PT1248650E - Vacinas de dna melhoradas para vírus herpes bovino-1 - Google Patents

Description

ΡΕ1248650 1 DESCRIÇÃO "VACINAS DE DNA MELHORADAS PARA VÍRUS HERPES BOVINO-1" A presente invenção refere-se a vacinas de DNA melhoradas para animais de produção, em particular bovinos e suínos. A utilização de moléculas de ácido nucieico (DNA) para. a vacinação é conhecida desde o início dos anos 90 {Wolf et al. Science 1990. 247: 1465-1468). Esta técnica de vacinação induz uma imunidade celular e humorai após a transfecção in vive de células do sujeito a vacinar pelas moléculas de DNA ou de RNA que codificam as proteínas imu-nologicamente aetívas.

Uma vacina de DNA é constituída por pelo menos um plasmídeo que possa ser expresso pela maquinaria celular do sujeito a vacinar e por um veículo ou por um excipiente farmaceutrcarnente aceitável. A. sequência nucieot.id.ica. deste plasmídeo codifica para, entre outros, um ou vários imuno-genes, de modo que as proteínas ou giicoproteínas capazes de induzir, no sujeito a vacinar, uma resposta imunitária celular (mobilização dos linfócitos T) e humoral (estimulação da produção de anticorpos especificamente dirigidos contra o ímunogene) (Davis H. L, Current Opinion Biotech. 1997. 8. 635-640). 2 ΡΕ1248650

Todos os imunogenes que são provenientes de um BHV-1 não são antigénios suficientemente eficazes natural- mente P a r a induzir uma resposta imunitária protectora óptimj a. no animar a vacinar, E deste modo necessário me lho: Γ clil cl resposta imunitária. Sâo propostas diferentes vias de administração da vacina de DNA (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, sub-cutânea, intradérmica, mucosa, etc.). São igualmente propostos deferentes meios de administração, nomeadamente partículas de ouro revestidas de DNA e projectada.s de modo a penetrar nas células da pele do sujeito a vacinar (Tang et ai, Nature 1992- 356. 152-154) e os injectores por jacto liquido que permitem transfectar, à vez, células da pele e células dos tecidos subjacentes (Furth et ai. Analytical Bioch. 1992. 205. 365-368). Vários compostos químicos têm sido utilizados para. a transfecção in vi tiro de DNA : A./ -os líprdos catrónicos.

Os iipidos catrónicos estão divididos em quatro subgrupos. 1) os lípidos catiónicos contendo sais de amónio quaternário, como por exemplo o DOTMA (dioie-oiloxipropil-trímetíiamónio, produzido por Gi- ΡΕ1248650 3 bco sob o nome de Lipofectina) , o DOTAP (tri- nio; Gregoriadís et al. FEBS Letters 1997. 402. 107-110), o DMRIE (N-{2-hidroxietil)-N,N-dime-tii-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamínio; WO-A-9634109), o DLRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-di-metii~2, 3-bis(dodeciloxi)-i-propanamineo; Fel-gner et ai, A.nn. N Y Acad, Sei, 1995, 772, 126-13 9) .

Estes lipidos catiónicos contendo sais de amónio quaternário podem estar ou não associados com um lípido neutro suplementar, tais como o DOPC (dioleoi .l-fosfatid.iI~coI.ina) ou o DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina) (J. P. Behr, BiQcon.juga.te Chemistry 1994. 5. 382-389). as lipoaminas, como por exemplo o DOGS (di-octadecilamidoglicilespermina, produzido por Promiega sob o nome de Transfectam; Abd.al.iah et ai, Biol, Cell, 1995, 85. 1~7), o DG-Chol (di-me 11.1 a m. i η o e t a η o - c a. r b arno i 1 - c o 1 e s t e r o 1.; G a o e

Huancj , Bioc hem, Biopnys, Res, Commun- 1991. 179. 9 G 0 ... 9 G i . v. . v. . 1), o BGSC (t ds-guanidino -o::; uermi- dino- coleste rol) , o EGTC (b i s - g u a n i d i η o - -tren- C O _L Θ 3 terol) (Vigneron et < ai, Proc. Natl. Acaci.

Sei. USA 1996, 93, 9682-9686), os lioidoí latioru :os ;onte: ao de amomo ΡΕ1248650 quaternário e lipoaminas, como por exemplo c pentaclor rdrato de ( .inocarboxamido) et: - x / — ! ropanrmíd ro, corm srciai some de LipofectAi CA nine :us 1993. 15. 73-7 '9) , o opii)-N,N -dimetil- - 2, 3 - namineo; Wheeier et ci. USA 1 996. 93. 11454 •ine 19 97. 15. 8 01- - 803) de (N,N-dimetil-N-(2- :minocarboxamido) et.

XI -propanimídio, conv o GAP-DLRIE (N- (3- copíl) -N, N-dimetil-2, 3-1: l-prop:

Acad. ; /1 \ os lípidos contendo S ci .i. S ( ie arnrdi] na, como po exemplo o ADPDS, o ADODE (Ruyssct laert et a 1 Bi ochem. Biophvs , .Re s. Comi τι u Ώ . 1 9 9 4 A 203. 1 622 B/- os polímeros, como por exemplo o SuperFect (moléculas de dendrimeros activados, produzidos por Qiagen; Xu et al. Mol. Genet, Metab. 1998. 64. 193-197), e C/ — os agentes bioquímicos, como por exemplo as toxinas, nomeadamente as toxinas da cólera. f inal

Alguns destes compostos foram também utilizados na formulação de vacinas de DMA com resultados mais do que mitigantes. Os conhecimentos em matéria de transfecção in vitro não sao transponiveis para a vacinação de DNA em que o objectivo final é assegurar uma reacção imunitária pro- 5 ΡΕ1248650 tector a. Os efeítc s negat: l v o s s o o 8' a a indução de urr ia pro tecção imunitária eficaz foram me s mio constatados com o compos tos conhecia; o s p a r a favorecer a t ransfecção in vítro

Certos compostos químicos de formulação são tóxicos para as células transfectadas quando em doses elevadas,

