JP2023536160A - 改変チクングニアウイルス及びシンドビスウイルス並びにそれらの用途 - Google Patents
改変チクングニアウイルス及びシンドビスウイルス並びにそれらの用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023536160A JP2023536160A JP2023506194A JP2023506194A JP2023536160A JP 2023536160 A JP2023536160 A JP 2023536160A JP 2023506194 A JP2023506194 A JP 2023506194A JP 2023506194 A JP2023506194 A JP 2023506194A JP 2023536160 A JP2023536160 A JP 2023536160A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- nucleic acid
- human
- subject
- acid construct
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 title claims description 123
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 title claims description 94
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 189
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 129
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 94
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 93
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 51
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 252
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 109
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 102
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 98
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 97
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 71
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 44
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 30
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 26
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 26
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 25
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 19
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 15
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 13
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 12
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011374 additional therapy Methods 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 claims description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 claims description 3
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 238000011125 single therapy Methods 0.000 claims description 3
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 claims description 3
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 109
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 25
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 25
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 25
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 25
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 25
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 20
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 19
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 19
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 108010007005 Estrogen Receptor alpha Proteins 0.000 description 14
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 13
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 11
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 11
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 10
- 229940119178 Interleukin 1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 10
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 10
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 9
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710132906 Structural polyprotein Proteins 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 8
- 101800000980 Protease nsP2 Proteins 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 8
- XVWMTUURNMVNJE-UHFFFAOYSA-N n'-(2-phenylsulfanylethyl)propane-1,3-diamine Chemical compound NCCCNCCSC1=CC=CC=C1 XVWMTUURNMVNJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 6
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- -1 coatings Substances 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 3
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 3
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 2
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 101000893689 Homo sapiens Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100039065 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 230000035986 JAK-STAT signaling Effects 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102100040854 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- MUPNITTWEOEDNT-TWMSPMCMSA-N 2,3-bis[[(Z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MUPNITTWEOEDNT-TWMSPMCMSA-N 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101800001643 6K protein Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 241001302714 Aedes pseudoscutellaris Species 0.000 description 1
- 241000256176 Aedes vexans Species 0.000 description 1
- 241000256187 Anopheles albimanus Species 0.000 description 1
- 241001414900 Anopheles stephensi Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000985254 Culex bitaeniorhynchus Species 0.000 description 1
- 241000256059 Culex pipiens Species 0.000 description 1
- 241000256057 Culex quinquefasciatus Species 0.000 description 1
- 241000823690 Culex theileri Species 0.000 description 1
- 241000256060 Culex tritaeniorhynchus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710201734 E3 protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082819 ERBB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100039770 Glutamate receptor-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091009426 Glutamate receptor-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091009425 Glutamate receptor-interacting protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039773 Glutamate receptor-interacting protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000238367 Mya arenaria Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- 241000204974 Natronobacterium Species 0.000 description 1
- 101710138767 Non-structural glycoprotein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000256179 Ochlerotatus triseriatus Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 101710132611 Protein E3 Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100031056 Serine protease 57 Human genes 0.000 description 1
- 101710197596 Serine protease 57 Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000521243 Stegomyia Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 241000202380 Toxorhynchites amboinensis Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710951 Western equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 239000006189 buccal tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002032 cellular defenses Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- CCJWSPZKRUOYDU-UHFFFAOYSA-N n'-(2-phenylsulfanylethyl)ethane-1,2-diamine Chemical compound NCCNCCSC1=CC=CC=C1 CCJWSPZKRUOYDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001103—Receptors for growth factors
- A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/36162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本開示は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関し、特に、改変ウイルスゲノムおよびレプリコンをコードする核酸分子、同じものを含有する医薬組成物、ならびに細胞培養物または生体における所望の産物を産生するための当該核酸分子および組成物の使用に関する。また、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法、ならびに予防および/または治療を必要とする対象において様々な健康状態を予防および/または治療するための方法も提供される。
関連出願
本出願は、2020年7月31日に出願された米国仮特許出願番号63/059,777号に対する優先権を主張し、任意の図面を含むその全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の組み込み
本出願は配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表テキストファイルは「058462-501001WO _Sequence Listing_ST25.txt」という名前で、2021年7月15日に作成されたもので、58KBである。
近年、いくつかの異なる動物ウイルス群が、相同組換えまたはそれらのゲノムの直接工学のいずれかによって遺伝子操作を受けている。DNAウイルスおよびRNAウイルスの両方に対する逆遺伝学システムの利用可能性は、例えば、ワクチン、発現ベクター、抗腫瘍剤、遺伝子治療ベクター、および薬物送達媒体としての組換えウイルスの使用に関する新しい展望を生み出した。
