JP2003502345A5 - - Google Patents

Description

【書類名】 明細書
【発明の名称】 ペットまたはスポ−ツ用動物のためのDNAワクチン
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ペットまたはスポ−ツ用動物、特にイヌ、ネコまたはウマに関する病原体に対するDNAワクチンであって、このDNA配列を生体内で発現できるような条件で、対応する動物種の病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドと、下記の［式１］で表される第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質とから成ることを特徴とするDNAワクチン：
【式１】

（ここで、
R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Xはヒドロキシルまたはアミン基であり）、
上記カチオン脂質は好ましくはDMRIE (N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス（テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム)である。
【請求項２】 DOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）をさらに含む請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】 対応する動物種のGM−CSF蛋白をさらに含む請求項1または２に記載のワクチン。
【請求項４】 対応する動物種のGM−CSF蛋白をコ−ドする遺伝子をこの配列を含む発現ベクタ−を、それが生体内で発現できる条件下でさらに含む請求項1または２に記載のワクチン。
【請求項５】 発現ベクタ−がプラスミドである請求項4に記載のワクチン。
【請求項６】 病原体免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が、膜貫通領域をコ−ドする部分が欠失している遺伝子の配列である請求項1〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列がtPAをコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドをさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドがスタビライザ−イントロンを含む請求項1〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項９】 イントロンがウサギβグロビン遺伝子のイントロンIIである請求項7に記載のワクチン。
【請求項１０】 CDVヌクレオチド配列を含む請求項１〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】 HAのシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のtPAシグナル配列によって最適化するか、および／または、HAの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によるか、および／または、イントロンの挿入、特に、HA遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化したHA遺伝子配列を含む請求項10に記載のワクチン。
【請求項１２】 Fのシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のシグナル配列のtRAシグナル配列で最適化するか、および／または、Fの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によるか、および／または、F遺伝子の上流にイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入することによって最適化したF遺伝子の配列を含む請求項10に記載のワクチン。
【請求項１３】 同じプラスミドまたは他のプラスミド内にMまたはN遺伝子の配列を含む請求項10〜12のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】 DMRIE−DOPEと、ヒトのtPAシグナル配列でHAシグナルペプチド配列を置換し、HAの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つHA遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化したCDVのHA抗原をコ−ドする発現プラスミドと、Fの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つF遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化させたCDVのF抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドとを含む、請求項10に記載のワクチン。
【請求項１５】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求項14に記載のワクチン。
【請求項１６】 CPI−2のヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】 F蛋白のシグナル配列のヒト起源のtPAのシグナル配列による置換、および／または、Fの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、イントロン、特にF遺伝子の上流側へのウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIの挿入によって最適化されたCPI−2のF遺伝子の配列を含む請求項16に記載のワクチン。
【請求項１８】 HNのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のtPAのシグナル配列による置換、および／または、HNの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、HN遺伝子の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIの挿入によって最適化したCPI−2のHN遺伝子配列を含む請求項16に記載のワクチン。
【請求項１９】 DMRIE−DOPEと、膜貫通領域をコ−ドするFのヌクレオチド配列の断片の欠失およびFの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンIIの挿入によって最適化したCPI−2のF抗原をコ−ドする発現プラスミドと、HNのシグナル配列の代わりにヒトtPAのシグナル配列を挿入し、HNの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つHNの上流側へのウサギβグロビンのイントロンIIの挿入によって最適化したCPI−2のH抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドとを含む請求項16に記載のワクチン。
【請求項２０】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求項19に記載のワクチン。
【請求項２１】 CHV−lヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】 gBの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたCHV−lのgB遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
【請求項２３】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したCHV−lのgC遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
【請求項２４】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したCHV−lの gD遺伝子の配列を含む請求項21に記載のワクチン。
【請求項２５】 DMRTE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC抗原をコ−ドする第2のプラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3のプラスミドとを含み、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化されている請求項21に記載のワクチン。
【請求項２６】 イヌGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求項25に記載のワクチン。
【請求項２７】 FHV−1ヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２８】 膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したFHV−lのgB遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
【請求項２９】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したFHV−lの gC遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
【請求項３０】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたFHV−lのgD遺伝子の配列を含む請求項27に記載のワクチン。
【請求項３１】 DMRTE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC抗原をコ−ドする第2のプラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3のプラスミドとから成り、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されている請求項27に記載のワクチン。
【請求項３２】 ネコGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求
項31に記載のワクチン。
【請求項３３】 EHV−lヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３４】 膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgB遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項３５】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgC遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項３６】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgD遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項３７】 DMRIE−DOPEと、gB抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3の発現プラスミドとから成り、gB、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化されている請求項33に記載のワクチン。
【請求項３８】 ウマのGN−CSFをコ−ドする発現プラスミド をさらに含む請求項37に記載のワクチン。
【請求項３９】 EHV−4ヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項４０】 gBの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgB遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項４１】 gCの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgC遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項４２】 gDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたgD遺伝子の配列を含む請求項33に記載のワクチン。
【請求項４３】 DMRIE−DOPEと、gBの抗原をコ−ドする発現プラスミドと、gC抗原をコ−ドする第2の発現プラスミドと、gD抗原をコ−ドする第3の発現プラスミドとから成り、gE、gCおよびgDが膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化されている請求項33に記載のワクチン。
【請求項４４】 ウマのGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドをさらに含む請求項37に記載のワクチン。
【請求項４５】 下記の群の中から選択される病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン：狂犬病ウィルス、ＣＰＶ、ＣＣＶ、ボオレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ＦＣＶ、ＦＲｙ、ＦＩＰＶ、猫白血病ウイルス、ＦＴＶ、ウマインフルエンザウィルス、ウマ日本脳炎ウイルス、ウマ西洋脳炎ウイルス、ウマベネズエラ脳炎ウイルスおよびクロストリジウムテタニ（tetani）。
【請求項４６】 請求項10〜15のいずれか一項に記載のワクチン、請求項16〜20のいずれか一項に記載のワクチンおよび請求項21〜26のいずれか一項に記載のワクチンから成る群の中から選択される二つまたは三つのワクチンから成るイヌ用のワクチン。
【請求項４７】 請求項33〜38のいずれか一項に記載のワクチンと、請求項39〜44のいずれか一項に記載のワクチンとから成るウマヘルペスウイルス用ワクチン。
【請求項４８】 請求項1〜47のいずれか一項に記載のワクチンと、不活化ワクチン、弱毒生ワクチン、サブユニットワクチンまたは生体内の発現ベクタ−を用いて組換えたワクチンから成る従来のワクチンとから成る多価ワクチン。
【請求項４９】 各プラスミドのDNAの量が10〜1000μg、好ましくは50〜500μgである請求項1〜47のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５０】 経筋肉投与用ワクチンの製造での請求項1〜47および49のいずれか一項に記載のDNAワクチンの使用。
【請求項５１】 経皮投与用ワクチンの製造での請求項1〜47および49のいずれか一項に記載のDNAワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、ペットまたはスポ−ツ動物、特にイヌ、ネコおよびウマのための改良されたDNAワクチンに関するものである。
【０００2】
【従来の技術】
予防接種のためのデオキシリボ核酸（DNA）分子の使用は1990年代の始めから知られている（Wolf.et al, Science 1990,247,1465−1468）。この予防接種技術は免疫活性蛋白をコ−ドし、対象細胞の生体内でトランスフェクションして発現する細胞および液体をDNAまたはRNA分子で予防注射して免疫するものである。ＤＮＡワクチンは予防注射をされる対象細胞で発現できる少なくとも一種のプラスミドと、薬学的に許容されるビヒクルまたは佐薬とから成る。このプラスミドのヌクレオチド配列は一つ以上の免疫原、例えば蛋白または予防注射をされる対象、細胞免疫反応（Ｔリンパ球の動員）および液性免疫応答に導くことができる糖タンパクをコ−ドし、発現する（免疫原に対する抗体作成の刺激）(Davis H.L. Current Opinion Biotech. 1997. 8. 635−640)。
【０００3】
