90% o más, preferiblemente 92% ó 95% o más con el ORF4 de la cepa ImplOlO, y para el ORF13, son aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 80%, ventajosamente 85% o más, preferiblemente 90% ó 95% o más con el ORF13 de la cepa ImplOlO. El ORF4 y ORF13 tienen el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares predichos de 37.7 kD y 27.8 kD respectivamente. El ORF7 y ORF10 (corresponden a ORF3 y ORF4 en Meehan y colaboradores, 1998) tienen el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares predichos de 11.9 y 6.5 kD respectivamente. Las secuencias de estos ORF están también disponibles en el Genbank AF 055392. También se pueden incorporar en plásmidos y usarse de conformidad con la invención solos o en combinación por ejemplo, con ORF4 y/o ORF13. Los otros ORF 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 descritos en la tabla anterior (COL 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 en WO-A- 9918214), o regiones de los mismos, que codifican un antígeno o epítope de interés, se pueden usar en la práctica de esta invención, por ejemplo, solos o en combinación o de otra manera uno con el otro o con los ORF4 y/o 13 o regiones de los mismos que codifican antígenos o epítopes. Similarmente para homología, se puede determinar que hay secuencias equivalentes que vienen de una cepa PCV que tiene un ORF 13 y/o ORF4 que tiene una homología como se define arriba con el ORF correspondiente de la cepa 1010 como se define aquí o en Meehan y colaboradores, 1998. Para el 0RF7, una secuencia equivalente tiene homología con ese, que es ventajosamente por ejemplo, igual o mayor a 80% por ejemplo 85% o mayor, preferiblemente 90% ó 95% o mayor con el ORF7 de la cepa ImplOlO. Y para el ORF10, ventajosamente una secuencia equivalente tiene una homología que es igual o mayor al 86% ventajosamente 90% ó más, preferiblemente 95% mayor con el ORF10 de la cepa ImplOlO. La homología de la secuencia de nucleótidos se puede determinar usando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1998, y disponible en NCBI). Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a un nucleótido o secuencia de aminoácido, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre 2 secuencias. El porcentaje de la homología de secuencia puede calcularse como (Nref - N dif) *100/Nref, donde Ndlf es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinea y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Así, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una similitud de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC ( Eef = 8; Ndlf=2) .

Alternativa o adicionalmente, "homología" o "identidad", con respecto a las secuencias, se puede referir al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divida entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en donde la alineación de las dos secuencias se puede determinar de conformidad con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman, 1993 PNAS USA 80:726), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por espacio de 4, y el análisis apoyado por computadora y la interpretación de los datos de la secuencia incluyendo la alineación, se pueden llevar a cabo convenientemente usando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA. ) . Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracil (U) en la secuencia de ARN. Las secuencias de ARN dentro del alcance de la invención se pueden derivar de las secuencias de ADN, por timidina (T) en la secuencia de ADN que se considera igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN. »^^^ , ??á_ ».«*-k. ¿ i.M^.?^ t__tt£t_____ Adicional o alternativamente, la similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos o la homología se pueden determinar usando el programa BlastP (Altschul y colaboradores, Nucí. Acids Res. 25, 3389-3402) y disponible en NCBI. Las siguientes referencias proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de los residuos de aminoácidos de las 2 proteínas, y adicionalmente o alternativamente con respecto a la anterior, las enseñanzas en estas referencias se pueden usar para determinar la homología o identidad del porcentaje: Needleman SB y Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y Waterman MS, "Compapson of Bio-sequences, " Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS y Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees, "J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast and sensitive múltiple sequence alignment on a microcomputer, " CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive Httaá,»,.* J i *aitÍ4ÍkA.*»?k**»* -->».. *.. **~* ~s. - ,** -*-& s_ .^*,^J ¿ _ ¿?MJ_ *x& -*&&.. ~£__M4~_. j ?J __j múltiple sequence alignment through sequence weighínq, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res. , 22:4673-480 (1994); y Devereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucí. Acids Res. , 12: 387-395 (1984) . La invención comprende además los usos de un ínmunógeno PCV-2, ya sea solo o en combinación adicional con un inmunógeno de otro patógeno porcino para generar composiciones de conformidad con la invención, por ejemplo, mezclando los ingredientes; y la invención también comprende por lo tanto un kit en donde los componentes se contienen individualmente y opcionalmente los recipientes se empacan juntos para mezclas y/o administración, en donde el kit puede también incluir opcionalmente instrucciones para mezclas y/o administración. Aunque la invención se ha discutido en términos de administración de las composiciones de vacuna o inmunogénicas a cerdas hembras, que comprenden un inmunógeno de PCV-2, la invención puede también comprender, la administración de tales composiciones a las cerdas o marranas jóvenes y/o para jabalíes como se describe aquí; así, tanto la madre como la descendencia (por ejemplo cerdas adultas, marranas jóvenes) y los jabalíes se le pueden administrar las composiciones de la invención y/o pueden ser sujetos de la aplicación de los métodos de la invención. De esta manera, se pueden administrar composiciones a las poblaciones de cerdos de la invención y/o se pueden someter a la aplicación de los métodos de la invención. De conformidad con la presente invención, • las composiciones inmunogénicas y de vacuna pueden comprender inmunógenos desde más de 1 cepa PCV-2. Por ejemplo, es posible combinar inmunógeno de las cepas 1121 y 1103, de una o ambas de estas cepas con al menos una cepa aquí descrita o cualquier otra combinación. La presente invención proporciona métodos que permiten a alguien con habilidad en el arte, evaluar la eficacia de las vacunas contra el PCV-2. Un primer método es un método ELISA o con seroneutralización. Un segundo método es una vacunación seguida por la aplicación de una prueba inmunogénica con una cepa virulenta PCV-2, por ejemplo, una de las cepas aquí descritas. En otras palabras, la invención permite verificar los inmunógenos PCV, incluyendo inmunógenos PCV-1, capaces de obtener una respuesta inmunogénica o protectora contra el PCV-2. Tales inmunógenos PCV son entonces útiles para prevenir o tratar cerdos contra una miocarditis y/o aborto y/o intrauterina particular asociada con el PCV-2, asi como ^¿I??^kiijtJÍÍ,^^ contra el PMWS y otras secuelas patológicas asociadas con el mismo. Así, un aspecto de la invención es proporcionar composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden un inmunógeno PCV y capaz de obtener una respuesta protectora o inmunogénica contra el PCV-2. La invención se refiere también a métodos de inmunización o vacunación usando tal inmunógeno, así como al uso de tal inmunógeno para producir tal composición inmunogénica o de vacuna. La invención se debe además describir a manera del siguiente ejemplo y resultados, proporcionados como ilustración y no considerados como una limitación de la invención. La figura 1 detalla la SEQ ID NO: 1, la secuencia de ADN del PCV del genoma de la cepa Imp.1011-48121. La figura 2 detalla la SEQ ID NO: 2, la secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp.1011-48285. La figura 3 detalla la SEQ ID NO: 3, la secuencia de ADN del PCV del genoma de la cepa Imp.999. La figura 4 detalla la SEQ ID NO: 4, la secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp.1010. La figura 5 detalla la SEQ ID NO: 5, la secuencia de ADN del genoma de la cepa PK/15. La figura 6 detalla la SEQ ID NO: 6, la secuencia de ADN del genoma de la cepa 1103, aislada en Alberta Canadá, k significa (G) o t (T) , y e significa (C) o t (T) . Estas variaciones de secuencia se observaron en la población viral . La figura 7 detalla la SEQ ID NO: 7, la secuencia de ADN del genoma de la cepa 1121, aislada en Saskatoon Canadá . EJEMPLOS Y RESULTADOS EJEMPLO RESULTADO 1: MIOCARDITIS, ABORTO E INFECCIÓN INTRAUTERINA ASOCIADA CON EL PCV-2. Los abortos tardíos y partos de la marrana, con lechones momificados y de parto muerto, se presentaron en una instalación nueva de cría de cerdos con 450 cerdas hembras cuando se llevaron a producción. La pseudo preñez se observó también en diversas marranas jóvenes. Las marranas jóvenes recibieron dos dosis de una vacuna inactivada que contenía parvovirus e inmunógenos leptoespirales antes de la cruza. Una carnada recibió la examinación postmortem que consistía de nueve fetos que parecían haber muerto en diversas etapas de la gestación. Había 2 lechones momificados, 2 macerados, 3 autolisados y 2 frescos, de parto muerto. Se observaron lesiones en el examen patológico total solamente en un feto autolisado parcialmente. Ambos ventrículos del corazón se dilataron, se alargó el higado y se mantuvo firme y habla hidrotórax *jU _*?_?J__Adi_%~ *?*~__t . , __ ___!__.-.____.,___. _d_*.--?_¿__. rií¿_ . !¿¡ÉÍ. ?*Í y ascitos. Histopatológicamente, había áreas ampi-ias^ de degeneración del miocardio o necrosis con edema y fibrosis moderada, y una infiltración moderada difusa de linfocitos y macrófagos. Había una congestión hepática marcada generalizada y pérdida hepatocelular. El vaso y los ríñones estaban también congestionados. No se detectaron lesiones histológicas importantes en otros fetos . La tinción inmunohistoquímica para el PCV-2, se llevó a cabo como se describió previamente usando un antisuero policlonal de conejo y un anticuerpo monoclonal que se formuló contra el PCV-2, en la secciones de tejido alojado y procesado rutinariamente, fijado en formalina (Ellis y colaboradores, 1998; Ellis y colaboradores, 1999) . En el feto con cardiomiopatía dilatada había una tinción ampliada para el antígeno PCV-2 a través del miocardio afectado. La tinción fue más amplia en áreas de necrosis y parecía involucrar miocitos principalmente. Estaba presente la tinción nuclear y citoplásmica. Había una tinción amplia de fetos múltiples en el hígado. En algunas secciones, parecía involucrar principalmente el endotelio sinusoidal y las células Kupfer mientras que en otros fetos incluyendo aquel con miocarditis, había también una tinción nuclear y citoplásmica de hepatocitos. Las células teñidas positivamente, se __A<LÁJ**__í_ú. *» __-.~.. íniimi.MAltl.í irff rf f JÉJÜIM -irnTflttÜIr?il diseminaron a través del pulmón, y multifocalmente en el riñon. La reacción en cadena de la polimerasa para el PCV-2 se llevó a cabo como se describió previamente usando tejido congelado (Ellis y colaboradores, 1999). El producto PCR del tamaño esperado para el PCV-2 se amplificó del tejido fetal. El PCV-2 se aisló del feto con miocarditis y un acumulado de tejido de otros fetos en la carnada al inocular homogeneizados de tejido sobre las células PK-15 libres de PCV. Los tejidos fetales se examinaron también para otros patógenos vírales que se habían asociado con la lesión fetal y los abortos en la población de cerdos, incluyendo parvovirus porcino (PPV), virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV), encefalomiocarditis (EMCV) , y enterovirus. El antígeno PPV no se detectó por prueba de anticuerpos fluorescente (FAT) en las secciones congeladas de pulmón, hígado y bazo de los fetos de parto muerto o momificado. Los homogeneizados de hígado, pulmón y bazos de los fetos abortados se inocularon también en cultivos de células PK-15 libres de PCV, células de tubo falopiano porcino primario y células Vero. Los virus citopáticos no se detectaron después de 3 pasos. Los tejidos fueron negativos para PPV usando PCR. No se detectó el antígeno PRRSV por tinción inmunohistoquímica.

Así, hubieron lesiones fetales y de aborto directamente asociadas con el PCV-2. Estos resultados también muestran la transmisión vertical del virus. En un estudio previo, el PCV-1 se aisló de 2 de 160 fetos de cerdo examinado, implicando que este grupo de virus se puede transmitir verticalmente; sin embargo, el antígeno PCV-1 no se puede asociar con ninguna lesión en el tejido (Alian y colaboradores, 1995). La exclusión de otros agentes que se han asociado con lesiones fetales y aborto en poblaciones de cerdos, incluyendo, PPV (Bolt y colaboradores, 1997; Molitor y colaboradores, 1991), PRRSV (Lager y colaboradores, 1996) , EMCV (Kim y colaboradores, 1989), y enterovirus (Molitor y colaboradores, 1991), indican que el PCV-2 puede provocar una patología fetal importante y el aborto subsecuente. Sin embargo, los inmunógenos PCV-1 (todavía según la definición general dada al comienzo) pueden obtener una respuesta protectora o inmunogénica contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina así como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y ergo, el inmunógeno PCV-1, se pueden también usar en la práctica de esta invención (por ejemplo en los métodos, composiciones, usos, etc.) ya sea solos o en conjunto con inmunógenos PCV-2 (el vector puede contener y expresar ADN que codifica un inmunógeno PCV-1 y/o epítope inmunógeno PCV-2 y/o epítope) y/o solos o en conjunto, un inmunógeno y/o epítope de otro patógeno porcino (si se usa un vector, el vector puede contener y expresar ADN que codifica el inmunógeno PCV-1 y/o epítope y un inmunógeno y/o epitope de otro patógeno porcino, o para un inmunógeno PCV-1 y/o epítope y un inmunógeno y/o epitope PCV-2 y un inmunógeno y/o epitope de otro patógeno porcino) . Así, alguien con habilidad en el arte puede usar alternativa o adicionalmente un inmunógeno PCV-1 y/o epítope y/o vector que codifica tal inmunógeno y/o epítope en la práctica de esta invención sin ninguna experimentación indebida, por ejemplo, para hacerlo así, se necesita solamente leer este texto antes de este ejemplo y a la terminación de (después de) este ejemplo, y substituir PCV-1 por "PCV-2" que son una modificación menor basada en las enseñanzas de la presente. El síndrome de desgaste asociado con la infección por PCV-2 ocurre más a menudo en cerdos de 5-12 semanas de edad (Alian y colaboradores, 1998; Ellis y colaboradores, 1998). La infección experimental de una población de cerdos neonatal indica un periodo prodromal relativamente extenso entre la infección y el desarrollo de los signos clínicos asociados con el PCV-2 (Alian y colaboradores, 1999; Ellis y colaboradores, 1999) . Los hallazgos de la presente muestran que el virus se ?ii . j ^.*t?iÁ?-Í ^ _c?_??i__,- .. __. __.i_. ^ Jfah^.^a^ JM^jJ.^^JaA».^M»«Jjhfe^?.--Mt|- ______ __^ —-...2* * fc.A . transmite verticalmente o en el periodo perinatal. No solamente puede la transmisión vertical ínter uterina del PCV resultar en aborto, sino que es posible que los lechones infectados in útero subletalmente puedan ser los animales que desarrollen posteriormente el PMWS. Además, estos resultados muestran que la inoculación de las cerdas hembras con una composición que comprende un inmunógeno PCV-2 (cuya composición puede también incluir un inmunógeno de otro patógeno de porcino, por ejemplo parvovirus porcino) previo a la cruza o cubrición o monta, o previo al periodo perinatal y/o durante la gestación puede evitar la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el circovirus 2 porcino, así como el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuencias patológicas asociadas con el PCV-2 al obtener una respuesta inmunológica o anticuerpos contra el PCV-2. Por supuesto, las composiciones, métodos y otros aspectos de la invención, se pueden usar o practicar en animales diferentes a los cerdos, por ejemplo, ovejas, bisontes, ganado, jabalíes salvajes; por ejemplo si el PCV-2 infecta a dichos otros animales. EJEMPLO/RESULTADO 2: MIOCARDITIS, ABORTO E INFECCIÓN INTRAUTERINA ASOCIADA CON EL PCV-2.

La presencia de PCV-2 en lechones neonatos sugiere que la transmisión vertical puede ser un medio importante de transmisión viral. Este modo de transmisión se puede relacionar no solamente a la falla reproductora, sino también al desarrollo de la enfermedad multisistémica posteriormente en la vida. Es de interés determinar si el PCV-2 previamente no detectado (y PCV-1) ha sido transmitido verticalmente en las áreas productoras de carne de cerdo en donde el PMWS y por extensión la infección PCV-2, ha sido endémica por al menos varios años . / Se evaluaron treinta y ocho presentaciones que involucran la falla reproductora recibidas en el laboratorio de diagnóstico de la Western College of Veterinary Medicine (WCVM) , University of Saskatchewan, Saskatoon, Canadá, sobre un periodo de cuatro años de un total de 30 de manadas de alta salud en Canadá . Cinco de la granjas de las cuales se obtuvieron las muestras tenían casos diagnosticados de PMWS. Veintisiete de las treinta-ocho revisiones (71%) se clasificaron como abortos; cinco de estas (13%) también involucraron al menos un feto momificado. De los 10 casos restantes: 5 involucraban lechones de parto muerto junto con lechones no viables (13%); 2 con parto muerto y uno o más fetos momificados (5%); 2 con lechones solamente de parto muerto (5%); y uno con solamente fetos momificados (2.5%). El diagnóstico de rutina para patógenos diferentes al circovirus reveló 4 casos (11%) en los cuales se determinó la etiología para ser parvovirus porcino y 2 casos (5%) en los cuales se determinó la etiología para ser de origen bacteriano. Las necropsias totales se llevaron a cabo y se recolectaron los tejidos y fijaron en formalina amortiguada (tiempo de fijación 24-72 horas) y en la mayoría de los casos, los tejidos frescos se remitieron también para una evaluación microbiológica de rutina. Ninguno de estos casos había sido probado previamente para el PCV-2. La técnica PCR usaaa para la detección de PCV-1 y PCV-2 se llevó a cabo como se describió previamente (Tischer y colaboradores, 19 4). El PCV-1 no se detectó por PCR en ninguna presentación que comprendía falla reproductora del periodo de 4 años. El PCV-2 se detectó por PCR en dos diferentes presentaciones, que se originaron de la misma unidad productora multisitio de carne de cerdo, en dos ocasiones separadas en la primavera del último año en el periodo de cuatro años. La primera de estas presentaciones comprendía una carnada de lechones con una evidencia gruesa de miocarditis, hipertrofia cardiaca y congestión pasiva crónica.

La identificación inmunohistoquímica del PCV-2 en tejidos se llevó a cabo como se describió previamente ((Tischer y colaboradores, 1974). La tinción inmunohistoquímica (IHC) para el PCV-2 fue positiva en los corazones de todos los seis lechones que se remitieron, mientras que 4 de 6 fueron positivos por PCR de PCV-2 (ver la tabla siguiente) . Tabla: Detección del PCV-2 en corazones fijados en formalina de porcinos con miocarditis por PCR. Aislamiento viral e IHC en cultivos celulares.

La segunda presentación de la misma granja consistió de una carnada de 4 lechones en la cual dos eran partos de feto muerto y otros 2 murieron poco después del nacimiento. Todos los 4 lechones también tenían una evidencia gruesa de una miocarditis difusa severa, hipertrofia cardiaca y congestión pasiva crónica. Solamente el corazón fresco congelado, y los acumulados de tejidos pulmón y bazo se remitieron para el análisis. El PCR para el PCV-2 fue positivo en los corazones de 2 de los 4 lechones y en los tejidos acumulados de pulmón y del bazo de 4 de 4 lechones. El aislamiento de PCV-2 de los corazones afectados y/o tejido acumulado del pulmón y del bazo fue positivo en 2 de los 4 casos que fueron positivos al PCV-2 por el PCR. Con base en la serología y/o PCR, otros agentes asociados con la falla reproductora en la población de cerdos, incluyendo el virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino y el parvovirus porcino fueron aparentemente circulantes en la manada de cruza. Sin embargo, estos agentes no se pueden mostrar como asociados con lesiones cardiacas severas (u otras) en los lechones afectados, pero pueden contribuir al PMWS. El PCV-2 no se detecta por PCR ó IHC en ninguno de los casos representativos de falla reproductora remitidos dentro de los primeros 3 años del periodo de 4 años (se detectó en casos de falla reproductora remitidos durante el último año del periodo de 4 años) . Con objeto de descartar al daño al ADN debido a la fijación de formalina como un posible factor diverso que limita la capacidad de detección del PCV-2 por PCR, se llevó a cabo la PCR en tejidos recolectados de 4 lechones destetados con PMWS, el ADN del PCV-2 se amplificó en todos los tejidos fijados probados, incluyendo pulmón, hígado, riñon y nodo linfático bronquial de los 4 individuos. |jjj rftA?.¿-«*^*^»**^^ Además, la sensibilidad del PCV-2 por el PCR fue independiente de la duración del tiempo que cada tejido se fijó en formalina. Estos resultados confirman y extienden la observación previa (Wes y colaboradores, 1999) de que el PCV-2 se puede trasmitir verticalmente y puede estar presente en grandes cantidades dentro de las lesiones de los lechones infectados in útero . La trasmisión vertical del virus PCV-2 y del daño fetal resultante, tal como la miocarditis, es una manifestación adicional de la enfermedad del PCV-2. Adicionalmente, la falla para detectar el PCV-2 en casos de falla reproductora previos al último año del periodo de 4 años de una área endémica de infección por PCV-2, pueden indicar que la transmisión vertical no es el principal mecanismo responsable de la diseminación artificial de la infección viral. Los modos de transmisión sexuales, así como verticales se pueden atribuir a la distribución de la infección por PCV-2 en los cerdos. EJEMPLO/ RESULTADO 3: CULTIVO Y AISLAMIENTO DE LAS CEPAS DE CIRCOVIRUS PORCINO Los virus 1103 y 1021 se aislaron respectivamente en Alberta, respectivamente Saskatoon, Canadá, de casos con aborto según el método descrito en J. Ellis y colaboradores, Can. J. Vet. 1998, Vol 39, 44-51.