Nos trabalhos de Etchart (Etchart et al. J. Gen. Vi rol. 1997. 78. 1577-1580), a utilização de DOTAP não produziu o efeito adjuvante quando da administração da vacina de DMA pela via intranasal, embora o tenha feito peia via oral. O DGTA.P for igualmente utilizado em vacinas de DMA. que codificam a hemaglut mina (HA) do vírus da gripe, no modelo de rato, administradas pela via intranasal (Ban et al. Vaccine 1 997, 15. 811-813), mas a. adi cão du dot AP inibiu a respo sta imuni tária, A utilização de DC-Chol ou de DOTAP/DOPE nas vacinas de DNA que codificam a proteina de superfície (S) do vi.ru; 3 da hepatite B, no mc ;deio do rat /Λ ·-" í administradas pela via intramuscular permitiu aumentar a resposta em ant icor rpos, uma vez que a utili zação da Lipo MA) não aumentou esta respost :.a (Gregoriadi et al. FEBS Let: ters 1997, 402. 1 07-110). 0 D( 7-Chol/DOPE fo igualmente utilizado em vacinas de DNA contra o vírus de imunodeficiência humana {HIV, proteína Env), no modelo de rato, em que a admínistraLção pelai via intramuscular induziu uma resposta imunitária mais eficaz, uma vez que a administração peia via subcutânea ou intradérmica não aumentou (Ishii et al, AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428). 6 ΡΕ1248650 A adição de certas citocinas, nomeadamente de ínterleucinas ou de interferões, pode permitir melhorar a resposta imunitária induzida em particular pelais vacinas de DMA. Cada citocina desencadeia uma reacção que lhe é mais própria e orienta mais ou menos a resposta imunitária através de uma resposta celular ou através de uma resposta humoral (Pasquini et ai, Immunol. Ceil, Biol, 1997. 75. 397-401; Kim et ai, J. Interferon Cytokine Res. 1999. 19. 77-34) . Os efeitos adjuvantes de uma citocina provêm de uma determinada espécie, não são necessariamente os mesmos se o contexto imunitário variar, nomeadamente se esta citocina for adminis traria a uma outra espécie, como num sistema imunitário heterólogo. A adição de citocina pode igua.lmente não ter qualquer efeito adjuvante, resultar numa inversão do efeito desejado, ou seja, numa diminuição ou uma inibição da resposta imunitária. Assim, uma vacina de DMA. que cod.ifica uma cadeia simples de uma imunoglobulína. em .fusão com o GJM-CSF não aumenta a resposta imunitária, enquanto que a administração dírecta no rato desta proteína de fusão é eficaz, assim como o é a administração de uma proteína de fusão formada de Fv e da citocina IL-lbeta ou a adminí straçã.o de uma vacina de DMA que codá.fica esta última proteína de fusão (Hakim et ai. J. Immunol 1996. 157. 5503-5511). A utilização de plasmideos que co-expressam a citocina IL-2 e a proteína do envelope do vírus da hepatite B numa conformação de fusão ou não fusão, resultam no aumento das respostas imunitárias humoraís e celulares (Chow et ai. J. Vi rol. 1997. 71. 169-78) . Mas a utilização de um plasmídeo bicistrónico que codifica a glicoproteina 7 ΡΕ1248650 gp!20 cio vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV-1) rai> * cit‘ scina IL-2 induziu uma respost: a imunitária cífica ant: L-gpl20 mais fj 13. c a c io que o obtido pela ízação de um plasmíãeo r aonoci strónico que codifica amente para gp!20 (Barouch 0 Ú CL .L , . J. InimuL :ol 1998. 161. ... 1 G 0 9 1 -L L' Z } . A co-injecção no rato de dois vectores de essãO; um que codifica a giicop roteína G ; do vírus da O. ; 0 Li tro para o GM-CSF ' de muríneo estimulam a vidade dos linfócitos Bei q enquanto que a co-injecção um p i a smide o que codifica < o inte rferão ga: ma (em vez de SF de mu r i neo) resulta n uma d .irnrnuição da resposta '\7Ύ· 7 7 ΓΊ 'h \ O ; imunitária (X. C-Θ1.1uS Γ30d.1. ΐ ΐC3.0G0S d.O Gl. νΘΐ. d.OS d..O. L 1a|0].1 1.0S ^ 0-3..1.3 como as deleções de uma parte da sequência nucleot id: i ca συ e codifica o antigéni· o, a . s .j. ri s θ .1.' v ô 0 s g 0 um fragmento de DMA. na sequência núcleo t i d 1 ca que codifica o antigénio ÍXI 1 nas regiões não traduz idas a montuj 5.nte ou a jusante, Pf. )dem igualmente melhorar a eficácia das vacinas de DNA, nomeadamente melhorando o nível de expressão do antiqénio ou a sua apresentação.

Mas na prática, as manipulações ao nível da sequência nucleotidica que codifica o antigénio podem resultar numa diminuição ou na perda de actividade imunológica inicial. Assim, a deleção do domínio transmembranar no gene que codifica o antigénio G do vírus da raiva diminuiu o nível de protecção induzido no modelo de rato após administração pela via intramuscular de uma ΡΕ1248650 vac ína de DNA que codif '± C cl este anti génio modificado (Xiang et ai. Virei. 1995, 209 5 6 9). A deieção do domínio tra nsmembranar no gene que codifica a glicoproteina gD do srpes k )Ovino (BHV) não permitiu aumentar a resposta corpos e nãc 5 induziu mais do que uma protecção nos b; svinos vacinados pela via intramuscular (van

Drunen Little-van den Hurk efc ai, J. Gen, Virol, 1998. 79. 831-839). As respostas imunitárias humorais e celulares e a protecção conferida são idênticas em cobaias aprovadas após terem sido imunizadas seja com o auxilio de uma vacina de DNA que codifica a glicoproteina GP do vírus Ehola, seja com uma vacina de DNA que codifica esta glicoproteina. GP mas sob uma forma segregada (Xu et ai, Nature Medicine 1998. 4. 37-42). do activador do n tissue Plasmi-

A ,j. Ώ S ΘÇ 3 O 0.3 S Θ C[ lí 0 Π C n. 5. S .1Ή 5. . I plasmínogénio tecidular (em inglês, "hum or" ou "humí s n t PA " ) no gene que codifica o 32 da malária não perm itiu aumentar a respos 3 3 ; num rato vacinado por via íntramuscui Ά V' , FEMS 1997, 18, í 93-2 02). A adição em fase de tPA ao gene que coar r c:a o aur- j qen j ο V u / r) n muríneo não permitiu igualmente aumentar a em resposta em anticorpos num rato vacinado por via intradér-mica, enquanto que a proteína de fusão formada pelo antígé-nio VP4 e tPA permitiu este aumento, mas sem induzir uma protecção eficaz d .998. 250. 230-240). modificaç efectuadas nu suq .a nuc 9 ΡΕ1248650 tidica de um a ntigénio não pc mente t jranspos· tas para outro antigén ios não possuem sempre tarai. dem, em geral, ser directa-antigénio, uma vez que os a mesma organização estru- 0 requerente tem como objectivo o melhoramento da eficácia da vacinação de DNA. Esta tem por objectivo, em particular, obter uma melhor resposta imunitária e, nomeadamente, uma protecção eficaz nos bovinos, através da va c r n a ç ã o de DNA. O requerente tem como objectivo a elaboração de vacinas de DNA melhoradas indutoras de uma resposta imunitária eficaz e protectora contra o vírus herpes bovino de tipo 1 (BH.V-1), também denominado vírus da rinotraqaeí te infecciosa bovina (IBE). G requerente tem igualmente como objectivo a Θ .1.3.1 joraç ão de vacinas de DNA me 11. loradar ? que perir lit am obter uma prot eccão eficaz contra o BHV- -1 que infecta c iS bovinos. y: rema de DNA é melhorada: ; seja. peia sua form.u.1 6 C ti O f ο Θ ’] cl pela Ição de GM-CSF, seja pe.: í. a up í. imi zaça.o do ou dos antigénios, seja pela combinação destas soluções

De modo preferido, a vacina de DNA é melhorada pela sua formulação, e facultativamente, seja pela a dição de GM-CSF , seja pela optimiração do ou dos anticíé ní os, finalmente, seja peia ; adição de GM-CSF e p Θ13- optimi zaçâo do ou dos antigénios. 10 ΡΕ1248650

Por definíçc lo, a vacina de DMA coim ureende como princípi 0 α C 01 -vo um p lasmideo que codifica 1 0 expres s a um gene ou f r agra ento de gene, e.g,, epitopo. 0 termo pias- mideo, < cobre uma uni·: iade de tran scriçâo ΌiTi DNA cc ;mpre- endendo uma sequência polinucleotídica compreendendo a sequência do gene a expressar e os elementos necessários à sua expressão in vivo. É preferida a forma circular do piasmideo, super-enrolada ou não. A forma linear está iaualmente incluída no âmbito desta invenção.

