JP2011207897A - Pcv−dnaワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】該要素は、遺伝子の発現産物に応答するカルボマ−、ブタサイトカイン、例えばGM−CSF、式(I)のカチオン脂質にすることができる(R1は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基、R2は2〜3の炭素原子を有する他の脂肪族基、Xは水酸基またはアミン基)。カチオン脂質はDMRIEでよく、DOPEと組み合わせることができる。式(I)
【選択図】なし
Description
なお、本明細書で引用した全ての文献の内容は本明細書の一部をなす。
PCV−2免疫原はPCV−1免疫原と一緒にしてPCV−2に対して動物を免疫するために使うことができる。
ORFは転写解読枠(open reading frame)を意味する。
A. L. Hamel et al. J. Virol. June 1998, vol 72,6: 5262−5267 I. orozov et al. J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol. 36,9: 2535−2541
van Ooyen et al. Science, 1979,206: 337−344 Montgomery et al. Cell. Mol. Biol. 1997,43: 285−292
R1は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
R2は2〜3の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Xは水酸基またはアミン基を表す)
DOPEが存在する場合のDMRIE:DOPEのモル比は95:5〜5:95、特に1:1にするのが好ましい。プラスミド:DMRIEまたはDMRIE−DOPEアジュバントの重量比は50:1〜1:10、特に10:1〜の1:5、好ましくは1:1〜1:2にする。
J. Fields et al. Nature, 186:778−780,4 June 1960
EMAs(登録商標)ではx=0、y=2であり、カルボマーではx=y=1である。
この原液に必要な量の水を加えて所望の最終濃度まで薄めてアジュバントの溶液を調製するのが好ましい。または、好ましくは生理的食塩水、好ましくはNaCl を添加(9g NaC 9g/1)した生理的食塩水とNaOHで中和(pH 7.3〜7.4)する。生理学的なpHのこの溶液は凍結乾燥するか、液状で凍った状態で保存され、プラスミドと混合するためにそのままに扱われる。最終的なワクチン組成物のポリマ−濃度は0.01%〜2% w/v、特に0.06〜1% w/v、好ましくは0.1〜0.6% w/vである。
本発明はさらに、ブタ・サーコウイルスに対する予防接種と、ブタの他の病原体(特に、PMWS症候群と関連する病原体)に対する予防接種とを結合することを提供する。
例としては以下が挙げられる:仮性狂犬病ウイルス、ブタ・インフルエンザウィルス、PRRS、ブタ・パルボウィルス、豚コレラウイルス、アクチノバチルス プルーポニューモニア(Actinobacilluspleuropneumoniae)。
上記のようにアジュバントと配合した本発明の製剤または一価または多価のDNAワクチンにはブタ起源のサイトカイン、特にブタGM−CSFを補うのが好ましい。このブタGM−CSF(顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、非特許文献17、18)は製剤中に添加するか、ワクチンまたはブタGM−CSF蛋白質またはブタGM−CSF遺伝子をコ−ドし、発現するプラスミド(非特許文献19)に添加することがきる。
Clark S. C. et al. Science 1987,230: 1229 Grant S. M. et al. Drugs, 1992,53: 516) Inumaru S. andTakamatsu H. Immunol. Cell. Biol.(1995,73:474−476)
Furth et al. AnalyticalBioch., 1992,205: 365−368 Tang et al. Nature, 1992,356: 152−154
好ましくは妊娠前に少なくとも1回接種し、妊娠中にさらに接種を行う。例えば、妊娠中期(妊娠の6−8週間頃)および/または妊娠後期(妊娠の11−13週間頃)に接種するのが好ましい。従って、有利な飼育は妊娠前の接種と妊娠中のブ−スタ接種である。その後は妊娠前の接種および/または妊娠中および/または妊娠後期に再接種する。子豚(例えば予防注射した雌(例えば上記の接種した雌)から生まれた子豚)は生まれてから数週以内に予防接種する。例えば、生まれてから1週間および/または2週間および/または3週間および/または4週間および/または5週間明細書に接種する。好ましくは子豚に生まれてから1週以内に接種するか、第3週以内(例えば、離乳時)に予防接種する。それから2〜4週間後に子豚にブースター投与をするのが好ましい。
以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定れるものではない。