El cultivo viral se lleva a cabo en cultivo de células PK/15, conocidas por estar descontaminadas por el circovirus (PCV) , virus de la peste, adenovirus porcino y parvovirus porcinos (Alian G. Y colaboradores, Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material . Vet. Microbiol. 1995, 44,49-64). Se disocian las monocapas de PK/15 por tripsinización (con una mezcla de tripsina-verseno) de cultivos confluentes, y se llevan a un medio MEM-SA que contiene 15% de suero de becerro fetal no contaminado con virus de la peste (=medio MEM-G) en una concentración final de alrededor de 400,000 células por ml . Se mezclan después alícuotas en fracciones de 10 ml de esta suspensión de células con fracciones de alícuotas de 2 ml de los inóculos arriba descritos, y las mezclas finales se forman en alícuotas en volúmenes de dml en dos matraces Falcon de 25 cm2. Estos cultivos se incuban después a +37 °C por 18 horas bajo una atmósfera que contiene C02 al 10 %. Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semi-confluentes se trata con D-glucosamida 300mM (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, Remo Unido) (Tischr I. y colaboradores, Arch. Virol., 1987 96 39-57), después se continua la incubación ^_si¿¿í¡^i¡ s^^^^ _¿^^ ¿Í?_..- _ I . ,Í.,Í por un periodo adicional de 48-72 horas a +37°C. Después de esta última incubación, uno de los dos matraces Falcon de cada inoculo se somete a 3 ciclos sucesivos de congelación/ deshielo. Las células PK/15 del Falcon restante, se tratan con una solución de tripsina/ verseno vuelta a suspender en 20ml de medio MEM-G y después se inoculan dentro de matraces Falcon de 75cm2 a una concentración de 400,000 células/ml. Los matraces recientemente inoculados se "sobreinfectan" después por la adición de 5ml del lisado correspondiente obtenido después de los ciclos de congelación/ deshielo. EJEMPLO/ RESULTADO 4: TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE PCV POR INMUNOFLUORESCENCIA La separación por exclusión inicial de todas las preparaciones de cultivos celulares fijados con acetona, se lleva a cabo por una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IIF) usando una dilución 1/100 de un acumulado de sueros de cerdo adulto. Este acumulado de sueros comprende sueros de 25 cerdas adultas de Irlanda del Norte y se conoce que contiene anticuerpos contra una amplia variedad de virus porcinos, incluyendo el PCV; parvovirus porcino, adenovirus porcino, y virus PRRS . La técnica IIF se lleva a cabo al poner en contacto el suero (diluido en PBS) con los cultivos celulares durante 1 hora a +37 °C, seguido por dos lavados en PBS. Los cultivos celulares se tiñen después con una dilución 1/80 en PBS de un anticuerpo de inmunoglobulina anti-cerdo de conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína por una hora, y después lavado con PBS y montado en solución amortiguadora de glicerol antes de la observación microscópica bajo luz ultravioleta. EJEMPLO/ RESULTADO 5: PRODUCCIÓN DE LOS ANTIGENOS PCV POR UN CULTIVO IN VITRO. El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación viral, se llevan a cabo según los mismos métodos como en el ejemplo 1. Las células infectadas se cosechan después del tratamiento con tripsina después de 4 días de incubación a 37°C y se enumeran. El siguiente paso se inocula con 400,000 células infectadas por ml . La diversas cepas PCV-2 aqui descritas, por ejemplo las cepas 1103 y 1121 también se cultivan. EJEMPLO/ RESULTADO 6: TITULACIÓN DEL PCV-2. La titulación se lleva a cabo en microplacas de 96 pozos. Se introduce primero una suspensión de células PK/15 (150 000 células por ml) (100 µl por pozo). Después se hacen las diluciones del cultivo viral y 100 µl de las mismas se introducen en los pozos. Se hace la incubación a 37°C con C02. Después de 24 horas se lleva a cabo un tratamiento con glucosamina por media hora a 37 °C (para las condiciones ver el ejemplo 3) . Se separa después el medio de cultivo y se introduce el medio fresco. Se lleva a cabo la incubación por 72 horas a 37 °C. La revelación de los focos se hace usando un anticuerpo monoclonal anti PCV-2 y un conjugado de ratón etiquetado con FITC. Este método se puede usar para la titulación al preparar inactivado así como PCV-2 atenuado vivo. EJEMPLO/ RESULTADO 7: INACTIVACIÓN DE LOS ANTIGENOS VIRALES Al final del cultivo viral, se cosechan las células infectadas y se usan usando ultrasonido (sonificador Branson) o con ayuda de un molino coloidal de tipo rotor estator (UltraTurrax, IKA) . Se centrifuga después la suspensión a 3700 g por 30 minutos. La suspensión viral se inactiva con etilenimina al 0.1% por 18 horas a +37°C o con 0.5% de beta-propiolactona por 24 horas a +28°C. Si la titulación del virus antes de la activación es inadecuada, la suspensión viral se concentra por ultra filtración usando una membrana con un corte de 300 Kda (Millipore PTMK300) . La suspensión viral inactivada se almacena a +5°C. EJEMPLO/ RESULTADO 8: PREPARACIÓN DE LA VACUNA EN FORMA DE UNA EMULSIÓN BASADA EN ACEITE MINERAL. La vacuna se prepara según la fórmula siguiente: -suspensión de circovirus porcino inactivado : 250ml <^^^^^_^^¡¡^^^^^&£®M^^^ -Montanide® ISA 70 (SEPPIC) : 750ml La fase acuosa y la fase aceitosa se esterilizan separadamente por filtración. La emulsión se prepara al mezclar y homogeneizar los ingredientes con ayuda de un emulsificador de turbina Silverson. Una dosis de vacuna contiene alrededor de 107'5 TCID50. El volumen de una dosis de vacuna es de 0.5 ml por administración por vía intradermal, y 2 ml por administración por vía intramuscular. Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome de desgaste multisistémico en comparación con la vacuna Parvovax*. EJEMPLO/ RESULTADO 9: PREPARACIÓN DE LA VACUNA EN FORMA DE UNA EMULSIÓN METABOLIZABLE DE BASE ACEITE La vacuna se prepara según la fórmula siguiente: -suspensión de circovirus porcino inactivado: 200ml -Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60ml -Radia 7204 (Oleofina) : 740ml La fase acuosa y la fase aceitosa se esterilizan separadamente por filtración. La emulsión se prepara al mezclar y homogeneizar a los ingredientes con ayuda de un emulsificador de turbina Silverson. Una dosis de vacuna contiene alrededor de 107'5 TCID50. El volumen de una dosis de vacuna es de 2ml por administración por vía intramuscular.

Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome de desgaste multisistémico en combinación con la vacuna Parvovax®. EJEMPLO/ RESULTADO 10: VACUNACIÓN DE LECHONES CON VECTOR DE ADN (PLÁSMIDO) Se colocan grupos de 3 ó 4 lechones, derivados de cesárea en el día 0 dentro de aisladores. Los lechones se vacunan el día 2 con (A) un plásmido que comprende ORF 13 o con (B) una mezcla de este plásmido y otro plásmido que comprende ORF 4, y con una solución fisiológica para el grupo de control. Cada plásmido se diluye en solución fisiológica estéril (NaCl 0.9%) a 250µg/µl de concentración final. Se inyecta un volumen de 2 ml por vía intramuscular en 2 puntos de 1 ml (1 punto a cada lado del cuello) . Una segunda inyección de vacuna o placebo se administra el día 14. La vacunación con ADN es bien tolerada por los lechones y no se observa evidencia de una reacción adversa a la vacunación. Se aplica una prueba inmunogénica a los lechones el día 21 por administración oro nasal de suspensión viral de PCV-2 , 1 ml en cada cavidad nasal. Después de la aplicación de la prueba inmunogénica, se pesan los lechones una vez a la semana. Se registran las temperaturas rectales en los días 17, 21, 22, 24, 27, 29, 31, 34, 37, 41, 44. Al día 44, se recolectan muestras fecales de cada lechón para la difusión del PCV-2. Se detecta el virus y se cuantifica por PCR cuantitativa. Se efectúan necropsias el día 45 y se recolectan muestras de tejido para el aislamiento del virus . Síntomas clínicos: No hay una diferencia importante para las ganancias de peso corporal medio o las temperaturas corporales medias entre los grupos. Lesiones por necroscopia: El único hallazgo grueso observado en los cerdos a la terminación es la linfadenopatía bronquial. Se registran las lesiones según los siguientes criterios: 0= no hay crecimiento visible de los ganglios linfáticos . 1= crecimiento moderado de los ganglios linfáticos, restringido a los ganglios linfáticos bronquiales 2= crecimiento moderado de los ganglios linfáticos, restringido a los ganglios linfáticos bronquiales. 3= crecimiento severo de los ganglios linfáticos extendido a los ganglios linfáticos inguinales y prescapulares, submandibulares bronquiales. Std es una abreviatura para la desviación estándar.

Grupos Registros de linfadenopatia Media std N (A) 1 . 2 1 . 3 4 (B) 2 . 0 1 . 7 3 controles 3 . 0 0 . 0 3 N= número de lechones en cada grupo. Una reducción en las lesiones de los ganglios linfáticos se observa en 3 de cada 4 lechones inmunizados con (A) y 1 de cada 3 lechones inmunizados con la mezcla (B) . Esta diferencia no es importante (p>0.05) debido al valor elevado de las desviaciones estándar (std) . Carga de virus en los tejidos de ganglios linfáticos : Se efectúa el re-aislamiento del virus cuantitativo en homogeneizados de tejido preparados de ganglios linfáticos mesentéricos y bronquiales. Los datos presentados corresponden a las titulaciones de virus en homogeneizados de tejido después de la transformación en logio- Titulaciones de PCV-2 Grupos bronquial LN mesentérico LN Media std media std N (A) 0.9 0.8 0.9 0.8 4 (B) 0.7 0.6 0.2 0.2 3 controles 2.0 1.1 1.8 1.1 4 Los ganglios linfáticos bronquiales parecen contener al virus más infeccioso. Se observa una reducción de la carga viral en los ganglios linfáticos mesentéricos y bronquiales de los lechones inmunizados con la mezcla (A) ó (B) . Esta reducción es importante (p< 0.05) para la mezcla de plásmidos. Excreción viral: Las muestras fecales posteriores a la aplicación de la prueba inmunogénica se evalúan par? el alojamiento del PCV-2 por PCR con base en la amplificación del ORF 13 del PCV-2. Cada ensayo se efectúa por triplicado en 2 ml de muestra. Los controles no vacunados son negativos para el PCV-2 previo a la aplicación de la prueba inmunogénica y positivos después de la aplicación de la prueba inmunogénica confirmando la validez del ensayo por PCR. Los valores se expresan como logio (número de moléculas de ADN del PCV-2 en una muestra de 2 µl ) . Número log10 de moléculas de ADN de PCV-2 Grupos media std N (A) 3.3 0.3 (A) 2.9 0.7 3 controles 3.6 0.6 4 Las diferencias entre los grupos no son importantes (p>0.05) EJEMPLO /RESULTADO 11: VACUNACIÓN DE LECHONES CON UN VECTOR VIVO DE VIRUELA DEL CANARIO Y RESULTADOS Se colocan grupos de 3 a 4 lechones, derivados de cesárea el día 0 dentro de aisladores. Se vacunan los lechones el día 2 con 108 pfu de una viruela de canario (C) que comprende al ORF 13, o (D) de una viruela de canario que comprende ORF 13 y ORF 4, o viruela de canario parental, en un 1 ml de PBS por vía intramuscular a una costado del cuello. Se administra una segunda inyección de la vacuna o placebo el dia 14. La vacunación con la viruela de canario es bien tolerada por los lechones y no hay evidencia de una reacción adversa a la vacunación. Los lechones se someten a una prueba inmunogénica el día 21 por administración oro nasal de una suspensión nasal PCV-2, 1 ml en cada cavidad nasal, se efectúan las necropsias del día 45 y se recolectan muestras de los tejidos para aislamiento del virus. Resultados de la necropsia: El PMWS se caracteriza generalmente por una linfadenopatía y más raramente por hepatitis o nefritis. En cuanto a los hallazgos totales en ganglios linfáticos se registran para cada lechón en la siguiente manera: 0= no hay un agrandamiento visible de ganglios linfáticos; 1= agrandamiento moderado de los ganglios linfáticos, restringido a los ganglios linfáticos bronquiales; 2= ¡|Í?¿^i j-^^--Í?á«a^-^--aai--^^Ai&=i=a-?tt--^»ta« »-.-» . -«. *....„,... :..,!, -.,_.„_, _*¿?A_,_^__._, _C_.?_3£__i,. agrandamiento moderado de los ganglios linfáticos, restringido a los ganglios linfáticos bronquiales; 3= agrandamiento severo de los ganglios linfáticos, extendido a los ganglios linfáticos inguinales y prescapulares, submandibulares, bronquiales. Grupos registros (C) 0.5 0.0 0.0 1.0 media 0.38 desviación estándar 0.48 (D) 0.0 0.5 0.5 1.0 media 0.5 desviación estándar 0.41 controles 2.0 2.5 2.5 2.5 media 2.38 desviación estándar 0.25 Hhltt t 1 É ilÜlf' "—"--"-•«- .^-u»-^- a ?_*_teia_?__+_j?t?ta___»_ La linfadenopatía bronquial para el PCV-2 es un hallazgo total prominente. Una reducción importante de la lesión en los ganglios linfáticos con relación al grupo de control se observa después de la inmunización con (C) y (D) (p< 0.05) . Habiendo descrito así en modalidades preferidas la presente invención, se entenderá que la invención definida por las reivindicaciones anexas no se limita a los detalles particulares establecidos en la descripción anterior, ya que muchas variaciones aparentes de la misma son posibles sin alejarse del espíritu o alcance de la presente invención. Referencias 1. Alian GM, McNelly F, Cassady JP, y colaboradores, 1995, Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet Microbiol 44:49-641. 2. Alian GM, McNeilly F, Kennedy S, y colaboradores,: 1998, Isolation of porcine circovirus-like viruses from piglets with a wasting disease in the United States and Europe. J. Vet Diag Invest 10:3-10. 3. Alian GM, Kennedy S, McNeilly F, y colaboradores, : 1999, Experimental reproduction of wasting disease and death by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J Comp Path 121:1-11 (julio 1999) . 4. Bolt DM, Hani H, Muller E, and Waldvogel AS: 1997, Nonsuppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection. J. Comp Path 117:107- 118. 5. Ellis, JA, Hassard L, Clark EG, y colaboradores,: 1998, Isolation of circovirus from lesions of piglets with postweaning multisystemic wasting syndrome. Can Vet J 39: 44-51. 6. Ellis JA, Krakowka S, Lairmore M, y colaboradores, : 1999, Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J Vet Diag Invest 11:3-14. 7. Kim HS, Jo HS and Bergeland ME: 1989, Serologic, Virologic, and histopathologic observations of encepnalomyocarditis virus infection in mummified and stillborn pigs- J Vet Diag Invest 1:101-104. 8. Larger KM and Halbur PG: 1996, Gross and microscopic lesions in porcine fetuses infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Vet Diag Invest 8:275-282. 9.Meethan BM, McNelly F. Todd D, y colaboradores,: 1998, Characterization of novel circovirus DNA' s associated wasting disease syndrome in pigs. J. Gen Virol 79:2171-2179. 10. Mengeling WL 1992, Porcine parvovirus. In: Diseases of swine, ed Leman AD, 7th ed-, pp.299-31 1. Iowa State University Press, Ames, IA. 11. Molitor TW, Orveerakul K, Zhang ZZ, y colaboradores, : 1991, Polymerase chain reaction (PRC) amplification for detection of porcine parvovirus. J Virol Meth 32:201-211. 12.Pensaert M y DeMeurichy W: 1973, A porcine enterovirus causing fetal death and mummification. Experimental infection of pregnant female pigs. Zentralbl Veterinaermed Beih 11:2025. 13. Tischer 1, Rasch R and Tochtermann G: 1974, Charactepzation of papovavirus- and picomavirus-like particles -in permanent piglet kidney cell lines. Zentrl i-Bakertiol-Org-A 226:153-167. 14. West KH, Bystrom, JM , Wojnarowicz C, y colaboradores, : 1999, Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus-2. J Vet Diag Invest 1. iAAM??tL?ßá*. ^.¿sA *.

APÉNDICE 1 Vacuna ADN-PCV. SOLICITUDES RELACIONADAS: Se hace referencia a la Solicitud US Serie 09/082,558 presentada el 21 de Mayo de 1998 y a la Solicitud US Serie 09/161,092, presentada el 25 de Septiembre de 1998 en la forma de una continuación en parte de la Serie 09/082,558, estas solicitudes se incorporan en la presente a modo de referencia, y cada uno de los documentos citados en la presente solicitud también se incorpora aquí a modo de referencia. (Se hace referencia a la Solicitud U.S. Serie No. 09/161,092, presentada el 25/09/98 como una CIP de ia solicitud U.S. Serie No. 09/082,558, presentada el 21/05/98, reivindicación de prioridad de las Solicitudes Francesas Nos. 97/12382, 98/00873, 98/03707, presentada el 03/10/97, 225/1/98, 20/3/98; cada una de las cuales, y cada uno de los documentos citados en estas, se incorporan en la presente para referencia) . La presente invención se refiere a constructos de plásmidos que codifican y expresan los inmunógenos del circovirus porcino (PCV para siglas en inglés del circovirus porcino) responsables del síndrome PMWS (Síndrome de desgaste Multisistémico Porcino, o Síndrome de desgaste Multisistémico posterior al destete) , a métodos de vacunación y a vacunas de ADN, así como a métodos para producir y formular estas vacunas. Todos los documentos citados en la presente, y todos los documentos citados en los documentos citados en la presente, se incorporan aquí para referencia. El PVC se detectó originalmente como un contaminante no citopatogénico en las líneas de células del riñon PK/15. Este virus se clasifica entre los Circoviridae con el virus de anemia del pollo (CAV por sus siglas en inglés del Virus de Anemia del Pollo) , y el virus PBFDV (virus de la enfermedad de las plumas y pico de las psitácidas). Estos son virus pequeños no desarrollados (de 15 hasta 24 nm) cuyas características comunes es que contienen un genoma en forma de ADN de hebra simple circular de 1.76 hasta 2.31 kilobases (kb). Se pensó primero que este genoma codificaba un polipéptido de alrededor de 30 kDa (Todd y colaboradores, Arch. Virol., 1991, 117: 129-135). Trabajos recientes han mostrado, sin embargo, una transcripción más compleja (Meehan B. M, y colaboradores, J. Gen. Virol., 1997, 78: 221-227). Por otro lado, no se conocen homologías significantes en la secuencia de nucleótido o en los antigénicos comunes determinantes entre las tres especies de circovirus conocidas .

El PCV derivado de las células PK/15 se considera que no es patogénico. Su secuencia se conoce de B.M. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1997 (78) 221-227. Solamente muy recientemente algunos autores han intentado que las cepas de PCV sean patogénicas y se asocien con el síndrome PMWS (G.P.S. Nayar y colaboradores, Can. Vet. J., 1997, 38: 385-387 y Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501): Nayar y colaboradores, han detectado que ADN del PCV en cerdos que tienen el síndrome PMWS usando técnicas de PCR. Los anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra los circovirus encontrados en cerdos que tienen los síntomas del síndrome PMWS, han sido capaces de demostrar diferencias entre estos circovirus y los circovirus porcinos aislados del cultivos de células PK- 15 (Alian G.M. y colaboradores, Vet Microbiol., 1999, 66: 115-123) . El síndrome PMWS detectado en Canadá, los Estados Unidos y Francia, se caracteriza clínicamente por una pérdida gradual de peso y por manifestaciones tales como taquipnea, disnea e ictericia. Desde el punto de vista patológico, se manifiesta por infiltraciones de linfocitos o granulomatosas, linfadenopatias y, más raramente, por hepatitis y nefritis de linfocitos o • granulomatosa (Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. i*k _t. .-. i,ti*ií*át_ -. . .-.-. 1997: 499-501; La Semaine Vétérinaire No. 26, suplemento de La Semaine Vétérinaire 1996 (834); La Semaine Vétérinaire 1997 (857): 54; G.P.S. Nayer y colaboradores, Can. Vet. J. , 1997, 38: 385-387). Estos circovirus obtenidos de Norteamérica y Europa están muy cercanamente relacionados, con un grado de identidad de más del 96% de su secuencia de nucleótido, en tanto que el grado de identidad es de menos del 80% cuando la secuencia de nucleótido de estos circovirus se compara con aquellas de los circovirus porcinos aislados de células PK-15. En consecuencia, se han propuesto dos subgrupos virales, PCV-2 para los circovirus asociados con el síndrome PMWS y PCV-1 para los circovirus aislados de las células PK-15 (Meehan B.M. y colaboradores, J. Gen. Virol., 1998, 79: 2171-2179; WO-A-9918214 ) . El solicitante ha encontrado que los constructos de plásmidos que codifican y expresan inmunógenos PCV-2 pueden usarse para inmunizar cerdos contra el síndrome PMWS. El solicitante ha encontrado que los constructos de plásmido que codifican y expresan los inmunógenos PCV-2 pueden usarse para inmunizar cerdos contra el síndrome PMWS.

