CN1404398B - 用于生产型动物的改良dna疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对感染生产型动物(特别是牛或猪)的病原体的DNA疫苗,它含有质粒-该质粒含有编码所述动物种的病原体免疫原的核苷酸序列(在使该序列能在体内表达的条件下),和含有季铵盐的阳离子脂,这种脂具有通式(I),其中R1是饱和或不饱和的线型脂族基团,含有12-18个碳原子;R2是另一个脂族基团,含有2或3个碳原子;X是羟基或氨基,该脂优选地是DMRIE。
Description
技术领域
本发明涉及用于家畜(特别是牛和猪)的改良DNA疫苗。
背景技术
自从二十世纪九十年代初以来,已经了解了脱氧核糖核酸(DNA)分子在接种中的用途(Wolf等人,Science 1990.247.1465-1468)。用编码有免疫活性的蛋白质的DNA或RNA分子体内转染将要接种的受体的细胞后,该接种技术诱发细胞和体液免疫。
一种DNA疫苗由至少一种质粒和药学可接受的载体或赋形剂组成,这种质粒由将要接种的受体的细胞机器表达。该质粒的核苷酸序列尤其编码一种或多种免疫原,例如能够在将要接种的受体中诱发细胞免疫应答(T淋巴细胞的动员)和体液免疫应答(刺激产生针对免疫原的特异性抗体)的蛋白质或糖蛋白(Davis H.L Current Opinion Biotech.1997.8.635-640)。
来自病原体的所有免疫原都不是在将要接种的动物中自然地十分有效地诱发最佳保护性免疫应答的抗原。因此必须增强免疫应答。
已提出DNA疫苗的多种施用途径(腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、粘膜等)。也提出了多种施用工具,特别是DNA包被和发射的金颗粒-用以穿透到将要接种的受体的皮肤细胞内(Tang等人,Nature 1992.356.152-154),和液体射流注射器-能转染皮肤细胞和下面的组织细胞(Furth等人,Analytical Bioch.1992.205.365-368)。
一些化学化合物已经用于DNA的体外转染:
A/-阳离子脂类。
阳离子脂类本身分为4个亚类。
1)含有季铵盐的阳离子脂,如DOTMA(二油酰-氧丙基三甲铵,Gibco生产,商品名为Lipofectine)、DOTAP(三甲基-2,3-(十八碳-9-烯酰氧基)-1-丙基铵;Gregoriadis等人,FEBS Letters 1997.402.107-110)、DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙基铵;WO-A-9634109)、DLRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-丙基铵;Felgner等人,Ann.N Y Acad.Sci.1995.772.126-139)。
这些含有季铵盐的阳离子脂可以与另一种中性脂组合,如DOPC(二油酰-磷脂酰胆碱)或DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)(J.P.Behr,Bioconjugate Chemistry 1994,5.382-389)。
2)脂胺(lipoamine),如DOGS(双十八烷基氨基甘氨酰精胺,Promega生产,商品名为Transfectam;Abdallah等人,Biol.Cell.1995.85.1-7)、DC-Chol(二甲基氨基乙烷-氨甲酰基-胆固醇;Gao和Huang,Biochem.Biophys.Res.Commun.1991.179.280-285)、BGSC(双胍-亚精胺-胆固醇)、BGTC(双胍-三(氨乙基)胺-胆固醇)(Vigneron等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996.93.9682-9686)。
3)含有季铵盐和脂铵的阳离子脂类,如DOSPA(N,N-二甲基-N-(2-(精胺羧基酰胺基)乙基)-2,3-双(二油酰氧基)-1-丙烷亚胺五氢-氯化物,Gibco销售,商品名为LipofectAmine;Hawley-Nelson等人,Focus 1993.15.73-79)、GAP-DLRIE(N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-丙烷铵;Wheeler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996.93.11454-11459;Norman等人,Vaccine 1997.15.801-803)。
4)含有脒盐的脂类,如ADPDE、ADODE(Ruysschaert等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.1994.203.1622-1628)。
B/-聚合物,如SuperFectTM(活化的dendrimer分子,Qiagen生产;Xu等人,Mol.Genet.Metab.1998.64.193-197),和
C/-生物化学剂,如毒素,特别是霍乱毒素。
这些化合物中有一些已经用于配制效果减轻的DNA疫苗。体外转染领域的知识不适用于DNA接种,后者的最终目的在于确保保护性免疫反应。利用已知能促进体外转染的化合物观察到对诱发有效免疫保护的负面影响。一些制剂化学化合物在高剂量时对转染的细胞有毒性。
在Etchart的工作中(Etchart等人,J.Gen.Virol.1997.78.1577-1580),在经鼻内途径施用DNA疫苗的过程中使用DOTAP没有佐剂作用,而经口途径有佐剂作用。DOTAP也已经用于编码流感病毒血凝素(HA)的DNA疫苗(用于小鼠模型),经鼻内途径施用(Ban等人,Vaccine1997.15.811-813),但是加入DOTAP抑制免疫应答。在通过肌内途径施用的编码乙肝病毒表面蛋白(S)的DNA疫苗(用于小鼠模型)中使用DC-Chol或DOTAP/DOPE,能提高抗体应答,而使用Lipofectine(或DOTMA)不能提高这种应答(Gregoriadis等人,FEBS Letters 1997.402.107-110)。DC-Chol/DOPE也已经用于针对人类免疫缺陷病毒(HIV,Env蛋白)的DNA疫苗(用于小鼠模型),经肌内途径施用诱发更有效的免疫应答,而经皮下或皮内途径施用不能提高这种应答(Ishii等人,AIDS Res.Hum.Retro.1997.13.1421-1428)。
添加某些细胞因子,特别是白介素和干扰素,能提高特别是由DNA疫苗诱发的免疫应答。每种细胞因子引发一种特异性的反应,将免疫应答较高或较低程度地定向于细胞反应或体液反应(Pasquini等人,Immunol.Cell.Biol.1997.75.397-401;Kim等人,J.InterferonCytokine Res.1999.19.77-84)。如果免疫内容不同,特别是如果对另外的物种施用这种细胞因子,因此处于异源免疫系统中,从特定种获得的细胞因子的佐剂作用不一定相同。加入细胞因子也可能没有佐剂作用,或者甚至可能导致所研究的作用逆转,也就是说,免疫应答降低或者抑制。因此,编码与GM-CSF融合的单链免疫球蛋白的DNA疫苗不能增强免疫应答,而直接对小鼠施用这种融合蛋白是有效的,施用由Fv和细胞因子IL-1β组成的融合蛋白,或者施用编码后一种融合蛋白的DNA疫苗,具有相同的结果(Hakim等人,J.Immunol.1996.157.5503-5511)。使用以融合或非融合构象共表达细胞因子IL-2和乙型肝炎病毒包膜蛋白的质粒导致体液和细胞免疫应答均增强(Chow等人,J.Virol.1997.71.169-78)。然而,使用编码人类获得性免疫缺陷病毒(HIV-1)糖蛋白gp120和细胞因子IL-2的双顺反子质粒,比使用只编码gp120的单顺反子质粒诱发更低的特异性抗-gp120免疫应答(Barouch等人,J.Immunol.1998.161.1875-1882)。向小鼠中同时注射两种表达载体-一种编码狂犬病病毒G糖蛋白,另一种编码鼠GM-CSF-刺激B和T淋巴细胞的活性,而同时注射编码γ-干扰素(代替鼠GM-CSF)的质粒导致免疫应答降低(Xiang等人,Immunity 1995.2.129-135)。
抗原的某种修饰,如编码抗原的核苷酸序列部分的缺失,DNA片段插入编码抗原的核苷酸序列中或非翻译区上游或下游,也能提高DNA疫苗的效能,特别是通过提高抗原的表达水平或其递呈。
然而实际上,对编码抗原的核苷酸序列操作可能导致最初的免疫活性降低或丧失。因此,编码狂犬病病毒G抗原的基因中跨膜域缺失,使得通过肌内途径施用编码这种修饰抗原的DNA疫苗后在小鼠模型中诱发的保护水平降低(Xiang等人,Virol.1995.209.569)。编码牛疱疹病毒(HBV)gD糖蛋白的基因中跨膜域缺失,在经肌内途径接种的牛中不能增强抗体应答,只能诱发部分保护(van Drunen Little-van den Hurk等人,J.Gen.Virol.1998.79.831-839)。在用编码埃博拉病毒GP糖蛋白的DNA疫苗或用编码分泌形式的此种GP糖蛋白的DNA疫苗免疫后攻击的豚鼠中,体液和细胞免疫应答及引起的保护相同(Xu等人,NatureMedicine 1998.4.37-42)
向编码疟疾Pf332抗原的基因中插入人组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号序列,在经肌内途径接种的小鼠中不能增强抗体应答(Haddad等人,FEMS 1997.18.193-202)。向编码鼠轮状病毒VP7抗原的基因中同时加入tPA序列,在经皮内途径接种的小鼠中也不能增强抗体应答,而由VP4抗原和tPA组成的融合蛋白则致使应答增强,但不诱发有效的保护(Choi等人,Virology 1998.250.230-240)。
对一种抗原的核苷酸序列进行的修饰通常不能直接用于另一种抗原,因为抗原不总是具有相同的结构排列。
发明内容
本申请人有提高DNA接种效率的目的。其目的特别在于通过DNA接种在家畜(特别是牛和猪)中获得更好的免疫应答,特别是有效的保护。
本申请人以生产如下改良DNA疫苗为目的,这些疫苗能在牛中诱发有效和保护性的免疫应答,对抗1型牛疱疹病毒(BHV-1),也称为牛传染性鼻气管炎(IBR),牛呼吸道合胞病毒(BRSV),粘膜病病毒或1型或2型牛瘟病毒(牛病毒性腹泻病毒或BVDV-1和BVDV-2),3型副流感病毒(bPI-3)。
本申请人以生产如下改良DNA疫苗为目的,这些疫苗能在猪中诱发有效和保护性的免疫应答,包含至少一种针对选自下列的病毒的效价:猪疱疹病毒或奥耶斯基病(假狂犬病病毒或PRV)、猪生殖道呼吸道综合征病毒(porcine reproductive respiratory syndrome virus)(或PRRSV)、猪流感病毒(或SIV)、普通猪霍乱病毒(或HCV)、细小病毒。
本申请人也以生产如下改良DNA疫苗为目的,这些疫苗能在牛中获得有效和保护性的免疫保护,包含至少一种针对BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的效价。
本发明的主题是改良的DNA疫苗,它们能获得针对至少一种感染家畜(特别是牛和猪)的病原体的有效保护。DNA疫苗的改良方法包括:配制、添加GM-CSF、抗原的优化或这些办法的组合。
优选地,DNA疫苗的改良方法是:配制,任选地添加GM-CSF或抗原优化,或者最后添加GM-CSF和优化抗原。
根据定义,DNA疫苗含有编码并表达基因或基因片段(例如表位)的质粒作为活性成分。术语质粒包括DNA转录单元,它含有多核苷酸序列,该序列含有将要表达的基因序列和在体内表达所必需的元件。环状质粒形式、超螺旋形式等是优选的。线性形式也属于本发明的范围内。
每个质粒含有启动子,它能确保插入的基因在其控制下在宿主细胞中表达。它们通常是强真核启动子,特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE,是人或鼠来源的,或者任选地是其它来源的,如大鼠或豚鼠来源的。一般来说,启动子是病毒来源或细胞来源的。关于CMV-IE以外的病毒启动子,能够提到的有SV40病毒早期或晚期启动子,或劳斯肉瘤病毒LTR启动子。也可以是衍生基因的病毒的启动子,例如对该基因特异的启动子。至于细胞启动子,能够提到的有细胞骨架基因的启动子,如结蛋白启动子,或肌动蛋白启动子。当几个基因存在于同一质粒中时,它们可能在同一转录单元或几个不同的单元中。
根据第一种模式,通过加入含有季铵盐的下式阳离子脂作为佐剂配制根据本发明的DNA疫苗:
其中R1是饱和或不饱和的线型脂族基团,含有12-18个碳原子,R2是另一脂族基团,含有2或3个碳原子,X是羟基或氨基。
优选地,这是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙铵;WO-A-9634109),优选与中性脂,特别是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)组合,形成DMRIE-DOPE。
因此,本发明的主题是一种针对至少一种侵袭家畜(特别是牛或猪)的病原体的DNA疫苗,它含有至少一种质粒-该质粒含有至少一种编码动物种病原体的免疫原的核苷酸序列(在允许该序列在体内表达的条件下),和含有季铵盐的阳离子脂,特别是DMRIE,优选地与DOPE组合。
优选地,在使用前即刻将重组载体与该佐剂混合,优选地在对动物施用之前使这样制备的混合物形成复合物,例如保持10-60分钟,特别是30分钟左右。
当含有DOPE时,DMRIE∶DOPE的摩尔比优选地是95∶5至5∶95,更特别地是1∶1。
