PL209304B1 - Szczepionka DNA obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1) - Google Patents
Szczepionka DNA obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1)Info
- Publication number
- PL209304B1 PL209304B1 PL356554A PL35655401A PL209304B1 PL 209304 B1 PL209304 B1 PL 209304B1 PL 356554 A PL356554 A PL 356554A PL 35655401 A PL35655401 A PL 35655401A PL 209304 B1 PL209304 B1 PL 209304B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- seq
- encoding
- plasmid
- bhv
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 43
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 29
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 179
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 69
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 21
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 141
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 116
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 72
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 67
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 67
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 67
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 63
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 63
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 55
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 37
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 37
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 33
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 27
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 claims description 27
- 101150002378 gC gene Proteins 0.000 claims description 23
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 claims description 23
- 101000746317 Bos taurus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 22
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 claims description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 29
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 15
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 abstract description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 abstract description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 abstract description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 105
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 105
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 105
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 92
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 88
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 84
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 73
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 73
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 55
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 44
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 44
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 41
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 38
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 37
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 29
- 241000712005 Bovine respirovirus 3 Species 0.000 description 27
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 27
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 27
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 23
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 23
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 15
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 15
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 13
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 13
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 13
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 13
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 13
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 13
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 13
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 13
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 13
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 13
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 13
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 13
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 13
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 13
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 13
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 13
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 13
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 13
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 13
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 13
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 13
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 13
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 13
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 13
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 13
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 13
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 13
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 13
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 13
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 13
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 13
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 13
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 13
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 13
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 13
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 13
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 13
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 13
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 13
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 13
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 11
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 11
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 11
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 11
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 11
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 11
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 11
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 11
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 11
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 11
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 11
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 11
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 11
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 11
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 11
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 11
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 11
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 11
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 11
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 241000530623 Bovine viral diarrhea virus 2 Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 8
- 101150062176 ORF5 gene Proteins 0.000 description 7
- 101900328733 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Glycoprotein 5 Proteins 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 108010058147 pseudorabies virus glycoprotein D Proteins 0.000 description 7
- 241001137901 Centropomus undecimalis Species 0.000 description 6
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 6
- 101150073872 ORF3 gene Proteins 0.000 description 6
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 6
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 5
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101000984570 Enterobacteria phage T4 Baseplate wedge protein gp53 Proteins 0.000 description 3
- 101000997743 Escherichia phage Mu Serine recombinase gin Proteins 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 2
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710154270 Nuclear protein UL4 homolog Proteins 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101710135104 Uncharacterized protein p6 Proteins 0.000 description 2
- 208000010399 Wasting Syndrome Diseases 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 108010008529 bovine viral diarrhea virus gp53 Proteins 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- JMKCNRWRKRJLNF-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxypropan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCOC(N)CC JMKCNRWRKRJLNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 101000959884 Ascaris suum Major pepsin inhibitor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000765604 Bacillus subtilis (strain 168) FlaA locus 22.9 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241001235164 Border disease virus 2 Species 0.000 description 1
- 101000964402 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized protein in xynC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101100488875 Cassava vein mosaic virus ORF 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101150060442 EO gene Proteins 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 102100023795 Elafin Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710126499 Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 101000830028 Escherichia phage Mu Uncharacterized protein gp25 Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 206010060919 Foetal malformation Diseases 0.000 description 1
- 241001506018 H1N1 swine influenza virus Species 0.000 description 1
- 108050002093 Haemagglutinin-neuraminidases Proteins 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101001048718 Homo sapiens Elafin Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101000977779 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 33.9 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 241001135960 Murine rotavirus Species 0.000 description 1
- TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N N'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol guanidine Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.NCCCCNCCCN.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000827630 Narcissus mosaic virus Uncharacterized 10 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000871677 PRRSV VR2332 Species 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001931 Porcine Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108700012261 Rotavirus VP7 Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101710142606 Sliding clamp Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101710183681 Uncharacterized protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010070396 bovine herpesvirus type-1 glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940090046 jet injector Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- OHZZTXYKLXZFSZ-UHFFFAOYSA-I manganese(3+) 5,10,15-tris(1-methylpyridin-1-ium-4-yl)-20-(1-methylpyridin-4-ylidene)porphyrin-22-ide pentachloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Mn+3].C1=CN(C)C=CC1=C1C(C=C2)=NC2=C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)C([N-]2)=CC=C2C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)=C(C=C2)N=C2C(C=2C=C[N+](C)=CC=2)=C2N=C1C=C2 OHZZTXYKLXZFSZ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical group NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylethylamine Chemical compound CCN(C)C DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest ulepszona szczepionka DNA dla zwierząt gospodarczych, a zwłaszcza dla bydła obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1).
Zastosowanie cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do szczepienia jest znane od początku lat 90. (Wolf i wsp. Science 1990), 247, 1465-1468). Ta technika szczepień indukuje odporność komórkową i humoralną po transfekcji in vitro komórek szczepionego osobnika przez cząsteczki DNA lub RNA kodujące i wyrażające białka immunologicznie czynne.
Szczepionka DNA składa się przynajmniej z jednego plazmidu, który może ulec ekspresji przez maszynerię komórkową szczepionego osobnika i nośnika lub zarobki dopuszczalnych farmaceutycznie. Sekwencja nukleotydów tego plazmidu koduje i wyraża, między innymi, jeden lub kilka immunogenów, takich jak białka lub glikoproteiny zdolne do indukowania u szczepionego osobnika odpowiedzi odpornościowej komórkowej (mobilizacja limfocytów T) i humoralnej (stymulacja produkcji przeciwciał specyficznie skierowanych przeciwko immunogenowi) (Davis H. L. Current Opinion Biotech. 1997, 8, 635-640).
Wszystkie immunogeny pochodzące od patogenu nie są antygenami, które naturalnie są dostatecznie skuteczne, aby zaindukować optymalną ochronną odpowiedź odpornościową (immunologiczną) u szczepionego zwierzęcia. Jest więc konieczne polepszenie odpowiedzi odpornościowej.
Proponowano różne drogi podawania szczepionki DNA (dootrzewnowa, dożylna, domięśniowa, podskórna, śródskórna, do śluzówek itd.). Proponowano różne sposoby podawania, w szczególności cząsteczki złota otoczone DNA i wstrzeliwane do komórek skóry szczepionego osobnika (Tang i wsp. Naturę 1992, 356, 152-154) oraz iniekcje płynu za pomocą wtryskiwacza strumieniowego pozwalające na transfekcję naraz komórek skóry i leżących pod nimi komórek (Furth i wsp., Analytical Bioch. 1992, 205, 365-368). Do transfekcji DNA in vitro stosowano związki chemiczne:
A) Lipidy kationowe
Lipidy kationowe dzielą się na cztery podgrupy:
1) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonowe jak, na przykład, DOTMA (dioleiloksypropylotrimetyloamon, produkowany przez Gibco pod nazwą Lipofektyna), DOTAP (trimetylo-2-3-(oktadeka-9-enooiloksy)-1-propanoamon; Gregoriadis i wsp., FEBS Letters 1997, 402, 107110), DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A-9634109), DLRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecyloksy)-1-propanoamon (Felgner i wsp., Ann. N Y Acad. Sci. 1995, 772, 126-139).
Te lipidy kationowe zawierające sole amonu czwartorzędowego mogą być zasocjowane lub nie z dodatkowym obojętnym lipidem, takim jak DOPC (dioleilofosfatydylocholina) lub DOPE (dioleilofosfatydyloetanolamina) (J. P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994, 5, 382-389).
2) lipoaminy jak, na przykład, DOGS (dioktadecyloamidoglicylospermina, produkowana przez Promega pod nazwą Transfectam; Abdallah i wsp., Biol. Cell. 1995, 85, 1-7), DC-Chol (dimetyloaminoetano-karbamoilo-cholesterol; Gao i Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 280285), BGSC (bis-guanidyno-spermidyno-cholesterol), BGTC (bis-guanidyno-tren-cholesterol) (Vigneron i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9682-9686).
3) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonu i lipoaminy jak, na przykład, DOSPA (N,N-dimetylo-N-(2-(sperminokarboksyamido)etylo)-2,3-bis(dioleiloksy)-1-propanimidu pięciochlorek, sprzedawany przez Gibco pod nazwą LipofectAmine®; Hawley-Nelson i wsp., Focus 1993, 15, 73-79), GAP-DLRIE (N-(3-ammopropylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecloksy)-1-propanoamina; Wheeler i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11454-11459; Normani wsp, Vacine 1997, 15, 801-803).
4) lipidy zawierające sole amidyny jak, na przykład, ADPDE, ADODE (Ruysschaert i wsp, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203, 1622-1628).
B) polimery jak, na przykład, SuperFect™ (cząsteczki aktywowanych dendrymerów), produkowane przez Qiagen; Xu i wsp. Mol. Genet. Metab. 1998, 64, 193-197), oraz
C) czynniki biochemiczne jak, na przykład, toksyny, a zwłaszcza toksyny cholery.
Niektóre z tych związków były też stosowane w preparatach szczepionek DNA z wynikami dość umiarkowanymi. Wiedza o transfekcji in vitro nie jest do przeniesienia na szczepienie DNA, gdzie ostatecznym celem jest zapewnienie ochronnej reakcji odpornościowej. Efekty negatywne wpływające na indukcję skutecznej ochrony immunologicznej były nawet stwierdzane ze związkami, o których
PL 209 304 B1 wiadomo, że sprzyjają transfekcji in vitro. Niektóre formulacje związków chemicznych są w wysokich dawkach toksyczne dla transfekowanych komórek.
W pracach Etcharta (Etchart i wsp, J. Gen. Virol. 1997, 78, 1577-1580), stosowanie DOTAP nie miało efektu adiuwanta podczas podawania szczepionki DNA drogą donosową, podczas gdy posiadało go na drodze podawania doustnej. DOTAP był też stosowany na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa grypy podawanych drogą donosową (Ban i wsp., Vaccine 1997, 15, 811-813), ale dodatek DOTAP hamował odpowiedź odpornościową. Stosowanie DC-Chol lub DOTAP/DOPE na modelu mysim w szczepionkach DNA kodujących białko powierzchniowe (S) wirusa zapalenia wątroby typu B podawanego drogą domięśniową pozwoliło na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał, podczas gdy stosowanie lipofektyny (lub DOTMA) nie zwiększyło tej odpowiedzi (Gregoriadis i wsp, FEBS Letters 1997, 402, 107-110). DC-Chol/DOPE był też stosowany w szczepionkach DNA przeciw ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV, białko Env), na modelu mysim, którego podanie na drodze domięśniowej zaindukowało bardziej skuteczną odpowiedź odpornościową, podczas gdy podanie drogą podskórną lub doskórną jej nie zwiększyło (Ishii i wsp, AIDS Res. Hum. Retro. 1997, 13, 1421-1428).
Dodatek pewnych cytokin, w szczególności interleukin lub interferonów może umożliwić wzmocnienie odpowiedzi odpornościowej indukowanej w szczególności przez szczepionki DNA. Każda cytokina wywołuje reakcję, która jest dla niej specyficzna i w mniejszym lub większym stopniu orientuje odpowiedź odpornościową w stronę odpowiedzi komórkowej lub w stronę odpowiedzi humoralnej (Pasquini i wsp, Immunol. Cell. Biol. 1997, 75, 397-401; Kim i wsp, J. Interferon Cytokine Res. 1999, 19, 77-84). Efekty adiuwantowe cytokiny pochodzącej z jednego gatunku niekoniecznie są te same w odmiennym kontekście odpornościowym, w szczególności, jeśli ta cytokina jest podana innemu gatunkowi, a więc do heterologicznego systemu odpornościowego. Dodatek cytokiny może również nie mieć żadnego efektu adiuwanta lub dać odwrócenie pożądanego efektu, to znaczy zmniejszenie lub hamowanie odpowiedzi odpornościowej. Tak więc szczepionka DNA kodująca prosty łańcuch immunoglobuliny w formie fuzji z GM-CSF nie zwiększa odpowiedzi odpornościowej, podczas gdy podanie bezpośrednie tej fuzji białkowej u myszy jest skuteczne, tak jak jest podanie fuzji białkowej złożonej z Fv i cytokiny IL-lbeta lub podanie szczepionki DNA kodującej tę ostatnią fuzję białka (Hakim i wsp, J. Immunol. 1996, 157, 5503-5511). Użycie plazmidów koeksprymujących cytokinę IL-2 i białko otoczki wirusa zapalenia wątroby typu B w konformacji fuzji lub bez fuzji daje w efekcie zwiększenie humoralnych i komórkowych odpowiedzi immunologicznych (Chow i wsp, J. Virol. 1997, 71, 169-78). Jednak stosowanie plazmidu bicistronowego kodującego glikoproteinę gpl20 ludzkiego wirusa nabytego niedoboru odporności (HIV-1) i cytokinę IL-2 indukowało specyficzną odpowiedź odpornościową anty-gpl20 słabszą niż uzyskaną przez stosowanie plazmidu monocistronowego kodującego tylko gpl20 (Barouch i wsp, J. Immunol. 1996, 161, 1875-1882). Koiniekcja u myszy dwóch wektorów ekspresyjnych, z których jeden koduje glikoproteinę H wirusa wścieklizny, a drugi mysi GM-CSF stymuluje aktywność limfocytów B i T, podczas gdy koiniekcja plazmidu kodującego interferon gamma (zamiast mysiego GM-CSF) daje w efekcie zmniejszenie odpowiedzi odpornościowej (Xiang i wsp, Immunity 1995,2, 129-135).
Pewne modyfikacje na poziomie antygenów, takie jak delecje części sekwencji nukleotydów kodujących antygen, insercja fragmentu DNA w sekwencji nukleotydów kodującej antygen lub w regionach nieulegających translacji powyżej lub poniżej mogą też polepszyć skuteczność szczepionki DNA, w szczególnoś ci poprawiają c poziom ekspresji antygenu lub jego prezentację .
Ale w praktyce manipulacje na poziomie sekwencji nukleotydów kodującej antygen mogą pociągnąć za sobą zmniejszenie lub utratę pierwotnej aktywności immunologicznej. Tak więc delecja domeny transbłonowej w genie kodującym antygen G wirusa wścieklizny zmniejszyła poziom ochrony indukowany w modelu mysim po podaniu drogą domięśniową szczepionki DNA kodującej ten zmodyfikowany antygen (Xiang i wsp, Virol 1995, 209, 569). Delecja domeny transbłonowej w genie kodującym glikoproteinę gD wirusa opryszczki bydlęcej (BHV) nie pozwoliła na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał i zaindukowała tylko ochronę częściową u gatunków bydła szczepionych drogą domięśniową (van Drunen Littlevan den Hurk i wsp, J. Gen. Virol. 1998, 79, 831-839). Odpowiedzi odpornościowe humoralne i komórkowe i nadawana ochrona są identyczne u świnek morskich badanych po immunizacji za pomocą albo szczepionki DNA kodującej glikoproteinę GP wirusa Ebola, albo szczepionki DNA kodującej tę glikoproteinę GP, ale w postaci wydzielanej (Xu i wsp. Nature Medicine 1998,4,37-42).
PL 209 304 B1
Wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (ang. human tissue Plasminogen Activator lub human tPA) do genu kodującego antygen Pf332 malarii nie pozwoliło na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej na drodze domięśniowej (Haddad i wsp, FEMS. 1997, 18, 193-202). Dodatek w fazie sekwencji tPA do genu kodującego antygen VP7 mysiego rotawirusa także nie pozwolił na zwiększenie odpowiedzi przeciwciał u myszy szczepionej drogą doskórną, podczas gdy fuzja białkowa wytworzona z antygenu VP4 i tPA pozwoliła na ten przyrost, ale bez indukcji skutecznej ochrony (Choi i wsp, Virology 1998, 250, 230-240).
Modyfikacje przeprowadzone na sekwencji nukleotydów antygenu nie mogą na ogół być bezpośrednio przeniesione na inny antygen, jako, że antygeny nie zawsze mają te same uwarunkowania strukturalne.
Celem wynalazku jest polepszenie skuteczności szczepienia szczepionką DNA. Celem jest zwłaszcza uzyskanie lepszej odpowiedzi odpornościowej, a w szczególności skutecznej ochrony u zwierząt gospodarczych, zwłaszcza u bydła i ś wiń przez szczepienie DNA.