Cada piasmideo compreende um promotor apto a assegurar, nas células hospedeiras, a expressão do gene inserido sob a sua dependência. Trata-se, em geral, de um promotor eucariota forte e, em particular, de um promotor precoce do citomegaiovírus CMV-IE, de origem humana ou murínea, ou ainda eventualmente de uma outra origem tal como o rato, cobaia. De forma mais geral, o promotor é, de or ig em v i ra I i , ou de p }·'] OORi 00 lul 0’ r:. Co mo GUI aro promot p V‘ vi ra. 1 P; :'i .T.' ci além de CR 4V- IE, pode c i t :.a .r-s ;e p r) roin otor preco p p O Li caro 1. O do viri IS S V 4 0 ou o pi Ό mot o r ;· ii' IR Ο π y í rus ri o b ci Γ ϋ OITI a o Rous v Po< de tratar-ε mi . nda -Í 0 um prorr io tor ri ri víru s d· p q r·, cie prov em 0 gene, po r e X emp io , o pr ópric ! promo- tor dc gene , Como promc itor celu lar f pode ci' tar -se c ) promo-- tor dC um < gene do c itc )esquelet ϋ F t al cc mio ροτ : ese amplo, o prom Pt '.u. r da d„p srr i f'! a, ou ainda o prc )ir íOtC V da act ina. Uma v ez que vár ros genes e :St α 0 presente ε n o me sm o p las mídec A est es pode m e: star presen teu ϊ n a mesma i mie Λ Cl c|p de trans criç; lo ou em várias unidades diferentes. 11 ΡΕ1248650

Seguindo uma primeira modalidade, as vacinas de DNA de acordo com a invenção são formuladas por adição a título de adjuvante: DMRiE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(te- tradí; ; c 11 o x 1 )-1-propan amónio; documento ]/\j Ç)—— 9 (a 3 í H09) , de modo prefer ido associado com um lípido neutro, no π leadarner 1 O0 o DC )PE (dz i. ο I e ο í I - f o s f a t i d r 1 - e t a η o 1 am i: :a), para formar o DMRIE-DOPE. A presente invenção tem assim por objectivo uma vacina de DNA contra peio menos um BHV-1 que ataca os bovinos, compreendendo pelo menos um plasmídeo, contendo pelo menos uma sequência nucleotidica que codifica um imunogene de um BHV-1 de BHV-1, em condições que permitam a expressão in vivo desta sequência, e um lípido catiónico contendo um sal de amónio quaternário, nomeadamente o DMRIE, associa.d.o ao DOPE,

De modo preferido, a mistura vector recombinante com este adjuvante faz-se de forma extemporânea e é preferido, antes da sua administração ao animal, dar uni tempo à mistura assim constituída para se complexar, por exemplo, durante um período de 10 a 60 minutos, nomeadamente, na ordem de 30 minutos.

DMRIE:DOPE o DOPE estiver presente, a razão mora aria, de um modo preferido, desde 95:5 a 5:95 mais particuia.rmente 12 ΡΕ1248650 'Λ T Cf Z Cl C i poncf arar plasmidc ;0 l C i.cij u\ '3 .nte DMRIE ou DMRIE- DOP '"i1 pode rrf nomeadamente, CÍ0 5 0 :1 a 1: 10, nomead ame rt ;· ρ oe 1L, dl a 1 - i de modo p ref ezia de 1:1 a 1 : 2 , Se guinde ) uma seg anda mod ali aacle t j u nta-se a s vacina S i de acord o com a invenção o GM-CS ’ 7 ( em ing lês "Granu loc yte macrc )f age-c: oion y stimula tin g fa C- tor" ; Clark s. C. et ã -i . C? r'· 7 .-7 n 1987 . 230. ", o . c -· Í/.J, G.:. ant q ^ M . et ai. Dr uas 1992, 53. ít -r r \ .L O ; , que se pode fazer por .i .ncorporação da proteína GR dírectamente na compoi a í ç a. o v a c .1 ri a i. o u f de modo prefer ido, pela inserção da sequêr i c 1 a n ucieotidica συ e codifica o GM-C SF num vector de expres são ei m condições συ e permitam a sua t s xp r e s s ã o 1 n vi vo , Como vecto r de express ão, é preferido utilizar um plasmideo, e.qu, o plasmideo con- tendo antigé n 1 o sequência (s) de rnt nuc ere; leotídica que codifica o ase ou um outro prasmroeo. (ou os) Para os bovino S Θ utilizado o Gj M-CS.F 1 de bovino. Seguindo uma ter ceira modalidade, a (ou as) sequen ci a is; nucreouro f. X,O \ o ) que cooiricam o r munogene estão S ob uma forma opt irniza .da. Por optimização, eu tende-se toda a mo dificação Cf d í sequê: ncia nucleotidica, nome adamente a que S 0 manifesta O 0 J - o me nos por um nível de e xpressâo ma is i ales 'cfCiO Cf 0 S L cl S 0 quênc ;ia nucleotidica, e/ou por um aumento cia estabilidade do RN A mensageiro que codifica este antigénio, e/ou por uma secreção provocada deste antigénio no meio extraceiular, e tendo por consequência directa, ou indirecta, um aumento da resposta imunitária induzida. 13 ΡΕ1248650

Na presente invenção, a optimização do antígénío de interesse consiste, de modo preferido, na deleçao do fragmento da sequência nucleotídica que codifica o domínio transmembranar do antígénío de rnteresse (por deleçao, entende-se a deleçao total ou uma deleção parcial, suficiente para que o domínio transmembranar não fique de todo, ou substancialmente, funcional, e/ou a adição em fase de uma sequência nucleotídica que codifica o sinal tPA (Montgomery et ai, Cell. Mol, Biol. 1997. 43, 285-292; Harris et ai, Mol. Biol. MecL 1986. 3, 27 9-2 92), e/ou a inserção do intrão estabilizador a montante do gene a expressar. A deleçao do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembranar do antrgénro de interesse favorece a secreção através do meio extracelufar dos antigénios assim truncados e aumentado assim as suas possibilidades de contacto com as células do sistema imunitário, A inserção da sequência nucleotídica que codifica o sinal tPA facilita a capacidade de tradução do RNA. mensageiro, a cujo sinal tPA está ligado, e aumenta assim o nível de expressão deste RNA mensageiro e, deste modo, a produção de antigénios. O sinal tPA desempenha assim um papel na. secreção do antigénio sintetizado.

Vi rol,, 68, 766-775).

Podemi ser utilizadas outras sequências núcleo-tídicas que codificam os péptidos sinal, nomeadamente, as do péptído sinal da melitína proveniente das abelhas (Sisk W. P, et aí., 1994, J ΡΕ1248650 14 codifica aberrant inserção de um intrão estabilizador de interesse evitai mensaoerro e mantém a no gene que as junções integridade , cl humana, .e último

De modo preferido, o sinal tPA é de origem seouência nucleotidica do sinal tPA humano é acessível o a partir de acesso NM 000930. 11 do gene da beta-

Science 1979. 206. .) tidica é acessível a número de acesso VOOS da base de dados GenBank sob o De modo preferido, o intrão é c globrna do coelho (van Ooyen 337-344), em que a sequência partir da ba.se de dados GenBan 82 e referenciada como intrão n número et ai. nu c 1. e o - k sob o Ct /*\ A presente invenção tem como objectivo uma vacina de DMA. melhorada, capaz de induzir uma resposta imunitária eficaz e protectora nos bovinos contra a rinotraqueíte inreociosa bovina. ( iBR) . G vírus responsável da rinotraqueíte infecciosa bovina é um vírus de herpes bovino do tipo 1 (3HV-1), membro da família dos AI faherpes viririae {Babiuk L. A, et ai , 19 9 6. Vet. Mi cr -Qbi oi. 53. 31-42) . São conhecidas se- quências nucleotídic -3.S que cod .ificam as gli .coproteínas gB, gC e gD, e estão ; ace; ssíveis a partir da base de dc idOS GenBank co: η o n úmer o d e acesso AJ004801.