质粒:DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比尤其可以为50∶1至1∶10,特别是10∶1至1∶5,优选地1∶1至1∶2。
根据第二种模式,向根据本发明的疫苗中加入GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;Clark S.C.等人,Science 1987.230.1229;GrantS.M.等人,Drugs 1992.53.516);其实现方法可以是:直接向疫苗组合物中掺入GM-CSF蛋白,或者优选地在允许体内表达的条件下向表达载体中插入编码GM-CSF的核苷酸序列。对于表达载体,优选地使用质粒,例如含有编码目的抗原的核苷酸序列的质粒或另一质粒。优选地根据将要接种的动物种选择GM-CSF;因此,对于牛,使用牛GM-CSF;对于猪,使用猪GM-CSF。
根据第三种模式,编码免疫原的核苷酸序列是一种优化的形式。优化是指核苷酸序列的任何修饰,特别是至少表现为该核苷酸序列的较高水平的表达,和/或编码该抗原的信使RNA的稳定性提高,和/或引发向胞外基质中分泌该抗原,直接或间接的结果是诱发的免疫应答增强。
在本发明中,目的抗原的优化优选地在于编码目的抗原跨膜域的核苷酸序列片段的缺失(缺失是指完全缺失或足以使跨膜域不再或基本上不再有功能的部分缺失),和/或在于编码tPA(Montgomery等人,Cell.Mol.Biol.1997.43.285-292;Harris等人,Mol.Biol.Med.1986.3.279-292)信号的核苷酸序列的框内添加,和/或在于稳定化内含子向将要表达的基因上游的插入。编码目的抗原跨膜域的DNA片段的缺失促使截短的抗原向胞外基质中分泌,从而提高了它们与免疫系统的细胞接触的可能性。编码tPA信号的核苷酸序列的插入提高与tPA信号连接的信使RNA的可翻译性,从而提高该信使RNA的表达水平,因此提高抗原的产生水平。tPA信号也在合成抗原的分泌中起作用。
也可以使用其它编码信号肽的核苷酸序列,特别是从蜜蜂中获得的编码蜂毒肽的信号肽的序列(Sisk W.P.等人,1994,J.Virol.68,766-775)。
稳定化内含子插入编码目的抗原的基因中避免了其信使RNA的异常剪接,并且保持后者的物理完整性。
优选地,tPA信号是人源的。人tPA信号的核苷酸序列可从GenBank数据库中获得,编号为NM_000930。优选地,内含子是兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人,Science 1979.206.337-344),其核苷酸序列可从GenBank数据库中获得,编号为V00882,在参考文献中命名为2号内含子。
本发明的主题是一种改良DNA疫苗,它在牛中能诱发针对牛传染性鼻气管炎(IBR)的有效和保护性的免疫应答。
引起牛传染性鼻气管炎的病毒是1型牛疱疹病毒(BHV-1),它是甲型疱疹病毒科(Alphaherpesviridae)的成员(Babiuk L.A.等人,1996,Vet.Microbiol.,53,31-42)。编码糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,编号为AJ004801。
根据本发明,优选地通过用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制,改进针对IBR的DNA疫苗。任选地,可以同时加入牛GM-CSF(Maliszewski等人,Molec.Immunol.,1988,25,843-850),或者优化至少一种IBR抗原,或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种IBR抗原。
编码牛GM-CSF的核苷酸序列可从GenBank数据库中获得,编号为U22385。
牛GM-CSF的添加可以如下实现:向疫苗组合物中掺入牛GM-CSF多肽,或者优选地向体内表达载体(优选地质粒)中插入编码牛GM-CSF的核苷酸序列。优选地,编码牛GM-CSF的核苷酸序列插入第二表达质粒(例如pLF1032,实施例13)中,该质粒不同于插入编码IBR抗原的基因的质粒。
来自IBR的抗原的优化如下进行:将糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信号肽序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号的那些(GenBank编号NM_000930),和/或缺失编码gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分(糖蛋白的胞质部分)缺失。根据本发明的针对IBR的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的IBR抗原(gB、gC或gD)或其中两种或所有三种,即,优化的gB、优化的gC和优化的gD。
能在本发明中应用的编码BHV-1抗原的核苷酸序列,和表达载体的不同构建体,在附加实施例和FR-A1-2751229中,特别是在实施例7和8BHV-1gC抗原的第二表达质粒(例如pPB292,实施例3.2.2),通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化;编码BHV-1gD抗原的第三表达质粒(例如pPB284,实施例3.3.2),通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。
通常,且不仅对于BHV-1,与编码跨膜域的序列邻接的C端部分可能是保守的。然而,与编码跨膜域的序列同时删除它通常比较容易。
本发明的目的也在于一种改良DNA疫苗,它在牛中能诱发针对牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的有效和保护性的免疫应答。
BRSV病毒是一种副粘病毒,也是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成员(Baker等人,Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.,1997,13,425-454)。编码F蛋白和G糖蛋白的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,编号分别为Y17970和U33539。
针对BRSV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入牛GM-CSF,或者优化至少一种BRSV抗原,或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种BRSV抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。
来自BRSV的抗原的优化如下进行:将BRSV的F蛋白和/或BRSV的G包膜糖蛋白的信号序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号序列,和/或缺失编码F和/或G的跨膜域的DNA片段。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对BRSV的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的BRSV抗原(F或G)或此两者(F和G)。
能在本发明中应用的编码BRSV抗原的核苷酸序列,和不同表达载体构建体,在附加实施例和FR-A1-2751229中,特别是在实施例9和10及图5和图6中给出。
优选地,根据本发明,针对BRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码BRSV F抗原的表达质粒(例如pSB114,实施例4.1.3),通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码跨膜域的F的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化;编码BRSV G抗原的第二表达质粒(例如pSB110,实施例4.2.2),通过插入人tPA的信号序列代替G的信号序列、缺失编码G的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。
本发明的主题也在于一种改良DNA疫苗,它在牛中能诱发针对BVDV病毒的有效和保护性的免疫应答。
BVDV病毒是黄病毒科(Flaviviridae)的一种瘟病毒。它广泛分布于牛群中,表现为胚胎畸形、流产或临床呼吸道(粘膜病)和肠道(牛病毒性腹泻)症状。
BVDV病毒可以根据临床指征的严重程度区分,分成两组:1型BVDV(不明显的或轻度的临床指征)和2型BVDV(急性临床指征,出血,高发病率,高死亡率)(Dean H.J.和Leyh R.,1999,Vaccine,17,1117-1124)。
当BVDV病毒类型不能清楚地指明时,该病毒被认为是1型或2型。
BVDV病毒是一种包膜单链RNA病毒,由编码一种多蛋白的单基因组成,该多蛋白在裂解后产生几种明确区分的蛋白质,特别是E0蛋白(gp48)和E2蛋白(gp53)(Vassilev V.B.等人,1997,J.Virol.,71,471-478)。
编码E0-E2多蛋白的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,BVDV-1的保藏号为M96687,BVDV-2的为AF145967。
针对BVDV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入牛GM-CSF,或者优化至少一种BVDV抗原,或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种BVDV抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。
来自BVDV的抗原的优化如下进行:在编码BVDV的E0蛋白和/或BVDV的E2蛋白的核苷酸序列上游添加一种“信号”序列,特别是人源tPA的信号序列,和/或缺失编码E2跨膜域的DNA片段,和/或在编码E0和/或E2的核苷酸序列上游插入内含子,特别是兔β-珠蛋白基因的内含子II。根据本发明的针对BVDV的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的BVDV抗原(E0或E2)或此两者(E0和E2)。
能在本发明中应用的编码BVDV抗原的核苷酸序列,和表达载体的不同构建体,在附加实施例和FR-A1-2751229中,特别是在实施例13及图9中给出。
优选地,根据本发明,针对BVDV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码BVDV E0抗原的表达质粒(例如pLF1029,实施例5.1.2,pLF1031,实施例6.2.2),通过在E0上游插入人tPA的信号序列并且在E0上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化;编码BVDV E2抗原的第二表达质粒(例如pLF1021,实施例5.2.2,pLF1023,实施例6.1.2),通过在E2上游插入人tPA的信号序列、缺失编码E2跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在E2上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化。
能有利地生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒,每种均表达一种不同的免疫原(E0或E2)和/或从不同类型的BVDV(BVDV-1或BVDV-2)获得。特别是,混合物由表达BVDV-1 E0、BVDV-1 E2、BVDV-2 E0和BVDV-2 E2的4种质粒组成。
本发明的主题也在于一种改良的DNA疫苗,它能在牛中诱发针对3型副流感病毒(bPI-3)的有效和保护性的免疫应答。
bPI-3病毒是一种副粘病毒,也是副粘病毒科的成员(Tsai等人,Infect.Immun.,1975,11,783-803)。
编码bPI-3的血凝素和神经氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,保藏号为U31671。
针对bPI-3的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入牛GM-CSF,或者优化至少一种bPI-3抗原,或者最后加入牛GM-CSF和优化至少一种bPI-3抗原。
牛GM-CSF的添加可以如BHV-1所述进行。
来自bPI-3的抗原的优化如下进行:将bPI-3的血凝素-神经氨酸酶(HN)的和/或bPI-3的融合蛋白(F)的信号序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号序列,和/或缺失编码HN和/或F的跨膜域的DNA片段,和/或在编码HN和/或F的核苷酸序列上游插入一种内含子,特别是兔β-珠蛋白基因的内含子II。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对bPI-3的DNA疫苗因此能编码并表达一种优化的bPI-3抗原(HN或F)或此两者(HN和F)。
能在本发明中应用的编码bPI-3抗原的核苷酸序列,和不同表达载体构建体,在附加实施例和FR-A1-2751229中,特别是在实施例14和15及图10和图11中给出。
