KR100820893B1

KR100820893B1 - 생산성 동물을 위한 개선된 ｄｎａ 백신

Info

Publication number: KR100820893B1
Application number: KR1020027009300A
Authority: KR
Inventors: 오도네쟝-크리스토프프란시스; 피셔로랑베르나르; 바르쥐-르-루시모나
Original assignee: 메리알
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2008-04-10
Also published as: EP1248650A2; PL209304B1; JP2004500375A; ES2277913T3; HUP0203974A3; DE60124862D1; CY1107627T1; CA2398229A1; WO2001052888A2; WO2001052888A3; NZ520270A; CN1404398B; PT1248650E; DK1248650T3; ZA200205698B; CN101554480A; CA2398229C; PL356554A1; AU783865B2; AR027926A1

Abstract

본 발명은

a) 관심 동물 종의 병원체 면역원을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 생체내 발현이 가능한 조건 하에 함유하는 플라스미드; 및

b) 하기 일반식의 4급 암모늄염을 함유하는 양이온성 지질:

(상기 식에서, R1은 12개 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 포화되거나 불포화된 선형의 지방족 라디칼이고, R2는 2개 또는 3개의 탄소 원자를 함유하는 또 다른 지방족 라디칼이고, X는 하이드록시기 또는 아민기이고, 지질은 바람직하게는 DMRIE임)

을 포함하는 생산형 사육 동물, 특히 소 또는 돼지를 공격하는 병원체에 대한 DNA 백신에 관한 것이다.

백신, 뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 인트론, 면역 접종, 생산형 사육 동물, 소, 돼지

Description

생산성 동물을 위한 개선된 ＤＮＡ 백신 {IMPROVED DNA VACCINES FOR PRODUCTION-TYPE ANIMALS}

본 발명은 사육 동물, 특히 소 및 돼지를 위한 개선된 DNA 백신에 관한 것이다.

백신 접종(vaccination)에 데옥시리보핵산(DNA) 분자를 사용하는 것은 1990년대 초기부터 알려져 왔다(Wolf et al., Science 1990, 247, 1465-1468). 이러한 백신 접종 기술은 면역학적 활성 단백질을 코딩 및 발현시키는 DNA 또는 RNA 분자로 백신 접종하고자 하는 대상의 세포에 생체내 트랜스펙션시킨 후 세포 및 호르몬 면역을 유도한다.

DNA 백신은 백신 접종하고자 하는 대상의 세포 기구에 의해 발현될 수 있는 적어도 하나의 플라스미드 및 약리학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle) 또는 부형제로 구성된다. 이러한 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열은 특히 백신 접종하고자 하는 대상 내에서 세포 면역반응(T 림프구의 동원) 및 호르몬 면역반응(면역원에 대항하여 특이적으로 유도되는 항체의 생성 자극)을 유도할 수 있는 단백질 또는 당단백질과 같은 하나 이상의 면역원을 코딩하고 발현시킨다(Davis H. L., Current Opinion Biotech., 1997, 8, 635-640).

병원체로부터 유도된 모든 면역원이 자연적으로는 백신 접종하고자 하는 동물 내에서 최적의 방어 면역반응을 유도하기에 충분히 유효한 항원은 아니다. 따라서, 면역반응의 개선이 요구된다.

DNA 백신의 다양한 투여 경로(복막내, 정맥내, 근육내, 피하, 피부내, 점막 등)가 제안되었으며, 다양한 투여 수단, 특히 DNA로 코팅되어 백신 접종하고자는 대상의 피부 세포를 관통하도록 투사되는 금 입자(Tang et al., Nature 1992, 356, 152-154) 및 피부와 및 그 하부 조직의 세포 모두로의 트랜스펙션을 가능하게 하는 액체 제트 주사기(Furth et al., Analytical Bioch., 1992, 205, 365-368)가 제안되었다.

DNA의 시험관내 트랜스펙션을 위해서는 화학적 물질이 사용되어 왔다:

A/ - 양이온성 지질.

양이온성 지질은 4개의 하위 그룹으로 분류된다:

1) 4급 암모늄을 함유하는 양이온성 지질, 예를 들면 DOTMA(디올레오일옥시프로필트리메틸암모늄, Gibco사에 의해 상품명 Lipofectine으로 제조됨), DOTAP(트리메틸-2,3-(옥타데크-9-엔오일옥시)-1-프로판암모늄; Gregoriadis et al., FEBS Letters, 1997, 402, 107-110), DMRIE(N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판암모늄; WO-A-9634109), DLRIE(N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판암모늄; Felgner et al., Ann. N Y Acad. Sci., 1995, 772, 126-139).

4급 암모늄을 함유하는 이러한 양이온성 지질은 대안적으로 DOPC(디올레오일 포스파티딜콜린) 또는 DOPE(디올레오일포르파티딜에탄올아민)과 같은 부가의 천연 지질과 조합될 수 있다(J. P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994, 5, 382-389).

2) 리포아민, 예를 들면 DOGS(디옥타데실아미도글리실스퍼민, Promega사에 의해 상품명 Transfectam으로 제조됨; Abdallah et al., Biol. Cell., 1995, 85, 1-7), DC-Chol(디메틸아미노에탄-카바모일-콜레스테롤; Gao 및 Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 179, 280-285), BGSC(비스-구아니딘-스퍼미딘-콜레스테롤), BGTC(비스-구아니딘-트렌콜레스테롤)(Vigneron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9682-9686).

3) 4급 암모늄염 및 리포아민을 함유하는 양이온성 지질, 예를 들면 DOSPA(N,N-디메틸-N-(2-(스퍼민카르복스아미도)에틸)-2,3-비스-(디올레오일옥시)-1-프로판이미듐, 펜타하이드로클로라이드, Gibco사에 의해 상품명 LipofectAmine^(R)으로 시판됨; Hawley-Nelson et al., Focus 1993, 15, 73-79), GAP-DLRIE(N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판암모늄; Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11454-11459; Norman et al., Vaccine 1997, 15, 801-803).

4) 아미딘 염을 함유하는 지질, 예를 들면 ADPDE, ADODE(Ruysschaert et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 203, 1622-1628).

B/ - 폴리머, 예를 들면 SuperFect™(활성화 덴트리머(dendrimer) 분자, Qiagen사에 의해 제조됨; Xu et al., Mol. Genet. Metab., 1998, 64, 193-197), 및

C/ - 생화학 제제, 예를 들면 독소, 특히 콜레라 독소.

이들 화합물의 일부는 보다 완화된 결과를 가져오는 DNA 백신의 제형화에 사용되었다. 시험관내 트랜스펙션 분야에서의 지식은 궁극적인 목적이 방어 면역반응을 일으키는 것인 DNA 백신 접종에는 적용될 수 없다. 시험관내 트랜스펙션을 촉진하는 것으로 알려진 화합물로는 유효한 면역 방어효과의 유도에 있어 부정적인 효과가 관찰되었다. 몇몇 제형 화학적 물질은 용량이 큰 경우 트랜스펙션된 세포에 대해 독성이다.

이미 언급된 Etchart의 연구에서(Etchart et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 1577-1580), DOTAP의 사용은 DNA 백신이 비강내 경로를 통해 투여되는 동안 면역 보강제로서의 효과를 나타내지 못하는 반면, 경구 투여를 통하는 경우에는 면역 보강제로서 효과를 나타낸다. 또한, DOTAP는 비강내 경로를 통해 투여된 마우스 모델에 대한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 DNA 백신에 사용되었으나(Ban et al., Vaccine 1997, 15, 811-813), DOTAP의 첨가는 면역반응을 억제하였다. 근육내 경로를 통해 투여된 마우스 모델에 대한 B형 간염 바이러스의 표면 단백질(S)을 코딩하는 DNA 백신에 DC-chol 또는 DOTAP/DOPE를 사용한 경우 항체 반응이 향상된 반면, 리포펙틴(또는 DOTMA)의 사용은 이러한 항체 반응을 향상시키지 못했다(Gregoriadis et al., FEBS Letters 1997, 402, 107-110). 또한, DC-chol/DOPE는 마우스 모델에 대한 인간 면역 결핍 바이러스(HIV, Env 단백질)에 대항하는 DNA 백신에 사용되었으나, 이때 근육내 경로를 통한 투여는 보다 효과적인 면역반응을 유도한 반면, 피하 또는 피부내 경로를 통한 투여는 면역반응을 증 가시키지 못했다(Ishii et al., AIDS Res. Hum. Retro., 1997, 13, 1421-1428).

특정 사이토킨, 특히 인터류킨 또는 인터페론의 첨가는 특히 DNA 백신에 의해 유도되는 면역반응을 강화하도록 할 수 있다. 각 사이토킨은 그것에 특이적인 반응을 개시시키고 면역반응을 세포 반응 또는 호르몬 반응에 대해 더 강하게 또는 약하게 조절한다(Pasquini et al., Immunol. Cell. Biol., 1997, 75, 397-401; Kim et al., J. Interferon Cytokine Res., 199, 19, 77-84). 주어진 종으로부터 얻어지는 사이토킨의 면역 보강 효과는 면역 환경이 바뀌는 경우, 특히 이들 사이토킨이 다른 종으로 투여되는 경우 이종 면역계 내에서는 동일할 필요가 없다. 또한, 사이토킨의 첨가는 면역 보강 효과를 나타내지 않거나, 심지어는 추구하는 효과에 대한 역효과, 즉 면역반응의 저하 또는 억제를 초래할 수 있다. 따라서, GM-CSF와 융합된 면역글로불린의 단일 사슬을 코딩하는 DNA 백신은 면역반응을 증가시키지 못하는 반면, Fv 및 사이토킨 IL-1베타로 이루어지는 융합 단백질을 투여하는 방식 또는 사이토킨 융합 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 투여하는 방식과 동일한 방식으로 이들 융합 단백질을 마우스 내로 직접 투여하는 것은 효과적이다(Hakim et al., J. Immunol., 1996, 157, 5503-5511). 융합 또는 비융합 형태의 사이토킨 IL-2 및 B형 간염 바이러스의 외피 단백질을 함께 발현시키는 플라스미드의 사용은 호르몬 및 세포 면역반응을 증진시킨다(Chow 등., J. Virol., 1997, 71, 169-78). 그러나, 인간의 후천성 면역 결핍 바이러스(HIV-1)의 당단백질 gp120 및 사이토킨 IL-2를 코딩하는 이중 시스트론성(bicistronic) 플라스미드의 사용은 단지 gp120만을 코딩하는 단일 시스트론성 플라스미드를 사용하는 경우에 얻어지는 것보다 낮은 항-gp120 특이적 면역반응을 유도하였다(Barouch et al., J. Immunol., 1998, 161, 1875-1882). 광견병 바이러스의 G 당단백질을 코딩하는 발현 벡터 및 쥐 GM-CSF를 코딩하는 발현 벡터인 2개의 발현 벡터를 마우스 내로 동시 주입하면 B 림프구 및 T 림프구의 활성이 자극되는 반면, 감마-인터페론을 코딩하는 플라스미드를 동시 주입하면 면역반응의 저하가 초래된다(Xiang et al., Immunity, 1995, 2, 129-135).

항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 일부의 결실, 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 하류 또는 상류의 비전사 부위로의 DNA 단편의 삽입과 같은 항원에 있어서의 특정 변형은 특히 항원의 발현 또는 이것의 제시(presentation) 수준을 높임으로써 DNA 백신의 효능을 증진시킬 수도 있다.

그러나 실제는, 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 상에서의 조작은 초기의 면역학적 활성의 저하 또는 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 광견병 바이러스 G 항원을 코딩하는 유전자로부터 막관통 도메인의 결실은 이러한 변형 항원을 코딩하는 DNA 백신의 근육내 경로를 통한 투여 후 마우스 모델 내에서 유도되는 방어 수준을 저하시켰다(Xiang et al., Virol., 1995, 209, 569). 소 헤르페스바이러스(BHV) gD 당단백질을 코딩하는 유전자로부터의 막관통 도메인의 결실은 항체 반응을 증가시킬 수 있도록 하지 목하였고, 근육내 경로를 통해 백신 접종된 소과 동물 내에서 부분 방어만을 유도하였다(van Drunen Little-van den Hurk et al., J. Gen. Virol., 1998, 79, 831-839). 호르몬 및 세포 면역반응과 수여된 방어는 분비된 형태를 제외한 상기 GP 당단백질을 코딩하는 DNA 백신 또는 에볼라 바이러스의 GP 당단백질을 코딩하는 DNA 백신 중 하나에 의해 면역 접종된 후 접종된 기니아 피그에서와 동일하다(Xu et al., Nature Medicine, 1998, 4, 37-42).