De acordo com a invenção, a vacina de DMA contra IBR é, de modo preferido, melhorada peia sua formulação com 15 ΡΕ1248650 um adjuvante de acordo com a invenção, nomeadamente o DMRIE, de modo preferido, o DMEIE-DGPE. Facuitativamente, isto pode ser combinado, seja com adição de GM-CSF bovino (Ma I iszeuski et ai, Molec. Immunol. 1988. 25, 893- 850), seja com a optimizaçâo de pelo menos um antigénio de IBR, seja finalmente com a adição de GM-CSF bovino e a optimizaçâo de pelo menos um antigénio de IBR.

Uma sequência nucleotídica que codifica o GM-CSF bovino está acessivel a partir da base de dados GenBank sob o número de acesso U22385. A adição de GM-CSF bovino pode fazer-se pela incorporação do polipéptido GM-CSF bovino na composição vacinai ou, de modo preferido, pela inserção da. sequência nucleotídica. que codifica o GM-CSF bovino num vector de expressão in vivGf de modo preferido, um piasrnideo. De modo preferido, a sequência nucleotídica que codifica o GM-CSF bovino é inserida num segundo piasrnideo de expressão (e.g. pLF1032 exemplo 13), diferente deste (ou destes) no qual é inserido o ou os genes que codificam o ou os antígéníos de IBR. A optimizaçâo dos antigénios provenientes de IBR faz-se por substituição, por uma sequência "61031’% nomeadamente a do sinal tPA de origem humana (numero de acesso GenBank NM000930), da sequência do péptido sinal da glíco-proteína gB e/ou da glicoproteina gC e/ou da glicoprotelna gD, e/ou pela deleção do fragmento de DMA que codifica o 16 ΡΕ1248650 domínio transmembranar de gB, e/ou de gC, e/ou de gD. A deleção do fragmento de DMA que codifica o domínio transmembranar de uma destas glícoproteinas é acompanhada, de modo preferido, da parte C terminal contígua (porção cito-plasmática da glicoproteína). A vacina de DNA contra IBR, de acordo com a invenção, pode deste modo codificar e expressar um só antigénio de IBR optimrzado (gB, gC ou gD) ou dois de entre eles ou os três, ou seja gB optimizado, gC optimizado e gD optimizado.

As sequências nucleotidicas que codificam os antigénios de BHV-1. utilizáveis na presente invenção e as diferentes construções de vectores de expressão são dados nos exemplos em anexo e no documento FR-A1-2751229, nomeadarnente nos exemplos 7 e 8, e nas figuras 3 e 1.

De modo preferido, de acordo com a invenção, a vacina de DBA contra BHV-1 é formulada com DMRIE-DOPE, e é constituída por um plasmídeo de expressão (e.g. pPB281, exemplo 3.1.2) que codifica o antigénio gB de BHV-I opti-rnizado pela deleção do fragmento da sequência nucleotidica que codAfica o domínio transmembranar e a parte C terminal contígua, por um segundo plasmídeo de expressão (e.g. ρΡΒ292, exemplo 3.2.2) que codifica o antigénio gC de BHV-1 optimizado peia deleção do fragmento ca sequência nucleotidica que codifica o domínio transmembranar e a parte C terminai contígua, e de um terceiro plasmídeo de expressão (e.g, pPB234, exemplo 3.3.2) que codifica o antigénio gD de BHV-1 optimizado pela deleção do fragmento da sequência 17 ΡΕ1248650 nucleotídica que codilíca o domínio transmembranar e a parte C terminal contígua.

De maneira geral, e não somente por BHV-1, a parte C terminal contígua à sequência que codifica o domínio transmembranar pode ser conservada. Ξ no entanto, frequentemente mars adequado removê-la ao mesmo tempo que a sequência que codifica o domínio transmembranar.

As vacinas de DNA melhoradas, de acordo com a invenção, podem ser igua.lm.ente associadas com pero menos uma vacina clássica, (inactivada, viva atenuada, subuni- 0.0.de s) ou com vacinas recombi- nadas uti1izando um vector de expres ;são in vivo (e.g., poxv.1 .rus, herpesvirus) dirigi .da. contra pelo menos um' BHV -1 diferente CfU0 .1 Ο -ΐ Θ C L 0 0 mesma espécie, ou ser utiJm . zadas como ref orço de tais vacinas. 0 especialista da técnica pode reportar-se ao documento FR-A1-275122 9 para os métodos pa.ra construir os plasrnídeos contendo estas valências bovinas.

Está iguaimente descrita a utilização de uma ou várias doses de vacina de DNA melhorada na Fêmea em gestação com vista á transferência passiva da imunidade ou no animal jovem ou no adulto. entre A quantidade de DNA utilizada nas vacinas de acordo com a presente invenção está compreendida 18 ΡΕ1248650 erca de i hg 1 e cerca de : 1000 h 0 r e está, de m· o pr eie- ido. entre ce rea de 5 0 hg ε : cerca de 50 0 pg r par; a um .eterm in ado pia .srnídeo. 0 espec. ialista da técnica P1 ossu r as ompet ên cias nt jcessárii Γ; Q P a r a de f i n í r precisamente ; a dose f icaz d e DMA a utiliza Γ para c :ada pro tocolo de v ciC inaç ão. Os vc ) rumes d e dose ] oodem e st ar, de m; DCU 3 p efe- ido. cc npreenc lidos en tre v,z e 5 mL , de modo p efer ido, entre 1 e 3 mL.

As vacinas de DMA melhoradas de acordo com a invenção podem ser administradas, no âmbito deste método de vacinação, pelas diferentes vias de administração propostas na técnica anterior para a vacinação polinucleotídica e pelos meios d.as técnicas de administraçã.o conhecidas.

Seguindo unia modalidade preferida da invenção, os métodos de vacinação compreendem a administração, pela via intramuscular, subcutânea ou com o auxilio de um injector sem agulha por via intradérmica, das vacinas de DMA melhoradas de acordo com a invenção. A invenção vai ser agora descrita em irais detalhe com o auxilio de formas de realização a título de exemplos não limitativos, e referindo-se às figuras nas quais:

Figura N° 1: Plasmídeo pVR1012

mura N* 2: Plasmídeo pABUO 19 ΡΕ1248650 LÍStSS dSS S6í|U8nCÍSS Ξ SEQ ID NO i : oligonucleótido PB326 SEQ 1D NO •r\ oligonucleótido PB329 SEQ ID NO 3 : oligonucleótido SB090 SEQ 1D NO 4 : oligonucleótido SB091 SEQ ID NO C * sj , oligonucleótido LF001 SEQ 1D NO 6; oligonucleótido LF002 SEQ ID NO η , oligonucleótido PB234 SEQ ID NO O V 0' * oligonucleótido PB235 SEQ ID NO 9: oligonucleótido PB511 SEQ ID NO 10 : oligonucleótido PB512 SEQ ID NO 11: oligonucleótido SB221 SEQ ID NO 12 : oligonucleótido SB222 SEQ ID NO 13 : oligonucleótido PB507 SEQ ID NO 1 4 i oligonucleótido PB508 SEQ ID NO ! » oligonucleótido PB513 SEQ ID NO 1 fc : oligonucleótido PB514 SEQ ID NO ’ π t oligonucleótido SB223 SEQ ID NO 13: oligonucleótido SB224 SEQ ID NO " O; w oligonucleótido PB497 SEQ ID NO 2 0 : oligonucleótido PB498 SEQ ID NO 21: oligonucleótido SB225 SEQ ID NO 22 : oligonucleótido SB226 SEQ ID NO 10 3 : oligonucleótido LF05 SEQ ID NO 104 : olicronucleótido LF0 5 20 ΡΕ1248650 EXEMPLOS :

Para cada um dos patogénios considerados, cada gene que codifica os principais antigénios (forma nativa e forma modificada) constitui o objectivo de uma construção particular num plasmídeo de expressão eucariota. As formas segregadas dos antigénios são obtidas por deleção dos fragmentos de genes que codificam os domínios transmembra-nares e citoplasmáticos * Em todos os casos, os domínios transmembranares das proteínas são identificadas com ba.se nos perfis de hidropatia (no MacVector 6.5) das sequências proteicas correspondentes.