プラスミドpJP109の構築
EcoRI断片の形でPCV−2ウィルスのゲノムを含むプラスミドpGEM7Z−Impl010 Stoon−EcoRI No.14 (B. Meehan et al. J. Gen. Virol.1998.79 2171−2179)を EcoRIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動の後、1768の塩基対(bp)のEcoRIEcoRI断片を分離した。この断片を自己リゲ−トした。PCV−2ウィルス菌株1010−Stoon (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1998.79.2171−2179のORF2遺伝子、GenBank配列寄託番号AF055392)は、自己リゲ−トしたEcoRI−EcoRI断片から成るひな型を用い、下記オリゴヌクレオチドのPCR法(PCR)法により増殖した:
5'CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3'
JP780(配列番号 2)(36mer):
5'TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3'
プラスミドpJP111の構築
プラスミドpGem7Z−Impl010−Stoon(Example 1を参照)について PCR法を実行し(B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1998.79.2171−2179)、下記オリゴヌクレオチドを用いた:
5'CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3'
JP782(配列番号 4)(36mer):
5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3'
PCV−2ウィルスのORF1遺伝子を含む970bp PCR断片を得た。この断片をSalIおよびBglIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動の後、955bp SalI−BglII制限断片を単離した。この断片をプラスミドpVR1012(実施例1)でリゲ−トして、プラスミド(実施例2)を得た。
プラスミドpJP120(PCV−1ORF2)の構築
プラスミドpPCVl (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997. 78.221−227) についてPCR法を実行し、下記オリゴヌクレオチドを用いた:
5'CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3'
JP784(配列番号 6)(40mer):
5'TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3'
プラスミドpPCVl(PCV−1 ORF1)の構築
PstI断片の形でPCV1ウイルスゲノムを含むプラスミドpJP121 (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997,78,221−227)をPstIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動の後、1759塩基対(bp)PstI−PstI断片を分離する。この断片を自己リゲ−トする。PCV−1ウィルス菌株PK−15のORF1遺伝子(E. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997,78,221−227、GenBank配列寄託番号U49186)は、自己リゲ−トされたPst−pst断片から成るひな型を用い、下記オリゴヌクレオチド2からPCR法(PCR)で増殖した:
5'CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3'
JP786(配列番号 8)(36mer):
5'TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3'
プラスミドpJP058(ブタGM−CSF)の構築
頸静脈からEDTAを含んでいる管を通じてブタ血液を集める。単核化した細胞をフィコ−ル勾配の遠心分離で回収し、RPMI 1640培地(Gibco−BRL)でインビトロで培養する。約5μ\ochgの終濃度/培地mlにconcanavaline A(シグマ)を添加して刺激する。72時間刺激した後、リンパ芽球を回収し、細胞の全RNAを抽出キット"MicroScale Total RNA Separator Kit" (Clontech)でこのメーカの推薦方法に従って抽出する。
5'TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3'
RG973(34mer):(配列番号.10)
5'TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3'
ブタ予防接種用精製プラスミドの生産