优选地,根据本发明,针对bPI-3的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码bPI-3HN抗原的表达质粒(例如pLF1025,实施例7.1.2),通过插入人tPA的信号序列代替HN的信号序列、缺失编码跨膜域的HN的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在HN上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化;编码bPI-3 F抗原的第二表达质粒(例如pLF1027,实施例7.2.2),通过插入人tPA的信号序列代替F的信号序列、缺失编码F的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在F上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化。
本发明的主题也在于一种改良DNA疫苗,它在猪中能诱发针对疱疹病毒(PRV)的有效和保护性的免疫应答。
PRV是甲型疱疹病毒科(Alphaherpesvirinae)的成员,该病毒引起奥耶斯基病(Sawitzky D.,Arch.Virol.Suppl.,1997,13,201-206)。
编码糖蛋白gB、gC和gD的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,保藏号分别为M17321、AF158090、AF086702。
针对PRV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入猪GM-CSF(Inumaru S.和Takamatsu H.,Immunol.Cell.Biol.,1995,73,474-476),或者优化至少一种PRV抗原,或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种PRV抗原。
猪GM-CSF的添加可以如下进行:向疫苗组合物中掺入猪GM-CSF多肽,或者向体内表达载体(优选地质粒)中插入编码猪GM-CSF的核苷酸序列(例如,可从GenBank数据库中获得,保藏号为D21074)。优选地,编码猪GM-CSF的核苷酸序列插入第二表达质粒(例如pLF1033,实施例14)中,该质粒不同于插入编码PRV抗原的基因的质粒。
来自PRV的抗原的优化如下进行:将糖蛋白gB和/或糖蛋白gC和/或糖蛋白gD的信号肽序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号序列(GenBank保藏号NM_000930),和/或缺失编码gB和/或gC和/或gD跨膜域的DNA片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对PRV的DNA疫苗因此可编码并表达一种优化的PRV抗原(gB、gC或gD)或其中两种或所有三种,即,优化的gB、优化的gC和优化的gD。
能在本发明中应用的编码PRV抗原的核苷酸序列,和不同表达载体构建体,在附加实施例和FR-A1-2751224中,特别是在实施例8和9以及图3和图5中给出。
优选地,根据本发明,针对PRV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码PRV gB抗原的表达质粒(例如pSB102,实施例8.1.2),通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化;编码PRV gC抗原的第二表达质粒(例如pSB104,实施例8.2.2),通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化;编码PRV gD抗原的第三表达质粒(例如pSB106,实施例8.3.2),通过缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。
本发明的目的也在于一种改良DNA疫苗,它在猪中能诱发针对猪生殖道呼吸道综合征病毒(PRRSV)的有效和保护性的免疫应答。
PRRSV是一种动脉炎病毒(Arterivirus),是动脉炎病毒科(Arteriviridae)的成员(Murtaugh等人,Arch.Virol.,1995,140,1451-1460)。
编码由开放阅读框ORF3、ORF5和ORF6编码的蛋白质的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,保藏号为U87392。
针对PRRSV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入猪GM-CSF,或者优化至少一种PRRSV抗原,或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种PRRSV抗原。
猪GM-CSF的添加可以如PRV所述进行。
来自PRRSV的抗原的优化如下进行:将开放阅读框3(ORF3,gp45或大包膜糖蛋白)和/或糖蛋白ORF5(gp25或包膜糖蛋白E)和/或糖蛋白ORF6(gp18或膜蛋白)编码的蛋白质的信号肽序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号序列(GenBank保藏号NM_000930),和/或缺失编码ORF3和/或ORF5和/或ORF6跨膜域的DNA片段。编码这些糖蛋白之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对PRRSV的DNA疫苗因此可编码并表达一种优化的PRRSV抗原(ORF3、ORF5或ORF6)或其中两种或所有三种,即,优化的ORF3、优化的ORF5和优化的ORF6。
能在本发明中应用的编码PRRSV抗原的核苷酸序列,和不同表达载体构建体,在附加实施例和FR-A1-2751224中,特别是在实施例14-17以及图14-17中给出。
优选地,根据本发明,针对PRRSV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码PRRSV ORF3抗原的表达质粒(例如pLF1009,实施例9.1.1,pLF1015,实施例10.1.1);编码PRRSV ORF5抗原的第二表达质粒(例如pLF1012,实施例9.2.2,pLF1018,实施例10.2.2),通过将ORF5的信号序列替换为人tPA信号肽序列、缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化;编码PRRSV ORF6抗原的第三种表达质粒(例如pLF1014,实施例9.3.2,pLF1016,实施例10.3.2),通过将ORF6的信号序列替换为人tPA信号肽序列、缺失编码跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分优化。
可以有利地能生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒,每种均表达一种不同的免疫原(ORF3、ORF5或ORF6)和/或从不同的PRRSV株(例如欧洲株,如Lelystad,美国株ATCC VR-2332)获得。特别是,一种混合物由表达PRRSV Lelystad ORF3、PRRSV Lelystad ORF5、PRRSV Lelystad ORF6、PRRSV VR-2332 ORF3、PRRSV VR-2332 ORF5和PRRSV VR-2332 ORF6的6种质粒组成。
本发明的主题也在于一种改良的DNA疫苗,它能在猪中诱发针对猪流感病毒(SIV)的有效和保护性的免疫应答。
SIV病毒是一种A族流感病毒,是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员(Murphy B.R.和Webster R.G.,《病毒学》,第二版,B.N.Fields,D.M.Knipe等人编写,Raven Press Ltd.,纽约1990)。
编码SIV H1N1株和H3N2株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的核苷酸序列已知,可从GenBank数据库中获得,保藏号分别为K00992、U86145、U07146、AF153238。
针对SIV的DNA疫苗优选地用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制。任选地,可以同时加入猪GM-CSF,或者优化至少一种SIV抗原,或者最后加入猪GM-CSF和优化至少一种SIV抗原。
猪GM-CSF的添加可以如PRV所述进行。
来自SIV的抗原的优化如下进行:将SIV血凝素(HA)和/或SIV神经氨酸酶(NA)蛋白的信号序列替换为一种“信号”序列,特别是人源tPA信号序列,和/或缺失编码HA和/或NA的跨膜域的DNA片段,和/或在编码HA和/或NA的核苷酸序列上游插入一种内含子,特别是兔β-珠蛋白基因的内含子II。编码这些蛋白质之一的跨膜域的DNA片段优选地伴随着邻接的C端部分缺失。根据本发明的针对SIV的DNA疫苗因此可编码并表达一种优化的SIV抗原(HA或NA)或此两者(HA和NA)。
能在本发明中应用的编码SIV抗原的核苷酸序列,和不同表达载体构建体,在附加实施例和FR-A1-2751224中给出,对于SIV H1N1株,特别是在实施例10和11及图7和图9中给出,对于SIV H3N2株,在实施例12和13及图11和图13中给出。
优选地,根据本发明,针对SIV的DNA疫苗用DMRIE-DOPE配制,包含:编码SIV HA抗原的表达质粒(例如pLF1002,实施例11.1.2,pLF1006,实施例12.1.2),通过插入人tPA的信号序列代替HA的信号序列、缺失编码跨膜域的HA的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在HA上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化;编码SIV NA抗原的第二表达质粒(例如pLF1004,实施例11.2.2,pLF1008,实施例12.2.2),通过插入人tPA的信号序列代替NA的信号序列、缺失编码NA的跨膜域的核苷酸序列片段和邻接的C端部分并且在NA上游插入兔β-珠蛋白基因的内含子II优化。
可以有利地生产一种质粒混合物。该混合物可含有至少两种表达质粒,每种均表达一种不同的免疫原(HA或NA)和/或来自于不同的SIV株(例如H1N1或H3N2)。特别是,一种混合物由表达SIV H1N1 HA、SIVH1N1 NA、SIV H3N2 HA和SIV H3N2 NA的4种质粒组成。
尽管本发明对特定DNA疫苗进行了描述,但是本发明特别是根据本发明的佐剂的应用也适用于针对这些动物种的其它病原体的DNA疫苗。
出于同样的考虑,对于一个动物种,根据本发明的疫苗可以互相组合,和/或与针对同一种的其它病原体的DNA疫苗组合。
其它病原体尤其可能是狂犬病病毒、猪霍乱病毒和猪细小病毒。
针对狂犬病病毒的根据本发明的免疫原制剂或改良DNA疫苗尤其含有一种质粒,该质粒编码未修饰的狂犬病病毒的G糖蛋白和DMRIE-DOPE,任选地添加GM-CSF。
针对猪细小病毒的根据本发明的改良免疫原制剂或DNA疫苗尤其含有一种质粒,该质粒编码来自细小病毒的抗原(例如VP2蛋白,FR-A1-2751224的实施例18和图18)和DMRIE-DOPE,任选地添加猪GM-CSF(例如pLF1033,实施例14)。
针对猪霍乱病毒(HCV)的根据本发明的改良免疫原制剂或DNA疫苗尤其含有一种质粒,该质粒编码来自HCV的抗原(例如E1蛋白,同一文献的实施例19和图19,或E2蛋白,实施例20和图20)和DMRIE-DOPE,任选地添加猪GM-CSF(例如pLF1033,实施例14)。
因此,本发明的主题也在于改良的多价DNA疫苗,它能在牛中获得针对选自BHV-1、BRSV、BVDV、bPI-3和狂犬病病毒的至少两种牛病原体的有效保护。
本发明的主题也在于改良的多价DNA疫苗,它能在猪中获得针对选自PRV病毒、PRRSV病毒、SIV病毒、猪霍乱病毒(或HCV)和猪细小病毒的至少两种猪病原体的有效保护。
这些多价DNA疫苗可以通过用根据本发明的佐剂(特别是DMRIE,优选地是DMRIE-DOPE)配制加以改进。任选地可以同时加入如前所述的GM-CSF,或者优化至少一种如前所述的目的抗原,或者最后加入GM-CSF和优化至少一种目的抗原。
根据本发明的改良多价DNA疫苗由一种或多种表达质粒构成,以致这些疫苗在体内表达第一病原体的至少一种免疫原,和感染同一动物物种的至少一种其它病原体的至少一种免疫原。其中至少一种免疫原优选地选自下列组别的成员:
-对于牛,BRSV的F、BRSV的G、BHV-1的gB、BHV-1的gC、BHV-1的gD、BVDV-1的E0、BVDV-1的E2、BVDV-2的E0、BVDV-2的E2、bPI-3的F和bPI-3的HN,和
-对于猪,PRV的gB、PRV的gC、PRV的gD、PRRSV Lelystad株的ORF3、PRRSV Lelystad株的ORF5、PRRSV Lelystad株的ORF6、PRRSVVR-2332株的ORF3、PRRSV VR-2332株的ORF5、PRRSV VR-2332株的ORF6、SIV H1N1株的HA、SIV H1N1株的NA、SIV H3N2株的HA和SIV H3N2株的NA。
也可以利用一种体内表达载体(例如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒),将根据本发明的改良单价或多价DNA疫苗与至少一种常规疫苗(灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗)或重组疫苗组合,对抗感染同一种的至少一种不同的病原体,或者用作这些疫苗的强化剂。