Exemplo 1: Métodos de biologia molecular 13. Extracção de DMA genômico virai

As suspensões virais são tratadas pela proteinase K (100 mg/mL final) em presença de dodecilsulfato de sódio (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37 *C. O DMA. virai é a. seguir extraído com o auxílio de urna mistura fenol/cio-rofórmio, depois precipitado com dois volumes de etanoi absoluto a. -20 °C durante 16 horas e a seguir centrifuga.d.o a 10 000 g durante 15 minutos a 4°C. Os sedimentos de DMA são secos, depois repostos num volume mínimo de água uitrapura estéril. 1.2 Isolamento de RN& genômico virai O RNA genômico de cada vírus é extraído 21 ΡΕ1248650 utilizando a técnica do "tiocianato de guanidina/fenol-clorofórmio" descrita por P. Chomczynski e N. Sacchi {Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). 1.3 Técnicas de biologia molecular

Todas as construções de plasmideos são realizadas utilizando as técnicas convencionais de biologia molecular descritas por Sambrook et al. (Molecular Cloning: Ά Labo-ratory Manual. 2a Edição. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Todos os fragmentos de restrição utilizados para a presente invenção são isolados com o auxilio do kit "Geneclean" (BiOlOi Inc., La Jolra, CA). Para todas as construções, os fragmentos de DNA clonados, mesmo as junções com o vector de expressão, são sequenciados pelo método de Sanger (Sambrook et ai, 1989).

1.4 PCR e RT-PCR

vSLiivcO aos O 00 n oigonucleó tid .os específicos dos genes ou los de genes clon a do s são sintetizados, alguns d Les o em . certos ca SOS na sua extremidade 5 f s í t í o cj de que facilitam Cl clonagem dos fragmentos am pj Li- As reacçôes de transcrição inversa (RT CZ'. ão em cadeia p or polimerase (PCR) s âo efectu ac d cl Cá :écnicas convencionais (Sambrook et ai. de acoroo com 1989). 22 ΡΕ1248650 1.5 Purificação de plasmideos em grande escala A produção. à escala das dezenas de mg, de pl as mideos purificados qt ie entram nas composiçcx 2 s vacin ais é efectuada pelo método dos grac (rentes de clor et o de c i:ésio - brometo de etideo (San nbrook et al. 1989). Q / 175. 95-97), figura 1 e ma a fase codifi- do piamínogénio ido por digestão con tendo vários 0 plasrnideo de expressão eucar.iota pVR1020 (Cd Luxe et ai. J". of Infectious Diseases. 1$ derivado do plasiuídeo PVR1012 (Figura N‘ exemplo 7 do documento WO-A-9803199), cont< cante da sequência-sinal do activador tecidular humano (tPA).

BamEI-BglII e inserção de uma sequênc. sitios de clonagem (BamHI, NotJ, EcóRI, Xbal, Pmllf Pstl, Bgl II) e resultante do emparelharnento dos ol igonucledtí dos seguintes: me r 0 \ (SEQ ID NO D : 7> r'' ,·"· AC r'' m (' γ;ί m Ό' -t O’ — - d. AGAGG ATATCGA ATTGGCGGC :C 3' 2 - mer O } (SEQ ID NO 2) :GGC CG r'· ?\ n' rn CGATA TGCTCTAi GACACGTGC (T 3 ' . roto r assim obtic io, com uma dime nsão c le cerca de ba ses (o u pb) f Θ 0-011 ominado p ; AB110 (Figura 2) 23 ΡΕ1248650 O intrão II do gene da β-globina de coelho é cionado no vector pCRII (Invi troçjen, Garlsbad, CA, USA) após obtenção do fragmento de DNA correspondente por PCR com o auxilio dos oligonucleótidos seguintes: SB090 (20 mero) (SEQ ID NO 3) 5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' e SB091 (21 mero) (SEQ ID NO i) 5' C!GTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' utilizando como matriz o DNA genómico de células do sangue periférico de coelho. O plasmideo resultante é designado pNSOSO. O plasmideo de expressão pABUO é modificado pela introdução da sequência do intrão II do gene da globina do coelho no sitio Ss.ll situado a montante do ATG do péptido sinal de activador do plasminogénio tecidular (tPA). A sequência do intrão II do gene da globina do coelho é amplificada por amplificação em cadeia por polrmerase (AGP ou PCR) a partir do plasmideo pNSOSO utilizando o par de oligonucleótidos seguinte: LF001 (30 mero) (SEQ ID NO 5) 5' CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3' e LF002 (30 mero) (SEQ ID NO 6) 5' GICCAT GT GGACGIGTAGGAAAAAGAAGAA 3' - 24 - ΡΕ1248650 0 produto PCR (573 paires de bast ; s ou pb( ) é diger: Ldo com i Sail e clonado no plt asm! de ^ o pABilO previame ute lineaj ilzado por Sal\ í , p ci r a produ: iir 0 plasmide o pLF999 de cerca de 5 67 8 pb. λ '’ί ' Dl a ewi γΪλλ© *ί ΐ ΐ ae i°í ΐ ‘í*OY*<avt^“a2iC! riv «V «Mn C« Α&9"*Αλ VaÍW iS? vJl %S Vr^ IvtJu Jw wAw IwvlUÍii XA 3%& \Awjw JLt Ç2v£ v&b <h5* * V\v> &w^ vCfw \*C ‘Sv »ltw3i dos antigénios do vírus do harpas bovino do tipo 1 (BHV-1) i:ai c 011 ten .do os ΟΌ Γ) ^ Q O B, são i s ora dos d 1ge r1: ndo o s de re : s t .1 tição, sepa ran do :ose e em anal: isandc à p or luxii io de sond as co ν' £ p O “ B, gC e gD da es tir Ό V Vi. r o logy. 1 9 94:. 199. 4 0 Cooper] l . númerc 7, ΓΠ . m f a. ·_✓ v 2 v R- 1 Cl cl o Os f ragmer itos cl 8 S ím or o: b 1 r .escri.pt S K 4- ( a l r 3. ™ q g 0 o D o a genom a vira. por t slectrc trans ferênc ponde ntes à - & Q CT^l tirpe B9Q1 de BHV-1 om. diferentes enzrria :ese em gel de aga: de Southern com o ; s fragmentos dos ger ST de BHV-1 (Leung-Tack P. et ai. V 421) . A estirpe BHV-1 864) pode ser igualmente utiliza identificados são clonados no vec tagene, La. Jolla., CA, USA) e estão na origem das clonagens no vector de expressão pVRI.012. 3.1 que as 3.1 no vacfcor

Dois fragmentos Xho i-Xhol contend .o as partes 5' e "·) 9 h ' ( io gene gB de BHV-1 são rc lentifiçados p or transferência de Southern e clonados no vector pBluescript SK+ (Stra- 25 ΡΕ1248650 tagene, La Jolla, CA, USA) previarnente digerido corri. Xhol. Os piasmideos assim obtidos são respectivamente designados pPEÍ28 e pPB117. O piasmideo pPB128, contendo o fragmento 5' do gene gB, é digerido com NotI e Xhol, produzindo um fragmento oe 1708 pb (fragmento A). O piasmideo pPBlli, contendo a parte 3' d.o gene gB, é digerido com Xhol e StuI, produzindo um fragmento de 1345 pb * Este último fragmento é clonado no vedor pBlue-script KS+ (Stratagene, a Jolla, CA, USA) previamente digerido com EcoRV e Xhol, O piasmideo resultante é denominado ρΡΒ279. O piasmideo oPB279 é a seguir digerido com Xhol e BarriRl r produzindo um fragmento de DMA de 1413 pb (fragmento B) .