Los inmunógenos PCV-2 pueden usarse en combinación con los inmunógenos PCV-1 también para inmunizar estos animales contra el PCV-2. De conformidad con al menos un modo preferido, los 5 inmunógenos PCV-1 pueden usarse solos. El objeto de la presente invención son constructos de plásmido que codifican y expresan un inmunógeno PCV-1 ó PCV-2, en particular las estructuras de lectura abiertas (ORF) 1 y 2 del PCV-1, y las ORF 1 y 2 del PCV- 10 2. No hace falta decir que la invención cubre automáticamente los plásmidos que codifican y expresan las secuencias de nucleótido equivalentes, es decir, las secuencias que no cambian ni la funcionalidad ni la 15 especificidad de la cepa del gen considerado, o aquellas de los polipéptidos codificados por este gen. Las secuencias que difieren de la degeneración del código serán, por supuesto, incluidas. Las secuencias de PCV-2 usadas en los ejemplos se 20 derivan de Meehan y colaboradores, supra (nucleótidos ORFl 398-1342; nucleótidos ORF2 1381-314; y corresponden respectivamente a ORF4 y ORF13 en la US 09/161,092 del 25 de Septiembre 1998 y a COL4 y COL13 en la WO-A-9918214 ) . Otras secuencias de PCV-2 también se han publicado en la 25 WO-A-9918214 y se nombran Impl008, Imp999, ImplOll-48285 ifaíaitáittaiii^É aAáiti ^tA^^ AiA ¿ai*»aa¿-e ImplOll-48121, así como en A.L. Hamel y colaboradores, J. Virol. Junio 1998, vol. 72, 6:5262-5267 (GenBank AF027217) y en I . Morozov y colaboradores, J. Clinical Microb. Septiembre 1998, vol. 36, 9: 2535-2541, así como GenBank AF086834, AF086835 y AF086836, y da acceso a secuencias ORF equivalentes. La invención también cubre las secuencias equivalentes en el sentido de que " son capaces de hibridizar a la secuencia de nucleótido del gen considerado bajo condiciones de alta severidad. Entre estas secuencias equivalentes, pueden mencionarse los fragmentos de gen que conservan la inmunogenicidad de la secuencia completa. Los otros ORF 1-3 y 5-12 descritos en la US 09/161,092 del 25 de Septiembre 1998 (COL 1-3 y 5-12 en la WO-A-9918214) , en particular los ORF 7 y 10, pueden usarse bajo las condiciones descritas aquí, en combinación, o de otra manera con cada uno de los otros o con los ORF 1 y 2 como se define aquí. La palabra plásmido se pretende que cubra cualquier unidad de transcripción de ADN en la forma de una secuencia de polinucleótido que comprende la secuencia de PCV a expresarse y los elementos necesarios para su expresión in vivo. Se prefiere la forma de plásmido circular, en sobre-espiral. La forma lineal también se incluye dentro del alcance de la invención. El objeto de la presente invención es más particularmente los plásmidos llamados pJP109 (que contienen el gen 0RF2 del PCV-2, Figura 1), pJPlll (que contienen el gen ORFl del PCV-2, Figura 2), pJP120 (que contienen el gen 0RF2 del PCV-1, Figura 3) y pJP121 (que contienen el gen ORFl del PCV-1, Figura 4) . Cada uno de los plásmidos comprenden un promotor capaz de asegurar, en las células huésped, la expresión del gen insertado bajo su control. Es en general un promotor eucariótico fuerte y en particular un promotor temprano del ci tomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, u opcionalmente de otro origen tal como de rata o de conejillo de indias. Más generalmente, el promotor es ya sea de origen viral o de origen celular. Como un promotor viral diferente a CMV-IE, puede mencionarse el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous. También puede ser un promotor del virus del cual se deriva el gen, por ejemplo el promotor específico del gen. Como un promotor celular, puede mencionarse el promotor del gen citoesqueletal, tal como por ejemplo el promotor de desmina, o alternativamente el promotor de actina. Cuando se presentan varios genes en el mismo plásmido, pueden proporcionarse en la misma unidad de transcripción o en dos unidades diferentes. Los plásmidos también pueden comprender otros elementos que regulan la transcripción tales como, por ejemplo, secuencias de estabilización del tipo intron, preferiblemente intron II del gen ß-globina de conejo (van Ooyen y colaboradores, Science, 1979, 206: 337-344), secuencia de señal de proteína codificada por el gen activador del plasminógeno de tejido (tPA; Montgomery y colaboradores, Cell. Mol. Biol.. 1997, 43: 285-292), y la señal de poliadenilación (poliA) , en particular del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (US-A- 5 , 122 , 458^ o del gen ß-globina de conejo. El objeto de la presente invención también son las preparaciones inmunogénicas y vacunas de ADN que comprenden al menos un plásmido de conformidad con la invención, que codifica y expresa uno de los inmunógenos PCV-1 ó PCV-2, preferiblemente uno de los ORF arriba mencionados, además de un vehículo o diluyente veterinariamente aceptable, con opcionalmente, además, un adyuvante veterinariamente aceptable. El objeto de la presente invención es más particularmente preparaciones inmunogénicas y vacunas que contienen al menos un plásmido que codifica y expresa uno de los inmunógenos PCV-1 ó PCV-2, composiciones ,__j.&,.¿ jn-t j ¿,t J > M. »t¿Jfcj .-.¿. » «Á>¿ AíÉ.-Í?Tlá i~ formuladas con un adyuvante, en particular un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternaria, por ejemplo, preferiblemente DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N, N-dimetil-2, 3-bis (tetradeciloxi) -1-propanamonio; WO-A-9634109) , y preferiblemente se acopla con un lípido neutro, por ejemplo, preferiblemente, DOPE (dioleoilfosfatidil etanolamina) , para formar DMRIE-DOPE. Preferiblemente, la mezcla de plásmido con este adyuvante se hace inmediatamente antes de usarse y, preferiblemente, antes de su administración al animal, la mezcla producida así se permite que forme un complejo, por ejemplo durante un periodo en el rango desde 10 hasta 60 minutos, en particular del orden de 30 minutos. Cuando está presente el DOPE, la relación molar DMRIE:DOPE preferiblemente está en el rango desde 95:5 hasta 5:95, más particularmente 1:1. La relación en peso del plásmido: DMRIE o DMRIE : adyuvante DOPE puede estar en el rango particular desde 50:1 hasta 1:10, en particular desde 10:1 hasta 1:5, preferiblemente desde 1:1 hasta 1:2. De conformidad con otro modo ventajoso de la invención, es posible usar, como adyuvante, un compuesto adyuvante seleccionado de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolimeros de anhídrido maléico y de derivado de alquenilo. Los polímeros de ácido acrílico o -A, MÍ*?_., m___í? _ '__ß____t.r_^_^i ?^?__t____ _^_ __ metacrílico reticulados en particular con éteres de polialquenilo de azúcares o de polialcoholes, son los preferidos. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, No. 2, Junio 1996). Las personas con habilidad en el arte también pueden referirse a la US-A-2, 909, 462 (incorporada para referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos se reemplazan con radicales alifáticos no saturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen 2 hasta 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente no saturados. Los radicales no saturados pueden contener por si mismos otros substituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EUA) son particularmente apropiados. Estos se reticulan con alil sacarosa o con alilpentaeritritol. Entre estos, se pueden mencionar el Carbopol© 974P, 934P y 9710P. Entre los copolímeros de anhídrido maléico y de un derivado de alquenilo, los EMA® (Monsanto) son los preferidos, que son copolímeros de anhídrido maléico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados con éter de divinilo. Puede hacerse referencia a J. Fiells y colaboradores, Nature, 186:778-78 4 Junio 1960 (incorporada para referencia) . Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los EMA®, consisten preferiblemente de unidades básicas de la siguiente fórmula: Ri R2 COOH en la cual -Ri y R2, que son idénticos o diferentes, representan H o CH3 -x = 0 ó 1, preferiblemente x = 1 -y = 1 ó 2, con x + y = 2. Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1. La disolución de estos polímeros en agua lleva a una solución acida que se neutralizará, preferiblemente hasta un pH fisiológico, para dar la solución adyuvante en la cual la vacuna actual se incorporará. Los grupos carboxilo del polímero se hacen en partes después en forma COO- .

Para este tipo de adyuvante, es preferible preparar una solución del adyuvante, en particular del carbómero, en agua destilada, preferiblemente en presencia de cloruro de sodio, la solución obtenida tiene un pH ácido. Esta solución esencial se diluye agregando la cantidad requerida (con objeto de obtener la concentración final deseada) , o un parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCL, preferiblemente solución salina fisiológica (NaCL 9 g/l) , en una o más porciones con neutralización concomitante o posterior (pH 7.3 hasta 7.4), preferiblemente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico, se usará como tal para mezclarse con el plásmido, en particular almacenarse en forma liofilizada, liquida o congelada. La concentración de polímero en la composición de vacuna final será de 0.01% hasta 2% p/v, más particularmente 0.06 hasta 1% p/v, preferiblemente 0.1 hasta 0.6% p/v. En una modalidad especifica, la preparación inmunogénica o de vacuna comprende un plásmido o una mezcla de plásmidos que codifican y expresan el ORFl y ORF2 de PCV-2. La invención también proporciona una vacuna de combinación contra el circovirus porcino con una vacuna contra otros patógenos del cerdo, en particular aquellos que pueden asociarse con el síndrome PMWS. El objeto de la presente invención también son mezclas de plásmidos que contienen al menos un plásmido de conformidad con la invención y al menos otro plásmido que codifica y expresa un inmunógeno porcino, seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste de las glicoproteínas gB y gD del virus de la enfermedad de Aujeszky (virus de la pseudorabia o PRV), la hemaglutinina y la nucleoproteina del virus de influenza porcina H1N1, la hemaglutinina y la nucleoproteína del virus de influenza porcina H3N2, los genes 0RF5 y 0RF3 del virus PRRS y de las cepas Lelystad y USA, la proteína VP2 del parvovirus porcino, las proteínas El y E2 del virus de cólera del cerdo (HCV) , los genes suprimidos apxl, apxll y apxIII del Actmobacill us pleuropneumoniae (ver para los plásmidos, por ejemplo, la WO-A-9803658 ) . Estas mezclas de plásmidos se toman en un vehículo o diluyente veterinariamente aceptable, opcionalmente con, además, un adyuvante veterinariamente aceptable como se describe arriba, formando así preparaciones inmunogénicas o vacunas de ADN multivalentes . Estas preparaciones o vacunas multivalentes pueden, en particular formularse ventajosamente con DMRIE, y acoplarse preferiblemente con un lípido neutral, DOPE, para formar el DMRIE-DOPE.

Las preparaciones o vacunas de ADN monovalentes o multivalentes de conformidad con la invención, formuladas o de otra manera con adyuvantes como se describe arriba, también pueden ventajosamente complementarse con una citosina, preferiblemente de origen porcino, en particular GM-CSF porcino. Esta adición de GM-CSF porcino (factor estimulante de la colonia de macrófago granulocito; Clark S.C. y colaboradores, Science 1987, 230: 1229; Grant S.M. y colaboradores, Drugs, 1992, 53:516) puede llevarse a cabo por la incorporación en la preparación o en la vacuna, de ya sea una proteína GM-CSF porcina o de un plásmido que codifica y expresa el gen M-CSF porcino (Inumaru S. y Takamatsu H. Immunol . Cell. Biol., 1995, 73: 474-476). Preferiblemente, el gen GM-CSF porcino se inserta en un plásmido diferente de aquellos que codifican los inmunógenos PCV o los otros inmunógenos porcinos . En particular, el plásmido que codifica y expresa el GM-CSF porcino puede ser el plásmido pJP058 (Figura 5) . Las preparaciones inmunogénicas y las vacunas de ADN monovalentes o multivalentes de conformidad con la invención, también pueden combinarse con al menos una vacuna convencional (viva atenuada, inactivada o subunidad) o vacuna recombinante (vector viral) dirigida contra al menos un patógeno porcino que es diferente o idéntico. La invención se proporciona, en particular, para la combinación con vacunas convencionales que contienen adyuvantes (viva atenuada, inactivada o subunidad) . Para las vacunas inactivadas o de subunidad, pueden mencionarse aquellas que contienen en particular gel de alúmina solamente o mezclado con saponina como adyuvante, o aquellas formuladas en forma de una emulsión aceite en agua. El objeto de la presente invención también es un método de inmunización que hace posible inducir una respuesta inmune en cerdos hacia los circovirus de conformidad con la invención. Este objeto es, en particular, un método de vacunación que es efectivo en cerdos. Estos métodos de inmunización y vacunación, comprenden la administración de una de las preparaciones o de una de las vacunas de ADN monovalentes o multivalentes como se describe arriba. Estos métodos de inmunización y vacunación comprende la administración de una o más dosis sucesivas de estas preparaciones o vacunas de ADN. Las preparaciones y vacunas de ADN pueden administrarse, en el contexto de este método de inmunización o de vacunación, por diferentes vías de administración propuestas en el arte previo para la vacunación de polinucleótidos, en particular las vías ' intramuscular e intradermal, y por medio de técnicas de administración conocidos, en particular inyecciones con una jeringa que tiene una aguja, por chorro líquido (Furth y colaboradores. Analytical Bioch., 1992, 205: 365-368) o por la proyección de partículas de oro recubiertas con ADN (Tang y colaboradores, Nature, 1992, 356: 152-154). Este método no solamente permite la administración a cerdos adultos, sino también a los jóvenes y hembras en gestación; en el último caso, es posible, en particular, conferir inmunidad pasiva sobre los recién nacidos (anticuerpos maternales). La cantidad de ADN usado en las vacunas de conformidad con la presente invención, está entre alrededor de 10 µg y alrededor de 2000 µg, y preferiblemente entre alrededor de 50 µg y alrededor de 1000 µg . Las personas con habilidad en el arte tendrán la competencia necesaria para definir precisamente la dosis efectiva de ADN a usarse para cada uno de los protocolos de inmunización o vacunación. Los volúmenes de dosis pueden estar entre 0.5 y 5 ml, preferiblemente entre 2 y 3 ml . Un método preferido de inmunización o de vacunación, consiste en la administración de las vacunas de ADN de conformidad con la invención, por la vía intramuscular.

La invención se describirá ahora en mayor detalle con la ayuda de las modalidades ejemplares no limitantes, tomando como referencia a los dibujos, en los cuales: La Figura 1: plásmido pJP109. La Figura 2: plásmido pJPlll. La Figura 3: plásmido pJP120. La Figura 4: plásmido pJP121. La Figura 5: plásmido pJP058. Listados de secuencias SEQ ID SEQ ID NO. 1: oligonucleótido JP779. SEQ ID NO. 2: oligonucleótido JP780. SEQ ID NO. 3: oligonucleótido JP781. SEQ ID NO. 4: oligonucleótido JP782. SEQ ID NO. 5: oligonucleótido JP783. SEQ ID NO. 6: oligonucleótido JP784. SEQ ID NO. 7: oligonucleótido JP785. SEQ ID NO. 8: oligonucleótido JP786. EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción del plásmido pJP109. El plásmido pGEM7Z-Impl010 Stoon-EcoRI No. 14, que contiene el genoma del virus PCV-2 en la forma de un fragmento EcoRI (B. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1998, 79 2171-2179), se digirió con EcoRI con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-EcoRI de 1768 pares base lll IÉ II l ii iln JÉiÉMi ílii iiHI r iiftlii inltr i i i i Ti I I 1 (bp) . Este fragmento se ligó por sí mismo. El gen ORF del virus PCV-2 de la cepa 1010-Stoon (B. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1998. 79. 2171-2179; GenBank secuencia de acceso no. AF055392) se amplificó, usando la plantilla que consiste del fragmento EcoRI- EcoRI ligado por si mismo, por la técnica de reacción de cadena de polimerasa (PCR) con los siguientes oligonucleótidos : JP779 (SEQ ID NO. 1) (35 mero) : 5 ' CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3 ' y JP780 (SEQ ID NO. 2 (36 mero) : 5 ' TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3 ' con objeto de generar un fragmento PCR de 730 bp. Este fragmento se digiere con Salí y Bglll con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción de 715 bp SalI-BglII. Este fragmento se liga después con el plásmido pVR1012 (Hartikka J. y colaboradores, Human Gene Therapy, 1996. 7. 1205-1217), digerido de antemano con Salí y Bglll, para dar el plásmido pJP109 (5567 pb) (Figura 1) . Ejemplo 2: Construcción del plásmido pJP 111. Se lleva a cabo una reacción de cadena de polimerasa con el plásmido pGem7Z-Impl010-Stoon (ver Ejemplo 1) (B. Meehan y colaboradores, J. Gen Virol. 1998, 79, 2171- 2179) y los siguientes oligonucleótidos: JP781 (SEQ ID NO 3) (35 mero) : 5 ' CATCATCATGTCGACATGCCCAGAAGAAGAATGG3' y JP782 (SEQ ID NO 4 (36 mero) : 5' TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3 ' con objeto de generar un fragmento PCR de 970 bp que contiene el gen ORFl del virus PCV-2. Este fragmento se digiere con Salí y Bglll con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 955 bp. Este fragmento se liga después con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para dar el plásmido pJPlll (5810 bp) (Figura 2). Ejemplo 3: Construcción del plásmido pJP120 (PCV-1 ORF2) . Una reacción de cadena de polimerasa se lleva a cabo con el plásmido pPCVl (B. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1997 78. 221-227), y los siguientes oligonucleótidos; JP783 (SEQ ID NO 5) (35 mero) : 5 ' CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3 ' y JP784 (SEQ ID NO 6) (40 mero) : 5 ' TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3 ' con objeto de generar un fragmento PCR de 730 bp que contiene el gen ORF2 del virus PCV-1 (cepa PK-15, GenBank secuencia de acceso No. U49186). Este fragmento se digirió con Salí y Bglll con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de ii??e^^^^^t^&^á^ ÍJí&^^^j íi^ ¿. j.ii^^ii*aafa-^,a.aii i.M<??-.;fi?.?.a??l?-»?i?'^i restricción SalI-BglII de 715 bp. Este fragmento se liga después con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para dar el plásmido pJP120 (5565 bp) (Figura 3). Ejemplo 4: Construcción del plásmido pJP121 (PCV-1 ORFl). El plásmido pPCVl que contiene el genoma del virus PCV1 en la forma de un fragmento PstI (B. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 19, 78, 221-227) se digirió en PstI con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Pstl-Pstl de 1759 pares base (bp) . Este fragmento es autoligado. El gen ORFl de la cepa PK-15 del virus PCV-1 (B-Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227; GenBak secuencia de acceso No. U49186) se amplificó, usando la plantilla que consiste del fragmento Pstl-Pstl autoligado, por la técnica de reacción de cadena de polimerasa (PCR) con los siguientes oligonucleótidos: JP785 (SEQ ID NO 7) (35 mero): 5 ' CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3 ' y JP786 (SEQ ID NO 8) (36 mero) : 5 ' TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3 ' con objeto de generar un fragmento PCR de 965 bp que contiene el gen ORFl del virus PCV-1 (cepa PK-15) . Este fragmento se digirió con Salí y Bglll con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción SalI-BglII de 946 bp . Este ¡ tkl fragmento se ligó después con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) para dar el plásmido pJP121 (5804 bp) (Figura 4) . Ejemplo 5: Construcción del plásmido pJP058 (que expresa la GM-CSF porcina) . Se colectó sangre de cerdo en un tubo que contenía EDTA tomando la sangre de la vena yugular. Las células mononucleadas se cosecharon por centrifugación en un gradiente Ficoll y se cultivaron in vitro en un medio RPMI 1640 (Gibco-BRL) y se estimularon por la adición de concanavalina A (Sigma) a una concentración final de alrededor de 5 µg/ml en el medio de cultivo. Después de 72 horas de estimulación, los linfoblastos se cosecharon y el ARN total de estas células se extrajo con el kit de extracción "Micro-Scale Total RNA Separator Kit" (Clontech) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Una reacción de transcripción inversa, llevada a cabo con la ayuda del kit "lst-Strand cDNA Synthesis Kit" (Perkin Elmer) , seguido por una reacción de cadena de polimerasa, se llevó a cabo en el total de ARN extraído de estos linfoblastos porcinos con los siguientes oligonucleótidos : RG972 (33 mero) : 5 ' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3 ' y RG973 (34 mero) : laja» flfl ?f"W* S i _ ¿mki¡a 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3 ' con objeto de generar un fragmento de PCR de alrededor de 450 pares base (bp) . Este fragmento se digirió con Notl con objeto de aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Notl-Notl de 450 bp. Este fragmento se ligó después con el plásmido pVR1012 (Ejemplo 1) , preferiblemente digerido con Notl y desfosforilado, para dar el plásmido pJP058 (5405 bp) (Figura 5). La secuencia del gen pGM-CSF clonado en el plásmido pJP058, se comprobó y se encontró que era idéntica a la disponible en la base de datos del GenBank (acceso No. D21074) . Ejemplo 6: Producción de los plásmidos purificados para la vacunación de cerdos . Se transformó la bacteria Escherichia coli K12 (cepas DH10B ó SCSI) con los plásmidos pJP109, pJPlll, pJP058, pJP120 y pJP121 de los Ejemplos 1 hasta 5 de arriba. Los cinco clones transformados obtenidos respectivamente con estos cinco plásmidos, se cultivaron después separadamente, con agitación a +37 °C, en un medio de caldo Luria (LB) . Los cultivos bacteriales se cosecharon al final de la fase exponencial y los plásmidos se extrajeron de conformidad con la técnica de lisis alcalina. Los plásmidos extraídos se purificaron después en un gradiente de cloruro de cesio de a¿fa conformidad con la técnica descrita por Sambrook y colaboradores (Molecular Biology: A Laboratory Manual, 2da Edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Después de la extracción final del bromuro de etidio y la precipitación en presencia de etanol absoluto, los plásmidos purificados se volvieron a suspender en solución amortiguadora TE (lmM tris/EDTA, pH 8.0) con objeto de obtener soluciones esenciales que contienen 2 mg del plásmido por ml . Estas soluciones esenciales se almacenaron a -20°C antes de usarse. Ejemplo 7: Control de la expresión de los ORF 1 y 2 del virus PCV-2. Con objeto de controlar los productos de expresión de los genes ORF2 PCV-2 y ORFl PCV-2, clonados respectivamente en los plásmidos pJP109 y pJPlll, estos plásmidos se transfectaron en células CHO-Kl (Ovario de Hámster Chino) (ATCC No. CCL-61) con el kit de transfección Lipofectamine Plus® (Gibco-BRL, # de Catálogo 10964-013), siguiendo las recomendaciones del fabricante para su uso. 48 horas después de la transfección, las células transfectadas se lavaron y se fijaron con una solución de acetona glacial al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se usaron cinco anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas ORFl PCV-2 (F199 1D3GA y F210 7G5GD) y proteínas ORF2 ,í, J i__*Slt3*__k S- ?___*_&¿__.__.r__>¿J ?_&t_ ¿jr-.

