BRPI0107767B1 - Dna vaccines improved for animals of income - Google Patents

Abstract

"vacinas dna melhoradas para animais de renda". a invenção refere-se a uma vacina dna contra um patógeno referente aos animais de renda, notadamente os bovinos ou os suínos, compreendendo um plasmídeo contendo uma seqüência nucleotídica codificando para um imunógeno de um patógeno da espécie animal considerada, em condições que permitem a expressão in vivo dessa seqüência, e um lipídio catiônico, contendo um sal de amônio quaternário, de fórmula (i), na qual r~ 1~ é um radical alifático linear, saturado ou insaturado, tendo de 12 a 18 átomos de carbono, r~ 2~ é um outro radical alifático, contendo 2 ou 3 átomos de carbono e x é um grupamento hidroxila ou amina, esse lipídeo sendo, de preferência, o dmrie.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAS DNA MELHORADAS PARA ANIMAIS DE RENDA". A presente invenção refere-se às vacinas DNA melhoradas para os animais de renda, em particular bovinos e suínos. A utilização de moléculas de ácido desoxi-ribonucléico (DNA) para a vacinação é conhecida há partir do início dos anos 90 (Wolf et al. Science 1990. 247. 1465-1468). Essa técnica de vacinação induz uma imunidade celular e humoral após a transfecção in vivo de células do animal a vacinar por moléculas de DNA ou de RNA codificando para proteínas imunologi-camente ativas.

Uma vacina DNA se compõe de pelo menos um plasmídeo que pode ser expresso pela maquinaria celular do animal a ser vacinado e de um veículo ou de um excipiente farmaceuticamente aceitável. A seqüência nu-cleotídica desse plasmídeo codifica para, entre outros, um ou vários imunó-genos, tais como proteínas ou glicoproteínas capazes de induzir, no animal a ser vacinado, uma resposta imunitária celular (mobilização dos linfócitos T) e humoral (estímulo da produção de anticorpos especificamente dirigidos contra o imunógeno) (Davis H.L. Current Opinion Biotech. 1997.8.635-640).

Todos os imunógenos provenientes de um patógeno não são antígenos bastante eficazes naturalmente para induzir uma resposta imunitária protetora ótima no animal a ser vacinado. Portanto, é necessário melhorar a resposta imunitária.

Diferentes vias de administração da vacina DNA são propostas (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, muco-sa, etc.). Diferentes meios de administração foram igualmente propostos, notadamente partículas de ouro revestidas de DNA e protegidas de forma a penetrarem nas células da pele do animal a ser vacinado (Tang et al. Nature 1992.356.152-154) e os injetores por jato líquido, permitindo transfectar ao mesmo tempo células da pele e células dos tecidos subjacentes (Furth et al., Analytical Bioch. 1992, 205, 365-368).

Compostos químicos foram utilizados para a transfecção in vitro de DNA: Ν - os lipídeos catiônicos Os lipídeos catiônicos são eles próprios divididos em quatro subgrupos. 1) os lipídeos catiônicos contendo sais de amônio quaternário, como, por exemplo, o DOTMA (dioleoiloxipropil-trietilamônio, produzido por Gibco sob o nome de Lipofectina), o DOTAP (trimetil-2,3-(octadec-9-eno-oilóxi)-1-propanamônio; Gregoriadis et al. FEBS Letters 1997. 402. 107-110), o DMRIE (N-(hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1-propanamínio; WO-A-9634109), o DLRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodecilóxi)-1-propanamínio; Felgner et al. Ann. N Y Acad. Sei. 1995.772. 126-139).

Esses lipídeos catiônicos contendo sais de amônio quaternário podem ser associados ou não com um lipídeo neutro suplementar, tal como o DOPC (dioleoil-fosfatidil-quolina) ou o DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994.5.382-389); 2) as lipoaminas, como, por exemplo, o DOGS (dioctadecilami-doglicilespermina, produzido por Promega sob o nome de Transfectam; Ab-dallah et al. Biol. Cell. 1995. 85. 1-7), o DC-Chol (dimetilaminoetano-carbamoil-colesterol; Gaoat Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. 179. 280-285), o BGSC (bis-guanidina-espermidina-colesterol), o BGTC (bis-guanidina-tren-colesterol) (Vigneron et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996. 93. 9682-9686); 3) os lipídeos catiônicos contendo sais de amônio quaternário e lipoaminas, como, por exemplo, o DOSPA (N,N-dimetil-N-(2-(esperminacar-boxamido)etil)-2,3-bis(dioleoilóxi)-1 -propanimídio penta-cloridrato, comercializado por Gibco sob o nome de LipofectAmina ®; Hawley-Nelson et al. Fo-cus 1993. 15. 73-79), o GAP-DLRIE (N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodecilóxi)-1-propanamínio; Wheeler et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996. 93. 11454-11-459; Norman et al. Vacine et al. Vacine 1997. 15. 801-803); 4) os lipídeos contendo sais de amidina, como, por exemplo, o ADPDE, o ADODE (Ruysschaert et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. 203. 1622-1628) Β/ - os polímeros, como, por exemplo, o SuperFect® (moléculas de dendrímeros ativados, produzidos por Qiagen; Xu et al. Mol. Genet. Me-tab. 1998. 64. 193-197); e C/ - os agentes bioquímicos, como, por exemplo, as toxinas, notadamente as toxinas coléricas.

Determinados desses compostos foram também utilizados na formulação de vacinas DNA com resultados mais que mitigados. Os conhecimentos em matéria de transfecção in vitro não são transponíveis à vacinação DNA onde o objetivo final é de assegurar uma reação imunitária protetora. Efeitos negativos sobre a indução de uma proteção imunitária eficaz foram mesmo constatados com compostos conhecidos para favorecer a transfecção in vitro. Certos compostos químicos de formulação são tóxicos em elevadas doses para as células transfectadas.

Nos trabalhos de Etchart (Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), a utilização do DOTAP não teve efeito adjuvante, quando da administração da vacina DNA pela via intranasal, enquanto que teve por via oral. O DOTAP foi igualmente utilizado em vacinas DNA codificando para a hemaglutinina (HA) do vírus da gripe sobre o modelo ratos administrados pela via intranasal (Ban et al. Vaccine 1997. 15. 811-813), mas a adição de DOTAP inibiu a resposta imunitária. A utilização de DC-Col ou de DO-TAP/DOPE em vacinas DNA codificando para a proteína de superfície (S) do vírus da hepatite B sobre o modelo ratos administrados pela via intramuscu-lar permitiu aumentar a resposta em anticorpos, enquanto que a utilização da Lipofectina (ou DOTMA) não aumentou essa resposta (Gregoriadis et al. FEBS Letters 1997. 402. 107-110). O DC-Col/DOPE foi igualmente utilizado em vacinas DNA contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV, proteína Env) sobre o modelo ratos, cuja administração pela via intramuscular induziu uma resposta imunitária mais eficaz, enquanto que a administração pela via subcutânea ou intradérmica não foi aumentada (Ishii et al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428). A adição de certas citoquinas, notadamente de interleuquinas ou de interferons, pode permitir melhorar a resposta imunitária induzida em par- ticular pelas vacinas DNA. Cada citoquina desencadeia uma reação que lhe é própria e orienta mais ou menos a resposta imunitária para uma resposta celular ou para uma resposta humoral (Pasquini et al. Immunol. Cell. Biol. 1997. 75. 397-401; Kim et al. J. Interferon Cytokine Res. 1999. 19. 77-84). Os efeitos adjuvantes de uma citoquina proveniente de uma espécie determinada não são necessariamente os mesmos, caso o contexto imunitário varie, notadamente se essa citoquina for administrada a uma outra espécie, portanto em um sistema imunitário heterólogo. A adição de citoquina pode igualmente não ter nenhum efeito adjuvante, até mesmo chegar a uma inversão do efeito buscado, isto é, uma diminuição ou uma inibição da resposta imunitária. Assim, uma vacina DNA codificando para uma cadeia simples de uma imunoglobulina fundida com o GM-CSF não aumenta a resposta imunitária, enquanto que a administração direta no rato dessa proteína de fusão é eficaz, como é a administração de uma proteína de fusão formada de Fv e da citoquina IL-1beta ou a administração de uma vacina DNA codificando para esta última proteína de fusão (Hakim et al. J. Immunol 1996. 157. 5503-5511). A utilização de plasmídeos co-expressando a citoquina IL-2 e a proteína de envoltório do vírus da hepatite B, em uma conformação fundida ou não fundida, chega ao aumento das respostas imunitárias humorais e celulares (Chow et al. J. Virol. 1977. 71. 169-78). Mas a utilização de um plasmídeo bicistrônico codificando para a glicoproteína gp120 do vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV-1)e a citoquina II-2 induziu uma resposta imunitária específica anti-gp120 mais fraca do que aquela obtida pela utilização de um plasmídeo monocistrônico codificando unicamente para gp120 (Barouch et al. J. Immunol 1998. 161. 1875-1882). A co-injeção no rato de dois vetores de expressão, um codificando para a glicoproteína G do vírus da raiva, o outro para o GM-CSF murin estimula a atividade dos linfócitos B e T, enquanto que a co-injeção com um plasmídeo codificando para o interferon gama (no lugar do GM-CSF murin) tem por resultado uma diminuição da resposta imunitária (Xiang et al. Immunity 1995. 2.129-135).

Certas modificações ao nível dos antígenos, tais como as dele-ções de uma parte da seqüência nucleotídica codificando para o antígeno, as inserções de um fragmento de DNA na seqüência nucleotídica codificando para o antígeno ou nas regiões não traduzidas a montante e a jusante, podem igualmente melhorar a eficácia das vacinas DNA, notadamente melhorando o nível de expressão do antígeno ou sua apresentação.

Mas na prática, as manipulações ao nível da seqüência nucleotídica codificando para o antígeno podem acarretar uma diminuição ou a perda da atividade imunológica inicial. Assim, a deleção do domínio trans-membranário no gene codificando para o antígeno G do vírus da raiva diminuiu o nível de proteção induzido no modelo rato, após administração pela via intramuscular de uma vacina DNA codificando para esse antígeno modificado (Xiang et al. Vi rol. 1995. 209. 569). A deleção do domínio transmem-branário no gene codificando para a glicoproteína gD do vírus herpes bovino (BHV) não permitiu aumentar a resposta em anticorpos e induziu apenas uma proteção parcial nos bovinos vacinados pela via intramuscular (van Li-ttle-van den Hurk et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 831-839). As respostas imu-nitárias humorais e celulares e a proteção conferida são idênticas nas cobaias testadas após terem sido imunizadas com o auxílio seja de uma vacina DNA codificando para a glicoproteína GP do vírus Ebola, seja de uma vacina DNA codificando para essa glicoproteína GP, mas sob uma forma secretada (Xu et al. Nature Medicine 1998. 4. 37-42). A inserção da seqüência sinal do ativador do plasminogênio tis-sular humano (em inglês human tissue Plasminogen Activator ou human tPA) no gene codificando para o antígeno Pf332 da malária não permitiu aumentar a resposta em anticorpos no rato vacinado por via intramuscular (Haddad et al. FEMS 1997. 18. 193-202). A adição em fase de uma seqüência tPA ao gene codificando para o antígeno VP7 do rotavírus murin não permitiu igualmente aumentar a resposta em anticorpos no rato vacinado por via intradérmica, enquanto que a proteína de fusão formada do antígeno VP4 e tPA permitiu esse aumento, mas sem induzir uma proteção eficaz (Choi et al. Virology 1998. 250. 230-240).

As modificações feitas sobre a seqüência nucleotídica de um antígeno não podem, em geral, ser diretamente transpostas para um outro antígeno, pois os antígenos nem sempre têm as mesmas disposições estruturais. A depositante tem por objetivo a melhoria da eficácia da vacinação DNA. Ela tem, em particular, por objetivo obter melhor resposta imunitá-ria e notadamente uma proteção eficaz nos animais de renda, notadamente nos bovinos e nos suínos, pela vacinação DNA. A depositante tem por objetivo a elaboração de vacinas DNA melhoradas, induzindo uma resposta imunitária eficaz e protetora contra o vírus herpes bovino de tipo 1 (BHV-1) ainda denominado vírus da rinotra-queíte infecciosa bovina (IBR), o vírus respiratório sincital bovino (BRSV), o vírus da doença das mucosas ou pestivírus bovino de tipo 1 ou de tipo 2 (bovino viral diarréia vírus ou BVDV-1 e BVDV-2), o vírus parainfluenza de tipo 3 (bPI-3) nos bovinos. A depositante tem por objetivo a elaboração de vacinas DNA melhoradas, induzindo uma resposta imunitária eficaz e protetora, compreendendo pelo menos uma valência escolhida dentre o grupo formado pelo vírus herpes suíno ou vírus do Mal de Aujeszky (Pseudorabies virus ou PRV), o vírus da síndrome respiratória e reprodutor suíno (porcine reproduc-tive respiratory syndrome ou PRRSV), o vírus da gripe suína (swine influen-za virus ou SIV), vírus da peste suína clássica (Hog Cholera Virus ou HCV), parvovírus nos suínos. A depositante tem igualmente por objetivo a elaboração de vacinas DNA melhoradas, permitindo obter uma proteção imunitária eficaz e protetora no bovino, compreendendo pelo menos uma valência escolhida dentre o grupo formado dos vírus BHV-1, BRSV, BVDV, bPI-3 e a raiva. A invenção tem por objeto vacinas DNA melhoradas, permitindo obter uma proteção eficaz contra pelo menos um patógeno que infecta os animais de renda, notadamente os bovinos e os suínos. A vacina DNA é melhorada: seja por sua formulação, seja pela adição de GM-CSF, seja pela otimização do ou dos antígenos, seja por combinações dessas soluções.