例えば、多くのウイルスベースの発現ベクターが、培養組換え細胞における異種タンパク質の発現のために展開されている。例えば、宿主細胞における遺伝子発現のための改変ウイルスベクターの用途は拡大し続けている。この点に関する最近の進歩としては、マルチサブユニットタンパク質複合体の生産のための技術とシステムのさらなる開発、および異種タンパク質生産を改善するためのタンパク質修飾酵素の共発現が挙げられる。ウイルス発現ベクター技術に関するその他の最近の進歩としては、遺伝子発現を制御するための多くの高度なゲノム工学的応用、ウイルスベクターの調製、インビボ遺伝子治療アプリケーション、およびワクチンデリバリーベクターの創製が挙げられる。
しかし、宿主細胞は、病原体の侵入を検出して対抗するための複雑で強力なメカニズムを開発できることが報告されている。さらに、ウイルス、特に病原性ウイルスは、感染および複製に対するこれらの細胞防御と戦うために宿主細胞とともに進化したことが報告されている。感染の結果として、多くの宿主細胞は、ウイルス複製および/または追加の細胞に広がる可能性のある子孫のウイルス産生を制御するために、細胞タンパク質翻訳機構をシャットダウンする。この現象は一般に「自然免疫応答」と呼ばれている。感染した細胞はまた、局所的および全身的に他の細胞に危険信号を送り、抗ウイルス状態を確立し、感染を制御する。これらの細胞性抗ウイルス系は宿主細胞に利益をもたらすが、有益なワクチン抗原または治療薬を発現するように設計された自己増幅RNA(レプリコンと呼ばれる)にも悪影響を与える可能性がある。例えば、細胞が有益なタンパク質を発現するレプリコンRNAを検出し、その自然免疫防御機構を活性化すると、そのような細胞における有益なタンパク質の発現が影響を受け、レプリコンの有効性が損なわれる可能性がある。
したがって、RNAレプリコンベースの発現プラットフォームにおいて関心のある産物を発現させるためのより効率的な方法およびシステムの必要性が依然として存在する。
本開示は一般的に、様々な健康状態(例えば、増殖性障害および微生物感染症)の予防並びに管理における使用のための、組換え核酸構築物および同じものを含む医薬組成物などの免疫治療薬の開発に関する。特に、以下でより詳細に説明されるように、本開示のいくつかの実施形態は、ウイルスの1つ以上の構造タンパク質をコードする、ウイルス核酸配列の少なくとも一部を欠いているアルファウイルス チクングニアウイルス(CHIKV)またはシンドビスウイルス(SINV)の改変ゲノムまたはレプリコンをコードする配列を含む核酸構築物を提供する。また、本明細書に開示される1つ以上の核酸構築物を含むように操作された組換え細胞およびトランスジェニック動物、目的の分子を生産するための方法、(a)本開示の核酸構築物、(b)本開示のポリペプチド、(c)本開示の組換え細胞のうち1つ以上を含む医薬組成物、も開示されている。本開示の特定の態様において、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための、ならびに/もしくは予防および/または治療を必要とする対象において増殖性障害(例えば、癌)および慢性感染症を含む様々な健康状態の予防および/または治療のための組成物および方法がさらに提供される。
本開示の一態様において、本明細書に提供されるのは、改変チクングニアウイルス(CHIKV)ゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、前記改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。
本開示の一態様において、本明細書に提供されるのは、改変シンドビスウイルス(SINV)ゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、前記改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。
本開示の核酸構築物の非限定的な例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の相当な部分を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、1つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットのそれぞれは、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットのうちの少なくとも1つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム(sg)プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、sgプロモーターは、26Sサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、1つ以上の非翻訳領域(UTR)をさらに含む。いくつかの実施形態において、UTRのうちの少なくとも1つは、異種UTRである。
いくつかの実施形態において、発現カセットのうちの少なくとも1つは、目的の遺伝子(GOI)のコード配列を含む。いくつかの実施形態において、GOIは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、GOIは、抗体、抗原、免疫調節物質、酵素、シグナル伝達タンパク質、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、GOIのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現に対して最適化される。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号1~4からなる群から選択される核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示されるように核酸構築物を含む組換え細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。 いくつかの実施形態において、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は蚊細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1細胞(COS-7)、ヒト胚性腎細胞(例えば、HEK 293またはHEK 293細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)、イヌ腎細胞(MDCK)、バッファローラット肝細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(Hep G2)、マウス乳腺腫瘍(MMT 060562)、TRI細胞、FS4細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、アフリカミドリザル腎細胞(Vero細胞)、ヒトA549細胞、ヒト子宮頸部細胞、 ヒトCHME5細胞、ヒトPER.C6細胞、NS0マウスミエローマ細胞であり、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトHUH-7細胞、ヒトMRC-5細胞、ヒト筋細胞、ヒトリンパ管内皮細胞、ヒトアストロサイト細胞、ヒトマクロファージ細胞、ヒトRAW264.7細胞、マウス3T3細胞、マウスL929細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、ウサギ腎細胞からなる群から選択される。また、関連する態様において、本明細書に開示される少なくとも1つの組換え細胞と培養培地とを含む細胞培養物も提供される。
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は、脊椎動物または無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は昆虫である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック昆虫は、トランスジェニック蚊である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、目的のポリペプチド(GOI)の産生方法であって、前記方法は、組換え細胞がGOIによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で、(i)本明細書に開示のトランスジェニック動物を飼育するステップ、又は(ii)本明細書に開示の核酸構築物を含む組換え細胞を培養するステップを含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であり、前記方法は、本明細書に開示される核酸構築物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、対象は昆虫である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。さらに別の態様において、本明細書に提供されるのは、本開示の方法によって産生される組換えポリペプチドである。
さらに別の態様において、本明細書に提供されるのは、医薬として許容される賦形剤、及びa)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;および/またはc)本開示の組換えポリペプチドを含む医薬組成物である。
本開示の医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される核酸構築物および医薬として許容される賦形剤を含む組成物である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される組換え細胞および医薬として許容される賦形剤を含む組成物である。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に開示されるような組換えポリペプチド、および医薬として許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、リポソーム、脂質ベースのナノ粒子(LNP)、またはポリマーナノ粒子中に製剤化された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は免疫原性組成物である。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、鼻腔内投与、節内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、眼内、経口、および直腸内投与のうちの1つ以上のために製剤化される。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法であり、この方法は、a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;c)本開示の組換えポリペプチド;および/またはd)本開示の医薬組成物を含む組成物を対象に投与することを含む。
さらに別の態様において、本明細書中で提供されるのは、予防および/または治療を必要とする対象における健康状態を予防および/または治療するための方法であり、この方法は、a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;c)本開示の組換えポリペプチド;および/またはd)本開示のいずれか一項に記載の医薬組成物:
を含む組成物を予防的または治療的に対象に投与することを含む。
を含む組成物を予防的または治療的に対象に投与することを含む。
本開示の方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含むことができる。いくつかの実施態様では、健康状態は増殖性障害又は微生物感染症である。いくつかの実施形態において、対象は、増殖性障害又は微生物感染症に関連する健康状態を有する又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象におけるインターフェロンの産生増加をもたらす。いくつかの実施形態において、組成物は、単回療法(単剤療法)として、又は少なくとも1つの追加の療法と組み合わせた第1の療法として、個々に対象に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの追加の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される。
さらに別の態様において、本明細書中で提供されるのは、免疫応答を誘発するため、予防のため、および/または健康状態または微生物感染症の治療のためのキットであり、該キットは、a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;c)本開示の組換えポリペプチド;および/またはd)本開示の医薬組成物を含む。
本明細書に記載される態様および実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明示的または明確に除外されない限り、共に使用することができる。
前述の概要は例示にすぎず、いかなる意味でも限定することを意図したものではない。本明細書に記載される例示的な実施形態および特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的および特徴は、図面および詳細な説明並びに請求項から完全に明らかになるであろう。
本明細書に提供されるのは、とりわけ、組換え細胞における、異種分子、例えばワクチンおよび治療用ポリペプチドなどを発現するのに適した、優れた発現能を有するウイルス発現系である。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、構造タンパク質をコードするその元のウイルス配列の少なくともいくつかが欠失している、チクングニアウイルス(CHIKV)またはシンドビスウイルス(SINV)の改変ゲノムまたはレプリコンRNAを含有する核酸構築物、例えば発現構築物およびベクターなどに関する。また、本開示のいくつかの実施形態において提供されるのは、異種ポリペプチドをコードする1つ以上の発現カセットを含むウイルスベースの発現ベクターである。さらに提供されるのは、本明細書に開示される核酸分子のうちの1つ以上を含むように遺伝子操作された組換え細胞である。当該組換え細胞に由来する生体材料および組換え産物も、当該出願の範囲内である。また、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するために有用な組成物および方法、ならびに予防および/または治療を必要とする対象において様々な健康状態を予防および/または治療するための方法も提供される。
RNAウイルス(例えば、アルファウイルス)に基づく自己増幅RNA(レプリコン)を、強力な発現系として使用することができる。例えば、CHIKVおよびSINVなどのアルファウイルスをウイルス発現ベクターとして使用する利点として、組換え宿主細胞において大量の異種タンパク質の合成を方向付けることが報告されている。他の利点の中でも、治療用一本鎖抗体などのポリペプチドは、インビボで、高レベルで発現される場合に最も効果的であり得る。さらに、培養物(ex vivo)中で細胞から精製された組換え抗体を産生するために、レプリコンRNAからの高タンパク質発現は、抗体産物の全体的な収率を増加させることができる。さらに、発現しているタンパク質がワクチン抗原である場合、高レベルの発現は、インビボで最も強力な免疫応答を誘導することができる。
アルファウイルスは、それらのUTR、構造領域、および非構造領域に含まれるモチーフを利用して、宿主細胞におけるそれらの複製に影響を与える。これらの領域には、宿主細胞の自然免疫を回避するメカニズムも含まれている。しかしながら、アルファウイルス種間の有意差が報告されている。例えば、新世界アルファウイルスと旧世界アルファウイルスは、ウイルス複製複合体の組み立てのために細胞内のストレス顆粒、JAK-STATシグナル伝達、FXR、およびG3BPタンパク質を利用するために異なる成分を進化させてきた。ゲノムのどの部分にこれらの成分が含まれているかも、アルファウイルス間で異なる。例えば、PKRの活性化とそれに続くEIF2αのリン酸化の迂回は、シンドビスなどの一部の旧世界アルファウイルスでは下流ループを介して行われるが、この経路を迂回することは、認識可能なDLPがないチクングニアにおいてNSP4を介して行われると考えられている。さらに、個々のアルファウイルス間の変動を超えて、アルファウイルスの株内にも、病原性などの特性の変化を説明することができる違いがあることが多い。例えば、東部馬脳炎ウイルス(EEEV)の北米株と南米株間の配列変動は、STAT1経路を調節する能力を変化させ、I型インターフェロンの誘導差とその結果生じる病原性の変化をもたらす。