말라리아 Pf332 항원을 코딩하는 유전자로의 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 단일 서열의 삽입은 근육내 경로를 통해 백신 접종된 마우스 내에서 항원 반응을 증가시킬 수 없었다(Haddad et al., FEMS 1997, 18, 193-202). 마찬가지로, 쥐 로타바이러스 VP7 항원을 코딩하는 유전자로의 tPA 서열의 부가 또한 진피내 경로를 통해 백신 접종된 마우스 내에서 항원 반응을 증진시키지 못한 반면, VP4 항원 및 tPA로 이루어진 융합 단백질은 항원 반응을 증가시켰으나, 유효한 방어는 유도하지 못했다(Choi et al., Virology 1998, 250, 230-240).

한 항원의 뉴클레오타이드 서열 상에서 이루어진 변형은 항원이 항상 동일한 구조의 배열을 갖는 것이 아니기 때문에 일반적으로는 다른 항원에 직접 적용될 수 없다.

본 발명의 목적은 DNA 백신의 효능을 강화하는 것이다. 이런 목적은 보다 구체적으로 DNA 백신 접종을 통해 사육 동물, 특히 소 및 돼지에서 보다 우수한 면역반응 및 특히 유효한 방어효과를 얻어내는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 소에서 소위 감염성 소 비기관염(IBR)이라 불리는 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 호흡기합포체(syncitial) 바이러스(BRSV), 점막 질환 바이러스 또는 소 페스티바이러스 타입 1 및 2(소의 바이러스성 설사 바이러스 또는 BVDV-1 및 BVDV-2), 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(bPI-3)에 대해 유효한 방어 면역반응을 유도하는 개선된 DNA 백신을 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 돼지에서 돼지 헤르페스바이러스 또는 오제스즈키병(Aujeszky' disease; 유사광견병 바이러스 또는 PRV), 돼지 재생성 호흡 증후군 바이러스(또는 PRRSV), 돼지 인플루엔자 바이러스(또는 SIV), 통상적인 돼지(hog) 콜레라 바이러스(또는 HCV), 파보바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 등가체(valency)를 포함하는 유효한 방어 면역반응을 유도하는 개선된 DNA 백신을 제조하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 BHV-1, BRSV, BVDV, bPI-3 및 광견병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 등가체를 포함하는 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신을 제조하는 것이다.

본 발명의 대상은 사육 동물, 특히 소 및 돼지에 감염되는 적어도 1종의 병원체에 대해 유효한 방어효과를 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다. 상기 DNA 백신은 제형화, 또는 GM-CSF의 부가, 또는 항원(들)의 최적화, 또는 이러한 방책들의 조합에 의해 개선된다.

DNA 백신은 제형화 및 선택적으로 GM-CSF의 부가, 또는 항원의 최적화, 또는 궁극적으로 GM-CSF의 부가 및 항원의 최적화에 의해 개선되는 것이 바람직하다.

정의에 의하면, DNA 백신은 활성 성분으로서 유전자 또는 유전자 단편, 예를 들면 에피토프를 코딩하고 발현시키는 플라스미드를 포함한다. 플라스미드란 용어는 발현시키고자 하는 유전자의 서열 및 그들의 생체내 발현에 필요한 요소를 포함 하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 전사 단위를 의미한다. 환형 플라스미드 형태, 슈퍼코일 형태 또는 그 밖의 형태가 바람직하다. 선형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

각 플라스미드는 숙주 세포 내에서 자신의 통제 하에 삽입된 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함한다. 인간 또는 쥐과 동물 기원의 강력한 진핵생물의 프로모터, 특히 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터(early promoter) CMV-IE가 일반적이고, 선택적으로는 래트 또는 기니아 피그와 같은 기타 기원의 것도 사용된다. 보다 일반적인 프로모터는 바이러스 기원 또는 세포 기원 중 하나의 것이다. CMV-IE 이외의 바이러스 프로모터의 예로는 SV40 바이러스의 초기 또는 후기 프로모터나 Rous Sarcoma 바이러스 LTR 프로모터를 들 수 있다. 또한, 유전자가 유래된 바이러스의 프로모터, 예를 들면 그 유전자에 대해 특이적인 프로모터일 수도 있다. 세포 프로모터의 예로는 예를 들면, 데스민(desmin) 프로모터와 같은 세포골격 유전자의 프로모터 또는 대안적으로 액틴 프로모터를 들 수 있다. 여러 종류의 유전자가 동일한 플라스미드 내에 존재하는 경우, 이들은 동일한 전사 단위체 또는 2개의 상이한 단위체로 제공될 수 있다.

제1 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 DNA 백신은 면역 보강제로서 하기 일 반식의 4급 암모늄염을 포함하는 양이온성 지질을 첨가하여 제형화된다.

상기 식에서,

R₁은 12개 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 포화되거나 불포화된 선형의 지방족 라디칼이고,

R₂는 2개 또는 3개의 탄소 원자를 함유하는 또 다른 지방족 라디칼이고,

X는 하이드록시기 또는 아민기이다.

천연 지질, 특히 DOPE(디올레오일포리파티딜에탄올아민)과 조합되어 DMRIE-DOPE를 형성하는 DMRIE(N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판암모늄; WO-A-9634109)이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 대상은 사육 동물, 특히 소 및 돼지를 공격하는 적어도 1종 병원체에 대한 DNA 백신으로서, 상기 DNA 백신은 생체내 발현이 가능한 조건 하에 관심 동물종의 병원체의 면역원을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 적어도 하나의 플라스미드, 그리고 4급 암모늄염, 바람직하게는 DOPE와 조합된 DMRIE를 함유하는 양이온성 지질을 포함한다:

재조합 벡터는 사용 직전, 바람직하게는 동물에 투여되기 전에 면역 보강제와 혼합하여, 얻어진 혼합물이 예를 들면 10분 내지 60분 동안, 특히 약 30분 동안 복합체를 형성하도록 하는 것이 바람직하다.

DOPE가 존재하는 경우, DMRIE:DOPE의 몰비는 바람직하게는 95:5 내지 5:95, 더욱 바람직하게는 1:1이다.

플라스미드:DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 면역 보강제의 중량비는 보다 구체적으로 50:1 내지 1:10, 특히 10:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:1 내지 1:2의 범위일 수 있다.

제2 양태에 따르면, GM-CSF(과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자; Clark S.C. et al., Science 1987, 230, 1229; Grant S. M. et al., Drugs 1992, 53, 516)가 본 발명에 따르는 백신에 첨가된다. 이는 생체내 발현이 가능한 조건 하에서 GM-CSF 단백질을 백신 조성물에 직접 혼입시키거나, 바람직하게는 GM-CSF를 코딩하는 서열을 발현 벡터에 삽입함으로써 수행될 수 있다. 발현 벡터로는 예를 들면 관심 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드 또는 다른 플라스미드와 같은 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. GM-CSF는 백신 접종하고자 하는 동물의 종에 따라 선택되는 것이 바람직하다. 그러므로, 소의 경우에는 소 GM-CSF가 사용되고, 돼지의 경우에는 돼지 GM-CSF가 사용된다.

제3 양태에 따르면, 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)은 최적화된 형태이다. 최적화(optimization)는 뉴클레오타이드 서열의 임의의 변형을 의미하는 것으로 이해되는데, 이는 특히 그 뉴클레오타이드 서열의 높은 발현 수준 및/또는 그 항원을 코딩하는 전령 RNA의 안정성 증가 및/또는 그 항원의 세포외 매질로의 개시된 분비 및 직접적 또는 간접적 결과로서 유도된 면역반응의 증가에 의해 자체로 나타난다.

본 발명에서, 관심 항원의 최적화는 관심 항원의 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실(결실은 막관통 도메인이 더 이상 또는 실질적으로 더 이상 기능을 갖지 못하게 하기에 충분한 완전 결실 또는 부분 결실을 의미하는 것으로 이해됨) 및/또는 프레임 내에 tPA(Montgomery et al., Cell. Mol. Biol., 1997, 43, 285-292; Harris et al., Mol. Biol. Med., 1986, 3, 279-292) 신호를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부가 및/또는 발현시키고자 하는 유전자의 상류에 위치하는 안정화 인트론의 삽입으로 이루어지는 것이 바람직하다. 관심 항원의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 이렇게 절단된 항원의 세포외 매질로의 분비를 촉진함으로써 그들이 면역계의 세포와 접촉할 가능성을 증가시킨다. tPA 신호를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입은 tPA 신호가 결합되는 전령 RNA의 번역(translatability)을 용이하게 함으로써 그 전령 RNA의 발현 수준 및 이에 따른 항원 생산을 증대시킨다. tPA 신호는 합성된 항원의 분비를 담당하기도 한다.

단일 펩타이드를 코딩하는 다른 뉴클레오타이드 서열, 특히 꿀벌로부터 얻어지는 멜리틴의 단일 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 사용할 수도 있다(Sisk W.P et al., 1994, J. Viol., 68, 766-775).

관심 항원을 코딩하는 유전자로의 안정화 인트론의 삽입은 그것의 전령 RNA의 이상 스플라이싱을 방지하고 후자의 물리적 완전성을 유지시킨다.

tPA 신호는 인간 기원의 것이 바람직하다. 인간 tPA 신호의 뉴클레오타이드 서열은 수탁 번호 NM_000930 하의 GenBank 데이터 베이스로부터 용이하게 이용할 수 있다. 인트론은 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ(van Ooyen et al., Science 1979, 206, 337-334)가 바람직한데, 이것의 뉴클레오타이드 서열은 수탁 번호 V00882 하의 GenBank 데이터 베이스로부터 용이하게 입수할 수 있으며, 참조로 인트론 번호 2로 지정되어 있다.

본 발명의 대상은 소에서 감염성 소 비기관염(IBR)에 대해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

감염성 소 비기관염의 원인이 되는 바이러스는 Alphaherpesviridae과의 일원인 소 헤르페스바이러스 타입 1(BHV-1)이다(Babiuk L.A. et al., 1996, Vet. Microbiol., 53, 31-42). 당단백질 gB, gC 및 gD를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 AJ004801 하에 GenBank 데이터베이스로부터 용이하게 입수 가능하다.

본 발명에 따르면, IBR에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 특히 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화하여 개선시키는 것이 바람직하다. 선택적으로, 이는 소 GM-CSF의 부가(Maliszewski et al., Molec. Immunol., 1998, 25, 843-850) 또는 적어도 하나의 IBR 항원의 최적화 중 하나, 또는 궁극적으로 소 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 IBR 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

소 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 수탁 번호 U22385 하에 GenBank 데이터베이스로부터 용이하게 입수할 수 있다.

소 GM-CSF는 소 GM-CSF 폴리펩타이드를 백신 조성물에 혼입하거나, 바람직하 게는 소 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생체내 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 삽입함으로써 부가될 수 있다. 소 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 IBR 항원(들)을 코딩하는 유전자(들)가 삽입된 것과는 상이한 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1032 실시예 13)로 삽입하는 것이 바람직하다.

IBR로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열에 의한, 당단백질 gB 및/또는 당단백질 gC 및/또는 당단백질 gD의 신호 펩타이드 서열의 치환, 및/또는 gB 및/또는 gC 및/또는 gD의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실에 의해 수행된다. 이들 당단백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분(당단백질의 세포질 부분)에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 IBR에 대한 DNA 백신은 최적화된 IBR 항원 중 하나(gB, gC 또는 gD), 혹은 이들 중 둘 또는 셋 모두, 즉 최적화된 gB, 최적화된 gC 및 최적화된 gD를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 IBR 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751229, 보다 구체적으로 실시예 7 및 실시예 8 그리고 도 3 및 도 4에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, BHV-1에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분 단편의 결실에 의해 최적화된 BHV-1 gB 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pPB281 실시예 3.1.2), 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분 단편의 결실에 의해 최적화된 BHV-1 gC 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pPB292 실시예 3.2.2), 그리고 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 BHV-1 gD 항원을 코딩하는 제3 발현 플라스미드(예를 들면, pPB284 실시예 3.3.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

일반적으로 BHV-1에 대해서만 제한되지 않고, 막관통 도메인을 코딩하는 서열과 인접한 C-말단 부분은 보존될 수 있다. 그러나, 이 부분은 흔히 막관통 도메인을 코딩하는 서열과 동시에 결실되기 쉽다.