De preferência, a vacina DNA é melhorada por sua formulação, e facultativamente seja pela adição de GM-CSF, seja pela otimização do ou dos antígenos, enfim seja pela adição de GM-CSF e pela otimização do ou dos antígenos.

Por definição, a vacina DNA compreende como princípio ativo um plasmídeo codificando para e expressando um gene ou fragmento de gene, por exemplo epitopo. O termo plasmídeo abrange uma unidade de transcrição DNA, compreendendo uma seqüêncía polínucleotídica compreendendo a seqüência do gene a ser expressa e os elementos necessários à sua expressão in vivo. Prefere-se a forma plasmídeo circular, superenrolada ou não. A forma linear entra igualmente no âmbito dessa invenção.

Cada plasmídeo compreende um promotor apto a assegurar, nas células hospedeiras, a expressão do gene inserido sob sua dependência. Trata-se em geral de um promotor eucariote forte e, em particular, de um promotor precoce do citomegalovírus CMV-IE, de origem humana ou murina, ou ainda eventualmente de uma outra origem tal como rato, cobaia. De maneira mais geral, o promotor é seja de origem viral, seja de origem celular. Como promotor viral além do CMV-IE, pode-se citar o promotor precoce ou tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus do Sarcoma de Rous. Pode também tratar-se de um promotor de vírus, do qual provém o gene, por exemplo o promotor próprio do gene. Como promotor celular, pode-se citar o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor da desmina, ou ainda o promotor da actina. Quando vários genes estão presentes no mesmo plasmídeo, estes podem ser apresentados na mesma unidade de transcrição ou em várias unidades diferentes.

De acordo com uma primeira modalidade, as vacinas DNA, de acordo com a invenção, são formuladas por adição a título de adjuvante, de lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, de fórmula: na qual Ri é um radical alifático linear, saturado ou insaturado, tendo de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é um outro radical alifático, contendo 2 ou 3 áto- mos de carbono e X é um grupamento hidroxila ou amina.

De preferência, trata-se do DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1-propanamônio; WO-A-9634109), de preferência associado com um lipídeo neutro, notadamente o DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina), para formar o DMRIE-DOPE. A presente invenção tem, portanto, por objeto uma vacina DNA contra pelo menos um patógeno referente aos animais de renda, notadamente os bovinos ou os suínos, compreendendo pelo menos um plasmídeo, contendo pelo menos uma seqüência nucleotídica codificando para um imunógeno de um patógeno da espécie animal considerada, em condições que permitam a expressão in vivo dessa seqüência, e um lipídeo catiônico contendo um sal de amônio quaternário, notadamente o DMRIE, de preferência associado ao DOPE.

De preferência, a mistura vetor recombinante com esse adju-vante é feita de maneira extemporânea e prefere-se, antes de sua administração no animal, deixar o tempo para a mistura assim constituída se com-plexar, por exemplo durante um período que vai de 10 a 60 minutos, notadamente da ordem de 30 minutos.

Quando o DOPE está presente, a razão molar DMRIE : DOPE vai, de preferência, de 95 : 5 a 5 : 95, mais particularmente de 1 : 1. A razão ponderai plasmídeo : adjuvante DMRIE ou DMRIE-DOPE pode ir notadamente de 50 : 1 a 1 : 10, notadamente de 10 : 1 a 1 : 5, de preferência de 1 :1 a 1 : 2.

De acordo com uma segunda modalidade, acrescentam-se às vacinas, de acordo com a invenção, o GM-CSF (em inglês Garnulocyte ma-crophage - colony stimulating factor; Clark S.C. et al. Science 1987. 230. 1229; Grant S.M. et al. Drugs 1992. 53. 516), o que pode ser feito pela incorporação de proteína GM-CSF diretamente na composição vacinai ou, de preferência, pela inserção da seqüência nucleotídica codificando para o GM-CSF em um vetor de expressão em condições que permitem sua expressão in vivo. Como vetor de expressão, prefere-se utilizar um plasmídeo, por exemplo o plasmídeo que contém a seqüência nucleotídica codificando para o(s) antígeno(s) de interesse ou um outro plasmídeo. A escolha do GM-CSF é feita, de preferência, em função da espécie animal a ser vacinada, assim para os bovinos o GM-CSF bovino é utilizado, para os suínos trata-se do GM-CSF suíno.

De acordo com uma terceira modalidade, a(s) seqüência(s) nu-cleotídica(s) codificando para o imunógeno estão sob uma forma otimizada. Por otimização, entende-se qualquer modificação da seqüência nucleotídica, notadamente manifestando-se pelo menos por um nível de expressão mais elevado dessa seqüência nucleotídica, e/ou por um aumento da estabilidade do RNA iniciador codificando para esse antígeno, e/ou pela secreção provocada desse antígeno no meio extracelular, e tendo por conseqüência direta ou indireta um aumento da resposta imunitária induzida.

Na presente invenção, a otimização do antígeno de interesse consiste, de preferência, na deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário do antígeno de interesse (por deleção, se entende a deleção total ou uma deleção parcial suficiente para que o domínio transmembranário não seja mais, ou substancialmente mais, funcional), e/ou na adição em fase de uma seqüência nucleotídica codificando para o sinal tPA (Montgomery et al. Cell. Mol. Biol. 1997. 43. 285-292; Harris et al. Mol. Biol. Med 1986. 3. 279:292) e/ou na inserção de íntron estabilizador a montante do gene a ser expresso. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário do antígeno de interesse favorece a secreção para o meio extracelular dos antígenos assim truncados e assim aumenta suas possibilidades de contato com as células do sistema imunitário. A inserção da seqüência nucleotídica codificando para o sinal tPA facilita a traductibilidade do RNA iniciador ao qual o sinal tPA é anexado, e aumenta assim o nível de expressão desse RNA iniciador e, portanto, a produção de antígeno. O sinal tPA exerce também um papel na secreção do antígeno sintetizado.

Outras seqüências nucleotídicas codificando para peptídeos sinais podem ser utilizados, notadamente aqueles do peptídeo sinal da meliti-na proveniente das abelhas (Sisk W. P. et al., 1994, J. Virol., 68, 766-775). A inserção de um íntron estabilizador no gene codificando para o antígeno de interesse evita os entrelaçamentos aberrantes de seu RNA ini-ciador e mantém a integridade física deste.

De preferência, o sinal tPA é de origem humana. A seqüência nucleotídica do sinal tPA humano é acessível junto à base de dados GenBank sob o número de acesso NM-000930. De preferência, o íntron é o íntron II do gene da beta-globina do coelho (van Ocyen et al. Science 1979. 206. 337-334), cuja seqüência nucleotídica é acessível junto da base de dados GenBamk sob o número de acesso V00882 e marcada sob íntron N° 2. A presente invenção tem por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora nos bovinos contra a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR). O vírus responsável da rinotraqueíte infecciosa bovina é um vírus herpes bovino de tipo 1 (BHV-1), membro da família dos Alphaherpesvi-rinae (Babiuk L. § et al. 1996. Vet. Microbiol. 53. 31-42). Seqüências nucleo-tídicas codificando para as glicoproteínas gB, gC e gD são conhecidas e acessíveis junto da base de dados GenBank sob o número de acesso AJ004801.

De acordo com a invenção, a vacina DNA contra IBR é, de preferência, melhorada por sua formulação com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência, o DMRIE-DOPE. Facultativamente, isto pode ser combinado com a adição de GM-CSF bovino (Ma-liszewski et al. Molec. Immunol. 1988. 25. 843-850), seja a otimização de pelo menos um antígeno de IBR, enfim seja a adição de GM-CSF bovino e otimização de pelo menos um antígeno de IBR.

Uma seqüência nucleotídica codificando para o GM-CSF bovino é acessível junto da base de dados GenBank sob o número de acesso U22385. A adição de GM-CSF bovino pode ser feita pela incorporação do polipeptídeo GM-CSF bovino na composição vacinai ou, de preferência, pela inserção da seqüência nucleotídica codificando para o GM-CSF bovino em um vetor de expressão in vivo, de preferência um plasmídeo. De preferência, a seqüência nucleotídica codificando para o GM-CSF bovino é inserida em um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pLF1032 exemplo 13), diferente daquele (ou daqueles) no qual é inserido o(s) gene(s) codificando para o(s) antígeno(s) de IBR. A otimização dos antígenos provenientes de IBR é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do sinal tPA de origem humana (GenBank número de acesso NM_000930), da seqüência do peptídeo sinal da glicoproteína gB e/ou da glicoproteína gC e/ou da glico-proteína gD, e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de gB e/ou de gC e/ou de gD. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de uma dessas glicoproteínas se acompanha, de preferência, da parte C terminal contígüa (parte citoplásmica da glicoproteína). A vacina DNA contra IBR, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um só antíge-no de IBR otimizado (gB, gC ou gD) ou dois entre eles, ou os três, isto é, gB otimizado, gC otimizado e gD otimizado.

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de BHV-1 utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e em FR-A1-2751229, notadamente nos exemplos 7 e 8, e nas figuras 3 e 4.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra BHV-1 é formulada com o DMRIE-DOPE e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo, pPB281, exemplo 3.1.2) codificando para o antígeno gB de BHV-1 otimizado pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa, de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo, pPB292, exemplo 3.2.2) codificando para o antígeno gC de BHV-1- otimizado pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa, e de um terceiro plasmídeo de expressão (por exemplo pPB284, exemplo 3.3.2) codificando para o antígeno gD de BHV-1 otimizado pela deleção do fragmento da sequência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa.

De maneira geral, e não somente para BHV-1, a parte C terminal contígüa à seqüência codificando para o domínio transmembranário pode ser conservada. Todavia, é freqüentemente mais fácil detectá-la ao mesmo tempo que a seqüência que codifica para o domínio transmembranário. A presente invenção tem também por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora nos bovinos contra o vírus respiratório sincitial bovino (BRSV). O vírus BRSV é um Paramixovírus, membro igualmente da família dos Paramyxoviridae (Baker et al. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 1997. 13. 425-454). Seqüências nucleotídicas codificando para a proteína F e a glicoproteína G são conhecidas e acessíveis junto à base de dados GenBank respectivamente sob o número de acesso Y17970 e US33539. A vacina DNA contra BRSV é, de preferência, formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF bovino, seja a otimização de pelo menos um antígeno de BRSV, enfim seja a adição de GM-CSF bovino e a otimização de pelo menos um antígeno de BRSV. A adição de GM-CSF bovino pode ser feita conforme descrito para BHV-1. A otimização dos antígenos provenientes de BRSV é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do tPA de origem humana, da seqüência sinal da proteína F de BRSV e/ou da glicoproteína de envoltório G de BRSV e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de F e/ou de G. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de uma dessas proteínas é acompanhada de preferência da parte C terminal contígüa. A vacina de DNA contra BRSV, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um só antígeno de BRSV otimizado (F ou G) ou os dois (F e G).

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de BRSV utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e em FR-A1-2751229, notadamente nos exemplos 9 e 10, e nas figuras 5 e 6.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra BRSV é formulada com DMRIE-DOPE, e é composto de um plasmídeo de expressão (por exemplo pSB114, exemplo 4.1.3) codificando para o antígeno F de BRSV otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humano no lugar da seqüência sinal de F, pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica de F, codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa, e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pSB110, exemplo 4.2.2) codificando para o antígeno G de BRSV otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humano no lugar da seqüência sinal de G, pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário de G e a parte C terminal contígüa. A presente invenção tem também por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora nos bovinos contra o vírus BVDV. O vírus BVDV é um pestivírus da família dos Flaviridae. É universalmente difundido nas populações bovinas e se manifesta por má formação do feto, dos abortos ou dos sintomas clínicos respiratórios (doença das mucosas) e enteríticas (diarréia viral bovina).

Os vírus BVDV se diferenciam pela gravidade dos sinais clínicos e dois grupos foram formados, os BVDV de tipo 1 (sinais clínicos não aparentes ou médios) e aqueles do tipo 2 (sinais clínicos agudos, hemorragia, acentuada morbidez, forte mortandade) (Dean H. J. e Leyth R., 1999, Vacci-ne, 17, 1117-1124).

Quando o tipo de um vírus BVDV não é precisado claramente, esse vírus é entendido como sendo do tipo 1 ou do tipo 2. O vírus BVDV é um vírus envolvido com RNA monocatenário, composto de um só gene codificando para uma poliproteína que após divagem de várias proteínas bem individualizadas, notadamente a proteína E0 (gp48) e a proteína E2 (gp53) (Vassilev V. B. et.al., 1997, J.Virol., 71, 471-478).

Seqüências nucleotídicas codificando para as poliproteínas E0-E2 são conhecidas e acessíveis junto da base de dados GenBank, sob o número de acesso M96687 para BVDV-1 e AF145967 para BVDV-2. A vacina DNA contra BVDV é, de preferência, formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF bovino, ou a otimização de pelo menos um antígeno de BVDV, enfim ou a adição de GM-CSF bovino e a otimização de pelo menos um antígeno de BVDV. A adição de GM-CSF bovino pode ser feita conforme descrito para BHV-1. A otimização dos antígenos provenientes de BVDV é feita por adição de uma seqüência "sinal11, notadamente aquela do tPA de origem humana, a montante da seqüência nucleotídica codificando para a proteína EO de BVDV e/ou da proteína E2 de BVDV, e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de E2, e/ou pela inserção de um íntron, notadamente do íntron II do gene da beta-globina do coelho a montante da seqüência nucleotídica codificando para EO e/ou para E2. A vacina DNA contra BVDV, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um único antígeno de BDV otimizado (EO ou E2) ou os dois (EO e E2).