(F190 4C7CF, F190 2B1BC y F190 3A8BC) como los primeros anticuerpos. Un conjugado IgG anti-ratón, etiquetado con Cy3, se usó para revelar el etiquetado específico. Se observó un PCV-2 de fluorescencia específica con los 3 monoclonales ORF2 PCV2 en las células transfectadas con el plásmido pJP109, pero no en aquellas transfectadas con el plásmido pJPlll. En contraste, se observó un PCV2 de fluorescencia específica con los dos monoclonales ORFl PCV-2 en las células transfectadas con el plásmido pJPlll, pero no en aquellas transfectadas con el plásmido pJP109. No se detectó fluorescencia con los monoclonales PCV-2 en las células CHO transfectadas solo con el plásmido pVR1012 o en las células CHO no transfectadas el mismo resultado de expresión se obtiene con un suero policlonal especípco para el vi^us PCV-2. En este caso, se usó un conjugado IgG anti-cerdo de fluorescencia etiquetada para detectar la fluorescencia específica. No se detectó fluorescencia con este suero policlonal en células CHO transfectadas solo con el plásmido pVR1012 o en las células CHO no transfectadas. Ejemplo 8: Vacunación de cerdos con ADN descubierto. 8.1. Lechones de un dia de edad. Grupos de lechones obtenidos por cesárea en DO del protocolo, se colocaron en una unidad de aislamiento. Estos lechones se vacunaron a los 2 dias de edad por la ¡ti«Lü ._í__._¿ ,_¿______,: vía intramuscular con varias soluciones de vacuna del plásmido. Las soluciones de vacuna se prepararon diluyendo las soluciones esenciales en solución salina fisiológica estéril (NaCl al 0.9%). Se vacunaron los lechones: ya sea sólo con el plásmido pJP109 o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y pJPlll o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y pJP058 o con la mezcla de los plásmidos pJP109, pJPlll y pJP058. Las soluciones de vacuna comprenden 500 µg de cada uno de los plásr.iidos. Volumen: Las soluciones de vacuna se inyectaron por la vía intramuscular en un volumen total de 2 ml . En la práctica, dando la edad de los lechones en la vacunación (1-2 días), se dio 1 inyección de 1 ml en cada uno de los lados del cuello (= 2 x 1 ml) . Se llevaron a cabo dos inyecciones de la vacuna a intervalos de dos semanas, que se nombran los días D2 y D14 del protocolo. Se aplicó la prueba inmunogénica el D21 del protocolo por administración oronasal de una suspensión viral de una cepa PCV-2 virulenta. Los lechones se observaron después durante 3 semanas para la aparición de los signos clínicos específicos del síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete en los lechones. Los signos que se observaron son: Temperatura rectal: medida diariamente durante los primeros 14 días, después dos mediciones durante la 3era semana después de aplicar la prueba inmunológica. Peso: se pesaron los lechones justo antes de la aplicar prueba inmunológica, después una vez por semana durante las 3 semanas después de que se aplicó la prueba inmunológica . Colección de muestras de sangre para probar la viremia y los anticuerpos: se tomaron muestras de sangre el D2, D14, D21, D28, D35 y D42. Autopsia: el D42, los cerdos sobrevivientes se eliminaron humanamente y se experimentó la autopsia para buscar lesiones anatómico-patológicas y hacer preparaciones histológicas del hígado, los ganglios linfáticos, el bazo, los ríñones y el timo para buscar lesiones en estos tejidos. 8.2. Lechones de 5-7 semanas de edad. Se vacunaron lechones de 5 hasta 7 semanas de edad, que ya no tenían anticuerpos maternales específicos para el virus PCV-2, por vía intramuscular: ya sea sólo con el plásmido pJP109, o con la mezcla de los plásmidos pJPl09 y pJPlll o con la mezcla de los plásmidos pJP109 y pJP058 o con la mezcla de los plásmidos pJP109, pJPlll y pJP058, las dosis de vacuna son las mismas como aquellas indicadas en el Ejemplo 8.1 (500 µg por plásmido). Las soluciones de vacuna se inyectaron por la vía intramuscular en un volumen de 2 ml (una administración simple de 2 ml, en los músculos del cuello) . Se realizaron dos vacunaciones a un intervalo de 21 días (DO y D21). Se aplicó una prueba inmunológica 14 días después de la última vacunación (D35) por administración intramuscular de una suspensión viral de una cepa PCV-2 virulenta. Los cerdos se observaron durante 8 semanas para la aparición de signos clínicos específicos del síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete en lechones. La observación clínica de los iechones después de aplicar la prueba inmunológica es idéntica a la que se describe en el Ejemplo 8.1, excepto que la duración total de la observación es de un tiempo de 8 semanas. Ejemplo 9: Vacunación de cerdos con ADN formulado con DMRIE-DOPE. Es posible usar, en lugar de las soluciones de plásmido de ADN descubierto descritas en el Ejemplo 8, soluciones de plásmido de ADN formuladas con DMRIE-DOPE. Se preparó una solución de ADN (que contenía uno o más plásmidos de conformidad con el Ejemplo 6) a 1 mg/ml en ¿i^í^L___Á__________ ___^__________é______- . . -.- ..r.*M.__...i. _Á.._ .^.r_.m , _,...... __ i _._.. . , _*;-&, ^?^^^B NaCl al 0.9%. Se preparó una solución de DMRIE-DOPE a 0.75 mM tomando un liofilizado de DMRIE-DOPE en un volumen apropiado de agua destilada estéril. La formación de los complejos lípido catiónico- 5 plásmido de ADN se realizó diluyendo, en partes iguales, la solución DMRIE-DOPE a 0.75 mM con la solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl al 0.9%. La solución de ADN se introduce gradualmente, con la ayuda de una jeringa montada con una aguja 26G, a lo largo de la pared del vial que contiene 10 la solución de lípido catiónico para evitar la formación de espuma. Se llevó a cabo una agitación lenta tan pronto como las dos soluciones se mezclaron. Se obtiene finalmente una composición que comprende 0.375 mM de DMRIE-DOPE y 500 µg/ml de ADN. 15 Es deseable para todas las soluciones usadas, que estén a temperatura ambiente para todas las operaciones descritas arriba. La formación del complejo ADN/DMRIE- DOPE se realiza a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de inmunizar los cerdos. 20 Los cerdos se vacunan después de conformidad con las condiciones descritas en los Ejemplo 8.1 y 8.2. Debe entenderse claramente que la invención definida por las reivindicaciones adjuntas no se limita a las modalidades especificas indicadas en la descripción de ??Á¡kM,i_m_m^_^¿___iA^ arriba, pero abarca las variantes que no se alejan ni del alcance ni del espíritu de la presente invención. i ^-.a^^^^^x-.i*^^ ¿á i £ &A^.

Reivindicaciones . 1. Una preparación inmunogénica o vacuna que comprende, por un lado, un plásmido que codifica y expresa un gen seleccionado del grupo que consiste del ORFl de PCV-2, ORF2 del PCV-2, ORFl del PCV-1 y ORF2 del PCV-1, y, por otro lado, un elemento capaz de incrementar la respuesta inmune dirigida contra el producto de expresión del gen. 2. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el elemento capaz de incrementar la respuesta inmune comprende DMRIE como adyuvante. 3. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el DMRIE se acopla a un lípido neutro. 4. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el DMRIE se acopla al DOPE. 5. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el elemento capaz de incrementar la respuesta inmune comprende un carbómero como adyuvante. 6. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ?á »?__i_í.^________?_?___ í el elemento capaz de incrementar la respuesta inmune comprende una citosina de porcino. 7. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la citosina de porcino es GM-CSF. 8. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque comprende un plásmido que codifica y expresa la citosma de porcino. 9. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el elemento capaz de incrementar la respuesta inmune comprende una citosina de porcino y un compuesto seleccionado del grupo que comprende DMRIE, DMRIE/DOPE y carbómero, como adyuvante. 10. La preparación inmunogénica o vacuna, de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende un plásmido que codifica y expresa otro inmunógeno porcino.

Figura 1/5 Plasmido pJP1Q9 ti a. ... _--cx ¿i..Mril_i;.

Figura 2/5 Plásmido pJP111 .rt ______________ *£)___. ._é___.4_jJ __.

Figura 3/5 Plasmido pJP120 Figura 4/5 Plásmido pJP121 Figura 5/5 Plasmido pJPOSd APÉNDICE 2. VACUNA DEL VIRUS RECOMBINANTE DE LA VIRUELA DEL CIRCOVIRUS PORCINO. Referencia cruzada a solicitudes relacionadas . Se hace referencia a la solicitud serie U.S. No. 09/082,358, presentada el 21 de mayo del 1998 y a la solicitud serie U.S. No. 09/161,092 presentada el 25 de septiembre del 1998 como una continuación del número de serie 09/082,558 cada una de los cuales se incorpora aquí como referencia junto con cada uno de los documentos ahí citados . Campo de la Invención La presente invención se refiere a virus de la viruela modificados y a métodos para la elaboración y usos de los mismos. Más en particular, la invención se refiere al ALVAC recombinante, cuyo virus expresa productos de genes del circovirus-2 porcinos (PCV2), y a composiciones o vacunas inmunológicas que inducen una respuesta inmune dirigida a los productos de genes PCV2 y que confieren inmunidad protectora contra la infección por PCV2. Se hace referencia a diversas publicaciones en esta solicitud. La cita completa de estos documentos se encuentra al final de la especificación que antecede a las reivindicaciones. Estos documentos se refieren al campo de esta invención, y cada uno de los documentos referenciado en esta solicitud, así como cada documento citado en cada uno de los documentos, se incorporan aquí en la presente como referencia. Antecedentes de la Invención El síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete (PMWS) es una enfermedad recientemente reconocida en los cerdos jóvenes. El PMWS se caracteriza clínicamente por la pérdida progresiva de peso y otros síntomas tales como la taquipnea, disnea e ictericia. Patológicamente, se han observado infiltrados lmfocíticos y granulomatosos, linfadenopatía y más raramente hepatitis y nefritis linfocítica y granulomatosa (Clark, 1997; Harding, 1997). Esta enfermedad ha sido descrita en diversos países europeos así como en Norteamérica. El tratamiento y prevención de esta enfermedad no está actualmente disponible . Diversas lineas de evidencia señalan al circovirus porcino como el agente etiológico del PMWS (Ellis y colaboradores, 1998). Se han recuperado los circovirus de cerdos con PMWS, y se han demostrado anticuerpos para el circovirus porcino con los cerdos con la enfermedad. Los circovirus son virus de ADN circular de hebra simple que se encuentran en una diversidad de especies ____. . ?__a_?k^^_ú^t_í__k_^^^M?^_m»)^_ _^______ Ék. animales y de plantas. El circovirus porcino se aisló originalmente como un contaminante de una línea celular de riñon de cerdo continua. El aislado del cultivo celular ha sido designado como PK/15 (Meehan y colaboradores, 1997) . Más recientemente, el circovirus porcino obtenido de cerdo con PMWS se ha comparado al PK/15. Tales virus difieren substancialmente del PK/15 al nivel de secuencia de proteínas y de nucleótido, y se han designado como PCV2 (Meehan y colaboradores, 1998; Hamel y colaboradores, 1998) . Se han identificado tantas como 13 estructuras de lectura abierta (ORF) en el genoma del PCV2 (CoLl al CoL13 en la solicitud de patente francesa 98 03707). Cuatro de estos ORF comparten una homología substancial con los ORF análogos dentro del genoma del PK/15. El ORFl (Meehan y colaboradores, 1998; que corresponde al COL4 en la solicitud de patente francesa 98 03707), comprende 398-1342 nt (número de acceso al GenBank AF055392), tiene el potencial de codificar una proteína con un peso molecular predicho de 37.7 kD. El ORF2 (Meehan y colaboradores, 1998; que corresponde al COL13 en la solicitud de patente 98 03707), comprende 1381-1768 nt unidos a 1-314 (número de acceso al GenBank AF 055392), puede modificar una proteína con un peso molecular predicho de 27.8 KD. El ORF3 (Meehan y colaboradores, 1998; que corresponde al C0L7 en la solicitud de patente francesa 98 03707), comprende 1018-704 nt (número de acceso al GenBank AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular predicho de 11.9 kD. El 0RF4 5 (Meehan y colaboradores, 1998; que corresponde al COL10 en la solicitud de patente francesa 98 03707), comprende 912-733 nt (número de acceso al GenBank AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular pronosticado de 6.5 kD. 10 El ORFl de PCV2 es altamente homólogo (86% de identidad) al ORFl del aislado PK-15 (Meehan y colaboradores, 1998) . La proteína ORFl del PK-15 se ha caracterizado parcialmente (Meehan y colaboradores, 1997; Mankertz y colaboradores, 1998a) . Se conoce que es 15 esencial para la replicación del virus y está probablemente involucrado en la replicación viral del ADN. La identidad de la secuencia de proteínas entre los ORF2 respectivos fue inferior (66% de identidad) a 20 aquella del ORFl pero cada uno de los ORF2 compartió una región N-terminal básica altamente conservada, similar a aquella observada en la región N-terminal de la proteína estructural principal del virus de la anemia de los pollos del circovirus de las aves (CAV) (Meehan y 25 colaboradores, 1998). Recientemente, Mankertz y colaboradores (1998b) han sugerido que el 0RF2 del aislado PK-15 (designado como ORF 1 en Mankertz y colaboradores, 1998b) codifica una proteína cápsida. Se observan diferencias superiores entre los 0RF3 y 0RF4 respectivos del aislado de PK-15 y del PCV2. En cada caso, hay una eliminación de la región terminal-C del 0RF4 y 0RF3 del PCV2 en comparación con los ORF correspondientes presentes en el genoma del aislado PK-15. La homología más alta la secuencia de proteínas se observa en las regiones N-terminal y en ambos, ORF3 y ORF4 (Meehan y colaboradores, 1998) . El análisis de trascripción del genoma del PCV2 no se ha publicado todavía. Los datos recientes obtenidos con el aislado PK-15 indican que el transcripto de ORF2 está empalmado (Mankertz y colaboradores, 1998b) . Los virus de vacuna se han usado exitosamente para inmunizar contra la viruela, culminando con la erradicación mundial de la viruela en 1980. Con la erradicación de la viruela, un nuevo rol para los virus de viruela se hizo importante, aquél de un vector preparado por ingeniería genética para la expresión de genes externos (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti y colaboradores, 1984). Los genes que codifican los antígenos heterólogos se han expresado en vacunas, resultando a menudo en una inmunidad protectora contra la prueba inmunogénica por el patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia y colaboradores, 1990) . Una cepa de vacuna altamente atenuada, designada como MVA, se ha usado también como un vector para las vacunas de base en el virus de viruela. El uso del MVA se describe en la patente de referencia U.S. No. 5,185,146. Dos sistemas vectores adicionales de vacuna involucran el uso de virus de viruela restringido naturalmente al huésped, virus de la viruela característico de las aves. Tanto el virus de viruela de la aves de corral (FPV; Taylor y colaboradores, 1988a, b) y el virus de viruela del canario (CPV; Taylor y colaboradores, 1991 & 1992) se han preparado por ingeniería para expresar productos externos de genes. El virus de viruela de las aves (FPV) es un virus prototípico del género Avipox de la familia de los virus de la viruela. El virus provoca una enfermedad económicamente importante de la producción avícola que ha sido bien controlada desde los años 1920 por el uso de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los virus de la viruela característicos de las aves, se limita a especies de aves (Matthe s, 1982) y no hay reportes en la literatura de virus de viruela en aves que provoquen una infección productiva en ninguna de las especies no aviarias incluyendo el hombre. Esta restricción del huésped proporciona una barrera de seguridad inherente a la transmisión del virus a otras especies, y hace uso de los vectores de vacuna basados en el virus de la viruela característico de la aves en aplicaciones veterinarias y humanas como una propuesta atractiva. El FPV se ha usado ventajosamente como un vector que expresa antígenos de patógenos de la producción avícola. La proteína de hemaglutinina de un virus de la influenza de la aves virulenta se expresa en un FPV recombinante (Taylor y colaboradores, 1988c) . Después de la inoculación del recombinante dentro de pollos y pavos, se induce una respuesta inmune que fue protectora contra la aplicación de la prueba inmunogénica del virus de la influenza virulenta homólogo o héterologo (Taylor y colaboradores, 1988c). Los recombinantes de FPV expresan las glicoproteínas de superficie del virus de la enfermedad de Ne castle se han también desarrollado (Taylor y colaboradores, 1990; Edbauer y colaboradores, 1990) . Otros vectores atenuados de virus de viruela se han preparado por modificaciones genéticas de cepas de tipo silvestre del virus. El vector NYVAC, derivado por eliminación de la virulencia específica y genes de intervalo de huésped de la cepa Copenhague de vacunas (Tartaglia y colaboradores, 1992) han probado ser útiles !¿AaÁi--^-^" -k- Í>*? ?. como un vector recombinante en la obtención de una respuesta inmunoprotectora contra un antígeno externo expresado. Otro vector del virus de viruela preparado por ingeniería es el ALVAC, derivado del virus de la viruela del canario. El ALVAC no replica productivamente en huéspedes no aviarios, una característica que se piensa que mejora su ' perfil de seguridad (Taylor y colaboradores, 1991 & 1992) . Tanto el ALVAC como el NYVAC son vectores de BSL-1. Un enfoque para el desarrollo de una subunidad de vacuna PCV2 , es el uso de vectores virales vivos para expresar ORF de PCV2 relevantes. los virus de viruela recombinantes se pueden construir en dos etapas conocidas en el arte y análogas a los métodos para la creación de recombinantes sintéticos de virus de viruela tales como el virus de vacuna y el virus de la viruela aviaria descritos en las patentes americanas U.S. Nos. 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112, 5,110,587, 5,174,993, 5,494,807, y 5,505,941, las descripciones de las cuales se incorporan aqui como referencia. Se puede así apreciar que el suministro de virus recombinantes de viruela de PCV2, y de composiciones y productos de los mismos particularmente recombinantes de PCV2 basados en ALVAC y composiciones y productos de los _.t_¿iiá,i_~í__- >.í -<i^.»Bi >¿ ¿¿ J. mismos, especialmente recombinantes tales que contienen ORFl y/o 2 del PCV2, y composiciones y productos de los mismos, serían un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología. Objetivos y Resumen de la Invención Es por lo tanto un objetivo de esta invención proporcionar composiciones y métodos para el tratamiento y profilaxis de la infección con PCV2. Es también un objetivo proporcionar un medio para tratar o evitar el PMWS. En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición de vacuna o inmunológica, antigénica o una composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica o inmunológica en un animal huésped inoculado con la composición, la vacuna incluye un portador y un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas en el virus no esenciales inactivadas, de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad enriquecida. El virus utilizado en la composición de conformidad con la presente invención, es ventajosamente un virus de viruela, particularmente un virus de vacuna o un virus de viruela aviaria, tal como un virus de viruela de las aves de corral y un virus de viruela del canario y más particularmente ALVAC. El virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región no esencial del genoma del virus, una secuencia heteróloga de ADN que codifica una proteína antigénica, por ejemplo, derivada del ORF del PCV2 por ejemplo ORFl y/o 2 del PCV2. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que contiene un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas por el virus inactivadas no esenciales, de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. El virus recombinante modificado incluye, con una región no esencial del genoma del virus, una secuencia heteróloga de ADN que codifica una proteína ant- génica (por ejemplo derivada de los ORF de PCV2, especialmente ORF 1 y/o 2) en donde la composición cuando se administra a un huésped, puede inducir una respuesta inmunológica específica del antígeno . Todavía en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas no esenciales codificadas por el virus, inactivadas allí de manera que el virus tiene virulencia atenuada, y en donde el virus recombinante modificado contiene además ADN de una fuente heteróloga en una región no esencial del genoma del ' virus. El ADN puede codificar los genes PCV2 como algunos -M am,. o todos los ORFl, 0RF2, 0RF3 y 0RF4 del PCV2 (Meehan y colaboradores, 1998). En particular, las funciones genéticas se inactivan al eliminar una estructura de lectura abierta que codifica un factor de virulencia o al utilizar virus restringidos por el huésped naturalmente. El virus usado de conformidad con la presente invención, es ventajosamente un virus de viruela o de erupciones pustulosas, particularmente un virus de vacuna o un virus de viruela característico de las aves, tal como el virus de la viruela de las aves de corral o el virus de la viruela del canario. Ventajosamente, la estructura de lectura abierta se selecciona del grupo que consiste de J2R, B13R+ B14R, A26L, A56R, C7L-K1L, y I4L (por la terminología reportada en Goebel y colaboradores, 1990) ; y la combinación de los mismos. A este respecto, la estructura de lectura abierta comprende un gen de timidina cinasa, una región hemorrágica, una región del cuerpo de inclusión de tipo A un gen de hemaglutinina, una región de gel del intervalo de huésped o una subunidad mayor, reductasa de ribonucleótido, o la combinación de los mismos. Una cepa apropiada modificada de Copenhague del virus de vacuna se identifica como NYVAC (Tartaglia y colaboradores, 1992), o un virus de vacuna del cual se han eliminado J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K11 y I4L ó un gen de timidina cinasa, una región hemorrágica, una región de cuerpo de inclusión * e tipo A, un gen de hemaglutinina una región del intervalo del huésped, y una subunidad grande, reductasa de ribonucleótido (ver también patente U.S. No. 5,364,773). Preferiblemente, el vector del virus de erupciones pustulosas es un ALVAC o un virus del la viruela del canario (cepa de vacuna Rentschler) que fue atenuado por ejemplo, a través de más de 200 pasos en serie en fibroblastos de embriones de pollos, una semilla maestra del mismo se sometió a 4 purificaciones sucesivas de plagas bajo agar, a partir de lo cual un clon de la plaga se amplificó a través de 5 pasos adicionales. La invención todavía en un aspecto adicional se refiere al producto de la expresión del virus de viruela recombinante de la invención y usos para el mismo, tal como para formar composiciones de vacuna o inmunológicas antigénicas para el tratamiento, prevención, diagnóstico o prueba; y al ADN del virus recombinante que es útil para la construcción de sondas de ADN y cebadores PCR. En un aspecto, la presente invención se refiere a un virus recombinante de viruela que contiene en él una secuencia de ADN del PCV2 en una región no esencial del genoma del virus de la viruela. El virus de viruela es ventajosamente un virus de viruela característico de las aves, tal como un virus de viruela de las aves de corral, especialmente un virus de viruela atenuado de las aves de corral, o un virus de viruela del canario especialmente un virus atenuado de la viruela del canario tal como el ALVAC . De conformidad con la presente invención, el virus de viruela recombinante expresa productos de genes del gen externo PCV2. Los ORF específicos del PCV2 se insertan dentro del vector del virus de la viruela y el virus recombinante de viruela resultante se usa para infectar un animal. La expresión en el animal de los productos de gen PCV2 resultan en una respuesta inmune en el animal al PCV2. Así, el virus recombinante de viruela de la presente invención puede usarse en una composición inmunológica o vacuna para proporcionar un medio para inducir una respuesta inmune que puede poro no necesita ser protectora. El procedimiento de administración para el PCV2 recombinante del virus de viruela o el producto de expresión del mismo, composiciones de la invención tales como composiciones de vacuna o antigénicas, inmunológicas o composiciones terapéuticas, pueden ser por medio de una vía parenteral ( intradermal, intramuscular o subcutánea) . Tal administración permite la respuesta inmune sistémica o respuestas humorales o mediadas por células.