Os fragmentos A e B são a seguir clonados num vector pBluescript KS+ digerido com Notl e BamHI, produzindo o piasmideo pPB278 (cerca de 6063 pb) e permitindo a. reconstituição do gene gB de BHV-1. G vector pPB278 serve a seguir de matriz através de uma reacção de PCR realizada com os oligonucleótidos seguintes: PB234 (30 mero) (SEQ ID NO 7) 5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3’ e PB235 (21 mero) (SEQ ID NO 8) 5! GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 31. 26 ΡΕ1248650 O produto de POR (14 6 pb) é a seguir digerido pelas enzimas de restrição Sail e Nhel. O piasmideo pPB278 é digerido com 1,¾ ei e Bani Hl. O fragmento de 2728 pb assim obtido e o fragmento de PCR previamente digerido são ligados ao vector pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido com Sail e Ba.ri7.HI, produzindo assim o piasmideo pPB28Q, com uma dimensão de cerca d.e 7742 pb. O gene gB de BHV-1 cod.irica para uma proteína de 933 aminoácidos. 3.1.2 pPB281: gene gB (forma A[TM-Cter] } clonada no vector PVR1G12 A forma truncada (sem os seus domínios transmem-branar e carboxi-terminal (Cter)) do gene gB de BHV-1 é obtida por ligação ao piasmideo pVR1012 (exemplo 2) pré-digerido com Sail e SarnHI, em vez de um fragmento com uma. dimensão de 2234 pb obtida após digestão por SalI-PvuII do piasmideo pPB280 (exemplo 3.1,1) e um. fragmento de 56 pb obtido por emparelhamento dos oligonucleótidos seguintes: PB511 (52 mero) (SSQ ID NO 9)

5'CTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACT GAG 3 ' e PB512 (57 mero) (SEQ ID NO 1G)

5'GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTC GTGCA.G 3 ' , 27 ΡΕ1248650 O plasmideo assirr:. produzido a. uma. dimensão de cerca de 7154 pb e é denominado ρΡΒ281. O gene gB truncado de BHV-l codifica para uma proteína de 759 aminoácidos. -Cfcer]) cl©nado no

3.1.3 vector p&BllG A forma tPA d[TM-Cter] do gene gB de BHV-l é amplificada por PCR a partir da matriz pPB281 (exemplo 3.1.2) e com o auxilio dos iniciadores seguintes: SB221 (39 mero) (SEQ ID NO 11) c, i 'Δ 'Δ Δ Δ :Γ! γ!ί T P P 'Δ Ί' Δ :Γ! P ""· P P P ι'"· P p p f"· p P P Δ P P P ι'"· P P 'Δ Δ 'Δ P ^ 5 n. .L J. í..,'..'.οίΛ J. tn..[ L';·.t.-a;L.· 1.753a;a;·..-*0foA...oa;L.·tn..cta; O td SB222 (33 mero) (SEQ ID NO 12) ampli tio. a.çao (2068 pb) é di Ígeri Bgl li e C i.O í íado no vector pABl digerido com Ec oR V e B Q.i 11 f proc 15, de uma. dimensão de ce rca de pelas enzima: .ndo o plasmideo pSBll.5, de 7154 pb. h forma tPA Δ [TM-Cter] do gene gB codifica para uma gl.icoprote.lna de 729 aminoácidos, contendo o domínio extraceluiar da glicoproteína gB de BHV-l. 28 ΡΕ1248650

3. 2. Plasmideoe que codificam as diferentes formas de BHV~ 1 gC 3.2.1 pPB264: gene gC (forma nativa) clonado no vector

Um fragmento BamRI-HindlII de 3,5 kb contendo o gene completo gC de BHV-1 é identificado por Transferência de Southern e clonado no vector pBluescript SK+. 0 plasmi-deo assim obtido é denominado pPB287. O plasmídeo pPB2 87 é a. seguir digerido com NcoI-BssSI. É obtido um. fragmento de digestão de uma dimensão de 1492 pb. Este é ligado com um fragmento de DNA de síntese obtido peio einparelhanento dos oligonucleótid.os seguintes: PB5 0 7 (37 mero) ÇSEQ ID NO 13) 5'TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3 ' e PB508 (37 mero) (SEQ ID NO 14) 5' CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3', no plasmídeo plc.tmus 28 (New England Biolabs, Inc, , Beverly, MA, USA) pré-digerido com BssSI e Xbal, produzindo o plasmideo intermediário pPB290.

O fragmento de 1554 pb objecto da digestão de ρΡΒ290 com Psti e Xbal é clonado no vector pVR1012 (exemplo 2) previamente digerido com PstI e Xbal, produzindo assim o plasmideo pPB2 64, com uma dimensão de cerca de 6427 pb. O 29 ΡΕ1248650 gene gC de BHV-1 codifica para uma proteína de b08 aminoácídos. 3.2.2 pPB292: gene gC (forma A[TM~Cter]) clonado no vector A forma truncada do gene gC de BHV-1 é obtida por ligação dos três fragmentos de DNA seguintes no vector pVRiOii (exemplo 2), previamente digerido com PstI e Xbal: (a) um fragmento de 1035 pb resultante da digestão de pPB264 (exemplo 3.2.1) com PstI e Xhol, (b) um fragmento de 350 pb resultante da digestão com Xhol e Bani de pPB264 e (c) um fragmento de sintese de 43 pb resultante do emparelhamento dos oligonucleótidos PB513 e PB514.

Estes oligonucleótidos são os seguintes: PB513 (43 mero) (SEQ ID NO 15) 5’GCAGCGCfGCCCGAGlTCTCCGCGACCGCCACGTAGGAClAGT 3’ e PB514 (43 mero) (SEQ ID NO 16) 5'CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3’. O plasmídeo de uma dimensão de cerca de 6305 pb, assim obtido, é denominado pPB292. O gene gC truncado de BHV-1 codifica para uma proteína de 466 aminoácídos. ΡΕ1248650 30 3.2.3 ρΒΒΙΙδ: gene gC (forma tPA A[TM~Cter]) clonado no vector p&BllG A forma tPA A[TM-Cter] do gene gC de BHV-1 é amplificada por PCR a partir da matriz pPB292 (exemplo 3.2.2) e com o auxilio dos iniciadores seauintes: 3B223 (39 mero} (SEQ ID NO 17) 5'AAAAIITCGATAICCCGGCGGGGGCICGCCGAGGAGGCG 3’e SB224 (32 mero} (SEQ ID NO 18) 5'GGAAGÃTCTCTAGTCGTÃCGTGGCGGTCGCGG 3'. O produto de amplificação (1362 pb) é pelais enzimas EcoRV e Bgl II e clonado no vectc (exemplo 2} previamente digerido com EcóRV e produzindo o piasmideo pSB116, de uma dimensão de 6404 pb. A forma t PA Δ[TM-Ct erj do gene gC codrf uma. glicoproteina de 479 ami noácidos, contendo o extr acelular da gl .icoproteina gC oe BHvT~J.. digerido : pABI10 Bgilll, cerca de X C cl ρ 3.Γ cl d οιαί n i.o 3.3 Plasmideos que codificam as diferentes formas de BHV-1 3.3.1 no vector

Um fragmento Xhol-Xhol de 5 kb contendo o gene gD de BHV-1 é identificado por transferência de Southern e clonado no vector pBluescript SK+ pré-digerido com Xhol, produzindo o piasmideo pPB147. 31 ΡΕ1248650