Celem wynalazku jest opracowanie ulepszonych szczepionek DNA indukujących skuteczną i ochronną odpowiedź odpornoś ciową przeciw wirusowi opryszczki bydł a typu 1 (BHV-1) zwanego te ż wirusem zakaźnego zapalenia nosa i gardła bydła (IBR). Podobne szczepionki mogą być również wytworzone przeciw bydlęcemu syncytialnemu wirusowi oddechowemu (BRSV), wirusowi choroby śluzówek lub pestiwirusowi bydła typu 1 lub 2 (wirus biegunki bydła zwany BVDV-1 i BVDV-2), wirusowi paragrypy bydła typu 3 (bPI-3).
Możliwe jest również opracowanie ulepszonych szczepionek DNA pozwalających na otrzymanie skutecznej i ochronnej reakcji odpornościowej u bydła zawierających przynajmniej jedną walencję wybraną z grupy złożonej z wirusów BHV-1, BRSV, BVDV, bPI-3 i wirusa wścieklizny.
Celem wynalazku jest otrzymanie ulepszonych szczepionek DNA pozwalających na otrzymanie skutecznej ochrony przeciw przynajmniej jednemu patogenowi zakażającemu zwierzęta gospodarcze takie jak bydło czy świnie. Szczepionka DNA jest ulepszona albo przez jej formułowanie albo przez dodatek GM-CSF, albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, lub przez kombinację tych rozwiązań.
Korzystnie szczepionka DNA jest ulepszona przez jej formułę, i ewentualnie przez dodanie GM-CSF albo przez optymalizację antygenu lub antygenów, albo przez dodanie GM-CSF i przez optymalizację antygenu lub antygenów.
Z definicji szczepionka DNA zawiera, jako czynnik aktywny plazmid kodują cy i wyraż ają cy gen lub fragment genu. Określenie plazmid obejmuje jednostkę transkrypcji DNA zawierającą sekwencję polinukleotydów zawierającą sekwencję genu, który ma być wyrażany i elementy potrzebne do jego ekspresji in vivo. Korzystna jest forma kolistego plazmidu, superzwinięta lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres wynalazku.
Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji wstawionego pod jego kontrolą genu. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny a w szczególności o wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego lub ewentualnie z innego źródła takiego jak szczur lub świnka morska. W bardziej ogólnie promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można podać wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Może też chodzić o promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład, własny promotor genu. Jako promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu taki jak, na przykład, promotor desminy lub alternatywnie promotor aktyny. Gdy szereg genów jest obecnych na tym samym plazmidzie mogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w kilku różnych jednostkach.
Wynalazek dotyczy szczepionki DNA obejmującej plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1) oraz elementy konieczne do jego wyrażania in vivo, N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon (DMRIE) oraz dioleilo-fosfatydylo-etanolaminę (DOPE).
Szczepionka ponadto korzystnie obejmuje białko czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
Szczepionka korzystnie ponadto obejmuje wektor ekspresyjny zawierający gen kodujący bydlęce białko GM-CSF, który umożliwia wyrażanie in vivo tego genu, korzystniej wektor ekspresyjny jest plazmidem.
W korzystnej szczepionce plazmid zawiera kwas nukleinowy kodują cy immunogen BHV-1, w którym to kwasie nukleinowym została wydeletowana część kodująca domenę transbłonową.
PL 209 304 B1
Równie korzystnie plazmid w szczepionce zawiera sekwencję nukleotydów kodującą immunogen BHV-1, i heterologiczną sekwencję sygnałową, korzystnie ludzki tkankowy aktywator plazminogenu (tPA).
Ponadto w korzystnej szczepionce plazmid zawiera kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen BHV-1 oraz zawiera stabilizujący intron, korzystniej intronem jest intron II genu beta-globiny królika.
W równie korzystnej szczepionce plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę gB BHV-1, korzystniej sekwencja genu gB zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gB, i/lub delecję fragmentu genu gB kodującego domenę transbłonową.
Ponadto w korzystnej szczepionce plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę gC BHV-1, korzystniej sekwencja genu gC zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gC, i/lub delecję fragmentu genu gC kodującego domenę transbłonową.
W innym wykonaniu korzystnej szczepionki plazmid zawiera kwas nukleinowy kodują cy glikoproteinę gD BHV-1, korzystniej sekwencja genu gD zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gD, i/lub delecję fragmentu genu gD kodującego domenę transbłonową.
Szczepionka równie korzystnie obejmuje plazmid ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący gB z BHV-1 z delecja fragmentu kodującego domenę transbłonową i przylegającą część C-końcową, oraz drugi plazmid ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący gD z BHV-1 z delecja fragmentu kodującego domenę transbłonową i przylegającą część C-końcową.
Szczepionki DNA są formułowane przez dodanie jako adiuwantów lipidów kationowych zawierających sól czwartorzędową amonu o wzorze:
ch3
R., -o-ch2-ch-ch2-n+—r2-x
0R1 CH3 w którym R1 jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą , mającą od 12 do 18 atomów węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą od 2 do 3 atomów węgla, a X jest grupą hydroksylową lub aminową.
Takim adiuwantem jest korzystnie DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1 -propanamon; WO-A-9634109), korzystniej DMRIE jest połączony z obojętnym lipidem jakim jest DOPE (dioleilofosfatydylo-etanolaminą) aby wytworzyć DMRIE-DOPE.
Opisane są, więc szczepionki DNA przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi zwierząt gospodarczych, w szczególności bydła, zawierające, co najmniej jeden plazmid obejmujący, co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą immunogen patogenu rozważanego gatunku zwierzęcia, w warunkach pozwalających na ekspresję in vivo tej sekwencji i lipid kationowy zawierający czwartorzędową sól amonu, w szczególności DMRIE, korzystnie zasocjowany z DOPE.
Korzystnie, zrekombinowany wektor miesza się z tym adiuwantem bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne aby przed podaniem zwierzę ciu tak przygotowanej mieszaniny, by ł a ona pozostawiona w celu wytworzenia kompleksów, na przykł ad, na okres od 10 do 60 minut, w szczególnoś ci na 30 minut.
O ile DOPE jest obecny, stosunek molarny DMRIE:DOPE korzystnie wynosi od 95:5 do 5:95, a korzystniej 1:1.
Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE lub DMRIE-DOPE może w szczególności wynosić od 50:1 do 1:10, zwłaszcza od 10:1 do 1:5, a korzystniej od 1:1 do 1:2.
Według innego wykonania dodaje się do szczepionek według wynalazku GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów, ang. granulocyte macrophage - colony stimulating
PL 209 304 B1 factor; Clark S.C. i wsp. Science 1987, 230, 1229; Grant S.M. i wsp, Drugs 1992, 53, 516) co może być zrobione przez włączenie białka GM-CSF bezpośrednio do kompozycji szczepionki lub korzystnie przez wstawienie sekwencji kodującej GM-CSF do wektora ekspresyjnego w warunkach pozwalających na jego ekspresję in vivo. Jako wektor ekspresyjny korzystnie stosuje się plazmid, na przykład, plazmid zawierający sekwencję nukleotydów kodującą interesujący antygen lub antygeny lub inny plazmid. Wybór GM-CSF korzystnie przeprowadza się zależnie od gatunku zwierzęcia, które ma być szczepione, tak więc dla bydła korzystnie stosowany jest GM-CSF bydlęcy, dla świń będzie to GM-CSF świni.
Według kolejnego wykonania sekwencja (lub sekwencje) nukleotydowa kodująca immunogen jest w postaci zoptymalizowanej. Przez optymalizację należy rozumieć każdą modyfikację sekwencji nukleotydów, w szczególności taką, której efektem będzie przynajmniej wyższy poziom ekspresji tej sekwencji nukleotydów i/lub zwiększenie stabilności mRNA kodującego ten antygen, i/lub indukowana sekrecja pozakomórkowa tego antygenu, której bezpośrednią lub pośrednią konsekwencją będzie zwiększenie indukowanej odpowiedzi odpornościowej.
W niniejszym wynalazku optymalizacja interesują cego antygenu skł ada się korzystnie z delecji fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę transbłonową interesującego antygenu (przez delecję rozumie się całkowite usunięcie lub częściową delecję wystarczającą, aby domena transbłonową nie była już, lub zasadniczo już, funkcjonalna) i/lub dodania w ramce odczytu sekwencji nukleotydów kodującej sygnał tPA (Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997, 43, 285-292; Harris i wsp. Mol. Biol. Med. 1986, 3, 279-292) i/lub wstawienie intronu stabilizującego powyżej genu do wrażania. Delecja fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową interesującego antygenu sprzyja sekrecji do podłoża zewnątrzkomórkowego tak obciętych antygenów i w ten sposób zwiększa możliwości ich kontaktu z komórkami systemu odpornościowego. Wstawienie sekwencji nukleotydowej kodującej sygnał tPA (sygnałowy tPA) ułatwia translację informacyjnego RNA, do którego jest przyłączony sygnałowy tPA i zwiększa w ten sposób poziom ekspresji tego informacyjnego RNA a przez to produkcję antygenów. Sygnał tPA odgrywa też rolę w sekrecji syntetyzowanego antygenu.
Inne sekwencje nukleotydów kodujące peptydy sygnałowe mogą też być stosowane, w szczególności peptydu sygnałowego melityny pochodzącej z pszczół (Sisk W. P. i wsp, 1994, J. Virol, 68, 766-775).
Insercja intronu stabilizującego w genie kodującym interesujący antygen pozwala na uniknięcie wadliwego składania jego informacyjnego RNA i utrzymuje jego fizyczną integralność.
Korzystnie sygnałowy tPA jest pochodzenia ludzkiego. Sekwencja nukleotydów ludzkiego sygnałowego tPA jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu NM 000930. Korzystnie intron jest intronem II genu beta-globiny królika (van Ooyen i wsp. Science 1979, 206, 337-344), którego sekwencja nukleotydów dostępna jest w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882 i ma odnośniki pod intronem nr 2.
Celem obecnego wynalazku jest ulepszona szczepionka DNA zdolna do indukcji odpowiedzi odpornościowej i ochronnej u bydła przeciw zakaźnemu zapaleniu nosa i gardła bydła (IBR).
Wirus odpowiedzialny za zapalne zakażenie nosa i gardła u bydła jest wirusem opryszczki bydła typu 1 (BHV-1), członkiem rodziny Alphaherpesvirinae (Babiuk L.A. i wsp, 1996, Vet. Microbiol. 53, 31-42). Sekwencje nukleotydów kodujące glikoproteiny gB, gC i gD są znane i dostępne w bazie danych GenBank pod numerem dostępu AJ004801.
Według wynalazku szczepionka DNA przeciwko IBR korzystnie jest ulepszona przez formułowanie z adiuwantem według wynalazku, w szczególności DMRIE-DOPE. Ewentualnie może być ona łączona albo przez dodanie GM-CSF bydlęcego (Maliszewski i wsp, Molec. Immunol. 1988, 25, 843-850) albo przez optymalizację przynajmniej jednego antygenu IBR, a w końcu dodanie GM-CSF bydlęcego i optymalizację przynajmniej jednego antygenu IBR.
Sekwencja nukleotydów kodująca bydlęcy GM-CSF dostępna jest w bazie danych GenBank pod numerem dostępu U22385.
Dodanie bydlęcego GM-CSF można przeprowadzić przez włączenie polipeptydu bydlęcego GM-CSF do kompozycji szczepionki lub korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej bydlęcy GM-CSF do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie, sekwencja nukleotydów kodująca bydlęcy GM-CSF wstawiona jest do drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1032, przykład 13), odmiennego od tego (lub tych), w którym wstawiony jest gen lub geny kodujące antygen/y IBR.
PL 209 304 B1
Optymalizacja antygenów pochodzących od IBR jest przeprowadzana przez podstawienie sekwencji „sygnałowej” w szczególności tej sygnałowego tPA pochodzenia ludzkiego (GenBank numer dostępu NM 000930), sekwencji peptydu sygnałowego glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD i/lub delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową gB i/lub gC i/lub gD. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową jednej z tych glikoprotein towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej (część cytoplazmatyczna glikoproteiny). Szczepionka DNA przeciwko IBR według wynalazku może więc kodować i wyrażać jeden pojedynczy zoptymalizowany antygen IBR (gB, gC lub gD) lub dwa z nich albo wszystkie trzy, to znaczy zoptymalizowany gB, zoptymalizowany gC i zoptymalizowany gD.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny BHV-1 stosowane w tym wynalazku i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są zilustrowane w obecnym wynalazku i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są zilustrowane w załączonych przykładach oraz w FR-A1-2751229, w szczególności w przykł adach 7 i 8 i na fig. 3 i 4.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko BHV-1 jest formułowana z DMRIE-DOPE i składa się z plazmidu ekspresyjnego (na przykł ad, pPB281, przykł ad 3.1.2) kodują cego antygen gB BHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i przyległą część C-końcową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pPB292, przykład 3.2.2) kodującego antygen gC BHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i przyległą część C-końcową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pPB284, przykład 3.3.2) kodującego antygen gD BHV-1 zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i przyległą część C-końcową.
Ogólnie i nie tylko dla BHV-1, część C końcowa przyległa do sekwencji kodującej domenę transbłonową może być zachowana, jest jednak często łatwiejsze wydeletowanie jej w tym samym czasie jak sekwencji kodującej domenę transbłonową.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołana skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u bydła przeciwko bydlęcemu syncytialnemu wirusowi oddechowemu (BRSV).
Wirus BRSV jest Paramyxowirusem, także członkiem rodziny Paramyxoviridae (Baker i wsp., Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 1997, 13, 425-454). Sekwencje nukleotydów kodujące białko F i glikoproteinę G są znane i dostępne w bazie danych GenBank odpowiednio pod numerami dostępu Y17970 i U33539.
Szczepionka DNA przeciwko BRSV korzystnie formułowana jest z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Szczepionka może być dowolnie łączona albo z dodatkiem bydlęcego GM-CSF, lub z optymalizacją przynajmniej jednego antygenu BRSV, lub dodatkiem bydlęcego GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu BRSV.
Dodanie bydlęcego GM-CSF można przeprowadzić tak jak jest to opisane dla BHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z BRSV przeprowadza się przez substytucję za pomocą jednej sekwencji „sygnałowej” w szczególności tPA pochodzenia ludzkiego, sekwencji sygnałowej białka F BRSV i/lub glikoproteiny otoczki G BRSV i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową F i/lub G. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową jednego z tych białek towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej. Szczepionka DNA przeciwko BRSV u może, więc kodować i wyrażać jeden optymalizowany antygen BRSV (F lub G) lub oba (F i G).
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny BRSV przydatne do użycia oraz różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w FR-A1-2751229, a zwłaszcza w przykł adach 9 i 10, i na fig. 5 i 6.
Szczepionka DNA przeciwko BRSV może być formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB114, przykład 4.1.3) kodującego antygen F BRSV zoptymalizowanego przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA na miejsce sekwencji sygnałowej F, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów F kodującego domenę transbłonową i przyległą część C-końcową i z drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSBUO, przykład 4.2.2) kodującego antygen G BRSV zoptymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA na miejsce sekwencji nukleotydów kodującej sekwencję sygnałową G, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową G i przyległą części C-końcową.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u bydła przeciw wirusowi BVDV.
PL 209 304 B1
Wirus BVDV jest pestiwirusem z rodziny Flaviviridae. Jest on uniwersalnie rozpowszechniony w populacjach bydła i wyraża się deformacjami płodu, poronieniami lub objawami klinicznymi oddechowymi (choroba śluzówek) i żołądkowymi (wirusowa biegunka u bydła).
Wirusy BVDV różnią się stopniem ciężkości objawów klinicznych i wyodrębniono dwie grupy, BVDV typu 1 (objawy kliniczne niewidoczne lub średnie) i te typu 2 (objawy kliniczne ostre, krwotoki, wysoka chorobowość, wysoka śmiertelność) (Dean H.J. i Leyh R., 1999, Vaccine, 17, 1117-1124).