본 발명의 대상은 또한 소에서 소 호흡기합포체 바이러스(BRSV)에 대해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

BRSV 바이러스는 Paramyxoviridae과의 일원인 파라믹소바이러스이다(Baker et al., Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 1997, 13, 425-454). F 단백질 및 G 당단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 Y17970 및 U33539 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

BRSV에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 특히 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화하여 개선시키는 것이 바람직하다. 선택적으로, 이는 소 GM-CSF의 부가 또는 적어도 하나의 BRSV 항원의 최적화 중 하나, 또는 궁극적으로 소 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 BRSV 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

소 GM-CSF의 부가는 BHV-1에 대해 기재한 바와 같이 수행할 수 있다.

BRSV로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열에 의한, BRSV의 F 단백질 및/또는 BRSV의 G 외피 당단백질의 신호 서열의 치환, 및/또는 F 및/또는 G의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실에 의해 수행된다. 이들 단백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 BRSV에 대한 DNA 백신은 최적화된 BRSV 항원 중 하나(F 또는 G) 또는 이들 둘 모두(F 및 G)를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 BRSV 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751229, 보다 구체적으로 실시예 9 및 실시예 10 그리고 도 5 및 도 6에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, BRSV에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, F의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입 및 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분 단편의 결실에 의해 최적화된 BRSV의 F 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pSB114 실시예 4.1.2), 그리고 G의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입 및 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분 단편의 결실에 의해 최적화된 BRSV의 G 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pSB110 실시예 4.2.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 대상은 또한 소에서 BVDV 바이러스에 대항하여 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

BVDV 바이러스는 Flaviviridae과의 페스티바이러스이다. 이 바이러스는 소 무리군 도처에 분포하며, 기형, 유산 또는 임상적인 호흡기(비강 질환) 및 위장(소 바이러스성 설사) 증후군에 의해 나타난다.

BVDV 바이러스는 임상 증상의 경중에 의해 구별되며, BVDV 타입 1(불분명하거나 가벼운 임상 징후) 및 BVDV 타입 2(급성 임상 징후, 출혈, 높은 질병률 및 높은 사망률)의 두 그룹으로 이루어진다(Dean H.J. 및 Leyh R., 1999, Vaccine, 17, 1117-1124).

BVDV 바이러스의 유형이 명료하게 명시되지 않은 경우, 이 바이러스는 타입 1 또는 2인 것으로 이해된다.

BVDV 바이러스는 절단 후, 잘 개별화된 여러 단백질, 보다 구체적으로는 E0 단백질(gp48) 및 E2 단백질(gp53)을 제공하는 다단백질(polyprotein)을 코딩하는 단일 유전자로 구성된 외피로 봉합된 단일-가닥 RNA 바이러스이다(Vassilev V.B. et al., 1997, J. Virol., 71, 471-478).

E0-E2 다단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, BVDV-1에 대해 수탁 번호 M96687 및 BVDV-2에 대해 수탁 번호 AF145967 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

BVDV에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 특히 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화하여 개선시키는 것이 바람직하다. 선택적으로, 이는 소 GM-CSF의 부가 또는 적어도 하나의 BVDV 항원의 최적화 중 하나, 또는 궁극적으로 소 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 BVDV 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

BVDV로부터 유래되는 항원의 최적화는 BVDV의 E0 단백질 및/또는 BVDV의 E2단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 상류에 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열의 부가, 및/또는 E2의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실, 및/또는 E0 및/또는 E2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 인트론, 특히 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 수행된다. 따라서, 본 발명에 따르는 BVDV에 대한 DNA 백신은 최적화된 BVDV 항원 중 하나(E0 또는 E2) 또는 이들 둘 모두(E0 및 E2)를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 BVDV 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751229, 보다 구체적으로 실시예 13 그리고 도 9에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, BVDV에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, E0의 상류에 인간 tPA의 신호 서열의 삽입 및 E0의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 BVDV의 E0 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1029 실시예 5.1.2, pLF1031 실시예 6.2.2), 그리고 E2의 상류에 인간 tPA의 신호 서열의 삽입, E2의 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실 및 E2의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 BVDV의 E2 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1021 실시예 5.2.2, pLF1023 실시예 6.1.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

플라스미드의 혼합물은 유용하게 제조될 수 있다. 혼합물은 상이한 면역원(E0 또는 E2)을 발현시키고/발현시키거나 상이한 BVDV 균주(예를 들면, BVDV-1 또는 BVDV-2)로부터 얻어지는 적어도 2개의 발현 플라스미드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 혼합물은 BVDV-1 E0, BVDV-1 E2, BVDV-2 E0 및 BVDV-2 E2를 발현시키는 4개의 플라스미드로 구성될 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 소에서 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(bPI-3)에 대항해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

bPI-3 바이러스는 Paramyxoviridae과의 일원인 Paramyxovirus이다(Tsai et al., Infect. Immun., 1975, 11, 783-803).

bPI-3의 융합 단백질(F) 및 헤마글루티닌과 뉴라미니다제 단백질(HN)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 U31671 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

bPI-3에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 특히 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되는 것이 바람직하다. 이것은 선택적으로 소 GM-CSF의 부가 또는 적어도 하나의 bPI-3 항원의 최적화 중 하나, 또는 궁극적으로 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 bPI-3 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

소 GM-CSF의 부가는 BHV-1에 대해 상기에 기재한 바와 같이 수행될 수 있다.

bPI-3로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열에 의한, bPI-3의 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 및/또는 bPI-3의 융합 단백질(F)의 신호 서열의 치환, 및/또는 HN 및/또는 F의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실, 및/또는 HN 및/또는 F를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 상류에 인트론, 특히 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 수행될 수 있다. 이들 단백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 bPI-3에 대한 DNA 백신은 최적화된 bPI-3 항원 중 하나(HN 또는 F) 또는 이들 둘 모두(HN 및 F)를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 bPI-3 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751229, 보다 구체적으로 실시예 14 및 실시예 15 그리고 도 10 및 도 11에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, bPI-3에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, HN의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입, 막관통 도메인을 코딩하는 HN의 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실 및 HN의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 bPI-3의 HN 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1025 실시예 7.1.2), 그리고 F의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입, F의 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실 및 F의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 bPI-3의 F 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1027 실시예 7.2.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 대상은 돼지에서 돼지 헤르페스바이러스(PRV)에 대해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

PRV 바이러스는 Alphaherpesviridae과의 일원으로, 오제스즈키병의 원인이 되는 바이러스이다(Sawitzky D., Arch. Virol. Suppl., 1997, 13, 201-206).

당단백질 gB, gC 및 gD을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 M17321. AF158090 및 AF086702 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

PRV에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 보다 구체적으로는 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되는 것이 바람직하다. 이것은 선택적으로 돼지 GM-CSF의 부가(Inumaru S. 및 Takamatsu H., Immunol. Coll. Biol., 1995, 73, 474-476) 또는 적어도 하나의 PRV 항원의 최적화 중 하나, 혹은 궁극적으로 돼지 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 PRV 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

돼지 GM-CSF의 부가는 돼지 GM-CSF 폴리펩타이드를 백신 조성물에 혼입하거나 (예를 들면, 수탁 번호 D21074 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능한) 돼지 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생체내 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 삽입함으로써 수행될 있다. 돼지 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 PRV 항원(들)을 코딩하는 유전자(들)가 삽입된 것과는 상이한 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1033 실시예 14)로 삽입하는 것이 바람직하다.

PRV로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열에 의한(GenBank 수탁 번호 NM_000930), 당단백질 gB 및/또는 당단백질 gC 및/또는 당단백질 gD의 신호 펩타이드 서열의 치환, 및/또는 gB 및/또는 gC 및/또는 gD의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실에 의해 수행된다. 이들 당단 백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 PRV에 대한 DNA 백신은 최적화된 PRV 항원 중 하나(gB, gC 또는 gD), 혹은 이들 중 둘 또는 셋 모두, 즉 최적화된 gB, 최적화된 gC 및 최적화된 gD를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 PRV 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751224, 보다 구체적으로 실시예 8 및 실시예 9 그리고 도 3 및 도 5에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, PRV에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 PRV의 gB 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pSB102 실시예 8.1.2), 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 PRV의 gC 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pSB104 실시예 8.2.2), 그리고 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 PRV의 gD 항원을 코딩하는 제3 발현 플라스미드(예를 들면, pSB106 실시예 8.3.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 대상은 또한 돼지에서 돼지 재생성 호흡 증후군 바이러스(PRRSV)에 대항해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

PRRSV 바이러스는 Arteriviridae과의 일원인 아르테리바이러스이다(Murtaugh et al., Arch. Virol., 1995, 140, 1451-1460).

오픈 리딩 프레임 ORF3, ORF5 및 ORF6에 의해 코딩되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 U87392 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

PRRSV에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 보다 구체적으로는 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되는 것이 바람직하다. 이것은 선택적으로 돼지 GM-CSF의 부가 또는 적어도 하나의 PRRSV 항원의 최적화 중 하나, 혹은 궁극적으로 돼지 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 PRRSV 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

돼지 GM-CSF의 부가는 PRV에 대해 상기에 기재한 바와 같이 수행될 수 있다.

PRRSV로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열(GenBank 수탁 번호 NM_000930)에 의한, 오픈 리딩 프레임 3 에 의해 코딩되는 단백질(ORF3, gp45 또는 거대 외피 당단백질) 및/또는 당단백질 ORF5(gp25 또는 외피 당단백질 E) 및/또는 당단백질 ORF6(gp18 또는 막 단백질)의 신호 펩타이드 서열의 치환, 및/또는 ORF3 및/또는 ORF5 및/또는 ORF6의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실에 의해 수행된다. 이들 당단백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 PRRSV에 대한 DNA 백신은 최적화된 PRRSV 항원 중 하나(ORF3, ORF5 또는 ORF6), 혹은 이들 중 둘 또는 셋 모두, 즉 최적화된 ORF3, 최적화된 ORF5 및 최적화된 ORF6을 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 PRRSV 항원을 코딩하 는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751224, 보다 구체적으로 실시예 14 내지 실시예 17 그리고 도 14 내지 도 17에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, PRRSV에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, PRRSV의 ORF3 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1009 실시예 9.1.1, pLF1015 실시예 10.1.1), 인간 tPA 신호 펩타이드 서열에 의한 ORF5의 신호 서열의 치환 및 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 PRRSV의 ORF5 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1012 실시예 9.2.2, pLF1018 실시예 10.2.2), 그리고 인간 tPA 신호 펩타이드 서열에 의한 ORF6의 신호 서열의 치환 및 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실에 의해 최적화된 PRRSV의 ORF6 항원을 코딩하는 제3 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1014 실시예 9.3.2, pLF1016 실시예 10.3.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

플라스미드의 혼합물은 유용하게 제조될 수 있다. 혼합물은 상이한 면역원(ORF3, ORF5 및 ORF6)을 발현시키고/발현시키거나 상이한 PRRSV 균주(예를 들면, European 균주, 예를 들면 Lelystad, American 균주 ATCC VR-2332)로부터 얻어지는 적어도 2개의 발현 플라스미드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 혼합물은 PRRSV Lelystad ORF3, PRRSV Lelystad ORF5, PRRSV Lelystad ORF6, PRRSV VR-2332 ORF3, PRRSV VR-2332 ORF5 및 PRRSV VR-2332 ORF6을 발현시키는 6개의 플라스미드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 돼지에서 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)에 대항해 유효한 방어 면역반응을 유도할 수 있는 개선된 DNA 백신이다.

SIV 바이러스는 Orthomyxoviridae과의 일원인 A군의 인플루엔자 바이러스이다(Murphy B.R. 및 Webster R.G., Virology, 2판, B.N. Fields 편저, D.M. Knipe et al., Raven Press Ltd., New York 1990).

SIV H1N1 및 H3N2 균주의 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 수탁 번호 K00992, U86145, U07146, AF153238 하에 GenBank 데이터베이스로부터 입수 가능하다.

SIV에 대한 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 보다 구체적으로는 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되는 것이 바람직하다. 이것은 선택적으로 돼지 GM-CSF의 부가 또는 적어도 하나의 SIV 항원의 최적화 중 하나, 혹은 궁극적으로 돼지 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 SIV 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

SIV로부터 유래되는 항원의 최적화는 "신호" 서열, 특히 인간 기원의 tPA 신호 서열에 의한, SIV 헤마글루티닌(HA) 및/또는 SIV 뉴라미니다제(NA) 단백질의 신호 서열의 치환, 및/또는 HA 및/또는 NA의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실, 및/또는 HA 및/또는 NA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 인트론, 특히 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 수행된다. 이들 단백질 중 하나의 막관통 도메인을 코딩하는 DNA 단편의 결실은 연속된 C-말단 부분에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따르는 SIV에 대한 DNA 백신은 최적화된 SIV 항원 중 하나(HA 또는 NA) 또는 이 둘 모두(HA 및 NA)를 코딩하고 발현시킬 수 있다.