Um fragmento de 325 pb resultante da digestão de pPB14 7 p· or iYdel e Bs rBI e um fra gmento de 943 pb resultante da diges L-ciO (.10 PPB14 7 pc. ;r iYdel < 3 Stil são a seguir ligados no vectc ) r pVRl 012 (exemplo 2) pré-digerido com EcóRV e Xbal, pr oduzind o ass ím c ; plasmíc ieo pPBliSf de uma dimensão de cerca de 617 ’ 1 pb. , 0 gene gD de BHV-1 codifica para uma proteina de 417 amim o a 0' r dos . 3.3,2 pPB2S4: gene gD (forma Δ[TM~Cter]) clonado no vector p¥RlG12 0 gene gD truncado de BHV-1 é obtido a partir de um. fragmento obtido após amplificação por PCR realizada sobre o DNA genómico da estirpe B901 do vírus BHV-1 previamente digerido com Fsfcl e XbaJ e com o auxilio do par de iniciadores seguintes: PB497 (33 mero} (SEQ ID NO 19) 5'TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' e PB498 (31 mero} (SEQ ID NO 20) 5'TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3’. O fragmento de PCR é a seguir clonado no plasmíde o pVR .1012 (e >xemplo 2) previament· e digerido com Pstl e Xbal, pr odi izinc l'.o o plasmídeo pPB234, de uma dimensão de cerca de 5 94 3 pb. 0 gene gD truncado de . BHV-1 codifica para uma prot eína de 3 55 aminoácidos. 32 ΡΕ1248650

3.3.3 pSBll?: gene gD (forma tPA Δ[TM-Cter]) clonado no vector pABUG A forma tPA Δ [TM-Cter] do gene gD de BHV-1 é amplificada por PCR a partir da matriz pPB284 (exemplo 3.3.2) e com o auxilio dos iniciadores seguintes: SB225 (39 mero) (SEQ ID MO 21) 5'AAAA ΠΊ Γ]Τ rp / CGATAT CCCCC GCGí 3CG CGGGTGACGGTATAC 3 ' e 3B2 2 6 (33 mero) (SEQ ID MO 22) 5'GGAA GATCTTTAG GGCGT AGCí 3GG GGCGGGCGG 3'. O produto de amplificação (1029 pb) é digerido com as enzimas EcoRV e Bgl.Il e cionado no vector p ABI 10 (exemplo 2) previamente digerido com McoRV e BglII, produzindo o plasmideo pSB117, de uma. dimensão de cerca de 6071 A forma tPA Δ[TM-Cter] do gene gD codifica para uma qlicoprotelna de 368 amrnoáeidosf contendo o domínio extraceiular da glicoproteína gD de BHV-1.

Exemplo 4: Plasmideos que codificam o GM-CSF bovino 0 cl )NA do < gene GP i C 0 j: Γ. iovino é sin tetizado a par: :;ir de RN A celular de cél .uras m ononucle adas sancíuine; ~! ^ bov; Lnas com o auxilio do inic :iador ( LF065 e ampl) Lficado p< r- uma reai ec;ão de PCR com o auxi lio do par de c ;iigo: .lucleótidí cg 33 ΡΕ1248650

jF0b4 (36 mero) (SSO ID NO 1G (34 mero) (SEQ ID NO 104) matgaccagatcttcacttctgggctggttccca 3'. O fragmento de DMA de 437 pb obtido por digestão do produto de POR por Sal I e Bgl II é ligado com um fragmento de 4860 pb resultante da digestão de pVR1012 (exemplo 2) com Sal 1 e Bgl III para produzir o plasmídeo pLF1032 (cerca de 5237 pb) . O gene GM-C5F bovino codifica para uma proteína de 143 aminoácidos.

Exemplo 5: Formulação dos plasmideos vacinais

Uma solução de DNA contendo um ou vários pias·· mídeos de acordo com os exempios 3 a 14 é concentrada por precipitação etanólica como descrito em Sambrook et ai. (1989). O sedimento de DNA é ressuspendido numa solução de

NaCi a 0,9% de maneira a obter uma concentraçã' o de 1 m Uma solução <: ie DMRIE-DOPE a 0, 7 5 mM é p reparado ressuspensão d e um iiofilizado de DMRIE·· DOPE \ x>r um v adaptado de Hg; ) estéril. A formação dos C'.< smplexos de DNA pia smí dico-lípido é realizada por dil; aiçâo em partes igua _L (t? da solução de DMRIE-DOPE a 0,75 mM pela solução de E)NA a I mg. /mL em NaCi a 0,3%, A solução de DNA é introduzida prc )gre ssi vamente com 34 ΡΕ1248650 auxr 1 J_ Ο Ο-θ Cl CJ L ilh a de cal. ibrí s 26G ao longo da Pc irede do lcon contendo a sol u v 3- O de lípido c; atióni GO de modo cL itar a formaç cl O OÍ0 mous se. Procede- se a uim a ; agitaç cl O ave a partir do mome urto em que são mistui a s du a s soluções. Obtém-se no final uma composição compreendendo 0,375 mM de DMRIE-DOPE e 500 ug/rnL de plasmídeo. É desejável que o conjunto das soluções utilizadas esteja à temperatura ambiente para o conjunto das operações aqui descritas. Deixa-se que ocorra a compiexaçáo de DNA/DMRIE-DOPE à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos antes de se proceder à imunização dos animais.

Exemplo 6: Imunização dos bovinos contra BHY-1 12 bovinos são organizados aleatoriamente em grupos de 4 animais. O grupo 1 constitui o grupo dos animais testemunha.

Aamrnistra-se aos animars do grupo 2 uma mistura de plasmideos vaci na is PPB281 uma forma A[TM-Ct€ ír] , exemplo gC de BHV-I sob uma forma Δ pPB284 (que codrfr C cl Q" D de BHV- (que codifica gB de BHV-i sob 3.1,2), pPB292 (que codifica [TM-Cter], exemplo 3.2.2) e -1 sob uma forma Δ[TM- Cter], 35 ΡΕ1248650

Administra-se aos animais do grupo 3 a mesma mistura do grupo 2 mas formulada com DMRIE-DOPE como acima descrito no exemplo 5,

Uma injecção de 10 mL por via intramuscular é praticada com a ajuda de seringas munidas de uma agulha para cada bovino, e é repetida 21 dras mais tarde. A massa total de cada plasmídeo utilizado à altura de cada imunização é de 1500 pg. O especialista da técnica possui os conhecimentos necessários para adaptar o volume ou a concentração em função da dose de plasmídeo necessária,

Uma continuidade da resposta serológica, induzida pelas duas misturas de plasmídeos de vacinas que expressam os antrgénros gB, gC e gD de BHV-1 é realizada num período de 35 dias após a primovacinação.

Os resultados estão apresentados na tabela que se segue:

Plasmídeos Formulação Antigénios SN a J28 SN a J35 controlo - 0,2 +/-0,0 0,2 -:-/-0, 0 pP32 81 - g3 Δ[TM-Cter] .1500 yg O L_! -l· í O 1,2 +/-0,8 p?32 92 gC Δ[TM-Cter] 15 00 ag p?B294 gD Δ[TM-Cter] 1500 pg p?32 81 DMRIE-DOPE gB Δ[TM-Cter] 15 00 ag 2,1 +/-0,6 2 t i -\- / — 01 6 pPB2 92 gC Δ[TM-Cter] 1500 ug pPB2 94 gD Δ[TM-Cter] 1500 ug 36 ΡΕ1248650

Listagem de sequências

<110> MFjRIAL <12Q> Vacina de DNA para animais de produção

< 13 0 > DNApF <14 0> < 141 > <160> 106 <170> Patentln Ver.2.1

<210> 1 <211> 40 <212> DMA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligcnucleótido <100> 1 facgtidcutg sgplasçgiãi altcgcngcu 40