アルファウイルスの非構造および構造領域における宿主細胞弱毒化因子の特定の存在を考えると、合成ベクターでの異種遺伝子発現を可能にするために構造遺伝子を削除すると、個々のベクターにさまざまな影響がある。非構造領域に異なる宿主弱毒化因子を有する合成レプリコンは、発現される異種遺伝子に対する免疫応答の誘導において差次的に優れている。チクングニアは、NSP領域に保持されたモチーフを介してPKR活性化とそれに続くEIF2αリン酸化を迂回する能力、I型インターフェロンの強力な活性化、およびストレス顆粒、JAK-STATシグナル伝達、およびG3BPタンパク質を活用する能力により、ワクチンベクターとしての使用に有利である。逆に、STAT1を阻害できない病原性シンドビス Girdwood 株は、コードされたタンパク質に対して強力な免疫応答を形成することなく、異種タンパク質の発現に有利なベクターになる。さらなる例として、SINV株S.A.AR86(AR86)は、IFN-γおよび/またはIFN-βに応答して、STAT1およびSTAT2のチロシンリン酸化を迅速かつ強力に阻害する。AR86 nsP1の538位にある特有のスレオニンは、非構造タンパク質プロセシングの遅延と、関連するSINV株Girdwood由来のサブゲノムRNA合成の遅延をもたらし、成体マウスの神経毒性表現型に寄与し、異種タンパク質発現の速度論と収量に有利であり、AR86ベースのレプリコンベクターから発現されるワクチン抗原に対するより強力な免疫応答に寄与する。これらの個々のベクターがもたらす利点は、これまで完全に未開拓で予測されていなかった。
以下でより詳細に説明するように、公的に入手可能なアルファウイルスゲノムデータは、構造タンパク質をコードする核酸配列を目的の遺伝子(GOI)で直接置換して自己複製RNAおよび導入遺伝子発現レプリコンをもたらすことができるヌクレオチド配列を常に提供するとは限らないという最初の観察がなされた。例えば、CHIKV株S27(Genbank AF369024)の構造ポリタンパク質遺伝子を合成HPV E6/E7遺伝子(ヒトパピローマウイルスE6/E7遺伝子)(例えば図2B参照)、またはインフルエンザAウイルスH5N1遺伝子のヘマグルチニン前駆体(HA) (例えば図3B参照)、もしくはアカホタルルシフェラーゼ遺伝子に置換して、トランスフェクトされたBHK-21細胞において、RNA複製および導入遺伝子発現が可能なレプリコンを作製することができるとわかったが、CHIKV株DRDE-06(Genbank EF210157)における構造ポリタンパク質遺伝子を同様に置換するために使用された遺伝子配列は、RNA複製を受けることも、導入遺伝子を発現することもできなかった。したがって、利用可能な公開された配列を用いたCHIKV構造タンパク質の異種遺伝子への単純な置換は、機能的レプリコンの生成に必ずしも十分ではない。別の言い方をすれば、ワクチンや治療薬での使用に適したレプリコンシステムを作成するには、異種の5'および/または3'UTR配列を使用するなどのさらなる操作が必要になる。
注目すべきことに、CHIKV株S27およびDRDE-06のゲノムにわたって見出される配列における多数の進化的相違にもかかわらず、本明細書に提示された実験データは、機能的なCHIKV株DRDEレプリコンが、DRDE 3'UTRをCHIKV株S27由来の3'UTRで置換することによって生成され得ることを実証した(例えば、図2Cを参照されたい)。さらに、本明細書に開示されるCHIKVおよびSINVレプリコンプラットフォーム系は、目的の異種ポリペプチドを高レベルで発現することができるとわかった。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、およびその他の科学用語または専門用語は、本出願が関係する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合により、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さのためにおよび/または即時参照するために本明細書において定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、必ずしも当該技術分野において一般的に理解されているものに対する実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者によって十分に理解され、従来の方法論を用いて一般的に採用される。
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。例えば、用語「細胞」は、1つ以上の細胞を含み、それらの混合物を含む。「Aおよび/またはB」は、本明細書において、「A」、「B」、「AまたはB」、および「AおよびB」の全ての代替を含み使用される。
本明細書で使用される用語「投与」および「投与すること」は、非限定的に、鼻腔内、経皮、静脈内、動脈内、筋肉内、節内、腫瘍内、関節内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、直腸内、膣内、眼内、および局所投与、またはそれらの組み合わせを含む投与経路による、生理活性組成物または製剤の送達を指す。該用語には、非限定的に、医療従事者による投与および自己投与が含まれる。
用語「細胞」、「細胞培養物」、および「細胞株」は、特定の対象細胞、細胞培養物、または細胞株だけでなく、培養における移植または継代の数に関係なく、当該細胞、細胞培養物、または細胞株の子孫もしくは潜在的な子孫も指す。すべての子孫が親細胞とまったく同一ではないことを理解されたい。これは、特定の改変が、突然変異(例えば、意図的または不注意な突然変異)または環境的影響(例えば、メチル化または他のエピジェネティック修飾)のいずれかのために、後世において起こり得るためであり、その結果、子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、子孫が元の細胞、細胞培養、または細胞株と同じ機能を保持する限り、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
本開示の組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」、または「薬学的有効量」という用語は、一般に組成物の非存在下と比較して、組成物が所定の目的を達成するのに十分な量を指す(例えば、投与される効果を達成する、免疫応答を刺激する、疾患を予防または治療する、または疾患、障害、感染症、または健康状態の1つ以上の症状を軽減する)。「有効量」の一例は、疾患の症状(単数または複数)の治療、予防、または軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも称され得る。症状の「軽減」とは、症状の重症度または頻度の減少、または症状の排除を意味する。「治療有効量」を含む組成物の正確な量は、治療の目的次第であり、既知の技術を用いて当業者によって確認可能であろう(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins) 。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限との間の各介在値(文脈が別段に明確に指示しない限り、下限の単位の10分の1まで)と、その規定された範囲内の任意のその他の規定値または介在値が開示内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含めることができ、規定された範囲内の任意の明確に除外された限度を条件として、開示内にも包含される。規定された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらに含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も開示に含まれる。
本明細書では、特定の範囲が、本明細書で使用される場合、通常およその意味を有する「約」という用語が数値の前に付き提示される。「約」という用語は、用語が先行する正確な数、並びに用語が先行する数に近い、またはほぼ用語が先行する数であるような数を文字通りサポートするために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか、またはほぼ具体的に列挙された数であるかを決定する際に、列挙されていない数に近いか近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数と実質的に同等であるものを提供する数であり得る。近似の程度が文脈から明確でない場合、「約」は、提供された値を含むすべての場合において、提供された値のプラスマイナス10%以内、または最も近い有効数字に丸められる。
「構築物」という用語は、異種供給源からの1つ以上の単離された核酸配列を含む組換え分子を指す。例えば、核酸構築物は、異なる供給源の2つ以上の核酸配列が単一の核酸分子に集合しているキメラ核酸分子であり得る。したがって、代表的な核酸構築物は、(1)天然に互いに隣接していない(例えば、ヌクレオチド配列の少なくとも1つは、その他のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して異種である)制御及びコーディング配列を含む核酸配列、または(2)天然に隣接していない機能的なRNA分子またはタンパク質の一部をコードする配列、もしくは(3)天然に隣接していないプロモーター部分を含有する任意の構築物を含む。代表的な核酸構築物としては、任意の組換え核酸分子、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNA核酸分子を含み得、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能な任意の供給源、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージに由来し、1つ以上の核酸配列が作動可能に連結されている核酸分子が挙げられる。本開示の構築物は、構築物中にも含まれる目的の核酸配列を直接発現させるために必要な要素を含み得る。このような要素は、目的の核酸配列に作動可能に連結されている(直接転写するように)プロモーターなどの制御要素を含み得、任意選択でポリアデニル化配列を含む。本開示のいくつかの実施形態において、核酸構築物はベクター内に組み込まれてもよい。構築物の構成要素に加えて、ベクターは、例えば、1つ以上の選択可能なマーカー、原核生物および真核生物起点などの1つ以上の複製起点、少なくとも1つの多重クローニングサイト、および/または細胞のゲノムへの構築物の安定的な組み込みを促進する要素を含み得る。2つ以上の構築物は、単一のベクターなどの単一の核酸分子内に組み込むことができ、または2つ以上の別々のベクターなどの2つ以上の別々の核酸分子内に含有することができる。「発現構築物」は一般に、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも一つの制御配列を含む。このようにして、例えば、発現するヌクレオチド配列と作動可能に連結するプロモーターが、細胞内で発現するための発現構築物において提供される。本開示の実施のために、構築物および細胞を調製並びに使用するための組成物および方法は、当業者に公知である。
本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」は、2つ以上の要素、例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の物理的または機能的連結を意味し、それらの意図された様式で作動することができる。例えば、本明細書に記載の核酸分子、または核酸分子中のコード配列およびプロモーター配列の文脈において用いられる場合、「作動可能に連結された」という用語は、コード配列およびプロモーター配列が、インフレーム並びに転写での転写因子またはRNAポリメラーゼによるそれぞれの結合の効果を可能にするために、適切な空間および距離にあることを意味する。作動可能に連結された要素は、連続的または非連続的であり得る(例えば、リンカーを介して互いに連結され得る)ことを理解されたい。ポリペプチド構築物の文脈において、「作動可能に連結された」とは、アミノ酸配列(例えば、異なるセグメント、部分、領域、またはドメイン)間の物理的連結(例えば、直接的または間接的に連結された)であって、構築物の記載された活性を提供する。本明細書に開示されるポリペプチドまたは核酸分子の作動可能に連結されたセグメント、部分、領域、およびドメインは、連続または非連続であり得る(例えば、リンカーを介して互いに連結され得る)。
本明細書において使用される用語「部分」は、分画を指す。ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列もしくはタンパク質などの特定の構造に関して、「部分」という用語は、前記構造の連続または不連続画分を示し得る。例えば、アミノ酸配列の一部は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、および少なくとも90%を含む。加えてまたは代替的に、当該部分が不連続画分である場合、前記不連続画分は、構造の2、3、4、5、6、7、8、またはそれ以上の部分(例えば、タンパク質のドメイン)から構成され、各部分は、構造の連続要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続画分は、2、3、4、5、6、7、8、またはそれ以上、例えば前記アミノ酸配列の4部分以下から構成されてもよく、各部分は、アミノ酸配列の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つの連続アミノ酸、少なくとも10個の連続アミノ酸、少なくとも20個の連続アミノ酸、または少なくとも30個の連続アミノ酸を含む。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限との間の各介在値(文脈が別段に明確に指示しない限り、下限の単位の10分の1まで)と、その規定された範囲内の任意のその他の規定値または介在値が開示内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含めることができ、規定された範囲内の任意の明確に除外された限度を条件として、開示内にも包含される。規定された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらに含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も開示に含まれる。
2つ以上の核酸またはタンパク質との関連において本明細書で使用される用語「パーセント同一性」は、同一である、または以下に記載される既定のパラメータを有するBLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査によって測定されたものと同一(例えば、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって一致が最大になるように比較および整列した場合、特定の領域にわたって約60%の配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはより高い同一性)である、特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する2つ以上の配列またはサブ配列を指す。ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのNCBIウェブサイトなどを参照のこと。そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、配列の補完も参照する、または適用できる。この定義には、削除および/または追加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、GCSプログラムパッケージ(Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)などの公開された技術および広く利用可能なコンピュータプログラムを用いて計算することができる。配列同一性は、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)の遺伝学コンピュータグループの配列分析ソフトウェアパッケージなどの配列分析ソフトウェアを使用して、その規定パラメータを使用して測定できる。
本明細書において使用される用語「医薬として許容される賦形剤」は、対象への目的の化合物(単数または複数)の投与のために医薬として許容される担体、添加剤、または希釈剤を提供する任意の好適な物質を指す。そのようにして、「医薬として許容される賦形剤」は、医薬として許容される希釈剤、医薬として許容される添加剤、および医薬として許容される担体と呼ばれる物質を包含することができる。本明細書において使用される場合、用語「医薬として許容される担体」は、非限定的に、生理食塩水、溶媒、分散液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含み、薬学的投与に適合する。補助的な活性化合物(例えば、抗生物質および追加の治療薬)も組成物に組み込まれ得る。