大腸菌K12バクテリアの(菌株DH10BまたはSCS1)を実施例1〜5のプラスミドpJP109、pJPlll、pJP058、pJP120およびpJP121で変性する。5つのプラスミドから得られる5つの形質転換クロ−ンを+37℃でLuria−Broth (LBの)培地で振盪培養する。培養細菌を対数期の終わりに収穫し、プラスミドをアルカリ溶解技術に従って抽出する。抽出されたプラスミドをSambrook et al. (Molecular Biology: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NYにに記載の技術に従って、塩化セシウム勾配で精製する。エチジウムブロミドの最終抽出および絶対エタノ−ル存在下での沈降後に得られる精製されたプラスミドをTE緩衝液、1mMトリス/EDTA、pH 8.0に再懸濁し、lml当たり2mgのプラスミドを含む原液を得る。この原液は−20℃で使用時まで保存する。
PCV−2ウィルスのORFs 1および2の発現(対照)
対照としてPCV−2 ORF2およびPCV−2 ORF1遺伝子の発現産物をそれぞれプラスミドpJP109およびpJPlllでクロ−ニングする。これらのプラスミドはトランスフェクションキット(Lipofectamine Plus (登録商標)、Gibco−BRL、Catalogue #、10964−013)を用い、メーカ推薦の方法に従ってCHO−K1(中国Hamster Ovary)細胞(ATCC番号CCL−61)に形質移入した。
ブタへの裸DNAの予防接種
8.1 誕生1日目の子豚
カーサリアンで得たブタのグループをプロトコルのDO(一日目)に分離単位に置いた。これらの子豚には2日にプラスミドの各種ワクチン溶液を筋肉内経路で予防注射した。ワクチン溶液は無菌生理的食塩水(0.9% NaCl)に原液を薄めて調製した。各子豚には下記を予防注射した:
プラスミドpJP109単独
プラスミドpJP109およびpJP111の混合物
プラスミドpJP109およびpJP058の混合物
プラスミドpJP109、pJP111およびpJP058の混合物
ワクチン溶液は各プラスミドの500μgから成る。
容積:ワクチン溶液は、2mlの全容積を筋肉内経路で注射する。予防接種(1−2日)では子豚の首の各側面に(2×1ml)注射した。
重量:抗原投与直前と、抗原投与後3週間、1週間に1回子豚を秤量。
ウイルス血症/抗体検査用血液サンプルの収集: D2、D14、D21、D28、D35、D42に血液サンプルを採取。
検死: 生き残ったブタは病変を捜すためにD42に屠殺し、病理解剖し、肝臓、リンパ節、脾臓、腎臓および胸腺から組織を取り、組織の障害を調べた。
5〜7周齢の子豚(PCV−2ウィルスに対する母性特異的抗体はもはやない)へ筋肉内の経
路で予防注射した:
プラスミドpJP109だけ
プラスミドpJP109およびpJP111の混合物
プラスミドpJP109 andpJP058の混合物
プラスミドpJP109、pJP111およびpJP058の混合物
これらのワクチンの投与量は実施例8.1と同じである(プラスミドにつき500μg)。ワクチンの溶液は2mlの容積を筋肉内の経路で注射した(首筋への2mlの単独投与)。
それから子豚の多臓器消耗症候群の特異的な臨床徴候を見るために各ブタを8週間モニタ−した。観測の全持期間は8週間であることを除いては、抗原投与の後の子豚の臨床監視結果は実施例8.1に記載されているそれに同一である。
DMRIE−DOPEを用いて配合しDNAのブタの予防接種
実施例8に記載の裸のプラスミドDNA溶液の代わりに、DMRIE−DOPEを用いたプラスミドDNAの溶液を使用することができる。DNA溶液(実施例6の一種以上のプラスミドを含む)を1mg/ml、0.9% NaCl中に調製する。滅菌蒸留水中に適切な容積のDMRIE−DOPE生理食塩水を取り、0.75mMのDMRIE−DOPE溶液を調製する。
子豚の予防接種とその結果
第1実験:
3〜4匹の子豚(caesarianから入手)の0日をアイソレ−タに入れた。子豚には日2にpJP109単独またはpJP109 +pJP111プラスミド混合物を予防注射した。対照群には生理学溶液を投与した。各プラスミドは無菌の生理溶液(NaCl 0.9%)に250μg/μl(最終濃度)で希釈した。2点で2ml容積を筋肉経路で注射した(首の各側面に1mlづつ)。ワクチンまたはプラセボの第2の注射を日14に投与した。DNAの予防接種は子豚に寛容で、予防接種の副作用の兆候は見られない。子豚には日21にPCV−2ウイルス性サスペンションを口鼻投与(各外鼻孔の1ml)して抗原投与した。抗原投与後、週に一度子豚の重さを量る。直腸温は日17,21,22,24,27,29,31,34,37,41,44に記録する。日44の糞便のスワブは各子豚PCV−2排泄物から集めた。ウィルスを検出し、PCRで定量化した。日45に剖検を実行し、組織サンプルを集め、ウィルスを単離した。
グル−プ間で平均体重増加または平均体温に有意差はない。最終時にブタに見られた総所見は気管支リンパ節症である。
剖検病変:
病変は下記基準で記録した。
1=気管支リンパ節に限られる小さなリンパ節がある。
2=気管支リンパ節に限られる大きなリンパ節がある。
3=気管支submandibullar prescapsularおよびinguinallymph節へ延びた大きなリンパ節がある。