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de BVDV utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e em FR-A1-2751229, notadamente no exemplo 13, e na figura 9.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra BVDV é formulada com o DMRIE-DOPE, e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo pLF 1029 exemplo 5.1.2, pLF1031 exemplo 6.2.2) codificando para o antígeno EO de BVDV otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humano a montante de EO e pela inserção do íntron II do gene da beta-globina do coelho a montante de EO, e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pl_F1021 exemplo 5.2.2, pLF1023 exemplo 6.1.2) codificando para o antígeno E2 de BVDV otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humano a montante de E2, pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário de E2 e a parte C terminal contígüa e pela inserção do íntron II do gene da beta-globina do coelho a montante de E2.

Uma mistura de plasmídeos pode vantajosamente ser realizada. A mistura pode compreender pelo menos dois plasmídeos de expressão, cada um expressando um imunógeno diferente (EO a E2) e/ou proveniente de um tipo de BVDV diferente (BVDV-1 ou BVDV-2). Em particular, uma mistura feita de quatro plasmídeos expressando BVDV-1, EO, BVDV-1 E2, BVDV-2 EO e BVDV-2 E2. A presente invenção tem também por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora nos bovinos contra o vírus parainfluenza de tipo 3 (bPI-3). O vírus bPI-3 é um paramyxovirus, membro igualmente da família dos paramyxoviridae (Tsaí et al. Infect. Immun. 1975. 11.783-803).

Seqüência nucleotídicas codificando para as proteínas hema-gluitinina-neuraminidase (HN) e a proteína de fusão (F) de bPI-3 são conhecidas e acessíveis junto à base de dados GenBank sob o número de acesso U31671. A vacina DNA contra bPI-3 é, de preferência, formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência de DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF bovino, ou a otimização de pelo menos um antígeno de bPI-3, enfim, seja a adição de GM-CSF bovino e a otimização de pelo menos um antígeno de bPI-3. A adição de GM-CSF bovino pode ser feita conforme descrito para BHV-1. A otimização dos antígenos provenientes de bPI-3 é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do tPA de ori- gem humana, da sequência sinal da hemaglutinina-neuraminidase (HN) de bPI-3 e/ou da proteína de fusão (F) de bPI-3, e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de HN e/ou de F, e/ou pela inserção de um íntron, notadamente do íntron II do gene da be-ta-globina do coelho a montante da seqüência nucleotídica codificando para HN e/ou para F. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de uma dessas proteínas é acompanhada, de preferência, da parte C terminal contígüa. A vacina DNA contra bPI-3, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um único antígeno de PI-3 otimizado (HN ou F) ou os dois (HN e F).

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de bPI-3 utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e em FR-A1-2751229, notadamente nos exemplos 14 e 15, e nas figuras 10 e 11.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra bPI-3 é formulada com DMRIE-DOPE, e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo, pLF1025 exemplo 7.1.2) codificando para o antígeno HN de bPI-3 otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humano ao invés da seqüência sinal de HN, pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica de HN codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa e pela inserção do íntron II do gene da beta-globina do coelho a montante de HN, e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pLF1027 exemplo 7.2.2) codificando para o antígeno F de bPI-3 otimizado pela inserção da seqüência sinal do tPA humana ao invés da seqüência sinal de F, pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário de F e a parte C terminal contígüa e pela inserção do íntron II do gene da beta-globina do coelho a montante de F. A presente invenção tem por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora no porco contra o vírus herpes suíno (PRV). O vírus PRV é um membro da família dos Alphaherpesvirinae, esse vírus é responsável pelo Mal de Aujeszky (Sawitzky D. Arch. Virol. Suppl. 1997. 13-201-206).

Seqüências nucleotídicas codificando para as glicoproteínas gB, gC e gD são conhecidas e acessíveis junto à base de dados GenBank sob o número de acesso M17321, AF158090, AF086702. A vacina DNA contra PRV é, de preferência, formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF suíno (Inumaru S. et Takamatsu H. Immunol. Cell. Biol. 1995. 73. 474-476), ou a otimização de pelo menos um antígeno de PRV, enfim ou a adição de GM-CSF suíno e a otimização de pelo menos um antígeno de PRV. A adição de GM-CSF suíno pode ser feita pela incorporação do polipeptídeo GM-CSF suíno na composição vacinai ou pela inserção de uma seqüência nucleotídica codificando para o GM-CSF suíno (por exemplo, acessível junto à base de dados GenBank sob o número de acesso D21074) em um vetor de expressão in vivo, de preferência um plasmídeo. De preferência, a seqüência nucleotídica codificando para GM-CSF suíno é inserida em um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pLF 1033 exemplo 14), diferente daquele (ou daqueles) no qual é inserido o(s) gene(s) codificando para o(s) antígeno(s) de PRV.

A otimização dos antígenos provenientes de PRV é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do sinal tPA de origem humana (GenBank número de acesso NM_000930), da seqüência do peptídeo sinal da glicoproteína gB e/ou da glicoproteína gC e/ou da glico-proteína gD, e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de gB e/ou de gC e/ou de gD. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de uma dessas glicoproteínas é acompanhada de preferência da parte C terminal contígua. A vacina DNA contra PRV, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um único antígeno de PRV otimizado (gB, gC ou gD) ou dois dentre eles ou os três, isto é, gB otimizado, gC otimizado e gD otimizado.

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de PRV utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e no FR-A1 -2751224, notada-mente nos exemplos 8 e 9 e nas figuras 3 e 5.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra PRV é formulada como DMRIE-DOPE, e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo, pSB102 exemplo 8.1.2) codificando para o antígeno gB de PRV otimizado pela deleção do fragmento da se-qüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e da parte C terminal contígüa, de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pSB104 exemplo 8.2.2) codificando para antígeno gC de PRV otimizado pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e da parte C terminal contígüa, e de um terceiro plasmídeo de expressão (por exemplo pSB106 exemplo 8.3.2) codificando para o antígeno gD de PRV otimizado pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e da parte C terminal contígüa. A presente invenção tem por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora no suíno contra o vírus da síndrome respiratória e reprodutora suína (PRRSV). O vírus PRRSV é um Arterivírus, membro da família dos Arterivi-ridae, (Murtaugh et al. Arch. Virol. 1995.140. 1451-1460).

Seqüências nucleotídicas codificando para as proteínas codificadas pelos quadros abertos de leitura COL3, COL5 e COL6 são conhecidas e acessíveis junto à base de dados GenBank sob o número de acesso U87392. A vacina DNA contra PRRSV é, de preferência, formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF suíno, ou a otimização de pelo menos um antígeno de PRRSV, enfim, ou a adição de GM-CSF suíno, e a otimização de pelo me- nos um antígeno de PRRSV. A adição de GM-CSF suíno pode ser feita conforme descrito para PRV. A otimização dos antígenos provenientes de PRRSV é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do sinal tPA de origem humana (GenBank número de acesso NM_000930), da seqüência do peptídeo sinal da proteína codificada pelo quadro aberto de leitura 3 (COL3, gp45 ou grande glicoproteína de envoltório) e/ou da glicoproteína COL5 (gp25 ou glicoproteína de envoltório E) e/ou glicoproteína COL6 (gp18 ou proteína de membrana) e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de COL3 e/ou de COL5 e/ou de COL6. A deleção do fragmento de DNA codificando para o domínio transmembranário de uma dessas glicoproteínas é acompanhada de preferência da parte C terminal contígüa. A vacina de DNA contra PRRSV, de acordo com a invenção, pode, portanto, codificar e expressar um único antígeno de PRRSV otimizado (COL3, COL5 ou COL6) ou dois dentre eles ou os três, isto é, COL3 otimizado, COL5 otimizado e COL6 otimizado.

Seqüências nucleotídicas codificando para os antígenos de PRRSV utilizáveis na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dadas nos exemplos anexados e no FR-A1-2751224, notadamente nos exemplos 14 a 17 e nas figuras 14 a 17.

De maneira preferencial, de acordo com a invenção, a vacina DNA contra PRRSV é formulada com DMRIE-DOPE, e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo pLF1009 exemplo 9.1.1, pLF1015 exemplo 10.1.1) codificando para o antígeno COL3 de PRRSV, de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo pLF1012 exemplo 9.2.2, pLF1018 exemplo 10.2.2) codificando para o antígeno COL5 de PRRSV otimizado por substituição da seqüência sinal de COL5 pela seqüência peptídeo sinal tPA humano e pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídi-ca codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígüa, e de um terceiro plasmídeo de expressão (por exemplo pLF1014 exemplo 9.3.2, pLF1016 exemplo 10.3.2) codificando para o antígeno COL6 de PRRSV otimizado por substituição da seqüência sinal de COL6 pela se-qüência peptídeo sinal tPA humano e pela deleção do fragmento da seqüência nucleotídica codificando para o domínio transmembranário e a parte C terminal contígua.

Uma mistura de plasmídeos pode vantajosamente ser realizada. A mistura pode compreender pelo menos dois plasmídeos de expressão, cada um expressando um imunógeno diferente (COL3, COL5 ou COL6) e/ou proveniente de uma cepa de PRRSV diferente (por exemplo cepa européia, por exemplo Lelystad, cepa americana ATCC VR-2332). Em particular, uma mistura feita de seis plasmídeos expressando PRRSV Lelystad COL3, PRRSV Lelystad COL5, PRRSV Lelystad COL 6, PRRSV VR-2332 COL3, PRRSV VR-2332 COL5 e PRRSV VR-2332 COL6. A presente invenção tem também por objeto uma vacina DNA melhorada capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protetora nos suínos contra o vírus da gripe suína (SIV). O vírus SIV é um vírus influenza do grupo A, membro da família dos Orthomyxovíridae (murphy B.R. et Webster R. G. Virology, Second Editi-on, edited by B. N. Fields, D.M. Knipe et al. Raven Press Ltd., New York 1990).

Seqüências nucleotídicas codificando para as proteínas hema-glutinina (HA) e neuraminidase (NA) da cepa SIV H1N1 e H3N2 são conhecidas e acessíveis junto à base de dados GenBank sob o número de acesso K00992, U86145, U07146, AF153238. A vacina DNA contra SIV é, de preferência formulada com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente o DMRIE, de preferência o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativamente combinado com a adição de GM-CSF suíno, ou a otimização de pelo menos um antígeno de SIV, enfim ou a adição de GM-CSF suíno e a otimização de pelo menos um antígeno de SIV. A adição de GM-CSF suíno pode ser feita conforme é descrito para PRV. A otimização dos antígenos provenientes de SIV é feita por substituição, por uma seqüência "sinal", notadamente aquela do tPA de origem humana, da seqüência de sinal da hemaglutinina (HA) de SIV e/ou da proteína da neuraminidase (NA) de SIV, e/ou pela deleção do fragmento de DNA codificador do domínio de transmembrana de HA e/ou de NA, e/ou pela inserção de um intron, particularmente o intron II do gene da beta-globina de coelho à montante da sequência de nucleotídeo codificador de HA e/ou de NA. A deleção do fragmento de DNA codificador do domínio de transmembrana de uma das proteínas é acompanhada preferencialmente da parte C terminal contígüa. A vacina de DNA contra SIV de acordo com a invenção pode assim codificar e expressar somente um antígeno de SIV otimizada (HA ou NA) ou os dois (HA e NA).

Sequências de nucleotídeos codificadores de antígenos de SIV utilizados na presente invenção e diferentes construções de vetores de expressão são dados nos Exemplos anexos e em FR-A1-2751224, particularmente nos Exemplos 10 e 11, e nas Figuras 7 e 9 para SIV da cepa H1N1, e nos Exemplos 12 e 13, e nas Figuras 11 e 13 para SIV da cepa H3N2.

De maneira preferencial conforme a invenção, a vacina de DNA contra SIV é formulada com DMRIE-DOPE, e é composta de um plasmídio de expressão (e.g., pLF1002 exemplo 11.1.2, pLF1006 exemplo 12.1.2) codificador do antígeno de HA de SIV otimizado pela inserção da sequência de sinal do tPA humano no lugar da sequência de sinal de HA, pela deleção do fragmento da sequência de nucleotídeo de HA codificador do domínio de transmembrana e a parte C terminal contígüa, e pela inserção do intron II do gene da beta-globina de coelho à montante do NA.

Uma mistura de plasmídios pode vantajosamente ser realizada. A mistura pode compreender pelo menos dois plasmídios de expressão, cada experimento um imunógeno diferente (HA ou NA) e/ou proveniente de uma cepa de SIV diferente (por exemplo H1N1 ou H3N2). Em particular, uma mistura feita de quatro plasmídeos expressando CIV, H1N1 HA, SIV H1N1 NA, SIV H3N2 HA e SIV H3N2 NA.

Embora a invenção seja descrita em ligação com vacinas DNA particulares, a invenção e notadamente a utilização dos adjuvantes, de acor- do com a invenção, se aplica igualmente a vacinas DNA dirigidas contra outros patógenos dessas espécies animais.

Na mesma ordem de idéia, as vacinas, de acordo com a invenção podem ser, para uma espécie animal, combinadas entre si e/ou com vacinas DNA dirigidas contra outros patógenos da mesma espécie.

Esses outros patógenos podem ser notadamente os vírus da raiva, da peste suína e parvovírus suínos.

Uma preparação imunógena ou uma vacina DNA melhorada, de acordo com a invenção, contra o vírus da raiva compreende notadamente um plasmídeo codificando para a glicoproteína G não-modificada do vírus da raiva e do DMRIE-DOPE e facultativamente a adição de GM-CSF.

Uma preparação imunógena ou uma vacina DNA melhorada, de acordo com a invenção, contra o parvovírus suíno compreende notadamente um plasmídeo codificando para um antígeno proveniente do parvovírus suíno (por exemplo a proteína VP2, exemplo 18 e figura 18 de FR-A1 -2751224) do DMRIE-DOPE e facultativamente a adição de GM-CSF suíno (por exemplo pl_F1033, exemplo 14).