病原体に由来する全ての免疫原が予防注射をされる動物の最適防御免疫応答を導くために自然に十分に効果的である抗原であるというわけではない。それゆえに免疫応答を改善することが必要である。投与の各経路はそれ自身の制約および困難を有する、すなわち、投与の一つの経路で効果的であるDNAワクチンが他の経路では無効であることがある。
【０００4】
投与経路の選択は開業医および育種家の要求を考慮しなければならない。困難は動物を制止することまたは産物の種類に関連する。筋肉内の経路が使えても皮下経路がペットの予防接種では大きな重要性がある（特に小さくて取り扱いが難しい動物の場合）。DNAワクチンは種々の経路で効果的な投与ができるように改良されなければならない。
【０００5】
DNAワクチンは実験的にすでに使われ、特に麻疹ウィルスのヘムアグルチニン（HA）をコ−ドするDNAワクチン(Etchart ec aiL. J. Cen. Virol. 1997. 78. 1577−1580）をマウスへの鼻腔内へ投与することが内服より効果的なことがわかった。他の実施例はエイズウィルス（HIV）のエンベロ−プ（Env）蛋白をコ−ドするDNAワクチンでは皮下投与が筋肉内の経路投与と比較して効果はなかった(Ishil ec al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421−1428)。
【０００6】
DNAワクチンはイヌジステンパ−ウイルス（CDV）を防ぐために実験的に動物ウィルスに対して使われた。いくらかのCDV免疫原が知られている。特にヌクレオカプシドタンパク質（N）、基質タンパク質（M）、融合蛋白質（F）、ヘムアグルチニン（HA）（WO−A−9741236）。しかし、CDVのヘムアグルチニンをコ−ドするDNAワクチンおよび融合蛋白質の皮下投与ではマウスの抗体作成は検出できず、小さい抗体作成だけが、このDNAワクチンの筋内投与後に認められた(Sixt et aI. J. Virol. 1998. 72. 8472−8476)。
免疫応答の誘導とそのレスポンスに関与する免疫系の種々の要素の間の関係は、各動物種で異なる。ハツカネズミで実行された実験で得られた多くの知識でマウスの免疫系の作用の理解は可能になるが、この知識は他の化学種には直接応用できない。特に、マウスの免疫応答は他の化学種よりも簡単である(van Drunen Little−van den Hurk et alL J. Gen. Virol. 1958. 79.831−839 B6hm et al. Vaccine 1998. 16. 949−954）。
【０００7】
DNAワクチンの投与経路は種々提案されている（腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、粘膜経由）。予防注射をされる対象の皮膚の細胞中に深く入ませるためにDNAを金粒子で被覆して投与する方法 (Tang et al. Nature 1992. 356. 152−154)や、皮膚細胞および皮下組織の細胞を形質移入するための液状のジェット式注射器(Furth ec al. Analytical Bioch. 1992. 205. 365−368）も提案されている。
【０００8】
DNAのインビボでのトランスフェクションのために各種の化合物が使われている：
A カチオン脂質
このカチオンの脂質は四つの部分群に分けられる：
1) 第四アンモニウム塩を含むカチオンの脂質、例えばDOTMA （ジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム、Lipofectineの名称でGibcoが製造）、DOTAP（トリメチル-2，3-(オクタデシル-9-エンオイルオキシ)-l-プロパンアンモニウム (Gregoriadis et al. FEDS Letters 1997, 402. 107−110)、DMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル9-N,N-ジメチル-2,3-ビス（テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）、DLRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル）、2,3-ビス（ドデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム (Fe1gner et al. Ann. N Y Acad. Sci. 1998. 772. 126−139)。第四アンモニウム塩を含むこれらのカチオン脂質はDOPC（ジオレオイル ホスファチジルコリン）またはDOPE（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン）のような追加の中性脂質と組み合わせることもできる(J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry 19S4. 5. 382−369)。
【０００9】
2) リポアミン、例えばDOGS（ジオクタデシル アミドグリシルスペルミン、Promegaの名称でTransfectamが製造、Abdallab et al. Biol. Cell. 1995. 85. 1−7）、DC−Cho2（ジメチルアミノエタン−カルバモイル−コレステロ−ル、BGSC（ビス−グアニジンスペルミジン−コレステロ−ル）、BGTC（ビス−グアニジン−トレン-コレステロール）（Vigneron. et aJ. Proc. Natl. Acad. Sd. USA 1996. 93. 9682−9689）。
【００10】
3) 第四アンモニウム塩およびリポアミンを含むカチオン脂質、例えばDOSPA((N,N-ジメチル)-N-(2-(スペルミンカルボキシアミド）エチル)-2,3-ビス-(オレオイルオキシ)-1-プロパンイミジウム（ペンタヒドロクロライド）プロパンイミジウム五塩酸塩、LipofectAmine（登録商標）の名称でGibcoから市販、Hawley−Nelson et al. Focus 1993. 15. 73−79）、GAP-DLRIE（N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス（ドデシルオキシ)-1-プロパンアミニウム(Wheeler et al. Proc. Nati. Acad.. Sci. USA 1996. 93. l2.4S4−l149; Norman et al. Vaccine 1997. 3.5. 801−803）
【００11】
4) アミジン塩を含む脂質、例えばADPDE、ADODE (Ruysschaert et al. Biochem. Biophys. Res. Comrnun. 1994. 203. J.622−1628)。
B ポリマ−、例えばSuperFect（登録商標）（活性化されたデンドリマー分子(Qiagen; Xu et al. Mol. Genet. Metab. 1998. 64. 193−197)
【００12】
C 生化学試剤、例えば毒素、特にコレラトキシン
これらの化合物はDNAワクチンの製剤で既に使われ、結果を良くしている。インビトロのトランスフェクションでの知識はDNA予防接種には適用できず、最終目的の保護免疫反応が確実に得られるか否かは分からない。インビトロのトランスフェクションを促進することが知られた化合物が負の免疫保護誘導効果を示すことも観測されている。いくらかの製剤化合物はトランスフェクション細胞に対して高投与量で中毒性になる。
【００13】
上記のEtchartの研究(Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577−1580)では鼻腔内経路でDNAワクチン投与する場合、DOTAPの使用はアジュバント効果を示さないが、経口投与ではアジュバント効果を示している。このDOTAPはハツカネズミのインフルエンザウィルスμヘムアグルチニン（HA）をコ−ドするDNAワクチンの鼻腔経路の投与で使用した（Ban et al. Vaccine 1997. 15.811−813)。この場合にはDOTAPの添加で免疫応答を抑制した。ハツカネズミの肝炎Sウィルス表面蛋白質（S）をコ−ドするDNAワクチンでのDC−CholまたはDOTAP/DOPEの筋肉経路による投与での使用では抗体レスポンスを増加するが、Lipofectine（またはDOTMA）の使用ではこのレスポンスは増えなかった(Gregoriadis et al. FEES Letters 1997. 402. 107−110)。
【００14】
DC−Chol/DOpEはヒトのエイズウィルス（HIV、Env蛋白）に対するDNAワクチンとしてハツカネズミで筋肉内経路による投与で使われ、効果的な免疫応答を導いているが、皮下または皮内の経路による投与では免疫応答は増加しなかった(Tshii et al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421−1428)。
【００15】
同様に、WO−A−98 40499では哺乳動物の粘膜上皮の形質移入のためのヌクレイン酸＋カチオンの脂質錯体で抗原発現させる免疫応答または遺伝子療法が提案されている。この文献は吸入法による粘膜経路で例えば肺上皮を目標にしている。結果は前の研究と異なることを示しており、筋肉内（腸管外）経路では裸のＤＮＡがDNA＋混合脂質より効果的であるとしている。
【００16】
一定のサイトカイン、特にインタ−ロイキンまたはインタ−フェロンの添加で免疫応答起因性、特にDNAワクチンによる免疫応答起因性を改良でできる。各サイトカインはそれに特異的な細胞応答性または液性応答性の免疫応答反応を誘発する(Pasquini et al. Immunol. Cell. Bid, 1997. 75. 397−401; Kim et al. フnterferon Cytokine Res. 1999. 19. 77−84）。免疫性の状況が変化する場合、所与の化学種から得られるサイトカインのアジュバント効果が必ずしも同じものであるというわけではない（特にサイトカインを他の化学種、従って異なる免疫系に投与した場合）。また、サイトカインの添加が効果的に逆結果となることもある。すなわち、アジュバント効果が低下するか、阻害される。
【００17】
GM−CSFとフュージョンしたイムノグロビンの単一の鎖をコ−ドするDNAワクチンはFv とILL−lbetaから成るこの融合蛋白質をコ−ドするDNAワクチンのサイトカインの投与またはこの融合蛋白質のマウスへの直接投与では効果があるが、免疫応答性を増やさない(Hakim ec al. フmmunol, 1996. 157. 5503−5511）。フュージョンまたは未フュージョンのコンフォメ−ション中でのサイトカインIL−2とＢ型肝炎ウイルス外膜蛋白との共発現プラスミドの使用では液性免疫応答および細胞免疫応答が増加する(Chow et al. J. Virol. 1997. 72.. 169−78)。
【００18】
しかし、ヒト獲得免疫不全ウイルス（HIV−l）の糖タンパクgpl2OおよびサイトカインIL−2をコ−ドするビシストロニック（bicistronic）なプラスミドの使用ではgpl2Oだけをコ−ドするモノシストロニック（monocistronic）なプラスミドの使用で得られるものより低い抗−gpl2O免疫応答しか得られない(Barouch et al. フmmunol 1998. 161. 1375−1882）。２つの発現ベクタ−（一つは狂犬病ウィルスG糖タンパクをコードし、他方はネズミのGM−CSF活性刺激B、Ｔリンパ球をコードする）をマウスに共注射した場合と、（ネズミのGM−CSFの代わりに）ガンマ型インタ−フェロンをコ−ドするプラスミドを共注射しは場合には免疫応答性が低下する (Xiang et al. Immunity 1995. 2. 129−135)。
【００19】
抗原レベルでの改質、例えば抗原をコ−ドするヌクレオチド配列の一部の欠失や、抗原をコ−ドするヌクレオチド配列へのＤＮＡ断片の挿入や、非−翻訳部位上流または下流への挿入でDNAワクチン効果、特に抗原の発現レベルを改良することができる。
【００20】
しかし、実際には、抗原をコ−ドするヌクレオチド配列をハンドリングすると元の免疫学的活性が低下または失われることがある。例えば、狂犬病ウィルスG抗原をコ−ドする遺伝子から膜貫通領域を欠失し、その修飾された抗原をコ−ドするDNAワクチンを筋肉内経路で投与すると、ハツカネズミの保護レベルが低下する(Xiang et al. Virol. 1995. 209。569）。ウシのヘルペスウィルス（BHV）gD糖タンパクをコ−ドする遺伝子から膜貫通領域を欠失し、筋肉内経路でウシ属の動物に予防注射しても抗体レスポンスは増えず、部分的な保護しか得られない(van Drunen Little−van den Hurk et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 831−839）。DNAエボラウィルスGP糖タンパクをコ−ドするワクチンか、分泌された形でこのGP糖タンパクをコ−ドするDNAワクチンで免疫したモルモットでは液性免疫応答および細胞免疫応答と保護も得られる(Xu et aiL. Nature Medicine 1998. 4. 37−42)。
【００21】
マラリヤPβ32抗原をコ−ドする遺伝子中にト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（tPA）のシグナル配列を挿入し、筋肉内経路で予防注射したマウスでは抗体レスポンスを増やすことができなかった（Haddad et al., FEMS 1997,18, 193−202）。ネズミのロタウィルスVP7抗原をコ−ドする遺伝子へtPA配列の追加し、皮内経路で予防注射したマウスでは、抗体レスポンスが増えず、効果的な保護が得られない。一方、VP4抗原およびtPAから成る融合蛋白質では抗体レスポンスが増えるが、効果的な保護は得られない、(Choi et al. Virology 1998. 250. 230−240)。
一つの抗原のヌクレオチド配列で行った改良は一般に他の抗原に直接置き換えることはできない。その理由は抗原は必ずしも同じ構造を有していないためである。
【００22】
【発明が解決しよとする課題】
本発明の目的は、DNA予防接種の有効性を増進させ、ペットおよびスポ−ツで使われる動物の免疫応答および保護をより効果的にし、特に、イヌ、ネコおよびウマに対して種々の投与経路、特に皮下経路で投与可能なDNA予防接種法を提供することにある。
【００23】
本発明の目的は、イヌジステンパ−ウイルス（CDV）、呼吸器系ウィルスまたはイヌ咳ウイルス（イヌインフルエンザ−2またはCPI−2ウィルス）、イヌヘルペスウィルス（CHV−l）に対して効果的で、改良された保護免疫応答を示すDNAワクチンを工業的に生産することにある。
【００24】
本発明の他の目的は、ネコのヘルペスウイルス（FHV−l）に対して効果的なおよび保護の免疫応答を導く改良型のDNAワクチンの生産にある。
【００25】
本発明のさらに他の目的は、ウマのヘルペスウイルス1型（EHV−l）またはウマのヘルペスウィルス4型（EHV−4）に対して効果的および保護免疫応答を導く改良型のDNAワクチンの生産にある。
【００26】
本発明のさらに他の目的は、CDVウィルス、CPI−2ウィルス、CHV−1ウィルス、狂犬病ウィルス（ラブドウィルス）、イヌのパルボウィルス（CPV）、イヌのコロナウィルス（CCV）およびボオレリアブルグドルフェリ（Bonrelia buirgdorferi）から成る群の中から選択される少なくとも一つのワチチン価を有するイヌに対して効果的な保護が得られる改良型のDNAワクチンの生産にある。
【００27】
本発明のさらに他の目的は、ネコのヘルペスウィルス（FHV−1）、ネコのカリシウイルス（FCV）、狂犬病ウィルス（ラブドウィルス）、ネコのパルボウィルス（FPV）、ネコの感染の腹膜炎ウイルス（EIPV）、ネコの白血病ウィルス（猫白血病ウイルス）およびネコの後天性免疫不全症候群ウィルス（FIV）から成る群の中から選択される少なくとも一つのワクチン価を有するネコに効果的な保護が得られる改良型のDNAワクチンの生産にある。
【００28】
本発明のさらに他の目的は、ウマのヘルペスウイルス1型（EHV−l）、ウマのヘルペスウイルス4型（EHV−4）、ウマのインフルエンザウィルス、ウマの東洋脳炎ウイルス、ウマの西洋脳炎ウイルス、ウマのベネズエラ脳炎ウイルス、狂犬病ウィルス、クロストリジウムテタニ（tetani）およびボオレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）から成る群の中から選択される少なくとも一つのワクチン価有するウマに効果的な保護が得られる改良型のDNAワクチンの生産にある。