다양한 발현 벡터 구조체 및 본 발명에 사용될 수 있는 SIV 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 및 FR-A1-2751224, 보다 구체적으로 SIV 균주 H1N1에 대해서는 실시예 10 및 실시예 11 그리고 도 7 및 도 9, 또한 SIV 균주 H3N2에 대해서는 실시예 12 및 실시예 13 그리고 도 11 및 도 13에 제시되어 있다.

본 발명에 따르면, SIV에 대한 DNA 백신은 DMRIE-DOPE와 함께 제형화되고, HA의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입, 막관통 도메인을 코딩하는 HA의 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실 및 HA의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 SIV의 HA 항원을 코딩하는 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1002 실시예 11.1.2, pLF1006 실시예 12.1.2), 그리고 NA의 신호 서열 대신 인간 tPA의 신호 서열의 삽입, 막관통 도메인을 코딩하는 NA의 뉴클레오타이드 서열의 단편과 연속된 C-말단 부분의 결실 및 NA의 상류에 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 삽입에 의해 최적화된 SIV의 NA 항원을 코딩하는 제2 발현 플라스미드(예를 들면, pLF1004 실시예 11.2.2, pLF1008 실시예 12.2.2)로 구성되는 것이 바람직하다.

플라스미드의 혼합물은 유용하게 제조될 수 있다. 혼합물은 상이한 면역원(HA 또는 NA)을 발현시키고/발현시키거나 상이한 SIV 균주(예를 들면, H1N1 또는 H3N2)로부터 얻어지는 적어도 2개의 발현 플라스미드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 혼합물은 SIV H1N1 HA, SIV H1N1 NA, SIV H3N2 HA 및 SIV H3N2 NA 를 발현시키는 4개의 플라스미드로 이루어질 수 있다.

본 발명은 특정 DNA 백신과 관련하여 설명되나, 본 발명 및 보다 구체적으로 본 발명에 따르는 아쥬번트의 사용은 이러한 동물종의 다른 병원체에 대항해 유도되는 DNA 백신에도 적용될 수 있다.

동일한 관점에서, 본 발명에 따르는 백신은 동물 종에 대해 서로 및/또는 동종의 다른 병원체에 대항하여 유도된 DNA 백신과 조합될 수 있다.

이러한 다른 병원체들은 보다 구체적으로 광견병 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스 및 돼지 파보바이러스일 수 있다.

광견병 바이러스에 대항하는 본 발명에 따르는 면역원성 제제 또는 개선된 DNA 백신은 특히 광견병 바이러스의 비변형된 G 당단백질을 코딩하는 플라스미드 및 DMIRE-DOPE 그리고 선택적으로 GM-CSF의 부가물을 포함한다.

돼지 파보바이러스에 대항해 유도되는 본 발명에 따르는 개선된 면역원성 제제 또는 DNA 백신은 보다 구체적으로 돼지 파보바이러스로부터 유래되는 항원을 코딩하는 플라스미드(예를 들면, VP2 단백질, FR-A1-2751224의 실시예 18 및 도 18) 및 DMIRE-DOPE 그리고 선택적으로 돼지 GM-CSF의 부가물(예를 들면, pLF1033, 실시예 14)을 포함한다.

돼지 콜레라 바이러스(HCV)에 대항하는 본 발명에 따르는 개선된 면역원성 제제 또는 DNA 백신은 보다 구체적으로 HCV으로부터 유래되는 항원을 코딩하는 플라스미드(예를 들면, E1 단백질, FR-A1-2751224의 실시예 19 및 도 19 또는 E2 단백질, FR-A1-2751224의 실시예 20 및 도 20) 및 DMIRE-DOPE 그리고 선택적으로 돼 지 GM-CSF의 부가물(예를 들면, pLF1033, 실시예 14)을 포함한다.

따라서, 본 발명의 대상은 또한 소에서 BHV-1, BRSV, BVDV, bPI-3 및 광견병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종의 소 병원체에 대항해 유효한 방어효과를 유도할 수 있는 개선된 다가 DNA 백신이다.

본 발명의 대상은 또한 돼지에서 PRV 바이러스, PRRSV 바이러스, SIV 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스(또는 HCV) 및 돼지 파보바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종의 돼지 병원체에 대항해 유효한 방어효과를 유도할 수 있는 개선된 다가 DNA 백신이다.

다가 DNA 백신은 본 발명에 따르는 면역 보강제, 특히 DMRIE, 바람직하게는 DMRIE-DOPE와 함께 제형화함으로써 개선시킬 수 있다. 이것은 선택적으로 상기에 기재된 GM-CSF의 부가 또는 상기에 기재된 적어도 하나의 관심 항원의 최적화 중 하나, 또는 궁극적으로 GM-CSF의 부가 및 적어도 하나의 관심 항원의 최적화와 조합될 수 있다.

본 발명에 따르는 개선된 다가 DNA 백신은 하나 이상의 발현 플라스미드로 구성됨으로써, 이들 백신이 동종의 동물을 감염하는 제1 병원체의 면역원 중 적어도 1종 및 동일 동물종을 감염시키는 적어도 1종의 다른 병원체의 면역원의 적어도 1종의 생체내 발현을 유도하도록 한다. 이들 면역원 중 적어도 1종은 하기의 군 중에서 선택되는 것이 바람직하다:

- 소의 경우, BRSV의 F, BRSV의 G, BHV-1의 gB, BHV-1의 gC, BHV-1의 gD, BVDV-1의 E0, BVDV-1의 E2, BVDV-2의 E0, BVDV-2의 E2, bPI-3의 F 및 bPI-3의 HN, 및

- 돼지의 경우, PRV의 gB, PRV의 gC, PRV의 gD, PRRSV 균주 Lelystad의 ORF3, PRRSV 균주 Lelystad의 ORF5, PRRSV 균주 Lelystad의 ORF6, PRRSV 균주 VR-2332의 ORF3, PRRSV 균주 VR-2332의 ORF5 및 PRRSV 균주 VR-2332의 ORF6, SIV 균주 H1N1의 HA, SIV 균주 H1N1의 NA, SIV 균주 H3N2의 HA 및 SIV 균주 H3N2의 NA.

본 발명에 따르는 개선된 1가 또는 다가 DNA 백신은 동종을 감염하는 상이한 병원체 중 적어도 1종의 상이한 병원체에 대항하여 유도되는 생체내 발현 벡터(예를 들면, 천연두 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스)를 이용하여 종래의 백신(불활성화 백신, 약독화 생백신, 서브유닛 백신) 또는 재조합 백신 중 적어도 하나와 조합하거나, 그러한 백신에 대한 추가 접종제(booster)로서 사용될 수 있다.

당업자는 이러한 소의 등가체를 함유하는 플라스미드의 제작 방법에 대해서는 FR-A1-2751229를 참조할 수 있으며, 돼지의 등가체를 함유하는 플라스미드의 제작 방법에 대해서는 FR-A1-2751224를 참조할 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 사육 동물, 특히 소 및 돼지를 백신 접종하는 방법에 관한 것이다. 상기 백신 접종 방법은 상기에 기재된 1가 또는 다가의 개선된 DNA 백신 중 하나를 투여하는 것을 포함한다. 이런 백신 접종 방법은 어린 동물 또는 어른 동물의 수동 전달을 위하여 암컷을 수태시키는 것과 관계 있다. 이런 백신 접종 방법은 개선된 DNA 백신을 1회 이상 투여하는 것을 포함한다.

본 발명에 따르는 백신에 사용되는 DNA의 양은 주어진 플라스미드에 대해 약 10 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 바람직하게는 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍이다. 당업자는 각각의 백신 접종 프로토콜에 사용하고자 하는 DNA의 유효한 1회 분량을 정확하게 판단할 수 있다.

1회 투여량의 부피는 0.2 내지 5 ㎖, 바람직하게는 1 내지 3 ㎖일 수 있다.

본 발명에 따르는 개선된 DNA 백신은 상기 백신 접종 방법과 관련하여, 폴리뉴크레오타이드 백신 접종을 위해 종래에 제안된 다양한 투여 경로 및 공지된 투여 기술에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 백신 접종 방법은 근육내 경로, 피하 경로, 또는 니들이 장착되지 않은 주사기를 이용해 경피 경로를 통해 본 발명에 따르는 개선된 DNA 백신을 투여하는 것을 포함한다.

이하에서 본 발명은 비제한적인 실시예로 주어진 구현예 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 자세히 설명된다.

도 1: 플라스미드 pVR1012

도 2: 플라스미드 pAB110

서열 목록

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SEQ ID NO 2: 올리고뉴클레오타이드 PB329

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SEQ ID NO 103: 올리고뉴클레오타이드 LF054

SEQ ID NO 104: 올리고뉴클레오타이드 LF055

SEQ ID NO 105: 올리고뉴클레오타이드 LF056

SEQ ID NO 106: 올리고뉴클레오타이드 LF057

관심 병원체 각각에 대해, 주요 표면 항원(천연 형태 및 변형된 형태)을 코딩하는 각각의 유전자는 진핵 생물의 발현 플라스미드 내에서의 특별한 제작 대상이었다. 분비된 형태의 표면 항원은 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 코딩하는 유전자의 단편을 결실시켜 얻었다. 모든 경우, 당단백질의 막관통 도메인은 해당 단백질 서열의 수치요법(hydropathy) 프로필(MacVector 6.5)을 기준으로 동정하였다.

실시예 1: 분자 생물학적 방법

1.1 바이러스 게놈 DNA의 추출

바이러스 현탁액을 37℃에서 2시간 동안 소듐 도데실 설페이트(SDS)(최종 농도 0.5%)의 존재 하의 프로테이나제 K(최종 농도 100 mg/㎖)로 처리하였다. 이어서, 바이러스 DNA를 페놀/클로로포름 혼합물을 이용해 추출한 뒤, -20℃에서 16시간 동안 2배 부피의 무수 에탄올로 침전시키고 4℃에서 15분 동안 10,000 g로 원심분리하였다. DNA 펠릿을 건조시키고, 최소 부피의 초고순도의 살균수에 넣었다.

1.2 바이러스 게놈 DNA의 분리

P. Chomczynski 및 N. Sacchi에 의한 "구아니디늄 티오시아네이트/페놀-클로로포름" 기술(Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159)을 이용하여 각 바이러스의 게놈 RNA를 추출하였다.

1.3 분자 생물학적 기술

모든 플라스미드는 Sambrook 등에 의한 표준 분자 생물학적 방법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)을 이용하여 제작하였다. 본 발명에 사용되는 모든 제한 단편은 "Geneclean" 키트(BIP0101 Inc., La Jolla, CA)를 이용하여 분리하였다. Sanger 방법(Sambrook et al., 1989)을 이용해 모든 구조체에 대해 클로닝된 DNA 단편 및 발현 벡터를 함유하는 접합체를 시퀀싱하였다.

1.4 PCR 및 RT-PCR

클로닝된 유전자 또는 유전자 단편에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 합성했는데, 이들 중 일부는 몇몇 경우 그들의 5' 말단에 증폭된 단편의 클로닝을 용이하게 하는 제한 자리를 함유하였다. 표준 방법(Sambrook et al., 1989)에 따라 역전사(RT) 반응 및 폴리머라이제 사슬연장 반응(PCR)을 수행하였다.

1.5 플라스미드의 대규모 정제

세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배법(Sambrook et al., 1989)을 이용하여 백신 조성물에 첨가되는 약 10 mg 규모의 정제된 플라스미드를 제조하였다.

실시예 2: 기본 플라스미드 구조체

플라스미드 pVR1012(WO-A-9803199의 도 1 및 실시예 7)로부터 유래된 진핵 생물 발현 플라스미드 pVR1020(C.J. Luke et al., J. of Infectious Disease, 1997, 175, 95-97)은 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 신호 서열의 코딩 상을 함유한다.

여러 클로닝 자리(BamHI, NotI, EcoRI, XbaI, PmlI, PstI, BglⅡ)를 함유하고 하기 올리고뉴클레오타이드의 짝짓기(pairing)로부터 얻어진 서열의 BamHI-BglⅡ 분해 및 삽입을 통해 플라스미드 pVR1020을 변형시켰다:

PB326(40량체; SEQ ID NO 1)

및

PB329(40량체; SEQ ID NO 2)

이렇게 얻어진 약 5105개 염기쌍(또는 bp) 크기를 갖는 벡터를 pAB110(도 2)으로 칭하였다.