关于构建具有这些牛效价的质粒的方法,本领域技术人员可参考FR-A1-2751229,对于具有猪效价的质粒的方法,参考FR-A1-2751224。
本发明的目的也在于一种接种家畜(特别是牛或猪)的方法。这种接种方法包括施用如上所述的单价或多价改良DNA疫苗之一。这些接种方法涉及用于被动转移免疫性的妊娠雌畜或幼畜或成畜。该接种方法包括施用一次或多次改良DNA疫苗。
在根据本发明的疫苗中使用的DNA的量,对于特定质粒,为约10μg至约1000μg,优选地约50μg至约500μg。本领域技术人员具有精确确定每一接种方案所用DNA的有效剂量所必需的能力。
优选地,剂量体积为0.2至5ml,优选地1至3ml。
在该接种方法中,可以通过现有技术中用于多核苷酸接种的多种施用途径,并利用已知的施用技术,施用根据本发明的改良DNA疫苗。
根据本发明的一种优选模式,接种方法包括,通过肌内途径、皮下途径或者借助于无针注射器通过皮内途径施用根据本发明的改良DNA疫苗。
现在将借助于被视为非限制性实施例的实施方案并参照附图更详细地描述本发明,其中:
图1:质粒pVR1012
图2:质粒pAB110
序列表
SEQ ID NO 1:寡核苷酸PB326
SEQ ID NO 2:寡核苷酸PB329
SEQ ID NO 3:寡核苷酸SB090
SEQ ID NO 4:寡核苷酸SB091
SEQ ID NO 5:寡核苷酸LF001
SEQ ID NO 6:寡核苷酸LF002
SEQ ID NO 7:寡核苷酸PB234
SEQ ID NO 8:寡核苷酸PB235
SEQ ID NO 9:寡核苷酸PB511
SEQ ID NO 10:寡核苷酸PB512
SEQ ID NO 11:寡核苷酸SB221
SEQ ID NO 12:寡核苷酸SB222
SEQ ID NO 13:寡核苷酸PB507
SEQ ID NO 14:寡核苷酸PB508
SEQ ID NO 15:寡核苷酸PB513
SEQ ID NO 16:寡核苷酸PB514
SEQ ID NO 17:寡核苷酸SB223
SEQ ID NO 18:寡核苷酸SB224
SEQ ID NO 19:寡核苷酸PB497
SEQ ID NO 20:寡核苷酸PB498
SEQ ID NO 21:寡核苷酸SB225
SEQ ID NO 22:寡核苷酸SB226
SEQ ID NO 23:寡核苷酸SB210
SEQ ID NO 24:寡核苷酸SB211
SEQ ID NO 25:寡核苷酸SB212
SEQ ID NO 26:寡核苷酸SB220
SEQ ID NO 27:寡核苷酸SB213
SEQ ID NO 28:寡核苷酸SB214
SEQ ID NO 29:寡核苷酸SB215
SEQ ID NO 30:寡核苷酸SB216
SEQ ID NO 31:寡核苷酸LF050
SEQ ID NO 32:寡核苷酸LF051
SEQ ID NO 33:寡核苷酸LF052
SEQ ID NO 34:寡核苷酸LF053
SEQ ID NO 35:寡核苷酸LF039
SEQ ID NO 36:寡核苷酸LF040
SEQ ID NO 37:寡核苷酸LF041
SEQ ID NO 38:寡核苷酸LF042
SEQ ID NO 39:寡核苷酸LF043
SEQ ID NO 40:寡核苷酸LF044
SEQ ID NO 41:寡核苷酸LF045
SEQ ID NO 42:寡核苷酸LF046
SEQ ID NO 43:寡核苷酸LF064
SEQ ID NO 44:寡核苷酸LF065
SEQ ID NO 45:寡核苷酸LF066
SEQ ID NO 46:寡核苷酸LF067
SEQ ID NO 47:寡核苷酸LF047
SEQ ID NO 48:寡核苷酸LF048
SEQ ID NO 49:寡核苷酸LF058
SEQ ID NO 50:寡核苷酸LF059
SEQ ID NO 51:寡核苷酸LF060
SEQ ID NO 52:寡核苷酸LF061
SEQ ID NO 53:寡核苷酸LF062
SEQ ID NO 54:寡核苷酸LF063
SEQ ID NO 55:寡核苷酸SB201
SEQ ID NO 56:寡核苷酸SB202
SEQ ID NO 57:寡核苷酸SB203
SEQ ID NO 58:寡核苷酸SB217
SEQ ID NO 59:寡核苷酸SB204
SEQ ID NO 60:寡核苷酸SB205
SEQ ID NO 61:寡核苷酸SB206
SEQ ID NO 62:寡核苷酸SB218
SEQ ID NO 63:寡核苷酸SB207
SEQ ID NO 64:寡核苷酸SB208
SEQ ID NO 65:寡核苷酸SB209
SEQ ID NO 66:寡核苷酸SB219
SEQ ID NO 67:寡核苷酸LF027
SEQ ID NO 68:寡核苷酸LF028
SEQ ID NO 69:寡核苷酸LF019
SEQ ID NO 70:寡核苷酸LF020
SEQ ID NO 71:寡核苷酸LF021
SEQ ID NO 72:寡核苷酸LF022
SEQ ID NO 73:寡核苷酸LF023
SEQ ID NO 74:寡核苷酸LF024
SEQ ID NO 75:寡核苷酸LF025
SEQ ID NO 76:寡核苷酸LF026
SEQ ID NO 77:寡核苷酸LF037
SEQ ID NO 78:寡核苷酸LF038
SEQ ID NO 79:寡核苷酸LF029
SEQ ID NO 80:寡核苷酸LF030
SEQ ID NO 81:寡核苷酸LF031
SEQ ID NO 82:寡核苷酸LF032
SEQ ID NO 83:寡核苷酸LF033
SEQ ID NO 84:寡核苷酸LF034
SEQ ID NO 85:寡核苷酸LF035
SEQ ID NO 86:寡核苷酸LF036
SEQ ID NO 87:寡核苷酸LF003
SEQ ID NO 88:寡核苷酸LF004
SEQ ID NO 89:寡核苷酸LF005
SEQ ID NO 90:寡核苷酸LF006
SEQ ID NO 91:寡核苷酸LF007
SEQ ID NO 92:寡核苷酸LF008
SEQ ID NO 93:寡核苷酸LF009
SEQ ID NO 94:寡核苷酸LF010
SEQ ID NO 95:寡核苷酸LF011
SEQ ID NO 96:寡核苷酸LF012
SEQ ID NO 97:寡核苷酸LF013
SEQ ID NO 98:寡核苷酸LF014
SEQ ID NO 99:寡核苷酸LF015
SEQ ID NO 100:寡核苷酸LF016
SEQ ID NO 101:寡核苷酸LF017
SEQ ID NO 102:寡核苷酸LF018
SEQ ID NO 103:寡核苷酸LF054
SEQ ID NO 104:寡核苷酸LF055
SEQ ID NO 105:寡核苷酸LF056
SEQ ID NO 106:寡核苷酸LF057
实施例:
对于所考虑的每种病原体,编码主要抗原(原始形式和修饰形式)的每种基因是在真核表达质粒中特定构建的主体。分泌形式的抗原通过缺失编码跨膜域和胞质域的基因片段获得。在所有情况中,根据相应蛋白质序列的亲水性图(在MacVector 6.5上)确定蛋白质的跨膜域。
实施例1:分子生物学方法
1.1病毒基因组DNA的提取
在十二烷基硫酸钠(SDS)(0.5%终浓度)存在下,用蛋白酶K(100mg/ml终浓度)在37℃下处理病毒悬液2小时。利用酚/氯仿混合液抽提病毒DNA,用两倍体积的纯乙醇在-20℃下沉淀16小时,然后在4℃下以10000g离心15分钟。干燥DNA沉淀,溶解于最小体积的无菌超纯水中。
1.2病毒基因组RNA的分离
利用P.Chomczynski和N.Sacchi(Anal.Biochem.1987.162.156-159)所述的“硫氰酸胍/酚-氯仿”技术提取每种病毒的基因组RNA。
1.3分子生物学技术
所有质粒构建都用Sambrook等人(《分子克隆:实验室手册》第二版,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1989)所述的标准分子生物学技术进行。用于本发明的所有限制性片段都用“Geneclean”试剂盒(BIO101Inc.,La Jolla,CA)分离。对于所有构建体,克隆的DNA片段以及与表达载体的连接体都用Sanger法(Sambrook等人,1989)测序。
1.4 PCR和RT-PCR
合成对于克隆的基因或基因片段特异的寡核苷酸,其中一些有时在5’末端含有便于克隆扩增片段的限制位点。反转录(RT)反应和聚合酶链反应(PCR)按标准技术(Sambrook等人,1989)进行。
1.5质粒的大量纯化
以大约10mg的规模纯化加入疫苗组合物的质粒,用氯化铯-溴化乙锭梯度法(Sambrook等人,1989)进行。
实施例2:基本质粒构建体
由质粒pVR1020(图1,WO-A-9803199的图1和实施例7)衍生的真核表达质粒pVR1020(C.J.Luke等人,J.of Infectious Diseases,1997,175,95-97)含有人组织纤溶酶原激活物(tPA)信号序列的编码序列。
通过BamHI-BglII消化并插入一种序列修饰质粒pVR1020,该插入序列含有几个克隆位点(BamHI、NotI、EcoRI、XbaI、PmII、PstI、BglII),由下列寡核苷酸的配对产生:
PB32 6(40mer)(SEQ ID NO 1)
5′GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3′和
PB329(40mer)(SEQ ID NO 2)
5′GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3′.
这样获得的载体大小约为5105个碱基对(或bp),称为pAB110(图2)。
用兔外周血细胞的基因组DNA作为模板,利用下列寡核苷酸通过PCR产生相应的DNA片段:
SB090(20mer)(SEQ ID NO 3)
5′TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3′和
SB091(21mer)(SEQ ID NO 4)
5′CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3′
之后,将兔β-珠蛋白基因的内含子II克隆到载体pCRII(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中,产生的质粒命名为pNS050。
表达质粒pAB110如下修饰:向位于组织纤溶酶原激活物(tPA)信号肽ATG上游的SalI位点导入兔珠蛋白基因内含子II的序列。利用下列寡核苷酸对,通过聚合酶链反应(PCR),由质粒pNS050扩增兔珠蛋白基因内含子II的序列:
LF001(30mer)(SEQ ID NO 5)
5′CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3′和
LF002(30mer)(SEQ ID NO 6)
5′CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3′
PCR产物(573个碱基对或bp)用SalI消化,克隆到预先用SalI线性化的质粒pAB110中,产生约5678bp的质粒pLF999。
实施例3:编码不同形式的1型牛疱疹病毒(BHV-1)抗原的质粒
含有BHV-1 B901株的gB、gC和gD基因的病毒DNA片段如下分离:用不同限制酶消化病毒基因组,通过琼脂糖凝胶电泳分离,利用对应于BHV-1 ST株gB、gC和gD基因片段的探针通过Southern印迹法分析(Leung-Tack D.等人,Virology,1994,199,409-421)。也能使用BHV-1科罗拉多株[cooper](ATCC号VR-864)。将这样鉴定的片段克隆到载体pBluescript SK+(Stratagene,La Jolla,CA,USA)中,位于这三个基因向表达载体pVR1012克隆的起点。
3.1编码不同形式的BHV-1 gB的质粒
3.1.1 pPB280:克隆到载体pVR1012中的gB基因(原始形式)
含有BHV-1 gB基因的5’和3’部分的两种XhoI-XhoI片段通过Southern印迹法鉴定,克隆到预先用XhoI消化的载体pBluescript SK+(Stratagene,La Jolla,CA,USA)中。这样获得的质粒分别命名为pPB128和pPB117。
用NotI和XhoI消化含有gB基因5’片段的质粒pPB128,产生1708bp的片段(片段A)。
用XhoI和StuI消化含有gB基因3’部分的质粒pPB117,产生1345bp的片段。将后一片段克隆到预先用EcoRV和XhoI消化的载体pBluescript KS+(Stratagene,La Jolla,CA,USA)中。产生的质粒称为pPB279。然后用XhoI和BamHI消化质粒pPB279,产生1413bp的DNA片段(片段B)。
然后将片段A和B克隆到用NotI和BamHI消化的载体pBluescriptKS+中,产生质粒pPB278(约6063bp),允许BHV-1 gB基因的重构。
载体pPB278然后在PCR反应中用作模板,该反应利用下列寡核苷酸进行:
PB234(30mer)(SEQ ID NO 7)
5′TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3′和
PB235(21mer)(SEQ ID NO 8)
5′GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3′.