Más generalmente, las composiciones PCV2 de virus de viruela de vacuna o inmunológicas, antigénicas, recombinantes del PCV2 del virus de viruela de la invención, o composiciones terapéuticas, se pueden preparar de conformidad con técnicas estándar bien conocidas por aquellos con habilidad en el arte farmacéutico o veterinario. Tales composiciones se pueden administrar en dosis y por técnicas bien conocidas por aquellos hábiles en las artes médicas o veterinarias tomando en cuenta factores como la edad, sexo, peso, especie, y condición del paciente en particular y la vía de administración. Las composiciones se pueden administrar solas o se pueden co-administrar ó administrar secuencialmente con composiciones, por ejemplo con "otras" composiciones terapéuticas o de vacuna o antigénicas, inmunológicas, por lo cual se proporcionan composiciones de combinación del cóctel ó multivalentes de la invención y métodos que las emplean. Nuevamente, los ingredientes y la forma de administración (secuencial o co-administración), así como las dosis, se pueden determinar tomando en cuenta factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente en particular y la vía de administración a este respecto, se hace referencia la patente U.S. No .5, 843, 456, que se incorpora aquí como . ~m,.,a¡tj*> -f fa -Hra .«-afc)i«.*d»*Aa..u **«f«»~-.*» ......?á^. referencia y que se dirige a composiciones de la rabia y composiciones de combinación y usos de la misma. Ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas para orificios, por ejemplo oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, etc, administración tal como suspensiones, jarabes o elíxires y preparaciones para administración parenteral subcutánea, intradermal, intramuscular, o intravenosa (por ejemplo administración inyectable) tal como suspensiones o emulsiones estériles. En tales composiciones el virus recombinante de la viruela o los antígenos pueden estar en una mezcla con un portador, diluyente o excipiente apropiado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones pueden estar -cambien liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, emulsificantes, agentes amortiguadores del pH, adyuvantes, gelificantes, o aditivos enriquecedores de la viscosidad, conservadores, agentes saborizantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Los textos estándar tales como "REMINGTON PHARMACEUTICAL SCIENCE", edición 17, 1985, que se incorporan en la presente como referencia, se pueden consultar para preparar preparaciones apropiadas sin experimentación indebida. Las dosis apropiadas se pueden también basar en los ejemplos abajo. Las composiciones pueden contener al menos un compuesto adyuvante elegido de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los co-polímeros del anhídrido maleico y derivados de alquenilo. Los componentes adyuvantes preferidos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con éteres de poli alquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Pharmeuropa Vol. 8. No. 2, junio 1996.). Las personas con habilidad en el arte se pueden también referir a la patente U.S. No. 2,909,462, (que se incorpora en la presente como referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticuiados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos 3 hidroxilos se reemplazan por radicales alifáticos no saturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos, y otros grupos etilénicamente no saturados. Los radicales no saturados pueden en si mismos contener otros sustituyentes tales como metilo. Los productos que se venden bajo el nombre de Carbopol® (BF níín ._.íí já_%____...í ifc A. *,-'-ti_A.*?^&*üí~^_ ?.k-?M_.:~ Goodrich, Ohio, USA) son particularmente apropiados. Están reticulados con una sacarosa de alilo ó pentaeritritol de alilo. Entre ellos se puede mencionar el Carbopol® 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros del anhídrido maléico y derivados de alquenilo, los copolímeros EMA® (Mnosanto) que son copolímeros del anhídrido maléico y del etileno, lineal ó reticulado, por ejemplo reticulado con éter de divinilo, se prefieren. Se puede hacer referencia a J: Fields y colaboradores, Nature, 186: 778-780, 4 junio, 1960, que se incorpora en la presente como referencia. Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido metacrilico o acrílico y los copolímeros EMA® se forman preferiblemente de las unidades básicas de la siguiente fórmula. en la cual Ri y R2 son idénticos o diferentes, representa H ó CH3 X= 0 ó 1 preferiblemente X=l Y= 1 ó 2 con X + Y= 2 Para los copolímeros EMA®, X=0 , y Y=2. para los carbómeros, X= Y=l .

La disolución de estos polímeros en agua, conduce a una solución acida que se neutraliza preferiblemente hasta un pH fisiológico con objeto de dar la solución adyuvante en la cual se incorporará la vacuna misma. Los grupos carboxilo del polímero están parcialmente en la forma COO". Preferiblemente, una solución de adyuvante de conformidad con la invención, especialmente de carbómero, se prepara en agua destilada preferiblemente en presencia de cloruro de sodio, la solución obtenida tiene un pH ácido. Esta solución de reserva se diluye al agregarle la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada) , o una parte substancial de la misma de agua cargada con NaCl, preferiblemente solución salina fisiológica (NaCL 9 g/l) todos a la vez en diversas porciones con neutralización concomitante o posterior (pH de 7.3 a 7.4), preferiblemente con NaOH. Esta solución a un pH fisiológico se usará como es para mezclarse con la vacuna, que se puede almacenar especialmente en forma congelada o liquida, secada por congelación. La concentración de polímeros de la composición final de vacuna será de 0.01% hasta 2% v/v, más particularmente 0.06 hasta 1% v/v, preferiblemente 0.1% hasta 0.6% v/v.

Las composiciones inmunológicas de conformidad con la invención se pueden asociar con al menos una subunidad de vacuna, inactivada, atenuada viva, o una vacuna recombinante (por ejemplo virus de erupciones pustulosas como un vector o un plásmido de ADN) que exprese al menos un inmunógeno o epítope de interés desde al menos otro patógeno de cerdo. Estas y otras modalidades se describen y son obvias y se abarcan por la siguiente descripción detallada. Breve descripción de los dibujos Un mejor entendimiento de la presente invención se tendrá con referencia a los dibujos anexos en los cuales: Figura 1 (SEQ ID NO:l) muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de un par de 3.7 kilobases de ADN de ALVAC que contiene la estructura de lectura abierta C6. Figura 2 muestra el mapa de un plásmido donador pJP102. Figura 3 (SEQ ID NO: 8) muestra la secuencia del nucleótido del fragmento de 2.5 kilo pares base del plásmido donador pJP102 del Kpnl (posición 653) al Sacl (posición 3166) sitios de restricción. Figura 4 muestra el mapa del plásmido donador pJP105. . g...» t ? rí. ¿t^____s__¡* Figura 5 muestra el mapa del plásmido donador pJP107. Figura 6 (SEQ ID NO: 11) muestra la secuencia del nucleótido del fragmento de 3.6 kilo pares base del plásmido donador pJP107 del Kpnl (posición 653) al Sacl (posición 4255) sitios de restricción. Descripción detallada de la invención. La invención se dirige a virus recombinantes de la viruela que contiene en ellos una secuencia del ADN del PCV2 en una región no esencial del genoma del virus de la viruela. Los virus recombinantes de la viruela expresan productos de genes del gen externo PCV2. En particular, los genes ORF2 y ORFl que codifican proteínas PCV2 se aislaron, caracterizaron e insertaron dentro de recombinantes ALVAC (vector de la viruela del canario) . las técnicas de biología molecular usadas, son aquellas descritas por Sambrook y colaboradores, (1989). Líneas celulares y cepas de virus. La cepa de PCV2 designada como Imp.1010-Stoon ha sido previamente descrita (Meehan y colaboradores, 1998). Se aisló de tejidos de ganglios linfáticos mesentéricos de un cerdo enfermo originario de Canadá. La clonación del genoma PCV2 se describe por Meehan y colaboradores, (1998). El plásmido pGem7Z-Impl010-Stoon-EcoRI No.14 contiene el genoma PCV2 como un fragmento EcoRl insertado dentro del Itá?éMÉá^?^ ?iMI^.í?k iin tiii?^^ -^afc¿A.»«?áá á^ .r^ ^'AA^,fc?^ ^A ¿ii • ^? s_.HM« sitio EcoRl del plásmido pGem-7Z (Promega, Madison, Wl). La secuencia completa de nucleótido de la cepa Imp. 100- Stoon PCV2 se ha determinado por Meehan y colaboradores, (1998) y está disponible bajo el número de acceso del GenBank AF055392. El virus parental de la viruela del canario (cepa Rentschler) es una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna se obtuvo de un aislado de tipo silvestre y se atenuó a través de más 200 pasos en serie sobre fibroblastos del embrión del pollo. Una semilla viral maestra se sometió a 4 purificaciones sucesivas de placas bajo agar y un clon de placas se amplificó a través de 5 pares adicionales después de lo cual el virus de reserva se usó como el virus parental en pruebas de recombinación in vitro. El aislado de virus de canario purificado en placas se designa como ALVAC. El ALVAC se depositó el 14 de noviembre de 1996 bajo los términos del tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, número de acceso ATCC VR-2547. La generación de los recombinantes del virus de la viruela involucran diferentes etapas: (1) construcción de un plásmido de inserción que contiene secuencias ("brazos") que flanquean el lugar de inserción dentro del genoma de virus de viruela y sitios de clonación múltiples (MCS) localizados entre los dos brazos kíAÁÁááAj?mÍMi ..^.sa* __i l?í _______'- --^ --*" ¿ .¿¿mt-i, -__t¡i¿.___* !~~ - ...srS... i*. -.^frß?f. ^ H|ü-| ?i?-t i flanqueantes (ver por ejemplo 1); (2) construcción de los plásmidos del donador que consisten de un plásmido de inserción dentro del MCS en el cual ha sido insertado un cásete de inserción de un gen externo (por ejemplo ver ejemplos 2 hasta 5); (3) recombinación in vitro en cultivos de células entre los brazos del plásmido donador del genoma del virus de viruela parental, permitiendo la inserción del cásete de expresión del gen externo dentro del lugar apropiado del genoma del virus de viruela, y la purificación de placas de virus recombinantes (ver por ejemplo, Ejemplo 6). Los inmunógenos recombinantes de PCV2 se pueden usar en asociación con los inmunógenos de PCVl para la inmunización de animales contra el PMWS. En el enfoque menos preferido, los inmunógenos PCVl se pueden usar sin inmunógenos PCV2. La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes. Ejemplo 1- CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO E INSERCIÓN DE LA VIRUELA DEL CANARIO EN EL LUGAR C6. La figura 1. (SEQ ID NO:l) es la secuencia de un segmento de 3.7 kb del ADN de la viruela del canario. El análisis de la secuencia revela un ORF designado como C6L que inicia en la posición 377 y termina en la posición 2254. Lo siguiente describe un plásmido de inserción C6 construido al eliminar el ORF C6 y reemplazándolo con una clonación múltiple (MCS) flanqueado por señales de terminación traduccional y transcripcional. Un fragmento PCR 380 pb se amplifica de un ADN de viruela de canario genómica usando cebadores de oligonucleótido C6A1 (SEQ ID NO:2) y C6B1 (SEQ ID NO:3). Un fragmento PCR de 1155 pares base se amplifica del ADN de la viruela de canario genómico usando cebadores de oligonucleótido C6C1(SEQ ID NO: 4) y C6D1(SEQ ID NO: 5). Los fragmentos de 380 pares base y 1155 pares base se funden juntos al agregarlos en conjunto como plantilla y amplificar un fragmento por PCR por 1613 pares base usando los cebadores de oligonucleótido C6A1 (SEQ ID NO:2) y C6D1(SEQ ID NO:5). Este fragmento se digiere con Sacl y kpnl y se liga dentro de un pBluescript Sk+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) digerido con Sacl/Kpnl. El plásmido resultante pC6L se confirma por una análisis de secuencia de ADN. Consiste de un ADN de viruela de canario de 370 pares base en la dirección 6' de la señal de terminación temprana de vacuna del C6 ("brazo izquierdo del C6"), codones de detención de la traducción en 6 estructuras de lectura, un MCS que contiene los sitios Smal, Pstl, Xhol, y EcoRl, señal de terminación temprana de vacuna, codones de detención de la traducción en 6 estructuras de lectura y 1156 pares base de una secuencia de viruela de canarios en la dirección 3' ("brazo derecho de C6") . El plásmido pJP099 se derivó del pC6L al ligar un cásete que contenía al promotor H6 de vacuna (descrito en Taylor y colaboradores, (1988c) , Guo y colaboradores, (1989), y Perkus y colaboradores, (1989)), acoplado a un gen externo dentro de los sitios Smal/EcoRl del pC6L.

Este plásmido pJP099 contiene un sitio EcoRV único y un sitio Nrul único localizado en la terminación 3' del promotor H6 y un sitio Salí único localizado entre el codón de detención del gen externo y el brazo izquierdo C6. El fragmento -EcoRV/Sall ó Nrul/Sall del pJP099 contiene la secuencia del plásmido (pBluescript SK+; Stratagene, La Jolla, CA, USA) , los dos brazos 6C y la terminación 5' del promotor H6 hasta el sitio EcoRv ó Nrul. Secuencia de los cebadores: Cebador C6A1 (SEQ ID NO: 2) ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAAGTCTTAATGAGTT Cebador C6B1 (SEQ ID NO: 3) GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTC GTAAGTAAGTATTTTTATTTAA Cebador C6C1 (SEQ ID NO: 4) CCCGGGCTCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGGAG TATATAATAATTGAAAAAGTAA % A. ^£^&.¿tob^^ ^a^Í^ia^a&lh^.^fet?if. ^ .??SÍ.Í. .

Cebador C6D1 (SEQ ID NO: 5) GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG Ejemplo 2- CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO DEL DONADOR ALVAC PARA EL ORF2 DEL PCV2 El plásmido pGem7Z-Impl010. Stoon-EcoRI No. 14, que contenía al genoma del PCV2 como un fragmento EcoRl en el plásmido pGem-7Z, se digirió con EcoRl, de un fragmento de 1768 pares base, se aisló y se ligó. Con objeto de ligar el 0RF2 del PCV2 dentro de un vector de inserción ALVAC apropiado, los cebadores JP760 (SEQ ID NO: 6) y JP773 (SEQ ID N0:7) se usaron para amplificar el ORF2 del PCV2 de un fragmento ligado de EcoRl de 1768 pares base (ver arriba) que resulta en el PCR JI304. El cebador JP760 (SEQ ID NO: 6) contiene la terminación 3' del promotor H6 del EcoRV y la terminación 5' del ORF2 del PCV2. El cebador JP773 (SEQ ID NO: 7) contiene la terminación 3' del 0RF2 del PCV2 seguido por un sitio Salí. El producto de PCR JI304 se digiere después con EcoRV/Sall y se clona como un fragmento de alrededor de -750 pares base dentro de un fragmento de alrededor de -4.5 pares base de EcoRV/Sall del pJP099 (ver arriba en el ejemplo 1). El plásmido resultante se confirma por el análisis de secuencia y se designa pJP102 (ver el mapa del pJP102 en la figura 2 y la secuencia (SEQ ID NO: 8) en la figura 3). La secuencia del ORF2 corresponde con la secuencia disponible del GenBank, número de acceso AF055392. El plásmido donador pJP102 (linealizado con Notl) se usa en una prueba de recombinación in vitro (IVR) prueba para generar el vCP1614 recombinante de ALVAC (ver ejemplo 6) . Secuencia de los cebadores. JP760 (SEQ IDNO:6) CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-ACG-AGG-CG JP773 (SEQ ID N0:7) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGC-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC EJEMPLO 3- CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO DONADOR ALVAC PARA LOS ORFl Y ORF 2 DEL PCV2 El ORFl del PCV2 se amplificó por PCR usando los cebadores JP774 (SEQ ID NO: 9) y JP775(SEQ ID NO: 10) sobre el plásmido pGem7Z-Impl010-Stoon-EcoRl No. 14 resultando en PCR J1311. El cebador JP774 (SEQ ID NO: 9) contiene la terminación 3' del promotor H6 del Nrul y la terminación 5' del ORFl del PCV2. El cebador JP775(SEQ ID NO: 10) contiene la terminación 3' del ORFl del PCV2 seguido por un sito Salí. El producto de PCR J1311 (~lKb) se clonó dentro de pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El plásmido resultante se confirma por un análisis de secuencia y se designa pJP104. La secuencia de ORFl corresponde con la secuencia disponible del GenBank número de acceso Afcl-fa. ^¿¿ g^ .?__¿j_ j..., ______,„_'.• _t.:..^u.r AF055382. Un fragmento de alrededor 970 pares base de Nrul/sall se aisla de pJP104 y se clona dentro de un fragmento -4.5 kb Nrul/Sall de pJP099 (ver ejemplo 1), resultando en un plásmido que se confirma por análisis de restricción y se designa pJP105 (ver figura 4). El plásmido donador pJPl05 se puede usar en una prueba de recombinación in vitro (descrita en el ejemplo 6) para generar un recombinante ALVAC que expresa el ORFl del PCV2. Un BamHl/Sall de -838 pares base del pJP102 (ver ejemplo 2) se completa en sus pares base usando el fragmento Klenow de una polimerasa de ADN, y se clona den ro del sitio EcoRl de Klenow combinado en sus pares base de pJP105. Se verifican los clones para su orientación del inserto por un análisis de restricción y una orientación tope a tope se escoge. Este plásmido se confirma por un análisis de secuencia y se designa pJP107 (ver el mapa de pJP107 en la figura 5 y la secuencia (SEQ ID NO: 11) en la figura 6. El plásmido donador pJP107 (linealizado con Notl) se usa en una recombinación in vitro 5(TVR), prueba para generar el vCP1615 recombinante de ALVAC (ver ejemplo 6). Secuencia de los cebadores: JP774 (SEQ ID NO:9) CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC- CAG-CAA-GAA-GAA-TGG JP775 (SEQ ID NO:10) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG Ejemplo 4-construcción del plásmido donador ALVAC para el 0RF2 de PCVl El plásmido pPCVl (B. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227), que contiene al genoma del PCVl como un fragmento Pstl en un plásmido pGem-7Z, se usa como una plantilla para amplificar 0RF2 del PCVl. Con objeto de insertar el ORF2 del PCV2 dentro de un vector de inserción apropiado ALVAC. Los cebadores JP787 (SEQ ID NO:12) y JP788 (SEQ ID NO:13) se usaron para amplificar el ORF2 del PCVl del plásmido pPVCl (ver arriba) que resulta en el PCR J1315. El cebador JP787 (SEQ ID NO: 12) contiene la terminación 3' del promotor H6 del EcoRV y el ORF2 seguido por un sitio Salí. El producto de PCR J1315 se refiere después con EcoRV/Sall y se clona como un fragmento de alrededor de -750 pares base dentro de un fragmento de alrededor -4.5 kb EcoRv/Sall del pJP099 (ver arriba en el ejemplo 1) . El plásmido resultante se confirma por un análisis de secuencia y se designa pJP113. La secuencia del ORF2 corresponde a la secuencia disponible en el Genbank, número de acceso U48186. El plásmido donador pJP113 (linealizado con Notl) se usa en una recombinación in vitro (TVR) prueba para generar el VCP1621 recombinante de ALVAC (ver ejemplo 7) . Secuencia de los cebadores: JP787 (SEQ ID N0:12) CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG- CCA-AGG-AGG-CG JP788 (DEQ ID N0:13) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G EJEMPLO 5- CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO DONADOR ALVAC PARA EL ORF2 Y ORFl DEL PCVl El plásmido pPCVl (ver ejemplo 4 arriba) que contiene el genoma de PCVl como un fragmento Pstl en el plásmido pGem-7Z, se digiere con Pstl, y un fragmento de 1759 pares base se aisla y se liga. Los cebadores JP789 (SEQ ID NO:14) y JP790 (SEQ ID NO:15) se usan para amplificar el ORFl del PCVl del fragmento 1759 pares base ligado a Pstl (ver arriba) , que resulta en PCR J1216. El cebador JP789 (SEQ ID NO: 14) contiene la terminación 3' del promotor H6 Nrul y la terminación 5' del ORFl del PCVl. El cebador JP790 (SEQ ID NO: 15) contiene la terminación 3' del ORFl del PCVl seguido por un sitio Salí. El producto de PCR J1316 (-1 Kb) se clona dentro de pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El plásmido resultante se confirma, por un análisis de secuencia y se designa pJP114. La secuencia del ORFl corresponde a la secuencia disponible en el GenBank número de acceso, U49186. Un fragmento de alrededor de -970 pares base de Nrul/Sall se aisla de pJP114 y se clona dentro de un fragmento de alrededor de -4.5 kb de Nrul/Sall del pJP099 (ver ejemplo 1), resulta en un plásmido que se confirma por un análisis de restricción y se designa pJP115. El plásmido donador pJP115 puede usarse en una prueba de recombinación in vitro (descrita en el ejemplo 7) para generar un ALVAC recombinante que expresa el ORFl del PCVl. Un BamHI/SalI de alrededor de 838 pares base de pJP113 (ver ejemplo 4) se completa en sus pares base usando un fragmento de Klenow de la polimerasa de ADN, y se clona dentro del sitio de EcoRI completo en sus pares base de Klenow de± pJP115. Se verifican los clones para su orientación del inserto por análisis de restricción y se escoge una orientación tope a tope. Este plásmido se confirma por análisis de secuencia y se designa pJP117. El plásmido donador pJP117 (linealizado con Notl) se usa en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el vCP1622 recombinante del ALVAC (ver ejemplo 7) . Secuencia de los cebadores JP789 (SEQ ID NO:14) CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC- AAG-CAA-GAA-AAG-CGG JP 790 (SEQ ID NO:15) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG Ejemplo 6 - GENERACIÓN DE LOS RECOMBINANTES DE PCV2- ALVAC . Se linealizaron los plásmidos pJP102 (ver ejemplo 2 y figura 2) y pJP107 (ver ejemplo 3 y figura 5) con Notl y se transfectaron dentro de las células CEF primarias infectadas con ALVAC al usar el método de precipitación con fosfato de calcio previamente descrito (Panicali and Paoletti, 1982; Piccini y colaboradores, 1987). Se seleccionan las placas positivas con base en la hibridación a sondas específicas radioetiquetadas con PCV2 y sometidas a cuatro rondas secuenciales de purificación de placas hasta que se alcanza una población pura. Una placa representativa para cada IVR se amplifica después y el y los recombinantes de ALVAC resultante se designan vCP1614 y vCP1615. El virus VCP1614 es el resultado de los eventos de recombinación entre el ALVAC y el plásmido donador pJP102, y contiene el ORF2 del PCV2 insertado dentro de los lugares C6 de ALVAC. El virus vCP1615 es el resultado de los eventos de recombinación entre el ALVAC y el plásmido donador pJP107, y contiene el ORF2 y ORFl de PCV2 insertado dentro del lugar C6 del ALVAC en una orientación tope a tope.