Uma preparação imunógena ou uma vacina DNA melhorada, de acordo com a invenção, contra o vírus da peste suína (HCV) compreende notadamente um plasmídeo codificando para um antígeno proveniente de HCV (por exemplo a proteína E1, exemplo 19 e figura 19 de ou a proteína E2, exemplo 20 e figura 20 de mesmo documento) e do DMRIE-DOPE e facultativamente do GM-CSF suíno (por exemplo pLF1033, exemplo 14).

Assim, a presente invenção tem igualmente por objeto vacinas DNA multivalentes melhoradas, permitindo obter uma proteção eficaz nos bovinos contra pelo menos dois patógenos bovinos escolhidos dentre o grupo formado dos vírus BHV-1, BRSV, BVDV, bPI-3 e raiva. A presente invenção tem igualmente por objeto vacinas DNA multivalentes melhoradas, permitindo obter uma proteção eficaz no porco contra pelo menos dois patógenos suínos dentre o grupo formado dos vírus PRV, PRRSV, SIV, vírus da peste suína (Hog Cholera Virus ou HCV), e parvovírus suínos.

As vacinas DNA multivalentes podem ser melhoradas por sua >rmulação com um adjuvante, de acordo com a invenção, notadamente com DMRIE, de preferência com o DMRIE-DOPE. Isto pode ser facultativa-,,iente combinado com a adição de GM-CSF conforme foi anteriormente descrito, ou com a otimização de pelo menos um antígeno de interesse conforme foi anteriormente descrito, enfim ou pela adição de GM-CSF e a otimização de pelo menos um antígeno de interesse.

As vacinas DNA multivalentes melhoradas, de acordo com a invenção, se compõem de um ou vários plasmídeo(s) de expressão, de tal modo que essas vacinas levam à expressão in vivo de pelo menos um imunógeno de um primeiro patógeno e de pelo menos um imunógeno de pelo menos um outro patógeno, infectando a mesma espécie animal. Pelo menos um desses imunógenos é, de preferência, escolhido dentre os membros do seguinte grupo: - F de BRSV, G de BRSV, gB de BHV-1, gC de BHV-1, gD de BHV-1, EO de BVDV-1, E2 de BVDV-1, EO de BVDV-2, E2 de BVDV-2, F de bPI-3 e HN de bPI-3 para os bovinos; e - gB de PRV, gC de PRV, gD de PRV, COL3 de PRRSV cepa Lelystad, COL5 de PRRSV cepa Lelystad, COL 6 de PRRSV cepa Lelystad, COL3 de PRRSV cepa VR-2332, COL5 de PRRSV cepa VR-2332, COL6 de PRRSV cepa VR-2332, HA de SIV cepa H1N1, NA de SIV cepa H1N1, HA de SIV cepa H3N2 e NA de SIV cepa H3N2 para os suínos.

As vacinas DNA monovalentes ou multivalentes melhoradas, de acordo com a invenção, podem ser igualmente associadas com pelo menos uma vacina clássica (inativada, vivo atenuado, subunidades) ou vacina re-combinada utilizando um vetor de expressão in vivo (por exemplo poxvirus, adenovírus, herpesvírus) dirigida contra pelo menos um patógeno diferente que infecta a mesma espécie, ou serem utilizadas como lembretes dessas vacinas. O técnico pode se reportar ao FR-A1-2751229 para os métodos para produzir os plasmídeos contendo essas valências bovinas, ao FR-A1 -2751224 para as valências suínas. A presente invenção tem igualmente por objeto um método de vacinação dos animais de renda, notadamente bovinos ou suínos. Esse método de vacinação compreende a administração de uma das vacinas DNA melhoradas monovalentes ou multivalentes, tais como descritos anteriormente. Esses métodos de vacinação se referem à fêmea gestante, com vistas à transferência passiva da imunidade ou ao jovem animal ou ao adulto. Esse método de vacinação compreende a administração de uma ou várias doses da vacina DNA melhorada. A quantidade de DNA utilizada nas vacinas, de acordo com a presente invenção, está compreendida entre aproximadamente 10 μg e aproximadamente 1000 pg e, preferencialmente, entre aproximadamente 50 μρ e aproximadamente 500 μg, para um plasmídeo determinado. O técnico possui as competências necessárias para definir precisamente a dose eficaz de DNA a ser utilizada para cada protocolo de vacinação.

Os volumes de dose podem estar, de preferência, compreendidos entre 0,2 e 5 ml, de preferência entre 1 e 3 ml.

As vacinas DNA melhoradas, de acordo com a invenção, podem ser administradas, no âmbito desse método de vacinação, pelas diferentes vias de administração propostas na técnica anterior para a vacinação polinu-cleotídica e por meio das técnicas de administração conhecidas.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, os métodos de vacinação compreendem a administração pela via intramuscular, subcutânea ou com o auxílio de un injetor sem agulha por via intradérmica das vacinas DNA melhoradas, de acordo com a invenção. A invenção vai ser a seguir descrita mais em detalhes com o auxílio de modos de realização considerados a título de exemplos não-limitati-vos e com referência aos desenhos nos quais: Figura Ns 1: plasmídeo pVR1012 Figura N9 2: plasmídeo PAB 110 LISTA DAS SEQÜÊNCIAS: SEQ ID N9 1: oligonucleotídeo PB326 SEQ ID N9 2: oligonucleotídeo PB329 SEQ ID N93: oligonucleotídeo SB090 SEQ ID N94: oligonucleotídeo SB091 SEQ ID N95: oligonucleotídeo LF001 SEQ ID N96: oligonucleotídeo LF002 SEQ ID N9 7: oligonucleotídeo PB234 SEQ ID N98: oligonucleotídeo PB235 SEQ ID N9 9: oligonucleotídeo PB511 SEQ ID N9 10: oligonucleotídeo PB512 SEQ ID N911: oligonucleotídeo SB221 SEQ ID N912: oligonucleotídeo SB222 SEQ ID N913: oligonucleotídeo PB507 SEQ ID N914: oligonucleotídeo PB508 SEQ ID N915: oligonucleotídeo PB513 SEQ ID N916: oligonucleotídeo PB514 SEQ ID N917: oligonucleotídeo SB223 SEQ ID N918: oligonucleotídeo SB224 SEQ ID N919: oligonucleotídeo PB497 SEQ ID N920: oligonucleotídeo PB498 SEQ ID N921: oligonucleotídeo SB225 SEQ ID N922: oligonucleotídeo SB226 SEQ ID N923: oligonucleotídeo SB210 SEQ ID N924: oligonucleotídeo SB211 SEQ ID N925: oligonucleotídeo SB212 SEQ ID N926: oligonucleotídeo SB220 SEQ ID N927: oligonucleotídeo SB213 SEQ ID N928: oligonucleotídeo SB214 SEQ ID N929: oligonucleotídeo SB215 SEQ ID N9 30: oligonucleotídeo SB216 SEQ ID N931: oligonucleotídeo LF050 SEQ ID N932: oligonucleotídeo LF051 SEQ ID N933: oligonucleotídeo LF052 SEQ ID N934: oligonucleotídeo LF053 SEQ ID N935: oligonucleotídeo LF039 SEQ ID N936: oligonucleotídeo LF040 SEQ ID N937: oligonucleotídeo LF041 SEQ ID N938: oligonucleotídeo LF042 SEQ ID N939: oligonucleotídeo LF043 SEQ ID N940: oligonucleotídeo LF044 SEQ ID N941: oligonucleotídeo LF045 SEQ ID N9 42: oligonucleotídeo LF046 SEQ ID N9 43: oligonucleotídeo LF064 SEQ ID N944: oligonucleotídeo LF065 SEQ ID N945: oligonucleotídeo LF066 SEQ ID N946: oligonucleotídeo LF067 SEQ ID N947: oligonucleotídeo LF047 SEQ ID N948: oligonucleotídeo LF048 SEQ ID N949: oligonucleotídeo LF058 SEQ ID N950: oligonucleotídeo LF059 SEQ ID N951: oligonucleotídeo LF060 SEQ ID N952: oligonucleotídeo LF061 SEQ ID N953: oligonucleotídeo LF062 SEQ ID N954: oligonucleotídeo LF063 SEQ ID N955: oligonucleotídeo SB201 SEQ ID N956: oligonucleotídeo SB202 SEQ ID N957: oligonucleotídeo SB203 SEQ ID N958: oligonucleotídeo SB217 SEQ ID N959: oligonucleotídeo SB204 SEQ ID N9 60: oligonucleotídeo SB205 SEQ ID N9 61: oligonucleotídeo SB206 SEQ ID N9 62: oligonucleotídeo SB218 SEQ ID N9 63: oligonucleotídeo SB207 SEQ ID N9 64: oligonucleotídeo SB208 SEQ ID N9 65: oligonucleotídeo SB209 SEQ ID N9 66: oligonucleotídeo SB219 SEQ ID N9 67: oligonucleotídeo LF027 SEQ ID N9 68: oligonucleotídeo LF028 SEQ ID N9 69: oligonucleotídeo LF019 SEQ ID N9 70: oligonucleotídeo LF020 SEQ ID N9 71: oligonucleotídeo LF021 SEQ ID N9 72: oligonucleotídeo LF022 SEQ ID N9 73: oligonucleotídeo LF023 SEQ ID N9 74: oligonucleotídeo LF024 SEQ ID N9 75: oligonucleotídeo LF025 SEQ ID N9 76: oligonucleotídeo LF026 SEQ ID N9 77: oligonucleotídeo LF037 SEQ ID N9 78: oligonucleotídeo LF038 SEQ ID N9 79: oligonucleotídeo LF029 SEQ ID N9 80: oligonucleotídeo LF030 SEQ ID N9 81: oligonucleotídeo LF031 SEQ ID NQ 82: oligonucleotídeo LF032 SEQ ID N9 83: oligonucleotídeo LF033 SEQ ID N9 84: oligonucleotídeo LF034 SEQ ID N9 85: oligonucleotídeo LF035 SEQ ID N9 86: oligonucleotídeo LF036 SEQ ID N9 87: oligonucleotídeo LFQ03 SEQ ID N9 88: oligonucleotídeo LF004 SEQ ID N9 89: oligonucleotídeo LF005 SEQ ID N9 90: oligonucleotídeo LF006 SEQ ID N9 91: oligonucleotídeo LF007 SEQ ID N9 92: oligonucleotídeo LF008 SEQ ID N9 93: oligonucleotídeo LF009 SEQ ID N9 94: oligonucleotídeo LF010 SEQ ID N9 95: oligonucleotídeo LF011 SEQ ID N9 96: oligonucleotídeo LF012 SEQ ID N9 97: oligonucleotídeo LF013 SEQ ID N9 98: oligonucleotídeo LF014 SEQ ID N9 99: oligonucleotídeo LF015 SEQ ID N9 100: oligonucleotídeo LF016 SEQ ID N9101: oligonucleotídeo LF017 SEQ ID N9102: oligonucleotídeo LF018 SEQ ID N9103: oligonucleotídeo LF054 SEQ ID N9 104: oligonucleotídeo LF055 SEQ ID N9105: oligonucleotídeo LF056 SEQ ID N9 106: oligonucleotídeo LF057 EXEMPLOS: Para cada um dos patógenos considerados, cada gene codificando para os principais antígenos (forma nativa e forma modificada) constitui o objeto de uma construção particular em um plasmídeo de expressão eucariote. As formas secretadas dos antígenos são obtidas por deleção dos fragmentos de genes codificando para os domínios transmembranários e citoplásmicos. Em todos os casos, os domínios transmembranários das proteínas são identificados sobre a base dos perfis de hidropatia (sobre Ma-cVector 6.5) das seqüências protéicas correspondentes. EXEMPLO 1: Métodos de biologia molecular 1.1 Extração de DNA aenômico viral Suspensões virais são tratadas pela proteinase K(100 mg/ml final) em presença de sódio dodecil sulfato (SDS) (0.5 % final) durante 2 horas a 37 °C. O DNA viral é em seguida extraído com o auxílio de uma mistura fenol/clorofórmio, depois precipitado com dois volumes de etanol absoluto a -20 °C, durante 16 horas e em seguida centrifugado a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C. Os resíduos de DNA são secados, depois retomados em um volume mínimo de água ultrapura estéril. 1.2 Isolamento de RNA qenômico viral O RNA genômico de cada vírus é extraído, aplicando a técnica do "tiocianato de guanidínio/fenol-clorofórmio" descrita por P. Chomczynski e N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). 1.3 Técnicas de biologia molecular Todas as produções de plasmídeos são realizadas aplicando-se as técnicas padronizadas de biologia molecular descritas por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Todos os fragmentos de restrição utilizados pela presente invenção são isolados com o auxílio do kit "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla, CA). Para todas as construções, os fragmentos DNA clonados, assim como as junções com o vetor de expressão, são seqüenciados pelo método de Sanger (Sambrook et al. 1989).

1.4 PCR e RT-PCR

Os oligonucleotídeos específicos dos genes ou dos fragmentos de genes clonados são sintetizados, alguns dentre eles comportando, em certos casos, em sua extremidade 5' dos locais de restrição facilitando a clonagem dos fragmentos amplificados. As reações de transcrição inversa (RT) e a amplificação em cadeia por polimerase (PCR) são feitas segundo técnicas padronizadas (Sambrook et al. 1989). 1.5 Purificação de plasmídeos em grande escala A produção, em escala da dezena de mg, de plasmídeos purificados que entra nas composições vacinais é feita pelo método dos gradientes de cloreto de césio-brometo de etídio (Sambrook et al. 1989). EXEMPLO 2: Produções plasmídicas de base O plasmídeo de expressão eucariote pVR1020 (C. J. Luke et al. J. of Infectious Diseases. 1997. 175. 95-97), derivado do plasmídeo pVR1012 (figura N° 1, figura 1 e exemplo 7 de WO-A-9803199), contém a fase codificadora da seqüência-sinal do ativador do plasminógeno tissular humano (tPA).