PCR产物(146bp)用限制酶SalI和NheI消化。
质粒pPB278用NheI和BamHI消化。这样获得的2728bp片段和预先消化的PCR片段连接到预先用SalI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为7742bp的质粒pPB280。
BHV-1gB基因编码一种有933个氨基酸的蛋白质。
3.1.2 pPB281:克隆到载体pVR1012中的gB基因(Δ[TM-Cter]形式)
BHV-1 gB基因的截短形式(其跨膜域(TM)和羧基端(Cter)域缺失)的获得方法是:向SalI和BamHI预消化的质粒pVR1012(实施例2)中连接以SalI-PvuII消化质粒pPB280(实施例3.1.1)获得的大小为2234bp的片段和由下列寡核苷酸配对获得的56bp片段:
PB511(52mer)(SEQ ID NO 9)
5′CTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACTGAG3′和
PB512(57mer)(SEQ ID NO 10)
5′GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTCGTGCAG 3′.
这样产生的质粒大小约为7154bp,称为pPB281。截短的BHV-1gB基因编码一种有759个氨基酸的蛋白质。
3.1.3 pSB115:克隆到载体pAB110中的gB基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pPB281(实施例3.1.2)PCR扩增BHV-1gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB221(39mer)(SEQ ID NO 11)
5′AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3′和
SB222(33mer)(SEQ ID NO 12)
5′GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3′
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(2088bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为7154bp的质粒pSB115。
gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有729个氨基酸的糖蛋白,含有BHV-1gB糖蛋白的胞外域。
3.2编码不同形式的BHV-1gC的质粒
3.2.1 pPB264:克隆到载体pVR1012中的gC基因(原始形式)
含有完整BHV-1gC基因的3.5kb的BamHI-HindIII片段通过Southern印迹法鉴定,并克隆到载体pBluescript SK+中。这样获得的质粒称为pPB287。
然后用NcoI-BssSI消化质粒pPB287。获得大小为1492bp的消化片段。将它与通过下列寡核苷酸配对获得的合成DNA片段连接:
PB507(37mer)(SEQ ID NO 13)
5′TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3′和
PB508(37mer)(SEQ ID NO 14)
5′CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3′
克隆到用NcoI和XbaI预消化的质粒pLitmus 28(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA,USA)中,产生中间质粒pPB290。
将PstI和XbaI消化pPB290产生的1554bp片段克隆到预先用PstI和XbaI消化的载体pVR1012(实施例2)中,从而产生大小约为6427bp的质粒pPB264。BHV-1gC基因编码一种有508个氨基酸的蛋白质。
3.2.2 pPB292:克隆到载体pVR1012中的gC基因(Δ[TM-Cter]形式)
通过将下列三种DNA片段连接于预先用PstI和XbaI消化的载体pVR1012(实施例2)中,获得BHV-1gC基因的截短形式。
(a)用PstI和XhoI消化pPB264(实施例3.2.1)产生的1035bp片段,
(b)用XhoI和BanI消化pPB264产生的350bp片段,和
(c)由寡核苷酸PB513和PB514配对产生的43bp合成片段。
这些寡核苷酸如下:
PB513(43mer)(SEQ ID NO 15)
5′GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3′和
PB514(43mer)(SEQ ID NO 16)
5′CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3′.
这样获得的大小约为6305bp的质粒称为pPB292。截短的BHV-1gC基因编码一种有466个氨基酸的蛋白质。
3.2.3 pSB116:克隆到载体pAB110中的gC基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pPB292(实施例3.2.2)PCR扩增BHV-1gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB223(39mer)(SEQ ID NO 17)
5′AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3′和
SB224(32mer)(SEQ ID NO 18)
5′GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3′
用EcoRV和BglII酶消化扩增产物(1362bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为6404bp的质粒pSB116。
gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有479个氨基酸的糖蛋白,其含有BHV-1gC糖蛋白的胞外域。
3.3编码不同形式的BHV-1gD的质粒
3.3.1 pPB148:克隆到载体pVR1012中的gD基因(原始形式)
含有BHV-1gD基因的5kb的XhoI-XhoI片段通过Southern印迹法鉴定,克隆到预先用XhoI消化的载体pBluescript SK+中,产生质粒pPB147。
然后将NdeI和BsrBI消化pPB147产生的325bp片段与NdeI和StyI消化pPB147产生的943bp片段连接到用EcoRV和XbaI预消化的载体pVR1012(实施例2)中,从而产生大小约为6171bp的质粒pPB148。BHV-1gD基因编码一种有417个氨基酸的蛋白质。
3.3.2 pPB284:克隆到载体pVR1012中的gD基因(Δ[TM-Cter]形式)
利用下列引物对:
PB497(33mer)(SEQ ID NO 19)
5′TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3′和
PB498(31mer)(SEQ ID NO 20)
5′TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3′.
对PstI和XbaI预消化的BHV-1病毒B901株的基因组DNA进行PCR扩增,由这样获得的片段获得截短的BHV-1gD基因。
然后将该PCR片段克隆到用PstI和XbaI预消化的质粒pVR1012(实施例2)中,产生大小约为5943bp的质粒pPB284。截短的BHV-1gD基因编码一种有355个氨基酸的蛋白质。
3.3.3 pSB117:克隆到载体pAB110中的gD基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pPB284(实施例3.3.2)PCR扩增BHV-1gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB225(39mer)(SEQ ID NO 21)
5′AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3′和
SB226(33mer)(SEQ ID NO 22)
5′GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1029bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为6071bp的质粒pSB117。
gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有368个氨基酸的糖蛋白,含有BHV-1gD糖蛋白的胞外域。
实施例4:编码不同形式的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)抗原的质粒
编码BRSV病毒F和G抗原的基因由Snook株的病毒RNA通过RT-PCR获得(Thomas等人,Research in Vet.Science,1982,33,170-182)。也可以使用BRSV A 51908株(ATCC号VR-794)。
4.1编码不同形式的BRSV-F的质粒
4.1.1 pSB107:克隆到载体pVR1012中的F基因(原始形式)
用病毒RNA作为模板,利用下列引物,经RT-PCR扩增BRSV Snook株的F基因:
SB210(34mer)(SEQ ID NO 23)
5′AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3′和
SB211(35mer)(SEQ ID NO 24)
5′TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3′.
用酶PstI和BamHI消化大小为1739bp的扩增产物,克隆到预先用PstI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,从而产生大小约为6583bp的质粒pSB107。
BRSV病毒的F基因编码一种有574个氨基酸的蛋白质。
4.1.2 pSB108:克隆到载体pVR1012中的F基因(Δ[TM-Cter]形式)
用病毒RNA作为模板,利用下列引物,经RT-PCR扩增BRSV Snook株F基因的截短形式:
SB210(SEQ ID NO 23)和
SB212(39mer)(SEQ ID NO 25)
5′AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3′.
用酶PstI和BamHI消化扩增产物(1581bp),克隆到预先用PstI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为6430bp的质粒pSB108。
F基因的截短形式编码一种有523个氨基酸的糖蛋白,含有BRSV F糖蛋白的胞外域。
4.1.3 pSB114:克隆到载体pAB110中的F基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
用病毒RNA作为模板,利用下列引物,通过RT-PCR扩增BRSV Snook株的F基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB212(SEQ ID NO 25)和
SB220(38mer)(SEQ ID NO 26)
5′AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATTTTATCAATC 3′.
用酶PmlI和BglII消化扩增产物(1516bp),克隆到预先用PmlI和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为6572bp的质粒pSB114。
F基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有535个氨基酸的糖蛋白,含有BRSV F糖蛋白的胞外域。
4.2编码不同形式的BRSV-G的质粒
对于BRSV G蛋白(II型糖蛋白),信号序列和跨膜序列无法区别,在跨膜域缺失过程中需要在对应于胞外域的序列上游添加一个信号序列。
质粒pAB110(实施例2)用于构建含有编码BRSV G蛋白的基因的截短形式的质粒。
4.2.1 pSB109:克隆到载体pVR1012中的G基因(原始形式)
用病毒RNA作为模板,利用下列引物,经RT-PCR扩增BRSV Snook株的G基因:
SE213(32mer)(SEQ ID NO 27)
5′ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC 3′和
SB214(38mer)(SEQ ID NO 28)
5′TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3′.
用酶SalI和XbaI消化扩增产物(784bp),克隆到预先用SalI和XbaI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为5661bp的质粒pSB109。
BRSV G基因编码一种有257个氨基酸的糖蛋白。
4.2.2 pSB110:克隆到载体pVR1012中的G基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
用病毒RNA作为模板,利用下列引物,通过RT-PCR扩增BRSV Snook株的G基因的截短形式:
SB215(33mer)(SEQ ID NO 29)
5′TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC 3′和
SB216(33mer)(SEQ ID NO 30)
5′TTAAAATC TAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3′.
用酶BamHI和XbaI消化扩增产物(666bp),克隆到预先用BamHI和XbaI消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为5660bp的质粒pSB110。
BRSV病毒G基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有218个氨基酸的糖蛋白,含有G糖蛋白的胞外域,但在它之前为组织纤酶原激活物的信号序列。
实施例5:编码不同形式的1型牛病毒性腹泻病毒(BVD-1)抗原的质粒
编码1型BVDV病毒的E0(48kDa的糖蛋白或gp48)和E2(gp53)抗原的基因由Osloss株的病毒RNA通过RT-PCR获得(L.De Morelooze等人,J.Gen.Virol.1993,74,1433-1438;A.Renard等人,DNA,1985,4,439-438;A.Renard等人,Ann.Rech.Vet.,1987,18,121-125)。也可以使用NADL(ATCC VR-534)或纽约(ATCC VR-524)株。
5.1编码不同形式的1型BVDV Osloss株E0的质粒
5.1.1 pLF1028:克隆到载体pVR1012中的E0基因(原始形式)
利用引物LF051,由相应的病毒RNA合成Osloss株E0基因的互补DNA(cDNA),并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF050(36mer)(SEQ ID NO 31)
5′CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3′和
LF051(40mer)(SEQ ID NO 32)
5′CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3′.
SalI和BamHI消化PCR产物获得的约765bp的DNA片段与SalI和BamHI消化pVR1012(实施例2)产生的4866bp片段连接,产生质粒pLF1028(约5636bp)。BVDV-1 Osloss株的E0基因编码一种有252个氨基酸的蛋白质。
向寡核苷酸LF050序列中引入一个ATG密码子,以允许相应重组E0多肽翻译的起始。
5.1.2 pLF1029:克隆到载体pLF999中的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应由pLF1028模板(实施例5.1.1)合成E0基因:
LF052(39mer)(SEQ ID NO 33)
5′CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3′和
LF053(40mer)(SEQ ID NO 34)
5′CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3′.
NotI和BglII消化PCR产物获得的约770bp的DNA片段与NotI和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1029(约6417bp)。
这样修饰的BVDV-1 Osloss株的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0)编码一种有283个氨基酸的蛋白质。
5.2编码不同形式的1型BVDV Osloss株E2的质粒
5.2.1 pLF1020:克隆到载体pVR1012中的E2基因(原始形式)
利用引物LF040,由相应的病毒RNA合成Osloss株E2基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF039(33mer)(SEQ ID NO 35)
5′CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 3′和
LF040(36mer)(SEQ ID NO 36)
5′CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3′.