stdは標準偏差の省略である。
Nは各グル−プの動物の数である。
pJP109で免疫した4匹中3匹の子豚と、pJP109およびpJP111プラスミド混合物で免疫した3匹中田の1匹の子豚でリンパ節病変の低下が観測された。標準偏差(std)の高い値であるので、この相違は有意でない(p > 0.05)。
気管支および腸間膜のリンパ節から調製したホモゲネ−ト組織で量的なウィルスre−isolationを実行した。示したデ−タはlog10変換後のホモゲネ−ト組織のウィルス力価に対応する。
ポスト抗原投与糞便のスワブでPCV−2 orf2の増殖をベースにしたPCRによってPCV−2のscheddingを確認した。各検定は2mlのサンプルの三つ組で実行した。ワクチン非投与の対照は抗原投与前はPCV−2に対してネガティブで、抗原投与後はポジティブになる。これでPCRの妥当性が確認される。値はlog10で示してある(2μlサンプル中のPCV−2 DNA分子の数)。
14週齢の通常の子豚(各グル−プ毎に8匹)を二回の投与で免疫した(pJP109と、pJPlllプラスミド+DMRIE DOPE混合物とを日0および日20)。各投与では2mlを筋注経路で耳の後の首側に注射した。ワクチン組成物は生理学溶液(0,9% NaCl)および0.375mM DMRIE DOPEのmlに対して各プラスミド250μgを含む。
子豚の臨床症状、へばり、おう吐、呼吸困難、咳、食欲不振、高体温(直腸温をポスト抗原投与後、28日間毎日記録)、体重減少(子豚の重さを日32、40、46、53、60に計量)をモニタ−した。徴候は下記基準で記録した:
付属書1(1匹の子豚のための評点は、観測の異なる日に対応する評点の合計に等しい)。日60に剖検を実行して、病変を下記基準で記録した:付属書2 (1匹の子豚のための評点は観測される各器官に対応する評点の合計に等しい)。組織サンプル、特にリンパ節を回収した。
免疫された子豚のグル−プで対照と比較して臨床的症状の有意な低下が観測される。対照群1はPMWS徴候で死んだが、予防注射をされた子豚グル−プは死ななかった。
免疫された子豚において対照と比較して病変の有意な差が特にリンパ節症(p≦0.005)で観測される。
腸間膜のおよび縦隔のリンパ節のウィルス負荷を免疫化学で求めた。以下の基準が、評点のために使われる:
0 = 蛍光なし
1 =いくつかの器官スライド上にいくらかの蛍光が見える。
2= 約1つの器官が蛍光。
3= 全てが螢光性器官。
PCV−2排泄物のPCRで排出スワブを調べた。
0=PCV−2なし
1=PCV−2存在
配列番号.1:オリゴヌクレオチドJP779
配列番号.2:オリゴヌクレオチドJP780
配列番号.3:オリゴヌクレオチドJP781
配列番号.4:オリゴヌクレオチドJP782
配列番号.5:オリゴヌクレオチドJP783
配列番号.6:オリゴヌクレオチドJP784
配列番号.7:オリゴヌクレオチドJP785
配列番号.8:オリゴヌクレオチドJP786
配列番号.9:オリゴヌクレオチドRG972
配列番号.10:オリゴヌクレオチドRG973
Claims (11)
- PCV−2のORF1、PCV−2のORF2、PCV−1のORF1およびPCV−1のORF2から成る群の中から選択される遺伝子をコ−ドし、発現するプラスミドと、この遺伝子の発現産物に対する免疫応答を増加することができる要素とからなる免疫原製剤またはワクチン。
- カチオン脂質がDMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム)である請求項2に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- DMRIEと中性脂質とを組み合わせた請求項3に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- DMRIEとDOPE(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン)とを組み合わせた請求項4に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- 免疫応答を増加させることができる要素がカルボマ−から成るアジュバントを含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- 免疫応答を増加させることができる要素がブタサイトカインを含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- ブタサイトカインがGM−CSFである請求項7に記載の免疫原製剤またはワクチン。
- ブタサイトカインをコ−ドし、発現するプラスミドを含む請求項7また
は8に記載の免疫原製剤またはワクチン。 - 免疫応答を増加させることができる要素がブタサイトカインと、DMRI
E、DMRIE/DOPEおよびカルボマ−から成る群の中から選択されるアジュバント化合物とを
含む請求項1に記載の免疫原製剤またはワクチン。 - 他のブタの免疫原をコ−ドし、発現するプラスミドを含む請求項1〜10のいずれか一項に記載の免疫原製剤またはワクチン。
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