주형으로서 토끼 말초 혈액 세포의 게놈 DNA를 사용하여 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR을 통해 상응하는 DNA 단편을 제작한 후, 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ를 벡터 pCRⅡ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 내로 클로닝하였다:

SB090(20량체; SEQ ID NO 3)

및

SB091(21량체; SEQ ID NO 4)

얻어진 플라스미드를 pNS050으로 지정하였다.

조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호 펩타이드의 ATG 상류에 위치하는 SalI 자리로 토끼 글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 서열을 도입하여 발현 플라스미드 pAB110을 변형시켰다. 토끼 글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 서열을 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용해 플라스미드 pNS050으로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시켰다:

LF001(30량체; SEQ ID NO 5)

및

LF002(30량체; SEQ ID NO 6)

PCR 산물(573 염기쌍 또는 bp)을 SalI을 이용해 분해시키고, SalI에 의해 사전 선형화된 플라스미드 pAB110 내로 클로닝하여 약 5678 bp의 플라스미드 pLF999를 제작하였다.

실시예 3: 다양한 형태의 소 헤르페스바이러스 타입 1(BHV-1) 항원을 코딩하는 플라스미드

BHV-1 B901 균주의 gB, gC 및 gD 유전자를 함유하는 바이러스 DNA의 단편을 다양한 제한 효소를 이용해 바이러스 게놈을 분해시키고, 아가로스 겔 전기영동으로 이를 분리하고, BHV-1 ST 균주의 gB, gC 및 gD 유전자의 단편에 상응하는 프로브(Leung-Tack P. et al., Viology, 1994, 199, 409-421)를 이용해 서던 블롯(southern Blotting)으로 분석해서 분리하였다. BHV-1 Colorado 균주[Cooper](ATCC 번호 VR-864)를 사용될 수도 있다. 이렇게 동정된 단편을 벡터 pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 내로 클로닝하여 발현 벡터 pVR1012 내로 이들 세 유전자의 클로닝 원점에 배치시켰다.

3.1 다양한 형태의 BHV-1 gB를 코딩하는 플라스미드

3.1.1. pPB280: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gB 유전자(천연 형태)

BHV-1 gB 유전자의 5' 및 3' 부위를 함유하는 2개의 XhoI-XhoI 단편을 서던 브롯으로 동정하고 XhoI으로 사전 분해된 벡터 pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 내로 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 각각 pPB128 및 pPB117로 지정하였다.

gB 유전자의 5' 단편을 함유하는 pPB128을 NotI 및 XhoI으로 분해해 1708 bp의 단편(단편 A)을 제작하였다.

gB 유전자의 3' 부위를 함유하는 플라스미드 pPB117을 XhoI 및 StuI으로 분해해 1345 bp의 단편을 제작하였다. 이 단편을 EcoRV 및 XhoI로 사전 분해된 pBluescript KS+(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 내로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 pPB279로 칭하였다. 이어서, 플라스미드 pPB279를 XhoI 및 BamHI으로 분해해 1413 bp의 DNA 단편(단편 B)을 제작하였다.

그런 다음, 단편 A 및 B를 NotI 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pBluescript KS+ 내로 클로닝하여 플라스미드 pPB278(약 6063 bp)을 제작하고 BHV-1 gB 유전자를 재구성하였다.

이어서, 벡터 pPB278을 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR 반응의 주형으로 제공하였다:

PB234(30량체; SEQ ID NO 7)

및

PB235(21량체; SEQ ID NO 8)

이어서, PCT 산물(146 bp)을 제한 효소 SalI 및 NheI으로 분해시켰다.

플라스미드 pPB278을 NheI 및 BamHI으로 분해시켰다. 이렇게 얻어진 2728 bp의 단편 및 사전 분해된 PCR 단편을 SalI 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2)에 결찰시켜 약 7742 bp 크기의 플라스미드 pPB280을 제작하였다.

BHV-1 gB 유전자는 933개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.1.2 pPB281: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gB 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gB 유전자의 (막관통(TM) 도메인 및 카르복시-말단(Cter) 도메인에 대해 결실된) 절단된 형태는 SalI 및 BamHI로 사전 분해된 플라스미드 pVR1012(실시예 2)에 플라스미드 pPB280(실시예 3.1.1)을 SalI-PvuⅡ로 분해한 후 얻어진 2234 bp 크기의 단편 및 하기 올리고뉴클레오타이드의 짝짓기에 의해 얻어진 56 bp의 단편을 결찰시켜 얻었다:

PB511(52량체; SEQ ID NO 9)

및

PB512(57량체; SEQ ID NO 10)

이렇게 제작된 플라스미드는 약 7154 bp의 크기를 가지며 pPB281이라 칭하였다. BHV-1의 절단된 gB 유전자는 759개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.1.3 pSB115: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gB 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gB 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태를 하기 프라이머를 이용해 주형 pPB281(실시예 3.1.2)로부터 PCR하여 증폭시켰다:

SB221(39량체; SEQ ID NO 11)

및

SB222(33량체; SEQ ID NO 12)

증폭 산물(2088 bp)을 EcoRV 및 BglⅡ로 분해하고, EcoRV 및 BglⅡ로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내에 클로닝하여 약 7154 bp 크기의 플라스미드 pSB115를 제작하였다.

gB 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 BHV-1 gB 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 729개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

3.2 다양한 형태의 BHV-1 gC를 코딩하는 플라스미드

3.2.1. pPB264: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gC 유전자(천연 형태)

완전한 BHV-1 gC 유전자를 함유하는 BamHI-HindⅢ 단편을 서던 브롯으로 동정하고 벡터 pBluescript SK+ 내로 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 pPB287로 지정하였다.

이어서, 플라스미드 pPB287을 NcoI-BssSI을 이용해 분해하였다. 1492 bp 크기의 분해 단편이 얻어졌다. 이것을 NcoI 및 XbaI으로 사전 분해된 플라스미드 pLitmus 28(New England Biolabs, Inc., Beverly, Ma, USA)에 하기 올리고뉴클레오타이드의 짝짓기에 의해 얻어진 합성 DNA 단편과 결찰시켜 중간체 플라스미드 pPB290을 제작하였다:

PB507(37량체; SEQ ID NO 13)

및

PB508(37량체; SEQ ID NO 14)

PstI 및 XbaI으로 pPB290을 분해시켜 얻은 1554 bp의 단편을 PstI 및 XbaI로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6427 bp 크기의 플라스미드 pB264를 제작하였다. BHV-1 gC 유전자는 508개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.2.2 pPB292: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gC 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gC 유전자의 절단된 형태는 PstI 및 XbaI으로 사전 분해된 플라스미드 pVR1012(실시예 2)에 하기의 DNA 단편 3개를 결찰시켜 얻었다.

(a) PstI 및 XhoI를 이용해 pPB264(실시예 3.2.1)를 분해시켜 얻은 1035 bp의 단편,

(b) XhoI 및 BanI을 이용해 pPB264를 분해시켜 얻은 350 bp의 단편, 및

(c) 올리고뉴클레오타이드 PB513 및 PB514의 짝짓기에 의해 얻어진 43 bp의 합성 단편.

이들 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:

PB513(43량체; SEQ ID NO 15)

및

PB514(43량체; SEQ ID NO 16)

이렇게 제작된 약 6305 bp 크기의 플라스미드를 pPB292라 칭하였다. BHV-1의 절단된 gC 유전자는 466개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.2.3 pSB116: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gC 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gC 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태를 하기 프라이머를 이용해 주형 pPB292(실시예 3.2.2)로부터 PCR하여 증폭시켰다:

SB223(39량체; SEQ ID NO 17)

및

SB224(32량체; SEQ ID NO 18)

증폭 산물(1362 bp)을 효소 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해하고, EcoRV 및 BglⅡ으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6404 bp 크기의 플라스미드 pSB116을 제작하였다.

gC 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 BHV-1 gC 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 479개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

3.3 다양한 형태의 BHV-1 gD를 코딩하는 플라스미드

3.3.1. pPB148: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gD 유전자(천연 형태)

BHV-1 gD 유전자를 함유하는 5 kb의 XhoI-XhoI 단편을 서던 브롯을 통해 동정하고 벡터 pBluescript SK+ 내로 클로닝하여 플라스미드 pPB147을 제작하였다.

이어서, NdeI 및 BsrBI을 이용해 pPB147을 분해시켜 얻은 325 bp의 단편 및 NdeI 및 StyI을 이용해 pPB147을 분해시켜 얻은 943 bp의 단편을 EcoRV 및 XbaI로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2)에 결찰시켜 약 6171 bp 크기의 플라스미드 pPB148을 제작하였다. 상기 BHV-1 gD 유전자는 417개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.2.2 pPB284: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gD 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gD 유전자의 절단된 형태는 하기 프라이머 쌍을 이용해 PstI 및 XbaI으로 사전 분해된 BHV-1 바이러스 B901 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 후 얻어진 단편으로부터 얻었다:

PB497(33량체; SEQ ID NO 19)

및

PB498(31량체; SEQ ID NO 20)

이어서, 이 PCR 단편을 PstI 및 XbaI으로 사전 분해된 플라스미드 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 5943 bp 크기의 플라스미드 pPB284를 제작하였다. 상기 BHV-1의 절단된 gD 유전자는 355개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

3.2.3 pSB117: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gD 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

BHV-1 gD 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 하기 프라이머를 이용해 주형 pPB284(실시예 3.3.2)로부터 PCR하여 증폭시켰다:

SB225(39량체; SEQ ID NO 21)

및

SB226(33량체; SEQ ID NO 22)

증폭 산물(1029 bp)은 효소 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해하고, EcoRV 및 BglⅡ으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6071 bp 크기의 플라스미드 pSB117을 제작하였다.

상기 gD 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 BHV-1 gD 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 368개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

실시예 4: 다양한 형태의 소 호흡기합포체바이러스(BRSV) 항원을 코딩하는 플라스미드

BRSV 바이러스의 F 및 G 항원을 코딩하는 유전자는 Snook 균주(Thomas et al., Research in Vet. Science, 1982, 33, 170-182)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다. BRSV A 51908 균주(ACCT 번호 VR-794)를 이용할 수도 있다.

4.1 다양한 형태의 BRSV-F를 코딩하는 플라스미드

4.1.1 pSB107: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 F 유전자(천연 형태)

BRSV Snook 균주의 F 유전자를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 RNA를 이용한 RT-PCR을 통해 증폭시켰다:

SB210(34량체; SEQ ID NO 23)

및

SB211(35량체; SEQ ID NO 24)

1739 bp 크기의 증폭 산물을 PstI 및 BamHI을 이용해 분해하고, 효소 PstI 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6583 bp 크기의 플라스미드 pSB107을 제작하였다.

상기 BRSV 바이러스의 F 유전자는 574개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

4.1.2 pSB108: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 F 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BRSV Snook 균주의 F 유전자의 절단된 형태는 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 RNA를 이용한 RT-PCR을 통해 증폭하였다:

SB210(SEQ ID NO 23) 및

SB212(39량체; SEQ ID NO 25)

증폭 산물(1581 bp)을 효소 PstI 및 BamHI을 이용해 분해하고, PstI 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6430 bp 크기의 플라스미드 pSB108을 제작하였다.

상기 BRSV 바이러스의 F 유전자의 절단된 형태는 BRSV F 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 523개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

4.1.3 pSB114: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 F 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BRSV Snook 균주의 F 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 RNA를 이용한 RT-PCR을 통해 증폭하였다:

SB212(SEQ ID NO 25) 및

SB220(38량체; SEQ ID NO 26)

증폭 산물(1516 bp)을 효소 PmlI 및 BglⅡ을 이용해 분해시키고, PmlI 및 BglⅡ로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6572 bp 크기의 플라스미드 pSB114를 제작하였다.

F 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 BRSV F 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 535개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

4.2 다양한 형태의 BRSV-G를 코딩하는 플라스미드

BRSV G 단백질(Ⅱ형 당단백질)의 경우, 신호 서열 및 막관통 서열은 막관통 도메인이 결실되는 동안 세포외 도메인에 해당하는 서열의 상류에 신호 서열의 부가가 요구된다는 점에서 식별이 불가능하다.