De una forma similar, un ALVAC recombinante que expresa solamente el ORFl del PCV2 se puede generar usando el plásmido donador pJP105 descrito en el ejemplo 3. Inmunofluorescencia . Con objeto de determinar si las proteínas PCV2 se expresan en células Vero infectadas recombinantes de ALVAC, se lleva a cabo el análisis de inmunofluorescencia (IF). Las células Vero infectadas se lavaron con PBC 24 horas después de la infección (m.o.i. de aproximadamente 10) y se fijan con acetona fría al 95% por 3 minutos a temperatura ambiente. Se usan cinco preparaciones de anticuerpos monoclonales (MAb) (sobrenadante del hibridoma) específicas para PCV2 ORFl (PCV2 199 ID3GA & PCV2 210 7G5GD) ó ORF2 ( PCV2 190 4C7CF, PCV2 190 2B1BC & PCV2 190 3A8BC) , como el primer anticuerpo. Estos anticuerpos monoclonales específicos se obtienen de Merial-Lyon. Se pueden también obtener los anticuerpos monoclonales siguiendo las enseñanzas de los documentos allí citados, por ejemplo las solicitudes de patente serie U.S. Nos. 09/082,358 y 09/161,092, que se incorporan aquí como referencia. La reacción de IF se lleva a cabo como se describe por Taylor y colaboradores, (1990) . La inmunofluorescencia específica del PCV2 con los tres anticuerpos específicos de ORF2 se puede detectar en t?- _*-k ií,i.i. *_üí, _£ _^ células infectadas con vCP1614 y células infectadas con vCP1615. La inmunofluorescencia específica del PCV2 con los dos anticuerpos específicos de ORFl se puede detectar en células infectadas solamente con VCP1615. Estos resultados indican que como se espera, el vCP1614 expresa solamente 0RF2, mientras que el vCP1615 expresa ORFl y 0RF2. No se detecta fluorescencia en las células Vero infectadas con ALVAC parentales ni en células Vero no infectadas . Ejemplo 7 - GENERACIÓN DE LOS RECOMBINANTES DE PCVl DE ALVAC . Los plásmidos pJP113 (ver ejemplo 4) y pJP117 (ver ejemplo 5) se linealizan con el Notl y se transfectan dentro de células CEF primarias infectadas con ALVAC al usar el método de precipitación con fosfato de calcio previamente descrito (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini y colaboradores, 1987). Se seleccionan placas positivas con base en la hibridación de las sondas radioetiquetadas específicas de PCVl y se someten a cuatro rondas secuenciales de purificación de placas hasta que se logra una población pura. Se amplifica después una placa representativa de cada IVR y los recombinantes resultantes de ALVAC se designan vCP1621 y vCP1622. El virus vCP1621 es el resultado de los eventos de recombinación entre ALVAC y el plásmido donador pJP113, y ¥ í • ía..k_ii? ?_Ái_____M,.i..%L.s_i!_i^.^..... . _.,..^__i..í^^.¿_. . .?^ ^..j__^__^.,.rt_^M^^^..,^.^^s^ t.t. ¡ ^_^_&_t.¡s_*_ contiene el 0RF2 del PCVl insertado dentro del lugar C6 de ALVAC. El virus VCP1622 es el resultado de los eventos de recombinación entre ALVAC y el plásmido donador pJP117, y contiene el 0RF2 y ORFl del PCVl insertado dentro del lugar C6 de ALVAC en una orientación tope a tope . En una forma similar, un ALVAC recombinante que expresa solamente el ORFl de PCVl se puede generar usando el plásmido donador pJP115 descrito en el ejemplo 5. Inmunofluorescencia . Con objeto de determinar si las proteínas PCVl se expresan en células Vero infectadas recombinantes de ALVAC, se lleva a cabo el análisis de inmunofluorescencia (IF). Se lavan las células Vero infectadas con PBS 24 horas después de la infección (m.o.i. de aproximadamente 10) y se fijan con acetona fría al 95% por 3 minutos a temperatura ambiente. Un suero policlonal de cerdo específico anti-PCVl (Alian G. y colaboradores, Vet. Microbiol. 1999. 66:115-123) se usa con el primer anticuerpo. La reacción IF se lleva a cabo como se describe por Taylor y colaboradores, (1990). La inmunofluorescencia específica de PCVl puede detectarse en células infectadas con vCP1621 y células infectadas con vCP1622. Estos resultados indican que como se espera, vCP1621 y vCP1622 expresan productos específicos de PCVl. No se detectó fluorescencia con un suero policlonal de cerdo específico de PCV2 en células infectadas con VCP1621 ni en células infectadas con vCP1622. No se detectó fluorescencia en células Vero infectadas con ALVAC parental ni en células Vero no 5 infectadas. Ejemplo 8 : FORMULACIÓN DE LOS VIRUS RECOMBINANTES DE VIRUELA DE CANARIO CON CARBOPOL™ 974P. Para la preparación de vacunas, los virus recombinantes de viruela de canario VCP1614 y vCP1615 (ejemplo 6) se 10 pueden mezclar con soluciones de carbómero. De la misma manera, los virus recombinantes de viruela de canario vCP1621 y vCP1622 (ejemplo 7) se pueden mezclar con soluciones de carbómero. El componente de carbómero usado para la vacunación de cerdos de conformidad con la 15 presente invención es el Carbopol™ 974P fabricado por la compañía BF Goodrich (peso molecular de # 3,000,000). Una solución de reserva de Carbopol™ 974P al 1.5% se prepara primero en agua destilada que contiene 1 g/l de cloruro de sodio. Esta solución de reserva se usa después para 20 fabricar una solución Carbopol™ 974P de 4 mg/ml en agua fisiológica. Se mezcla la solución de reserva con el volumen requerido de agua fisiológica, ya sea en una etapa o en diversas etapas sucesivas, ajustando el valor de pH en cada etapa con una solución de hidróxido de 25 sodio 1N (o más concentrada) para obtener un valor final fe&^.;^^^fciii Ífc ;ty|^-^^!M^.^.jJt. **, __*___.*._? &.^Ji .^t-^a^^i^^fc-^~^»--^*?teto^^^^.^»»«t .a»A<*Al de PH de 7.3-7.4. Esta solución final Carbopol™ 974P es una solución lista para usar para reconstituir un virus recombinante liofilizado o para diluir una reserva de virus recombinante concentrado. Por ejemplo, para obtener una suspensión viral final que contiene 10c8 pfu por dosis de 2 ml, se puede diluir 0.1 ml de una reserva de 10c9 pfu/ml solución dentro de 1.9 ml de la solución lista para usar de Carbopol™ 974P anterior de 4 mg/ml. De la misma manera, las soluciones listas para usar de Carbopol™ 974P de 2 mg/ml se pueden también preparar. Ejemplo 9 - INMUNIZACIÓN DE CERDOS Y APLICACIÓN DE LA PRUEBA INMUNOGENICA POSTERIOR. 9.1. INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 1 DÍA DE EDAD. Se colocan grupos de lechones, derivados de cesárea en el día 0, dentro de aisladores. Los lechones se vacunan por vía intramuscular el día 2 con diversas soluciones de vacuna. Se preparan las soluciones vírales de vacuna por dilución de las reservas de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl 0.9%). Los intervalos apropiados para suspensiones vírales se pueden determinar empíricamente pero estarán generalmente en el intervalo de 106 hasta 1010, y preferiblemente alrededor de 1010, pfu/dosis. Se puede también preparar soluciones de vacuna al mezclar la suspensión de virus recombinante con una solución de Carbopol™ 974 P como se describe en el ejemplo 8. Los lechones se vacunan con: Virus recombinante vCP1614 (ejemplo 2) Virus recombinante vCP1615 (ejemplo 3) Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (solución 4 mg/ml) Virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (solución 4 mg/ml) . Las suspensiones virales contienen 10c8 unidades formadoras de placa (pfu) por dosis. Cada suspensión viral se inyecta por vía intramuscular bajo un volumen de 1 ml . La inyección intramuscular se administra dentro de los músculos del cuello. Dos inyecciones de suspensiones vírales se administran en el día 2 y día 14 del experimento. Se hace una prueba inmunogénica el día 21 por administración oronasal de una suspensión viral preparada a partir de un cultivo de cepa virulenta de PCV-2. Después de la prueba inmunogénica, se observan los lechones durante 3 semanas para signos clínicos específicos del síndrome multisistémico posterior al destete. Se registran los siguientes signos: Temperatura rectal: monitoreo diario durante 2 semanas posteriores a la prueba inmunogénica, después dos medidas de temperatura rectal durante la tercera semana. Peso: Se pesan los lechones justo antes de la prueba inmunogénica y después semanalmente durante las primeras 3 semanas posteriores a la prueba inmunogénica. Se toman muestras de sangre el día 2, día 14, día 21, día 28, día 35 y día 42 del experimento con objeto de observar los niveles de viremia y las concentraciones de anticuerpo específicas de anti-PCV-2. Necropsias: El dia 42, todos los lechones sobrevivientes se les aplica la eutanasia humanamente y se aplica la necropsia para buscar lesiones macroscópicas específicas por PW S . Se preparan muestras de tejido del hígado, ganglios linfáticos, bazo, ríñones y timo con objeto de buscar lesiones histológicas específicas. 9.2 INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 5-7 SEMANAS DE EDAD. Se vacunan lechones de 5-7 semanas de edad libres de anticuerpos maternales específicos de anti-PCV-2 por vía intramuscular con diversas soluciones de vacunas. Las suspensiones virales de vacunas se preparan por dilución de reservas de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl 0.9%). Se pueden también preparar soluciones de vacuna al mezclar la suspensión de virus recombinante con una solución de Carbopol™ 974P, como se describe en el ejemplo 8. Los lechones se vacunan con: Virus recombinante VCP1614 (ejemplo 2) Virus recombinante VCP1615 (ejemplo 3) Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (solución 4 mg/ml) Virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (solución 4 mg/ml) . Las suspensiones que contienen 10c8 unidades formadoras de placa (pfu) por dosis. Cada suspensión viral se inyecta por vía intramuscular bajo un volumen de 2 ml . La inyección intramuscular se administra dentro de los músculos de cuello. Dos inyecciones de suspensiones virales se administran el día 0 y el día 21 del experimento. Se hace una prueba inmunogénica el día 35 por una administración oronasal de una suspensión viral preparada de un cultivo de cepa virulenta PCV-2. Después de la prueba inmunogénica, se observan los lechones durante 8 semanas para signos clínicos específicos del síndrome multisistémico posterior al destete. La observación clínica es idéntica con una descrita en el ejemplo 9.1, excepto que la duración total de la observación es de 8 semanas en lugar de 3 semanas.

..M h__ .?., t._-í_^,^___.ií _,._., _r..a________^__i____^ ¡_________j{ . ?¿l| É ^a|j Se hacen las necropsias a lo largo del experimento para los lechones que mueren de la prueba inmunogénica y al final del experimento (día 97) para todos los lechones sobrevivientes. Las muestras de tejido son las mismas que se describen en el ejemplo 9.1. REFERENCIAS 1. Clark, E.G. Proc. Amer. Assoc. Swine Pract . , pp. 499-501 (1997). 2. Edbauer, C, R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, P. Desmettre and E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1990) . 3. Ellis, J., L. Hassard, E. Clark, J. Harding, G. Alian, P. Willson, J. Strakappe, K. Martin, F. McNeilly, B. Meehan, D. Todd, D. Haines, Can. Vet. J. 39, 44-51 (1998) . 4. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, E. Paoletti, Virology 179, 247-266, 517-563 (1990) . 5. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Alien, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989) . 6. Hamel, A.L., L.L. Lin and G.P.S. Nayar, J. Virol. 72, 5262-5267 (1998) . 7. Harding J.C., Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 28, 503 (1997) . y Éak, 8. Mankertz, A., J. Mankertz, K. Wolf, H.-J. Buhk, Gen. Virol. 79, 381-384 (1998a). 9. Mankertz, J., H.-J. Buhk, G. Blaess, A. Mankertz, Virus Gene 16, 267-276 (1998b) . 10. Matthews, R.E.F., Intervirology 17, 42-44 (1982). 11. Meehan, B.M., J.L. Creelan, M.S. McNulty, D. Todd, J. Gen. Virol. 78, 221-227 (1997). 12. Meehan, B.M., F. McNeilly, D. Todd, S. Kennedy, V.A. Jewhurst, J.A. Ellis, L.E. Hassard, E.G. Clark, D.M. Haines, G.M. Alian, J. Gen. Virol. 79, 2171-2179 (1998). 13. Nayar, G.P.S., A. Hamel and L. Lin. Can. Vet. J. 38, 385-386 (1997) . 14. Panicali. D. and E. Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982) . 15. Paoletti, E., B.R. Lipinskaks, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81, 193-197 (1984). 16. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989) . 17. Piccini, A., M.E. Perkus. and E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R. , and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987). 18. Sambrook, J. , E.F. Fritsch, and T. Maniatis, In Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press, NY) (1989) . 19. Tartaglia, J. , J. Winslow, S. Goebel, G.P. Johnson, J. Taylor, and E. Paoletti, J. Gen. Virol. 71, 1517-1524 (1990) . 20. Tartaglia, J., Perkus ME, Taylor J, Norton EK, Audonnet JC, Cox Wl, Davis SW, van der Hoeven J, Meignier B, Riviere M, and E. Paoletti, Virology 188, 217-32 (1992) . 21. Taylor, J. , R. Weinberg, B. Languet, Ph. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988a) . 22. Taylor, J. and E. Paoletti, Vaccine 6, 466-468 (1988b) . 23. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988c) . 24. Taylor, J. , C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre and E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990). 25. Taylor, J. , C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 9, 190- 193 (1991) . 26. Taylor J, Weinberg R, Tartaglia J, Richardson C, Alkhatib G, Briedis D, Appel M, Norton E, Paoletti E., Virology 187, 321-328 (1992). 27. Todd, D., F.D. Niagro, B.W. Ritchie, W. Curran, G.M. Alian, P.D. Lukert, K.S. Latimer, W.L. Steffens, M.S. McNulty, Arch. Virol. 117, 129-135 (1991).

REIVINDICACIONES Se reivindica: 1. Un virus recombinante que comprende ADN a partir del circovirus porcino 2. 2. El virus recombinante de la reivindicación 1, que es un virus de la viruela. 3. El virus de la viruela recombinante de la reivindicación 2, que es un virus de la viruela característico de las aves. . El virus de la viruela recombinante característico de las aves de la reivindicación 3, que es ALVAC . 5. El virus recombinante ALVAC de la reivindicación 4, en donde el ADN del circovirus 2 porcino codifica y se expresa como la proteína cápsida principal del circovirus porcino. 6. El virus recombinante ALVAC de la reivindicación 4, en donde el ADN del circovirus 2 porcino consiste de la estructura de lectura abierta (ORF2) del circovirus porcino 2. 7. El virus recombinante ALVAC de la reivindicación 4, en donde el ADN del circovirus 2 porcino consiste de una estructura de lectura abierta 1 (ORFl) del circovirus porcino 2. iteÁíHn'ir dia<Ai¿ > 8. El virus recombinante ALVAC de la reivindicación 4, en donde el ADN del circovirus 2 porcino consiste de las estructuras de lectura abiertas 1 y 2 (ORFl y 0RF2) del circovirus porcino. 9. El virus recombinante ALVAC de la reivindicación 4 que es VCP1614 o VCP1615. 10. Una composición inmunológica para inducir una respuesta inmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 1. 11. Una composición inmunológica para inducir una respuesta inmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 5. 12. Una composición inmunológica para inducir una respuesta inmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 6. 13. Una composición inmunológica para inducir una respuesta inmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 7. 14. Una composición inmunológica para inducir una respuesta inmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 8. 15. Una composición inmunológica para inducir una respuesta irmunológica en un huésped inoculado con la composición inmunológica, la composición inmunológica comprende un portador y el virus recombinante de la reivindicación 9. 16. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un huésped que comprende administrar al huésped, la composición inmunológica de la reivindicación 11. 17. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un huésped que comprende administrar al huésped, la composición inmunológica de la reivindicación 12. 18. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un huésped que comprende administrar al huésped, la composición inmunológica de la reivindicación 13. 19. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un huésped que comprende administrar al huésped, la composición inmunológica de la reivindicación 14. 20. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un huésped que comprende administrar al huésped, la composición inmunológica de la reivindicación 15.