Um plasmídeo pVR1020 é modificado por digestão BamHI-BglII e inserção de uma sequência contendo vários locais de clonagem (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) e resultando do emparelhamento dos seguintes oligonucleotídeos: PB326 (40 mer) (SEQ JD NOf) 5' GATCTGCÀGGACGTGTCTAG AGGATATCGAATTCGCGGCC 3' e PB329 (40 mer) (SEQ 1D NO 2) 5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'. O vetor assim obtido, de um tamanho de aproximadamente 5105 pares de bases (ou pb) é nomeado pAB110 (figura N° 2). O íntron II do gene da β-globina de coelho é clonado no vetor pCRIl (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), após obtenção do fragmento de DNA correspondente por PCR com o auxílio dos seguintes oligonucleotídeos: SB090 (20 mer) (SEQ 1D NO 3) 5’ TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' e SB091 (21 mer) (SEQ ID NO 4) 5‘ CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3* utilizando como matriz o DNA genômico de células do sangue periférico de coelho. O plasmídeo resultante é designado pNS 050. O plasmídeo de expressão pAB110 é modificado pela introdução da seqüência do íntron II do gene da globina do coelho no local Sall situado a montante do ATG do peptídeo sinal do ativador do plasminógeno tissular (tPA). A seqüência do íntron II do gene da globina do coelho é amplificada por amplificação em cadeia por polimerase (ACP ou PCR), a partir do plasmídeo pNS050, utilizando o par dos seguintes oligonucleotídeos: LF001 (30 mer) (SEQ ID NO 5) 5’ CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3’ e LF002 (30 mer) (SEQ ID NO 6) 5’ CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3’ O produto de PCR (573 pares de bases ou pb) é digerido por Sall e clonado no plasmídeo pAB110 previamente linearizado por Sall, para gerar o plasmídeo pLF999 de aproximadamente 5678 pb. EXEMPLO 3: plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus herpes bovino de tipo 1 (BHV-1) Fragmentos de DNA viral contendo os genes gB, gC e gD da cepa B901 de BHV-1 são isolados digerindo o genoma viral por diferentes enzimas de restrição, separando-os por eletroforese em gel de agarose e analisando-os por Southern blot com o auxílio de sondas correspondentes a fragmentos dos genes gB, gC e gD da cepa ST de BHV-1 (Leung-Tack P. et al. Virology. 1994. 199. 409-421). A cepa BHV-1 Colorado [Cooper] (ATCC número VR-864) pode igualmente ser utilizada. Os fragmentos assim identificados são clonados no vetor pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) e são na origem clonagens dos três genes no vetor de expressão pVR1012.

3.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de BHV-1 aB 3.1.1 pPB280: aene aB (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 Dois fragmentos Xhol-Xhol contendo as partes 5' e 3' do gene gB de BHV-1 são identificados por Southern blot e clonados no vetor pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) previamente digerido por Xhol. Os plasmídeos assim obtidos são respectivamente designados pPB128 e pPB117. O plasmídeo pPB128, contendo o fragmento 5' do gene gB, é digerido por Notl e Xhol, gerando um fragmento de 1708 pb (fragmento A). O plasmídeo pPB117, contendo a parte 3' do gene gB, é digerido por Xhol e Stul, gerando um fragmento de 1345 pb. Este fragmento é clonado no vetor pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) previamente digerido por EcoRV e Xhol. O plasmídeo resultante é nomeado pPB279. O plasmídeo pPB279 é em seguida digerido por Xhol e BamHI, gerando um fragmento de DNA de 1413 pb (fragmento B).

Os fragmentos A e B são em seguida clonados em um vetor pBluescript KS+ digerido por Notl e BamHI, gerando o plasmídeo pPB278 (aproximadamente 6063 pb) e permitindo a reconstituição do gene gB de BHV-1. O vetor pPB278 serve em seguida de matriz quando de uma reação de PCR realizada com os seguintes oligonucleotídeos: PB234 (30 mer) (SEQ1DN0 7) 5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3’ e PB235 (21 mer) (SEQ ID NO 8) 5’ GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3’. O produto de PCR (146 pb) é em seguida digerido pelas enzimas de restrição Sall e Nhel. O plasmídeo pPB278 é digerido por Nhel e BamHI. O fragmento de 2728 pb assim obtido e o fragmento PCR anteriormente digerido são ligados no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Sall e Ba-mHI, gerando assim o plasmídeo pPB280, de um tamanho de aproximadamente 7742 pb. O gene gB de BHV-1 codifica para uma proteína de 933 aminoá- cidos. 3.1.2 pPB281: gene aB (forma AÍTM-Cterlt clonado no vetor pVR1012. A forma truncada (deletada de seus domínios transmembranário (TM) e carbóxi-terminal (Cter) do gene gB de BHV-1 é obtida ligando no plasmídeo pVR1012 (exemplo 2) pré-digerido por Sall e BamHI, ao mesmo tempo um fragmento de um tamanho de 2234 pb obtido após digestão por Sall-Pvull do plasmídeo pPB280 (exemplo 3.1.1) e um fragmento de 56 pb obtido pelo emparelhamento dos seguintes oligonucleotídeos: PB511 (52 mer) (SEQID NO 9) SOTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACT GAG 3' e PB512 (57 mer) (SEQ ID N010) 5'GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTC GTGOAG 3*. O plasmídeo assim gerado tem um tamanho de aproximadamente 7154 pb e é nomeado pPB281. O gene gB truncado de BHV-1 codifica para uma proteína de 759 aminoácidos. 3.1.3 dSB1 15: gene aB (forma tPA AfTM-CterlI clonado no vetor pAB110 A forma tPA A[TM-Cter] do gene gB de BHV-1 é amplificada por PCR a partir da matriz pPB281 (exemplo 3.1.2) e com o auxílio das seguintes atrações: SB221 (39 mer) (SEQ ID Ns 11) SB221 (39 mer) (SEQ ID NO 11) 5’ AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3’ e SB222 (33 mer) (SEQ ID N012) 5’ GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3’. O produto de amplificação (2088 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB115, de um tamanho de aproximadamente 7154 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gB codifica para uma glicopro-teína de 729 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gB de BHV-1.

3.2. Plasmídeos codificando para as diferentes formas de BHV-1 aC 3.2.1 pPB264: aene aC (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 Um fragmento BamHI-Hindlll de 3,5 kb, contendo o gene completo gC de BHV-1 é identificado por Southern blot e clonado no vetor pBluescript SK+. O plasmídeo assim obtido é nomeado pPB287. O plasmídeo pPB287 é em seguida digerido por Ncol-BssSI. Um fragmento de digestão de um tamanho de 1492 pb é obtido. Ele é ligado com um fragmento de DNA de síntese obtido pelo emparelhamento dos seguintes oligonucleotídeos: PB507 (37 mer) (SEQID NO 13) 5' TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3' e PB508 (37 mer) (SEQ ID NO 14) 5' CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3\ no plasmídeo pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA) pré-digerido por Ncol e Xbal, gerando o plasmídeo intermediário pPB290. O fragmento de 1554 pb proveniente da digestão de pPB290 por Pstl e Xbal é clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Pstl e Xbal, gerando assim o plasmídeo pPB264, de um tamanho de aproximadamente 6427 pb. O gene gC de BHV-1 codifica para uma proteína de 508 aminoácidos. 3.2.2 pPB292: gene aC (forma AÍTM-Cterl) clonado no vetor PVR1012 A forma truncada do gene gC de BHV-1 é obtida ligando os seguintes três fragmentos de DNA no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Pstl e Xbal: (a) um fragmento de 1035 pb proveniente da digestão de pPB264 (exemplo 3.2.1) por Pstl e Xhol; (b) um fragmento de 350 pb proveniente da digestão por Xhol e Bani de pPB264; e (c) um fragmento de síntese de 43 pb, resultante do emparelha-mento dos oligonucleotídeos PB513 e PB514. São os seguintes esses oligonucleotídeos: PB513 (43 mer) (SEQID NO 15) 5' GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3‘ e PB514 (43 mer) (SEQ JD N016) 5’ CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3‘. O plasmídeo de um tamanho aproximadamente 6305 pb, assim obtido, é nomeado pPB292. O gene gC truncado de BHV-1 codifica para uma proteína de 466 aminoácidos. 3.2.3 pSB1 16 : gene aC íforma tPA AÍTM-Cterll clonado no vetor pAB110 A forma tPA A[TM-Cter] do gene gC de BHV-1 é amplificada por PCR a partir da matriz pPB292 (exemplo 3.2.2) e com o auxílio das seguintes atrações: SB223 (39 mer) (SEQ ID NO 17) 5’ AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTÇGCCGAGGAGGCG 3r SB224 (32 mer) (SEQ ÍD N018) 5’ GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3’. O produto de amplificação (1362 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB116, de um tamanho de aproximadamente 6404 pb. A forma tPA delta[TM-Cter] do gene gC codifica para uma glico-proteína de 479 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicopro-teína gC de BHV-1.

3.3 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de BHV-1 qD 3.3.1 pPB148: aene aD (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 Um fragmento Xhol-Xhol de 5 kb, contendo o gene gD de BHV-1 é identificado por Southern blot e clonado no vetor pBluescript SK+ pré-digerido por Xhol, gerando o plasmídeo pPB147.

Um fragmento de 325 pB proveniente da digestão de pPB147 por Ndel e BsrBI e um fragmento de 943 pB proveniente da digestão de pPB147 por Ndel e Styl são em seguida ligados no vetor pVR1012 (exemplo 2) pré-digerido por EcoRV e Xbal, gerando assim o plasmídeo pPB148, de um tamanho de aproximação 6171 pB. O gene gD de BHV-1 codifica para uma proteína de 417 aminoácidos. 3.3.2 pPB284: gene aD íforma AÍTM-Cterlf clonado no vetor PVR1012 O gene gD truncado de BHV-1 é obtido a partir de um fragmento obtido após amplificação por PCR realizada sobre o DNA genômico da cepa B901 do vírus BHV-1 previamente digerido por Pstl e Xbal e com o auxílio do par das seguintes atrações: PB497 (33 mer) (SEQID NO 19) 5’ TTTCTGGAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' e PB498 (31 mer) (SEQ JD NO 20) 5' TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3\ Esse fragmento de PCR é em seguida clonado no plasmídeo pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Pstl e Xbal, gerando o plasmídeo pPB284, de um tamanho de aproximadamente 5943 pb. O gene gD truncado de BHV-1 codifica para uma proteína de 355 aminoácidos. 3.3.3 pSB117: gene aD íforma tPA AÍTM-Cterl) clonado no vetor pAB1 10 A forma tPA A[TM-Cter] do gene gD de BHV-1 é amplificada por PCR a partir da matriz pPB284 (exemplo 3.3.2) e com o auxílio das seguintes atrações: SB225 (39 mer) (SEQ ID NO 21) 5' AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3’ e SB226 (33 mer) (SEQ ID NO 22) 5' GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3’. O produto de amplificação (1029 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB117, de um tamanho de aproximadamente 6071 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gD codifica para uma glicopro-teína de 368 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gD de BHV-1. EXEMPLO 4: plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus respiratório syncitial bovino (BRSV) Os genes codificando para os antígenos F e G do vírus BRSV são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral da cepa Snook (Thomas et ai. Research in Vet. Science. 1982. 33. 170-182). A cepa BRSV A 51908 (ATCC número VR-794) pode igualmente ser utilizada.

4.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de BRSV-F 4.1.1 pSB107: gene F (forma natival clonado no vetor pVR1012 O gene F da cepa Snook de BRSV é amplificado por RT-PCR, utilizando o RNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB210 (34 mar) (SEQ1D NO 23) 5' AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3' e SB211 (35 mer) (SEQ ID NO 24) 5' TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3’. O produto de amplificação, de um tamanho de 1739 pb, é digerido pelas enzimas Pstl e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Pstl e BamHI, gerando assim o plasmídeo pSB107, de um tamanho de aproximadamente 6583 pb. O gene F do vírus BRSV codifica para uma proteína de 574 ami- noácidos. 4.1.2 PSB108: gene F (forma AÍTM-Cterl clonado no vetor PVR1012 A forma truncada do gene F do cepa Snook de BRSV é amplificada por RT-PCR, utilizando o RNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB210 (SEQ ID NÒ 23) e SB212 (39 mer) (SEQ ID NO 25) 5’ AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3’. O produto de amplificação (1581 pb) é digerido pelas enzimas Pstl e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Pstl e BamHI, gerando o plasmídeo pSB108, de um tamanho de aproximadamente 6430 pb. A forma truncada do gene F codifica para uma glicoproteína de 523 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína F de BRSV. 4.1.3 pSB114: gene F (forma tPA AfTM-Cterl clonado no vetor pAB1 10 A forma tPA A[TM-Cter] do gene F do cepa Snook de BRSV é amplificada por RT-PCR, utilizando o RNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB212 (SEQ ID NO 25) e SB220 (38 mer) (SEQ ID NO 26) 5’ AAAATTCACGTGAAGATÀACAGAAGAATTTTATCAATC 3’. O produto de amplificação (1516 pb) é digerido pelas enzimas PMII e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por PMII e BGIII, gerando o plasmídeo pSB114, de um tamanho de aproximadamente 6572 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene F codifica para uma glicoproteína de 535 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína F de BRSV.