本明細書で使用される場合、「対象」または「個体」は、動物、例えばヒト(例えば、ヒト個体)および非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態において、「対象」又は「個体」は、医師のケアを受けている患者である。したがって、対象は、目的の健康状態(例えば、癌または感染症)および/または健康状態の1つ以上の症状を有する、有するリスクがある、または有する疑いのあるヒト患者または個体であり得る。対象はまた、診断時またはそれ以降に目的の健康状態のリスクがある診断された個体であり得る。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、および非哺乳動物、例えば両生類、爬虫類などを含む。
本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、「含む(comprising)」、「構成する」、および「本質的に~なる」態様および実施形態を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」は、「含む(including)」、「含有する」、または「~によって特徴付けられる」と同義であり、包括的または無制限であり、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを排除するものではない。本明細書で使用される場合、「~からなる」は、特許請求の範囲に記載された組成物または方法において、特定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「本質的に~からなる」は、特許請求の範囲の組成物または方法の基本的および新規な特性に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を排除しない。本明細書における用語「含む(comprising)」の任意の列挙は、特に組成物の構成要素の説明または方法の工程の説明において、列挙された構成要素または工程から本質的になる、および列挙された構成要素または工程からなる組成物および方法を包含すると理解される。
本開示の特定の特徴は、明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載され、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることを理解されたい。逆に、本開示の様々な特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明され、別々に、または任意の適切な部分的組み合わせで提供することもできる。本開示に関する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素の全ての部分的組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのような部分的組み合わせの各々が個別かつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
チクングニアウイルス(CHIKV)およびシンドビスウイルス(SINV)
チクングニアウイルス(CHIKV)およびシンドビスウイルス(SINV)は、グループIVトガウイルス科の遺伝的、構造的、および血清学的に関連するウイルスのグループを含むアルファウイルス属の仲間である。現在、アルファウイルス属には、シンドビスウイルス(SINV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ロスリバーウイルス(RRV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、および東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)などが含まれ、これらはすべて密接に関連しており、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類などのさまざまな脊椎動物、およびヒトやウマなどの大型哺乳類、並びに昆虫などの無脊椎動物に感染し得る。特に、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、これらのウイルスのライフサイクル、複製様式などはよく特徴付けられている。SINVは西部馬脳炎ウイルス複合体の仲間であるが、CHIKVはセムリキ森林ウイルス複合体の仲間であり、ロスリバーウイルス、オニョンニョンウイルス、セムリキ森林ウイルスと密接に関連している。特に、アルファウイルスは動物細胞内で非常に効率的に複製することが示されているため、そのような細胞でタンパク質や核酸を産生するためのベクターとして有益である。種と個体の間の感染は主に、蚊を介して発生し、アルファウイルスをアルボウイルス―または節足動物媒介ウイルスのコレクションに寄与させる。
これらのアルファウイルスの各々は、ウイルススパイクタンパク質を含むエンベロープで包囲されたヌクレオカプシドに囲まれた正極性の一本鎖RNAゲノムを有する。アルファウイルス粒子は包まれており、球形である傾向があり(わずかに多形であるが)、等尺性ヌクレオカプシドを有する。アルファウイルスゲノムは、長さ約11~12kbの正極性の一本鎖RNAであり、5'キャップ、3'ポリA尾部、および酵素機能を有する非構造タンパク質をコードする第1のフレーム、並びにウイルス構造タンパク質(例えば、カプシドタンパク質CP、E1糖タンパク質、E2糖タンパク質、E3タンパク質および6Kタンパク質)をコードする第2のフレームを有する2つのオープンリーディングフレームである。
アルファウイルスゲノムの5'側3分の2は、ウイルスRNAの転写および複製に必要な多数の非構造タンパク質をコードする。これらのタンパク質はRNAから直接翻訳され、細胞タンパク質とともに、ウイルスゲノム複製およびサブゲノムRNAの転写に不可欠なRNA依存性RNAポリメラーゼを形成する。4つの非構造タンパク質(nsP1-4)は、ウイルスの複製機構を構成する単一のポリタンパク質として産生される。ポリタンパク質のプロセシングは高度に制御された方法で行われ、P2/3接合部での切断はゲノム複製中のRNAテンプレートの使用に影響を与える。このサイトは狭いくぼみの底部にあり、簡単にはアクセスできない。切断されると、nsP3はnsP2を囲むリング構造を作成する。これら2つのタンパク質は広範な界面を有する。非細胞変性ウイルスまたは温度感受性表現型を産生するnsP2における変異は、P2/P3界面領域にクラスター化する。nsP2非細胞変性変異の位置の反対側のP3変異は、P2/3の効率的な切断を妨げる。これは、RNA感染力に影響を与え、ウイルスRNA産生レベルを変化させる可能性がある。
ゲノムの3'側3分の1は、ウイルス粒子の形成に必要な全ての構造タンパク質:コアヌクレオカプシドタンパク質C、並びにヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質P62およびE1、の翻訳のための鋳型として働くサブゲノムRNAを含む。ウイルス膜アンカー表面糖タンパク質は、受容体の認識と膜融合による標的細胞への侵入に関与している。サブゲノムRNAは、nsP4タンパク質をコードするRNA配列の3'末端に存在するp26Sサブゲノムプロモーターから転写される。P62のE2およびE3へのタンパク質分解の成熟は、ウイルス表面の変化を引き起こす。E1、E2、および時にはE3の糖タンパク質「スパイク」は共にE1/E2二量体またはE1/E2/E3三量体を形成し、E2は中心から頂点に伸び、E1は頂点の空間を埋め、E3が存在する場合はスパイクの頭部に存在する。ウイルスがエンドソームの酸性度にさらされると、E1はE2から解離してE1ホモ三量体を形成する。これは融合ステップが細胞膜およびウイルス膜を共に駆動するのに必要である。アルファウイルス糖タンパク質E1はクラスIIウイルス融合タンパク質であり、インフルエンザウイルスおよびHIVに見られるクラスI融合タンパク質とは構造的に異なる。E2糖タンパク質は、その細胞質ドメインを介してヌクレオカプシドと相互作用するように機能し、その外部ドメインは細胞受容体に結合する役割を果たす。ほとんどのアルファウイルスは末梢タンパク質E3を失うが、セムリキウイルスではウイルス表面に結合したままである。
アルファウイルス複製は、宿主細胞内の膜状表面で起こることが報告されている。感染サイクルの最初のステップでは、ゲノムRNAの5'末端が、ゲノムRNAに相補的なネガティブ鎖を生成するRNAポリメラーゼ活性を有するポリタンパク質(nsP1-4)に翻訳される。第2の工程では、ネガティブ鎖は、それぞれ2つのRNA:(1)翻訳によって他のnsPタンパク質を産生し、ウイルスのゲノムとして作用する二次ウイルスのゲノムに対応するポジティブゲノムRNA;(2)感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムRNA、を産生するための鋳型として使用される。ポジティブゲノムRNA/サブゲノムRNA比は、ポリタンパク質のnsP1、nsP2、nsP3およびnsP4へのタンパク質分解自己切断によって調節される。実際には、ウイルス遺伝子発現は2段階で起こる。第1段階は主に、ポジティブゲノム鎖とネガティブ鎖の合成である。第2段階では、サブゲノムRNAの合成は事実上排他的であるため、大量の構造タンパク質が生成される。
本開示の構成
以下でより詳細に説明するように、本開示の1つの態様は、改変されたウイルスゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む酸構築物に関し、ここで、改変ゲノムまたはレプリコンRNAは、対応する未改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAの1つ以上の構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている(例えば含まない)。本開示のいくつかの実施形態は、非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3、およびnsP4のコード配列が存在する、改変アルファウイルスゲノムまたはレプリコンRNAを提供するが、1つ以上の構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部または全体が存在しない。また、本明細書に開示される核酸構築物を含むように操作された組換え細胞および細胞培養物も提供される。
A.核酸構築物
以下でより詳細に記載されるように、本開示の一態様は、チクングニアウイルス(CHIKV)またはシンドビスウイルス(SINV)などのアルファウイルスの改変ゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む、新規の核酸構築物に関する。例えば、改変されたアルファウイルスゲノムは、親アルファウイルスゲノムの1つ以上のゲノム領域における欠失、置換、および/または挿入を含み得る。
本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含み、ここで、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、未改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAの1つ以上の構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いており、例えば、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のCHIKV構造タンパク質、CP、E1、E2、E3、および6Kのコード配列の少なくとも一部を含まない。病原性および非病原性CHIKV株の両方が適している。本開示の組成物および方法に適したCHIKV株の非限定的な例としては、CHIKV S27、CHIKV LR2006-OPY-1、CHIKV YO123223、CHIKV DRDE、CHIKV 37997、CHIKV 99653、CHIKV Ag41855、およびNagpur(インド)653496株が挙げられる。本開示の組成物および方法に適したCHIKV株のさらなる例としては、Afreen et al. Microbiol. Immunol. 2014, 58:688-696, Lanciotti and Lambert ASTMH 2016, 94(4):800-803 および Langsjoen et al. mBio. 2018, 9(2): e02449-17に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、CHIKV株S27の株に由来する。いくつかの実施形態において、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、CHIKV株DRDEに由来する。いくつかの実施形態において、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、CHIKV株DRDE-06に由来する。いくつかの実施形態において、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、CHIKV株DRDE-07に由来する。
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含み、改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAは、未改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAの1つ以上の構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いており、例えば、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のSINV構造タンパク質、CP、E1、E2、E3、および6Kのコード配列の少なくとも一部を含まない。病原性および非病原性SINV株の両方が適している。本開示の組成物および方法に適したSINV株の非限定的な例には、SINV株AR339およびGirdwoodが含まれる。本開示の組成物および方法に適したSINV株のさらなる例としては、Sammels et al. J. Gen. Virol. 1999, 80(3):739-748, Lundstrom and Pfeffer Vector Borne Zoonotic Dis. 2010, 10(9):889-907, Sigei et al. Arch. of Virol. 2018, 163:2465-2469 および Ling et al. J. Virol. 2019, 93:e00620-19に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAは、SINV株 Girdwoodに由来する。いくつかの実施形態において、改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAは、SINV株AR86に由来する。
本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、改変されたウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、未改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAの1つ以上のウイルス構造タンパク質CP、E1、E2、E3、および6Kをコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、CPをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、E1をコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態において、改変されたウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、E2をコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、E3をコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、6Kをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、CP、E1、E2、E3、および6Kの組み合わせをコードする配列の一部または全体を欠いている。本開示のいくつかの実施形態は、未改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAの非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3、およびnsP4のコード配列が存在するが、1つ以上の構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部または全体(例えば、CP、E1、E2、E3、および6K)のCHIKVゲノムまたはレプリコンRNAが存在しない、改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、未改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAの非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3、およびnsP4のコード配列が存在するが、1つ以上の構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部または全体(例えば、CP、E1、E2、E3、および6K)のSINVゲノムまたはレプリコンRNAが存在しない、改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAを提供する。
いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている。当業者は、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列の実質的な部分が、当業者による配列の手動評価によって、またはBLASTなどのアルゴリズムを用いたコンピュータ自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドの推定同定を可能にするのに十分な、ウイルス構造ポリペプチドコード核酸配列を含むことができることを理解する。(たとえば、“Basic Local Alignment Search Tool”; Altschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993参照。)したがって、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、配列を含む核酸断片の特異的同定および/または単離を可能にするのに十分な配列を含む。例えば、核酸配列の実質的な部分は、全長核酸配列の少なくとも約20%、例えば、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%を含み得る。上述のように、本開示は、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする部分的または完全な核酸配列を欠いている核酸分子および構築物を提供する。当業者は、本明細書に開示される配列の恩恵を有し、開示された配列の全部または実質的な部分を、本開示の組成物および方法に容易に使用することができる。したがって、本出願は、本明細書に開示される完全配列、例えば、添付の配列表に記載されるもの、ならびに上記で定義したそれらの配列の実質的な部分を含む。
いくつかの実施形態において、改変ウイルスゲノム又はレプリコンRNAは、ウイルス構造タンパク質をコードする配列全体を欠く、例えば、改変ウイルスゲノム又はレプリコンRNAは、ウイルス未改変ゲノム又はレプリコンRNAの構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、1つ以上の発現カセットをさらに含む。原則として、本明細書に開示される核酸構築物は、一般に、任意の数の発現カセットを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される核酸構築物は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの発現カセットを含むことができる。当業者は、「発現カセット」という用語が、コード配列、およびインビボおよび/またはエキソビボで、細胞内のコード配列の適切な転写および/または翻訳を方向付けるのに十分な制御情報を含む遺伝物質の構築物を指すことを理解する。発現カセットは、所望の宿主細胞および/または対象にターゲティングするためのベクターに挿入することができる。したがって、いくつかの実施形態において、用語発現カセットは、用語「発現構築物」と交換可能に使用することができる。いくつかの実施形態において、「発現カセット」という用語は、例えば、プロモーターおよび/または終結シグナルなどの調節要素に作動可能に連結された、タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子、および任意選択で、遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列またはそれらの組み合わせを含む、核酸構築物を指す。
いくつかの実施形態において、発現カセットの少なくとも1つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。したがって、本明細書中で提供される核酸構築物は、例えば、異種核酸配列に作動可能に連結された調節要素(例えば、プロモーター)を含む場合、異種核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる発現ベクターとしての用途を見出すことができる。いくつかの実施形態において、発現カセットの少なくとも1つは、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム(sg)プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、sgプロモーターは、26Sサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、1つ以上の非翻訳領域(UTRs)をさらに含む。いくつかの実施形態において、UTRsの少なくとも1つは、異種UTRである。いくつかの実施形態において、異種UTRsの少なくとも1つは、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、異種UTRのうちの少なくとも1つは、配列番号6の核酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットのうちの少なくとも1つは、対象の遺伝子(GOI)のコード配列を含む。いくつかの実施形態において、GOIのコード配列は、所望の特性に最適化される。例えば、いくつかの実施形態において、GOIのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現に最適化される。ヌクレオチド配列の配列最適化に関して、遺伝暗号の縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく、遺伝子の配列をコードするタンパク質の少なくとも1つの塩基を異なる塩基で置換する可能性を提供する。したがって、本開示の核酸構築物はまた、遺伝暗号の縮重に関連する置換によって、本明細書に開示される任意のポリヌクレオチド配列から変更された任意の塩基配列を有し得る。コドン使用頻度を記載する参考文献は、容易に公開されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主についての発現を最適化するため(例えば、アルファウイルスmRNAにおけるコドン使用を、ヒト、非ヒト霊長類、ハムスター、マウス、またはサルなどの他の生物に好ましいものに変更する)のために作製され得る。したがって、いくつかの実施形態において、GOIのコード配列は、発現に最適化されたコドンの使用を通じて、標的宿主細胞における発現に最適化される。宿主細胞発現に最適な好ましいコドンを用いてGOIをコードする合成核酸配列を構築するための技術は、当技術分野で周知の技術によって、宿主細胞ゲノムの天然タンパク質をコードするためのコドン使用頻度およびそれらの相対存在量の共通性を分析する計算方法によって決定され得る。コドン使用頻度データベース(http://www.kazusa.or.jp/codon)は、哺乳類細胞環境におけるコドン最適化配列の生成に使用することができる。さらに、ある生物の配列を別の宿主生物の最適なコドン使用頻度に変換するためのさまざまなソフトウェアツール、例えばJCatコドン最適化ツール(www.jcat.de)、統合DNAテクノロジー(IDT)コドン最適化ツール(https://www.idtdna.com/CodonOpt)、オプティマイザーオンラインコドン最適化ツール(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)を利用可能である。このような合成配列は、合成核酸分子の構築のために当技術分野で公知の技術によって構築され得、様々な商業ベンダーから入手してもよい。
いくつかの実施形態において、GOIのコード配列は、増強されたRNA安定性および/または発現に最適化される。RNAの安定性は一般にRNAの「半減期」に関係する。「半減期」は、活性、量、または分子数の半分を除去するのに必要な期間に関係する。本開示の文脈において、RNAの半減期は、前記RNAの安定性の指標である。RNAの半減期は、RNAの「発現期間」に影響を与える可能性がある。RNA安定性の増強に使用するための原理、戦略、および方法に関する追加情報は、例えば、Leppek K. et al., Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. bioRxiv. (Preprint). Mar 30, 2021. doi: 10.1101/2021.03.29.437587で知ることができる。
GOIによってコードされるポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであり得、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、GOIは、抗体、抗原、免疫調節物質、酵素、シグナル伝達タンパク質、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号1~4から成る群から選択される核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する改変CHIKVまたは改変SINVをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号1の核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する改変CHIKVまたは改変SINVをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号2の核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する改変CHIKVまたは改変SINVをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号3の核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する改変CHIKVまたは改変SINVをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、配列番号4の核酸配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する改変CHIKVまたは改変SINVをコードする核酸配列を含む。
目的の改変CHIKVまたは改変SINVの配列に対して高度の配列同一性(例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%)を有する核酸配列は、本明細書で同定された配列(例えば、配列番号1~4)または当該技術分野において公知である任意の他のものを用いて、ゲノム配列分析、ハイブリダイゼーション、および/または、それぞれのCHIKVまたはSINVゲノムにおいて同定された配列由来の縮重プライマーもしくは遺伝子特異的プライマーとのPCRにより、同定および/または単離することができる。
B.組み換え細胞
本開示の核酸構築物を宿主細胞に導入して、該核酸分子を含有する組換え細胞を産生することができる。したがって、本明細書に記載の改変CHIKVまたはSINVゲノムをコードする核酸構築物を含有する原核細胞または真核細胞もまた、本開示の特徴である。関連する態様において、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書中で提供される核酸構築物を動物細胞などの宿主細胞に導入することを含む、細胞を形質転換する方法、次いで形質転換細胞を選択またはスクリーニングする方法に関連する。本開示の核酸構築物の細胞への導入は、当業者に公知の方法、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって達成することができる。
一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、組み換え細胞、例えば、本明細書に開示される核酸構築物を含む組み換え動物細胞に関する。核酸構築物は、宿主ゲノムに安定に組み込まれることができ、エピソーム複製されることができ、もしくは安定なまたは一過性の発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞内に存在する。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、核酸構築物は、エピソーム単位として組換え宿主細胞において維持および複製される。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定した組み込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術、またはより正確なゲノム編集技術、例えば、ガイドRNA指向CRISPR/Cas9またはTALENゲノム編集の使用によって完了することができる。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、安定なまたは一過性の発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在する。
いくつかの実施形態において、組換え細胞は、細菌大腸菌などの原核細胞、または昆虫細胞(例えば、蚊細胞またはSf21細胞)、もしくは哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、またはHeLa細胞)などの真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボ、例えば、生体内の組換え細胞、例えば、トランスジェニック対象の細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物または無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、対象は昆虫である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、細胞はエキソビボである。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロである。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1細胞(COS-7)、ヒト胚性腎細胞(例えば、HEK 293またはHEK 293細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)、イヌ腎細胞(MDCK)、バッファローラット肝細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(Hep G2)、マウス乳腺腫瘍(MMT 060562)、TRI細胞、FS4細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、アフリカミドリザル腎細胞(Vero細胞)、ヒトA549細胞、ヒト子宮頸部細胞、 ヒトCHME5細胞、ヒトPER.C6細胞、NS0マウスミエローマ細胞であり、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトHUH-7細胞、ヒトMRC-5細胞、ヒト筋細胞、ヒトリンパ管内皮細胞、ヒトアストロサイト細胞、ヒトマクロファージ細胞、ヒトRAW264.7細胞、マウス3T3細胞、マウスL929細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、ウサギ腎細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、組換え細胞は、昆虫細胞、例えば、昆虫細胞株の細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、Sf21細胞である。さらなる好適な昆虫細胞株としては、非限定的に、昆虫目双翅目、鱗翅目および半翅目から確立された細胞株が挙げられ、異なる組織源から誘導することができる。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、鱗翅目昆虫細胞株の細胞である。過去数十年で、鱗翅目の昆虫細胞株の利用可能性は10年あたり約50株で増加した。利用可能な鱗翅目昆虫細胞株に関するより多くの情報は、例えば、Lynn D.E., Available lepidopteran insect cell lines. Methods Mol Biol. 2007;388:117-38で知ることができ、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、蚊細胞、例えば、ハマダラカ属(An)、アカイエカ属(Cx.)、およびネッタイシマカ(Stegomyia)属内の蚊種の細胞である。本明細書に記載の組成物および方法に適した例示的な蚊細胞株には、以下の蚊種由来の細胞株が含まれる: Aedes aegypti、Aedes albopictus、Aedes pseudoscutellaris、Aedes triseriatus、Aedes vexans、Anopheles gambiae、Anopheles stephensi、Anopheles albimanus、Culex quinquefasciatus、Culex theileri、Culex tritaeniorhynchus、Culex bitaeniorhynchus、およびToxorhynchites amboinensis。好適な蚊細胞株としては、非限定的に、CCL-125、Aag-2、RML-12、C6/26、C6/36、C7-10、AP-61、A.t. GRIP-1、A.t. GRIP-2、UM-AVE1、Mos.55、Sua1B、4A-3B、Mos.43、MSQ43、およびLSB-AA695BBが挙げられる。いくつかの実施形態において、蚊細胞は、C6/26細胞株の細胞である。