【００29】
【課題を解決するための手段】
本発明の対象は、ペットおよびスポ−ツで使われる動物、特にイヌ、ネコおよびウマに感染する少なくとも一種の病原体に対して効果的な保護が得られる改良型のDNAワクチンにある。このDNAワクチンは製剤によるか、GM−CSFの追加によるか、抗原の最適化によるか、これらの組み合わせにより作られる。
【００30】
このDNAワクチンはその製剤によって改良するか、GM−CSFの追加によるか、抗原の最適化によるか、GM−CSFの追加と抗原の最適化によるのが好ましい。
【００31】
本発明のDNAワクチンは活性成分として遺伝子または遺伝子断片をコ−ドし、発現するプラスミドを含む。プラスミドとは生体内で発現される遺伝子およびその発現に必要な要素の配列から成るポリヌクレオチド配列から成るDNA転写単位を意味する。円形プラスミド形状（ス−パ−コイルでもよい）が好まれる。直鎖形状も本発明の範囲内である。
【００32】
各プラスミドは、宿主細胞において、挿入された遺伝子の発現を確実にすることができるプロモ−タを含む。それは、一般に強い真核性プロモ−タ、特にヒトまたはネズミ起源または選択的にラットまたはモルモットのような他の生物起源のシトメガロウィルス早期プロモ−タCMV−IEである。より一般にはプロモ−タはウイルス細胞起源である。CMV−IE以外のウイルスのプロモ−タとしてはSV40ウィルスの早期または後期プロモ−タまたはサルコムドルス（Rous Sarcoma）ウィルスのLTRプロモ−タが挙げられる。また、遺伝子から誘導されるウィルスからのプロモ−タ、例えば遺伝子のプロモ−タでもよい。細胞のプロモ−タとしてはデスミンμプロモ−タまたはアクチンμプロモ−タのようなサイトスケルトン遺伝子のプロモ−タを挙げることができる。複数の遺伝子が同じプラスミドに存在するときには、それらは同じ転写単位中または二つの異なる単位中に存在することができる。
【００33】
最初の形態では、本発明のDNAワクチンはアジュバントとして第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質、特にDMRIEを加え、好ましくは中性脂質、特にDOPEと一緒に組み合わされてDMRIE−DOPE形にするのが好ましい。
【００34】
従って、本発明の対象は、ペットおよびスポ−ツで使われる動物、特にイヌ、ネコまたはウマに影響を及ぼす少なくとも一種の病原体に対するDNAワクチン、対象動物種の病原体の免疫原をコ−ドする少なくとも一種のヌクレオチド配列を生体内で発現可能な条件で含む少なくとも一種のプラスミドと、下記式の第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質とからなる：
【００35】
【式２】

（ここで、
R₁は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
R₂は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Xはヒドロキシルまたはアミン基であり、
【００36】
上記脂質はDMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス（テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）であるのが好ましく、さらに好ましくは、中性脂質、特にDOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と組み合わされて、DMRIE−DOPEの形にするのが好ましい。
【００37】
組換え型ベクタ−は上記アジュバントと使用直前に混合するのが好ましい。動物へ投与前、好ましくは10〜60分、特に30分前に混合して錯体にするのが好ましい。
【００38】
DOPEが存在するときのDMRIE：DOPEのモ比は95：5〜5：95、特に1:1である。プラスミド：DMRIEまたはDMRIE−DOPEアジュバントの重量比は50：1〜1：10、特に10：1〜1：5、好ましくは1：1〜1:2である。
【００39】
本発明の第2の形態では、GM−CSF（顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、Clark S.C. et al. Science 1987. 230. 1229; Grant SM. et al. Drugs 1992. 53. 516）をワクチンに加える。本発明では直接GM−CSF蛋白をワクチン組成物に組み込むことにより実行できる。また、GM−CSFをコードする配列を発現可能な状態で発現ベクターに挿入することも好ましい。
【００40】
発現ベクタ−としては、プラスミド、例えば主要な抗原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはその他のプラスミドの使用が好ましい。GM−CSFの選択は予防注射する動物種に依存する。従って、イヌではイヌGN−CSFが使われ、ネコではネコのGM−CSFが使われ、ウマではウマのGM−CSFが使われる。
【００41】
本発明の第3の形態では、免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が最適化された形にされる。最適化とはヌクレオチド配列の任意の改質を意味し、抗原をコ−ドするメッセンジャ−ＲＮＡの安定性の増加、少なくともヌクレオチド配列のより高いレベルの発現または細胞外培地中への抗原の分泌によって示され、結果として直接的または間接的に免疫応答が増加する。
【００42】
本発明では対象抗原の最適化を対象抗原の膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失（欠失とは膜貫通領域が無くなるか、実質的に機能しなくなるのに充分な完全な欠失または不完全な欠失を意味する）で行うか、および／または、tPA（組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ）信号をコ−ドするヌクレオチド配列の追加で行うか、、および／または、発現される遺伝子の上流側に安定化のためのイントロンを挿入(Montgomery et al. Cell. Mol. Bid. 1997. 43. 285−292; Harris et al. Mol. Biol. Med 1986. 3. 279−292)して行なうのが好ましい。
【００43】
対象抗原の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失は切り詰めた抗原の細胞外培地への分泌を促進し、免疫系細胞との接触可能性を増やす。tPAシグナルをコ−ドするヌクレオチド配列の挿入はtPAシグナルが結合したメッセンジャ−ＲＮＡの転写性を容易にし、メッセンジャ−ＲＮＡの発現レベル、従って、抗原の生産を増加させる。tPAシグナルも合成抗原の分泌で役割を演ずる。対象抗原をコ−ドする遺伝子の安定化イントロンの挿入はそのメッセンジャ−ＲＮＡの異所性のスプライシングを避け、後者の物理的一体性を維持する。
【００44】
tPAシグナルはヒト起源であるのが好ましい。ヒトtPAシグナルのヌクレオチド配列はジーンバンク（GenBank）デ−タベ−スから受入れ番号NM000930でアクセスできる。イントロンはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIが好ましい(van Ooyen et al. Science 1979. 206. 337−344)。このヌクレオチド配列は受入れ番号V00882でGenPankデ−タベ−スからアクセスでき、イントロンNo.2で示される。
【００45】
本発明の対象は、イヌのイヌジステンパ−（Canine Distemper Virus、CDV）に対して効果的な免疫応答を導き、保護を与える改良型のDNAワクチンにある。イヌジステンパ−ウイルスはパラミクソビリダ（Paramyxoviridae）族の構成メンバであるモリビリウイルス（Morbillivirus）で、このウィルスはイヌ種またはネコを感染させる（Hard et al J. Virol.1996.77.397−405）。
【００46】
本発明はイヌのイヌジステンパ−に対して皮下経路で効果的な保護が得られるDNAワクチンを得ることができる（Sixt et al J. Viral.1998.72.8472−8476）。
【００47】
本発明のCDVに対するDNAワクチンは、DMRIH、好ましくはDMRIE＋DOPEのアジュバントを含む製剤によって改善するのが好ましい。そのためにはイヌのGM−CSF（Nash et al. Blood, 1991。78.50−56）と組合せるか、少なくとも一つのCDV抗原の最適化するか、イヌGN−CSFを追加し且つ少なくとも一種のCDV抗原を最適化する。イヌGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列はGenBankデ−タベ−スから受入れ番号S49738でアクセスできる。
【００48】
イヌGM−CSFの追加はワクチンの組成物中へのイヌのGM−CSFポリペプチドの取込みか、好ましくは生体内の発現ベクタ−（好ましくはプラスミド）中にイヌのGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列を挿入して実行できる。イヌGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列はCDV抗原をコ−ドする遺伝子が挿入されるのとは異なる第2の発現プラスミド中に挿入するのが好ましい。
【００49】
CDVに由来する抗原の最適化は「シグナル」配列、特にtPAのヒト起源（GenBank受入れ番号NM_000930）のシグナルによるヘムアグルチニン（HA）のシグナルペプチドおよび／または融合蛋白質（F）の配列の置換、および／または、HAおよび／またはFの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、イントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子（そのヌクレオチド配列であるイントロンNo.2はGenBankデ−タベ−スから受入れ番号V00882の下にアクセスできる）のイントロンIIのHAおよび／またはFをコ−ドするヌクレオチド配列の上流への挿入で実行できる。従って、本発明のCDVに対するDNAワクチンは最適化された単一のCDV抗原（HAまたはF）をコ−ドし、発現するか、両方（すなわち最適化されたHAおよび最適化されたF）をコ−ドし、発現する。
【００50】
天然形（改質なし）のCDVのマトリックスタンパク質（M）をコ−ドする配列および／または天然形（改質なし）のCDVのヌクレオプロテイン（N）をコ−ドするヌクレオチド配列をプラスミドに挿入し、発現させ、最適化されたHAおよび／または最適化されたFを含むプラスミドと組み合せることもできる。
本発明で使用可能なCDV抗原をコ−ドするヌクレオチド配列と発現ベクタ−の種々の構造は添付実施例およびWO−A−9803199の実施例、特に実施例8、9と図2および図3に示されている。
【００51】
本発明では筋肉内の経路による投与のためのCDVに対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEと一緒に配合し、ヒトのtPAシグナルペプチド配列でHAシグナル配列を置換し、HAの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失し、HA遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化したCDVのHA抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpNS024、図4）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失とF遺伝子の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを挿入して最適化したCDVのF抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpNSO2l、図3）とで構成するのが好ましい。
【００52】
本発明では、皮下の経路による投与のためのCDVに対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEと一緒に配合し、イヌGM−CSをコ−ドする発現プラスミドと上記定義の２つのプラスミド（例えばpNSO24およびpNSO2l）とで構成するのが好ましい。
【００53】
本発明のさらに他の対象はイヌの呼吸複合症またはイヌ咳（イヌパラインフルエンザ（parainfluenza）ウィルス−2、CPI−2）に対して効果的な免疫応答を導き、保護を与える改良型のDNAワクチンにある。CPI−2ウィルスはパラミクソウイルス（Paramyxovirus）で、Paramyxoviridae族の構成メンバである(Bittle et al. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1970. 156. 1771−1773; Maloney et aI. Aust Vet J. 1985. 62. 285−286）。
本発明では、このCPI−2に対するDNAワクチンはアジュバント、特にDMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEと一緒に配合するのが好ましい。必要に応じてさらにイヌGM−CSFを追加するか、少なくとも一つのCPT−2抗原を最適化するか、イヌGM−CSFを追加するか、少なくとも一つのCPI−2抗原を最適化することができる。
【００54】
イヌGM−CSFの追加はCDVで記載のものと同じように実行できる。CPI−2に由来する抗原の最適化は「シグナル」配列、特にヒト起源のtPAのシグナル配列、CPI−2のヘムアグルチニン−ノイラミニダ−ゼ（HN）および／またはCPI−2の融合蛋白質（F）のシグナル配列の置換、および／または、HNおよび／またはFの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、イントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIのHNおよび／またはFをコ−ドするヌクレオチド配列の上流側への挿入によって実行される。本発明によるCPI−2に対するDNAワクチンは最適化された単一のCPI−2抗原（RNまたはF）か、その両方（RNおよびF）をコ−ドし、発現できる。
【００55】
本発明で使用可能なCPI−2抗原をコ−ドするヌクレオチド配列と種々の発現ベクタ−の構造は添付の実施例に示してある。本発明の筋肉内経路による投与用のCPI−2に対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEと一緒に配合され、RNのシグナル配列の代わりにヒトtPAのシグナル配列の挿入、膜貫通領域をコ−ドするHNのヌクレオチド配列の断片の欠失、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIのHNの上流側への挿入によって最適化されたCPI−2のHN抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpSBO34、図6）と、Fの膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失と、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIのFの上流側への挿入による最適化をしたCPI−2のF抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpSB032、図5）とで構成するのが好ましい。
【００56】
本発明では経皮投与するCPI−2に対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEと一緒に配合し、イヌGM−CSをコ−ドする発現プラスミドと上記の２つのプラスミド（例えばpSBO34およびpSBO32）と組み合わせるのが好ましい。