SalI和BglII消化PCR产物获得的约1235bp的DNA片段与SalI和Bg1II消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接,产生质粒pLF1020(约6100bp)。
BVDV-1 Osloss株的E2基因编码一种有409个氨基酸的蛋白质。
向寡核苷酸LF039序列中引入一个ATG密码子,以允许相应重组E2多肽翻译的起始。
5.2.2 pLF1021:克隆到载体pLF999中的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter]形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应由pLF1020模板(实施例5.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因:
LF041(36mer)(SEQ ID NO 37)
5′CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3′和
LF042(35mer)(SEQ ID NO 38)
5′CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3.
NotI和BglII消化PCR产物获得的1132bp的DNA片段与NotI和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1021(约6779bp)。
这样修饰的BVDV-1 Osloss株的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter])编码一种有404个氨基酸的蛋白质。
实施例6:编码不同形式的2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)抗原的质粒
编码2型BVDV病毒E2抗原(gp53)的基因由890株的病毒RNA通过RT-PCR获得(J.F.Ridpath和S.R.Bolin,Virology,1995,212,36-46)。也能使用Q140株,它可以获自Quebec Ministry of Agriculture,Fisheries and Food,Armand-Frappier Institute(P.Tijssen等人,Virology,1996,217,356-361)。也可以使用1373株和296株(J.F.Ridpath,BVDV研究计划,国家动物疾病中心,2300 Dayton Avenue,Ames,USA)。
6.1编码不同形式的2型890株E2的质粒
6.1.1 pLF1022:克隆到载体pVR1012中的E2基因(原始形式)
利用引物LF044,由相应的病毒RNA合成890株E2基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF043(36mer)(SEQ ID NO 39)
5′ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3′和
LF044(39mer)(SEQ ID NO 40)
5′ACTGTAAGATCTTTAAGTATTCACTCCAGCACCCATAGC 3 ′.
XbaI和BglII消化PCR产物获得的约1240bp的DNA片段与XbaI和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4891bp片段连接,产生质粒pLF1022(约6136bp)。
BVDV-2 890株的E2基因编码一种有410个氨基酸的蛋白质。
向寡核苷酸LF043序列中引入一个ATG密码子,以允许相应重组E2多肽翻译的起始。
6.1.2 pLF1023:克隆到载体pLF999中的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter]形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应由pLF1022模板(实施例6.2.1)合成跨膜域和羧基端域缺失的E2基因:
LF045(41mer)(SEQ ID NO 41)
5′CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3′和
LF046(36mer)(SEQ ID NO 42)
5′CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3′.
NotI和BglII消化PCR产物获得的1140bp的DNA片段与NotI和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1023(约6787bp)。
这样修饰的BVDV-2 890株的E2基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM+Cter])编码一种有405个氨基酸的蛋白质。
6.2编码不同形式的2型890株E0的质粒
6.2.1 pLF1030:克隆到载体pVR1012中的E0基因(原始形式)
利用引物LF065,由相应的病毒RNA合成890株E0基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF064(39mer)(SEQ ID NO 43)
5′CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3′和
LF065(39mer)(SEQ ID NO 44)
5′CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3′.
SalI和BamHI消化PCR产物获得的约768bp的DNA片段与SalI和BamHI消化pVR1012(实施例2)产生的4866bp片段连接,产生质粒pLF1030(约5639bp)。BVDV-2 890株的E0基因编码一种有253个氨基酸的蛋白质。
向寡核苷酸LF064的序列中引入一个ATG密码子,以允许相应重组E0多肽翻译的起始。
6.2.2 pLF1031:克隆到载体pLF999中的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应由pLF1030模板(实施例6.2.1)合成E0基因:
LF066(42mer)(SEQ ID NO 45)
5′CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3′和
LF067(39mer)(SEQ ID NO 46)
5′CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3′.
NotI和BglII消化PCR产物获得的约770bp的DNA片段与NotI和BglII消化pLF999(实施例2)产生的5642bp片段连接,产生质粒pLF1031(约6417bp)。
这样修饰的BVDV-2 890株的E0基因(β-珠蛋白tPA-E0)编码一种有283个氨基酸的蛋白质。
实施例7:编码不同形式的3型牛副流感病毒(bPI-3)抗原的质粒
编码bPI-3病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)抗原的基因由Rinsinger SF-4株(可从ATCC获得,ATCC号为VR-281)的病毒RNA通过RT-PCR获得。
7.1编码不同形式的bPI-3 SF-4株HN的质粒
7.1.1 pLF1024:克隆到载体pVR1012中的HN基因(原始形式)
利用引物LF048,由相应的病毒RNA合成SF-4株的HN基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF047(39mer)(SEQ ID NO 47)
5′CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3′和
LF048(38mer)(SEQ ID NO 48)
5′CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT 3′.
SalI和EcoRV消化PCR产物获得的约1726bp的DNA片段与SalI和EcoRV消化pVR1012(实施例2)产生的4896bp片段连接,产生质粒pLF1024(约6619bp)。
bPI-3HN基因编码一种有572个氨基酸的蛋白质。
7.1.2 pLF1025:克隆到载体pLF999中的HN基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM]形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应,由pLF1024模板(实施例7.1.1)合成跨膜域缺失的HN基因:
LF058(33mer)(SEQ ID NO 49)
5′CATACTGCGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT 3′和
LF059(35mer)(SEQ ID NO 50)
5′CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3′.
NotI和EcoRV消化PCR产物获得的1566bp的DNA片段与NotI和EcoRV消化pLF999(实施例2)产生的5663bp片段连接,产生质粒pLF1025(约7229bp)。
这样修饰的bPI-3HN基因(β-珠蛋白tPA-E2Δ[TM])编码一种有548个氨基酸的蛋白质。
7.2编码不同形式的bPI-3 SF-4株F的质粒
7.2.1 pLF1026:克隆到载体pVR1012中的F基因(原始形式)
利用引物LF061,由相应的病毒RNA合成SF-4株的F基因的cDNA,并且利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF060(36mer)(SEQ ID NO 51)
5′CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA 3′和
LF061(36mer)(SEQ ID NO 52)
5′CATGACCAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA 3′.
SalI和BglII消化PCR产物获得的1628bp的DNA片段与SalI和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接,产生质粒pLF1026(约6488bp)。
bPI-3 F基因编码一种有550个氨基酸的蛋白质。
7.2.2 pLF1027:克隆到载体pLF999中的F基因(β-珠蛋白tPA-FΔ[TM+Cter]形式)
利用下列寡核苷酸对,通过PCR反应由pLF1026模板(实施例7.2.1)合成跨膜域和C端域缺失的F基因:
LF062(42mer)(SEQ ID NO 53)
5′CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAACGT 3′和
LF063(41mer)(SEQ ID NO 54)
5′CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC 3′.
NotI和EcoRV消化PCR产物获得的1434bp的DNA片段与NotI和EcoRV消化pLF999(实施例2)产生的5663bp片段连接,产生质粒pLF1027(约7097bp)。
这样修饰的bPI-3 F基因(β-珠蛋白tPA-FΔ[TM+Cter)编码一种有504个氨基酸的蛋白质。
实施例8:编码不同形式的假狂犬病病毒(PRV)抗原的质粒
编码PRV糖蛋白gB、gC和gD的基因由NIA3株的病毒DNA经PCR获得(M.Riviere等人,J.Virol.66,3424-3434;A.Baskerville等人,The Veterinary Bulletin,1973,43,第9号)。也可以使用PRV NIA3株的突变体,在US-A-4,680176中有描述,保藏于国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM),Institut Pasteur,巴黎,法国,编号为I-351和I-352。
8.1编码不同形式的PRV-gB的质粒
8.1.1 pSB101:克隆到载体pVR1012中的gB基因(原始形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gB基因:
SB201(36mer)(SEQ ID NO 55)
5′TTTTAAGATATCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG 3′和
SB202(39mer)(SEQ ID NO 56)
5′TTTTAAGGATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(2766bp),克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为7631bp的质粒pSB101。
PRV gB基因编码一种有913个氨基酸的糖蛋白。
8.1.2 pSB102:克隆到载体pVR1012中的gB基因(Δ[TM-Cter]形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gB基因的截短形式:
SB201(SEQ ID NO 55)和
SB203(39mer)(SEQ ID NO 57)
5′TTTTAAGGATCCCTAGTGGTCCACCTTGACCACGCGGTC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(2262 bp),克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为7142bp的质粒pSB102。
gB基因的截短形式(Δ[TM-Cter])编码一种有750个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gB糖蛋白的胞外域。
8.1.3 pNS009:克隆到载体pAB110中的gB基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pSB101(实施例8.1.1)PCR扩增PRV NIA3株的gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB203(SEQ ID NO 57)和
SB217(39mer)(SEQ ID NO 58)
5′AAAATTTCGATATCCACCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(2088 bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为7127bp的质粒pNS009。
gB基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有720个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gB糖蛋白的胞外域。
8.2编码不同形式的PRV-gC的质粒
8.2.1 pSB103:克隆到载体pVR1012中的gC基因(原始形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gC基因:
SB204(36mer)(SEQ ID NO 59)
5′TTTTAAGATATCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATG 3′和
SB205(37mer)(SEQ ID NO 60)
5′TTTTAAAGATCTTTAAGGCCCCGCCTGGCGGTAGTAG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1452bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为6323bp的质粒pSB103。
PRV gC基因编码一种有479个氨基酸的糖蛋白。
8.2.2 pSB104:克隆到载体pVR1012中的gC基因(Δ[TM-Cter]形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gC基因的截短形式:
SB204(SEQ ID NO 59)和
SB206(36mer)(SEQ ID NO 61)
5′TTTTAAAGATCTTTAGGGGGAGGCGTCGTAGCGCTG 3′.
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1332bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为6206bp的质粒pSB104。
gC基因的截短形式(Δ[TM-Cter])编码一种有440个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gC糖蛋白的胞外域。
8.2.3 pNS012:克隆到载体pAB110中的gC基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pSB103(实施例8.2.1)PCR扩增PRV NIA3株的gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB206(SEQ ID NO 61)和
SB218(39mer)(SEQ ID NO 62)
5′AAAATTTCGATATCCACGGCGCTCGGCACGACGCCCAAC 3′.
用酶EcoRV和BglII消化扩增产物(1270bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为6311bp的质粒pNS012。
gC基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有448个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gC糖蛋白的胞外域。
8.3编码不同形式的PRV-gD的质粒
8.3.1 pSB105:克隆到载体pVR1012中的gD基因(原始形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gD基因:
SB207(36mer)(SEQ ID NO 63)
5′AATTTTGATATCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGCG 3′和
SB208(36mer)(SEQ ID NO 64)
5′AATTTTGGATCCCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1227bp),克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为6104bp的质粒pSB105。
PRV gD基因编码一种有404个氨基酸的糖蛋白。
8.3.2 pSB106:克隆到载体pVR1012中的gD基因(Δ[TM-Cter]形式)
用病毒DNA作为模板,利用下列引物,PCR扩增PRV NIA3株的gD基因的截短形式:
SB207(SEQ ID NO 63)和
SB209(40mer)(SEQ ID NO 65)
5′AAATTTTGGATCCCTAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGC 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1077bp),克隆到预先用EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例2)中,产生大小约为5957bp的质粒pSB106。
gD基因的截短形式(Δ[TM-Cter])编码一种有355个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gD糖蛋白的胞外域。
8.3.3 pPB238:克隆到载体pAB110中的gD基因(tPAΔ[TM-Cter]形式)
利用下列引物,由模板pSB105(实施例8.3.1)PCR扩增PRV NIA3株的gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式:
SB209(SEQ ID NO 65)和
SB219(39mer)(SEQ ID NO 66)
5′AAAATTTCGATATCCACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCG 3′.