플라스미드 pAB110(실시예 2)은 BRSV G 단백질을 코딩하는 유전자의 절단된 형태를 함유하는 플라스미드의 제작에 사용된다.

4.2.1 pSB109: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 G 유전자(천연 형태)

BRSV Snook 균주의 G 유전자를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 RNA를 이용한 RT-PCR을 통해 증폭시켰다:

SB213(32량체; SEQ ID NO 27)

및

SB214(38량체; SEQ ID NO 28)

증폭 산물(784 bp)을 효소 SalI 및 XbaI을 이용해 분해시키고, SalI 및 XbaI로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 5661 bp 크기의 플라스미드 pSB109를 제작하였다.

BRSV G 유전자는 257개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

4.2.2 pSB110: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 G 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

BRSV Snook 균주의 G 유전자의 절단된 형태는 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 RNA를 이용한 RT-PCR을 통해 증폭하였다:

SB215(33량체; SEQ ID NO 29)

SB216(33량체; SEQ ID NO 30)

증폭 산물(666 bp)을 효소 BamHI 및 XbaI을 이용해 분해시키고, BamHI 및 XbaI으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 5660 bp 크기의 플라스미드 pSB110을 제작하였다.

BRSV 바이러스 G 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 조직 플라스미노겐 활성화인자의 신호 서열이 앞에 오고 G 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 218개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

실시예 5: 다양한 형태의 소 바이러스성 설사 바이러스 타입 1(BVDV-1) 항원을 코딩하는 플라스미드

BVDV-1 바이러스의 E0(48 kDa의 당단백질 또는 gp48) 및 E2(gp53) 항원을 코딩하는 유전자는 Osloss 균주(L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 1433-1438; A. Renard et al., DNA, 1985, 4, 439-438; A. Renard et al., Ann. Rech. Vet., 1987, 18, 121-125)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다. NADL(ACCT VR-534) 또는 New York(ACCT VR-524) 균주를 이용할 수도 있다.

5.1 다양한 형태의 BVDV-1 Osloss 균주의 E0을 코딩하는 플라스미드

5.1.1 pLF1028: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 E0 유전자(천연 형태)

Osloss 균주의 E0 유전자의 상보적인 DNA(cDNA)를 프라이머 LF051을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF050(36량체; SEQ ID NO 31)

및

LF051(40량체; SEQ ID NO 32)

SalI 및 BamHI을 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 765 bp 크기의 DNA 단편을 SalI 및 BamHI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4866 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1028(약 5636 bp)을 제작하였다. BVDV-1 균주 Osloss의 E0 유전자는 252개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

ATG 코돈을 올리고뉴클레오타이드 LF050의 서열에 도입하여 상응하는 재조합 E0 폴리펩타이드의 번역을 개시시켰다.

5.1.2 pLF1029: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 E0 유전자(β-글로빈 tPA-E0 형태)

E0 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1028 주형(실시예5.1.1)로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF052(39량체; SEQ ID NO 33)

및

LF053(40량체; SEQ ID NO 34)

NotI 및 BglⅡ를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 770 bp 크기의 DNA 단편을 NotI 및 BglⅡ을 이용해 pLF999를 분해시켜 얻은 5642 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1029(약 6417 bp)를 제작하였다.

이렇게 변형된 BVDV-1 균주 Osloss의 E0 유전자(β-글로빈 tPA-E0)는 283개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

5.2 다양한 형태의 BVDV 타입1 Osloss 균주의 E2를 코딩하는 플라스미드

5.2.1 pLF1020: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 E2 유전자(천연 형태)

Osloss 균주의 E2 유전자의 cDNA를 프라이머 LF040을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭하였다:

LF039(33량체; SEQ ID NO 35)

및

LF040(36량체; SEQ ID NO 36)

SalI 및 BglⅡ을 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1235 bp 크기의 DNA 단편 을 SalI 및 BglⅡ을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4860 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1020(약 6100 bp)을 제작하였다.

BVDV-1 균주 Osloss의 E2 유전자는 409개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

ATG 코돈을 올리고뉴클레오타이드 LF039의 서열에 도입하여 상응하는 재조합 E2 폴리펩타이드의 번역을 개시시켰다.

5.2.2 pLF1021: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 E2 유전자(β-글로빈 tPA-E2 Δ[TM-Cter] 형태)

막관통 도메인 및 카르복시 말단 도메인에 대해 결실된 E2 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1020 주형(실시예 5.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF041(35량체; SEQ ID NO 37)

및

LF042(35량체; SEQ ID NO 38)

NotI 및 BglⅡ를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 1132 bp 크기의 DNA 단편을 NotI 및 BglⅡ을 이용해 pLF999를 분해시켜 얻은 5642 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1021(약 6779 bp)을 제작하였다.

이렇게 변형된 BVDV-1 균주 Osloss의 E2 유전자(β-글로빈 tPA-E2 Δ[TM-Cter])는 404개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 6: 다양한 형태의 소 바이러스성 설사 바이러스 타입 2(BVDV-2) 항원을 코딩하는 플라스미드

BVDV 타입 2 바이러스의 E2 항원(gp53)을 코딩하는 유전자는 균주 890(J.F. Ridpath 및 S.R. Bolin, Virology, 1995, 212, 36-46)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다. 균주 Q140도 사용될 수 있으며, Quebec Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Armand-Frappier Institute(P. Tihssen et al., Virology, 1996, 217, 356-361)로부터 얻을 수 있다. 균주 1373 및 296도 사용될 수 있다(J.F. Ridpath, BVDV Research Project, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, USA).

6.1 다양한 형태의 BVDV-2 890 균주의 E2를 코딩하는 플라스미드

6.1.1 pLF1012: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 E2 유전자(천연 형태)

균주 890의 E2 유전자의 cDNA를 프라이머 LF040을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭하였다:

LF043(36량체; SEQ ID NO 39)

및

LF044(39량체; SEQ ID NO 40)

XbaI 및 BglⅡ를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1240 bp 크기의 DNA 단편을 XbaI 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4891 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1022(약 6136 bp)를 제작하였다.

BVDV-2 균주 890의 E2 유전자는 410개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

ATG 코돈을 올리고뉴클레오타이드 LF043 서열에 도입하여 상응하는 재조합 E2 폴리펩타이드의 번역을 개시시켰다.

6.1.2 pLF1023: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 E2 유전자(β-글로빈 tPA-E2 Δ[TM-Cter] 형태)

막관통 도메인 및 카르복시 말단 도메인에 대해 결실된 E2 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1022 주형(실시예 6.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF045(41량체; SEQ ID NO 41)

및

LF046(36량체; SEQ ID NO 42)

NotI 및 BglⅡ를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 1140 bp의 DNA 단편을 NotI 및 BglⅡ을 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5642 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1023(약 6787 bp)을 제작하였다.

이렇게 변형된 BVDV-2 균주 890의 E2 유전자(β-글로빈 tPA-E2 Δ[TM-Cter])는 405개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

6.2 다양한 형태의 BVDV-2 890 균주의 E0을 코딩하는 플라스미드

6.2.1 pLF1030: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 E0 유전자(천연 형태)

890 균주의 E0 유전자의 cDNA를 프라이머 LF065를 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF064(39량체; SEQ ID NO 43)

및

LF065(39량체; SEQ ID NO 44)

SalI 및 BamHI을 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 768 bp의 DNA 단편을 SalI 및 BamHI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4866 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1030(약 5639 bp)을 제작하였다. BVDV-2 균주 890의 E0 유전자는 253개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

ATG 코돈을 올리고뉴클레오타이드 LF064의 서열에 도입하여 상응하는 재조합 E0 폴리펩타이드의 번역을 개시시켰다.

6.2.2 pLF1031: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 E0 유전자(β-글로빈 tPA-E0 형태)

E0 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1030 주형(실시예6.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF066(42량체; SEQ ID NO 45)

LF067(39량체; SEQ ID NO 46)

NotI 및 BglⅡ를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 770 bp 크기의 DNA 단편을 NotI 및 BglⅡ를 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5642 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1031(약 6417 bp)을 제작하였다.

이렇게 변형된 BVDV-2 균주 890의 E0 유전자(β-글로빈 tPA-E0)는 283개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 7: 다양한 형태의 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(bPI-3) 항원을 코딩하는 플라스미드

bPI-3 바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 및 융합(F) 항원을 코딩하는 유전자는 Reisinger SF-4 균주(수탁 번호 VR-281 하에 ATCC로부터 입수 가능)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다.

7.1 다양한 형태의 bPI-3 SF-4 균주의 HN을 코딩하는 플라스미드

7.1.1 pLF1024: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 HN 유전자(천연 형태)

SF-4 균주의 HN 유전자의 cDNA를 프라이머 LF048을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF047(39량체; SEQ ID NO 47)

및

LF048(38량체; SEQ ID NO 48)

SalI 및 EcoRV을 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1726 bp 크기의 DNA 단편 을 SalI 및 EcoRV를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4896 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1024(약 6619 bp)를 제작하였다.

bPI-3 HN 유전자는 572개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

7.1.2 pLF1025: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 HN 유전자(β-글로빈 tPA-HN Δ[TM] 형태)

막관통 도메인 및 카르복시 말단 도메인에 대해 결실된 HN 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1024 주형(실시예 7.1.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF058(33량체; SEQ ID NO 49)

및

LF059(35량체; SEQ ID NO 50)

NotI 및 EcoRV를 이용해 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 1566 bp의 DNA 단편을 NotI 및 EcoRV을 이용해 pLF999를 분해시켜 얻은 5663 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1025(약 7229 bp)를 제작하였다.

이렇게 변형된 bPI-3 HN 유전자(β-글로빈 tPA-HN Δ[TM])는 548개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

7.2 다양한 형태의 bPI-3 SF-4 균주의 F를 코딩하는 플라스미드

7.2.1 pLF1026: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 F 유전자(천연 형태)

균주 SF-4의 F 유전자의 cDNA를 프라이머 LF061을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF060(36량체; SEQ ID NO 51)

LF061(36량체; SEQ ID NO 52)

SalI 및 BglⅡ을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 1628 bp의 DNA 단편을 SalI 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4860 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1026(약 6488 bp)을 제작하였다.

bPI-3 F 유전자는 550개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

7.2.2 pLF1027: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 F 유전자(β-글로빈 tPA-F Δ[TM+Cter] 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 F 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLR1026 주형(실시예 7.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF062(42량체; SEQ ID NO 53)

및

LF063(41량체; SEQ ID NO 54)

NotI 및 EcoRV를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 1434 bp 크기의 DNA 단편을 NotI 및 EcoRV를 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5663 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1027(약 7097 bp)을 제작하였다.

이렇게 변형된 bPI-3 F 유전자(β-글로빈 tPA-F Δ[TM-Cter])는 504개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 8: 다양한 형태의 유사광견병 바이러스(PRV) 항원을 코딩하는 플라스미드

PRV 당단백질 gB, gC 및 gD를 코딩하는 유전자는 NIA3 균주(M. Riviere et al., J. Virol. 66, 3424-3434; A. Baskerville et al., The Veterinary Bulletin, 1973, 43 No. 9)의 바이러스 DNA로부터 PCR하여 얻었다. PRV NIA3 균주의 돌연변이를 사용할 수도 있으며, 이는 France Paris 소재의 Collection National de Cultures de Microorganismes(CNCM), Institute Pasteur에 참고번호 I-351 및 I352 하에 기탁되어 있다.

8.1 다양한 형태의 PRV gB를 코딩하는 플라스미드

8.1.1. pSB101: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gB 유전자(천연 형태)

PRV NIA3 균주의 gB 유전자를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB201(36량체; SEQ ID NO 55)

SB202(39량체; SEQ ID NO 56)

증폭 산물(2766 bp)을 효소 EcoRV 및 BamHI을 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2)에 결찰시켜 약 7631 bp 크기의 플라스미드 pSB101을 제작하였다.

PRV gB 유전자는 913개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.1.2 pSB102: 벡터 pVR1012 벡터 내로 클로닝된 gB 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gB 유전자의 절단된 형태를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB201(SEQ ID NO 55) 및

SB203(39량체; SEQ ID NO 57)

증폭 산물(2262 bp)을 효소 EcoRV 및 BamHI을 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2)에 결찰시켜 약 7142 bp 크기의 플라스미드 pSB102를 제작하였다.

gB 유전자의 절단된 형태(Δ[TM-Cter])는 PVR gB 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 750개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.1.3 pNS009: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gB 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gB 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태를 하기 프라이머를 이용해 주형 pSB101(실시예 8.1.1)로부터 PCR하여 증폭시켰다:

SB203(SEQ ID NO 57) 및

SB217(39량체; SEQ ID NO 58)

증폭 산물(2088 bp)을 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BglⅡ으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 7127 bp 크기의 플라스미드 pNS009를 제작하였다.

gB 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 PRV gB 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 720개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.2 다양한 형태의 PRV gC를 코딩하는 플라스미드

8.2.1. pSB103: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gC 유전자(천연 형태)

PRV NIA3 균주의 gC 유전자를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB204(36량체; SEQ ID NO 59)

및

SB205(37량체; SEQ ID NO 60)

증폭 산물(1452 bp)을 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BglⅡ으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6323 bp 크기의 플라스미드 pSB103을 제작하였다.