本発明の他の対象は、イヌのヘルペスウイルス1型（CHV−l）に対して効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のDNAワクチンにある
【００57】
CHV−1ウィルスはAlphaherpesvirinae族に属し、このウィルスはイヌのウイルス性鼻気管炎を引き起こす。gB、gCおよびgD糖タンパクをコ−ドするヌクレオチド配列が公知である(Limbach et aI. J. Gen. Virol. 1994. 75. 2029−2039）
CHV−1を防ぐためのDNAワクチンは本発明に従うアジュバント、特に、DMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEと配合するのが好ましい。これに少なくとも一つのイヌGM−CSFを添加するか、少なくとも一つのCHV−l抗原を最適化するか、イヌGM−CSFを添加し、少なくとも一つのCHV−l抗原を最適化することができる。
【００58】
イヌGM−CSの添加はCDVで記載の上記方法で行う。CHV−lから誘導される抗原の最適化はCHV−lのgB糖タンパクおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはgD糖タンパクの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって実行される。従って、本発明で改良したCHV−lに対するDNAワクチンは最適化されたCHV−l抗原の一つ（gE、gCまたはgD）のみまたはそれらの二つまたは三つをコ−ドし、発現できる。
【００59】
本発明で使用可能なCHV−l抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および各種の発現ベクタ−構造は実施例およびWO−A−98/3199に記載されており、特に、実施例7、8および図13および14に記載されている。
【００60】
経筋投与用のCHV−1に対する本発明のDNAワクチンはDMRIE−DOPEを配合し且つ膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したCHV−lのgE抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpSB0l6、図7）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化した抗原CHV−lのgCをコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpSBOl9、図8）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化した抗原CHV−lのgDをコ−ドする第3の発現プラスミド（例えばpSBOl7、図9）とから成るのが好ましい。
【００61】
経皮投与のためのCHV−lに対する本発明のDNAワクチンはDMRIE−DOPEを配合し且つイヌGM−CSをコ−ドする発現プラスミドと、上記3つのプラスミド（例えばpSBO16、pSBOl9およびpSBOl7）から成るのが好ましい。
本発明の他の対象は、ネコのヘルペスウイルス1型（FHV−l）に対して効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のDNAワクチンである、
【００62】
FHV−lウィルスはネコのウイルスの鼻気管炎の原因となるAlphaherpesvirinae族のウィルスである（Fargeaud ot..Virol。1984。80。69−82）。
FHV−lに対するDNAワクチンは本発明に従ったアジュバント、特にDMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEを配合するのが好ましい。これにネコのGM−CSFを添加するか、少なく一つのFHV−1抗原で最適化するか、選択的にまたはネコのGM−CSFを添加し且つ少なくとも一つのFHV−l抗原で最適化することができる。
【００63】
ネコGM−CSの添加はワクチンの組成物中にネコのGM−CSポリペプチドを入れるか、インビボで発現ベクタ−（好ましくはプラスミド）中にネコのGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列（GenBankデ−タベ−スからアクセス可能な例えば受入れ番号AF053007）を挿入して行うことができる。好ましくはネコGM−CSをコ−ドするヌクレオチド配列を第2の発現プラスミド（FHV−l抗原をコ−ドする遺伝子を挿入したものとは異なるもの）に挿入する。
【００64】
FHV−lから誘導される抗原の最適化はFHV−１のgB糖タンパクおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはgD糖タンパクから膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片を欠失して実行される。従って、本発明のFHV−lに対する改良型のDNAワクチンは最適化されたFHV−l抗原（gE、gCまたはgD）のみか、それらの二つまたは三つをコ−ドし、発現できる。
本発明で使用可能なFHV−1抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および各種の発現ベクタ−構造は実施例およびWO−A−98／03660に記載されており、特に、実施例14および15と図11および12に示してある。
【００65】
本発明では経筋肉投与用のFHV−lに対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEを配合し且つ、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したFHV−lのgE抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpSBO2l、図10）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したFHV−1のgC抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばPS2023、図11）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片欠失によって最適化したFHV−lのgD抗原をコ−ドする第3の発現プラスミド（例えばpSBO24、図12）とを含むのが好ましい。
【００66】
本発明の経皮投与用のFHV−lに対するDNAワクチンはDMRTE−DOPEを配合し且つネコのGM−CSをコ−ドする発現プラスミドと上記３つのプラスミド（例えばpSBO2l、pSB023およびpSE024）を含むのが好ましい。
本発明の他の対象はウマのヘルペスウイルスタイプ1（EHV−l）に対して効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のDNAワクチンにある
【００67】
EHV−1ウィルスはAlphaherpesvirinae族に属し、ウマのウイルス性流産の原意になる（Virus Res. 1995.45.153−190）。このウィルスの完全なゲノムは決定されている(Telford et al. Virology 1992. 18S. 304−316）。EHV−lに対するDNAワクチンには本発明のアジュバント、特にDMRTE、好ましくはDMRIE−DOPEを配合するの好ましい。これにさらにウマのGM−CSFを添加するか、少なく一つのEHV−l抗原の最適化をするか、ウマのGM−CSFを添加し且つ少なくとも一つのERV−l抗原の最適化を行うことができる。ウマのGM−CSFの添加はワクチン組成物中へのウマのGM−CSFポリペプチドを入れるか、インビボで発現ベクタ−（好ましくはプラスミド）中にウマのGM−CSをコ−ドするヌクレオチド配列（例えば配列番号 69、図26）を挿入して実行できる。ウマのGM−CSFをコ−ドするヌクレオチド配列は第2の発現プラスミド（EHV−l抗原をコ−ドする遺伝子が挿入されたものとは異なるもの）に挿入するのが好ましい。
【００68】
EHV−lから誘導される抗原の最適化はEHV−lのgB糖タンパクおよび／またはgC糖タンパクのおよび／またはgD糖タンパクの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって実行される。従って、本発明のEHV−lに対する改良型のDNAワクチンは最適化されたEHV−l抗原の（gE、gCまたはgD｝のみまたはこれらの二つまたは三つをコ−ドし、発現できる。
本発明で使用得能なEHV−l抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および各種の発現ベクタ−構造は実施例およびWO−A−98／03198に記載されており、特に実施例8および10と図2および図4に示してある。
【００69】
ウマでは筋肉内経路が好ましい。経筋肉投与用のEHV−1に対する本発明のDNAワクチンはDMRTE−DOPEを配合し、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−1のgE抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpSBO28、図13）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−lのgC抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpSBO29、図14）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−lのgD抗原をコ−ドする第3の発現プラスミド（例えばpSBO3O、図15）を含むのが好ましい。
【００70】
しかし、皮下経路で使用することも可能である。この場合のEHV−lに対するDNAワクチンはDMRIE−DOPEを配合し、ウマのGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドと上記三つのプラスミド（例えばpSBO28、pSBO29およびpSBO3O）とを含むのが好ましい。
本発明の他の対象はウマのヘルペスウイルスタイプ4（EHV−4）に対して効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のDNAワクチンにある
【００71】
EHV−4ウィルスはAlphaherpesvirinae族に属し、ウマのウイルス性鼻肺炎（rhinopneumonia）の原因となる(Crabb et al. Adv. Virus Res. 1995. 45.153−190)。このウィルスの完全なゲノムは決定されている（Telfprd et al. J.Gen. Virol。1998。79。1197−203）
EHV−4に対するDNAワクチンには本発明のアジュバント、特にDMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEを配合し、ウマのGM−CSを添加するか、少なくとも一つのEHV−4抗原を最適化するか、ウマのGM−CSFを添加しかつ少なくとも一つのEHV−4抗原を最適化したものと組み合わせるのが好ましい。
【００72】
ウマのGM−CSFの添加はEHV−1の場合と同様に行うことができる。EHV−4から誘導される抗原の最適化はEHV−4の糖タンパクgEおよび／または糖タンパクgCおよび／または糖タンパクgDの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって実行される。従って、EHV−4に対する本発明の改良型のDNAワクチンは最適化されたEHV−4抗原（gB、gCまたはgD）のみまたはこれらの二つまたは三つのをコ−ドし、発現できる。
【００73】
本発明で使用得能なEHV−4抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および各種の発現ベクタ−の構造は実施例およびWO−A−98／03198に記載され、特に、実施例9および11と図3および図5に示してある。
【００74】
経筋肉投与用の本発明のEHV−4に対するDNAワクチンにはDMRIE−DOPEを配合し且つ膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−4のgE抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばpSB025、図16）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−4のgC抗原をコ−ドする第2の発現プラスミド（例えばpSBO26、図17）と、膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失によって最適化したEHV−4のgD抗原をコ−ドする第3の発現プラスミド（例えばpSB027、図18）とを含むのが好ましい。
【００75】
皮下経路用のERV−4に対するDNAワクチンにはDMRIE−DOPEを配合し且つ、ウマのGM−CSFをコ−ドする発現プラスミドと上記の三つのプラスミド（例えばpSEO2S、pSB026およびpSBO27）を含むのが好ましい。
【００76】
以上、本発明を特定のDNAワクチンに関して記載したが、本発明は上記動物種の他の病原体に対するDNAワクチンにも適用される。従って、本出願に記載のワクチン価は本発明のアジュバントの添加による改良型ワクチンまたはGM−CSを対象とするものであり、また、以下で詳細に記載するいくつかのワクチン価のように、遺伝子の最適化またはこれらの組み合わせを対象とするものである。
同様に、本発明のワクチンは互いに組み合わせることができおよび／または同じ動物種のための他の病原体に対するDNAワクチンと組み合わせることができる。
【００77】
従って、本発明の他の対象は、CDV、CPI−2、CHV−l、狂犬病ウィルス（ラブドウィルス）、イヌμパルボウィルス（CPV）、イヌμコロナウィルス（CCV）、ボレリアブルドフェリ（Borrelia burgdofferi）から成る群の中から選択される少なくとも二つのイヌの病原体に対して効果的な保護を得ることが可能な改良型の多価のDNAワクチンにある。
【００78】
本発明の他の対象は、FHV−l、ねこカリシウイルス（FCV）、狂犬病ウィルス（ラブドウィルス）、ねこパルボウィルス（FPV）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（FIPV）、ネコ白血病ウィルス（FeLV）、ネコの後天性免疫不全症候群ウィルス（FIV）から成る群の中から選択される少なくとも二つのネコの病原体に対して効果的な保護を得るが可能な改良型の多価DNAワクチンにある。
【００79】
本発明の他の対象は、EHV−1、EHV−4、ウマインフルエンザウィルス、東洋ウマ脳炎ウイルス、西洋ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、狂犬病ウィルス、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani)、ボレリアブルドフェリ（Borrelia burgdorferi)から成る群の中から選択される少なくとも二つのウマの病原体に対して効果的な保護を得ることが可能な改良型の多価DNAワクチンにある。
【００80】
これらの多価DNAワクチンは本発明のアジュバント、特にDMRIE、好ましくはDMRIE−DOPEと一緒に製剤することによって改良できる。これにさらに必要に応じて上記で述べたGM−CSFを添加するか、上記で述べたように少なくとも一つの主要な抗原を最適化するか、GM−CSFを添加し且つ少なくとも一つの主要な抗原を最適化することができる。
【００81】
本発明の改良された多価DNAワクチンは一種または複数の発現プラスミドを含み、このワクチンは同じ動物種を感染させる第1の病原体の少なくとも一つの免疫原および他の病原体の少なくとも一つの免疫原をインビボで発現する。これらの免疫原の少なくとも一つは下記の群の中から選択するのが好ましい：
【００82】
イヌの場合、CDVのF、CDVのHA、CPI−2のF、CPI−2のHN、CHV−lのgB、CHV−lのgCおよびCHV−lのgD、
ネコの場合、HV−lのgB、FHV−lのgC、FRV−lのgD、
ウマの場合、EHy−のgE、EHV−lのgC、EHV−lのgD、EHV−4のgE、EHV−4のgCおよびEHV−4のgD