Gdy typ wirusa BVDV nie jest jasno podany, to ten wirus ma być rozumiany, jako będący typu 1 lub typu 2.
Wirus BVDV jest wirusem otoczkowym z jednoniciowym RNA złożonym z pojedynczego genu kodującego polibiałko, które po cięciu daje kilka białek dobrze oddzielonych w szczególności białko EO (gp48) i białko E2 (gp53) (Vassilev V.B. i wsp., 1997, J. Virol, 71, 471-478).
Sekwencje nukleotydów kodujące polibiałka E0-E2 są znane i dostępne w bazie danych GenBank pod numerem dostępu M96687 dla BVDV-1 oraz AF145967 dla BDV-2.
Szczepionka DNA przeciwko BVDV jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem bydlęcego GM-CSF lub z optymalizacją przynajmniej jednego antygenu BVDV, lub dodatkiem bydlęcego GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu BVDV.
Dodatek bydlęcego GM-CSF można wprowadzić tak jak jest opisane dla BHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z BVDV przeprowadza się przez dodanie sekwencji „sygnałowej” w szczególności ludzkiego tPA, powyżej sekwencji nukleotydów kodującej białko EO BVDV i/lub białko E2 BVDV, i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową E2 i/lub przez wstawienie intronu, w szczególności intronu II genu beta-globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej EO i/lub E2. Szczepionka DNA przeciwko BVDV może, więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen BVDV (EO lub E2) lub oba (EO i E2).
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny BVDV do użycia w takiej szczepionce i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w FR-A1-2751229, a zwłaszcza w przykładzie 13 i na fig. 9.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko BVDV jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykł ad, pLF1029, przykł ad 5.1.2, pLF1031, przykł ad 6.2.2) kodują cego antygen EO BVDV optymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA powyżej EO i przez wstawienie intronu II genu beta globiny królika powyżej EO i drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1021, przykład 5.2.2, pLF1023, przykład 6.1.2) kodującego antygen E2 BVDV zoptymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA powyżej E2, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową E2 i przylegającej części C-końcowej i przez wstawienie intronu II genu beta globiny królika powyżej E2.
Korzystnie można przygotować mieszaninę plazmidów. Mieszania może zawierać przynajmniej dwa plazmidy ekspresyjne, każdy wyrażający inny immunogen (EO i E2) i/lub pochodzący z innego typu BVDV (BVDV-1 lub BVDV-2). W szczególności może być to mieszanina zrobiona z czterech plazmidów wyrażających EO BVDV-1, E2 BVDV-1, EO BVDV-2 i E2 BVDV-2.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u bydła przeciwko wirusowi paragrypy typu 3 (bPI-3).
Wirus bPI-3 jest Paramyxowirusem, jest także członkiem rodziny Paramyxoviridae (Tsai i wsp., Infect. Immun. 1975, 11, 783-803).
Sekwencje nukleotydowe kodujące białka hemaglutyniny- i neuraminidazy (HN) i białko fuzyjne (F) z bPI-3 są znane i dostępne w bazie danych GenBank pod numerem dostępu U31671.
Szczepionka DNA przeciwko bPI-3 jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem bydlęcego GM-CSF, lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu z bPI-3, lub z dodatkiem bydlęcego GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu bPI-3.
Dodatek bydlęcego GM-CSF można wprowadzić tak jak jest to opisane dla BHV-1.
Optymalizację antygenów pochodzących z bPI-3 przeprowadza się przez substytucję przez sekwencję „sygnałową” w szczególności ludzkiego tPA sekwencji sygnałowej hemaglutyniny-neuraminidazy (FIN) z bPI-3 i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HN i/lub F i/lub przez wstawienie intronu w szczególności intronu II genu beta globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HN i/lub F. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonoPL 209 304 B1 wą jednego z tych białek towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej. Szczepionka DNA przeciwko bPI-3 może więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen PI-3 (HN lub F) lub oba (HN i F).
Sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny bPI-3 możliwe do użycia i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w FR-A 1-2751229, a zwłaszcza w przykładach 14 i 15 i na fig. 10 i 11.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko bPI-3 jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1025, przykład 7.1.2) kodującego antygen HN bPI-3 optymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA na miejsce sekwencji sygnałowej HN, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów HN kodującej domenę transbłonową i przyległą część C-końcową i przez wstawienie intronu II genu beta globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HN i drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1027, przykład 7.2.2) kodującego antygen F bPI-3 zoptymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej tPA ludzkiego na miejsce sekwencji sygnałowej F, przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową F i przyległą część C-końcową i przez wstawienie intronu II genu beta-globiny królika powyżej F.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u świni przeciwko świńskiemu herpeswirusowi (PRV) (wirus pseudowścieklizny).
Wirus PRV jest członkiem rodziny Alphaherpesvirinae, wirus ten jest odpowiedzialny za chorobę Aujeszky'ego (Sawitzky D., Arch. Virol. Suppl. 1997, 13,201-206).
Sekwencje nukleotydów kodujące glikoproteiny gB, gC i gD są znane i dostępne z bazy danych GenBank pod numerem dostępu Ml7321, AF158090, AF086702.
Szczepionka DNA przeciwko PRV jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona albo z dodatkiem GM-CSF świni (Inumaru S. et Takamatsu H. Immunol. Cell. Biol. 1995, 73, 474-476), lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu PRV, lub w końcu z dodatkiem GM-CSF świni i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu PRV.
Dodanie GM-CSF świni można przeprowadzić przez włączenie polipepty-du GM-CSF świni do kompozycji szczepionki, korzystnie przez wstawienie sekwencji nukleotydów kodującej GM-CSF świni (na przykład, dostępnej w bazie danych GenBank pod numerem dostępu D21074) do wektora ekspresyjnego in vivo, korzystnie do plazmidu. Korzystnie sekwencja nukleotydów kodująca GM-CSF świni jest wstawiona do drugiego plazmidu ekspresyjnego, (na przykład, pLF1033, przykład 14) odmiennego od tego (lub tych), gdzie wstawiony jest gen lub geny kodujące antygeny PRV.
Optymalizację antygenów pochodzących z PRV przeprowadza się przez podstawienie za pomocą sekwencji „sygnałowej”, w szczególności sygnału tPA pochodzenia ludzkiego (GenBank numer dostępu NM 000930) sekwencji peptydu sygnałowego glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową gB i/lub gC i/lub gD. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową jednej z tych glikoprotein towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej. Szczepionka DNA przeciwko PRV może, więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen PRV (gB, gC lub gD) lub dwa z nich lub trzy, to znaczy zoptymalizowany gB, zoptymalizowany gC, zoptymalizowany gD.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny PRV do zastosowania jak i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w FR-A 1-2751224, a zwłaszcza w przykładach 8 i 9 i na fig. 3 i 5.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko PRV jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB102, przykład 8.1.2) kodującego antygen gB PRV optymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i przyległą części C-końcową, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB104, przykład 8.2.2) kodującego antygen gC PRV zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i przyległą część C-końcową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pSB106, przykład 8.3.2) kodującego antygen gD PRV zoptymalizowany przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i przyległą część C-końcową.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u świni przeciwko wirusowi
PL 209 304 B1 poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego u świń (PRRSV) (zwanym też zespołem oddechowym i rozrodczym świń).
Wirus PRRSV jest Arteriwirusem, członkiem rodziny Arteriviridae (Murtaugh i wsp., Arch. Virol. 1995, 140, 1451-1460).
Sekwencje nukleotydów kodujących białka kodowane przez otwarte ramki odczytu ORF3, ORF5 i ORF6 są znane i dostępne w bazie danych GenBank pod numerem dostępu U87392.
Szczepionka DNA przeciwko PRRSV jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem GMCSF świni, lub optymalizacją przynajmniej jednego antygenu PRRSV, lub z dodatkiem GM-CSF świni i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu PRRSV.
Dodatek GM-CSF świni można przeprowadzić tak jak opisano dla PRV.
Optymalizację antygenów pochodzących z PRRSV przeprowadza się przez substytucję przez sekwencję „sygnałową” w szczególności sygnałową tPA pochodzenia ludzkiego (GenBank numer dostępu NM 000930) sekwencji peptydu sygnałowego peptydu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu 3 (ORF3, gp45 lub duża glikoproteina otoczki) i/lub glikoproteiny ORF5 (gp25 lub glikoproteina otoczki E) i/lub glikoproteiny ORF6 (gpl8 lub białko membranowe) i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową glikoproteiny ORF3 i/lub ORF5 i/lub ORF6. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową jednej z tych glikoprotein towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej. Szczepionka DNA przeciwko PRRSV może, więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen PRRSV (ORF3, ORF5 lub ORF6) lub dwa z nich lub trzy, to znaczy zoptymalizowany ORF3, zoptymalizowany ORF5 i zoptymalizowany ORF 6.
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny PRRSV do użycia w tym wynalazku i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych podane są w załączonych przykładach i w FR-A1-2751224, a zwłaszcza w przykładach 14 i 17 i na fig. 14 do 17.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko PRRSV jest formułowana z DMRIE-DOPE, i złożona jest z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1009, przykład 9.1.1, pLF1015 przykład 10.1.1) kodującego antygen ORF3 PRRSV, drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1012, przykład 9.2.2, pLF 1018 przykład 10.2.2) kodującego antygen ORF5 PRRSV zoptymalizowany przez zastąpienie sekwencji sygnałowej ORF5 przez sekwencję ludzkiego peptydu sygnałowego ludzkiego tPA i przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową i przyległa część C-końcową i trzeciego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1014, przykład 9.3.2, pLF106 przykład 10.3.2) kodującego antygen ORF6 PRRSV zoptymalizowany przez podstawienie fragmentu sekwencji sygnałowej ORF6 przez sekwencje peptydu sygnałowego ludzkiego tPA i przez delecję sekwencji nukleotydów kodującej domenę transbłonową i przylegającą część C-końcową.
Korzystnie może być zrobiona mieszanina plazmidów. Mieszanina może zawierać przynajmniej dwa plazmidy ekspresyjne, z których każdy wyraża inny immunogen (ORF3, ORF5 lub ORF6) i/lub pochodzi z innego szczepu PRRSV (na przykład, szczep europejski, na przykład, Lelystad, szczep amerykański ATCC VR-2332). W szczególności możliwa jest mieszanina zrobiona z sześciu plazmidów i wyrażająca ORF3 PRRSV Lelystad, ORF5 PRRSV Lelystad, ORF6 PRRSV Lelystad, ORF3 PRRSV VR-2332, ORF5 PRRSV VR-2332, i ORF6 PRRSV VR-2332.
Rozwiązania opisane w wynalazku umożliwiają również wytworzenie ulepszonej szczepionki DNA zdolnej do wywołania skutecznej i ochronnej odpowiedzi odpornościowej u świni przeciwko wirusowi świńskiej grypy (SIV).
Wirus SIV jest wirusem grypy z grupy A, członkiem rodziny Orthomyxoviridae (Murphy B.R. i Webster R.G., Virology, drugie wydanie, redagowane przez B. N. Fields, D. M. Knipe i wsp., Raven Press Ltd. Nowy Jork 1990).
Sekwencje nukleotydów kodujących białka hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) szczepu SIV H1N1 i H3N2 są znane i dostępne w bazie danych GenBank pod numerem dostępu K00992, U86145, U07146, AF153238.
Szczepionka DNA przeciwko SIV jest korzystnie formułowana z adiuwantem w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Taka formulacja może być dowolnie łączona z dodatkiem GM-CSF świni, lub z optymalizowanym przynajmniej jednym antygenem SIV, lub z dodatkiem GM-CSF świni i optymalizacją przynajmniej jednego antygenu SIV.
Dodanie GM-CSF świni można przeprowadzić tak jak opisano dla PRV. Optymalizację antygenów pochodzących z SIV przeprowadza się przez substytucję przez sekwencję „sygnałową” w szczególności sygnałową tPA sekwencji sygnałowej hemaglutyniny pochodzenia ludzkiego (HA) SIV i/lub
PL 209 304 B1 białka neuraminidazy (NA) SIV i/lub przez delecję fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową HA i/lub NA, i/lub przez wstawienie intronu, w szczególności intronu II genu beta globiny królika powyżej sekwencji nukleotydów kodującej HA i/lub NA. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę transbłonową jednego z tych białek towarzyszy korzystnie delecja przyległej części C-końcowej. Szczepionka DNA przeciwko SIV może, więc kodować i wyrażać pojedynczy zoptymalizowany antygen SIV (HA lub NA) lub oba (HA i NA).
Sekwencje nukleotydów kodujące antygeny SIV do zastosowania i różne konstrukcje wektorów ekspresyjnych są podane w załączonych przykładach i w FR-A 1-2751224, a zwłaszcza w przykładach 10 i 11 i na fig. 7 i 9 dla SIV szczepu H1N1, oraz w przykładach 12 i 13 i na fig. 11 i 13 dla SIV szczepu H3N2.
Korzystnie szczepionka DNA przeciwko SIV jest formułowana z DMRIE-DOPE i jest złożona z plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1002, przykład 11.1.2, pLF106 przykład 12.1.2) kodującego antygen HA SIV zoptymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA zamiast sekwencji sygnałowej HA, przez delecję sekwencji fragmentu nukleotydów HA kodującego domenę transbłonową i przyległą część C-końcową, i przez wstawienie intronu II genu beta-globiny królika powyżej HA i drugiego plazmidu ekspresyjnego (na przykład, pLF1004, przykład 11.2.2, pLF1008, przykład 12.2.2) kodującego antygen NA SIV zoptymalizowany przez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego peptydu sygnałowego tPA na miejsce sekwencji sygnałowej NA i przez delecję fragmentu sekwencji nukleotydów kodującego domenę transbłonową NA i przyległą część C-końcową i przez wstawienie intronu II genu beta-globiny królika powyż ej NA.
Korzystnie może być wytworzona mieszanina plazmidów. Mieszanina może zawierać przynajmniej dwa plazmidy ekspresyjne, z których każdy wyraża inny immunogen (HA lub NA) i/lub pochodzi z innego szczepu SIV (na przykład, H1N1 lub H3N2). W szczególności może to być mieszanina zrobiona z czterech plazmidów wyrażająca HA SIV H1N1, NA SIV H1N1, HA SIV H3N2, NA SIV H3N2.
Choć wynalazek jest opisany w odniesieniu do konkretnych szczepionek DNA, wynalazek a w szczególności stosowanie adiuwantów opisanych w wynalazku także stosuje się do szczepionek DNA skierowanych przeciwko innym patogenom tych gatunków zwierząt.
W tym samym zamyś le opisane szczepionki mogą być dla okreś lonego gatunku zwierzę cia kombinowane między sobą i/lub ze szczepionkami DNA skierowanymi przeciwko innym patogenom tego samego gatunku.
Te inne patogeny mogą być w szczególności wirusem wścieklizny, zarazy świń i parwowirusami świni.
Preparat immunogenny lub ulepszona szczepionka DNA przeciwko wirusowi wścieklizny zawiera w szczególności plazmid kodujący niemodyfikowaną glikoproteinę G wirusa wścieklizny i DMRIE-DOPE i dowolnie dodatek GM-CSF.
Preparat immunogenny lub ulepszona szczepionka DNA przeciwko parwowirusowi świni będzie zawierać w szczególności plazmid kodujący antygen pochodzący z parwowirusa świni (na przykład, białko VP2, przykład 18 i fig. 18 opisu FR-A1-2751224) i DMRIE-DOPE i dowolnie dodatek GM-CSF świni (na przykład, pLF1033, przykład 14).
Preparat immunogenny lub ulepszona szczepionka DNA według wynalazku przeciwko wirusowi świńskiej cholery (HCV) zawiera w szczególności plazmid kodujący antygen pochodzący z HCV (na przykład, białko El, przykład 19 i fig. 19 lub białka E2 przykład 20 i figura 20 tego samego dokumentu) i DMRIE-DOPE i dowolnie dodatek GM-CSF ś wini (na przykł ad, pLF1033, przykł ad 14).
Tak więc możliwe są też ulepszone multiwalentne szczepionki DNA pozwalające na uzyskanie skutecznej ochrony u bydła przeciwko przynajmniej dwóm patogenom bydła wybranym z grupy złożonej z: BHV-1, BRSV, BVDV bPI-3 i wścieklizny.