別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書に開示される少なくとも1つの組換え細胞を含む細胞培養物、および培養培地である。一般に、培養培地は、本明細書に記載の細胞を培養するための任意の好適な培養培地であり得る。多種多様な上記の宿主細胞および種を形質転換するための技術は、当該技術分野において公知であり、技術文献および科学文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも1つの組換え細胞を含む細胞培養物も、本出願の範囲内にある。細胞培養物を生成および維持するのに適した方法およびシステムは、当該技術分野において公知である。
C.トランスジェニック動物
また、別の態様において、本明細書に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物が提供される。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は、脊椎動物または無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は昆虫である。いくつかの実施形態において、昆虫は蚊である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は、本明細書に記載の目的のタンパク質を産生する。
本開示のトランスジェニック非ヒト宿主動物は、外因性核酸を非ヒト動物のゲノムに導入するための当技術分野で公知の標準的な方法を用いて調製される。いくつかの実施形態において、本開示の非ヒト動物は、非ヒト霊長類である。本開示の組成物および方法に適した他の動物種には、(i)遺伝子組み換えに適し、かつ(ii)抗体応答を生じるために免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列することができる動物が挙げられる。このような種の例としては、非限定的に、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ヒツジおよびウシが挙げられる。トランスジェニック非ヒト動物を調製するためのアプローチおよび方法は、当該技術分野において公知である。例示的な方法としては、前核マイクロインジェクション、DNAマイクロインジェクション、初期胚へのレンチウイルスベクター媒介DNA導入および精子媒介導入、動物の精子(例えばブタ)へのアデノウイルス媒介DNAの導入、レトロウイルスベクター(例えば、鳥類種)、体細胞核移植(例えば、ヤギ内)が挙げられる。トランスジェニック家畜の調製における最先端技術は、Niemann, H. et al. (2005) Rev. Sci. Tech. 24:285-298でレビューされている。
本開示のいくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は、脊椎動物または無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、動物は昆虫である。いくつかの実施形態において、昆虫は蚊である。いくつかの実施形態において、動物は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は非ヒト動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、本開示のトランスジェニック動物は、古典的なランダムゲノム組換え技術を用いて、またはより正確な技術、例えば、ガイドRNA指向のCRISPR/Casゲノム編集、NgAgo(ナトロノバクテリウム・グレゴリ・アルゴノート)によるDNAガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集、TALENsゲノム編集(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)などを用いて作製することができる。いくつかの実施形態において、本開示のトランスジェニック動物は、トランスジェニックマイクロインジェクション技術を用いて作製することができ、相同組換え技術の使用を必要としないため、相同組換えを用いるアプローチよりも調製および選択が容易であると考えられる。別の態様において、本明細書に提供されるのは、目的のポリペプチドを生産するための方法であり、ここで、該方法は、(i)本明細書に開示されるトランスジェニック動物を飼育すること;(ii)トランスジェニック動物または組換え細胞がGOIによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で、本明細書に開示される核酸構築物を含む組換え細胞を培養することを含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、目的のポリペプチドを産生するための方法であり、ここで、該方法は、(i)本明細書に開示されるトランスジェニック動物を飼育すること;(ii)トランスジェニック動物または組換え細胞がGOIによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で、本明細書に開示される核酸構築物を含む組換え細胞を培養することを含む。別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であり、ここで、該方法は、本明細書に開示される核酸構築物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。したがって、本明細書に開示される方法によって産生される組換えポリペプチドもまた、本開示の範囲内にある。
組換えポリペプチドを産生するための開示された方法の非限定な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドを産生するための方法は、産生されたポリペプチドを単離および/または精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生するための方法は、半減期を増加させるように産生されたポリペプチドを構造的に改変することをさらに含む。
D.医薬組成物
本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチドは、組成物(医薬組成物を含む)に組み込むことができる。このような組成物は、一般に、核酸構築物、組換え細胞、本明細書に記載および提供される組換えポリペプチド、および医薬として許容される賦形剤、例えば担体のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、免疫疾患または微生物感染症などの健康状態の予防、治療、または管理のために処方される。例えば、本開示の組成物は、予防用組成物、治療用組成物、または医薬として許容される賦形剤もしくはそれらの混合物を含む医薬組成物として製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、ワクチンとして使用するために製剤化される。いくつかの実施形態において、本出願の組成物は、アジュバントとして使用するために製剤化される。
したがって、一態様において、本明細書中で提供されるのは、医薬として許容される賦形剤および:a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;および/またはc)本開示の組換えポリペプチドを含む医薬組成物である。
本開示の医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される核酸構築物および医薬として許容される賦形剤を含む組成物である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え細胞および医薬として許容される賦形剤を含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に開示される組換えポリペプチドおよび医薬として許容される賦形剤を含む。
いくつかの実施形態において、リポソーム中に製剤化される本開示の組成物。いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子(LNP)中に製剤化される本開示の組成物。いくつかの実施形態において、ポリマーナノ粒子中に製剤化される本開示の組成物。いくつかの実施形態において、組成物は、免疫原性組成物、例えば、対象における免疫応答を刺激することができる組成物である。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アジュバントとして製剤化される。
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性であり、例えば対象における免疫応答を最小的に刺激する組成物である。いくつかの実施形態において、非免疫原性または最小免疫原性組成物は、バイオ治療薬として製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、眼内、直腸内、および経口投与のうちの1つ以上のために処方される。
注射用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォールEL(商標)(BASF, Parsippany, N.J.)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。これらの場合、組成物は無菌であるべきであり、注射性が容易である程度に流動的であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散溶媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール、および/または塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物に含めるのが一般的である。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記に列挙した成分の1種または組合せと共に必要量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散溶媒および上記に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。
いくつかの実施形態において、組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、筋肉内投与、節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、膣内、眼内、直腸内、又は頭蓋内投与のうちの1つ以上のために製剤化される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、対象におけるインターフェロンの産生増加をもたらす。
本開示の方法
本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物のいずれか1つの投与は、増殖性障害(例えば、癌)および慢性感染症(例えば、ウイルス感染症)などの関連する健康状態の治療に使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物は、1つ以上の関連する健康状態を発症する高いリスクを有する、有する疑いのある、または発症するリスクが高い可能性のある個体を治療する方法において使用するための治療薬に組み込まれ得る。例示的な健康状態または疾患としては、非限定的に、癌、免疫疾患、遺伝子治療、遺伝子置換、心血管疾患、加齢に伴う病状、急性感染症、および慢性感染症を含み得る。いくつかの実施形態において、該個体は、医師のケアを受けている患者である。
したがって、一態様において、本明細書中で提供されるのは、免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法であり、該方法は、a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;c)本開示の組換えポリペプチド;および/またはd)本開示の医薬組成物、を含む組成物を対象に投与することを含む。
別の態様において、本明細書中で提供されるのは、予防および/または治療を必要とする対象における健康状態を予防および/または治療するための方法であり、この方法は、a)本開示の核酸構築物;b)本開示の組換え細胞;c)本開示の組換えポリペプチド;および/またはd)本開示のいずれか一項に記載の医薬組成物、を含む組成物を予防的または治療的に対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、健康状態は、増殖性障害又は微生物感染症である。いくつかの実施形態において、対象は、増殖性障害又は微生物感染症に関連する健康状態を有する又はその疑いがある。
いくつかの実施形態において、開示された組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。例えば、本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物は、経口または吸入によって与えることができるが、それらは非経口経路を介して投与される可能性が高い。非経口投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、節内投与、皮内投与、皮下投与、経皮経皮投与(局所投与)、経粘膜投与、膣内投与、眼内投与、直腸内投与が挙げられる。非経口適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る:注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。pHは、一塩基性および/または二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る(例えば、約7.2~7.8のpH、例えば、7.5)。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスやプラスチック製の複数回投与バイアルに封入され得る。
このような本開示の対象核酸構築物、組み換え細胞、組み換えポリペプチド、および/または医薬組成物の投与量、毒性並びに治療有効性は、細胞培養物または実験動物における、例えば、LD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%に治療的に有効な用量)を決定するための標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が一般的に適している。毒性の副作用を示す化合物を使用することもできる一方で、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、副作用を減らすために、当該化合物を患部組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意する必要がある。