4.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de BRSV-G

No caso da proteína G do BRSV (glicoproteína de tipo II), a se-qüência-sinal e a seqüência transmembranária são confundidas, necessitando a adição de uma seqüência sinal a montante da seqüência correspondente ao domínio extracelular, quando da deleção do domínio transmembra-nário. O plasmídeo pAB110 (exemplo 2) é utilizado para a produção dos plasmídeos contendo a forma truncada do gene codificando para a proteína G de BRSV. 4.2.1 pSB109: gene G (forma natival clonado no vetor dVR1Q12. O gene G da cepa Snook de BRSV é amplificado por RT-PCR, utilizando o RNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB213 (32 mer) (SEQ ID NO 27) 5’ AGGCQTCGACATGTCCAACGATACCCATCATC 3’ e SB214 (38 mer) (SEQ ID NO 28) 5’ TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3'. 0 produto de amplificação (784 pb) é digerido pelas enzimas Sall e Xbal e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por Sall e Xbal, gerando plasmídeo pSB109, de um tamanho de aproximadamente 5661 pb. O gene G de BRSV codifica para uma glicoproteína de 257 ami- noácidos. 4.2.2 dSB1 10: gene G (forma tPA ΔΓΓΜ-Cterh clonado no vetor pAB110 A forma truncada do gene G da cepa Snook de BRSV é amplificada por RT-PCR, utilizando o RNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB215 (33 mer) (SEQ )D NO 29) 5' tttTaaggatccgctaaagccaagcccacatcc 3' e SB216 (33 mer) (SEQ ID NO 30) 5’ TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3'. O produto de amplificação (666 pb) é digerido pelas enzimas BamHI e Xbal e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por BamHI e Xbal, gerando o plasmídeo pSB110, de um tamanho de aproximadamente 5660 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene G do vírus BRSV codifica para uma glicoproteína de 218 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína G, mas precedida pela seqüência sinal do ativador do plasmi-nogenio tissular. EXEMPLO 5: plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus da doença das mucosas de tipo 1 dos bovinos (BVDV-1) Os genes codificando para os antígenos E0 (glicoproteína de 48 kDa ou gp48) e E2 (gp53) dos vírus BVDV de tipo 1 são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral do cepa Osloss (L/ De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993. 74. 1433-1438; A. Renard et al/. DNA, 1985, 4, 439-438; A. Renard et al., Ann. Rech. Vet., 1987, 18, 121-125). Os cepas NADL (ATCC VR-534) ou New York (ATCC VR-524) podem igualmente ser utilizados. 5.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de EO da cepa BVDV de tipo 1 Osloss 5.1.1 PLF1028: gene EO (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNA complementar (DNAc) do gene EO do cepa Osloss é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF051 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF050 (36 mçr) (SEQ1D NO 31) 5' CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3’ e LF051 (40 mer) (SEQ ID NO 32) 5’ CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 765 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e BamHI é ligado com um fragmento de 4866 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Ba-mHI para gerar o plasmídeo pLF1028 (aproximadamente 5636 pb). O gene EO de BVDV-1 cepa Osloss codifica para uma proteína de 252 aminoácidos.

Um códon AGT é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF050, de forma a permitir a iniciação da tradução do polipeptídeo EO re-combinante correspondente. 5.1.2 PLF1029: gene EO. forma (β-qlobina tPA-EO) clonado no vetor pLF999. O gene EO é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1028 (exemplo 5.1.1) e com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF052 (39 mer) (SEQ JD NO 33) 5’ CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3’ LF053 (40 mer) (SEQ 1D NO 34) 5’ CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 770 pB obtido por digestão do produto de PCR por Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1029 (aproximadamente 6417 pb). O gene EO de BVDV-1 cepa Osloss assim modificado (β-globina tPA-EO) codifica para uma proteína de 283 aminoácidos. 5.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de E2 do cepa BVDV de tipo 1 Osloss 5.2.1 PLF1020: gene E2 (forma nativa) clonada no vetor PVR1012. O DNAc do gene E2 do cepa Osloss é sintetizado a partir do RNA viral correspondente com o auxílio da atração LF040 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF039 (33 mer) (SEQID NO 35) 5’ CATGAÔGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 31 e LF040 (35 mer) (SEQ 1D NO 36) 5’ CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3’. O fragmento de DNA de 1235 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Bgll é ligado com um fragmento de 4860 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Bgll para gerar o plasmídeo pLF1020 (aproximadamente 6100 pb). O gene E2 de BVDV-1 cepa Osloss codifica para uma proteína de 409 aminoácidos.

Um códon ATG é introduzido na seqüência de oligonucleotídeos LF039 de forma a permitir a iniciação da tradução do polipeptídeo E2 re-combinante correspondente. 5.2.2 pLF1021: gene E2. forma (β-alobina tPA-E2 AÍTM+Cterl] clonado no vetor PLF999. O gene E2 deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1020 (exemplo 5.2.1) e com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF041 (36 mer) (SEQ ID NO 37) 5’ CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3* e LF042 (35 mer) (SEQ ID NO 38) 5’ CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3’. O fragmento de DNA de 1132 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e Bglll para gerar o plasmídeo pl_F1021 (aproximadamente 6779 pb). O gene E2 de BVDB-1 cepa Osloss assim modificado (β-globina tPA-E2 Δ [TM+Cter]) codifica para uma proteína de 404 aminoácidos. EXEMPLO 6: plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus da doença das mucosas de tipo 2 dos bovinos (BVDV-2) Os genes codificando para o antígeno E2 (gp53) dos vírus BVDV de tipo 2 são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral do cepa 890 (J.F. Ridpath e S.R. Bolin, Virology, 1995, 212, 39-46). O cepa Q140 é igualmente utilizável e pode ser obtido junto ao Ministério da Agricultura, às pesqueiras e à alimentação do Quebec (MAPAQ), Institut Armand-Frappier (P. Tijssen et al., Virology, 1996, 217, 356-361). As cepas 1373 e 296 são igualmente utilizáveis (J.F. Ridpath, BVDV Research Project, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, USA). 6.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de E2 da cepa de tipo 2-890 6.1.1 pLF1022: gene E2 (forma nativa) clonado no vetor PVR1012. O DNAc do gene E2 do cepa 890 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente com o auxílio da atração LF044 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF043 (36 mer) (SEQID NO 39) 5’ ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3’ e LF044 (39 mer) (SEQ ID NO 40) 5’ ACTGTAAGATCTTTAAGTATTGACTGCAGCACCCATAGC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 1240 pb obtido por digestão do produto de PCR por Xbal e BGIII é ligado com um fragmento de 4891 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Xbal e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1022 (aproximadamente 6136 pb). O gene E2 de BVDV-2 cepa 890 codifica para uma proteína de 410 aminoácidos.

Um códon ATG é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF043, de forma a permitir a iniciação da tradução do polipeptídeo E2 re- combinante correspondente. 6.1.2 PLF1023: gene E2. forma (B-alobina tPA-E2 A ÍTM+CterT) clonado no vetor pLF999 O gene E2 deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pl_F1022 (exemplo 6.2.1) e com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF045 (41 mer) (SEQID NO 41) 5’ CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTGCTAATC 3’ e LF046 (36 mer) (SEQ ID NO 42) 5’ CATGACAGATCTTrATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 1140 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1023 (aproximadamente 6787 pb). O gene E2 de BVD-2 cepa 890 assim modificado (β-globina tPA-E2 Δ [TM+Cter]) codifica para uma proteína de 405 aminoácidos. 6.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de E0 da cepa de tipo 2-890 6.2.1 PLF1030: gene E0 (forma nativel clonado no vetor pVR1012 O DNAc do gene E0 da cepa 890 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF065 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF064 (39 mer) (SEQ ID NQ 43) 5’ CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3’ e LF065 (39 mer) (SEQ ID NO 44) 5’ CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 768 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e BamHI é ligado com um fragmento de 4866 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Ba-mHI para gerar o plasmídeo pl_F1030 (aproximadamente 5639 pb). O gene E0 de BVDV-2 cepa 890 codifica para uma proteína de 253 aminoácidos.

Um códon ATG é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF064, de forma a permitir a iniciação da tradução do polipeptídeo EO re-combinante correspondente. 6.2.2 pLF1031: aene EO. forma (B-alobina tPA-EOtelonado no vetor pLF999. O gene EO é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pl_F1030 (exemplo 6.2.1.) e com o auxílio do par dos seguintes oligonu-cleotídeos: LF066 (42 mer) (SEQ ID NO 46) 5’ CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3’ e LF067 (39 mer) (SEQ ID NO 46) 5’ CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 770 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1031 (aproximadamente 6417 pb). O gene EO de BVDV-2 cepa 890 assim modificado (β-globina tPA-EO) codifica para uma proteína de 283 aminoácidos. EXEMPLO 7: plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus parainfluenza bovino, de tipo 3, (bPI-3) Os genes codificando para os antígenos hemaglutinina-neurami-nidase (HN) e fusão (F) do vírus bPI-3 são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral do cepa Reisinger SF-4 (acessível junto à ATCC sob o número VR-281). 7.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de HN da cepa bPI-3 SF-4 7.1. pLF1024: aene HN (forma nativa) clonado no vetor PVR1012, O DNAc do gene HN da cepa SF-4 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio do atração LF048 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF047 (39 mer) (SEQ ID NO 47) 5' CATATCGTQGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3’ e LF048 (38 mer) (SEQ ID NO 48) 5’ CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT 3'. O fragmento de DNA de 1726 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e EcoRV é ligado com um fragemnto de 4896 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e EcoRV para gerar o plasmí-deo pLF1024 (aproximadamente 6619 pb). O gene HN de bPI-3 codifica para uma proteína de 572 aminoá- cidos. 7.1.2 PLF1025: aene HN. forma (B-alobina tPA-E2 ΔΓΓΜ11 clonado no vetor PLF999 O gene HN deletado de seu domínio transmembranário é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pl_F1024 (exemplo 7.1.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF05B (33 mer) (SEQID NO 49) 5’ CATACTGGGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT 3' e LF059 (35 mer) (SEQ !D NO 50) 5’ CATATCGATATCTAGCTGCAGI í ΓΠ CGGAACTTC 3’. O fragmento de DNA de 1566 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl e EcoRV é ligado com um fragmento de 5663 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e EcoRV para gerar o plasmí-deo pl_F1025 (aproximadamente 7229 pb). O gene HN de bPI-3 assim modificado (β-globina tPA-E2 Δ [TM]) codifica para uma proteína de 548 aminoácidos. 7.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de F da cepa bPI-3 SF-4 7.2.1 PLF1026: gene F (forma nativa1) clonado no vetor PVR1012. O DNAc do gene F da cepa SF-4 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF061 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF060 (36 mer) (SEQ ID NO 51) 5’ GATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA3‘ e LF061 (36 mer) (SEQ !D NO 52) 5’ CATGACGAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA 3’. O fragmento de DNA de 1628 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e BGIII é ligado com um fragmento de 4860 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1026 (aproximadamente 6488 pb). O gene F de bPI-3 codifica para uma proteína de 550 aminoáci- dos. 7.2.2 pLF1027: gene F. forma (β-qlobina tPA-F ΔΓΤΜ+Cterl) clonado no vetor PLF999 O gene F deletado de seus domínios transmembranário e C-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1026 (exemplo 7.2.1) e com o auxílio do binário dos seguintes oligonucleotídeos: LF062 (42 mer) (SEQID NO 53) 5’ CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAAÇGT3’ e LF0B3 (41 mer) (SEQ ID NO 54) 5' CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC 3'. O fragmento de DNA de 1434 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl e EcoRV é ligado com um fragmento de 5663 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl e EcoRV para gerar o plasmídeo pLF1027 (aproximadamente 7097 pb). O gene F de bPI-3 assim modificado (β-globina tPA-F Δ [TM+Cter]) codifica para uma proteína de 504 aminoácidos. EXEMPLO 8: Plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus da pseudoragem (PRV).

Os genes codificando para as glicoproteínas gB, gC e gD de PRV são obtidos por PCR a partir do DNA viral do cepa NIA3 (M. Rivière et al. J. Virol. 66. 3424-3434; A. Baskerville et al., The Veterinary Bulletin, 1973, 43, N° 9). Mutantes do cepa NIA3 de PRV podem igualmente ser utilizados e são descritos em US-A-4.680.176 e depositados junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, France, sob as referências 1-351 e I-352.

8.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de PRV-aB 8.1.1 pSB101: aene aB (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O gene gB do cepa NIA3 de PVR é amplificado por PCR, utilizando o DNA viral como matriz das seguintes atrações: SB201 (36 mer) (SEQID NO 55) 5’ TT7TAAGATATCATGCCCGGTGGTGGCGGTCTTTGG 3’ e SB202 (39 mer) (SEQ ID NO 56) 5’ TTTTAAGGATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTC 3’. O produto de amplificação (2766 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e BamHI, gerando o plasmídeo pSB101, de um tamanho de aproximadamente 7631 pb. O gene gB de PRV codifica para uma glicoproteína de 913 ami- noácidos. 8.1.2 pSB102: aene aB (forma ΔΓΤΜ-Cterl) clonado no vetor PVR1012 A forma truncada do gene gB da cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR, utilizando o DNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB201 (SEQ ID NO 55) e SB203 (39 mer) (SEQ ID NO 57) 5’ TTTTAAGGATCCCTAGTGGTCCACCTTGACCACGCGGTC 3’. O produto de amplificação (2262 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e BamHI, gerando o plasmídeo pSB102, de um tamanho de aproximadamente 7142 pb. A forma truncada (A[TM-Cter]) do gene gB codifica para uma glicoproteína de 750 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gB de PRV. 8.1.3 pNS009: aene aB (forma tPA AÍTM-Cterl) clonado no vetor pAB110 A forma tPA A[TM-Cter] do gene gB da cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR a partir da matriz pSB101 (exemplo 8.1.1) e com o auxílio das seguintes atrações: SB203 (SEQID NO 57) e SB217 (39 mer) (SEQ ID NO 58) 5’ AAAATTTCGATATCCACCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGG 3’. O produto de amplificação (2088 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pNS009, de um tamanho de aproximadamente 7127 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gB codifica para uma glicopro-teína de 720 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gB de PRV.