Możliwe są też ulepszone multiwalentne szczepionki DNA pozwalające na uzyskanie skutecznej ochrony u świni przeciwko przynajmniej dwóm patogenom świni wybranym z grupy złożonej z: wirusa PRV, PRRSV, SIV, wirusa świńskiej holery (Hog Cholera Virus lub HCV) i parwowirusów świni.
Multiwalentne szczepionki DNA mogą być ulepszone przez ich formułowanie z adiuwantem, w szczególności DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE. Formulacja może też być fakultatywnie łączona z dodatkiem GM-CSF jak to był o poprzednio opisane lub z optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu jak to uprzednio opisano, a w końcu z dodaniem GM-CSF i optymalizacją przynajmniej jednego interesującego antygenu.
PL 209 304 B1
Ulepszone multiwalentne szczepionki DNA złożone są z jednego lub więcej plazmidów ekspresyjnych tak, że te szczepionki prowadzą do ekspresji in vivo przynajmniej jednego immunogenu pierwszego patogenu i przynajmniej jednego immunogenu przynajmniej innego patogenu zakażającego ten sam gatunek zwierzęcia. Przynajmniej jeden z tych immunogenów może być korzystnie wybrany wśród członków następującej grupy:
- F BRSV, G BRSV, gB BHV-1, gC BHV-1, gD BHV-1, EO BVDV-1, E2 BV-DV-1, EO BVDV-2, E2 BVDV-2, F bPI-3 i FIN bPI-3 dla bydła, oraz
- gB PRV, gC PRV, gD PRV, ORF3 PRRSV szczep Lelystad, ORF5 PRRSV szczep Lelystad, ORF6 PRRSV szczep Lelystad, ORF3 PRRSV szczep VR-2332, ORF5 PRRSV szczep VR-2332, ORF6 PRRSV szczep VR-2332, HA SIV szczep H1N1, NA SIV szczep H1N1, HA SIV szczep H3N2, NA SIV szczep H3N2 dla świń.
Ulepszone szczepionki DNA monowalentne lub multiwalentne mogą być także połączone z przynajmniej jedną szczepionką klasyczną (nieaktywną, żywą atenuowaną, podjednostkową) lub szczepionką rekombinowaną stosując wektor ekspresyjny in vivo (na przykład, wirus krowianki, adenowirus, wirus opryszczki) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi w szczególności innemu zakażającemu ten sam gatunek lub być stosowane, jako dawki przypominające dla takich szczepionek.
Specjalista może odnieść się do FR-A1-2751229 dla metod konstrukcji plazmidów zawierających takie walencje bydlęce, i do FR-A1-2751224 dla walencji dla świń.
Opisane rozwiązania umożliwiają również prowadzenie sposobu szczepienia zwierząt gospodarczych w szczególności bydła lub świń. Taki sposób szczepienia obejmuje podanie jednej z tych ulepszonych szczepionek DNA monowalentnych lub multiwalentnych takich jak opisano uprzednio.
Taki sposób szczepienia obejmuje podanie jednej lub więcej dawek ulepszonej szczepionki DNA.
Ilość DNA stosowana w tych szczepionkach według wynalazku jest zawarta między około 10 μg i około 1000 μg a korzystnie między około 50 μg a około 500 μg dla danego plazmidu. Specjalista z tej dziedziny posiada potrzebną wiedzę, aby dokładnie określić skuteczna dawkę DNA do stosowania w każdym protokole szczepienia.
Objętości dawki korzystnie mogą wynosić między 0,2 i 5 ml, a korzystniej między 1 i 3 ml.
Ulepszone szczepionki DNA według wynalazku mogą być podawane w ramach opisanego sposobu szczepienia przez różne drogi podawania, proponowane w uprzednim stanie wiedzy dla szczepień polinukleotydowych i za pomocą znanych technik szczepienia.
Według dwóch korzystnych sposobów opisanych w wynalazku, takie sposoby i szczepienia obejmują podanie na drodze domięśniowej lub na drodze podskórnej ulepszonych szczepionek DNA według wynalazku.
Wynalazek będzie niżej opisany za pomocą sposobów jego wykonania przedstawionych, jako nieograniczające przykłady, które odnoszą się do załączonych rysunków, na których fig. 1 przedstawia Plazmid pVR1012, a fig. 2 przedstawia Plazmid pAB110.
Lista sekwencji:
SEQ ID NO 1: oligonukleotyd PB326
SEQ ID NO 2: oligonukleotyd PB329
SEQ ID NO 3: oligonukleotyd SB090
SEQ ID NO 4: oligonukleotyd SB091
SEQ ID NO 5: oligonukleotyd LF001
SEQ ID NO 6: oligonukleotyd LF002
SEQ ID NO 7: oligonukleotyd PB234
SEQ ID NO 8: oligonukleotyd PB235
SEQ ID NO 9: oligonukleotyd PB511
SEQ ID NO 10: oligonukleotyd PB512
SEQ ID NO 11: oligonukleotyd SB221
SEQ ID NO 12: oligonukleotyd SB222
SEQ ID NO 13: oligonukleotyd PB507
SEQ ID NO 14: oligonukleotyd PB508
SEQ ID NO 15: oligonukleotyd PB513
SEQ ID NO 16: oligonukleotyd PB514
PL 209 304 B1
SEQ ID NO 17: o SEQ ID NO 18: o SEQ ID NO 19: o SEQ ID NO 20: o SEQ ID NO 21: o SEQ ID NO 22: o SEQ ID NO 23: o SEQ ID NO 24: o SEQ ID NO 25: o SEQ ID NO 26: o SEQ ID NO 27: o SEQ ID NO 28: o SEQ ID NO 29: o SEQ ID NO 30: o SEQ ID NO 31: o SEQ ID NO 32: o SEQ ID NO 33: o SEQ ID NO 34: o SEQ ID NO 35: o SEQ ID NO 36: o SEQ ID NO 37: o SEQ ID NO 38: o SEQ ID NO 39: o SEQ ID NO 40: o SEQ ID NO 41: o SEQ ID NO 42: o SEQ ID NO 43: o SEQ ID NO 44: o SEQ ID NO 45: o SEQ ID NO 46: o SEQ ID NO 47: o SEQ ID NO 48: o SEQ ID NO 49: o SEQ ID NO 50: o SEQ ID NO 51: o SEQ ID NO 52: o SEQ ID NO 53: o SEQ ID NO 54: o SEQ ID NO 55: o SEQ ID NO 56: o SEQ ID NO 57: o SEQ ID NO 58: o SEQ ID NO 59: o SEQ ID NO 60: o SEQ ID NO 61: o SEQ ID NO 62: o SEQ ID NO 63: o SEQ ID NO 64: o SEQ ID NO 65: o SEQ ID NO 66: o SEQ ID NO 67: o SEQ ID NO 68: o SEQ ID NO 69: o SEQ ID NO 70: o SEQ ID NO 71: o SEQ ID NO 72: o igonukleotyd SB223 igonukleotyd SB224 igonukleotyd PB497 igonukleotyd PB498 igonukleotyd SB225 igonukleotyd SB226 igonukleotyd SB210 igonukleotyd SB211 igonukleotyd SB212 igonukleotyd SB220 igonukleotyd SB213 igonukleotyd SB214 igonukleotyd SB215 igonukleotyd SB216 igonukleotyd LF050 igonukleotyd LF051 igonukleotyd LF052 igonukleotyd LF053 igonukleotyd LF039 igonukleotyd LF040 igonukleotyd LF041 igonukleotyd LF042 igonukleotyd LF043 igonukleotyd LF044 igonukleotyd LF045 igonukleotyd LF046 igonukleotyd LF064 igonukleotyd LF065 igonukleotyd LF066 igonukleotyd LF067 igonukleotyd LF047 igonukleotyd LF048 igonukleotyd LF058 igonukleotyd LF059 igonukleotyd LF060 igonukleotyd LF061 igonukleotyd LF062 igonukleotyd LF063 igonukleotyd SB201 igonukleotyd SB202 igonukleotyd SB203 igonukleotyd SB217 igonukleotyd SB204 igonukleotyd SB205 igonukleotyd SB206 igonukleotyd SB218 igonukleotyd SB207 igonukleotyd SB208 igonukleotyd SB209 igonukleotyd SB219 igonukleotyd LF027 igonukleotyd LF028 igonukleotyd LF019 igonukleotyd LF020 igonukleotyd LF021 igonukleotyd LF022
PL 209 304 B1
SEQ ID NO 73: oligonukleotyd LF023 SEQ ID .NO 74: oligonukleotyd LF024 SEQ ID NO 75: oligonukleotyd LF025 SEQ ID NO 76: oligonukleotyd LF026 SEQ ID NO 77: oligonukleotyd LF037 SEQ ID NO 78: oligonukleotyd LF038 SEQ ID NO 79: oligonukleotyd LF029 SEQ ID NO 80: oligonukleotyd LF030 SEQ ID NO 81: oligonukleotyd LF031 SEQ ID NO 82: oligonukleotyd LF032 SEQ ID NO 83: oligonukleotyd LF033 SEQ ID NO 84: oligonukleotyd LF034 SEQ ID NO 85: oligonukleotyd LF035 SEQ ID NO 86: oligonukleotyd LF036 SEQ ID NO 87: oligonukleotyd LF003 SEQ ID NO 88: oligonukleotyd LF004 SEQ ID NO 89: oligonukleotyd LF005 SEQ ID NO 90: oligonukleotyd LF006 SEQ ID NO 91: oligonukleotyd LF007 SEQ ID NO 92: oligonukleotyd LF008 SEQ ID NO 93: oligonukleotyd LF009 SEQ ID NO 94: oligonukleotyd LF010 SEQ ID NO 95: oligonukleotyd LF011 SEQ ID NO 96: oligonukleotyd LF012 SEQ ID NO 97: oligonukleotyd LF013 SEQ ID NO 98: oligonukleotyd LF014 SEQ ID NO 99: oligonukleotyd LF015 SEQ ID NO 100: oligonukleotyd LF016 SEQ ID NO 101: oligonukleotyd LF017 SEQ ID NO 102: oligonukleotyd LF018 SEQ ID NO 103: oligonukleotyd LF054 SEQ ID NO 104: oligonukleotyd LF055 SEQ ID NO 105: oligonukleotyd LF056 SEQ ID NO 106: oligonukleotyd LF057
P r z y k ł a d y
Dla każdego z rozważanych patogenów każdy gen kodujący główne antygeny (w formie natywnej i formie zmodyfikowanej) był celem dla uzyskania odpowiedniego konstruktu w eukariotycznym plazmidzie ekspresyjnym. Formy wydzielane antygenów powierzchniowych uzyskano przez delecję fragmentów genów kodujących domeny transbłonowe i cytoplazmatyczne. We wszystkich przypadkach domeny transbłonowe glikoprotein zidentyfikowano na podstawie profili hydropatii (na MacVector 6,5) odpowiednich sekwencji białek.
P r z y k ł a d 1: Metody biologii molekularnej
1.1 Ekstrakcja genomowego DNA wirusa
Zawiesiny wirusów poddano działaniu proteinazy K (końcowe 100 mg/ml) w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) (końcowe 0,5%) podczas 2 godzin w 37°C. DNA wirusowy następnie wyekstrahowano za pomocą mieszaniny fenol/chloroform, a następnie strącono dwiema objętościami absolutnego etanolu w -20°C przez 16 godzin a następnie wirowano przy 10000 g przez 15 minut przy 4°C. Osady DNA wysuszono, a następnie zawieszono w minimalnej objętości ultraczystej sterylnej wody.
1.2 Izolacja genomowego RN A wirusa
RN A genom owy każdego wirusa ekstrahowano stosując technikę „rodanek guanidyny/fenolchloroform”, którą opisali P. Chomczynski i N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162, 156-159).
1.3 Techniki biologii molekularnej
Wszystkie konstrukcje plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej opisane przez Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne
PL 209 304 B1 stosowane do tego wynalazku wyizolowano za pomocą zestawu „Geneclean” (BIOT 01 Inc., La Jolla, CA). Dla tych wszystkich konstrukcji, sklonowane fragmenty DNA jak i styki z wektorami ekspresyjnymi sekwencjonowano metodą Sangera (Sambrook i wsp., 1989).
1.4 PCR i RT-PCR
Zsyntetyzowano oligonukleotydy specyficzne dla genów oraz sklonowano fragmenty genów, niektóre z nich zawierają w pewnych przypadkach na swoich końcach 5' miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie zamplifikowanych fragmentów. Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując standardowe techniki (Sambrook i wsp., 1989).
1.5 Oczyszczanie plazmidów na dużą skalę
Wytwarzanie na skalę dziesiątków mg oczyszczonych plazmidów wchodzących w kompozycje szczepionek przeprowadzono wykorzystując metodę z gradientem chlorku cezu - bromku etydyny (Sambrook i wsp., 1989).
P r z y k ł a d 2: Podstawowe konstrukcje plazmidów
Eukariotyczny plazmid ekspresyjny pVR1020 (C. J. Lukę i wsp., J. of Infectious Diseases 1997, 175, 95-97) pochodna plazmidu pVR1012 (fig. nr 1. fig. 1 i przykład 7 publikacji WO-A-9803199), zawiera ramkę kodującą sekwencję sygnałową ludzkiego aktywatora tkankowego plazminogenu (tPA).
Plazmid pVR1020 został zmodyfikowany przez trawienie BamHI-Bgllli wstawienie sekwencji kodującej kilka miejsc dla klonowania (BamHI, Notl, Eco-RI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) będącej wynikiem parowania następujących oligonukleotydów:
PB326 (40 mer) (SEQ ID NO 1)
5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' i
PB329 (40 mer) (SEQ ID NO 2)
5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'.
Uzyskany wektor o wielkości około 5105 par zasad (lub bp) nazwano pAB110 (fig. 2).
Intron II genu (3-globiny królika sklonowano w wektorze pCRII (Invitro-gen, Carlsbad, CA, USA) po wytworzeniu fragmentu DNA uzyskanego w reakcji PCR przy pomocy następujących oligonukleotydów:
SB090 (20 mer) (SEQ ID NO 3)
5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' i
SB091 (21 mer) (SEQ ID NO 4)
5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' stosując, jako matrycę genomowy DNA z komórek krwi obwodowej królika. Powstały plazmid określono, jako pNS050.
Plazmid ekspresyjny pAB110 zmodyfikowano przez wprowadzenie sekwencji intronu II genu globiny królika w miejscu Sali położonym powyżej ATG peptydu sygnałowego aktywatora plazminogenu tkankowego (tPA). Sekwencja intronu genu globiny królika była poddana amplifikacji za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy ( PCR) wychodząc z plazmidu pNS050 i stosując następującą parę nukleotydów:
LF001 (30 mer) (SEQ ID NO 5)
5' CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3' i
LF002 (30 mer) (SEQ ID NO 6)
5' CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3'
Ten produkt PCR (573 par zasad) strawiono Sali i wklonowano do plazmidu pAB110 uprzednio linearyzowanego Sali, aby uzyskać plazmid pLF999 wielkości około 5678 bp.
P r z y k ł a d 3. Plazmidy kodujące różne postacie antygenów wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1)
Fragmenty DNA wirusa zawierające geny gB, gC i gD szczepu B901 BHV-1 wyizolowano trawiąc genom wirusa różnymi enzymami restrykcyjnymi, rozdzielono w żelu agarozowym i analizowano techniką Southerna za pomocą sond odpowiadającym fragmentom genów gB, gC i gD szczepu ST BHV-1 (Leung-Tacl P. i wsp., Virology, 1994, 199, 409-421). Może być również stosowany szczep BHV-1 Colorado (Cooper) (ATCC numer VR-864). Tak zidentyfikowane fragmenty klonowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) i były one podstawą do klonowania trzech genów w wektorze ekspresyjnym pVR1012.
3.1 Plazmidy kodujące różne formy BHV-1 gB
3.1.1. pPB280: gen gB (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
PL 209 304 B1
Dwa fragmenty XhoI-XhoI zawierające części 5' i 3' genu gB BHV-1 zidentyfikowano za pomocą techniki Southerna i sklonowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) uprzednio strawionym XhoI. Tak uzyskane plazmidy zostały określone, jako pPB128 i pPB117, odpowiednio.