【００83】
本発明の改良した一価または多価DNAワクチンは同じ種を感染させる少なくとも1つの別の病原体に対する少なくとも一種の従来のワクチン（不活性化、弱度毒、サブユニット）またはインビボ発現ベクタ−(例えばポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス）を使用した組換え型ワクチンを含むことができる。
【００84】
当業者はネコのワクチン価を含むプラスミドを作る方法に関してはWO−A−9803660を、イヌの場合にはWO−A−9803199を、そして、ウマの場合にはWO−A−9803198を参照できる。
本発明の他の対象はペットおよびスポ−ツ用動物、特にイヌ、ネコまたはウマへの予防注射方法にある。この接種方法は上記の一価または多価の改良型DNAワクチンの一つを投与することから成る。この接種方法は改良型DNAワクチンを一回または複数回投与することから成る。
【００85】
本発明のDNAワクチンの使用量は所定プラスミドに対して約10μg〜約1000μg、好ましくは50μg〜約500μgである。当業者は各予防接種プロトコルで使用するための正確なDNAの有効量を元塗ることができる。投与容積は0.5〜5ml、好ましくは1〜3mlである。
【００86】 本発明の改良型DNAワクチンはポリヌクレオチドの予防接種の従来技術と公知の投与方法を用いて種々の投与経路で投与できる。
本発明の二つの好ましい態様は筋肉内経路か皮下経路で本発明の改良型DNAワクチンを投与する予防接種方法である。
【００87】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００88】
【実施例】
各病原体に対して主要な表面抗原（天然形および修正形）をコ−ドする各遺伝子を真核性発現プラスミドの構築の対象とした。表面抗原の分泌形は膜内外および細胞質領域をコ−ドする遺伝子断片の欠失によって得た。全ての場合で糖蛋白の膜貫通領域を対応蛋白配列のヒドロパシプロフィルを基礎として識別した。野生タンパク（アミノ酸の）の寸法、位置は対応する発現プラスミドの名称および膜貫通領域、先端を切った蛋白の寸法を実施例11の[表1]に要約してある。
【００89】
実施例1
基礎プラスミドの構築
プラスミドpVRlOl2（WO−A−9803199の図1、実施例 7、本出願の図2で引用）からの真核性発現プラスミドpVRlO2O (C.J. Luke et al. J. of Infectious Diseases 1997, 175: 95−97）はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（tPA）のシグナル配列のコ−ド相を含む。このプラスミドpVRlO2OをBamMT−RglII消化し、複数のクロ−ニングμサイトを含む配列を挿入して変成し、下記オリゴヌクレオチドにした（BamHI、NotI、EcoRI、XbaI、PmlI、PscI、BglII）：
【００90】
PB326（40mer）（配列番号9）
5'gatctgcagcacgtgtctagaggatatcgaattcgcggcc 3'
PB329（40mer）（配列番号10）
5'gatccgcggccgcgaattcgatatcctctagacacgtgct 3'
【００91】
得られたベクタ−pABl1O（図No.1）を用いてイヌジステンパ−ウイルス（CDV）ヘムアグルチニン（HA）をコ−ドする遺伝子の先端切断形を含んでいるプラスミドおよび2型のパラインフルエンザウィルス（CPI−2）の赤血球凝固−ノイラミダ−ゼ（haemag glucininne nuraminidase、HN）を構築した。
下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRで対応するＤＮＡ断片を生産した後、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIをベクタ−pCRII（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）でクロ−ニングする：
【００92】
SBO9O（20mer）（配列番号 7）
5'ttggggacccttgattgttc 3'
52091（21mer）（配列番号 8）
5'ctgtaggaaaaagaagaaggc 3'
【００93】
ひな型としてはウサギの末しょう血細胞ゲノムＤＮＡを用いる。得られたプラスミドをpNS050とよぶことにする。
【００94】
実施例2
各種形状のCDV抗原をコ−ドするプラスミド
SH菌株のウィルスＲＮＡ（American Tissue Culture Collectionから番号ATCC VR−526でアクセス可能）からRT−PCRによってCDV菌株スナイダ−Hill（SH）の融合蛋白（F）およびヘムアグルチニン（HA）をコ−ドする遺伝子を得た。
【００95】
2.1. CDV−Fの各種形をコ−ドするプラスミド
2.1.1. pPB229：ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたF遺伝子（天然形）
CDVのF遺伝子の相補ＤＮＡをプライマ92383を用いて合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてPCR反応で増殖した：
【００96】
PB383（26mer）（配列番号 13）
5'tttctagacagccgagccccatgcac 3'
P2384（30mer）（配列番号14）
5'ttggatccgatatatgaccagaatacttca 3'
【００97】
PCR産物をBamHIおよびXbaIで消化し、BamHIおよびXbaIで予め消化した発現ベクタ−pVRlOl2（実施例1）でクロ−ニングしてプラスミドpPB229（6925塩基対、bp）を作る。野生CDVのF遺伝子は662の残基の蛋白をコ−ドする。
【００98】
2.1.2. pNSO22：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたF遺伝子（βグロビン形 F ΔTM）
膜内外およびＣ末端領域の切り詰めらたF遺伝子を含むプラスミドpNSOI3（6735bp）をプラスミドpPE229（実施例2.1.1）に由来するBsu3EI−BamHI断片（6593bp）と、下記オリゴヌクレオチドを用いてひな型pPR22SからPCRで得た142−bp断片とのリゲーションによって得た：
【００99】
NSO3O（21mer）（配列番号1）
5'atgagcccactcttacaacaa 3'
NSO31（35mer）（配列番号2）
5'tttcgcggatccattaaaggaagagcgcctaaccg 3'
【０100】
Bsu36I−BarrフTを消化した。CDV先端を切ったF遺伝子は605残基の蛋白をコ−ドする。
次に、ウサギIB−グロビン遺伝子のイントロンIIに対応する配列を先端を切ったF遺伝子の暗号配列の上流側のプラスミドpNSOl3のSalIサイトへ挿入した。イントロン（573bp）に対応するＤＮＡ断片はPCRで下記オリゴヌクレオチドを用いて得た：
【０101】
NS036（34mer）（配列番号 5）
5'tttacgcgtcgacttggggacccttgattgttc 3'
NS037（36mer）（配列番号 6）
5'tttacgcgtcgacctgtaggaaaaagaagaaggcat 3'
【０102】
ひな型はpNSOSO（実施例1）。消化し、Sallコンパチブル端を開放。このβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを含むプラスミドpNSOl3の誘導体をpNSO2l（7308bp）（図No.3）とよぶ。
2.2． 各種の形のCDV−HAをコ−ドするプラスミド
【０103】
2.2.1. pNSO18： ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたHA遺伝子（天然形）
CDVのHA遺伝子の相補ＤＮＡをプライマPB381を用いて合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてPCR反応で増殖した：
【０104】
PB381（30mer）（配列番号11）
5'ttctgcagatgctctcctaccaagayaagg 3'
P5382（28mer）（配列番号12）
5'ttgtcgacatgtgtatcatcatmctgtc 3'
【０105】
PCR産物をベクタ−pCRII（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）でクロ−ニングしてプラスミドpPB235を作る。HA遺伝子を含むプラスミドpPE235の1846bpのPstI−SalI断片をPstI−SalIで消化した発現ベクタ−pVRlOl2（実施例1）でクロ−ニングしてプラスミドpNSOlS（6748bp）を作る。CDV原株のHA遺伝子は607残基の蛋白をコ−ドする。
【０106】
2.2.2. pNSO24： ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたHA遺伝子（β−グロビン形、tPAΔTM HA）
CDVのHA遺伝子の先端を切った形はHA蛋白の最初の60残基をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって得た。この蛋白のシグナル配列と膜内外配列とを融合し、先端を切った産物を分泌物をヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（cPA）と先端を切ったHA遺伝子のシグナル配列と間の相融合の生産によって確実にした。tPAシグナルとの融合産物のプラスミドpNSOl9をコ−ドするpNSOl8の誘導体は下記３つのＤＮＡ断片のに従うリゲーションで得た：
【０107】
１） 断片AはpABllO（実施例1）のBamHI-EcoRV消化によって得た。
２） 断片Bは下記オリゴヌクレオチドを用いたひな型pNSOl8（実施例2.2.1）のPCR反応で得た：
【０108】
N5034（30mer）（配列番号3）
5'tttcgcggatcccacaaagtatcaactagc 3'
NSO3S（23mer）（配列番号4）
5'gggatttgctgccgatgcaatag 3'
PCR産物はBamlil−Sapiで消化する。
【０109】
３） 断片CはpNSOl8のSapI−EcoRV消化断片である。
雑種遺伝子tPA ΔTM HAは574残基（1725bp）の蛋白をコ−ドする。
ウサギβ−グロビン遺伝子（実施例2.1.2）のイントロンIIをpNSOl9のSalIサイトへのHA遺伝子をコードする相の上流側に挿入してプラスミドpNS024（図No.4）を得た。
【０110】
実施例3
各種形のタイプ２のイヌパラインフルエンザウィルス（CPI−2）の抗原をコ−ドするプラスミド
CPI−2菌株D008（MERIAL）のFおよびHN遺伝子はRT−PCRによってウィルスＲＮＡから得た。
【０111】
3.1. CPI−2Fの各種形をコ−ドするプラスミド
3.1.1. pAB115： ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたF遺伝子（天然形）
CPI−2のF遺伝子の相補ＤＮＡを合成し、下記オリゴヌクレオチド組を用いてRT−PCPで増殖した：
【０112】
S5131（38mer）（配列番号57）
5' apaacgcgtcgacatgggtactataattcaatttctg 3'
5B132（38mer）（配列番号 58）
5' ttttctagtctagattatttatgataaacaaaattctc 3'
【０113】
PCR産物はSalIおよびXbaTで消化して1594bpの断片を作る。同じ酵素で予め消化した発現ベクタ−pVRlO12（実施例1）でクロ−ニングしてプラスミドpABilS（6479bp）を作る。CPI−2原株のF遺伝子（配列番号 72）（図27）をこのプラスミドでクロ−ニングする。529残基の蛋白をコ−ドする。
【０114】
3.1.2. pSBO32： ベクタ−pVR2.012でクロ−ニングしたF遺伝子（β−グロビン形、FΔTM）
細胞質領域の切り詰められた膜内外およびＣ末端のF遺伝子を含むプラスミドpSBO3lは下記方法で得た。ひな型pAHilE（実施例3.1.1）で下記オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を実行する：
【０115】
5B131（配列番号 57）
5B133（41mer）（配列番号 59）
5'ttttctagtctagattagtatgtgtcactttgtgctaagtg 3'
【０116】
約1450bpのPCR断片を得る。この断片をSallおよびXbaIで消化して1436bpのSalI−XbaI制限断片を分離する。この断片をSalIおよびXbaIで予め消化したベクタ−pVR1O12（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドにpSBO3lを得る。CPT−2の先端を切ったF遺伝子は473残基の蛋白をコ−ドする。
次に、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIに対応する配列をCPI−2先端を切ったF遺伝子の暗号配列の上流側でプラスミドpESO31のSallサイトへ挿入した。オリゴヌクレオチドN5036（配列番号 5）およびNS037（配列番号 6）を用いてひな型pNSO5O（実施例1）でPCRで得る。次に、Sallで消化し、Sallとコンパチブルな端を開放する。イントロン（573bp）に対応するＤＮＡ断片は、に助けられたた。このSalI−SalI制限断片をSalIで予め消化したプラスミドpSBO3lでリゲ−トし、脱ホスホリル化してプラスミドにpSBO32（6884bp）（図No.5）を得る。
【０117】
3.2. 各種形のCPI−2のHNをコ−ドするプラスミド
3.2.1. pAB114： ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたHN遺伝子（天然形）
CPI−2のHN遺伝子のｃDNAを合成し、下記オリゴヌクレオチドを用いて増殖した：
【０118】
5B134（41mer）（配列番号 60）
5'aaaaacgcgtcgacatggttgcagaagatgcccctgttagg 3'
SBl3S（35mer）（配列番号 61）
5'ttttggaagatctttaggatagtgtcacctgacgg 3'
【０119】
約1720bpのPCR断片を得る。この断片をSalIおよびBglIで消化して1704bpのSalI−EglI断片を分離する。次に、この断片をSallおよびEglIlで予めに消化したベクタ−pVRlOl2（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドにpABll4（6566bp）を得る。このプラスミドでクロ−ニングしたCPI−2原株のHN遺伝子（配列番号 73）（図28）は565残基の蛋白をコ−ドする。
【０120】
3.2.2. pSBO34： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたHN遺伝子（β−グロビン形、HN tPA ΔTM）
CPI−2のHN遺伝子の先端を切った形はHN蛋白の最初の40残基をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって得た。この蛋白のシグナルおよび膜内外配列を融合し、先端を切った蛋白の分泌はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（tPA）と先端を切ったHN遺伝子のシグナル配列との間の相融合の生産によって確実にした。tPAとの融合産物をコ−ドするpABll4（実施例3.2.1）から得たプラスミドpSB033は、pABliG（実施例1）のEcoRI−PmlI断片とひな型pABll4上での下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによってtPAシグナル配列をコ−ドする転写解読枠とpVR1Ol2断片（1599bp）を含む誘導体のリゲーションによって得る：
【０121】
SB136（37mer）（配列番号62）
5'ttaaaagaattcgacccaaaagcaaatcatgagccac 3'
5B137（33mer）（配列番号 63）