用酶EcoRV和BamHI消化扩增产物(1015bp),克隆到预先用EcoRV和BglII消化的载体pAB110(实施例2)中,产生大小约为6056bp的质粒pPB238。
gD基因的tPAΔ[TM-Cter]形式编码一种有363个氨基酸的糖蛋白,含有PRV gD糖蛋白的胞外域。
实施例9:编码不同形式的猪生殖道呼吸道综合征病毒(PRRSV)Lelystad株抗原的质粒
编码PRRSV ORF3、ORF5和ORF6蛋白的基因由Lelystad株的病毒RNA经RT-PCR获得(J.Meulenberg等人,Virology,1993,19,62-72;WO-A-92-21375),于1991年6月5日保藏于国立微生物保藏中心(CNCM),Institut Pasteur,巴黎,法国,编号为I-1102。
9.1编码不同形式的PRRSV Lelystad株ORF3的质粒
9.1.1 pLF1009:克隆到载体pVR1012中的ORF3基因(原始形式)
利用引物LF028,由相应的病毒RNA合成Lelystad株的ORF3基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF027(30mer)(SEQ ID NO 67)
5′CACTACGATATCATGGCTCATCAGTGTGCA 3′和
LF028(30mer)(SEQ ID NO 68)
5′CACTACAGATCTTTATCGTGATGTACTGGG 3′.
EcoRV和BglIII消化PCR产物获得的802bp的DNA片段与EcoRV和BglIII消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接,产生大小约为5681bp的质粒pLF1009。
PRRSV Lelystad ORF3基因编码一种有265个氨基酸的蛋白质。
9.2编码不同形式的PRRSV Lelystad株ORF5的质粒
9.2.1 pLF1011:克隆到载体pVR1012中的ORF5基因(原始形式)
利用引物LF020,由相应的病毒RNA合成Lelystad株的ORF5基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF019(30mer)(SEQ ID NO 69)
5′CTCACCGTCGACATGAGATGTTCTCACAAA 3 ′和
LF020(30mer)(SEQ ID NO 70)
5′CTCACCTCTAGACTAGGCCTCCCATTGCTC 3′.
SalI和XbaI消化PCR产物获得的802bp的DNA片段与SalI和XbaI消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接,产生大小约为5681bp的质粒pLF1011。
PRRSV Lelystad ORF5基因编码一种有201个氨基酸的蛋白质。
9.2.2 pLF1012:克隆到载体pAB110中的ORF5基因(截短形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1011(实施例9.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF5基因:
LF021(30mer)(SEQ ID NO 71)
5′CACCTCGGATCCTTTGCCGATGGCAACGGC 3′和
LF022(33mer)(SEQ ID NO 72)
5′CACCTCGGATCCTTAGACTTCGGCTTTGCCCAA 3′.
BamHI消化PCR产物获得的432bp的DNA片段与BamHI消化pAB110(实施例2)产生的5105bp片段连接,产生大小约为5537bp的质粒pLF1012。
这样修饰的PRRSV Lelystad ORF5基因(tPAΔ[TM+Cter])编码一种有168个氨基酸的蛋白质。
9.3编码不同形式的PRRSV Lelystad株ORF6的质粒
9.3.1 pLF1013:克隆到载体pVR1012中的ORF6基因(原始形式)
利用引物LF024,由相应的病毒RNA合成Lelystad株的ORF6基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF023(30mer)(SEQ ID NO 73)
5′CACTCAGTCGACATGGGAGGCCTAGACGAT 3′和
LF024(30mer)(SEQ ID NO 74)
5′CACTCATCTAGATTACCGGCCATACTTGAC 3′.
SalI和XbaI消化PCR产物获得的528bp的DNA片段与SalI和XbaI消化pVR1012(实施例2)产生的4881bp片段连接,产生大小约为5409bp的质粒pLF1013。
PRRSV Lelystad ORF6基因编码一种有173个氨基酸的蛋白质。
9.3.2 pLF1014:克隆到载体pAB110中的ORF6基因(截短形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1013(实施例9.3.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF6基因:
LF025(30mer)(SEQ ID NO 75)
5′CACTACGGATCCGTGTCACGCGGCCGACTC 3′和
LF026(33mer)(SEQ ID NO 76)
5′CACTACGGATCCTTAAACAGCTCGTTTGCCGCC 3′.
BamHI消化PCR产物获得的390bp的DNA片段与BamHI消化pAB110(实施例2)产生的5105bp片段连接,产生大小约为5495bp的质粒pLF1014。
这样修饰的PRRSV Lelystad ORF6基因(tPAΔ[TM+Cter])编码一种有154个氨基酸的蛋白质。
实施例10:编码不同形式的猪生殖道呼吸道综合征病毒(PRRSV)美国株ATCC VR-2332抗原的质粒
编码PRRSV病毒ORF3、ORF5和ORF6蛋白的基因由保藏为ATCC号VR-2332的美国株的病毒RNA经RT-PCR获得(M.Murtaugh等人,Arch.Virol.,1995,140,1451-1460)。
10.1编码不同形式的PRRSV VR-2332株ORF3的质粒
10.1.1 pLF1015:克隆到载体pVR1012中的ORF3基因(原始形式)
利用引物LF038,由相应的病毒RNA合成VR-2332株的ORF3基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF037(30mer)(SEQ ID NO 77)
5′CACTACGATATCATGGTTAATAGCTGTACA 3′和
LF038(30mer)(SEQ ID NO 78)
5′CACTACTCTAGACTATCGCCGTACGGCACT 3′.
EcoRV和XbaI消化PCR产物获得的769bp的DNA片段与EcoRV和BglIII消化pVR1012(实施例2)产生的4900bp片段连接,产生大小约为5669bp的质粒pLF1015。
PRRSV VR-2332株ORF3基因编码一种有254个氨基酸的蛋白质。
10.2编码不同形式的PRRSV VR-2332株ORF5的质粒
10.2.1 pLF1017:克隆到载体pVR1012中的ORF5基因(原始形式)
利用引物LF030,由相应的病毒RNA合成VR-2332株的ORF5基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF029(30mer)(SEQ ID NO 79)
5′CACTACGATATCATGTTGGAGAAATGCTTG 3′和
LF030(30mer)(SEQ ID NO 80)
5′CACTACAGATCTCTAAGGACGACCCCATTG 3′.
EcoRV和BglII消化PCR产物获得的607bp的DNA片段与EcoRV和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接,产生大小约为5486bp的质粒pLF1017。
PRRSV VR-2332株ORF5基因编码一种有200个氨基酸的蛋白质。
10.2.2 pLF1018:克隆到载体pAB110中的ORF5基因(截短形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1017(实施例10.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF5基因:
LF031(33mer)(SEQ ID NO 81)
5′CACTACGGATCCGCCAGCAACGACAGCAGCTCC 3′和
LF032(33mer)(SEQ ID NO 82)
5′CACTACGGATCCTTAGACCTCAACTTTGCCCCT 3 ′.
BamHI消化PCR产物获得的426bp的DNA片段与BamHI消化pAB110(实施例2)产生的5105bp片段连接,产生大小约为5531bp的质粒pLF1018。
这样修饰的PRRSV VR-2332株ORF5基因(tPAΔ[TM+Cter])编码一种有166个氨基酸的蛋白质。
10.3编码不同形式的PRRSV VR-2332株ORF6的质粒
10.3.1 pLF1019:克隆到载体pVR1012中的ORF6基因(原始形式)
利用引物LF034,由相应的病毒RNA合成VR-2332株的ORF6基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF033(33mer)(SEQ ID NO 83)
5′CACATCCTGCAGATGGGGTCGTCCTTAGATGAC 3′和
LF034(30mer)(SEQ ID NO 84)
5′CACATCTCTAGATTATTTGGCATATTTGAC 3′
PstI和XbaI消化PCR产物获得的527bp的DNA片段与PstI和XbaI消化pVR1012(实施例2)产生的4871bp片段连接,产生大小约为5398bp的质粒pLF1019。
PRRSV VR-2332株ORF6基因编码一种有174个氨基酸的蛋白质。
10.3.2 pLF1016:克隆到载体pAB110中的ORF6基因(截短形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1019(实施例10.3.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的ORF6基因:
LF035(30mer)(SEQ ID NO 85)
5′CACTACGGATCCGTGAGTCGCGGCCGACTG 3′和
LF036(33mer)(SEQ ID NO 86)
5′CACTACGGATCCTTAAACAGCTTTTCTGCCACC 3′.
BamHI消化PCR产物获得的390bp的DNA片段与BamHI消化pAB110(实施例2)产生的5105bp片段连接,产生大小约为5459bp的质粒pLF1016。
这样修饰的PRRSV VR-2332株ORF6基因(tPAΔ[TM+Cter])编码一种有154个氨基酸的蛋白质。
实施例11:编码不同形式的猪流感病毒(SIV)H1N1株抗原的质粒
编码猪流感病毒H1N1型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的基因由“SW”H1N1株的病毒RNA经RT-PCR获得。这些株可从位于加拿大LaVal的魁北克大学Armand-Frappier研究所的病毒学研究中心获得(D.S.Arora等人,Virus Genes,1997,14,251-254)。参见G.W.Both等人,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 1983,80,6996-7000。
11.1编码不同形式的SIV H1N1株HA的质粒
11.1.1 pLF1001:克隆到载体pVR1012中的HA基因(原始形式)
利用引物LF004,由相应的病毒RNA合成H1N1株的HA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF003(30mer)(SEQ ID NO 87)
5′CTCCATGATATCATGGAAGCAAAACTATTC 3′和
LF004(30mer)(SEQ ID NO 88)
5′CTCCATCAGATCTTAAATGCATATTCTGCA 3′
EcoRV和BglIII消化PCR产物获得的1705bp的DNA片段与EcoRV和BglIII消化pVR1012(实施例2)产生的4879bp片段连接,产生大小约为6584bp的质粒pLF1001。
SIV H1N1 HA基因编码一种有566个氨基酸的蛋白质。
11.1.2 pLF1002:克隆到载体pLF999中的HA基因(修饰形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1001(实施例11.1.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因:
LF005(30mer)(SEQ ID NO 89)
5′TCCGCGGCCGCACATGCTAACAATTCCACA 3′和
LF006(32mer)(SEQ ID NO 90)
5′TCCGCGGCCGCTTACATTGATTCTAGTTTCAC 3′.
NotI消化PCR产物获得的1515bp的DNA片段与NotI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接,产生大小约为7193bp的质粒pLF1002。
这样修饰的SIV H1N1 HA基因(兔β-珠蛋白基因的内含子II,tPA,Δ[TM+Cter])编码一种有530个氨基酸的蛋白质。
11.2编码不同形式的SIV H1N1株NA的质粒
11.2.1 pLF1003:克隆到载体pVR1012中的NA基因(原始形式)
利用引物LF008,由相应的病毒RNA合成H1N1株的NA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF007(30mer)(SEQ ID NO 91)
5′CACCTGGTCGACATGAATCCAAATCAGAAG 3′和
LF008(30mer)(SEQ ID NO 92)
5′CACCTGTCTAGACTACTTGTCAATGGTGAA 3′.
SalI和XbaI消化PCR产物获得的1416bp的DNA片段与SalI和XbaI消化pVR1012(实施例2)产生的4881bp片段连接,产生大小约为6297bp的质粒pLF1003。
SIV H1N1 NA基因编码一种有469个氨基酸的蛋白质。
11.2.2 pLF1004:克隆到载体pLF999中的NA基因(修饰形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1003通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因:
LF009(31mer)(SEQ ID NO 93)
5′CACTACGAATTCACAAATTGGGAATCAAAAT 3′和
LF010(30mer)(SEQ ID NO 94)
5′AATTTGTGAATTCGCGGCCGCGGATCCGGT 3′.