Plazmid pPB128 zawierający fragment 5' genu gB strawiono Notl i XhoI generując fragment 1708 bp (fragment A).
Plazmid pPB117 zawierający część 3' genu gB strawiono XhoI i Stul generując fragment 1345 bp. Ten ostatni fragment sklonowano w wektorze pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) uprzednio strawionym EcoRV i XhoI. Tak uzyskany plazmid nazwano pPB279. Plazmid pPB279 następnie strawiono XhoI i BamHI generując fragment DNA 1413 bp (fragment B).
Fragmenty A i B następnie sklonowano w wektorze pBluescript KS+ strawionym Notl i BamHI i otrzymano plazmid pPB276 (okoł o 6063 bp), co pozwolił o na rekonstrukcję genu gB BHV-1.
Wektor pPB278 posłużył następnie, jako matryca do reakcji PCR przeprowadzonych z następującymi oligonukleotydami:
PB234 (30 mer) (SEQ ID NO 7)
5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3' i
PB235 (21 mer) (SEQ ID NO 8)
5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3'.
Produkt PCR (146 bp) następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Sali i Nhel.
Plazmid pPB278 strawiono Nhel i BamHI. Tak uzyskany fragment 2728 bp i fragment PCR uzyskany uprzednio ligowano z wektorem pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Sali i BamHI, generując w ten sposób plazmid pPB280 o wielkości około 7742 bp.
Gen gB BHV-1 koduje białko z 933 aminokwasów.
3.1.2. pPB281: gen gB (forma Δ^Μ-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą (pozbawioną domeny transbłonowej (TM) i C-końcowej (Cter)) genu gB BHV-1 uzyskano przez ligację z plazmidem pVR1012 (przykład 2) strawionym Sali i BamHI równocześnie obu fragmentów o wielkości 2234 bp uzyskanych po strawieniu SalI-PvuII plazmidu pPB280 (przykład 3.1.1) i fragmentu 56 bp uzyskanego przez połączenie następujących oligonukleotydów:
PB511 (52 mer) (SEQ ID NO 9)
5' CTGC ACGAGCTCCGGTTCTACGAC ATTGACCGCGTGGTC AAGACGGA CTGAG3' i
PB512 (57 mer) (SEQ ID NO 10)
5'GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAG CTCGTGCAG 3'.
Powstały plazmid ma wielkość około 7154 bp i został nazwany pPB281. G Skrócony gen gB z BHV-1 koduje białko z 759 aminokwasów.
3.1.3 pSB115: gen gB (forma tPA Δ^Μ-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ^Μ-Cter] genu gB BHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pPB281 (przykład 3.1.2) i wykorzystując następujące startery:
SB221 (39 mer) (SEQ ID NO 11)
5' AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3' i
SB222 (33 mer) (SEQ ID NO 12)
5' GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3'.
Produkt amplifikacji (2088 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym przez EcoRV i Bglll generując plazmid pSB115 o wielkości około 7154 bp.
Forma tPA Δ[TM-Cter] genu gB koduje glikoproteinę złożoną z 729 aminokwasów, zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gB BHV-1.
3.2 Plazmidy kodujące różne formy gC BHV-1
3.2.1. pPB264: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 Fragment BamHI-HindlH o wielkości 3,5 kb zawierający całkowity gen gC BHV-1 zidentyfikowano za pomocą techniki Southerna i sklonowano w wektorze pBluescript SK+. Tak uzyskany plazmid nazwano pPB287.
Plazmid pPB287 następnie strawiono Ncol-BssSI. Uzyskano fragment o wielkości 1492 bp. Zligowano go z syntetycznym fragmentem DNA uzyskanym przez połączenie następujących nukleotydów:
PB507 (37 mer) (SEQ ID NO 13)
5' TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3' i
PB508 (37 mer) (SEQ ID NO 14)
5' CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3',
PL 209 304 B1 w plazmidzie pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA, USA) uprzednio strawionym Ncol i Xbal generując w ten sposób plazmid pośredni pPB290.
Fragment 1554 bp pochodzący z trawienia pPB290 przez Pstl i Xbal sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Pstl i Xbal generując w ten sposób plazmid pPB264 o wielkości około 6427 bp. Gen gC BHV-1 koduje białko złożone z 508 aminokwasów.
3.2.2. pPB292: gen gC (forma Δ^Μ-Cter] sklonowany w wektorze pVR1012 Formę skróconą genu gC BHV-1 uzyskano przez ligację trzech następujących fragmentów DNA w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Pstl i Xbal:
(a) fragment 1035 bp pochodzący z trawienia pPB264 (przykład 3.2.1) Pstl i Xho-I, (b) fragment 350 bp pochodzący z trawienia pPB264 XhoI i Bani, oraz (c) fragment syntetyczny 43 bp pochodzący z połączenia oligonukleotydów PB513 iPB514.
Te nukleotydy są następujące:
PB513 (43 mer) (SEQ ID NO 15)
5' GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3' i
PB514 (43 mer) (SEQ ID NO 16)
5' CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3'.
Tak uzyskany plazmid o wielkości około 6305 bp nazwano pB292. Skrócony gen gC z BHV-1 koduje białko z 466 aminokwasów.
3.2.3 pSB116: gen gC (forma tPA Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA A[TM-Cter] genu gC BHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pPB292 (przykład 3.2.2) i następujących starterów:
SB223 (39 mer) (SEQ ID NO 17)
5' AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3' i
SB224 (32 mer) (SEQ ID NO 18)
5' GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3'.
Produkt amplifikacji (1362 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym przez EcoRV i Bglll generując w ten sposób plazmid pSB116 o wielkości około 6404 bp.
Forma tPA Δ[TM-Cter] genu gC koduje glikoproteinę złożoną z 479 aminokwasów, zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gC BHV-1.
3.3 Plazmidy kodujące różne formy gD BHV-1
3.3.1 pPB148: gen gD (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 Fragment XhoI-XhoI o wielkości 5 kb zawierający całkowity gen gD BHV-1 zidentyfikowano za pomocą techniki Southerna i sklonowano w wektorze pBluescript SK+ uprzednio strawionym XhoI generując plazmid pPB147.
Fragment 325 bp pochodzący z trawienia pPB147 Ndel i BsrBI i fragment 943 bp pochodzący z trawienia pPB147 Ndel i Styl następnie zligowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Xbal w ten sposób generując plazmid pPB148 o wielkości około 6171 bp. Gen gD BHV-1 koduje białko złożone z 417 aminokwasów.
3.3.2 pPB284: gen gD (forma Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu gD BHV-1 uzyskano z fragmentu uzyskanego po amplifikacji PCR przeprowadzonej na DNA genomowym szczepu B901 wirusa BHV-1 uprzednio strawionego Pstl i Xbal przy pomocy pary następujących starterów:
PB497 (33 mer) (SEQ ID NO 19)
5' TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' i
PB498 (31 mer) (SEQ ID NO 20)
5' TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3'.
Ten fragment PCR następnie wklonowano w plazmid pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawiony Pstl i Xbal generując plazmid pPB284 o wielkości około 5943 bp. Skrócony gen gD BHV-1 koduje białko złożone z 355 aminokwasów.
3.3.3 pSB117: gen gD (forma tPA Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ[TM-Cter] genu gD BHV-1 zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pPB284 (przykład 3.3.2) i następujących starterów:
SB225 (39 mer) (SEQ ID NO 21)
5' AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3' i
SB226 (33 mer) (SEQ ID NO 22)
5' GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3'.
PL 209 304 B1
Produkt amplifikacji (1029 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym przez EcoRV i Bglll generując plazmid pSB117 o wielkości około 6071 bp.
Forma tPA Δ^Μ-Cter] genu gD koduje glikoproteinę złożoną z 368 aminokwasów, zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gD BHV-1.
P r z y k ł a d 4: Plazmidy kodujące różne formy antygenów bydlęcego syncytialnego wirusa oddechowego (BRSV)
Geny kodujące antygeny F i G wirusa BRSV uzyskano za pomocą RT PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu Snook (Thomas i wsp., Research in Vet. Science. 1982, 33, 170-182). Szczep BRSV A 51908 (ATCC numer VR-794) może być również zastosowany.
4.1 Plazmidy kodujące różne formy BRSV-F
4.1.1 pSB107: gen F (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Gen F szczepu Snook BRSV zamplifikowano za pomocą RT-PCR stosując RNA wirusa, jako matrycę i wykorzystując następujące starterów:
SB210 (34 mer) (SEQ ID NO 23)
5' AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3' i
SB211 (35 mer) (SEQ ID NO 24)
5' TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3'.
Produkt amplifikacji o wielkości 1739 bp strawiono enzymami Pstl i BamHI i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Pstl i BamHI w ten sposób generując plazmid pSB107 o wielkości około 6583 bp.
Gen F wirusa BRSV koduje białko zbudowane z 574 aminokwasów.
4.1.2 gen F (forma Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu F szczepu Snook BRSV zamplifikowano za pomocą RT-PCR stosując RNA wirusa, jako matrycę za pomocą następujących starterów:
SB210(SEQ ID NO 23) i
SB212 (39 mer) (SEQ ID NO 25)
5' AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3'.
Produkt amplifikacji (1581 bp) strawiono enzymami Pstl i BamHI i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Pstl i BamHI, generując tym plazmid pSB108 o wielkości około 6430 bp.
Forma skrócona genu F koduje glikoproteinę złożoną z 523 aminokwasów zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny F BRSV.
4.1.3 pSB114 gen F (forma tPA Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ[TM-Cter] genu F szczepu Snook BRSV zamplifikowano za pomocą RT-PCR stosując RNA wirusa, jako matrycę za pomocą następujących starterów:
SB212(SEQ ID NO 25) i
SB220 (38 mer) (SEQ ID NO 26)
5' AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATTTTATCAATC 3'.
Produkt amplifikacji (1516 bp) strawiono enzymami Pmll i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym Pmll i Bglll, i otrzymano plazmid pSB114 o wielkości około 6572 bp.
Forma tPA Δ[TM-Cter] genu F koduje glikoproteinę zbudowaną z 535 aminokwasów zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny F BRSV.
4.2 Plazmidy kodujące różne formy BRSV-G
W przypadku białka G BRSV (glikoproteina typu II) sekwencja sygnałowa i sekwencja transbłonową są trudne do odróżnienia, co czyni koniecznym dodanie sekwencji sygnałowej powyżej sekwencji odpowiadającej domenie zewnątrzkomórkowej podczas delecji domeny transbłonowej.
Plazmid pAB110 (przykład 2) stosowano do konstrukcji plazmidów zawierających formę skróconą genu kodującego białko G BRSV.
4.2.1 pSB109: gen G (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Gen G szczepu Snook BRSV zamplifikowano za pomocą RT-PCR stosując RNA wirusa, jako matrycę i następujące startery:
SB213 (32 mer) (SEQ ID NO 27)
5' ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC 3' i
SB214 (38 mer) (SEQ ID NO 28)
5' TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3'.
PL 209 304 B1
Produkt amplifikacji (784 bp) strawiono enzymami Sali i Xbal i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym Sall i Xbal w ten sposób generując plazmid pSB109 o wielkości około 5661 bp.
Gen G wirusa BRSV koduje białko zbudowane z 257 aminokwasów.
4.2.2 pSB110: gen G (forma tPA Δ[TM-Cter] sklonowany w wektorze pAB110
Formę skróconą genu G szczepu Snook BRSV zamplifikowano za pomocą RT-PCR stosując, RNA wirusa, jako matrycę za pomocą następujących starterów:
SB215 (33 mer) (SEQ ID NO 29)
5' TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC 3' i
SB216 (33 mer) (SEQ ID NO 30)
5' TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3'.
Produkt amplifikacji (666 bp) strawiono enzymami BamHI i Xbal i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym BamHI i Xbal, i otrzymano plazmid pSB110 o wielkości około 5660 bp.
Forma tPA ΔΠ^^ή genu G wirusa BRSV koduje glikoproteinę złożoną z 218 aminokwasów zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny G, ale poprzedzoną sekwencją sygnałowa tkankowego aktywatora plazminogenu.
P r z y k ł a d 5: Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusów wirusowej biegunki bydła typu I (BVDV-1)
Geny kodujące antygeny E0 (glikoproteina 48 kDa lub gp48) i E2 (gp53) wirusa BVDV typu 1 uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu Osloss (L. De Moerlooze i wsp., J. Gen. Virol. 1993, 74, 1433-1438; A. Renard i wsp., DNA, 1985, 4, 439-438; A. Renard i wsp., Ann. Rech. Vet, 1987, 18, 121-125). Szczepy NADL (ATCC VR-534) lub New York (ATCC VR-524) mogą być również zastosowane.
5.1 Plazmidy kodujące różne formy E0 szczepu BVDV typu 1 Osloss
5.1.1 pLF1028: gen EO (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
DNA komplementarny (cDNA) genu E0 szczepu Osloss syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF051 i zamplifikowano za pomocą reakcji PCR stosując następującą parę oligonukleotydów:
LF050 (36 mer) (SEQ ID NO 31)
5' CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' i
LF051 (40 mer) (SEQ ID NO 32)
5' CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3'.
Fragment DNA o wielkości około 765 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR za pomocą Sali i BamHI ligowano z fragmentem 4866 bp pochodzącym z trawienia pVR1012 (przykład 2) za pomocą Sali i BamHI, aby wygenerować plazmid pLF1028 (około 5636 bp). Gen EO BVDV-1 szczepu Osloss koduje białko o 252 aminokwasach.
Kodon ATG wprowadzano do sekwencji oligonukleotydu LF050 aby pozwolić na inicjację translacji odpowiedniego zrekombinowanego polipeptydu E0.
5.1.2 pLF1029; gen E0, forma ((3-globina tPA-E0) sklonowany w wektorze pLF999
Gen E0 syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1028 (przykład 5.1.1.) za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF052 (39 mer) (SEQ ID NO 33)
5' CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' i
LF053 (40 mer) (SEQ ID NO 34)
5' CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3'.
Fragment DNA o wielkości około 770 bp uzyskany przez strawienie produktu PCR Notl i Bglll zligowano z fragmentem 5642 bp wynikającym z trawienia pLF999 (przykład 2) za pomocą Notl i Bglll dając plazmid pLF1029 (około 6417 bp).
Tak zmodyfikowany gen E0 szczepu Osloss BVDV-1 (β-globina tPA-E0) koduje białko o 283 aminokwasach.
5.2 Plazmidy kodujące różne formy E2 szczepu BVDV typu 1 Osloss
5.2.1 pLF1020: gen E2 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu E2 szczepu Osloss syntetyzowano na podstawie odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF040 i zamplifikowano za pomocą reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
PL 209 304 B1
LF039 (33 mer) (SEQ ID NO 35)
5' CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 3' i
LF040 (36 mer) (SEQ ID NO 36)
5' CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3'.
Fragment DNA 1235 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Ball i Bglll zligowano z fragmentem 4860 bp powstałym z trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Bglll, aby wygenerować plazmid pLF1020 (około 6100 bp).
Gen E2 szczepu Osloss BVDV-1 koduje białko złożone z 409 aminokwasów.
Kodon ATG został wprowadzony do sekwencji oligonukleotydu LF039, aby pozwolić na inicjację translacji odpowiedniego zrekombinowanego polipeptydu E2.
5.2.2. pLF1021: gen E2 (forma β-globina tPA [ΔΤΜ+Cter]) sklonowany w wektorze pLF999.
Gen E2 pozbawiony swoich domen transbłonowych i karboksykońcowej zsyntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1020 (przykład 5.2.1) za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF041 (36 mer) (SEQ ID NO 37)
5' CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3' i
LF042 (35 mer) (SEQ ID NO 38)
5' CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3'.
Fragment DNA 1132 bp uzyskano przez trawienie produktu PCR Notl i Bglll i zligowano z fragmentem 5642 bp powstałym w wyniku trawienia pLF999 (przykład 2) Notl i Bglll, aby wygenerować plazmid pLF1021 (około 6779 bp).
Gen E2 BVDV-1 szczepu Osloss tak zmodyfikowany (β-globina tPA [ΔΤΜ+Cter]) koduje białko o 404 aminokwasach.