Figura ÍA rtindili CT, AAGC- '.' - TCA?A ? CT .ATG J.\ ÍUÍ GA^ AA r.A AAA. T AC \a C GAA A. A ;>Me! Ser LeuLeuG! nLysLeuT y rPhßTnr Gl uGI nSe' I I eVa AGACTC ..'.'. '.' ..-.TAr-.- ..?.--Í ^ TA C^-A. TGT AT - * -.A^.CAGA CAGATGATGATAC3 > I Gl uSeí Ppe.y s5e' TyrAsn?_eulys sDAsn?-t? sAsnVa i I I ePnelhr Tpr Ser AspAspAspThr ;<J> Va I Va I Va i I l eAspG AspAspV l LeuLeuSer Tnr A rcLeu euSer Pne Asp Lys I I e Leu Phe í_< > reAsrSs' >_6uSerl sTyrG¡ uTnr 1 I e&er AspThr 11 eLeuA p ¡ i e s Th: u E"> sAsr-T y p v ' I 1 e rcSer &£• Sor Ser -euLeuAsp I e?-euLysl. sArsAI aCvsAspLßüGl uLet • G,G. .e-As: ?T ?i Lßul i eG yAsoAsnSer AsriLßuT yrT r Vs scMe í Thr Tyrt?e tAsriA 111 > e "~í I Lc-jLe LArgAsc-Va lAspLysCvsTy rLy Nru! (6B0) Nde! (901) 84 - A — -. ¿ T A.T AAT AAAAA A- .TA _ - ? _ ??T A..^A. - AT A. —A * .\JCGA AACAGACAJ ATAACA.TA GGTT1 Z.E* > eG I l el I eAsp ! leí I eni e AGOASDAS?AGOGI r yrAsn l i eT r Va I ~.~~> I eGi üT vrCvsSer ProG yTyrl i eLeuT rDLeuHi sAspLeu.vsAl ßAl aAl aG uA -....i?i-..r..u.-..?.-.v .?..V?*an.-...?.tai\;_uj.--..?n/-.. ±?if*..— •-._- _ .. — f- ;-euA-;~'. rAsDAs-iArci leAsr.G U euSerA?aAEp_ysL.eu"yr7nr Phe ?uPnel 22 ' f*.= ? l i e.ejGl uAsnAsni i tiys-. s_euArg l G' Tnr l ? el l e al h¡ sProAsnLysl ? el le ;c > A aAsn3 ,T ' S-e snAsn ' le-.ßuTnrAspPne_euSe' Tyr al Gl uGl uLsul l eTyrH?sh?sA EcoR' (1223) jsr &e lel igLeuAlaG uTnr Tnr I leSe ;?5S Ser &e. Ser G _~ rp Va l e;AsnSer AsnCys^eu a I ni S euLysTnt G? yTyrGI uAl ai i e?_eu ? 5" cneAsoA a Se- .eu Pne Pne 31 n!_e^.Ser Tnr '_y eSer AspT y r Va ! LysTyrT rpTnr LyslysThr t w -TAG GAAAA. A A.TAA AAGAAAGA AG CAGG 11 euG, rT >rL sAs"PnePneLvsAspG yLysGl n euAl a(. sTyrl l el l eLysLysAscSef Gl n a Figura IB 147. GATA3ATAGA3TATGTTATTTAGACGCAG CTG ATA AATGACGTAACTTACrrAATGGATACGTTTAAA 365 I i I eAsoAroVal CysT y rLeuhi sAi a Al a Va 1 TyrAsnhi sVa I Tnr T vr?_euMe t AspThr PneLys l€ll ATGAGAATATATrTTA.TCCGAAACGTG7T : GTAACTA.VrAT?AT^^ 41'. • snGí uAsn I I ePheT y r roLys Ar? a I Ser Val Thr As ni I e I i eSer Gl uSß- 1 I e yi Al aAscPn 16 E : TCA-rr- AT.ATCAGATGT A AAATTGAGTAAAAAG ATA--AATA7AA.A.AGTAT-rr- CTTATACTCGCA 43. - e" y r Pne i i eSer Asp a I AsnLysPneSer Lys Lys I i eG1 uT y rLysTnr Me t Prie rol I eLeuAl a 1"3 GAAAACTACT.AGCC.AA-AAGGAAGGCCCTA7 TTACACATA ATGT^^ 5^> G? uAsnTy 'TyDrc ysGI yA rgPrcTyr eThr Hi eThr SerAsnGI uAspLeuLeuSer I I eCye 1 ?Z TATG3GAA3TA-.CA T GTAAAoATATAAAAAATCCA'-''-ATTATA'~ VlA-A^ 48- euCveGl i-Val Thr Val Cys Lys Aso I leLysAsrsroLe-?LeuTyr5er LysLysAs I I eSer Al aLy . A.T TAGATCTGTGGATATAAAT £;Í . sAro=ne I I eGl LeuPheThr Ser Va I Asp I I eAsnThr Al a Va I Gl uLeuArgGI yTyrLys I I -Arg .3 1 GTAA .GGATGTT A AA.TGGTCTGAAAAGA AAAAA A.T AA ^A ?.* _ ACATA CA^TAGATTAT 5C=> Va l I i eG' yCys^euG: uT rcPrcG, u y e I I e^ys I I ePheAsnSer Asr. roTn- Tyr I leArgLeuL '_ T21 TACT AACAGAAA GAC GTT A.'GATA"-'* TTATA?-'-CT A.T ilG_"-"-A.AA'- '*AATA_TAAGAGAGGr.TATAG-. £EC ^ eu?_e?T-?r Gi uA'gArgLeuAs I . eLeuHisSet y rLeuLeu?_ sPneAsnl I eT r Gl UASDI I eAI í~S* aThr ArcAspGI yValA roAsnAspLeuPro I I e I I ßSer Phe I I eVa! Ser T rCvsArgSe T yrThr Ndel (2169) i - ?n--.----t,L- - A r_S-__r^ .-. ¿ > rLs :-euLejAsnCvsH' sMel Tyr AsrSer CVS VS I I eThr Ly eCys y e y i AenGI nVal I I eT GGAACG ^ C BarrH (28S0 ."_ -. -.r?-?_O? AT?J-ATG Figura 1C = . ATCATAA CA3TA -rrACATTAA.TGA~GATATACTGAA.^CG.ATCTACAG nCTGAACTATGCA.AGGAi-.TAAG 2 CAATATGCCA-A.TTAT r-pA?TATTTTAACT ^^ S 1 CCT-^.TAGC-~GTT.A.AAAGCTGG- TAA?.TAGTAAGGATGTAGAA GAAATACTTTGT CTATACCTTCGG 5: AGGAAAG.AAr rAG.AAGAAC AAGTTTAAT -^ ^CTrG TAT V.G - AT.A A A TGG 3] AGATACAA GTAAAAG.^.TGGATCT GAAT-rTCGTAGT TAGAACATAA-TATACGC CTA.ACTTAT.ATAA-£C: GTGTACGGA--AAAACGAACATATGVrTACTTATATA ^ <--•*•---•- r.. nn... JIUOU .../U;?.^?..¡n^ -..nl.j.r.-..>u/u?^r.:.-..r.;';':';' ? f. _____ Figura 2 ^iteÍ^A-toi-tá<fc--Jfctoii^^«aM^r^ ^• h»t^--?M_ta^ ?Mt Jú»_^M?mmj?^M Figura 3 Kpnl (1) GGTACCT CATAA?TACAAGT TGATTAAA TT TTCTAA uw.Iv...;; ? j?Aws.ñ?AWiA 71 C-^.AAGTA.'.'.-- -rA.CA.TC-rTA- .ATTTATTGCA3-. -;-rAAGA5CrrATC.irGTA C; AGTTGAGTCTGTAGATC3TTTCA~ATAT--?.CTGATTA?TGTA-TACT3TTATGATGAAATATAGA.^TCG El ATATT33G-.TTTAACTGTTT ..ATACT.AACT'CTAGAT--.'?V-. -; .:?: IÍ?-.-Ü tf..n. 4A?ü? 21 CACAT7rT~AGAT.A?.3ATA-3A-rrAT:r7TTATCTTTATTA~ TA.GA3TAAAATaATCTGGCTATTAA^C;.TAGGC--A3TTACC?-rA.G.AA.TGCrrGC CCCGTTA-LACT AATT.\TTTAC-ATCT:CTCAAAGAAC:-TATTTT.^^ rrAAf.TTTATATTTACTTTCTG-.TCATCTG;.CTTAGTTAG TT,GT.AATAA33^ -A-j^T.AATTC3TTGAATGA-.3CTCT'ATTTGCT3TATCATTTTTA.TCT.A*-TTTTGGAj "~ -t-t;.t Ecc I (i lA-ATAACTAAT I12d5? EcoRV (.378) Nrul (",374) 1.^ Ve' Tnr T \ f0roArgArgArgTvrArcAroArgArgr'? sAroProArgSer Hi sLeuGt yGI ni i e<_e 25'A r;?'C •S.e ..Val hi e rcA'gh" s ArgT r Ar T rcArgArgLysAsnG' y I I eD eAsnt ::,neG?>T r*r- Va? LvsA'gTn r Tn' Va¡ 7hr7r ProSe-7 rpAl aValAs Sma! (164-1 C TGATG A.3ATTT AAAATT CAC G- CTTT CTTCCC C C 3G3A333333AC CAAGAAAAT CTCTATACCCTTT I eAsDAscPne va ! P -cD roG1 yGI y I y7nr Asn.y s I 1 eSer l I eP roPne -...aferftti*.****-' - * -* * Figura 4 Figura 5 ,««. - A Figura 6A 72 CAAAGTA.TTTCTT: -- TC-rr C TTr TG^^ 14". T T3G -^?CG .': -r-T~-^AGTr-A T ^ 211 AGTT GAGTGT -p,AGA.TGC77r GAGTATAT-^.CTGATTAATGtACTA- -p ATGA >?AAAT 2 ? ATATTGGCATTTAA.CT'GT /GTTATACrA?GTC^ zz -;j^_A3CTTCCACGrTT TGTATAGATTTCTTTC-^TA-TTA3TA3GrAGTACT 4 1 CAT AT-rr- -TA-3ATAA.GATA-^.CTATCTTTATGTTTATTAGTAGAAAATA.GTT-^ BamHl (532) 451 .AA..,:?. 1. -. -•: .'l • . AGATATA.TATTAAATATC A-^GGATC TA.TTA.T T-r&3TAAAATGTT,TA 5 £ ; TAGA.GTAA-A>.TGAr-r2GGCTí^TAAACATA3GCCA3TTACGATAGAATGTTG -rrTGCCGTTAGAGTGTTT £2- TACC.ATAA-CATAGftTCT3C- GTA ~ C : TAATTATTAATA.TCAGC7:A. -T:-ATTTC^^ ~ " 2 AATTA.TTTGA" ATCT : rt?AAC?? G^ 6 1 T3AAGGG -rTTGATGGA.ATA.AGT -^ --T ACATCS-^^ Sil TTATACCGTAACTrTAAATTTAT.ATTTAC TTCT-^ S E 2 rTC^_AAAAATTAA.A.A3GTAATTCG^GAATGA".3CTGTATT^ 205: ATTTA3C-A3TA- 7rA-rTT-^.TTAGAAGAAGAATCTGGCACTTCC C^CTA TACT .15: TTZ 3AC7TA333TT AA3T3GG 3GT-. '. '. AA3AT AAATTCTCTGAATT-3TAGATAGATGGTTAGACGG 2?2^ cro-.y sLei. = roP roAeo y sLeuAsn»heG -lArgPneGI nVa 1 TyrMe . Thr Va I A rg i Stu' (1306) .__ '_ ATATTCTACTCCT33TCCTATTTACTGTTTT^CCAA.C3CA.GCGCCGAGGCCTACGTGGT"CGACATT CGAG 222 I eAsnT rAspG nAspT y r?-> sSe AsnGí uPnßAI «Al aGi yLeuGi yVa I H. eAs aiAsnGI ySe ftoj...v).«. — _-uj--_rw--o_.o?.-.L ».V.V;ÍI;'¿?. TGCTTGGAAGTAAT AATAGTGGAGTGAAG 125 < r Tr G Gin.euArg.eLTrpLe Gl nAenA gLysAsnAsnP roG1 nPneTyr Asp I I eTnr Ser AspLeu . C". AAGA3CTTT- .GTCT-LAAGTft CGGGAGTGGTAGGAGAA3- TTGGGGG^ 156 « Val cro_. s oTpr -VieT vr ArcSer H sT y rSer PnePfcG, nProl i eThr HisArgSerSerTyrA Noe (^47£, 2471 TTTAC.A2ATGGGT2ATAG-rrrAGG3-TGTGGC:r- T3TTA-^AAG^ lí2<snValTyCroA5p~yrTn'LeuAI aTnr Al auysThr Va! PheAsnAspAspLeu i I e Vs I Al aThr Se EccR1 C5S4) 22? "< ' Gl yVaí G vA rcAseG1 yGl -Trr I i e^rcSer CysPrcT roPneG! uVa I Lys el ysArgMeArg Sma' (1651) 1612 GT GT.-TTCA.A-.GGC ATAGACATTTTCTTGGTCCC"^ Sé T vu y rG uPheP-cl leSeí . leLysAsrThrGíyGlyGlyProProVal PneAspAspI I e Lys Phe A Figura 6B 6c - CTCATCATCTCA.. CGCCCAuGAGGGCCTTGTGACTGTGGTACGCTTGACAGTATATCCGAAGGTGCGGG .' r gMetMelAsoValAl al rpSer ProThr Tnr Val Thr Thr ArgLyeVal Tnr Ty rG' yP eThr ArgSe 4'' r LeuArgT-r sn nei 1 eG vAsnLveArgArcT rpArgTyrArch eArgP ro-ti s Va 1 LeuT rppro 21- ^Arg roAr? eul ? eG1 rG?>?.euH?sSe?ArQ roArcl-?tsArgArgArgArgTyrArgArgArgPro7 Nrul (1921) EcoRV (1917) 2 s 5 : TACCTCATTACCA.TACAAA.CTTA^CGG.A ATCGCGATAATGAA.ATAAT ATGÍ- GA.TT ^GCGCTTTCA 2 < y •Tnrf?s' 25£ - A7TCAAG-.C.A."-.— . - O*J-Ü."-- ... * . GTA.TTTATTTT— ACTTTTTAGW.A.?UJAA. A rivs A.GCTGGG G 2 _"__ _ Bap^l (2'12¡ 11 T AATT A".. "_ AA.G^iA....C o.......ATTTTATA-.. AAAAAJ I VSAAGU-.AAAAA AGAAAGCTTC TC ?coRV (2224) Niul (22201 .. .. ^ T...t . -.^3„-^-.»........?--.J. l i l?e' Prc&erLys.vsAsrGivA rsSe' G yP'oG1 nDroh s.vsArg rpVaI P eTnrLeu Sec (2347, i;>Asr,As-c?oSc G LAs G uArcLys.ye? leArcG??.i-euprol leSe' Leu neAs T °hel I eV -£- '.2 ^A^*^ — -J-J..A- - *_ -.-roAA3G^CGA.-CACCTG-.C_.CCAGGG '. tCGCTA*--l.;".L". GTGAAGAAGCA 4r> £iG v l 3 uü yAenGi LG L&yArcThr ProHisLeuGInGlyPheAi aAsnPheVa I LvsLysGl cr^ r'nr ^ieAs .vsVa' LvsT 'p'yr.euG vAl a Ar Cysrii s I i eGl uLvsAi aLysG1 yTnr AspGi r Sac (2E70. 52 > G nAs-.vsG jTvCvsSe' .ysG LG vAsn.eu.ej I eGI uGysGl vA I ap roArgSer Gl nGl yG "... i^. ... _^__..- r .-^," o...sA..... -\ — ?,? u--. A ""rA aVa' Ser Tn- .euLeuG uSe- G1 vSer Leu .a I Thr Va I Al aGI uGl . -a. ^ w_ __~ — ... — i o.i u/-. — ... GAAAo". S~ rea ' ~G rgA nPne AraGl VLeuA aGi L.euLeuLysVaí Ser G' yLysMet Gi n Neo. ¡2ßcc ÍES" ? s??-eA?aAs = = rcG u~n'" 7 r -~ GS ,e~rcProA'cAsn_\ s oTrDAspG? yTyr'-?? sGI --.. o . \. CC8l-v3 uG uValVa' Va I BAsD sD3ne"" vrGI y T '2_euP rc~ rpAsDAspLe..euArg?_euCysAs? E ñV (2942) 222' A -gT , : ,ct " ' Va i G uThi .vsGI yGl ythr Va I DroPne1.euAI aA'gSß' i I eLeui leTh £ Figura 6C 3 C I : GCAATCAGACCCCGTT GGAATG ~AGTC'CTCAACTGCTGTCCCAGCTGTAGAAG -7T-TCTATCG3AGGAT 2S5> et AsnGí nThr roLeuGI uT rp y tSer Ser Thr Al a Va I FroA! a e I GluAlaLeuTytAroArgll Smal (2199) Ndel (3173) Sal! (3193) ; 1 ? : T~CCCCCATGCC-rrGAATTTCC^.TATGA-^.TA-A^ C • Ser rc roCyeProGI uPneProTy tGl ul I eAsnTy 2 2: GTCA.TTTT T C GTAA GTAA -rr T Trr ATA- TT A GTA-r A rr AT -rr A ^ 325 - TAAGAAA.ATCCA.TTATGTA.TTATTTí-rA-A-^-TAAJT CrrrAGCGTA-^ 236: AATAG^TCGG -rr C TT -T -^J TTG T- AT C ^ 3 2 A.VGCTGAACCCTCCA.AA.T TGCAGT A'TTATATGAGCGTA.TCTA.^ 23 C : ATR.AATATC.=T-RTACRTTA--AATTGATA&GAAA-TATGAATACCTT^GTAG Saci (3604) Not; (3596) c~ .AA A-rTT TGATAGGCGGCCGCGAGCTC IO-i fc¿.< ¿*_á_¿.._,±Ul__li . .-A**», .«- LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: ( ) SOLICITANTE: Eublot, Michel Pérez, ?e?.p-.íer M. Charreyre, Cathepne E. { -. ) TITULO DE LA INVENCIÓN: Virus Recombinante del Circovirus 2 Porcino (m) NUMERO DE SECUENCIAS: 13 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA' . (•--) DIRECCIÓN. Virocenetics Inc. í = ) CALLE' ^'5 Jorcar. Road (C) CIUDAD: -roy (C) ESTADO: NY Í?) PAÍS: USA (?; CP. 12160 ( ; FORMA PARA LEER EN COMPUTADORA. A-i TIPO DE MEDIO: Disco flexible ( 3 ) COMPUTADORA: Compatible con PC IBM >~ SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS ?> PROGRAMA' Patear. Ir. liberación #1.C, Versión ', vi . DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL :. NUMERO DE SOLICITUD: > 31 FECHA DE PRESENTACIÓN. 'X. CLASIFICACIÓN: i , INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE A) NOMBRE' Kswe, T xotr.y R. '3 NUMERO DE REGISTRO: 3S,22S - NUMERO DE REFERENCIA DOCUMENTO TH015 > -x INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN. (A? TELEFONO: '570! 5B6-1C22 '=' TELEFAX. (570) E55-27C2 ^ij&^^^ ^ iiú?ámití ? (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N?:l: ( -- . CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA ÍA) LONGITUD 3701 pares base (E) TIPO acido nucleico <C) TIPO DE HEBRA simple .'D) TOPOLOGÍA lineal .Y.: i DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ?EQ ID KO 1. G2TTCTA7 CAAAAGTCTT AATGAGTTAG GT3TAGATAG TATAGATATT ACTACAAAGC /-.!-._ _ G ?A': GTCA: 1SC "TCAAC TGC . ??.-ÜA or.l". ^ '.. p. ".. : _ A i 240 -TAAAT AJ -.r\ -. ^ -_ . -•'if ftlifyrt'ilf il ^ 660 GTTAGATAT CT.AAAAA.AAA GA3CGTGTGA TTTAGAATTA GAAGATCTAA ATT.ATGCGTT 720 AATAGGAGAC AATAGTAACT TATA7TATAA AGATATGACT TACATGAATA A.TTGGTTA.TT 780 TACTAAAGGA TTATTAGATT ACAAGTTTGT ATTATTGCGC GATGTAGATA AA.TGTTACAA 840 A.CAGTATAA7 AAAAA2-AATA CTATAA7AGA TATAATACAT CGCGATAACA GACAGTATAA. 900 AA?AA G A TAGAATACTG TTCTCCTGGC TATA.TATTA.T GGT.ACATGA 96C TT AAGATACGAT AACCGTATAA ACGAATTATC 102C r'—^ J*~-. _-. i , GAAAA7AATA TAAAACATTT 1080 GAATA GC AA CA- CTAATAA 1140 ?_ 1 _ - o -iAAh "-TGAT22TA GTTTAT7-7T 3CAACTCTCT ACTAAAAGCA A.TTA.7GTAAA 138 C r...-..Tuo.-.2A AAGAAAAE7T TGZAGTA AA GAA2TTTTTT -AAAGACGGTA AACA.GTTAGC 1441 -.^ .".-.".^.-. : TACACGCAGC 150C TGTATA.TAAT CACGTAACTT ACTTAATGGA TACGTTTAAA ATTCCTGGTT TTGATTTTAA 1560 ATTCTCGGGA ATGATAGATA TACTACTGTT TGGAATA.TTG CATAAGGATA ATGAGAATAT 1620 ATT7TATCCG AAACGTGTTT CTGTAACTAA TATAATATCA. GAATCTATCT ATGCAGATTT 1680 TTACTTTATA TCAGATGTTA ATAAATT--AG TAAAAAGATA GAATATAAAA CTATGTTTCC 1740 TATACTCGCA GA.AAACTACT ATCCAAAAGG AAGGCCCTAT TTTACACATA CATCTAAC3A 180C ICAGTTTGT AAAGATATAA AAA.ATCCATT 1860 f_.—_i-. ^ _?t-..r-- -.GCAAA A.EGA.TTCATA. GGTTT.ATTTA CATCTGTCGA 1520 ?AGT T.AAGAGGATA TAAAATAAGA GTAATAGGAT GT7TAGAATC isec . í t"" "" *rr " : C :..AAA... Í-ATA..A? .-.G : oo 216C /--. - --; _ r-, „-?_rv . . _j.wi r*.H»ar- - -_?.*t-M - 212C i.—. _ . jrn. AAAAG: :2s: TTCTAATGAA GTAAGTACTG CTAAATCTCC AAAATTAGAT AAAAATGATA CAGC-AAATAC • , , 2400 ".* f-l , AGCTTCA.TTC AACGAATTAC CTTTTAATTT TTTCAGACAC ACCTTATTAC AAACTAACTA 2460 AGTCAGATGA TGAGAAAGTA AATATAAATT TAACTTATGG GTATAATATA ATAAAGATTC 2520 ATGATATTAA TAATTTACTT AACGATGTTA ATAGACTTAT TCCATCAACC CCTTCAAACC 25SG TTTCTGGATA TTATAAAATA CCAGTTAATG ATA.TTAAAAT AGATTGTTTA AGAGATGTAA 2640 ATAATTATTT G3AGGTAAAG GATATAAA-.7 TAGTCTATCT TTCACATGGA AATGAA7TAC 27C0 ATCAACA 2760 ACTGTAACGG GAAGCAGCAT TCTATGGTAA 2S2C 2 4C ATAGTCGAI iOOO 2060 'TTAAAATC TAGACTTA3C ATAACAAAA ATAA.CA.3 TAGTA2AT.A ATCA2TGATA — ?..-i-t C T2AA.C_A.22 AA3G.AATAAG CAATATG2CA ATTATGTCTA li-***,-!.-».*^ 3240 A.TA.TTTTAAC TTTAGAACTA AAACGTTCTA CCAATACTAA AAATAGGA.TA CGTGATAGGC 330C TGTTAAAAGC TGCAA.TAAAT AGTAAGGATG TAGAAGAAAT ACTTTGTTCT ATACCTTCGG 3360 AGGXAAGAAC TTTAG.AACAA CTT AGTTTA ATCAAA TTG TATTTA.TG.AA CACTATAAAA 3420 •AATTATG3A AGATACAAGT AAAAGAATGG ATGTTGAATG TCGTAGTTTA GAACATAACT 34S0 Í.C3GCAA CTTATATAAA GTC-TACGGAC AAAACGAATA TATGA.TTACT TATA.TA2TAC 254C :AG 360C -AATCTA2 .AATACGTAA7 ATAAATT.ATA TAATTTCACA AAGAACAAAA AAAAATCAAG 3660 A ' . . "T7ACCACTG A ¡701 INFORMACIÓN PARA S?C ID NO.2 : ' CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA A: LONGITUD 42 pares base ÍB' TIPO ácido nucleico 'C; TIPO DE HEBRA simple ;D; TOPOLOGÍA lineal ( - DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA £?; 12 NC : 2. I.C .-..'. ..G*.GGCC . i??.OAij - .