EcoRI消化PCR产物获得的1207bp的DNA片段与EcoRI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接,产生大小约为6885bp的质粒pLF1004。
这样修饰的SIV H1N1 NA基因(兔β-珠蛋白基因的内含子II,tPA,Δ[TM+Cter])编码一种有431个氨基酸的蛋白质。
实施例12:编码不同形式的猪流感病毒(SIV)H3N2株抗原的质粒
编码H3N2型猪流感病毒的HA和NA抗原的基因由“ Cotes du Nord1987”(cdn87)株的病毒RNA经RT-PCR获得,该毒株由世界卫生组织(WHO)引用,可获自国家流感参考中心,病毒学实验室,8 avenueRockfeller,69008里昂,法国。
12.1编码不同形式的SIV H3N2株HA的质粒
12.1.1 pLF1005:克隆到载体pVR1012中的HA基因(原始形式)
利用引物LF012,由相应的病毒RNA合成H3N2株的HA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF011(30mer)(SEQ ID NO 95)
5′CTGCACGTCGACATGAAGACTGTCATTGCC 3′和
LF012(24mer)(SEQ ID NO 96)
5′GATATCTCAGATGCAAATGTTGCA 3′.
EcoRV和SalI消化PCR产物获得的1709bp的DNA片段与EcoRV和SalI消化pVR1012(实施例2)产生的4893bp片段连接,产生大小约为6602bp的质粒pLF1005。
SIV H3N2 HA基因编码一种有566个氨基酸的蛋白质。
12.1.2 pLF1006:克隆到载体pLF999中的HA基因(修饰形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1005(实施例12.1.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的HA基因:
LF013(33mer)(SEQ ID NO 97)
5′CACCGCGGATCCCTTCCAGAAAATGGCAGCACA 3′和
LF014(33mer)(SEQ ID NO 98)
5′CACCGCGGATCCTTAGTCTTTGTATCCCGACTT 3′.
BamHI消化PCR产物获得的1542bp的DNA片段与BamHI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接,产生大小约为7220bp的质粒pLF1006。
这样修饰的SIV H3N2 HA基因(兔β-珠蛋白基因的内含子II,tPA,Δ[TM+Cter])编码一种有538个氨基酸的蛋白质。
12.2编码不同形式的SIV H3N2株NA的质粒
12.2.1 pLF1007:克隆到载体pVR1012中的NA基因(原始形式)
利用引物LF016,由相应的病毒RNA合成H3N2株的NA基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF015(30mer)(SEQ ID NO 99)
5′CACTCAGATATCATGAATCCAAAGCAAAAG 3′和
LF016(30mer)(SEQ ID NO 100)
5′CACTCATCTAGATTATATAGGCATGAGATC 3′.
EcoRV和XbaI消化PCR产物获得的1414bp的DNA片段与EcoRV和XbaI消化pVR1012(实施例2)产生的4900bp片段连接,产生大小约为6314bp的质粒pLF1007。
SIV H3N2 NA基因编码一种有469个氨基酸的蛋白质。
12.2.2 pLF1008:克隆到载体pLF999中的NA基因(修饰形式)
利用下列寡核苷酸对,由模板pLF1005(实施例12.2.1)通过PCR反应合成跨膜域和羧基端域缺失的NA基因:
LF017(33mer)(SEQ ID NO 101)
5′CACTACGGATCCTTCAAGCAATATGAGTGCGAC 3′和
LF018(33mer)(SEQ ID NO 102)
5′CACTACGGATCCTTATGAAGTCCACCATACTCT 3′.
BamHI消化PCR产物获得的1221bp的DNA片段与BamHI消化pLF999(实施例2)产生的5678bp片段连接,产生大小约为6899bp的质粒pLF1008。
这样修饰的SIV H3N2 NA基因(兔β-珠蛋白基因的内含子II,tPA,Δ[TM+Cter])编码一种有431个氨基酸的蛋白质。
实施例13:编码牛GM-CSF的质粒
利用引物LF065,由牛血单核细胞的细胞RNA合成牛GM-CSF基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF054(36mer)(SEQ ID NO 103)
5′CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3′和
LF055(34mer)(SEQ ID NO 104)
5′CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3′.
SalI和BglII消化PCR产物获得的437bp的DNA片段与SalI和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接,产生质粒pLF1032(约5297bp)。牛GM-CSF基因编码一种有143个氨基酸的蛋白质。
实施例14:编码猪GM-CSF的质粒
利用引物LF067,由猪血单核细胞的细胞RNA合成猪GM-CSF基因的cDNA,并利用下列寡核苷酸对通过PCR反应扩增:
LF056(36mer)(SEQ ID NO 105)
5′CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3′和
LF057(37mer)(SEQ ID NO 106)
5′CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCAGCA 3 ′.
SalI和BglII消化PCR产物获得的440bp的DNA片段与SalI和BglII消化pVR1012(实施例2)产生的4860bp片段连接,产生质粒pLF1033(约5300bp)。猪GM-CSF基因编码一种有144个氨基酸的蛋白质。
实施例15:疫苗质粒的配制
含有一种或多种根据实施例3-14的质粒的DNA溶液如Sambrook等人(1989)所述通过乙醇沉淀浓缩。DNA沉淀溶解于0.9%NaCl溶液中,获得1mg/ml的浓度。用适当体积的无菌水溶解DMRIE-DOPE的冻干物制备0.75mM DMRIE-DOPE溶液。
通过溶于0.9%NaCl溶液的1mg/ml DNA溶液与0.75mM DMRIE-DOPE溶液等份稀释,实现质粒DNA-脂复合物的形成。利用26G针头,沿瓶壁逐渐加入该DNA溶液,瓶中含有阳离子脂溶液,以避免形成泡沫。两种溶液一混合就轻轻摇动。最终获得含有0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml质粒的组合物。
对于上述所有操作,在室温下使用所有溶液是所希望的。在免疫动物之前,DNA/DMRIE-DOPE复合物的形成在室温下进行30分钟。
实施例16:牛针对BHV-1的免疫
12头牛随机分配到3组中,每组4头。
第1组为对照动物组。
对第2组的动物施用疫苗质粒pPB281(编码Δ[TM-Cter]形式的BHV-1gB,实施例3.1.2)、pPB292(编码Δ[TM-Cter]形式的BHV-1gC,实施例3.2.2)和pPB284(编码Δ[TM-Cter]形式的BHV-1gD,实施例3.3.2)的混合物。
对第3组的动物施用与第2组相同的混合物,但是该混合物如实施例15所述用DMRIE-DOPE配制。
利用针头注射器经肌内途径对每头牛进行10ml的注射,21天后重复一次。每次免疫中使用的每种质粒的总量为1500μg。
本领域的技术人员有根据所需的质粒剂量调节体积或浓度的必要能力。
在第一次接种后的35天的时间内,监测由两种表达BHV-1gB、gC和gD抗原的疫苗质粒混合物诱发的血清学反应。
结果示于下表中:
质粒 | 制剂 | 抗原 | 剂量 | 第28天的SN | 第35天的SN |
对照 | --- | --- | --- | 0.2+/-0.0 | 0.2+/-0.0 |
pPB281pPB292pPB294 | --- | gBΔ[TM-Cter]gCΔ[TM-Cter]gDΔ[TM-Cter] | 1500μg1500μg1500μg | 1.0+/-0.5 | 1.2+/-0.8 |
pPB281pPB292pPB294 | DMRIE-DOPE | gBΔ[TM-Cter]gCΔ[TM-Cter]gDΔ[TM-Cter] | 1500μg1500μg1500μg | 2.1+/-0.6 | 2.7+/-0.6 |
实施例17:猪针对PRV的免疫
15只大约7周龄的猪随机分配到3组中,每组5只。
第1组为对照动物组。
对第2组的动物施用疫苗质粒pNS009(编码tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gB,实施例8.1.3)、pNS012(编码tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gC,实施例8.2.3)和pPB238(编码tPAΔ[TM-Cter]形式的PRV gD,实施例8.3.3)的混合物。
对第4组的动物施用与第3组相同的混合物,但是该混合物如实施例15所述用DMRIE-DOPE配制,获得0.0535mM的终DMRIE-DOPE浓度。
这些接种方案所需的质粒,每种350μg混合于14ml终体积中。
利用针头注射器经肌内途径对每只猪进行2ml的注射,21天后重复一次。
在第35天时,经鼻施用2ml PRV NIA3株攻击病毒溶液攻击这些猪,每只鼻孔1ml,效价为107.76CCID50/ml。
在第一次接种后的42天的时间内,监测每只动物的体重(kg)。
在攻击后的7天内计算每只动物的相对体重增加(G7)。它是第7天(D7)的体重减去攻击日(D0)的体重,除以攻击日的体重,每日表示为百分数:
(D7的体积-D0的体重)·100/(D0.7的体重)
ΔG7是接种动物与对照动物的相对体重增加平均值的差。
结果示于下表中:
质粒 | 制剂 | 抗原 | 剂量 | 第35天的平均体重 | 第42天的平均体重 | ΔG7 |
对照 | --- | --- | --- | 25.3+/-6.2 | 22.0+/-5.0 | --- |
pNS009pNS012pPB238 | --- | gBΔ[TM-Cter]tPAgCΔ[TM-Cter]tPAgDΔ[TM-Cter]tPA | 350μg350μg350μg | 25.3+/-4.8 | 26.1+/-4.7 | 2.46 |
pNS009pNS012pPB238 | DMRIE-DOPE | gBΔ[TM-Cter]tPAgCΔ[TM-Cter]tPAgDΔ[TM-Cter]tPA | 350μg350μg350μg | 23.8+/-4.5 | 26.2+/-4.9 | 3.41 |
应当清楚地理解,附加权利要求书所确定的本发明不限于以上说明书所述的具体实施方案,而包括既不超出本发明的范围又不违反其精神的变化。
Claims (6)
1.针对侵袭家畜的病原体的DNA疫苗,其中含有质粒、DMRIE,即N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙铵,和DOPE,即二油酰磷脂酰乙醇胺,所述质粒含有选自下述的编码BHV-1免疫原的核苷酸序列,条件是允许该序列在体内表达,
(1)经如下优化的BHV-1gB基因序列:用信号序列替换糖蛋白gB的信号肽序列,和/或缺失编码gB跨膜域的DNA片段;
(2)经如下优化的BHV-1gC基因序列:用信号序列替换糖蛋白gC的信号肽序列,和/或缺失编码gC跨膜域的DNA片段;
(3)经如下优化的BHV-1gD基因序列:用信号序列替换糖蛋白gD的信号肽序列,和/或缺失编码gD跨膜域的DNA片段;或
(4)DMRIE-DOPE和下列质粒:编码BHV-1gB抗原的表达质粒,通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段而被优化;编码BHV-1gC抗原的第二表达质粒,通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段而被优化;和编码BHV-1gD抗原的第三表达质粒,通过缺失编码跨膜域和邻接的C端部分的核苷酸序列片段而被优化。
2.根据权利要求1的疫苗,其中,所述家畜是牛或猪。
3.根据权利要求1的疫苗,其特征在于该疫苗另外还含有所述动物种的GM-CSF蛋白。
4.根据权利要求1的疫苗,其特征在于该疫苗另外还含有表达载体,该表达载体含有编码所述动物种的GM-CSF蛋白的基因,条件是允许该基因的序列在体内表达。
5.根据权利要求4的疫苗,其特征在于该表达载体是质粒。
6.根据权利要求1的疫苗,其特征在于信号序列是人源组织纤溶酶原激活物的信号序列。
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