P r z y k ł a d 6: Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa wirusowej biegunki bydła typu 2 (BVDV-2)
Geny kodujące antygen E2 (gp53) wirusa BVDV typu 2 uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusowego szczepu 890 (J. F. Ridpath i S. R. Bolin, Virology, 1995, 212, 39-46). Szczep Q140 jest także możliwy do stosowania i może być uzyskany z Ministerstwa Rolnictwa, Rybołówstwa i Żywienia w Quebek (MAPAQ) Institut Armand-Frappier (P. Tijssen i wsp., Virology, 1996, 217, 356-361). Szczepy 1373 i 296 mogą także być stosowane (J. F. Ridpath, BVDV Research Project, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, USA).
6.1 Plazmidy kodujące różne formy E2 szczepu typu 2-890
6.1.1 pLF1022: gen E2 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu E2 szczepu 890 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF044 i amplifikowano za pomocą reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF043 (36 mer) (SEQ ID NO 39)
5' ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3' i
LF044 (39 mer) (SEQ ID NO 40)
5' ACTGTAAGATCTTTAAGTATTCACTCCAGCACCCATAGC 3'.
Fragment DNA około 1240 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Xbal i Bgll zligowano z fragmentem 4891 bp powstałym z trawienia pVR1012 (przykład 2) za pomocą, Xbal i Bglll, aby wygenerować plazmid pLF1022 (około 6136 bp).
Gen E2 BVDB-2 szczep 890 koduje białko z 410 aminokwasów.
Wprowadzono kodon ATG do sekwencji oligonukleotydu LF043, aby pozwolić na inicjację translacji odpowiedniego polipeptydu zrekombinowanego E2.
6.1.2 pLF1023: gen E2 (forma β-globina tPA-E2 ^TM+Cter]) sklonowany w wektorze pLF999
Gen E2 pozbawiony swoich domen transbłonowych i karboksykońcowej zsyntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1022 (przykład 6.2.1) za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF045 (41 mer) (SEQ ID NO 41)
5' CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3' i
LF046 (36 mer) (SEQ ID NO 42)
5' CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3'.
PL 209 304 B1
Fragment DNA około 1140 bp uzyskany za pomocą trawienia produktu PCR Notl i Bglll zligowano z fragmentem 5642 bp wynikającym z trawienia pLF999 (przykład 2) Notl i Bglll aby wygenerować plazmid pLF1023 (około 6787 bp).
Gen E2 BVDV-2 szczep 890 tak zmodyfikowany (β-globina tPA Δ[TM+Cter]) koduje białko o 405 aminokwasach.
6.2 Plazmidy kodujące różne formy E0 wirusa typu 2 - szczepu 890
6.2.1 pLF1030: gen E0 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu E0 szczepu 890 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF065 i amplifikowano za pomocą reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF064 (39 mer) (SEQ ID NO 43)
5' CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3' i
LF065 (39 mer) (SEQ ID NO 44)
5' CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3'.
Fragment DNA około 768 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Sali i BamHI zligowano z fragmentem 4866 bp powstałym z trawienia pVR1012 (przykład 2) za pomocą Sali i BamHI, aby wygenerować plazmid pLF1030 (około 5639 bp). Gen E0 BVDB-2 szczep 890 koduje białko z 253 aminokwasów.
Wprowadzono kodon ATG do sekwencji oligonukleotydu LF064, aby pozwolić na inicjację translacji odpowiedniego polipeptydu zrekombinowanego E0.
6.2.2 pLF1031: gen E0 (forma β-globina tPA-E0) sklonowany w wektorze pLF999.
Gen E0 zsyntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1030 (przykład 6.2.1) i za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF066 (42 mer) (SEQ ID NO 45)
5' CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3' i
LF067 (39 mer) (SEQ ID NO 46)
5' CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3'.
Fragment DNA około 770 bp uzyskany za pomocą trawienia produktu PCR Notl i Bglll zligowano z fragmentem 5642 bp wynikającym z trawienia pLF999 (przykład 2) Notl i Bglll, aby wygenerować plazmid pLF1031 (około 6417 bp).
Gen E0 BVDV-2 szczep 890 tak zmodyfikowany (β-globina tPA-E0) koduje białko z 283 aminokwasów.
P r z y k ł a d 7: Plazmidy kodujące różne formy antygenów bydlęcego wirusa para-grypy typu 3 (bPI-3)
Geny kodujące antygeny hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) i antygeny fuzyjne (F) wirusa bPI-3 uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu Reisinger SF-4 (dostępny w ATCC pod numerem dostępu VR-281).
7.1 Plazmidy kodujące różne formy HN szczepu bPI-3 SF-4
7.1.1 pLF1024: gen HN (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu HN szczepu SF-4 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF048 i amplifikowano za pomocą reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF047 (39 mer) (SEQ ID NO 47)
5' CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3' i
LF048 (38 mer) (SEQ ID NO 48)
5' CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT 3'.
Fragment DNA 1726 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Sali i EcoRV zligowano z fragmentem 4896 bp powstałym z trawienia pVR1012 (przykład 2) za pomocą Sali i EcoRV, aby wygenerować plazmid pLF1024 (około 6619 bp).
Gen HN bPI-3 koduje białko o 572 aminokwasach.
7.1.2 pLF1025: gen HN (forma β-globina tPA-E2 Δ[TM]) sklonowany w wektorze pLF999
Gen HN pozbawiony swojej domeny transbłonowej zsyntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1024 (przykład 7.1.1) za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF058 (33 mer) (SEQ ID NO 49)
5' CATACTGCGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT 3' i
LF059 (35 mer) (SEQ ID NO 50)
PL 209 304 B1
5' CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3'.
Fragment DNA 1566 bp uzyskany za pomocą trawienia produktu PCR Notl i EcoRV zligowano z fragmentem 5663 bp wynikającym z trawienia pLF999 (przykład 2) Notl i EcoRV, aby wygenerować plazmid pLF1025 (około 7229 bp).
Gen HN bPI-3 tak zmodyfikowany (β-globina tPA-E2 Δ[ΤΜ] koduje białko o 548 aminokwasach.
7.2 Plazmidy kodujące różne formy F szczepu bPI-3 SF-4
7.2.1 pLF1026: gen F (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu F szczepu SF-4 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF061 i amplifikowano za pomocą reakcji PCR wykorzystując pary następujących oligonukleotydów:
LF060 (36 mer) (SEQ ID NO 51)
5' CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA 3' i
LF061 (36 mer) (SEQ ID NO 52)
5' CATGACCAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA 3'.
Fragment DNA około 1628 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Sali i Bglll zligowano z fragmentem 4860 bp powstałym z trawienia pVR1012 (przykład 2) za pomocą Sali i Bglll, aby wygenerować plazmid pLF1026 (około 6488 bp).
Gen F bPI-3 koduje białko o 550 aminokwasach.
7.2.2 pLF1027: gen F (forma β-globina tPA-F Δ[TM+Cter]) sklonowany w wektorze pLF999
Gen F pozbawiony swoich domen transbłonowych i C-końcowej zsyntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1026 (przykład 7.2.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF062 (42 mer) (SEQ ID NO 53)
5' CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAACGT 3' i
LF063 (41 mer) (SEQ ID NO 54)
5' CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC 3'.
Fragment DNA 1434 bp uzyskany za pomocą trawienia produktu PCR Notl i EcoRV zligowano z fragmentem 5663 bp wynikającym z trawienia pLF999 (przykład 2) Notl i EcoRV, aby wygenerować plazmid pLF1027 (około 7097 bp).
Gen F bPI-3 tak zmodyfikowany (β-globina tPA-F Δ[TM+Cter]) koduje białko o 504 aminokwasach.
P r z y k ł a d 8: Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa pseudowścieklizny (PRV)
Geny kodujące glikoproteiny gB, gC i gD szczepu PRV uzyskano za pomocą PCR wychodząc z DNA wirusa szczepu NIA3 (M. Riviere i wsp., J. Virol. 66, 3424-3434; A. Baskerville i wsp., The Veterinary Bulletin, 1973, 43 nr 9). Mutanty szczepu NIA3 PRY mogą być także stosowane i są opisane w opisie US-A-4,680,176 i zdeponowane w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Francja pod numerem 1-351 i 1-352. 8.1 Plazmidy kodujące różne formy PRV-gB
8.1.1 pSB101: gen gB (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Gen gB szczepu NIA PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując wirusowy DNA, jako matrycę wykorzystując następujące startery:
SB201 (36 mer) (SEQ ID NO 55)
5' TTTTAAGATATCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG3' i
SB202 (39 mer) (SEQ ID NO 56)
5' TTTTAAGGATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTC 3'.
Produkt amplifikacji (2766 bp) strawiono enzymami EcoRV i BamHI i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i BamHI, generując plazmid pSB101 o wielkości około 7631 bp.
Gen gB PRV koduje glikoproteinę o 913 aminokwasach.
8.1.2 pSB102: gen gB (forma Δ[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu gB szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując wirusowy DNA, jako matrycę za pomocą następujących starterów:
SB201 (SEQ ID NO 55) i
SB203 (39 mer) (SEQ ID NO 57)
5' TTTTAAGGATCCCTAGTGGTCCACCTTGACCACGCGGTC 3'.
PL 209 304 B1
Produkt amplifikacji (2262 bp) strawiono enzymami EcoRV i BamHI oraz sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i BamHI, generując plazmid pSB102 o wielkości około 7142 bp.
Forma skrócona ^[TM-Cter]) genu gB koduje glikoproteinę o 750 aminokwasach zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gB PRV.
8.1.3 pNS009: gen gB (forma tPA Δ[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ[TM-Cter] genu gB szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pSB101 (przykład 8.1.1) wykorzystując następujące startery:
SB203 (SEQ ID NO 57) i
SB217 (39 mer) (SEQ ID NO 58)
5' AAAATTTCGATATCCACCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGG 3'.
Produkt amplifikacji (2088 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Bglll, generując plazmid pNS009 o wielkości około 7127 bp.
Forma skrócona tPA Δ[TM-Cter] genu gB koduje glikoproteinę o 720 aminokwasach zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gB PRV.
8.2 Plazmidy kodujące różne formy gC PRV
8.2.1 pSB103: gen gC (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Gen gC szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując DNA wirusa, jako matrycę wykorzystując następujące startery:
SB204 (36 mer) (SEQ ID NO 59)
5' TTTTAAGATATCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATG 3' i
SB205 (37 mer) (SEQ ID NO 60)
5' TTTTAAAGATCTTTAAGGCCCCGCCTGGCGGTAGTAG 3'.
Produkt amplifikacji (1452 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll oraz sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Bglll, generując plazmid pSB103 o wielkości około 6323 bp.
Gen gC PRV koduje glikoproteinę o 479 aminokwasach.
8.2.2 pSB104: gen gC (forma Δ[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu gC szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując DNA wirusowy jako matrycę wykorzystując następujące startery:
SB204 (SEQ ID NO 59) i
SB206 (36 mer) (SEQ ID NO 61)
5' TTTTAAAGATCTTTAGGGGGAGGCGTCGTAGCGCTG 3'.
Produkt amplifikacji (1332 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll oraz sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Bglll, generując plazmid pSB104 o wielkości około 6206 bp.
Forma skrócona ^[TM-Cter]) genu gC koduje glikoproteinę o 440 aminokwasach zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gC PRV.
8.2.3 pNS012: gen gC (forma tPA Δ[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ[TM-Cter] genu gC szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pSB103 (przykład 8.2.1) wykorzystując następujące startery:
SB206 (SEQ ID NO 61) i
SB218 (39 mer) (SEQ ID NO 62)
5' AAAATTTCGATATCCACGGCGCTCGGCACGACGCCCAAC 3'.
Produkt amplifikacji (1270 bp) strawiono enzymami EcoRV i Bglll i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Bglll, generując plazmid pNS012 o wielkości około 6311 bp.
Forma tPA Δ[TM-Cter] genu gC koduje glikoproteinę zbudowaną z 448 aminokwasów zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gC PRV.
8.3 Plazmidy kodujące różne formy gD PRV
8.3.1 pSB105: gen gD (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012
Gen gD szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując DNA wirusa, jako matrycę wykorzystując następujące startery:
SB207 (36 mer) (SEQ ID NO 63)
5' AATTTTGATATCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCG 3' i
PL 209 304 B1
SB208 (36 mer) (SEQ ID NO 64)
5' AATTTTGGATCCCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG 3'.
Produkt amplifikacji (1227 bp) strawiono enzymami EcoRV i BamHI i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i BamHI generując plazmid pSB105 o wielkości około 6104 bp.
Gen gD PRV koduje glikoproteinę o 404 aminokwasach.
8.3.2 pSB106: gen gD (forma Δ^Μ-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012
Formę skróconą genu gD szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR stosując DNA wirusowy, jako matrycę wykorzystując następujące startery:
SB207 (SEQ ID NO 63) i
SB209 (40 mer) (SEQ ID NO 65)
5' AAATTTTGGATCCCTAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGC 3'.
Produkt amplifikacji (1077 bp) strawiono enzymami EcoRV i BamHI i sklonowano w wektorze pVR1012 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i BamHI, generując plazmid pSB106 o wielkości około 5957 bp.
Forma skrócona ^[TM-Cter]) genu gD koduje glikoproteinę o 355 aminokwasach zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gD PRV.
8.3.3 pPB238: gen gD (forma tPA Δ[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110
Formę tPA Δ[TM-Cter] genu gD szczepu NIA3 PRV zamplifikowano za pomocą PCR wychodząc z matrycy pSB105 (przykład 8.3.1) wykorzystując następujące startery:
SB209 (SEQ ID NO 65) i
SB219 (39 mer) (SEQ ID NO 66)
5'AAAATTTCGATATCCACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCG 3'.
Produkt amplifikacji (1015 bp) strawiono enzymami EcoRV i BamHI i sklonowano w wektorze pAB110 (przykład 2) uprzednio strawionym EcoRV i Bglll, generując plazmid pPB238 o wielkości około 6056 bp.
Forma tPA ΔΠ^^ή genu gD koduje glikoproteinę o 363 aminokwasach zawierającą domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gD PRV.
P r z y k ł a d 9. Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego u świń (PRRSV) szczepu Lelystad
Geny kodujące białka ORF3, ORF5 i ORF6 PRRSV uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu Lelystad (J. Meulenberg i wsp., Virology, 1993, 19, 62-72; WO-A-92-21375) deponowanego 5 czerwca 1991 w Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Instytut Pasteura, Paryż, Francja, pod numerem 1-1102.
9.1 Plazmidy kodujące różne formy ORF3 szczepu Lelystad PRRSV
9.1.1 pLF1109: gen ORF3 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF3 szczepu Lelystad syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF028 i zamplifikowano w reakcji PCR z parą następujących oligonukleotydów:
LF027 (30 mer) (SEQ ID NO 67)
5' CACTACGATATCATGGCTCATCAGTGTGCA 3' i
LF028 (30 mer) (SEQ ID NO 68)
5' CACTACAGATCTTTATCGTGATGTACTGGG 3'.
Fragment DNA 802 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Bglll zligowano z fragmentem 4879 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Bglll generując plazmid pLF1009 o wielkości około 5681 bp.
Gen ORF3 PRRSV Lelystad koduje białko o 265 aminokwasach.
9.2 Plazmidy kodujące różne formy ORF5 szczepu Lelystad PRRSV
9.2.1. pLF1011: gen ORF5 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF 5 szczepu Lelystad syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF020 i zamplifikowano w reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF019 (30 mer) (SEQ ID NO 69)
5' CTCACCGTCGACATGAGATGTTCTCACAAA 3' i
LF020 (30 mer) (SEQ ID NO 70)
5' CTCACCTCTAGACTAGGCCTCCCATTGCTC 3'.
PL 209 304 B1
Fragment DNA 802 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR Sali i Xbal zligowano z fragmentem 4879 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Xbal generując plazmid pLF1012 o wielkości około 5681 bp.
Gen ORF5 PRRSV Lelystad koduje białko o 201 aminokwasach.