PRV gB 유전자는 479개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.2.2 pSB104: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gC 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gC 유전자의 절단된 형태를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB204(SEQ ID NO 59), 및

SB206(36량체; SEQ ID NO 61)

증폭 산물(1332 bp)을 효소 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BglⅡ로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2)에 결찰시켜 약 6206 bp 크기의 플라스미드 pSB104를 제작하였다.

gC 유전자의 절단된 형태(Δ[TM-Cter])는 PVR gC 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 440개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.2.3 pNS012: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gC 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gC 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 pSB103(실시예 8.2.1)을 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB206(SEQ ID NO 61) 및

SB218(39량체; SEQ ID NO 62)

증폭 산물(1270 bp)을 효소 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BglⅡ으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6311 bp 크기의 플라스미드 pNS012를 제작하였다.

gC 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 PRV gC 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 448개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.3 다양한 형태의 PRV gD를 코딩하는 플라스미드

8.3.1. pSB105: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gD 유전자(천연 형태)

PRV NIA3 균주의 gD 유전자를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용해 PCR하여 증폭시켰다:

SB207(36량체; SEQ ID NO 63)

및

SB208(36량체; SEQ ID NO 64)

증폭 산물(1227 bp)을 효소 EcoRV 및 BamHI를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6014 bp 크기의 플라스미드 pSB105를 제작하였다.

PRV gD 유전자는 404개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.3.2 pSB106: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 gD 유전자(Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gD 유전자의 절단된 형태를 하기 프라이머를 이용하고 주형 으로서 바이러스 DNA를 이용한 PCR을 통해 증폭시켰다:

SB207(SEQ ID NO 63), 및

SB209(40량체; SEQ ID NO 65)

증폭 산물(10777 bp)을 효소 EcoRV 및 BamHI를 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pVR1012(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 5957 bp 크기의 플라스미드 pSB106을 제작하였다.

gD 유전자의 절단된 형태(Δ[TM-Cter])는 PRV gD 당단백질의 세포외 도메인을 함유하는 355개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

8.3.3 pPB238: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 gD 유전자(tPA Δ[TM-Cter] 형태)

PRV NIA3 균주의 gD 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태를 하기 프라이머를 이용하고 주형으로서 바이러스 DNA를 이용한 PCR을 통해 증폭시켰다:

SB209(SEQ ID NO 65) 및

SB219(39량체; SEQ ID NO 66)

증폭 산물(1015 bp)을 효소 EcoRV 및 BamHI을 이용해 분해시키고, EcoRV 및 BamHI으로 사전 분해된 벡터 pAB110(실시예 2) 내로 클로닝하여 약 6056 bp 크기의 플라스미드 pPB238을 제작하였다.

gD 유전자의 tPA Δ[TM-Cter] 형태는 PRV gD 당단백질의 세포외 도메인을 함 유하는 363개 아미노산의 당단백질을 코딩한다.

실시예 9: 다양한 형태의 돼지 재생성 호흡 증후군 바이러스(PRRSV) 균주 Lelystad 항원을 코딩하는 플라스미드

PRRSV ORF3, ORF5 및 ORF6 단백질을 코딩하는 유전자는 France Paris 소재의 Collection National de Cultures de Microorganismes(CNCM), Institute Pasteur에 참고번호 I-1102 하에 기탁되어 있는 Lelystad 균주(J. Meulenberg et al., Viology, 1993, 19, 62-72; WO-A-92-21375)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다.

9.1 다양한 형태의 PRRSV Lelystad 균주 ORF3을 코딩하는 플라스미드

9.1.1 pLF1009: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF3 유전자(천연 형태)

Lelystad 균주의 ORF3 유전자의 cDNA를 프라이머 LF028을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF027(30량체; SEQ ID NO 67)

및

LF028(30량체; SEQ ID NO 68)

EcoRV 및 BglⅡ을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 802 bp 크기의 DNA 단편을 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4879 bp의 단편에 결찰시켜 약 5681 bp 크기의 플라스미드 pLF1009를 제작하였다.

PRRSV Lelystad ORF3 유전자는 265개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

9.2 다양한 형태의 PRRSV Lelystad 균주 ORF5를 코딩하는 플라스미드

9.2.1 pLF1011: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF5 유전자(천연 형태)

Lelystad 균주의 ORF5 유전자의 cDNA를 프라이머 LF020을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF019(30량체; SEQ ID NO 69)

및

LF020(30량체; SEQ ID NO 70)

SalI 및 XbaI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 802 bp의 DNA 단편을 SalI 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4879 bp의 단편에 결찰시켜 약 5681 bp 크기의 플라스미드 pLF1011을 제작하였다.

PRRSV Lelystad ORF5 유전자는 201개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

9.2.2 pLF1012: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 ORF5 유전자(절단된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 ORF5 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1011 주형(실시예 9.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF021(30량체; SEQ ID NO 71)

LF022(33량체; SEQ ID NO 72)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 432 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pAB110(실시예 2)을 분해시켜 얻은 5105 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 약 5537 bp 크기의 pLF1012를 제작하였다.

이렇게 변형된 PRRSV Lelystad ORF5 유전자(tPA Δ[TM-Cter])는 168개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

9.3 다양한 형태의 PRRSV Lelystad 균주 ORF6을 코딩하는 플라스미드

9.3.1 pLF1013: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF6 유전자(천연 형태)

Lelystad 균주의 ORF6 유전자의 cDNA를 프라이머 LF024를 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF023(30량체; SEQ ID NO 73)

및

LF024(30량체; SEQ ID NO 74)

SalI 및 XbaI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 528 bp의 DNA 단 편을 SalI 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4881 bp의 단편에 결찰시켜 약 5409 bp 크기의 플라스미드 pLF1013을 제작하였다.

PRRSV Lelystad ORF6 유전자는 173개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

9.3.2 pLF1014: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 ORF6 유전자(절단된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 ORF6 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1013 주형(실시예 9.3.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF025(30량체; SEQ ID NO 75)

LF026(33량체; SEQ ID NO 76)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 390 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pAB110(실시예 2)을 분해시켜 얻은 5105 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 약 5495 bp 크기의 pLF1014를 제작하였다.

이렇게 변형된 PRRSV Lelystad ORF6 유전자(tPA Δ[TM-Cter])는 154개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 10: 다양한 형태의 돼지 재생성 호흡 증후군 바이러스(PRRSV) American 균주 ATCC VR-2332 항원을 코딩하는 플라스미드

PRRSV ORF3, ORF5 및 ORF6 단백질을 코딩하는 유전자는 수탁 번호 VR-2332 하에 ATCC에 기탁되어 있는 American 균주(M. Murtaugh et al., Arch Virol. 1995, 140, 1451-1460)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다.

10.1 다양한 형태의 PRRSV VR-2332 균주 ORF3을 코딩하는 플라스미드

10.1.1 pLF1015: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF3 유전자(천연 형태)

VR-2332 균주 ORF3 유전자의 cDNA를 프라이머 LF038을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF037(30량체; SEQ ID NO 77)

및

LF038(30량체; SEQ ID NO 78)

EcoRV 및 XbaI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 769 bp 크기의 DNA 단편을 EcoRV 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4900 bp의 단편에 결찰시켜 약 5669 bp 크기의 플라스미드 pLF1015를 제작하였다.

PRRSV 균주 VR-2332 ORF3 유전자는 254개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

10.2 다양한 형태의 PRRSV VR-2332 균주 ORF5를 코딩하는 플라스미드

10.2.1 pLF1017: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF5 유전자(천연 형태)

VR-2332 균주 ORF5 유전자의 cDNA를 프라이머 LF030을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF029(30량체; SEQ ID NO 79)

및

LF030(30량체; SEQ ID NO 80)

EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 607 bp의 DNA 단편을 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4879 bp의 단편에 결찰시켜 약 5486 bp 크기의 플라스미드 pLF1017을 제작하였다.

PRRSV 균주 VR-2332 ORF5 유전자는 200개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

10.2.2 pLF1018: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 ORF5 유전자(절단된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 ORF5 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1017 주형(실시예 10.2.1)으로부터 PCR하여 합성하였다:

LF031(33량체; SEQ ID NO 81)

및

LF032(33량체; SEQ ID NO 82)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 426 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pAB110(실시예 2)을 분해시켜 얻은 5105 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 약 5531 bp 크기의 pLF1018을 제작하였다.

이렇게 변형된 PRRSV 균주 VR-2332 ORF5 유전자(tPA Δ[TM-Cter])는 166개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

10.3 다양한 형태의 PRRSV VR-2332 균주 ORF6을 코딩하는 플라스미드

10.3.1 pLF1019: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 ORF6 유전자(천연 형태)

VR-2332 균주 ORF6 유전자의 cDNA를 프라이머 LF034를 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF033(33량체; SEQ ID NO 83)

및

LF034(30량체; SEQ ID NO 84)

PstI 및 XbaI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 약 527 bp의 DNA 단편을 PstI 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4871 bp의 단편에 결찰시켜 약 5398 bp 크기의 플라스미드 pLF1019를 제작하였다.

PRRSV 균주 VR-2332 ORF6 유전자는 174개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

10.3.2 pLF1016: 벡터 pAB110 내로 클로닝된 ORF6 유전자(절단된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 ORF6 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1019 주형(실시예 10.3.1)으로부터 PCR하여 합성하였다:

LF035(30량체; SEQ ID NO 85)

및

LF036(33량체; SEQ ID NO 86)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 390 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pAB110(실시예 2)을 분해시켜 얻은 5105 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 약 5495 bp 크기의 pLF1016을 제작하였다.

이렇게 변형된 PRRSV 균주 VR-2332 ORF6 유전자(tPA Δ[TM-Cter])는 154개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 11: 다양한 형태의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 균주 H1N1 항원을 코딩하는 플라스미드

돼지 인플루엔자 바이러스 타입 H1N1의 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)를 코딩하는 유전자는 "SW" H1N1 균주의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다. 이들 균주는 Viology Research Center, Armand-Frappier Institute, University of Quebec, Laval, Canada(D.S. Arora et al., Virus Genes, 1997, 14, 251-254)로부터 입수 가능하다. G.W. Both et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 6996-7000도 참조한다.

11.1 다양한 형태의 SIV H1N1 균주 HA을 코딩하는 플라스미드

11.1.1 pLF1001: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 HA 유전자(천연 형태)

H1N1 균주의 HA 유전자의 cDNA를 프라이머 LF004를 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF003(30량체; SEQ ID NO 87)

및

LF004(30량체; SEQ ID NO 88)

EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1705 bp 크기의 DNA 단편을 EcoRV 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4879 bp의 단편에 결찰시켜 약 6584 bp 크기의 플라스미드 pLF1001을 제작하였다.

SIV H1N1 HA 유전자는 566개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

11.1.2 pLF1002: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 HA 유전자(변형된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 HA 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1001 주형(실시예 11.1.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF005(30량체; SEQ ID NO 89)

및

LF006(32량체; SEQ ID NO 90)

NotI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1515 bp의 DNA 단편을 NotI을 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5678 bp의 단편에 결찰시켜 약 7193 bp 크기의 플라스미드 pLF1002를 제작하였다.

이렇게 변형된 SIV H1N1 HA 유전자(토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ, tPA Δ[TM-Cter])는 530개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

11.2 다양한 형태의 SIV H1N1 균주 NA을 코딩하는 플라스미드

11.2.1 pLF1003: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 NA 유전자(천연 형태)

H1N1 균주의 NA 유전자의 cDNA를 프라이머 LF008을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF007(30량체; SEQ ID NO 91)

및

LF008(30량체; SEQ ID NO 92)

SalI 및 XbaI를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1416 bp 크기의 DNA 단편을 SalI 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4881 bp의 단편에 결찰시켜 약 6297 bp 크기의 플라스미드 pLF1003을 제작하였다.