5'ttaaaaggcctttaggatagtgtcacctgacgg 3'
【０122】
EcoRIおよびEcoRVで消化する。
ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIをHN遺伝子の符号化機構の上流側でpSB033のSalIサイトへ挿入してプラスミドpSB034（図No.6）を得た。イントロンを含むSalI断片はオリゴヌクレオチドN5036（配列番号 5）とN5037（配列番号 6）を用いてPCRでひな型pNSO5O（実施例1）で得た。
【０123】
実施例4
CHV−lウィルス糖タンパクの各種形をコ−ドするプラスミド
タイプＩのイヌのヘルペスウィルス（CHV−l）のカ−マイケル菌株の糖タンパクgE、gC、gDをコ−ドする遺伝子をウイルスのゲノムからPCRで分離した。ベクタ−pVPAOl2でのgBおよびgDをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングは特許出願WO−A−9803199（プラスミドpADO37、pAEO38、図7および図8、実施例13、14）に記載されている。gCをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングもこの文献に記載されている。
【０124】
4.1. CHV−gBの先端を切った形をコ−ドするプラスミド
4.1.1. pSBO16： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形）
【０125】
ヒドロパシプロフィルに従ってCHV−lのgE蛋白（878アミノ酸）の膜貫通領域は残基702と769との間に位置する。gEをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは３つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) PstI−XbaI重複消化で線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）（b）pAEO37（実施例4）のPstI−NsiI消化で得られる1997bpの断片および（c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得た225bp断片：
【０126】
EBlOl（22mer）（配列番号15）
5'tatattgaaggacaacttgggg 3'
SElQ2（36mer）（配列番号16）
5'ctagtctagattaattattatcaacttttacaacac 3'
【０127】
ひな型としてはプラスミドpABO37を使用する。NsiIおよびXbaIで消化する。得られたプラスミドpSBOl6（6983bp）（図7）は701残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgB遺伝子を含む。
【０128】
4.2. CHV−gCの各種形をコ−ドするプラスミド
4.2.1. pSBOl8： ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgC遺伝子（天然形）
CHV−lのgC遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た：
【０129】
5B105（32mer）（配列番号 19）
5'aaaactgcagatgagttttaaaaatttttatc 3'、
SB1O6（30mer）（配列番号20）
5'ctagtctagattagatcttattattttttg 3'
【０130】
ひな型としてウィルスＤＮＡを使用する。このPCR産物をPstIおよびXbaIで消化し、1400bpの断片を得る。それから同じ重複消化によって線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）でリゲ−トする。得られたプラスミドpSBOl8、6253bpは459残基のgC糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０131】
4.2.2. pSBOJ.9： ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニングしたgC遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシプロフィルからgC蛋白の膜貫通領域は残基422と452との間にある。
【０132】
452. gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドを三つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：
【０133】
(a)重複消化PstI−XbaIによって線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）、
(b) pSBOl8（上記実施例）のPstI−StuI消化で得た335bpの断片
(c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRで得られる934bpの断片：
【０134】
5B107（24mer）（配列番号 21）
5'tggattgacggtcttataacaggc 3'、
SB1O8（37mer）（配列番号22）
5'ctagtctagattaattttcatccgatgcatcaaacac 3'
【０135】
ひな型としてプラスミドpSBOl8を使用し、StulおよびXbaIで消化した。
【０136】
得られたプラスミド（pSBOl9、6139bp）(図8)は421残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgC遺伝子を含む。
【０137】
4.3. CHV−gDの先端を切った形をコ−ドするプラスミド
4.3.1. pSBOl7：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形）
CHV−lのgD蛋白（345アミノ酸）の膜貫通領域は残基310と328との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは三つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：
【０138】
(a) PstI−NotI重複消化で線形にしたベクタ−pVR1Ol2（実施例1）、
(b）pABO38（実施例4）のPstI−AvaII消化で得た663bpの断片、
(c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRで得られる415bp断片：
【０139】
SBlO3（25mer）（配列番号17）
5'cgagaaacttgttatttttctaaag 3'、
5B104（51mer）（配列番号18）
5'ataagaatgcggccgcaaacgctatatattttttgoggtattatttattcg 3'
【０140】
ひな型としてプラスミドpABO38を使用し、AvailとNotIで消化した。得られたプラスミド（pSBOl7、5819bp）(図9)は309残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgD遺伝子を含む。
【０141】
実施例5
FHV−1糖タンパクの各種形をコ−ドするプラスミド
糖タンパクgB、gCおよびgDをコ−ドする遺伝子はネコヘルペスウイルス1型（FHV−l）のCO菌株のPCRによってウイルスのゲノムから分離した。ヌクレオチド配列がC−27菌株と同一であるgDをコ−ドする遺伝子の場合には、菌株C−27からクロ−ニングした対応する遺伝子を含むpVRlOl2からのプラスミドpABO29を使用する。これは特許出願WO−A−9803660（プラスミドpABO29、図12、実施例15）に記載されている。
【０142】
5.1. FHV−gBの各種形をコ−ドするプラスミド
5.1.1. pSBO2O：ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングされたgB遺伝子（天然形）
FHV−lのgB遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得た：
【０143】
SE13（34mer）（配列番号27）
5'ttttctgcagatgtccactcgtggcgatcttggg 3'
5B114（40mer）（配列番号28）
5'atagtttagcggccgcttagacaagatttgtttcagtatc 3'
【０144】
ひな型としてウィルスＤＮＡを使用して2849bpの断片を得る。このPCR産物をPstIおよびNotIでは消化する。次に同じ重複消化によって線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）でリゲ−トする。得られたプラスミドpSBO2O、7728bpは949残基のgB糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０145】
5.1.2. pSBO21：ベクタ−pVRlO12dでクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシプロフィルに従ってFHV−1のgB蛋白の膜貫通領域は残基761と834との間にある。gBをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドは三つのＤＮＡ断片でリゲーションで得た：
【０146】
(a) 重複消化のPstINotIで線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）、
(b）pSBC2O（前述の実施例）のPstI−HindIIの消化で得た1839bpの断片、
(c）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得た447bpの断片：
【０147】
5B109（24mer）（配列番号 23）
5'ctgtggacagagaccctaaaactc 3'、
SBllO（50mer）（配列番号24）
5'tttccttttgcggccgcttatatgctgtctatatcataaattttaaggc 3'
【０148】
ひな型としてプラスミドpSBO2Oを使用し、HindIlおよびNotIで消化した。得られたプラスミド（pSBO2l、7164bp）(図10)は760残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgE遺伝子を含む。
【０149】
5.2. FHV−gCの各種形をコ−ドするプラスミド
5.2.1. pSBO22：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgC遺伝子（天然形）
FHV−1のgC遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片をPCRによって下記オリゴヌクレオチドを用いて得た：
【０150】
SB15（34mer）（配列番号29）
5'ttttctgcagatgagacgatataggatgggacgc 3'、
SB116（34mer）（配列番号30）
5'agtttagcggccgcttataatcgccggggatgag 3'
【０151】
ひな型としてウィルスＤＮＡを使用して1605bpの断片を得る。このPCR産物をPstTおよびNotIで消化し、同じ重複消化で線形にしたベクタ−pVR1Ol2（実施例1）でリゲ−トした。得られたプラスミドpSB022(6483bp)は534残基のgC糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０152】
5.2.2. pSBO23：ベクタ−pVRlO12でクロ−ニングしたgC遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシプロフィルに従いFHV−lのgC蛋白の膜貫通領域は残基495と526との間にある。gCをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは二つのＤＮＡ断片に従うリゲーションによって得た：pSB022（前述の実施例）のBcllおよびNotIの消化によって得た6198bpの断片およびが（b）下記オリゴヌクレオチドを用いたPCPによって得た168bp断片：
【０153】
S2117（24mer）（配列番号 31）
5'gttaaatgtgtaccacgggacggg 3'、
S2118（41mer）（配列番号32）
5'agtttagcggccgcttattcaggggacgcgtcgtagacttc 3'
【０154】
ひな型としてプラスミドpSB022を使用し、DcliおよびNotIで消化した。
得られたプラスミド（pSB023、6366bp）(図11)は494残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgC遺伝子を含む。
【０155】
5.3. FHV−gDの先端を切った形状をコ−ドするプラスミド
5.3.1. pSBO24：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形）
FHV−lのgD蛋白（374アミノ酸）の膜貫通領域は残基328と353との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形状を含んでいるプラスミドは二つのＤＮＡ断片のリゲーションによって得た： (a)pABO29（実施例5）のXbaI−BglII消化で得た5712bpの断片および（b）下記オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって得た129bpの断片：
【０156】
SBlll（24mer）（配列番号25）
5'gatcgtcccgccataccgtctggg 3'
そして、
SBll2（39mer）（配列番号26）
5'tttggaagatctttactgattattcatgcccttgggagg 3'
【０157】
ひな型としてプラスミドpAB029を使用し、XbaIおよびBglIIで消化した。得られたプラスミド（pSBO24、5841bp）(図12)は327残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgD遺伝子を含む。
【０158】
実施例6
EHV−1糖タンパクの種々の形をコ−ドするプラスミド
2234/88−2の菌株のEHV−1の糖タンパクgB、gCおよびgDをコ−ドする遺伝子をPCRによってウィルスＤＮＡから分離した。
【０159】
6.1. EHV−lのgBの種々の形をコ−ドするプラスミド
6.1.1. pAB127：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgB遺伝子（天然形）、
EHV−1のgB遺伝子のコード相を下記オリゴヌクレオチドを用いてPCPにより増殖した：
【０160】
NSOO3（30mer）（配列番号39）
5'ttctgcagatgtcctctggttgccgttcgt 3'
NSOO4（30mer）（配列番号40）
5'tttctagattaaaccattttttcattttcc 3'、
【０161】
得られたＤＮＡ断片をPstIおよびXbaIで消化し、PstIおよびXbaIで線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）でリゲ−トしてプラスミドpAEl27（7818bp）を得た。gB遺伝子は980のアミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０162】
6.1.2. pSBO28：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシプロフィルに従ってEHV−lのgB蛋白の膜貫通領域を残基801と875との間に位置した。GBをコードする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドを下記の２つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) AfeTおよびXbaIについては消化されるプラスミドpAEl27（実施例6.1.1）および（b）下記オリゴヌクレオチドを用いたのPCRによって得た276bpの断片：