<210> 2 <211> 40 <212> DMA <213> Sequência artificiai <22 Q> <223> Descrição da sequência artificial: oiigonucleótido <400 > 2 gsiíxgpggg sgsgdditdg ipgisglpt 40 <210> 3 <211> 20 <212> DMA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <100> 3igaigie ts <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência irtiticial oligonucIeotido arti f.i.cial oliçjonucleótido ΡΕ1248650 37 <4 00> 4 «pgggggg ç 21 <210> 5 <211 > 30 <212> DNA <213> S e qu ê n c :l a artificial <22 0> <223 > Descrição da sequência <4 00> 3 dcoalgtcg aotiggggút: çsiteadg! <210> 6 <211> 30 <21 2> DNA <213> Sequência artificiai <22 0> <2 2 3> Descrição cia sequência <4 00> 6 <21 0> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificiai <22 0> <22 3> Descrição da sequência < 4 0 0 > 7 ngtdpca? ogougctigo ggcggtgctc <21 Q> 8 <211 > 21 <212> DNA <213> S e qu e n c i a artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <4 00> 8 gsâggggiggggaagggciig 7Λ <210> 3 <211 > 52 <212> DNA <213> Sequência artificial artificial: olígonucieótido artificia.].: olígonucieótido •N.'\ •^•5 $ artificial : ol iqon.ucIeótiáo artificial: olígonucieótido 38 ΡΕ1248650 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: cligonucleótido < 4 0 0 > 9

Idsgglcia egaaaggMr iagesfesti* ps% p §2

<210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: cligonucleótido <400> 10

iâta^aaiitctflcigás: Pcpfgtsa âlgttgláp aBppgtss gpiag SS

<210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 11 tiaslíldga tifsepsge ggggcgicp pg«ss;â p 39 <210> 12 <211> s g <212> DNA <21 3> Sequência a rtíficia1 <22 0> <22 3> Descrição da sequência artificial < 4 0 0 > 12 qg$ âga k:3 aígkãtq ^ í:|!g8t:os$sps| 33 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Sequêricia artif iclai <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial cligonucleótido oligonucleótido <400 > 13

<210> 14 <211> 37 <212> DNA 39 ΡΕ1248650 <213> Sequência artificial <22 ϋ> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 14 <210> 15 <21.1 > 4 3 <212> DNA <213> Sequência art 11: icial <2 2 0> <223> Descrição da sequência nrA O V 15 oligonucleótido dtaccgcídc c-ogap.dc ogcgsssõym gopppd sgl <210> 16 <211> 43 <212> DNA <21 3> Sequênc1a a rt i f1c1a 1 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial; oligonucleótido <400> 16 çgtnpggç ggtpgy gpcitópggca pg 43 <210> 17 <211> 39 <21 2> DNA <213> Sequência artificiai <22 0> <2 2 3> Descrição da sequência artificia.].; oligonucleótido <400> 17 pgQi^ll Si

<210> 18 <211> 32 <212> DMA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial; oligonucleótido <40Q> 18 40 ΡΕ1248650 f psigâlsls IggAgpdgé gg 32

<210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <4G0> 19

AlcUAddç tgeadgggp:; 9¾¾¾¾¾ gtO 33 <210> 2 0 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência artificiai <2 2 0> <22 3> Descrição da sequência artificial: : oligonucleótido nts O O V 2 0 dgggcgiago gggggogggc <3 31 <21 o> 21 <211 > 39 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: : oligonucleótido <4Q0> 21 33 <21 Q> 22 <211 > 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : oligonucleótido <4 00> 22 ggaagalat lagggaglág cgggggogaa caa 3$: <21 o> 1 03 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> Descrição da sequência artificial : oligonucleótido 41 ΡΕ1248650

103 ^ p: ..v'.::;.;í :. í;. > :, : 01--1 '.1: O : Ο- 0¾¾ artificial <210> 104 <211> 34 <212> DNA <213> Sequê <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleôt < 4 0 0 > 104 34 £a||âfccâgâi loltcaéik; ippptóqql çcca

Lisboa, 16 evereir de

Claims (10)

1. ΡΕ1248650 1 REIVINDICAÇÕES 1 . :ontendo um Vacina cie DNA compreendendo um plasmídeo :ido nucleico que codifica um imunogene do vírus de herpes bovino do tipo 1 (BHV-l) e os elementos necessários a sua expressão in vivo, o (N~ (2~h.iclroxiet.il) ~ N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamónio (DMRIE) e dioleoil-fosra.tidil-etanoiamina (DOPE) .
2. 2. Vacina de acordo com a revindieação 1, compreendendo uma outra proteína factor de estimulação de colónias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF).
3. 3. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, compreende um outro vector de expressão contendo o gene que codifica para a proteína GM-CSF bovina, em condições que permitem a expressão in vivo deste gene, Vacina de acordo com a reivindicação 3, em aue o vector de exoressao e um plasmídeo.
4. 5. Vacina de aco rd.o com qualqi ler uma dar ; r e i - V 1 .ndicaçõ es 1 ai, em qu e o plasmídeo eon tém um áciú riu nu- ,0ÍCO Q"! ’ r-O codifica par a u m imunogénio de BHV -lf ác ido nu ί C1Θ i C 0 de que roi remov icia a parte que cc )dír ica 0 CU nmí ní o tr •ansmemb rar 1 d 1_ « C ci · Vacina de a c o rdo com qualquer uma das i r ei- V J. ndicaçõ es 1 a 5, em que o plasmídeo C- o n tém um ác ido 2 ΡΕ1248650 nucleico que coaiiica um imunogene de BHV-1, e uma sequência sinal heterói Loga, de modo preferido a de um activador de plasminogénio teciduiar humano (tPA). Vacina de acordo com qualquer uma das rei- vind .1 cações 1 3- 6, em que o plasmídeo contém um ácido nu ci eico que comporta a sequência nucleoti dica que codifica um. i munogene de BHV-1 e um .intrão estafei li sad.or.
5. 8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, em que o intrá.o é o intrão 1 . .1. ci o cj θπ e da beta-alobina do coelho. O * Vacina de acc Drdo com qualquer uma das i - vd Í “ vindicações 1 a 8, compreen dendo um plasmídeo contendo um ácido nucleico . que codific a para a glicoproteína gB de BHV-1.
6. 10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo um plasmídeo contendo um ácido nucleico que codifica para a gl icoproteina gC de BHV-1„
7. 11. Vacina de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo um plasmídeo contendo um ácido nucleico que codifica para a glicoproteína gD de BHV-1.
8. 12. Vac: Lna de acordo com que a sequência d o gene gB compreei heteróloga, nomeac lamente a do sinal reivindicação 9, em uma sequência sinal PA de origem humana, 3 ΡΕ1248650 em vez da sequência do péptido sinal da çlicoproteína gB, e/ou a deleção da parte do gene gB que codifica para o domínio transmembranar.
9. 13. Vacina de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência, do gene gC compreende uma sequência sinal heteróloga, nomeadarn.en.te a. do sinal tPA. de origem humana, em vez d. a se quê: •q r'' \ a do péptido sinal da gí icoproteína gC, e/ou a deleção da parte do gene gC que c tod.ífica para o domínio transirem .bra n a. r. 14. V ací na de acordo com a reivi ndicação 11, em que a sequência dO gene g D c ompre e nde uma sequência sinal heteróloga, nome ;ade intentei a do sinal t PA de origem humana, em vez da seque: nem a do p éptido sinal da gl icoproteína gD, e/ou a deleção da parte do gene gD /“•f· : r '.Λ ·_α ·_ V codifica para o domínio transmembranar.
10. 15. Vacina de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um plasmídeo de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica o gB de BHV-1 com deleção do fragmento que codifica o domínio transmembranar e a parte C terminal contígua, e um segundo plasmídeo de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica o gD de BHV-1 com deleção do fragmento que codifica o domínio transmembranar e a parte C terminal contígua. Lisboa, 16 de Fevereiro de 2007