8.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de PRV-aC 8.2.1 PSB103: aene aC (forma natival clonado no vetor PVR1012 O gene gC da cepa NIA3 de PRV é amplificado por PCR, utilizando o DNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB204 (36 mer) (SEQ ID NO 59) 5' TTTTAAGATATCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATG 3’ e SB205 (37 mer) (SEQ ID NO 60) 5’ TTTTAAAGATCTTTAAGGCCCCGCCTGGCGGTAGTAG 3’. O produto de amplificação (1452 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB103, de um tamanho de aproximadamente 6323 pb. O gene gC de PRV codifica para uma glicoproteína de 479 aminoácidos. 8.2.2 pSB104: aene aC (forma ΔΓΤΜ-CterT) clonado no vetor PVR1012 A forma truncada do gene gC da cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR, utilizando o DNA viral com matriz e com o auxílio das seguintes amostras: SB204 (SEQ ID NO 59) e SB206 (36 mer) (SEQ ID NO 61) 5’ TTTTAAAGATCTTTAGGGGGAGGCGTCGTAGCGCTG 3'. O produto de amplificação (1332 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB104, de um tamanho de aproximadamente 6206 pb. A forma truncada (A[TM-Cter]) do gene gC codifica para uma glicoproteína de 440 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glico-proteína gC de PRV. 8.2.3 pNS012: gene aC fforma tPA ΔΓΤΜ-Cterll clonado no vetor pAB1 10 A forma tPA A[TM-Cter]-do gene gC- da cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR, a partir da matriz pSB103 (exemplo 8.2.1) e com o auxílio das seguintes atrações: SB206 (SEQ ID NO 61) e SB218 (39 mer) (SEQ ID NO 62) 5' AAAATTTCGATATCCACGGCGCTCGGCACGACGCCCAAC 3’. O produto de amplificação (1270 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pNS012, de um tamanho de aproximadamente 6311 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gC codifica para uma glicoproteína de 448 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gC de PRV.

8.3 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de PRV-aD 8.3.1 pSB105: aene aD fforma nativa) clonado no vetor PVR1012. O gene gD da cepa NIA3 de PRV é amplificado por PCR, utilizando o DNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB207 (36 mer) (SEQ1D NO 63) 5’ AATTTTGATATCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCG 3' e SB208 (36 mer) (SEQ ID NO 64) 5' AATTTTGGATCCCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG 3’. O produto de amplificação (1227 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e BamHI, gerando o plasmídeo pSB105, de um tamanho de aproximadamente 6104 pb. O gene gD de PRV codifica para uma glicoproteína de 404 ami- noácidos. 8.3.2 pSB1 06: aene aD (forma ΔΓΤΜ-Cterl) clonado no vetor pRV1012 A forma truncada do gene gD da cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR, utilizando o DNA viral como matriz e com o auxílio das seguintes atrações: SB207 (SEQ ID NO 63) e SB209 (40.mer) (SEQ ID NÓ 65) 5’ AAATTTTGGATCCCTAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGC 3'. O produto de amplificação (1077 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e BamHI, gerando o plasmídeo pSB106 de um tamanho de aproximadamente 5957 pb. A forma truncada (A[TM-Cter]) do gene gD codifica para uma glicoproteína de 355 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gD de PRV. 8.3.3 OPB238: gene aD íforma tPA ΔΓΤΜ-Cterll clonado no vetor pAB1 10 A forma tPA A[TM-Cter] da gene gD do cepa NIA3 de PRV é amplificada por PCR a partir da matriz pSB105 (exemplo 8.3.1) e com o auxílio das seguintes atrações: SB209 (SEQ ID NO 65) e SB219 (39 mer) (SEQ ID NO 66) 5’ AAAATTTCGATATCCACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCG 3’. O produto de amplificação (1015 pb) é digerido pelas enzimas EcoRV e BamHI e clonado no vetor pAB110 (exemplo 2) previamente digerido por EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pPB238, de um tamanho de aproximadamente 6056 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gD codifica para uma glicoproteína de 363 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gD de PRV. EXEMPLO 9: plasmídeo codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus da síndrome respiratória e reprodutor suíno (PRRSV), cepa Le-lystad Os genes codificando para as proteínas COL3, COL5 e COL6 de PRRSV são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral da cepa Lelystad (J.Meulenberg et al. Virology, 1993. 19. 62-72; WO-A-92-21375), depositado em 5 de junho de 1991 junto à Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, Paris, France, sob a referência 1-1102. 9.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do COL3do cepa PRRSV Lelvstad 9.1.1 PLF1009: gene COL3 (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNAc do gene COL3 da cepa Lelystad é sintetizado partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF028 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF027 (30 mer) (SEQ ID NO 67) 5' CACTACGATATCATGGCTCATCAGTGTGCA3’ e LF028 (30 mer) (SEQ ID NO 68) 5’ CACTACAGATCTTTATCGTGATGTACTGGG 3’. O fragmento de DNA de 802 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Bgllll é ligado com um fragmento de 4879 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Bglll para gerar o plasmídeo pLF 1009 de um tamanho de aproximadamente 5681 pb. O gene COL3 de PRRSV Lelystad codifica para uma proteína de 265 aminoácidos. 9.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do COL5 da cepa PRRSV Lelvstad 9.2.1 PLF1011: gene CQL5 (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNAc do gene COL5 da cepa Lelystad é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF020 e amplificado por uma reação de PCR ao auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF019 (30 mer) (SEQ ID NO 69) 5’ CTCACCGTCGACATGAGATGTTCTCACAAA 3’ e LF020 (30 mer) (SEQID NO 70) 5’ CTCACCTCTAGACTAGGCCTCCCATTGCTC 3’. O fragmento de DNA de 802 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Xbal é ligado com um fragmento de 4879 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Xbal para gerar o plasmídeo pl_F1011 de um tamanho de aproximadamente 5681 pb. O gene COL5 de PRRSV Lelystad codifica para uma proteína de 201 aminoácidos. 9.2.2 pLF1012: gene COL5 (forma truncadal clonada no vetor pAB110. O gene COL5 deletado de seus domínios transmembranário e carbóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1011 (exemplo 9.2.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF021 (30 mer) (SEQ ID NO 71) 5’ CACCTCGGATGCTTTGCCGATGGCAACGGC 3’ e LF022 (33 mer) (SEQ ID NO 72) 5' CACCTCGGATCCTTAGACTTCGGCTTTGCCCAA 3’. O fragmento de DNA de 432 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5105 pb resultante da digestão de pAB110 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pLF1012 de um tamanho de aproximadamente 5537 pb. O gene COL5 de PRRSV Lelystad assim modificado (tPA A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 168 aminoácidos. 9.3 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do COL6 da cepa PRRSV Lelystad 9.3.1 pLF1013: gene COL6 (forma nativa) clonado no vetor pVR1012. O DNAc do gene COL6 da cepa Lelystad é sintetizado a partir do RN A viral correspondente com o auxílio da atração LF024 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF023 (30 mer) (SEQ ID NO 73) 5’ CACTCAGτCGACAτGGGAGGCCTAGACGAT3, e LF024 (30 mer) (SEQID NO 74) 5’ CACTCATCTAG ATT ACCGGCC ATACTTG AC 3’. O fragmento de DNA de 528 obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Xbal é ligado com um fragmento de 4881 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Xbal para gerar o plasmídeo pLF1013 de um tamanho de aproximadamente 5409 pb. O gene COL6 de PRRSV Lelystad codifica para uma proteína de 173 aminoácidos. 9.3.2 PLF1014: gene COL6 (forma truncada) clonado no vetor pAB1 10 O gene COL6 deletado de seus domínios transmembranário e carbóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1013 (exemplo 9.3.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF025 (30 mer) (SEQ ID NO 75) 5’ GACTACGGATCCGTGTCACGCGGCCGACTC 3’ e LF026 (33 mer) (SEQ ID NO 76) 5’ CACTACGGATCCTTAAACAGCTCGTTTGCCGCC 3’. O fragmento de DNA de 390 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5105 pb resultante da digestão de pAB110 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pLF1014 de um tamanho de aproximadamente 5495 pb. O gene COL6 de PRRSV Lelystad assim modificado (tPA A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 154 aminoácidos. EXEMPLO 10: plasmídeo codificando para as diferentes formas dos antíge-nos do vírus da síndrome respiratória e reprodutor suíno (PRRSV), cepa americana ATCC VR-2332 Os genes codificando para as proteínas COL3, COL5 e COL6 dos vírus PRRSV são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral da cepa americana (M. Murtaugh et al. Arch Vitol. 1995. 140. 1451 -1460), depositado junto à ATCC sob o número VR-2332. 10.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do CQL3 da cepa PRRSV VR-2332 10.1.1 PLF1015: gene COL3 (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O DNAc do gene COL3 da cepa VR-2332 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF038 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF037 (30 mer) (SEQID NO 77) 5’ CACTACGATATCATGGTTAATAGCTGTACA 3’ e LF038 (30 mer) (SEQ ID NO 78) 5' CACTACTCTAGACTATCGCCGTACGGGACT 3’. O fragmento de DNA de 769 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Xbal é ligado com um fragmento de 4900 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Bgllll para gerar o plas-mídeo pl_F1015 de um tamanho de aproximadamente 5669 pb. O gene COL3 de PRRSV cepa VR-2332 codifica para uma proteína de 254 aminoácidos. 10.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do COL5 da cepa PRRSV VR-2332 10.2.1 pLF1017: gene COL5 íforma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNAc do gene COL5 da cepa VR-2332 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente com o auxílio da atração LF030 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF029 (30 mer) (SEQ ID NO 79) 5‘ CACTACGATATCATGTTGGAGAAATGCTTG 3’ e LF030 (30 mer) (SEQ ID NO 80) 5’ CACTACAGATCTCTAAGGACGACCCCATTG3'. O fragmento de DNA de 607 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Bglll é ligado com um fragmento de 4879 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Bglll para gerar o plas-mídeo pLF1017 de um tamanho de aproximadamente 5486 pb. O gene COL5 de PRRSV cepa VR-2332 codifica para uma pro- teína de 200 aminoácidos. 10.2.2 PLF1018: aene COL5 (forma truncada) clonado no vetor dAB1 10 O gene COL5 deletado de seus domínios transmembranários e carbóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1017 (exemplo 10.2.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF031 (33 mer) (SEQID NO 81) 5’ CACTACGGATGCGCCAGCAACGACAGCAGCTCC 3’ e LF032 (33 mer) (SEQ ID NO 82) 5’ CACTACGGATCCTTAGACCTCAACTTTGCCCCT 3*. O fragmento de DNA 426 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5105 pb resultante da digestão de pAB110 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pLF1018 de um tamanho de aproximadamente 5531 pb. O gene COL5 de PRRSV cepa VR-2332 assim modificado (tPA A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 166 aminoácidos. 10.3 Plasmídeos codificando para as diferentes formas do COL6 da cepa PRRSV VR-2332 10.3.1 pLF1019: gene COL6 (forma nativa) clonado no vetor PVR1012. O DNAc do gene COL6 da cepa Lelystad é sintetizado a partir do RNA viral correspondente com o auxílio do atração LF034 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do binário dos seguintes oligonucleo-tídeos: LF033 (33 mer) (SEQ ID NO 83) 5’ CACATCCTGCAGATGGGGTCGTCCTTAGATGAC 3’ e LF034 (30 mer) (SEQ ID NO 84) 5’ CACATCTCTAGATTATTTGGCATATTTGAC 3’. O fragmento de DNA de 527 pb obtido por digestão do produto de pCR por Pstl e Xbal é ligado com um fragmento de 4871 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Pstl e Xbal para gerar o plasmídeo pLF1019 de um tamanho de aproximadamente 5398 pb. O gene COL6 de PRRSV cepa VR-2332 codifica para uma pro- teína de 174 aminoácidos. 10.3.2 pLF 1016: gene COL6 (forma truncada) clonado no vetor pAB110 O gene COL6 deletado de seus domínios transmembranário e carbóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1019 (exemplo 10.3.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF035 (30 mer) (SEQID NO 85) 5’ CACTACGGATCCGTGAGTCGCGGCCGACTG 3’ e LF036 (33 mer) (SEQ ID NO 86) 5’ CACTACGGATCCTTAAACAGCTTTTCTGCCACC 3’. O fragmento de DNA de 390 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5105 pb resultante da digestão de pAB110 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pLF1016 de um tamanho de aproximadamente 5495 pb. O gene COL6 de PRRSV cepa VR-2332 assim modificado (tPA A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 154 aminoácidos. EXEMPLO 11: Plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antí-genos do vírus da gripe suína (SIV), de posição H1N1 Os genes codificando para os antígenos hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) do vírus da gripe suína de tipo H1N1 são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral de uma cepa "SW" H1N1. Cepas são disponíveis junto ao Centre de Recherche en Virologie, Instituí Armand-Frappier, Université du Quebec, Lavai, Canada (D.S. Arora et al., Virus Genes, 1997, 14, 251-254). Ver também G.W. Both et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, 80, 6996-7000. 11.1 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de HA da cepa SIV H1N1 11.1.1 pLF1001: gene HA (forma nativa) clonado no vetor PVR1012. O DNAc do gene HA da cepa H1N1 é sintetizada a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF004 e amplificado por uma reação de PCR com auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF003 (30 mer) (SEQ ÍD NO 87) 5’ CTCCATGATATCATGGAAGCAAAACTATTC 3’ e LF004 (30 mar) (SEQID NO 88) 5’ CTCCATCAGATCTTAAATGCATATTCTGCA 3’. O fragmento de DNA de 1705 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Bglll é ligado com um fragmento de 4879 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Bglll para gerar o plas-mídeo pLF1001 de um tamanho de aproximadamente 6584 pb. O gene HA de SIV H1N1 codifica para uma proteína de 566 aminoácidos. 11.1.2 PLF1002: gene HA (forma modificada) clonado no vetor PLF999. O gene HA deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1001 (exemplo 11.1.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotí-deos: LF005 (30 mer) (SEQ ID NO 89) 5’ TGCGCGGCCGCACATGCTAACAATTCGACA 3’ e LF006 (32 mer) (SEQ ID NO 90) 5' TCCGCGGCCGCTTACATTGATTCTAGTTTCAC 3'. O fragmento de DNA de 1515 pb obtido por digestão do produto de PCR por Notl é ligado com um fragmento de 5678 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por Notl para gerar o plasmídeo pLF1002 de um tamanho de 7193 pb. O gene HA de SIV H1N1 assim modificado (íntron II do gene da β-globina do coelho, tPA, A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 530 aminoácidos. 11.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de NA da cepa SIV H1N1 11.2.1 PLF1003: gene NA (forma nativa) clonado no vetor PVR1012. O DNAc do gene NA da cepa H1N1 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF008 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF007 (30 mer) (SEQ ID NO 91) 5' CACCTGGTCGACATGAATCCAAATCAGAAQ 3' e LF008 (3Θ mer) (SEQID NO 92) 5’ CACGTGTCTAGACTAGTTGTCAATGGTGAA 3’. O fragmento de DNA de 1416 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Xbal é ligado com um fragmento de 4881 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Xbal para gerar o plasmídeo pLF1003 de um tamanho de aproximadamente 6297 pb. O gene NA de SIV H1N1 codifica para uma proteína de 469 aminoácidos. 11.2.2 pLF1004: gene NA (forma modificada) clonado no vetor pLF999 O gene NA deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1003 com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF009 (31 mer) (SEQ ID NO 93) 5’ CACTACGAATTCACAAATTGGGAATCAAAAT 3’ e LF010 (30 mer) (SEQ ID NO 94) 5’ AATTTGTGAATTCGCGGCCGCGGATCCGGT 3’. O fragmento de DNA de 1207 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRI é ligado com um fragmento de 5678 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por EcoRI para gerar o plasmídeo pLF1004 de um tamanho de aproximadamente 6885 pb. O gene NA de SIV H1N1 assim modificado (íntron II do gene da β-globina do coelho, tPA, A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 431 aminoácidos. EXEMPLO 12: Plasmídeos codificando para as diferentes formas dos antí-genos do vírus da gripe suína (SIV), cepa H3N2 Os genes codificando para os antígenos hemaglutinina HA e NA do vírus da gripe suína de tipo H3N2 são obtidos por RT-PCR a partir do RNA viral da cepa "Côtes du Nord 1987" (cdn87), marcadas pela Organisati-on Mondiale de Ia Santé (OMS) e disponível junto ao National Influenza Re-ference Center, Virology Laboratory, 8 avenue Rockfeller, 69008 Lyon, Fran-ce. 12.1. Plasmídeo codificando para as diferentes formas de HA da cepa SIV H3N2 12.1.1 pLF 1005: gene HA (forme nativel clonado no vetor pVR1012 O DNAc do gene HA da cepa H3N2 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF012 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio da atração LF012 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF011 (30 mer) (SEQID NO 95) 5' CTGCACGTCGACATGAAGACTGTCATTGCC 3’ e LF012 (24 mer) (SEQ ID NO 96) 5' GATATGTCAGATGCAAATQTTGCA 3’. O fragmento de DNA de 1709 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Sall é ligado com um fragmento de 4893 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Sall para gerar o plasmídeo pLF1005 de um tamanho de aproximadamente 6602 pb. O gene HA de SIV H3N2 codifica para uma proteína de 566 aminoácidos. 12.1.2 pLF1006: gene HA (forma modificada) clonado no vetor PLF999 O gene A deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1005 (exemplo 12.1.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF013 (33 mer) (SEQ ID NO 97) 5’ GACGGCGGATGCCTTCCAGAAAATGGGAGGAGA 3' e LF014 (33 mer) (SEQ JD NO 98) 5’ CACCGCGGATCCTTAGTCTTTGTATCCCGACTT 3’. O fragmento de DNA de 1542 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5678 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pl_F1006 de um tamanho de aproximadamente 7220 pb. O gene HA de SIV H3N2 assim modificado (íntron II do gene da β-globina do coelho, tPA, A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 538 aminoácidos. 12.2 Plasmídeos codificando para as diferentes formas de NA da cepa SIV H3N2 12.2.1 pLF1007: aene NA (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNAc do gene NA da cepa H3N2 é sintetizado a partir do RNA viral correspondente ao auxílio da atração LF016 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF015 (30 mer) (SEQID NO 99) 5' CACTCAGATATCATGAATCCAAAGCAAAAG 3’ e LF016 (30 mer) (SEQ ID NO 100) 5’ CACTCATCTAGATTATATAGGCATGAGATC 3’. O fragmento de DNA de 1414 pb obtido por digestão do produto de PCR por EcoRV e Xbal é ligado com um fragmento de 4900 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por EcoRV e Xbal para gerar o plas-mídeo pLF1007 de um tamanho de aproximadamente 6314 pb. O gene NA de SIV H3N2 codifica para uma proteína de 469 aminoácidos. 12.2 PLF1008: aene NA (forma modificadal clonado no vetor pLF999 O gene NA deletado de seus domínios transmembranário e car-bóxi-terminal é sintetizado por uma reação de PCR a partir da matriz pLF1005 (exemplo 12.2.1) com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF017 (33 mer) (SEQ ID NO 101) 5’ CACTACGGATCCTTCAAGCAATATGAGTGCGAC3’ e LF018 (33 mer) (SEQ ID NO 102) 5' CACTACGGATQCTTATQAAQTCCACCATACTCT 3’ O fragmento de DNA de 1221 pb obtido por digestão do produto de PCR por BamHI é ligado com um fragmento de 5678 pb resultante da digestão de pLF999 (exemplo 2) por BamHI para gerar o plasmídeo pl_F1008 de um tamanho de aproximadamente 6899 pb. O gene NA de SIV H3N2 assim modificado (íntron II do gene da β-globina do coelho, tPA, A[TM+Cter]) codifica para uma proteína de 431 aminoácidos. EXEMPLO 13: Plasmídeo codificando para o GM-CSF bovino O DNAc do gene GM-CSF bovino é sintetizado a partir do RNA celular de células mononucleadas sangüíneas bovinas com o auxílio da atração LF065 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF054 (36 mer) (SEQ1D N0103) 5’ CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3' e LF055 (34 mer) {SEQ ID N0104) 5’ CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3'. O fragmento de DNA de 437 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Bglll é ligado com um fragmento de 4860 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1032 (aproximadamente 5297 pb). O gene GM-CSF bovino codifica para uma proteína de 143 aminoácidos. EXEMPLO 14: Plasmídeo codificando para o GM-CSF bovino O DNAc do gene GM-CSF suíno é sintetizado a partir do RNA celular de células mononucleadas sangüíneas suínas com o auxílio da atração LF067 e amplificado por uma reação de PCR com o auxílio do par dos seguintes oligonucleotídeos: LF056 (36 mer) (SEQ 1D NO 105) 5’ CATATGGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTÇTC 3’ e LF057 (37 mer) (SEQ ID N0106) 5' CATGACCAGATCTrCACTTCTGGGCTGQTTCCCAGCA 3\ O fragemnto de DNA de 440 pb obtido por digestão do produto de PCR por Sall e Bglll é ligado com um fragmento de 4860 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) por Sall e Bglll para gerar o plasmídeo pLF1033 (aproximadamente 5300 pb). O gene GM-CSF suíno codifica para uma proteína de 144 aminoácidos. EXEMPLO 15: Formulação dos plasmídeos vacinais A solução de DNA contendo um ou vários plasmídeos, segundo os exemplos 3 a 14, é concentrada por precipitação etanólica conforme des- crito em Sambrook et al. (1989). O resíduo de DNA é retomado por uma solução de NaCI 0,9 %, de forma a se obter uma concentração de 1 mg/ml. Uma solução de DMRIE-DOPE a 0,75mM é preparada por retomada de um liofilizado de DMRIE-DOPE por um volume adaptado de H2O estéril. A formação dos complexos DNA plasmídico-lipídeo é realizada por diluição em partes iguais da solução de DMRIE-DOPE 0.75 mM pela solução de DNA a 1 mg/ml em NaCI 0,9 %. A solução de DNA é introduzida progressivamente com o auxílio de uma agulha engastada 26G ao longo da parede do frasco contendo a solução de lipídeo catiônico, de forma a evitar a formação de espuma. Procede-se a uma agitação suave, desde que as duas soluções sejam misturadas. É obtida no final uma composição que compreende 0,375 mM de DMRIE-DOPE e 500 pg/ml de plasmídeo. É desejável que o conjunto das soluções utilizadas está à temperatura ambiente para o conjunto das operações descritas acima. Deixa-se a complexação DNA/DMRIE-DOPE colocar-se à temperatura ambiente durante 30 minutos aproximadamente antes de proceder à imunização dos animais. EXEMPLO 16: Imunização dos bovinos contra BHV-1 12 bovinos são randomizados em 3 grupos de 4 animais. O grupo 1 constitui o grupo dos animais provas.