【０163】
52125（24mer）（配列番号 51）
5'aacaacagagggtcgatagaaggc 3'、
52126（39mer）（配列番号 52）
5'aatttttctagattacacgttgaccacgctgtcgatgtc 3'
【０164】
ひな型としてのプラスミドpABl27を使用し、AfelとXbaIで消化した。得られたプラスミドpSBO28（7279bp）は800残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったEHV−1 48の遺伝子を含む。
【０165】
6.2. EEV−1 gCの種々の形をコ−ドするプラスミド
6.2.1. pAB2.29：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニンしたgC遺伝子（天然形）
EHV−1 gC遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た：
【０166】
NSOO5（31mer）（配列番号41）
5'ttgtcgacatgtggttgcctaatctcgtgag 3'
NSOO6（33mer）（配列番号42）
5'ttggatccctaaaagtcagacttcttgtacggc 3'
【０167】
このPCR産物をSalIおよびBamHIで消化し、1412bpの断片を得た。それを同じ重複消化で線形にしたベクタ−pVR1O12（実施例1）中でリゲ−トした。得られたプラスミドpAEl29（6281bp）はEHV−lのgC糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含み、468残基の寸法を有している。
【０168】
6.2.2. pSBO29：ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニングしたgC遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシプロフィルに従ってEHV−lのgC蛋白の膜貫通領域を残基429と455との間にある。gCをコ−ドする遺伝子を含むの先端を切った形のプラスミドは下記の２つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) AspI−BamHIの重複消化によって線形にした287bpのプラスミドpABl29（実施例6.2.1）および（b）下記オリゴヌクレオチドSを用いてPCRによって得た断片：
【０169】
SB127（24mer）（配列番号53）
5'gatccggaggaggaatacacaccc 3'、
5E128（39mer）（配列番号54）
5'aattttggatccctaaccggcctgtcctcaacaatcgg 3'
【０170】
ひな型としてプラスミドpAB129を使用し、AspIおよびBamHIで消化した。得られたプラスミドpSB029（6161bp）は428残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgC遺伝子を含む。
【０171】
6.3. EHV−1 gDの先端を切った形をコ−ドするプラスミド
6.3.1. pAB131：ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたgD遺伝子（天然形）
EHV−lのgD遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た：
【０172】
NSOO7（33mer）（配列番号43）
5'ttgtcgacatgtctaccttcaagcttatgatgg 3'、
N5008（32mer）（配列番号44）
5'ttggatccttacggaagctgggtatatttaac 3'
【０173】
このPCR産物をSalTおよびBamHIで消化して、1214bpの断片を得た。それを同じ重複消化によって線形したベクタ−pVRlOl2（実施例1）中でリゲ−トした。得られたプラスミドpAB138（6083bp）は402残基のgD糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０174】
6.3.2. pSBO3O：ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシμプロフィルに従い、EHV−1の gD蛋白の膜貫通領域は残基348と371との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドは下記の３つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) SalI−BamIの重複消化によって線形にしたプラスミドpVRlQl2（実施例1）、（b）pAEl3l（実施例6.3.1）のSallおよびEsmIによる消化で得られる825bp断片、（c）下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た239bpの断片：
【０175】
5B129（24mer）（配列番号55）
5'cggtttcttggtgaattcaacttc 3'
SB13O（42mer）（配列番号56）
5'aattttggatccttacgtagagttgctcttagacgtttttgg 3'
【０176】
ひな型としてプラスミドpABl3lを使用し、EsmIおよびBamlilで消化した。得られたプラスミドpSBO3O（5921bp）は347残基の蛋白をコ−ドする頭を切ったgD遺伝子を含む。
実施例7：
EHV−4の種々の形の糖タンパクをコ−ドするプラスミド
EHV−4の菌株KYT445/２のgB、gC、gD糖タンパクをコ−ドする遺伝子を精製したウィルスＤＮＡからのPCPで分離した。
【０177】
7.1. EHV−4gBの種々の形の糖タンパクをコ−ドするプラスミド
7.1.1. pABl36：ベクタ−pVR1Ol2でクロ−ニングしたgB遺伝子（天然形）
EHV−4のgE遺伝子のコードフェーズは下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって増殖した：
【０178】
AB325（35mer）（配列番号33）
5'tttctgcagatgtccacttcttgccgtgctatttg 3'
AB326（31mer）（配列番号34）
5'ttttctagattaaaccattttttcgctttcc 3'
【０179】
得られたＤＮＡ断片をPstIとXbaIで消化してプラスミドpABl3S（7801bp）を得た。それをPstIとXbaIで線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）中でリゲ−トした。EHV−4のgB遺伝子は975のアミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０180】
7.1.2. pSBO25：ベクタ−pVR1O2でクロ−ニングしたgB遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシμプロフィルに従いEHV−4 48の蛋白の膜貫通領域は残基797と867の間に位置する。GBをコードする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドは下記の２つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) SplIとXbaIで消化したプラスミドpABl36（実施例7.1.1）および（b）下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た231bpの断片：
【０181】
SBll9（36mer）（配列番号45）
5'ttttggtctagattagtccacgttgacaacgctgtc 3'
【０182】
SBl2O（23mer）（配列番号 46）
5'cocaagcttatcgagccgtgcgc 3'
ひな型としてはプラスミドpABl36を使用し、SplIとXbaIで消化した。得られたプラスミドpSBQ25、7264bpは796の残基の蛋白をコ−ドする先端を切った48の遺伝子を含む。
【０183】
7.2. EHV−4 gCの種々の形をコ−ドするプラスミド
7.2.1. pABl37：ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニングしたgC遺伝子（天然形）
EHV−4のgC遺伝子の転写解読枠を含んだＤＮＡ断片は下記のオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た：
【０184】
AB327（32mer）（配列番号35）
5'tttgtcgacatgggtttggtaaatataatgco 3'、
AB328（33mer）（配列番号36）
5'tttggatccttagaagtctgctttcttgtaggg 3'
【０185】
このPCR産物をSalIおよびBamHIで消化し、1463bpの断片を得た。それを同じ重複消化で線形にしたベクタ−pVRlOl2（実施例1）中でリゲ−トした。得られたプラスミドpABl37、6330bpは485残基のgC糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０186】
7.2.2. pSBO26：ベクタ−pVRlOl2でクロ−ニンしたgC遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシμプロフィルに従いEHV−4のgC蛋白の膜貫通領域は残基425と472との間にある。gCをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドは下記の２つのＤＮＡ断片のリゲーションによって得た：(a) AclI−BamHIの重複の消化によって線形にしたプラスミドpAEl37（実施例7.2.1）および（b）下記オリゴヌクレオチドを用いたPORによって得た237bpの断片：
【０187】
52121（24mer）（配列番号47）
5'gtatcaatcccagctgaccccgac 3'、
SB122（41mer）（配列番号48）
5'aattttggatccttagccgtccgggtaaccctctatgatgc 3'
【０188】
ひな型としてはプラスミドpAEl37を使用し、AclIおよびBamHIで消化した。得られたプラスミドpSBO26（6147bp）は424残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgC遺伝子を含む。
【０189】
7.3. EHV−4 gDの先端を切った形をコ−ドするプラスミド
7.3.1. pAB138：ベクタ−pVR1OJ.2でクロ−ニングしたgD遺伝子（天然形）
EHV−4のgD遺伝子の転写解読枠を含むＤＮＡ断片は下記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た：
【０190】
AB329（33mer）（配列番号37）
5'tttgtcgacatotctaccttcaagcctatgatg 3'、
AB330（33mer）（配列番号38）
5'tttggatccttacggaagctgagtatatttgac 3'
【０191】
このPCR産物をSallおよびBamHIで消化し、1214bpの断片を得た。それを同じ重複消化によって線形にしたベクタ−pVRlO2.2（実施例1）中でリゲ−トした。得られたプラスミドpABl3E（6081bp）は402残基のgD糖タンパクをコ−ドする遺伝子を含む。
【０192】
7.3.2. pSBO27：ベクタ−pVR1O12でクロ−ニングしたgD遺伝子（ΔTM形）
ヒドロパシμプロフィルに従いEHV−4のgD蛋白の膜貫通領域は残基348と371との間にある。gDをコ−ドする遺伝子の先端を切った形を含んでいるプラスミドは下記の２つのＤＮＡ断片のリゲーションで得た：(a) EcoRI−BamHIの重複消化によって線形にしたプラスミドpABl38（実施例7.3.1）および（b）下記オリゴヌクレチオドを用いたPCRによって得た310bpの断片：
【０193】
5B123（24mer）（配列番号49）
5'ttttccgtaacaattccgagcagc 3'、
SB124（39mer）（配列番号50）
5'aattttggatccttacgtagagttgctattagacoctgg 3'
【０194】
ひな型としてはプラスミドpAB138を使用し、EcoRI−BamHIで消化した。得られたプラスミドpSBO27（5919bp）は347残基の蛋白をコ−ドする先端を切ったgD遺伝子を含む。
【０195】
実施例8
イヌのGM−CSFをコ−ドするプラスミド
8.1. マイトジェンでインビトロ刺激したイヌリンパ球の全RNAの製剤
ビーグル犬で行った血液収集でEDTAを含んだチューブにイヌ血液を集めた。フィコ−ル勾配を付けた遠心分離で単核化した細胞を回収し、直径60mmのペトリ皿で培養した。単核化したイヌ細胞をコンカナバリンA（ConA）（最終濃度 約４μg/ml）と、フィトヘムアグルチニン（PHA）（最終濃度 約10μg/ml）で刺激した。刺激作用後、培養物を皿から掻きとってリンパ芽球「ConA」と「PEA」とを回収し、培養物の全RNAをキット「White Blood CellsのためのmＲＮＡ単離キット」（Boehringer Mannheime/ Roche Cat＃1934325）を使用して抽出した。
【０196】
8.2. イヌGM−CSFをコ−ドする遺伝子の単離とプラスミドpJPO74の構築
ConAまたはPEAによって刺激したイヌリンパ芽球（lymphoblast）（実施例8.1）の全抽出RNAを使用して相補ＤＮＡの最初のストランドの合成にひな型として使った。この相補ＤＮＡの最初のストランドはオリゴヌクレオチドp(dT) 15（（Boehringer Mannheime/ Roche ロシュCat＃814 270）の延長によって作った。得られた単一の相補ＤＮＡを下記オリゴヌクレオチドを用いたPCR反応でひな型として使用した：
【０197】
JP578（配列番号64）（33 mer）
5'tatgcggccgccaccatgtggctgcagaacctg 3'
そして、
JP579（配列番号 65）（36 mer）
5'tatgccgccgctacgtatcacttcttgactggtttc 3'
【０198】
約450塩基対（bp）のPOR断片を増殖した。この断片をアガロ−スゲル電気泳動で精製し、ベクタ−pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）でリゲ−トしてプラスミドにpJPO74を得た。pJPO74でクロ−ニングしたイヌGN−CSF遺伝子の配列は、GenBankで入手可能なイヌGM−CSF配列（受入れ番号＃S49738）と同じあった。
【０199】
8.3. プラスミドpJPO84の構築およびイヌのGM−CSF遺伝子の配列
プラスミドpJP074（実施例8.2）をNotIで消化し、アガロ−スゲルで電気泳動した後に、イヌGM−CSF遺伝子を含む約450bpのNotI−NotI断片を分離した。この断片をプラスミドpVRlQl2（実施例1）でリゲ−トした。hCMV/IEプロモ−タにたいして正しく配列したイヌGM−CSF配列（配列番号 66、図No.20）を含むクロ−ンを同定した（pJPO84）。このプラスミドの寸法は5364bp（図No.19）である
【０200】
実施例9
ネコのGM−CSFをコ−ドするプラスミド
9.1. マイトジェンでインビトロ刺激したネコリンパ球の全RNAの調製
血液を収集し、EDTAを収容したチューブにネコ血液を集めた。単核化した細胞をPicoll勾配の遠心分離で回収し、直径60mmのペトリ皿で培養した。次に、単核化したネコ細胞をコンカナバリンA（ConA）（最終濃度 約４μg/ml）とフィトヘムアグルチニン（PEA）（最終濃度 約10μg/ml）で刺激した。刺激作用後、培養細胞をペトリ皿を掻き取ってリンパ芽球の「ConA」と「PEA」を回収し、全RNAをキット「mRNA isolation kit for White Blood Cells」（Eoehringer Mannheim/Roche Cat #1934325)を用いて抽出した。
【０201】
9.2. ネコGM−CSFをコ−ドする遺伝子の単離とプラスミドpJPO89およびpJPO9Oの構築