例えば、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を処方する際に使用され得る。当該化合物の投与量は、一般に、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本開示の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定されるIC50(例えば、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物は、1日に1回以上~1週間に1回以上(一日おきに一回を含む)投与することができる。当業者は、疾患の重篤度、以前の治療、対象の一般的な健康状態および/または年齢、ならびに存在するその他の疾患を非限定的に含む、特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解する。さらに、本開示の治療有効量の被験体の多価ポリペプチドおよび多価抗体による被験体の治療は、単一の治療を含むことができ、または、一連の治療を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、5日間、8時間毎に投与され、続いて2~14日の休息期間、例えば、9日間、続いて、さらに5日間、8時間毎の投与が続く。核酸構築物および組換えポリペプチドに関して、本開示の核酸構築物または組換えポリペプチドの治療有効量(例えば、有効投与量)は、選択される核酸構築物または組換えポリペプチドに依存する。例えば、患者体重の約0.001~0.1mg/kgの範囲の単回投与量を投与することができる。いくつかの実施形態において、約0.005、0.01、0.05mg/kgを投与することができる。いくつかの実施形態において、患者体重の約0.03μg~300μg/kgの範囲の単回投与量を投与することができる。いくつかの実施形態において、患者体重の約0.3mg~3mg/kgの範囲の単回投与量を投与することができる。
前述のとおり、治療有効量は、健康状態、例えば疾患または感染症を有する者、有する疑いがある者、またはリスクがある者などを対象に投与した場合に、特定の効果を促進するのに十分である治療用組成物の量を含む。いくつかの実施形態において、有効量は、疾患又は感染症の症状の発症を予防若しくは遅延させる、疾患又は感染症の症状の経過を変化させる(例えば、非限定的に、疾患又は感染症の症状の進行を遅らせる)、又は疾患又は感染症の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の事例について、適切な有効量は、ルーチンの実験を用いて当業者によって決定され得ることが理解される。
疾患または感染症の治療のための、開示された治療用組成物を含む治療の有効性は、熟練の臨床医によって決定され得る。しかしながら、疾患または感染症の徴候または症状の少なくともいずれか1つまたはすべてが改善または改良される場合には、治療は効果的な治療とみなされる。有効性は、入院または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体の悪化の減退によっても測定できる(たとえば、疾患または感染症の進行が停止するか、少なくとも遅くなる)。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、および/または本明細書に記載される。治療は、対象または動物(いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む)における疾患または感染症の任意の治療を含み、(1)疾患または感染症を阻害すること、例えば、症状の進行を停止または遅らせること;もしくは(2)疾患または感染症を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすこと;および(3)症状が発症する可能性を予防または低減すること、を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び/又は医薬組成物は、医薬として許容される担体を有する組成物中で、および免疫応答を刺激するのに有効な量で、対象に投与され得る。一般に、対象は、最初の一連の注射(または以下に説明される他の経路の1つを介した投与)によって免疫され、その後、元の一連の投与によって提供される保護を高めるためにブースターを与えられる。最初の一連の注射およびその後のブースターは、対象における免疫応答を刺激するために必要であるような当該用量および当該期間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象におけるインターフェロンの産生増加をもたらす。開示された方法のいくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
上述のように、注射用に適した医薬として許容される担体は、滅菌水溶液(ここで水溶性)または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。これらの場合、組成物は無菌でなければならず、注射性が容易である程度に流動的でなければならない。組成物はさらに、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物のコンタミに対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。
滅菌注射用溶液は、核酸構築物、組換え細胞、および/または組換えポリペプチドを、必要に応じて上記に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要なマウントで組み込むことによって調製し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。
核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物が適切に保護される場合、上記のように、それらは、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与され得る。核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物およびその他の成分は、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に圧縮することも、個体の食事に直接組み込むこともできる。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤などの形態で使用され得る。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物および組換えポリペプチドは、脂質ベースのナノ粒子(LNP)によって細胞または対象に送達され得る。LNPは一般にウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くの人間はウイルス粒子に対する既存の免疫を有している一方で、LNPに対する既存の免疫を有していない。さらに、LNPに対する適応免疫応答が起こりにくく、LNPの反復投与が可能となる。
LNPにおいて使用するために、いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が開発されている。これらには、とりわけC12-200、MC3、LN16、およびMD1が含まれる。例えば、あるタイプのLNPにおいて、GalNAc部分がLNPの外側に結合し、アジアリロ糖タンパク質受容体を介して肝臓に取り込むためのリガンドとして機能する。これらのカチオン性脂質のいずれも、本開示の核酸構築物および組換えポリペプチドの肝臓への送達のためのLNPを製剤化するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、LNPは、1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、または25nm未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子のサイズは、1~1000nm、1~500nm、1~250nm、25~200nm、25~100nm、35~75nm、または25~60nmの範囲であり得る。
LNPは、カチオン性、アニオン性、または中性脂質から製造され得る。融合性リン脂質DOPEや膜成分コレステロールなどの中性脂質を「ヘルパー脂質」としてLNPに含めることができ、トランスフェクション活性とナノ粒子の安定性を高めることができる。カチオン性脂質の制限には、安定性が低く、クリアランスが速いため有効性が低いこと、および炎症性または抗炎症性反応が発生することが含まれる。LNPは、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性および親水性脂質の両方を有し得る。
当該技術分野において公知である任意の脂質または脂質の組合せを、LNPを製造するために使用することができる。LNPの生成に使用される脂質の例は、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-コレステロール、DOTAP-コレステロール、GAP-DMORIE-DPyPE、およびGL67A-DOPE-DMPE-ポリエチレングリコール(PEG)である。カチオン性脂質の例は、DPSC、DPPC、POPC、DOPE、およびSMである。PEG-改変脂質の例は、PEG-DMG、PEG-CerC14、およびPEG-CerC20である。
いくつかの実施形態において、脂質を任意の数のモル比で組み合わせてLNPを生成することができる。さらに、ポリヌクレオチドを脂質と広範囲のモル比で組み合わせてLNPを生成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び/又は医薬組成物は、癌、自己免疫疾患、および/または感染症を発症する危険性が高い可能性がある対象を予防又は治療する方法において使用するための治療組成物に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物は、微生物感染症を発症する高いリスクを有する、有する疑いのある、または発症するリスクが高い可能性がある対象を予防または治療する方法において使用するための治療組成物に組み込まれる。いくつかの実施形態において、微生物感染症は細菌感染症である。いくつかの実施形態において、微生物感染症は、真菌感染症である。いくつかの実施形態において、微生物感染症はウイルス感染症である。
追加の治療法
いくつかの実施形態において、本開示に記載の組成物は、単回療法(単独療法)として、又は少なくとも1つの追加療法(例えば、第2の療法)と組み合わせた第1の療法として、個々に対象に投与される。いくつかの実施形態において、第2の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第2の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法又は手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第1の療法及び第2の療法は、付随して行われる。いくつかの実施形態において、第1の療法は、第2の療法と同時に行われる。いくつかの実施形態において、第1の療法及び第2の療法は、順次投与される。いくつかの実施形態において、第1の治療は、第2の療法の前に投与される。いくつかの実施形態において、第1の療法は、第2の療法の後に投与される。いくつかの実施形態において、第1の療法は、第2の療法の前および/または後に投与される。いくつかの実施形態において、第1の療法及び第2の療法は、交代で投与される。いくつかの実施形態において、第1の療法及び第2の療法は、単一の処方中で共に投与される。
キット
本明細書に記載の方法を実施するための種々のキットも本明細書に提供する。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を誘発するためのキットを提供する。いくつかの他の実施形態は、予防を必要とする被験体における健康状態を予防するためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、治療を必要とする被験体における健康状態を治療する方法のためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で提供および記載される核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物のうちの1つ以上、ならびにそれらを産生および使用するための書面による説明書を含むキットが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、本開示のキットは、提供された核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物のいずれか1つを対象に投与するのに有用な1つ以上の手段をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のキットは、提供された核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または医薬組成物のいずれか1つを対象に投与するために使用される、1つ以上のシリンジ(プレフィルドシリンジを含む)および/またはカテーテル(プレフィルドシリンジを含む)をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、所望の目的のために、例えば、診断、予防、または治療を必要とする対象における健康状態を診断、予防、または治療するために、他のキットの構成要素と同時に又は連続して投与することができる1つ以上の追加の治療薬を有することができる。
上述のキットのいずれかは、1つ以上の追加の試薬をさらに含むことができ、ここで、当該追加の試薬は、希釈緩衝液;再構成溶液、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロール発現ベクター、陰性対照、陽性対照、提供された核酸構築物のインビトロ産生に適した試薬、組換え細胞、組換えポリペプチド、および/または本開示の医薬組成物から選択できる。
いくつかの実施形態において、キットの構成要素は、別々の容器に入れることができる。いくつかの他の実施形態において、キットの構成要素を単一の容器内で組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示される方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。該方法を実施するための説明書は、一般に適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙やプラスチックなどの基板に印刷することができる。説明書は、添付文書としてキット中、キットまたはその構成要素の容器のラベル中(例えば、包装または副包装に関連する)などに存在することができる。説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えばCD-ROM、フロッピーディスク、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。いくつかの例において、実際の説明書はキット中に存在しないが、遠隔の情報供給源から(例えば、インターネットを介して)説明書を得るための手段を提供することができる。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができるおよび/または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録することができる。
本開示で言及された全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個々に示した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用された任意の参考文献は先行技術を構成することが認められない。参考文献の議論は、著者が主張することを述べており、出願者は引用文献の正確性および関連性に異議を唱える権利を留保する。科学雑誌の記事、特許文献、および教科書を含む多くの情報源が本明細書で参照されているが、この参照は、これらの文献のいずれかが当技術分野における技術常識の一部を形成することを認めるものではないことが、明確に理解される。
本明細書で与えられる一般的な方法の議論は、例示のみを目的としている。他の代替方法および代替は、本開示の検討時に当業者には明らかであり、本出願の精神および範囲に含まれるべきである。
さらなる実施形態は、例示として提供される以下の実施例においてさらに詳細に開示され、本開示または特許請求の範囲を限定することを意図しない。
本開示の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業者に周知である。このような技術は、例えば以下の文献において十分に説明されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (jointly referred to herein as “Sambrook”); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); and Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V