( : ) INFORMACIÓN PARA ».^&*..áM6fa¿_J¿A&.i-t¿* (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 73 pares base (3) TIPO. ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA simple (D) TOPOLOGÍA lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA S?Q ID NO:! 'TCCTCG AGCTGCAGCC CGGG1 :TA TAGCTAATTA GTCATTTTTT CGTAASTAAG 60 INFORMACIÓN PARA S?Q ID NC i-, CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A LONGITUD 72 pares base (E TIPO. ácido nucleico TIPO DE HEBRA simple TOPOLOGÍA lineal x ; DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA S?Q ID N0:4: -_ . „—. - w A--. - ,*-. O - r-- __..—. - -— - - ?? INFORMACIÓN PARA -2 :D N CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (Av LONGITUD 45 pares base ÍE' TIPO acido nucleico ¡C? TIPO DE HEBRA simple .D; TOPOLOGÍA lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GATGATGGTA CCTTCATAAA TACAAGTTTG ATTAAACTTA AC-TTG 45 (2) INFORMACIÓN PARA S?Q ID NO : 6 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ÍA) LONGITUD: 53 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (O TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA' lineal DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: =EQ ID NO: A. --.. .. J?L- INFORMACIÓN PARA ??Q ID NO : 7 : ! ; CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA. (A) LONGITUD: 36 pares base (B) TIPO ácido nucleico (O TIPO DE HEBRA. simple (D) TOPOLOGÍA. lineal DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ??C ID NO: 7: INFORMACIÓN PARA £E ID NO: 8 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A LONGITUD: 2520 pares base TIPO ácido nucleico TIPO DE HEBRA simple ÍD TOPOLOGÍA: lineal i^-«A-a-?--|)ffµ?------..t.^itt--h -^-^n- .-.!»-----.-----»- (y.A DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEO ID NO: 8: G3TACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTC2GA 60 AGGTATAG.AA CAAAGCATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT 120 ATCACGTATC CTATTTTTAG TATTG3TA3A ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA 180 CATAATTGGC ATATTGCTTA TTCCTT3CAC AGTTGAGTCT GTA3ATCGTT TCAGTATATC 24C CT TAA.T GTAC ACTGT TAT A-T AA TA ..JAA.- CG .-..n.-. __.¿ j ._„-. * . A-n-- -: - J.T 300 T?TTATACTA AGTCT?GATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC 35C CAC3TTT77G TATACATTTC TTTCCATATT A3TAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT 420 CATATCTT3T AGATAAG.ATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTA3AAAATA CTTCTGGCCA 480 -.--.. . — - — -"-• --". .^ T.31.3TT.-.3 ATATAATATC AAATATCTA3 G?T i?i 5 C T.-.- , . .3.. ?_-AACGTTT.~. TAG 3T.~.~AA T3AT2T3GCT ATTAAACATA GGCCAGTTA^.

CATA3AAT3C TGCTTCCCGT TAC.-3T3TTT TACi;.TAACC ATAGATCTG2 CTGTATTGTT 660 GAT-.2ATAT - A--A33C 7 A A CCTAAAAA AT CCVATCA TAATTATTAA TATTAGGTAA ~2C 7T2-.T7T22- T2T3AAAGAT AGA2TA-.TTT TATATCCTTT ACCTCCAAAT AA.TTATTTAC ATCTCTTAAA CAATCTATTT TAATATCATT AACTGGTATT TTATAATATC CAGAAAGGTT 840 TGAAG3G3TT GATGGAATAA GTCTA.TTAAC ATCGTTAAGT AAATTA.TTAA TATCA.TGAAT 90C CTT7ATTATA T7ATACCCAT AAGTTAAATT TATA.TTTACT TTCTCATCAT CTGACTTAGT 960 7AG777G7AA TAA33TGTGT CTGAAAAAAT TAAAAGGTAA TTCGTTGAAT GAAGCTGTAT 1020 7TG2TGTATC ATTT77ATCT A?-.TTTTGGAG ATTTAGCAGT ACTTACTTCA TTAGAAGAAG 108C ,1 C TCATTTGACT A3TTAATCAA TAAAAAGAAT ;oo ACAAATAGT TTCGTTT7CA CCTTGTCTAA T.AACT.AATTA 126C • J -j AAAA. _AA -AA.AGGT GCATA AATTATTTCA .:sc - - - 'J --- * G buGC _T .CG7 CCACCCC leo: O UJ * j *. 7GATGAGA tóÉgJ * ---<a&tfl¡áÉ£--------^^ TTTAAAATTG ACGACTTTGT TCCCCCGGGA GGGGGGACCA ACAAAATCTC TATACCCTTT 1680 G.AATACTACA GAATAAGAAA GGTTAAGGTT GAATTCTGGC CCTGCTCCCC CATCACCCAG 1740 Jivr...". .- AC1 u? j.I ?JÍ'.-?UA.V: f?.?r..ii.C-. .?.. Aí.uc. 1800 ACAGCC2TAA CC7ATGACCC ATA.TGTAAAC 7ACTCCT2CC GCCATACAA7 CCCCCAACCC 1860 TTCTCCTACC AC7CC0GTTA CTTCACACC2 AAACCTGTTC TTGACTCCAC TATTGATTAC 1S20 1S8C 2C4Í :GT.AAC; AAGACCCCÍ 21C0 ?.?O, AT7 AGTCA: .. - - (_«: A. GT; 'TTTTA' -6C AAAA.7 CCATTATC AT37C7C72 AAA.T CATCC .TGAAC3C : 34 C ! 40 C -520 (2) INFORMACIÓN PARA S?Q ID N?:S: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: Í ) LONGITUD: 57 pares base (S) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple ÍD) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: S?Q ID NO: 9: CATCATCAT7 CGCGATATCC GTTAAGTTTG TATCGTAATG CCCAGCAAGA A.GAATGG Í2) INFORMACIÓN PARA S?Q ID NO: 10: di CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ÍA) LONGITUD: 36 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple ÍD) TOPOLOGÍA: lineal '.:•:-.) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 . _ >— r. *r ¿ INFORMACIÓN PARA S?Q ID NO: 11: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A LONGITUD' 3609 pares base (?) TIPO. ácido nucleico (O TIPO DE HEBRA: simple ÍD) TOPOLOGÍA' lineal " i irt-t-É-fíir i ' tntffa--- g ^ *fc^_. kk _i. J (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 11: GGTACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTCCGA 60 AGGTATAGAA CAAAGTATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT 120 ATCACGTATC CTATTTTTAG TA77GGTAGA ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA 180 CATAATTG3C ATATTGCTTA TTCCTTGCA.T AGTTGAGTCT GTAGATCGTT TCAGTATATC 240 ACTGATTAA7 3TACTACTGT TATGATGAAA. TATAGAATCG ATA.TTGGCA.T TTAACTGTTT 300 7377A7AC7A AGTOTAGATT 7T.AAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC 360 CAC37TTT7G 7A7ACATTTC T77CCATATT AGTAGCTAC7 ACTAAATGAT TATCTT2TTT 420 CA7A7C7737 AGATAAGATA GACT.ATCT77 ATC7T7A77A G7AGAAAA7A C77CTGGCCA 480 TACATCGTrA AATTTTTTTG TTGTTGTTA.G ATAT.AA7AT7 A.AATATCTA3 ACJATCCTAT 540 6CG C J.AGA -. C C CTTCCCG - TACAGTGTT- TACCA. AACC ATAGA.TC TGC C ± G -A.T ¿. -.TT 660 GATACATj- TA ACAGCTGTAA A CCT AAAA AT7CC7ATCA TAATTATT.AA TATTAGGTAA 72 C 77CA77722.- 7373AAA3A7 AGACTAATTT TATATCC777 ACCTCCAAAT AATTATTTAC 7 S C A. .T. — . A-A 3AACC7A.777 7.AA7ATCAT7 AAC73C7AT7 77ATAA7A70 CAGAAAGGTT 84 3 TGAAG3GGTT GATGGAATAA GTCTATTAAC ATCGTTAAGT AAATTATTAA TATCATGAAT 90C CTTTATTATA TTATACCCAT AAGTTAAATT TATATTTACT TTCTCATCAT CTGACTTAGT 960 TAG7T7GTAA TAA3G7GTGT CTGAAAAAAT TAAAAGGTAA TTCGTTGAAT GAAGCTGTAT 102C TTGCTGTATC A7TTTTATCT AATTTTGGAG ATTTAGCAGT ACTTACTTCA TTAGAA3AAG 1080 AATCTGCCAG TTCCTGTCTA TTACTGATAT TTC3TTTCAT TATTATATGA TTTATATTTT 1140 1200 jG - - * A.-Í * G CT77 AAGA.TTAAAT TCTCTGAATT GTACATACA.T GC 1250 rCTGGTCGTA 777AC7G77T TCGAACGCAG C3C7GAGGCC TACG73GTCC 132C f. -J . .~.. X v .-i. -G- . - * AAG ? -: . . r --.-". . ." i. j __. -r.— x -r X .-.r..jG.. ?-A.hl? Gü-CA A-i--. .A-r-j .. x -- 150C ;«.?J.GG -r.^» :CTATCACCC .560 : J n ^_ -i -_r -r 7T.AACCT TTCTTATTCT GTAGTATTCA L?? O - • "TTAAAT CTCATCATGT CCACCGCCCA GGAGGGCGTT GTGACTGTGG TACGCTTGAC AGTATATCCG 1740 AAGGTGCGGG AGAGGCGGGT GTTGAAGATG CCATTTTTCC TTCTCCA?-CG GTAGCGGTGG 1800 CGGGGGTGGA CGAGCCAGGG GCGGCGGCGG AGGATCTGGC CAAGATGGCT GCGGGGGCGG 1860 TGTCTTCTTC TG2GGTAACG CCTCCTTG3A TACGTCATTA CGATACAAAC TTAACGGATA 1520 TCGCGATAA.T GAAATAATTT ATGATTATTT CTCGCTTTCA ATTTAACACA ACCCTCAAGA 1980 ACCTTT3TA7 T7A7TTTCAC TTTTTAAGTA TAGAATAAAG AAGCTGGGGG ATCAATTCCT 2040 :7ACA AATAC :C7T GTCT.AA.TAAC 2100 rCCCCC AGCTTC7T7A TTCTATACTT AAAAAGTG.AA AATAAATACA 2160 . '„ -. __. __: TAAA.TTG.AAA GCGAGAAATA ATCATAAATT ATTTC.ATTAT 2220 2280 : . o . X _~.. . . o rJ A-.T'UAA.TCCTT OCCAAGACGA G2GCAAGAAA : 2 C . ->.. . . x .*-. 2400 14 60 -- .j ? o AG _ G CT.* *.TTTG G G AAOTGATCAG 2520 ^GA^.TAAA^ .-ATA77GCA.3 7AAAGAA33C AACTTA.CCTA T7GAA.7GTG3 AG0TCCTCGA TGATGATTAA AATGTGAACC GTCCAAATTT GCAGTCATTA TATGAGCGTA TCTATTATCT 3480 ACT.ATCATCA TCTTTGAGTT ATTAATATCA TCTACTTTAG AATTGATA3G AAATATGAA7 3540 ACCTTTGTAG TAATATCTAT ACTATCTACA CCTAACTCAT TAAGACTTT7 GATA.GGCGGC 3600 3609 (2) INFORMACIÓN PARA S?Q ID NO 12: 11 ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 53 pares base (E) TIPO acido nucleico vC) TIPO DE HEBRA simple D^ TOPOLOGÍA lineal di) TIPO DE MOLÉCULA ADN (genomico) ,x:, DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA S?Q ID NC 12. 'TCATG A7A7CCC77 AGT77G7A7C 37AATGACGT G3CCAAG3A3 GCG INFORMACIÓN PARA SI ;? ID NO í i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA h" LONGITUD 40 pares base Í?) TIPO acido nucleico (C, TIPO DE HEBRA simple .Z) TOPOLOGÍA lineal .-- TIPO DE MOLÉCULA ADN (genomico) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA =EQ IE C 13 GACTACTACG TCGACTTATT TATTTAGAGG GTCTTTTAGG 40 »••- ^=fr»,r :. i.3_^._.. ¿¿ttatdtofamtf Aitrtl=lfcfeiTii i i?l.p^«?¿¿ ^- -- ^ri?.i.?.r.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> MERIA <120> Prevención de la miocarditis, aborto e infección intrautepna asociada con el c?rcov?rus-2 porcino < 130> PCV-2 abortivo <140> PCT/EP00/08781 <141> 2000-08-28 <150. US 60/151,564 <151> 1999-08-31 <160> 7 <170> Patentln Ver. 2 1 210 > 1 <21.> 1 67 212- ADN ' 3~> CIGCOM?IS porcino <4C0^ 1 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60 ccccc cctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 agcgttctga ctgtgg'-tcg cttgacag a tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgt g 180 aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggs ggtggacgag ccaggggcgg 240 csqc?gdgga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc t cttctccg gtaacgcctc 300 cttqqatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcgcc agcacctcag cagcaacatg ccgagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgac gaacgacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaa g 660 aacaga :ac cagaataaag aatactgcag taaaqaaggc aacttactga tggagtgtgg 720 agctcctaga tctcagggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagc ggagt ctggtga c? ttgcaqagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agaccc?gaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gtlgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgt ggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctgta gaagctcttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 - aacadlcc acggaggaaa ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440 cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagt?ccgag gcctacgtgg 1500 tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctggt ttcttttgtt gtttggttgg 1560 aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620 aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggtgagggct 1680 gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740 ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767 <210> 2 <211> 1767 <212> ADN <213> Circovirus porcino ^ <400> 2 aattcaacct taacctt -ct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60 ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttttga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc C?á C CCCci t á aaayy Lggyt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 ggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 acttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 660 aacagatcag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc aacttactga tggagtgtgg 720 ag tcctaga tctcagggac aacggagtsa cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgqqagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900 tg acacgt c attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080 act?tgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140 crgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 ccagctgta gaagc cttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggag aag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattac gagtcttt t tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440 cggatattgt attcctcgtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 1500 tctacatttc cagtagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt gtttggttgg 1560 aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620 aaqgqctggg ttatggtatg acgggaggag tagtttacat aggggtcata cgtgagggct 1680 gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740 ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767 <210 3 <211> 1768 <212> ADN <213> Circovirus porcino <400> 3 aattcaacct taaccttttt tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc 60 ccccctcccg ggggaacaaa gtcgtcaata ttaaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttctga ctgtggtagc cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccaacggtag cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctgcg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatagctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 aacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg 660 aactgatcag cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg 720 agctcctcga tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgtlatty alyactttta tggctqgctg ccgtgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcaqac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctgta gaagctctct atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt 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1ctccgga ggatgtttcc aagatggctg cgggggcggg tccttcttct gcggtaacgc 300 ctccttgscc acgtcatccL ataaaagtga aagaaqtgcg ctgctgtagt attaccagcg 360 cact cggcd gcgqcagca ctcggcagcg tcagtgaaaa tgccaagcaa gaaaagcggc 420 ccgcaaccrc ataagaggtc ggtgttcacc cttaataatc cttccgagga ggagaaaaac 480 aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattattttg tttgcggaga ggaaggtttg 540 gaagaggqta gaactcctca cctccagggq tttgcgaatt ttgctaagaa gcagactttt 600 aacaa gtga agtg?tattt tggtgcccgc tgccacatcg agaaagcgaa aggaaccgac 660 cagcagaata aagaa tactg cagtaaagaa ggccacatac ttatcgagtg tggagctccg 720 cggaaccagg ggaagcgcag cgacctgtct actgctgtga gtaccctttt ggagacgggg 780 t tttggtga ctgtagccga cagttcccc gtaacgtatg tgagaaatt t ccgcgggctg 840 gr tgaacttt tgaaagtgag cgggaagatg cagcagc?tg attggaagac agctgtacac 900 gtcatagtgg gcccgcccgg ttgtgggaag agccagtggg cccgtaattt tgctgagcct 960 agggacacct actggaagcc tagtagaaat aagtggtggg atggatatca tggagaagaa 1020 gttgttgttt tggatgattt ttatggctgg ttaccttggg atgatctact gagactgtgt 1080 gaccggtatc 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Circovirus porcino <400> 7 -accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttegetaatt 240 ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300 agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360 ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaa ggag tgacctgtct actgctgtga 420 gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 t cagaaa t t ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 fl ggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtyy dad aycaaatggg 600 c gctaattt tgcagacccg gaadcc&cat actggaaacc aectagaaac aagtggtggg 660 atggtt acca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg 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atctggccaa 1680 gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740 aaaacgaaag aagtgcgct? taagta t 1768 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

J?Ááe, S rSfiSaSBii»

Claims (15)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. El uso de un inmunógeno PCV-2 para formular una composición de vacuna, que comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para prevenir o tratar cerdos contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunógeno es un PCV-2 atenuado vivo, o un PCV-2 inactivado, o subunidades PCV-2 o fragmentos de los mismos, o un vector recombinante que comprende y expresa in vivo una secuencia, fragmento o epitope del PCV-
2. 2.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la cepa de PCV-2 es Imp999, ImplOlO, ImplOll-48121 ó ImplOll-48285.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la cepa de PCV-2 es una cepa 1103 ú 1121.
5. 5. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el inmunógeno se formula con un adyuvante. 4,íi..-,
6. 6. El cultivo de la cepa 1103 como se deposita en el ECACC bajo el V00012710.
7. 7. El cultivo de la cepa 1121 como se deposita en el ECACC bajo el V00012709.
8. 8. Una composición de vacuna, que comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y un inmunógeno PCV-2, caracterizada porque el inmunógeno PCV-2 es un inmunógeno de la cepa 1103 o de la cepa 1121.
9. 9. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el inmunógeno PCV- 2 es un PCV-2 atenuado vivo, o un PCV-2 inactivado, o subunidades o fragmentos PCV-2 de los mismos, o un vector recombinante que comprende y expresa in vivo una secuencia, fragmento o epitope de PCV-2.
10. 10. Un fragmento de ADN, caracterizado porque comprende la SEQ ID NO: 6.
11. 11. Un fragmento de ADN, caracterizado porque comprende la SEQ ID NO: 7.
12. 12. El uso de un inmunógeno PCV-2 para formular una composición de vacuna, que comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para prevenir o tratar cerdos contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2 y/o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2, en donde la composición de vacuna se pretende administrar a cerdos hembras con al menos una inoculación antes de la cubrición o monta, preferiblemente seguido por una inoculación durante la gestación, preferiblemente alrededor de las 6-8 semanas de gestación, y/o una inoculación al final de la gestación, preferiblemente a alrededor de las 11-13 semanas de gestación.
13. 13. Un método de vacunación de cerdos para prevenir o tratar cerdos contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2 y/o síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2, caracterizado porque una composición de vacuna que comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y un inmunógeno PCV-2, se administra a cerdos hembras con al menos una inoculación antes de la cubrición o monta, preferiblemente seguido por una inoculación durante la gestación, preferiblemente alrededor de las 6-8 semanas de gestación, y/o una inoculación al final de la gestación, preferiblemente a alrededor de las 11-13 semanas de gestación.
14. 14. El uso de un inmunógeno PCV-2 para formular una composición de vacuna que comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para prevenir o tratar cerdos contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2 y/o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2, en donde la composición de vacuna se pretende administrar a lechones dentro de la primera semana de vida o dentro de la tercera semana de vida, preferiblemente seguido por una inyección de refuerzo dos hasta cuatro semanas más tarde .
15. 15. Un método para la vacunación de cerdos, para prevenir o tratar cerdos contra la miocarditis y/o aborto y/o infección intrauterina asociada con el PCV-2 y/o el síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete y otras secuelas patológicas asociadas con el PCV-2, caracterizado porque la composición de vacuna comprende un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y un inmunógeno PCV-2, se administra a lechones dentro de la primera semana de vida o dentro de la tercera semana de vida, preferiblemente seguido por una inyección de refuerzo dos hasta cuatro semanas más tarde. fca¿aA¿ - - - •^ **> _?fa+*__?_M_____________^