SIV H1N1 NA 유전자는 469개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

11.2.2 pLF1004: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 NA 유전자(변형된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 NA 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1003 주형으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF009(31량체; SEQ ID NO 93)

및

LF010(30량체; SEQ ID NO 94)

EcoRI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1207 bp의 DNA 단편을 EcoRI을 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5678 bp의 단편에 결찰시켜 약 6885 bp 크기의 플라스미드 pLF1004를 제작하였다.

이렇게 변형된 SIV H1N1 NA 유전자(t토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ, PA Δ[TM-Cter])는 431개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 12: 다양한 형태의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 균주 H3N2 항원을 코딩하는 플라스미드

타입 H3N2의 돼지 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA를 코딩하는 유전자는 World Health Organization(WHO)에 의해 참조되고 National Influenza Reference Center, Viology Laboratory(8 avenue Rockfeller, 69008 Lyon, France)로부터 입수 가능한 "Cotes du Nord 1987"(cdn87)의 바이러스 RNA로부터 RT-PCR하여 얻었다.

12.1 다양한 형태의 SIV H3N2 균주 HA을 코딩하는 플라스미드

12.1.1 pLF1005: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 HA 유전자(천연 형태)

H3N2 균주의 HA 유전자의 cDNA를 프라이머 LF012를 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF011(30량체; SEQ ID NO 95)

및

LF012(24량체; SEQ ID NO 96)

EcoRV 및 SalI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1709 bp 크기의 DNA 단편을 EcoRV 및 SalI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4893 bp의 단편에 결찰시켜 약 6602 bp 크기의 플라스미드 pLF1005를 제작하였다.

SIV H3N2 HA 유전자는 566개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

12.1.2 pLF1006: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 HA 유전자(변형된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 HA 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1005 주형(실시예 12.1.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF013(33량체; SEQ ID NO 97)

및

LF014(33량체; SEQ ID NO 98)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1542 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5678 bp의 단편에 결찰시켜 약 7220 bp 크기의 플라스미드 pLF1006을 제작하였다.

이렇게 변형된 SIV H3N2 HA 유전자(토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ, tPA Δ[TM-Cter])는 538개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

12.2 다양한 형태의 SIV H3N2 균주 NA을 코딩하는 플라스미드

12.2.1 pLF1007: 벡터 pVR1012 내로 클로닝된 NA 유전자(천연 형태)

H3N2 균주의 NA 유전자의 cDNA를 프라이머 LF016을 이용해 상응하는 바이러스 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭시켰다:

LF015(30량체; SEQ ID NO 99)

및

LF016(30량체; SEQ ID NO 100)

EcoRV 및 XbaI를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1414 bp 크기의 DNA 단편을 EcoRV 및 XbaI을 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4900 bp의 단편에 결찰시켜 약 6314 bp 크기의 플라스미드 pLF1007을 제작하였다.

SIV H3N2 NA 유전자는 469개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

12.2.2 pLF1008: 벡터 pLF999 내로 클로닝된 NA 유전자(변형된 형태)

막관통 도메인 및 C-말단 도메인에 대해 결실된 NA 유전자를 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 pLF1005 주형(실시예 12.2.1)으로부터 PCR 반응시켜 합성하였다:

LF017(33량체; SEQ ID NO 101)

및

LF018(33량체; SEQ ID NO 102)

BamHI을 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 1221 bp의 DNA 단편을 BamHI을 이용해 pLF999(실시예 2)를 분해시켜 얻은 5678 bp의 단편에 결찰시켜 약 6899 bp 크기의 플라스미드 pLF1008을 제작하였다.

이렇게 변형된 SIV H3N2 NA 유전자(토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ, tPA Δ[TM-Cter])는 431개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 13: 소 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드

소 GM-CSF 유전자의 cDNA를 소 혈액 단핵화 세포의 세포 RNA로부터 합성하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 PCR 반응하여 증폭시켰다:

LF054(36량체; SEQ ID NO 103)

및

LF055(34량체; SEQ ID NO 104)

SalI 및 BglⅡ를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 437 bp의 DNA 단편을 SalI 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4860 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1032(약 5297 bp)를 제작하였다. 소 GM-CSF 유전자는 143개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 14: 돼지 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드

돼지 GM-CSF 유전자의 cDNA를 돼지 혈액 단핵화 세포의 세포 RNA로부터 합성 하고, 하기 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용해 PCR 반응하여 증폭시켰다:

LF056(36량체; SEQ ID NO 105)

및

LF057(37량체; SEQ ID NO 106)

SalI 및 BglⅡ를 이용해 상기 PCR 산물을 분해시켜 얻은 440 bp의 DNA 단편을 SalI 및 BglⅡ를 이용해 pVR1012(실시예 2)를 분해시켜 얻은 4860 bp의 단편에 결찰시켜 플라스미드 pLF1033(약 5300 bp)을 제작하였다. 돼지 GM-CSF 유전자는 144개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

실시예 15: 백신 플라스미드의 제형화

실시예 3 내지 14에 따르는 하나 이상의 플라스미드를 함유하는 DNA 용액을 Sambrook 등에 의한 에탄올 침전법(1989)을 이용해 농축시켰다. DNA 펠릿을 0.9%의 NaCl 용액에 넣어 1 mg/㎖ 농도로 만들었다. 적당량의 멸균수에 DMRIE-DOPE 냉동건조체를 넣어 0.75 mM DMRIE-DOPE 용액을 제조하였다.

상기 0.75 mM DMRIE-DOPE 용액을 동량 부(equal part)의 0.9 % NaCl 내의 DNA 용액으로 희석하여 플라스미드 DNA-지질 복합체를 만들었다. 상기 DNA 용액을 주름진 26G 니들을 이용해 양이온성 지질 용액을 함유하는 바이러스의 벽을 따라 점진적으로 주입하여 기포 형성을 방지하였다. 두 용액이 혼합될 때까지 적당히 교반하여, 0.375 mM의 DMRIE-DOPE 및 500 ㎍/㎖의 플라스미드를 포함하는 조성물을 얻었다.

상기에 기재된 모든 조작 과정에 사용된 모든 용액은 실온의 것이 바람직하다. 동물에게 면역 접종하기 전 30분 동안 실온에서 DNA/DMRIE-DOPE 복합체를 형성시킨다.

실시예 16: BHV-1에 대한 소의 면역화

12마리의 소를 그룹당 4마리씩 3그룹으로 무작위적으로 나누었다.

그룹 1은 대조군 동물 그룹을 구성한다.

백신 플라스미드 pPB281(Δ[TM-Cter] 형태의 BHV-1 gB 코딩, 실시예 3.1.2), pPB292(Δ[TM-Cter] 형태의 BHV-1 gC 코딩, 실시예 3.2.2) 및 pPB284(Δ[TM-Cter] 형태의 BHV-1 gD 코딩, 실시예 3.3.2)의 혼합물을 그룹 2의 동물에게 투여하였다.

실시예 15에 기재된 바와 같이 DMRIE-DOPE와 함께 제형화된 것을 제외하고는 그룹 2에서와 동일한 혼합물을 그룹 3의 동물에게 투여하였다.

니들이 장착된 주사기를 이용해 근육내 경로를 통해 10 ㎖ 주사액을 각각의 소에게 투여하고, 21일 후 반복하였다. 각각의 면역화에 사용된 각 플라스미드의 총 질량은 1500 ㎍이었다.

당업자는 요구되는 플라스미드의 용량에 따라 부피 또는 농도를 조절할 수 있는 능력이 있다.

1차 백신 접종 후 35일 동안 BHV-1 gB, gC 및 gD 항원을 발현시키는 백신 플라스미드의 두 혼합물에 의해 유도되는 혈청학적 반응을 관찰하였다.

결과를 하기 표에 나타내었다:

실시예 17: PRV에 대한 돼지의 면역화

생후 약 7주된 15마리의 소를 그룹당 5마리씩 3그룹으로 무작위적으로 나누었다.

그룹 1은 대조군 동물 그룹을 구성한다.

백신 플라스미드 pNS009(tPA Δ[TM-Cter] 형태의 PRV gB 코딩, 실시예 8.1.3), pNS012(tPA Δ[TM-Cter] 형태의 PRV gC 코딩, 실시예 8.2.3) 및 pPB238(tPA Δ[TM-Cter] 형태의 PRV gD 코딩, 실시예 8.3.3)의 혼합물을 그룹 2의 동물에게 투여하였다.

실시예 15에 기재된 바와 같이 DMRIE-DOPE와 함께 제형화된 것을 제외하고는 그룹 2에서와 동일한 혼합물을 그룹 2의 동물에게 투여하여 최종 DMRIE-DOPE 농도 0.0535 mM을 얻었다.

이러한 백신 접종 프로토콜에 필요한 각각의 플라스미드 350 ㎍을 최종 14 ㎖의 부피로 혼합하였다.

니들이 장착된 주사기를 이용해 근육내 경로를 통해 2 ㎖ 주사액을 각각의 돼지에게 투여하고, 21일 후 반복하였다.

10^7.76 CCID₅₀/㎖의 역치를 갖는 PRV 균주 NIA3 추가 접종 바이러스의 용액 2 ㎖를 콧구멍당 1㎖의 양으로 비강을 통해 투여하여 돼지를 추가 접종하였다.

1차 백신 접종 후 42일 동안 각 동물의 체중을 관찰하였다.

상대적인 체중 증가(G7)는 추가 접종 직후 7일 동안 각 동물에 대해 산출하였다. 이는 추가 접종일의 체중으로 나눈 7일째의 체중(D7)과 추가 접종일의 체중(D0) 사이의 차이로서, 매일 백분율로 나타내었다.

(D7 체중 - D0 체중)ㆍ100/(D0.7 체중)

ΔG7은 백신 접종된 동물 및 대조군 동물의 상대적인 체중 증가의 평균값 사이의 차이이다.

결과를 하기 표에 나타내었다:

첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명은 상기 명세서에 제시된 특정한 구현예로 제한되지 않으며, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 변형을 포함한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

숙주를 공격하는 병원체에 대한 DNA 백신에 있어서,

상기 숙주는 소이며,

상기 병원체는 소 헤르페스바이러스(BHV-1)이며,

a) 상기 병원체의 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하며 상기 서열을 상기 숙주의 생체내에서 발현하는 플라스미드; 및

b) DMRIE(N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판암모늄)

을 포함하는 DNA 백신.
제1항에 있어서,

상기 병원체의 면역원은 소 헤르페스바이러스(BHV-1)의 gB, gC 및 gD 유전자임을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 숙주의 과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 숙주의 과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
제4항에 있어서,

상기 발현 벡터가 플라스미드인 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 병원체 면역원을 코딩하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 막관통 도메인을 코딩하는 부분이 결실된 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 플라스미드는 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 함유하며 상기 서열을 상기 숙주세포에서 발현하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 플라스미드는 안정화 인트론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제8항에 있어서,

상기 인트론이 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 면역원은 소 헤르페스바이러스(BHV-1)의 gB 유전자이며, 상기 gB 유전자는, 그 신호 펩타이드 코딩서열의 인간 기원의 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호 서열로의 치환 및 그 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실 중 하나 이상에 의해 변형된, BHV-1의 gB 유전자 서열을 면역원으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 면역원은 소 헤르페스바이러스(BHV-1)의 gC 유전자이며, 상기 gC 유전자는, 그 신호 펩타이드 코딩서열의 인간 기원의 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호 서열로의 치환 및 그 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실 중 하나 이상에 의해 변형된, BHV-1의 gC 유전자 서열을 면역원으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 면역원은 소 헤르페스바이러스(BHV-1)의 gD 유전자이며, 상기 gD 유전자는, 그 신호 펩타이드 코딩서열의 인간 기원의 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호 서열로의 치환 및 그 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실 중 하나 이상에 의해 변형된, BHV-1의 gD 유전자 서열을 면역원으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백신은

N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판암모늄-디올레오일포리파티딜에탄올아민(DMRIE-DOPE);

막관통 도메인 및 연속 C-말단 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실에 의해 변형된 소 헤르페스바이러스(BHV-1) gB 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 이를 숙주세포에서 발현하는 제1 플라스미드;

막관통 도메인 및 연속된 C-말단 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실에 의해 변형된 BHV-1 gC 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 이를 숙주세포에서 발현하는 제2 플라스미드; 및

막관통 도메인 및 연속 C-말단 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 단편의 결실에 의해 변형된 BHV-1 gD 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 이를 숙주세포에서 발현하는 제3 플라스미드

를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
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제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 백신이 DOPE (디올레오일포르파티딜에탄올아민)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.