9.2.2 pLF1012: gen ORF5 (forma skrócona) sklonowany w wektorze pAB110
Gen ORF5 pozbawiony domeny transbłonowej i C-końcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1011 (przykład 9.2.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF021 (30 mer) (SEQ ID NO 71)
5' CACCTCGGATCCTTTGCCGATGGCAACGGC 3' i
LF022 (33 mer) (SEQ ID NO 72)
5' CACCTCGGATCCTTAGACTTCGGCTTTGCCCAA 3'.
Fragment DNA 432 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR BamHI zligowano w z fragmentem 5105 bp powstałym w wyniku trawienia pAB110 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1012 o wielkości około 5537 bp.
Tak zmodyfikowany gen ORF5 PRRSV Lelystad (tPA Δ[TM+Cter]) koduje białko o 168 aminokwasach.
9.3 Plazmidy kodujące różne formy ORF6 szczepu Lelystad PRRSV
9.3.1 pLF1013: gen ORF6 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF6 szczepu Lelystad syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF024 i zamplifikowano w reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF023 (30 mer) (SEQ ID NO 73)
5' CACTCAGTCGACATGGGAGGCCTAGACGAT 3' i
LF024 (30 mer) (SEQ ID NO 74)
5' CACTCATCTAGATTACCGGCCATACTTGAC 3'.
Fragment DNA 528 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR Sali i Xbal zligowano z fragmentem 4881 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Xbal generując plazmid pLF1013 o wielkości około 5409 bp.
Gen ORF6 PRRSV Lelystad koduje białko o 173 aminokwasach.
9.3.2 pLF1014: gen ORF6 (forma skrócona) sklonowany w wektorze pAB110
Gen ORF6 pozbawiany domeny transbłonowej i C-końcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1013 (przykład 9.3.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF025 (30 mer) (SEQ ID NO 75)
5' CACTACGGATCCGTGTCACGCGGCCGACTC 3' i LF026 (33 mer) (SEQ ID NO 76)
5' CACTACGGATCCTTAAACAGCTCGTTTGCCGCC 3'.
Fragment DNA 390 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR BamHI zligowano z fragmentem 5105 bp powstałym w wyniku trawienia pAB110 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1014 o wielkości około 5495 bp.
Tak zmodyfikowany gen ORF6 PRRSV Lelystad (tPA Δ[TM+Cter]) koduje białko o 154 aminokwasach.
P r z y k ł a d 10: Plazmidy kodujące różne formy antygenów poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego u świń (PRRSV) szczep amerykański W-2332
Geny kodujące białka ORF3, ORF5 i ORF6 PRRSV uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu amerykańskiego (M. Murtaugh i wsp., Arch. Virol, 1995, 140, 1451-1460) deponowanego w ATCC pod numerem VR-2332.
10.1 Plazmidy kodujące różne formy ORF3 szczepu VR-2332 PRRSV
10.1.1 pLF1015: gen ORF3 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF3 szczepu VR-2332 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF038 i zamplifikowano za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF037 (30 mer) (SEQ ID NO 77)
5' CACTACGATATCATGGTTAATAGCTGTACA 3' i
LF038 (30 mer) (SEQ ID NO 78)
5' CACTACTCTAGACTATCGCCGTACGGCACT 3'.
PL 209 304 B1
Fragment DNA 769 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Xbal zligowano z fragmentem 4900 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Xbal generując plazmid pLF1015 o wielkości około 5669 bp. Gen ORF3 PRRSV VR-2332 koduje białko o 254 aminokwasach.
10.2 Plazmidy kodujące różne formy ORF5 szczepu VR-2332 PRRSV
10.2.1 pLF1017: gen ORF5 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF5 szczepu VR-2332 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF030 i zamplifikowano w reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF029 (30 mer) (SEQ ID NO 79)
5' CACTACGATATCATGTTGGAGAAATGCTTG 3' i
LF030 (30 mer) (SEQ ID NO 80)
5' CACTACAGATGTCTAAGGACGACCCCATTG 3'.
Fragment DNA 607 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Bglll zligowano z fragmentem 4879 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Bglll generując plazmid pLF1017 o wielkości około 5486 bp.
Gen ORF5 PRRSV szczep VR-2332 koduje białko o 200 aminokwasach.
10.2.2 pLF1018: gen ORF5 (forma skrócona) sklonowany w wektorze pAB110
Gen ORF5 pozbawiany domeny transbłonowej i C-końcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1017 (przykład 10.2.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF031 (33 mer) (SEQ ID NO 81)
5' CACTACGGATCCGCCAGCAACGACAGCAGCTCC3' i
LF032 (33 mer) (SEQ ID NO 82)
5' CACTACGGATCCTTAGACCTCAACTTTGCCCCT 3'.
Fragment DNA 426 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR BamHI zligowano z fragmentem 5105 bp powstałym w wyniku trawienia pAB110 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1018 o wielkości około 5531 bp.
Tak zmodyfikowany gen ORF5 PRRSV szczepu VR-2332 (tPA Δ[TM-Cter]) koduje białko o 166 aminokwasach.
10.3 Plazmidy kodujące różne formy ORF6 szczepu VR-2332 PRRSV
10.3.1 pLF1019: gen ORF6 (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu ORF6 szczepu VR-2332 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF034 i zamplifikowano w reakcji PCR wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF033 (33 mer) (SEQ ID NO 83)
5' CACATCCTGCAGATGGGGTCGTCCTTAGATGAC 3' i
LF034 (30 mer) (SEQ ID NO 84)
5' CACATCTCTAGATTATTTGGCATATTTGAC 3'.
Fragment DNA 527 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR Pstl i Xbal zligowano z fragmentem 4871 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Pstl i Xbal generując plazmid pLF1019 o wielkości około 5398 bp.
Gen ORF6 PRRSV szczepu YR-2332 koduje białko o 174 aminokwasach.
10.3.2 pLF1016: gen ORF6 (forma skrócona) sklonowany w wektorze pAB110
Gen ORF6 pozbawiony domeny transbłonowej i C-końcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1019 (przykład 10.3.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF035 (30 mer) (SEQ ID NO 85)
5' CACTACGGATCCGTGAGTCGCGGCCGACTG 3' i
LF036 (33 mer) (SEQ ID NO 86)
5' CACTACGGATCCTTAAACAGCTTTTCTGCCACC 3'.
Fragment DNA 390 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR BamHI zligowano z fragmentem 5105 bp powstałym w wyniku trawienia pAB110 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1016 o wielkości około 5495 bp.
Tak zmodyfikowany gen ORF6 PRRSV szczepu VR-2332 (tPA Δ[TM-Cter]) koduje białko o 154 aminokwasach.
PL 209 304 B1
P r z y k ł a d 11. Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa świńskiej grypy (SIV) szczepu HIN 1
Geny kodujące antygeny hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) wirusa grypy świni typu H1N1 uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu „SW” H1N1. Szczepy są dostępne w Centre de Recherche en Virologie, Institut Armand Frappier, Univerite du Quebec, Laval, Canada (D. S. Arora i wsp., Virus Genes, 1997, 14, 251-254). Patrz też G.W. Both i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 6996-7000. 11.1 Plazmidy kodujące różne formy HA szczepu H1N1 SIV
11.1.1 pLF1001: gen HA (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu HA szczepu H1N1 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF004 i zamplifikowano w reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF003 (30 mer) (SEQ ID NO 87)
5' CTCCATGATATCATGGAAGCAAAACTATTC 3' i
LF004 (30 mer) (SEQ ID NO 88)
5' CTCCATCAGATCTTAAATGCATATTCTGCA 3'.
Fragment DNA 1705 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Bglll zligowano z fragmentem 4879 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Bglll generując tym plazmid pLF1001 o wielkości około 6584 bp.
Gen HA SIV H1N1 koduje białko o 566 aminokwasach.
11.1.2 pLF1002: Gen HA (forma zmodyfikowana) sklonowany w wektorze pLF999
Gen HA pozbawiony domeny transbłonowej i karboksykońcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1001 (przykład 11.1.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF005 (30 mer) (SEQ ID NO 89)
5' TCCGCGGCCGCACATGCTAACAATTCCACA 3' i
LF006 (32 mer) (SEQ ID NO 90)
5' TCCGCGGCCGCTTACATTGATTCTAGTTTCAC 3'.
Fragment DNA 1515 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR Notl zligowano z fragmentem 5678 bp powstałym w wyniku trawienia pLF999 (przykład 2) Notl generując plazmid pLF1002 o wielkości około 7193 bp.
Gen HA SIV H1N1 tak zmodyfikowany (intron II genu β-globiny królika, tPA, Δ[TM+Cter] koduje białko z 530 aminokwasów.
11.2 Plazmidy kodujące różne formy NA szczepu H1N1 SIV
11.2.1 pLF1003: gen NA (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu NA szczepu H1N1 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF008 i zamplifikowano w reakcji PCR wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF007 (30 mer) (SEQ ID NO 91)
5' CACCTGGTCGACATGAATCCAAATCAGAAG 3' i
LF008 (30 mer) (SEQ ID NO 92)
5' CACCTGTCTAGACTACTTGTCAATGGTGAA 3'.
Fragment DNA 1416 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR Sali i Xbal zligowano z fragmentem 4881 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Xbal generując plazmid pLF1003 o wielkości około 6297 bp.
Gen NA SIV H1N1 koduje białko o 469 aminokwasach.
11.2.2 pLF1004: gen NA (forma skrócona) sklonowany w wektorze pLF999
Gen NA pozbawiony domeny transbłonowej i karboksykońcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1003 za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF009 (31 mer) (SEQ ID NO 93)
5' CACTACGAATTCACAAATTGGGAATCAAAAT 3' i
LF010 (30 mer) (SEQ ID NO 94)
5' AATTTGTGAATTCGCGGCCGCGGATCCGGT 3'.
Fragment DNA 1207 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR EcoRI zligowano z fragmentem 5678 bp powstałym w wyniku trawienia pLF999 (przykład 2) EcoRI generując plazmid pLF1004 o wielkości około 6885 bp.
PL 209 304 B1
Gen NA SIV H1N1 tak zmodyfikowany (intron II genu β-globiny królika, tPA, Δ[TM+Cter]) koduje białko o 431 aminokwasach.
P r z y k ł a d 12: Plazmidy kodujące różne formy antygenów wirusa świńskiej grypy (SIV) szczep H3N2
Geny kodujące antygeny HA i NA wirusa grypy świni typu H3N2 uzyskano za pomocą RT-PCR wychodząc z RNA wirusa szczepu „Cótes du Nord 1987” (cdn87), z listy Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) i dostępnego w National Influenza Reference Center, Virology Laboratory, 8 avenue Rockefeller, 69008 Lyon, Francja.
12.1 Plazmidy kodujące różne formy HA szczepu H3N2 SIV
12.1.1 pLF1005: gen HA (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu HA szczepu H3N2 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF012 i zamplifikowano w reakcji PCR za pomocą pary następujących oligonukleotydów:
LF011 (30 mer) (SEQ ID NO 95)
5' CTGCACGTCGACATGAAGACTGTCATTGCC 3' i
LF012 (24 mer) (SEQ ID NO 96)
5' GATATCTCAGATGCAAATGTTGCA 3'.
Fragment DNA 1709 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Sali zligowano z fragmentem 4893 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Sali generując plazmid pLF1005 o wielkości około 6602 bp.
Gen HA SIV H3N2 koduje białko o 566 aminokwasach.
12.1.2 pLF1006: Gen HA (forma zmodyfikowana) sklonowany w wektorze pLF999
Gen HA pozbawiony domeny transbłonowej i C-końcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1005 (Przykład 12.1.1) wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF013 (33 mer) (SEQ ID NO 97)
5' CACCGCGGATCCCTTCCAGAAAATGGCAGCACA 3' i LF014 (33 mer) (SEQ ID NO 98)
5' CACCGCGGATCCTTAGTCTTTGTATCCCGACTT 3'.
Fragment DNA 1542 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR BamHI zligowano z fragmentem 5678 bp powstałym w wyniku trawienia pLF999 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1006 o wielkości około 7220 bp.
Gen HA SIV H3N2 tak zmodyfikowany (intron II genu β-globiny królika, tPA, Δ[TM+Cter]) koduje białko o 538 aminokwasach.
12.2 Plazmidy kodujące różne formy NA szczepu H3N2 SIV
12.2.1 pLF1007: gen NA (forma natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu NA szczepu H3N2 syntetyzowano wychodząc z odpowiedniego RNA wirusa za pomocą startera LF016 i zamplifikowano w reakcji PCR wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF015 (30 mer) (SEQ ID NO 99)
5' CACTCAGATATCATGAATCCAAAGCAAAAG 3' i
LF016 (30 mer) (SEQ ID NO 100)
5' CACTCATCTAGATTATATAGGCATGAGATC 3'.
Fragment DNA 1414 bp uzyskany po strawieniu produktu PCR EcoRV i Xbal zligowano z fragmentem 4900 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) EcoRV i Xbal generując plazmid pLF1007 o wielkości około 6314 bp.
Gen NA SIV H3N2 koduje białko o 469 aminokwasach.
12.2.2 pLF1008: gen NA (forma zmodyfikowana) sklonowany w wektorze pLF999
Gen NA pozbawiony domeny transbłonowej i karboksykońcowej syntetyzowano za pomocą reakcji PCR wychodząc z matrycy pLF1005 wykorzystując parę następujących oligonukleotydów:
LF017 (33 mer) (SEQ ID NO 101)
5' CACTACGGATCCTTCAAGCAATATGAGTGCGAC 3' i
LF018 (33 mer) (SEQ ID NO 102)
5' CACTACGGATCCTTATGAAGTCCACCATACTCT 3'
Fragment DNA 1221 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR BamHI zligowano z fragmentem 5678 bp powstałym w wyniku trawienia pLF999 (przykład 2) BamHI generując plazmid pLF1008 o wielkości około 6899 bp.
PL 209 304 B1
Gen NA SIV H3N2 tak zmodyfikowany (intron II genu β-globiny królika, tPA, Δ[TM+Cter]) koduje białko o 431 aminokwasach.
P r z y k ł a d 13. Plazmid kodujący GM-CSF bydlęcy cDNA genu GM-CSF bydlęcego syntetyzowano wychodząc z komórkowego RNA jednojądrowych komórek krwi bydlęcej za pomocą startera LF065 i zamplifikowano za pomocą reakcji PCR z parą następujących oligonukleotydów:
LF054 (36 mer) (SEQ ID NO 103)
5' CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3' i
LF055 (34 mer) (SEQ ID NO 104)
5' CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3'.
Fragment DNA 437 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Sali i Bglll zligowano z fragmentem 4860 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Bglll generując tym plazmid pLF1032 (około 5297 bp). Gen bydlęcego GM-CSF koduje białko o 143 aminokwasach.
P r z y k ł a d 14: Plazmid kodujący GM-CSF świni cDNA genu GM-CSF świni syntetyzowano wychodząc z komórkowego RNA jednojądrowych komórek krwi świni za pomocą startera LF067 i zamplifikowano za pomocą reakcji PCR z parą następujących oligonukleotydów:
LF056 (36 mer) (SEQ ID NO 105)
5' CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3' i
LF057 (37 mer) (SEQ ID NO 106)
5' CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCAGCA 3'.
Fragment DNA 440 bp uzyskany przez trawienie produktu PCR Sali i Bglll zligowano z fragmentem 4860 bp powstałym w wyniku trawienia pVR1012 (przykład 2) Sali i Bglll generując plazmid pLF1033 (około 5300 bp). Gen świni GM-CSF koduje białko o 144 aminokwasach.
P r z y k ł a d 15: Formułowanie plazmidów do szczepionek
Roztwór DNA zawierający jeden lub kilka plazmidów według przykładów 3 do 14 zatężano za pomocą strącenia etanolem jak opisano w Sambrook i wsp. (1989). Osad DNA zawieszano w roztworze 0,9% NaCl, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml. Roztwór 0,75 mM DMRIE-DOPE przygotowano przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej H2O.
Tworzenie kompleksów DNA plazmidowy-lipid przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE roztworem DNA 1 mg/ml w 0,9% NaCl. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany butelki zawierającej roztwór kationowego lipidu, tak, aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie do momentu, gdy dwa roztwory zmieszają się. Wówczas otrzymuje się końcową kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 pg/ml DNA.