Administra-se nos animais do grupo 2 uma mistura de plasmí-deos vacinais pPB281 (codificando para gB de BHV-1 sob uma forma Δ[ΤΜ-Cter], exemplo 3.1.2), pPB292 (codificando para gC de BHV-1 sob uma forma A[TM-Cter], exemplo 3.2.2) e pPB284 (codificando para gD de BHV-1 sob uma forma A[TM-Cter], exemplo 3.3.2).

Administra-se nos animais do grupo 3 a mesma mistura que aquela do grupo 2, mas formulada com DMRIE-DOPE conforme descrito no exemplo 15.

Uma injeção de 10 ml por via intramuscular é praticada com o auxílio de seringas munidas de agulha sobre cada bovino, e é repetida 21 dias mais tarde. A massa total de cada plasmídeo utilizado quando de cada imunização é de 1500 pg. O técnico possui os conhecimentos necessários para adaptar o volume ou a concentração em função da dose de plasmídeo requerida.

Uma seqüência da resposta serológica induzida pelas duas misturas de plasmídeos vacinas, expressando os antígenos gB, gC e gD de BHV-1 é realizada em período de 35 dias após a primovacinação.

Os resultados são apresentados na tabela a seguir: EXEMPLO 17: Imunização dos porcos contra PRV 15 porcos, com idades aproximadas de 7 semanas, são rando-mizados em 3 grupos de 5 animais. O grupo 1 constitui o grupo dos animais provas.

Administra-se nos animais do grupo 2 uma mistura de plasmídeos vacinais pNS009 (codificando para gB de PRV sob uma forma tPA A[TM-Cter], exemplo 8.1.3), pNS012 (codificando para gC de PRV sob uma forma tPA A[TM-Cter], exemplo 8.2.3) e pPB238 (codificando para gD de PRV sob uma forma tPA A[TM-Cter], exemplo 8.3.3).

Administra-se nos animais do grupo 4 a mesma mistura que aquela do grupo 3, mas formulada com DMRIE-DOPE conforme foi descrito no exemplo 15, a fim de se obter uma concentração final em DMRIE-DOPE de 0,0535 mM. 350 μg de cada plasmídeo necessário para esses protocolos de vacinação são misturados em um volume final de 14 ml.

Uma injeção de 2 ml por via intramuscular é praticada com o auxílio de seringas munidas de agulha sobre cada porco, e é repetida em 21 dias mais tarde.

Os porcos são testados no 35° dia por administração nasal de 2 ml de uma solução de vírus de prova PRV cepa NIA3, à razão de 1 ml por narina e titulando 107,76DICC5o por ml.

Um acompanhamento do peso (em kg) de cada animal é feito em um período de 42 dias, após a primovacinação. O ganho ponderai relativo (G7) é calculado para cada animal em um período de 7 dias que se segue à prova. Trata-se da diferença entre o peso no 7- dia (J7) e no dia da prova (JO), dividida pelo peso do JO, levada a 1 dia e expressa em percentagem: (peso no J7 - peso no JO). 100/(peso no J0.7). ΔΘ7 é a diferença entre as médias dos ganhos ponderais relativos dos animais vacinados e dos animais provas.

Os resultados são apresentados na tabela que se segue: Deve ser bem compreendido que a invenção definida pelas reivindicações anexadas não está limitada aos modos de realização particulares indicados na descrição acima, mas engloba as variantes que não saiam nem do âmbito, nem do espírito da presente invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Vacina DNA contra vírus de herpes bovino tipo 1 caracterizada pelo fato de compreender um plasmídeo contendo uma sequência nucleotídica codificando um imunógeno de vírus de herpes bovino tipo 1 (BHV-1), em que o imunógeno de BHV-1 é a glicoproteína B (gB); glicoproteína c (gC), ou glicoproteína D (gD), em que os antígenos gB, gC e gD de BHV-1 estão sob a forma [TM-Cter] , em que compreende um plasmídeo de expressão codificando o antigeno gB de BHV-1 otimizado pela deleção do fragmento da sequência nucleotídica codificando o domínio transmembranário e a porção C-terminal contígua, um segundo plasmídeo de expressão codificando o antigeno gC de BHV-1 otimizado pela deleção do fragmento da sequência nucleotídica codificando o domínio transmembranário e a porção C-terminal contígua, e um terceiro plasmídeo de expressão codificando o antigeno gD de BHV-1 otimizado pela deleção do fragmento da sequência nucleotídica codificando o domínio transmembranário e a porção C-terminal contígua e elementos necessários que permitam a expressão in vivo dessa sequência, N(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamônio (DMRIE) e dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE), em que vacina compreende simultaneamente os três antígenos (gB, gC e gD) de BHV-1.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma proteína fator estimulador de colônia de granulócito-macrófago (GMCSF).

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão é um plasmídeo.