ConAまたはPEAで刺激したネコリンパ芽球（実施例9.1）から抽出した全RNAを相補ＤＮＡの最初のストランドの合成のひな型として使用した。この相補ＤＮＡの最初のストランドはオリゴヌクレオチドp(dT)15（Boehringer Nannheim/Roche Cat#814270）の延長によって作った。得られた単一の相補ＤＮＡせ欠きオリゴヌクレオチドを用いたPCR反応のひな型として使った：
【０202】
JP578（配列番号64）（33mer）
5'tatgcggccgccaccatgtggctgcagaacctg 3'
JP579（配列番号 65）（36mer）
5'tatgcggccgctacgtatcacttcttgactggtttc 3'
【０203】
約450塩基対（bp）のPCR断片を増殖した。この断片をNotIで消化し、アガロ−スゲルで電気泳動した後に、450bpのNotI−NOtI断片を分離した。この断片をプラスミドpVR1Ol2（実施例1）でリゲ−トした。hCMV/IEプロモ−タに対して正しく配列したネコGN−CSF配列（配列番号67および配列番号 68）を含んだ２つのクロ−ンを同定した（pJPO89およびpJPO9O）。これら２つのプラスミドの寸法は5364bpである（図No.21、図23）。
【０204】
このプラスミドpJPO89でクロ−ニングしたネコのGM−CSF遺伝子の配列はGenBankから入手可能なネコGN−CSF配列（受入れ番号AF053007）とは13のヌクレオチドが相違する。最も大きな相違点はC→Tへの変化、従って、アミノ酸でロイシン→フェニルアラニンへの変化である（アミノ酸コ−ドン＃107の最初の塩基、図22）。プラスミドpJPO9Oでクロ−ニングしたネコGM−CSF遺伝子の配列はプラスミドpJPO89に含まれるそれと同じであるが、アミノ酸＃107（図No.24）ではロイシンC→フェニルアラニンへの変化はない。3'RACEキットを用いたネコのGM−CSF遺伝子の3'配列の確認から、同じネコでアミノ酸ロイシンまたはアミノ酸フエニルアラニンをこの位置107に有することが示された。
【０205】
実施例10
ウマのGM−CSFをコ−ドするプラスミド
10.1 マイトジェンによるインビトロ刺激したウマリンパ球の全RNAの調整
頸静脈から血液を収集してウマ血液をEDTAを収用したチューブに集めた。単核化した細胞をフィコ−ル勾配の遠心分離で回収し、直径60mmのペトリ皿で培養された。単核化したウマ細胞をコンカナバリンA（ConA）（最終濃度 約5μg/ml）か、フィトヘムアグルチニン（PHA）最終濃度 約10μg/ml）で刺激された。刺激作用後に、培養ペトリ皿を掻き取ってリンパ芽球「ConA」および「PHA」を収穫し、全RNAをキット「mRNA isolation kit for White Blood Cells」（Boehringer Mannheim/Roche Cat＃1934325) を使用して抽出した。
【０206】
10.2. ウマのGM−CSFをコ−ドする遺伝子の単離
ConAまたはPEA（実施例10.1）で刺激したウマリンパ芽球から抽出した全RNAを相補ＤＮＡの最初のストランドの合成のひな型として用いた。この相補ＤＮＡの最初のストランドはオリゴヌクレオチドp(dT)15（Boehringer Mannheime/ Roche Cat＃814270）の伸長で作った。得られた単一ストランドの相補ＤＮＡを下記オリゴヌクレオチドのPCR反応でひな型として使った：
【０207】
JP734（配列番号70）（44mer）
5'catcatcatgtcgacgccaccatgtggctgcagaacctgcttct 3'
JP735（配列番号71）（41mer）
5'catcatcatgcggccgctacttctgggctgctggcttccag 3'
【０208】
約500塩基対（bp）のPCR断片を増殖した。この断片をアガロ−スゲル電気泳動で精製した。
【０209】
10.3. プラスミドpJPO97の構築およびウマのGM−CSF遺伝子の配列
実施例10.2で得た精製したPCR断片をNotIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動後に、ウマGM−CSF遺伝子を含んだ約450bpのNotI−NotI断片を分離した。この断片をプラスミドpVRlOl2（実施例1）でリゲ−トした。hCMV/IEプロモ−タに対して正しく配列したウマGM−CSF配列（配列番号69、図26）を含むクロ−ンを同定した（pJPO97）。このプラスミドの寸法は5334bp（図25）である。
【０210】
【表１】

【０211】
実施例12
分子生物学方法
ウィルスの栽培および精製
細胞変性効果が得られるまでウィルスを該当する細胞機構で培養した。各ウィルスのために使用した細胞機構は当業者に周知である。簡単に言うと、該当する細胞を感染多重度1で研究ウイルス菌株で感染し、37℃で細胞変性効果を得るのに必要な時間（平均36時間）培養した。
【０212】
ＤＮＡウィルスの場合、栽培後に上澄みと溶菌した細胞を収穫し、細胞破片を1000gで４℃で10分間遠心分離して除去した。ウィルス粒子を40℃で400,000gで１時間、超遠心分離して回収した。ペレットを最小容積の緩衝液（10mMトリス、1mM EDTA）に採った。
ＲＮＡウィルスは当業者に周知の標準的精製方法で精製した。
【０213】
ウイルスゲノムDNAの抽出
濃縮されたウイルスの上記懸濁液をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（最終濃度 0.5%）の存在下で37℃で２時間、プロテイナ−ゼＫ（100mg/ml最終濃度）で処理した。それからフェノ−ル/クロロホルム混合物を用いてウィルスＤＮＡを抽出し、２容積の絶対エタノ−ルで−20℃で16時間沈殿させ、４℃で15分間、10,000gで遠心分離した。DNAペレットを乾燥し、最小量の無菌超高純度水に採った。
【０214】
ウイルスゲノムRNAの単離
各ウィルスゲノムのRNAをP. Chomczynski and N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156−159）が記載の方法「guanidinium thiocyanate/phenol−chloroform」を用いて抽出した。
【０215】
分子生物学方法
プラスミドの全構築はSambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)に記載の標準的分子生物学手技を使用して行った。本発明で使用した全ての制限断片は"Geneclean"キット（BIOlOl Inc, La Jolla, CA）を用いて分離した。全ての構造物、発現ベクタ−との継目およびＤＮＡ断片はサンガー法（Sanger method）(Samibrook et al., 1989）を用いて配列決定した。
【０216】
PCRおよびRT−PCR
遺伝子またはクロ−ニングした遺伝子断片の特異的オリゴヌクレオチドを合成した。そのいくつかは5'端に増殖された断片のクロ−ニングを容易にする制限サイトを有するものがあった。逆転写（RT）反応およびPCR法による鎖の増殖（PCR）は標準方法(Sambrook et al. 1989)に従って行った。
【０217】
プラスミドの大規模精製
ワクチン組成物中に含まれる精製プラスミドを約10mg単位で生産するために、塩化セシウム−エチジウムブロミド勾配法（Sambrook et al., 1989）を用いた。
【０218】
実施例13
ワクチンプラスミドの調製
実施例2〜10のプラスミドを含んだDNA溶液をSarnbrook et al. (1989）に記載の方法でエタノ−ル沈殿で濃縮する。DNAペレットを0.9% NaCl溶液に採り、1mg/mlの濃度にした。無菌H₂0中に該当する容積のDMRIE−DOPEの生理食塩水を入れ、0.75mMのDNRIE−DOPE溶液を調製する。
【０219】
プラスミドＤＮＡ−脂質複合体製剤は同量希釈（0.9% NaClの1mg/mlのDNA溶液と0.75mM DMRIE−DOPE溶液）して得る。気泡を避けるためにカチオン脂質溶液を主要したビンの内壁に沿って26G針を用いてDNA溶液を徐々に導入する。２つの溶液の混合後、すぐに穏やかに攪拌する。0.375mMのDMRIE−DOPEおよび500μg/mlのプラスミドから成る最後組成物を得る。
【０220】
上記の全ての操作と使用する全ての溶液は室温であるのが望ましい。DNA/DMRTE−DOPE複合体は動物を免疫する30分前に室温で調製する。
【０221】
実施例14
CDVに対するイヌの免疫
皮下または筋肉経路で2mlの注射を28日間隔で2回行う。各免疫化で使われるプラスミドの全量はワクチンで100、500、1000または2000μgである。当業者は容積または濃度を必要なプラスミド投与量の関数として調節するのに必要な知識を有する。
【０222】
14.1. ビルレント抗原投与
使用した抗原投与菌株はウイルス感染させたイヌから採ったイヌジステンパ−ウイルス菌株スナイダ−HillをPBS緩衝液に100倍に希釈したものである。希釈液は使うまで氷で保存した。一般麻酔後、抗原菌株（100倍に希釈）の0.5ml容積を頭蓋経路で投与し、最初の注射後49日後に投与した。
【０223】
14.2. 抗原投与後の臨床的監視
臨床的監視は抗原投与後21日間毎日実行した。イヌジステンパ−の臨床徴候および直腸温を取るために各イヌを臨床検査した。下記の臨床検査を行った：
【０224】
１） 評価点4で動物の一般状態を観測：
0＝評点「良し」
1＝評点「無気力」
2＝評点「鬱状態」
3＝評点「衰弱」
動物が死んが場合の臨床評点は10
【０225】
２） 口鼻徴候（しょう液性または化膿性分泌物および／または結膜炎の検査）。血清鼻汁と同時の結膜炎/鼻炎は評点１、化膿鼻汁は評点２。
３） 消化器症状（胃腸炎徴候検査）の価値判断。
１＝軽症胃腸炎
２＝激しい胃腸炎
４） 神経徴候（痙攣および／または麻痺検査）
１＝ミオクローノス
２＝痙攣
３＝麻痺
【０226】
５）動物体温の監視
37.5℃の以下の温度は3の評点にする。37.5℃〜39.5℃の間の温度は0の評点にする。39.5〜40℃の間の度は1の評点にする。40℃〜40.5℃の温度は2の評点にする。40.5℃を超える温度は3の評点にする。
抗原投与した動物の脾臓を取り、免疫蛍光法でイヌジステンパ−ウイルスを識別した。
【０227】
全臨床評点は下記方法で計算した：観測期間での動物グル−プでの各臨床徴候の平均評点を取り、五つの臨床徴候の全評点を平均評点と比較した。筋肉経路で抗原を投与したイヌ免疫実験の結果は下記の通り：
【０228】
【表２】

【０229】
【表３】

【０230】
天然遺伝子Mおよび天然遺伝子Nを挿入したプラスミドpNSOl6およびプラスミドpNSOl7はpNSOl8と同様にして作った。
最適化されたHA単独で得られた保護結果は、最適化されたHAおよびFまたは最適化されたHAおよびF＋天然MおよびNで得られた結果に比べて驚くべきものである。
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発明の精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。
【０231】
添付の配列リストは下記を表す：
配列番号 1：オリゴヌクレオチドNS030
配列番号 2：オリゴヌクレオチドNSO31
配列番号 3：オリゴヌクレオチドNS034
配列番号 4：オリゴヌクレオチドNS035
配列番号 5：オリゴヌクレオチドNS036
配列番号 6：オリゴヌクレオチドNS037
配列番号 7：オリゴヌクレオチドSB090
配列番号 8：オリゴヌクレオチドSB091
配列番号 9：オリゴヌクレオチドPB326
配列番号 10：オリゴヌクレオチドPB329
配列番号 11：オリゴヌクレオチドPB381
配列番号 12：オリゴヌクレオチドPB382
配列番号 13：オリゴヌクレオチドPB383
配列番号 14：オリゴヌクレオチドSB384
配列番号 15：オリゴヌクレオチドSBlOl
配列番号 16：オリゴヌクレオチドSB102
配列番号 17：オリゴヌクレオチドSB103
配列番号 18：オリゴヌクレオチドSB104
配列番号 19：オリゴヌクレオチドSB105
配列番号 20：オリゴヌクレオチドSB106
配列番号 21：オリゴヌクレオチドSB107
配列番号 22：オリゴヌクレオチドSB108
配列番号 23：オリゴヌクレオチドSBlO9
配列番号 24：オリゴヌクレオチドSB110
配列番号 25：オリゴヌクレオチドSB111
配列番号 26：オリゴヌクレオチドSB112
配列番号 27：オリゴヌクレオチドSB113
配列番号 20：オリゴヌクレオチドSB114
配列番号 29：オリゴヌクレオチドSB115
配列番号 30：オリゴヌクレオチドSB116
配列番号 31：オリゴヌクレオチドSB117
配列番号 32：オリゴヌクレオチドSB118
配列番号 33：オリゴヌクレオチドAB325
配列番号 34：オリゴヌクレオチドAB326
配列番号 35：オリゴヌクレオチドAB327
配列番号 36：オリゴヌクレオチドAB328
配列番号 37：オリゴヌクレオチドAB329
配列番号 38：オリゴヌクレオチドAB330
配列番号 39：オリゴヌクレオチドNS003
配列番号 40：オリゴヌクレオチドNS004
配列番号 41：オリゴヌクレオチドNS005
配列番号 42：オリゴヌクレオチドNSOO6
配列番号 43：オリゴヌクレオチドNSOO7
配列番号 44：オリゴヌクレオチドNS008
配列番号 45：オリゴヌクレオチドSBll9
配列番号 46：オリゴヌクレオチドSB120
配列番号 47：オリゴヌクレオチドSB121
配列番号 48：オリゴヌクレオチドSB122
配列番号 49：オリゴヌクレオチドSB123
配列番号 50：オリゴヌクレオチドSB124
配列番号 51：オリゴヌクレオチドSB125
配列番号 52：オリゴヌクレオチドSB126
配列番号 53：オリゴヌクレオチドSB127
配列番号 54：オリゴヌクレオチドSB128
配列番号 55：オリゴヌクレオチドSB129
配列番号 56：オリゴヌクレオチドSBl3O
配列番号 57：オリゴヌクレオチドSBl3l
配列番号 58：オリゴヌクレオチドSB132
配列番号 59：オリゴヌクレオチドSB133
配列番号 60：オリゴヌクレオチドSB134
配列番号 61：オリゴヌクレオチドSBl3S
配列番号 62：オリゴヌクレオチドSBl3E
配列番号 63：オリゴヌクレオチドSB137
配列番号 64：オリゴヌクレオチドJP578
配列番号 65：オリゴヌクレオチドJP579
配列番号 66：イヌGM−CSFの遺伝子配列（図20参照）
配列番号 67：ネコGM−CSFの3R3の遺伝子配列（図22参照）
配列番号 68：ネコGM−CSFの3R4の配列遺伝子（図24参照）
配列番号 69：ウマGM−CSFの遺伝子配列（図26参照）
配列番号 70：オリゴヌクレオチドJP734
配列番号 71：オリゴヌクレオチドJP735
配列番号72：CPI−2 Fの遺伝子配列（図27参照）
配列番号73：CPI−2 HNの遺伝子配列（図28参照）
【配列表】
【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpABllOの図
【図２】 プラスミドpVRlOl2の図
【図３】 プラスミドpNSO2lの図
【図４】 プラスミドpNSO24の図
【図５】 プラスミドpSBO32の図
【図６】 プラスミドpSBO34の図
【図７】 プラスミドpSBOl6の図
【図８】 プラスミドpSBOl9の図
【図９】 プラスミドpSBOl7の図
【図１０】 プラスミドpSBO2lの図
【図１１】 プラスミドpSB023の図
【図１２】 プラスミドpSB024の図
【図１３】 プラスミドpSBO28の図
【図１４】 プラスミドpSB029の図
【図１５】 プラスミドpSBO3Oの図
【図１６】 プラスミドpSBO25の図
【図１７】 プラスミドpSBO26の図
【図１８】 プラスミドpSB027の図
【図１９】 プラスミドpJPO84の図
【図２０】 イヌのGM−CSの遺伝子配列の図
【図２１】 プラスミドpJPO89の図
【図２２】 ネコの遺伝子3R3 GM−CSの配列の図
【図２３】 プラスミドpJPO9Oの図
【図２４】 ネコの遺伝子3R4 GM−CSの配列の図
【図２５】 プラスミドpJPO97の図
【図２６】 ウマのGM−CSF遺伝子の配列の図
【図２７】 CPI−2のF遺伝子の配列の図
【図２８】 CPI−2のHN遺伝子の配列の図