Jest korzystne, aby wszystkie stosowane roztwory miały temperaturę pokojową dla przeprowadzenia operacji opisanych powyżej. Powstawanie kompleksów DNA/DMRIE-DOPE umożliwia siew temperaturze otoczenia przez okres czasu 30 minut przed rozpoczęciem immunizacji zwierząt.
P r z y k ł a d 16. Immunizacja bydła przeciwko BHV-1 12 sztuk bydła randomizowano do 3 grup po 4 zwierzęta.
Grupa 1 jest grupą zwierząt kontrolnych.
Zwierzętom z grupy 2 podawano mieszaninę plazmidów szczepionkowych pPB281 (kodujący gen gB BHV-1 w formie A[TM-Cter], przykład 3.1.2), pPB292 (kodujący gen gC BHV-1 w formie Δ[ΤΜCter], przykład 3.2.2) i pP284 (kodujący gen gD BHV-1 w formie ΔΙΤΜ-Cter], przykład 3.3.2).
Zwierzętom z grupy 3 podawano tę samą mieszaninę jak grupie 2, ale formułowaną z DMRIE-DOPE jak opisano w przykładzie 15.
Wykonywano zastrzyk o objętości 10 ml każdemu zwierzęciu domięśniowo za pomocą strzykawek zaopatrzonych w igłę, i powtórzono po 21 dniach. Całkowita masa każdego plazmidu stosowanego w czasie każdej immunizacji wynosiła 1500 μg.
Specjalista z tej dziedziny ma odpowiednią wiedzę, aby dopasować objętość lub stężenie w zależności od wymaganej dawki plazmidu.
Badanie odpowiedzi serologicznej indukowanej przez dwie mieszaniny plazmidów szczepionkowych wyrażających antygeny gB, gC i gD BHV-1 przeprowadzono w okresie 35 dni po pierwszym szczepieniu.
PL 209 304 B1
Wyniki przedstawiono w następującej tabeli:
| Plazmid | Formuła | Antygeny | Dawka | SN dzień 28 | SN dzień 35 |
| kontrola | — | — | — | 0,2 +/- 0,0 | 0,2 +/- 0,0 |
| pPB281 | gB A[TM-Cter] | 1500 μg | 1,0+/- 0,5 | 1,2+/- 0,8 | |
| pPB292 | gC A[TM-Cter] | 1500 μg | |||
| pPB294 | — | gD A[TM-Cter] | 1500 μg | ||
| pPB281 | DMRIE-DOPE | gB A[TM-Cter] | 1500 μg | 2,1 +/- 0,6 | 2,7 +/- 0,6 |
| pPB292 | gC A[TM-Cter] | 1500 μg | |||
| pPB294 | gD A[TM-Cter] | 1500 μg |
P r z y k ł a d 17: Immunizacja świń przeciwko PRY 15 świń w wieku około 7 tygodni randomizowano do 3 grup po 5 zwierząt.
Grupa 1 jest grupą zwierząt kontrolnych.
Zwierzętom z grupy 2 podawano mieszaninę plazmidów szczepionkowych pNS009 (kodujący gB PRV w formie tPA Δ[TM-Cter], przykład 8.1.3), pNS012 (kodujący gC PRV w formie tPA Δ[TM-Cter], przykład 8.2.3) i pPB238 (kodujący gD PRV w formie tPA Δ[TM-Cter], przykład 8.3.3).
Zwierzętom z grupy 4 podawano tę samą mieszaninę jak grupie 3, ale formułowaną z DMRIEDOPE jak opisano w przykładzie 15, aby uzyskać końcowe stężenie DMRIE-DOPE 0,0535 mM.
350 μg plazmidu koniecznego do tych protokołów szczepienia mieszano w końcowej objętości ml.
Każdemu zwierzęciu robiono zastrzyk domięśniowy 2 ml za pomocą strzykawek zaopatrzonych w igłę, i powtórzono po 21 dniach.
Świnie testowano w dniu 35 przez podanie donosowo 2 ml roztworu wirusa testowego PRV szczep NIA3 w ilości 1 ml na nozdrze o mianie 107,76 DICC50 na ml.
Śledzono masę (w kg) każdego zwierzęcia przez okres 42 dni po pierwszym szczepieniu.
Względny przyrost masy (G7) wyliczono dla każdego zwierzęcia w okresie 7 dni po teście. Chodzi o różnicę masy w siódmym dniu (D7) i dniu testu (DO) dzielone przez masę w DO, sprowadzone do 1 dnia i wyrażane, jako procent: (masa w D7 - masa w DO) x 100/(masa w D7).
AG7 jest różnicą między średnią względnych przyrostów masy zwierząt szczepionych i kontrolnych.
Wyniki przedstawiono w następującej tabeli:
| Plazmid | Formuła | Antygeny | Dawka | Masa średnia D35 | Masa średnia D42 | AG7 |
| Kontrola | — | — | — | 25,3 +/- 6,2 | 22,0 +/- 5,0 | — |
| pNS009 pNS012 pPB238 | gB A[TM-Cter] tPA gC A[TM-Cter] tPA gD A[TM-Cter] tPA | 350 μg 350 μg 350 μg | 25,3 +/- 4,8 | 26,1 +/- 4,7 | 2,46 | |
| pNS009 pNS012 pPB238 | DMRIE- DOPE | gB A[TM-Cter] tPA gC A[TM-Cter] tPA gD A[TM-Cter] tPA | 350 μg 350 μg 350 μg | 23,8 +/- 4,5 | 26,2 +/- 4,9 | 3,41 |
Należy podkreśli, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania przytoczonych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza zakres tego wynalazku.
Claims (15)
1. Szczepionka DNA obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1) oraz elementy konieczne do jego wyrażania in vivo, N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon (DMRIE) oraz dioleilo-fosfatydylo-etanolaminę (DOPE).
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje białko czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
3. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że ponadto obejmuje wektor ekspresyjny zawierający gen kodujący bydlęce białko GM-CSF, który umożliwia wyrażanie in vivo tego genu.
4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że wektor ekspresyjny jest plazmidem.
5. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienna tym, że plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący immunogen BHV-1, w którym to kwasie nukleinowym została wydeletowana część kodująca domenę transbłonową.
6. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że plazmid zawiera sekwencję nukleotydów kodującą immunogen BHV-1, i heterologiczną sekwencję sygnałową, korzystnie ludzki tkankowy aktywator plazminogenu (tPA).
7. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że plazmid zawiera kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą immunogen BHV-1 oraz zawiera stabilizujący intron.
8. Szczepionka według zastrz. 7, znamienna tym, że intronem jest intron II genu beta-globiny królika.
9. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę gB BHV-1.
10. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę gC BHV-1.
11. Szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że plazmid zawiera kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę gD BHV-1.
12. Szczepionka według zastrz. 9, znamienna tym, że sekwencja genu gB zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gB, i/lub delecję fragmentu genu gB kodującego domenę transbłonową.
13. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że sekwencja genu gC zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gC, i/lub delecję fragmentu genu gC kodującego domenę transbłonową.
14. Szczepionka według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja genu gD zawiera heterologiczną sekwencję sygnałową, zwłaszcza ludzką sekwencję sygnałową tPA zamiast sekwencji sygnałowej dla peptydu sygnałowego glikoproteiny gD, i/lub delecję fragmentu genu gD kodującego domenę transbłonową.
15. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje plazmid ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący gB z BHV-1 z delecja fragmentu kodującego domenę transbłonową i przylegającą część C-końcową, oraz drugi plazmid ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący gD z BHV-1 z delecja fragmentu kodującego domenę transbłonową i przylegającą część C-końcową.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0000798A FR2804028B1 (fr) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Vaccins adn ameliores pour animaux de rente |
| PCT/FR2001/000187 WO2001052888A2 (fr) | 2000-01-21 | 2001-01-19 | Vaccins adn ameliores pour animaux de rente |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL356554A1 PL356554A1 (pl) | 2004-06-28 |
| PL209304B1 true PL209304B1 (pl) | 2011-08-31 |
Family
ID=8846183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL356554A PL209304B1 (pl) | 2000-01-21 | 2001-01-19 | Szczepionka DNA obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1) |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1248650B1 (pl) |
| JP (1) | JP2004500375A (pl) |
| KR (1) | KR100820893B1 (pl) |
| CN (2) | CN101554480A (pl) |
| AR (1) | AR027926A1 (pl) |
| AT (1) | ATE346611T1 (pl) |
| AU (1) | AU783865B2 (pl) |
| BR (2) | BR0107767A (pl) |
| CA (1) | CA2398229C (pl) |
| CY (1) | CY1107627T1 (pl) |
| DE (1) | DE60124862T2 (pl) |
| DK (1) | DK1248650T3 (pl) |
| ES (1) | ES2277913T3 (pl) |
| FR (1) | FR2804028B1 (pl) |
| HU (1) | HU229597B1 (pl) |
| MX (1) | MXPA02007110A (pl) |
| NZ (1) | NZ520270A (pl) |
| PL (1) | PL209304B1 (pl) |
| PT (1) | PT1248650E (pl) |
| WO (1) | WO2001052888A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200205698B (pl) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852705B2 (en) | 2000-01-21 | 2005-02-08 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| US7078388B2 (en) | 2000-01-21 | 2006-07-18 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| PT2311848E (pt) | 2002-12-23 | 2013-10-03 | Vical Inc | Vacinas à base de polinucleótido optimizadas por codão contra a infecção do citomegalovírus humano |
| EP1594537B1 (en) * | 2003-02-19 | 2012-10-24 | Merial | Vaccination or immunization using a prime-boost regimen against brsv, bhv-1, bvdv, bpi-3 |
| EP1689858B1 (en) | 2003-11-13 | 2013-05-15 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods of characterizing infectious bursal disease virus |
| CU23544A1 (es) | 2006-02-28 | 2010-06-17 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| AU2010249330B2 (en) * | 2009-05-22 | 2015-11-05 | Genocea Biosciences Inc. | Vaccines against Herpes Simplex Virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| CN103547286B (zh) * | 2010-11-19 | 2016-10-19 | 北京凯因科技股份有限公司 | 一种用于预防和治疗乙型肝炎的dna疫苗组合物 |
| CN112034169A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-12-04 | 华威特（江苏）生物制药有限公司 | 用于检测牛病毒性腹泻病毒1型的直接免疫荧光试剂及其试剂盒 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2139756A1 (en) * | 1992-07-08 | 1994-01-20 | Eric M. Bonnem | Use of gm-csf as a vaccine adjuvant |
| JPH09500013A (ja) * | 1993-06-01 | 1997-01-07 | ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | カチオン性脂質による遺伝子免疫 |
| US5658785A (en) * | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
| EP0779923A2 (en) * | 1994-09-09 | 1997-06-25 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Interleukin-1 type 3 receptors |
| US5736524A (en) * | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
| US5719131A (en) * | 1994-12-09 | 1998-02-17 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules |
| EP0826063A1 (en) * | 1995-04-25 | 1998-03-04 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
| JPH11508231A (ja) * | 1995-05-26 | 1999-07-21 | ソマティックス セラピー コーポレイション | 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル |
| FR2751224B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
| FR2751229B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins |
| FR2751228B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Vaccin polynucleotidique bovin pour voie intradermique |
| WO1998040499A1 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Heather Lynn Davis | Gene delivery to mucosal epithelium for immunization or therapeutic purposes |
| AUPO856097A0 (en) * | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| EP1185662B1 (fr) * | 1999-06-10 | 2011-03-02 | Merial | Vaccins adn pour les chiens |
| US6943152B1 (en) * | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
-
2000
- 2000-01-21 FR FR0000798A patent/FR2804028B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-01-19 AU AU35566/01A patent/AU783865B2/en not_active Expired
- 2001-01-19 BR BR0107767-8A patent/BR0107767A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-19 PL PL356554A patent/PL209304B1/pl unknown
- 2001-01-19 PT PT01907651T patent/PT1248650E/pt unknown
- 2001-01-19 CA CA2398229A patent/CA2398229C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 BR BRPI0107767-8A patent/BRPI0107767B1/pt unknown
- 2001-01-19 KR KR1020027009300A patent/KR100820893B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 JP JP2001552935A patent/JP2004500375A/ja active Pending
- 2001-01-19 NZ NZ520270A patent/NZ520270A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-01-19 DK DK01907651T patent/DK1248650T3/da active
- 2001-01-19 CN CNA2008101667835A patent/CN101554480A/zh active Pending
- 2001-01-19 AT AT01907651T patent/ATE346611T1/de active
- 2001-01-19 CN CN018054072A patent/CN1404398B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 WO PCT/FR2001/000187 patent/WO2001052888A2/fr not_active Ceased
- 2001-01-19 ES ES01907651T patent/ES2277913T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 HU HU0203974A patent/HU229597B1/hu unknown
- 2001-01-19 DE DE60124862T patent/DE60124862T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 EP EP01907651A patent/EP1248650B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-19 MX MXPA02007110A patent/MXPA02007110A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 AR ARP010100267A patent/AR027926A1/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-07-17 ZA ZA200205698A patent/ZA200205698B/en unknown
-
2007
- 2007-02-14 CY CY20071100201T patent/CY1107627T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1404398B (zh) | 2012-05-02 |
| BR0107767A (pt) | 2002-11-12 |
| HUP0203974A2 (hu) | 2003-03-28 |
| NZ520270A (en) | 2004-08-27 |
| FR2804028B1 (fr) | 2004-06-04 |
| ZA200205698B (en) | 2003-09-29 |
| DK1248650T3 (da) | 2007-04-16 |
| KR20020084093A (ko) | 2002-11-04 |
| CN101554480A (zh) | 2009-10-14 |
| BRPI0107767B1 (pt) | 2017-10-24 |
| ATE346611T1 (de) | 2006-12-15 |
| CA2398229C (en) | 2012-05-15 |
| WO2001052888A3 (fr) | 2001-12-20 |
| CA2398229A1 (en) | 2001-07-26 |
| MXPA02007110A (es) | 2003-01-28 |
| CN1404398A (zh) | 2003-03-19 |
| HU229597B1 (en) | 2014-02-28 |
| PT1248650E (pt) | 2007-02-28 |
| EP1248650A2 (fr) | 2002-10-16 |
| KR100820893B1 (ko) | 2008-04-10 |
| AR027926A1 (es) | 2003-04-16 |
| FR2804028A1 (fr) | 2001-07-27 |
| CY1107627T1 (el) | 2013-04-18 |
| AU3556601A (en) | 2001-07-31 |
| AU783865B2 (en) | 2005-12-15 |
| HUP0203974A3 (en) | 2004-07-28 |
| EP1248650B1 (fr) | 2006-11-29 |
| ES2277913T3 (es) | 2007-08-01 |
| DE60124862T2 (de) | 2007-07-05 |
| PL356554A1 (pl) | 2004-06-28 |
| WO2001052888A2 (fr) | 2001-07-26 |
| JP2004500375A (ja) | 2004-01-08 |
| DE60124862D1 (de) | 2007-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6852705B2 (en) | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines | |
| KR100768114B1 (ko) | 애완 동물 및 스포츠용 동물을 위한 ｄｎａ 백신 | |
| JP2003502345A5 (pl) | ||
| PL194348B1 (pl) | Szczepionki DNA i zastosowanie polimerów kwasu akrylowego albo metakrylowego oraz kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej oraz zastosowanie karbopolu | |
| US7078388B2 (en) | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines | |
| PL209304B1 (pl) | Szczepionka DNA obejmująca plazmid zawierający kwas nukleinowy kodujący immunogen wirusa opryszczki bydła typu 1 (BHV-1) | |
| AU2005202233B2 (en) | DNA vaccines for pets and sport animals | |
| US20040002472A1 (en) | Vaccination or immunization using a prime-boost regimen | |
| AU2003215835B2 (en) | Vaccination or immunization using a prime-boost regimen against BRSV, BHV-1, BVDV, BPI-3 | |
| RU2283867C2 (ru) | Днк-вакцина (варианты) и иммуногенная композиция против чумки собак | |
| PL215173B1 (pl) | Zestaw do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła, zastosowanie czynnika patogennego bydła (BRSV) do wytwarzania szczepionki, szczepienie oraz inaktywowana szczepionka |