さらなる実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されるが、これらは例示として提供され、本開示または特許請求の範囲を限定することを意図していない。
実施例1.CHIKVベクターの構築
この実施例は、目的の遺伝子、例えば(i)インフルエンザAウイルスH5N1のヘマグルチニン前駆体(HA)、または(ii)エストロゲン受容体α(ESR1)、上皮成長因子受容体2(HER2)、およびヒト上皮成長因子受容体(HER3)などの腫瘍学に関連する遺伝子または遺伝子の一部、またはアカホタルルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子、またはインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1RA)またはインターロイキン-12(IL12)などのサイトカインをコードする合成配列カセットの発現のために、後に使用される多数のベースCHIKVベクター(例えば、異種遺伝子なし)を構築するために実施された実験の結果を記載する。あるいは、ヒトパピローマウイルス(HPV)E6/E7遺伝子も使用することができる。
公的に入手可能なアルファウイルスゲノムデータは、構造タンパク質をコードする核酸配列を目的の遺伝子(GOI)で直接置換して自己複製RNAおよび導入遺伝子発現レプリコンをもたらし得るヌクレオチド配列を常に提供するとは限らない、という最初の観察がなされた。以下でより詳細に説明するように、CHIKV株S27(Genbank AF369024)の構造ポリタンパク質遺伝子を合成HPV E6/E7遺伝子(ヒトパピローマウイルス E6/E7遺伝子) (例えば、図2C参照)、インフルエンザAウイルスH5N1由来のヘマグルチニン(HA)遺伝子(例えば、図3B参照)、または赤色ホタルルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることは可能であり、トランスフェクトされたBHK-21細胞においてRNA複製および導入遺伝子発現が可能なレプリコンを作製するために使用できたが、CHIKV株DRDE-06(Genbank EF210157)の構造ポリタンパク質遺伝子において同様に置換するために使用された同じ合成配列は、RNA複製を受けることも導入遺伝子を発現することもできなかった。したがって、利用可能な公開されている配列を使用してCHIKV構造タンパク質を異種遺伝子に単純に置き換えることは、機能的レプリコンの生成に不十分ではない可能性がある。別の言い方をすれば、ワクチンや治療薬での使用に適したレプリコンシステムを作成するには、異種の5'および/または3'UTR配列を使用するなどのさらなる操作が必要になる可能性がある。
以下でより詳細に説明するように、CHIKV株S27およびDRDE-06のゲノムにわたって見出される、配列における多数の進化的相違にもかかわらず、本明細書に提示される実験データは、DRDE 3' UTRをCHIKV株S27由来の3' UTRで置換することによって、機能的CHIKV株DRDEレプリコンが生成され得ることを実証した(例えば、図2C参照)。
これらの実験において、ベースCHIKVベクター(S27およびDRDE-06)を、CHIKV構造遺伝子のコード配列の代わりに、固有の制限酵素切断サイト(SpeI、5'-A'CTAG,T-3')を有する参照配列(株S27およびDRDE-06について、それぞれGenbank AF369024およびEF210157)由来の4つの~4kb部分(Twist Bioscience, Thermo Fisher GeneArt)で、初めから合成した(ここで、5'Aは構造ポリタンパク質のATG開始コドンの位置と一致し、3'Tは構造ポリタンパク質の終止コドンTAAの位置と一致する)。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’;配列番号7)は、CHIKVゲノム配列の上流に含まれ、下流には(37-A)ポリA配列とそれに続くT7ターミネーター配列(5'-AACCCCTCTCTAAACGGGGGGTTTTTTTT-3';配列番号8)、それに続く特有の制限酵素切断サイト(NotI、5'-GC’GGCC,GC-3')が含まれる。これらの部分は、5ピースのGibson Assembly(登録商標)反応において、線状化されたpYL骨格と4つの合成フラグメントとを組み合わせて、CHIKVベースベクターを生成した。得られたCHIKV S27およびCHIKV DRDEベースベクターは、それぞれ配列番号1および配列番号2である。配列番号1は、S27 5' UTRおよびS27 3' UTR配列を含むCHIKV S27ベースベクターに対応する。配列番号2は、DRDE 5' UTRおよびDRDE 3' UTR配列を含むCHIKV DRDEベースベクターに対応する。このCHIKV DRDEベースベクターは複製を受けることができないことが観察された。
改変CHIKV DRDE ベースベクターを以下のように構築した。CHIKV DRDEベクター(図3C)は、DRDE-06ベースベクターのSpeIおよびNotI制限酵素処理によって構築され、2ピースのGibson Assembly(登録商標)反応で、線状化された骨格と、3' UTR(配列番号6)、polyA、およびT7ターミネーター配列(配列番号8)を含むCHIKV S27ベクター由来のPCR産物とを組み合わせた。得られたCHIKV DRDEベースベクターは、配列番号3である。このCHIKV DRDEベースベクターは、DRDE 5’ UTRおよびS27 3’ UTR配列を含み、複製を受けることができるとわかった。
発現レポーター遺伝子をコードするCHIKVベクターは、以下のように構築された。赤色ホタルルシフェラーゼ(rFF)レポーター遺伝子を合成し、SpeI制限エンドヌクレアーゼ処理および線状化されたベースベクターに相同末端を有するrFF遺伝子を含むPCR産物との2フラグメントGibson Assembly(登録商標)反応により、上記のCHIKVベースベクターに挿入した。
CHIKV S27ベクター(図2B)は、S27ベースベクターのSpeI制限酵素処理によって構築され、線状化骨格および合成HPV E6 / E7遺伝子を含むPCR産物との2ピースのGibson Assembly(登録商標)反応において結合された。
CHIKV DRDE ベクター (図2C) は、DRDEベースベクターのSpeIおよびNotI制限酵素処理によって構築され、(i)線状化骨格、(ii)合成HPV E6/E7遺伝子を含むPCR 産物、および(iii)3' UTR (配列番号6)、polyA、およびT7ターミネーター配列(配列番号8) を含むCHIKV S27ベクター由来のPCR産物を、3ピースのGibson Assembly(登録商標)反応で組み合わせた。
HAを発現するCHIKVベクターは、以下のように構築された。インフルエンザ由来のヘマグルチニン(HA)遺伝子(Genbank AY651334)をヒト発現用にインシリコでコドン最適化/リファクタリングし、はじめから合成し(IDT)、SpeI制限エンドヌクレアーゼ処理、および線状化されたベースベクターに相同末端を有するHA遺伝子を含むPCR産物との2フラグメントGibson Assembly(登録商標)反応によって上記のCHIKVベースベクターに挿入した。得られたCHIKV S27およびCHIKV DRDEベクターを図3Bおよび図3Cにそれぞれ記載する。
SpeI制限エンドヌクレアーゼ処理、および線状化ベースベクターに対する相同末端を有する合成カセットを含むPCR産物との、2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)反応による、上述のCHIKVベースベクターへの合成カセットの挿入によって、ヒトIL-1RAおよびIL-12の発現カセットをコードするCHIKVベクターを同様に構築した。
腫瘍学に関連するポリペプチドを発現するCHIKVベクターは、相同末端を有する、ESR1、HER2、およびHER3由来の配列を含むPCR産物の2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)手順(Gibson et al., Nat. Methods 6, 343-345, 2009)によって同様に構築された。得られたCHIKV S27およびCHIKV DRDEベクターを図3Fおよび図3Gにそれぞれ記載する。
対照VEEベクター(図2A、図3A、図3Eに記載)、rFFレポーター、ならびにヒトIL-1RAおよびIL-12カセットを、CHIKVベースベクターについて上記と同様に構築した。 対照VEEベクターを、参照配列(Genbank L01443)からはじめから合成した。
実施例2.SINVベクターの構築
本実施例は、目的の遺伝子(例えば、インフルエンザAウイルスH5N1のヘマグルチニン前駆体(HA)、またはESR1、HER2、およびHER3などの腫瘍学に関連する遺伝子もしくは遺伝子の一部、または赤色ホタルルシフェラーゼ、またはIL-1RAやIL12などのサイトカインをコードする合成配列カセット) の発現のために、後に使用される多数のベースSINVベクター(例えば、異種遺伝子なし)の設計および構築を記載する。あるいは、ヒトパピローマウイルス(HPV)E6/E7遺伝子も使用することができる。
ベースSINV Girdwoodベクターを、SINV構造遺伝子のコード配列の代わりに、固有の制限酵素切断サイト(SpeI、5'-A'CTAG,T-3')を有するGirdwood株参照配列(Genbank MF459683)由来の4つの~4kb部分(Twist Bioscience, Thermo Fisher GeneArt)で、初めから合成した(ここで、5'Aは構造ポリタンパク質遺伝子のヌクレオチド93に続くP2A配列の後の次のヌクレオチドであり、3'Tは構造ポリタンパク質の終止コドンTGAの位置と一致する)。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’;配列番号7)は、SINVゲノム配列の上流に含まれ、下流には(37-A)ポリA配列とそれに続くT7ターミネーター配列(5'-AACCCCTCTCTAAACGGGGGGTTTTTTTT-3';配列番号8)、それに続く特有の制限酵素切断サイト(NotI、5'-GC’GGCC,GC-3')が含まれる。これらの部分は、5ピースのGibson Assembly(登録商標)反応(例えば、線状化されたpYL骨格および4つの合成フラグメント)で組み合わされて、SINV Girdwoodベースベクター(配列番号4)を生成した。
ベースSINV AR86ベクターを、SINV構造遺伝子のコード配列の代わりに、固有の制限酵素切断サイト(SpeI、5'-A'CTAG,T-3')を有するAR86株参照配列(Genbank U38305)から4つの~4kb部分(Twist Bioscience, Thermo Fisher GeneArt)で、初めから合成した(ここで、5'Aは構造ポリタンパク質遺伝子のヌクレオチド93に続くP2A配列の後の次のヌクレオチドであり、3'Tは構造ポリタンパク質の終止コドンTGAの位置と一致する)。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’;配列番号7)は、SINVゲノム配列の上流に含まれ、下流には(37-A)ポリA配列とそれに続くT7ターミネーター配列(5'-AACCCCTCTCTAAACGGGGGGTTTTTTTT-3';配列番号8)、それに続く特有の制限酵素切断サイト(NotI、5'-GC’GGCC,GC-3')が含まれる。これらの部分は、5ピースのGibson Assembly(登録商標)反応(例えば、線状化されたpYL骨格および4つの合成フラグメント)で組み合わされて、SINV AR86ベースベクターを生成する(機能性を改善するための追加の改変も含まれる)。
発現レポーター遺伝子をコードするSINVベクターは、以下のように構築した。赤色ホタルルシフェラーゼ(rFF)レポーター遺伝子を合成し、SpeI制限エンドヌクレアーゼ処理、および線状化ベースベクターに対する相同末端を有するrFF遺伝子を含むPCR産物との2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)反応により、上記のSINVベースベクターに挿入した。
図3Dに記載のSINVベクターは以下のように構築した。インフルエンザ由来のヘマグルチニン(HA)遺伝子(Genbank AY651334)をヒト発現用にインシリコでコドン最適化/リファクタリングし、はじめから合成し(IDT)、SpeI制限酵素処理、およびベースベクターに相同末端を有するHA遺伝子を含むPCR産物との2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)反応によって上記のSINV Girdwoodベースベクターに挿入して、最終ベクターを得た。別の実験において、コドン最適化HA遺伝子を含むSINV AR86ベクターを、上記の実施例2に記載したSINV AR86ベースベクターを用いて同様に構築した(データは示さない)。
SpeI制限エンドヌクレアーゼ処理、および線状化ベースベクターに対する相同末端を有する合成カセットを含むPCR産物との2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)反応による、上述のSINVベースベクターへの合成カセットの挿入により、ヒトIL-1RAおよびIL-12の発現カセットをコードするSINVベクターを同様に構築した。
腫瘍学に関連するポリペプチドを発現するSINVベクターは、SpeI線状化ベースSINVベクターに対する相同末端を有するESR1、HER2、およびHER3由来の配列を含むPCR産物の2フラグメントのGibson Assembly(登録商標)反応によって同様に構築された。SINV Girdwoodベクターの概略図を図3Iに記載する。
実施例3.改変CHIKVおよびSINVベクターのインビトロ評価
この実施例は、上記の実施例1および2に記載される合成CHIKVおよびSINVレプリコン構築物の発現レベルを評価し、その任意の差異的な挙動(例えば、複製およびタンパク質発現)を調査するために実施されたインビトロ実験の結果を記載する。
これらの実験において、以下のアルファウイルスに由来する合成レプリコン構築物が設計され、続けて評価された:VEE、CHIKV S27、CHIKV DRDE、SINV AR86、およびSINV Girdwood。
インビトロ転写:RNAは、5'ARCAキャップ(HiScribe(商標) T7 ARCA mRNA kit、NEB)、またはキャップなし転写(HiScribe(商標) T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB)のいずれかを有する、バクテリオファージT7ポリメラーゼを用いたインビトロ転写、続いて5'キャップ1(Vaccinia Capping System, mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase, NEB)を添加することによって調製した。次に、フェノール/クロロホルム抽出、またはカラム精製(Monarch(登録商標) RNA Cleanup Kit, NEB)を用いてRNAを精製した。RNA濃度は、260nmでの吸光度(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific)により決定した。
複製:RNAをエレクトロポレーションによりBHK-21またはVero細胞(例えば、4D-Nucleofector(商標)、Lonza)に形質転換した。形質転換後18~20時間で、細胞を固定および透過処理し(eBioscience(商標) Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set、Invitrogen)、続いてPE標識抗dsRNAマウスモノクローナル抗体(J2、Scicons)を用いて染色し、蛍光フローサイトメトリーによってdsRNA+細胞の頻度および個々の細胞におけるdsRNAの平均蛍光強度(MFI)を定量化した。
タンパク質発現:RNAをエレクトロポレーションによりBHK-21またはVero細胞(例えば、4D-Nucleofector(商標)、Lonza)に形質転換した。形質転換後18~20時間で、導入遺伝子の発現を定量化した。rFFを発現するレプリコンについて、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステムプロトコル(Promega)を用いて定量化した(図4)。これらのレプリコントランスフェクト細胞からの発光の検出は、レプリコンがRNA複製を受け、目的の遺伝子(GOI)を発現することができたことを示している。本実施例において、GOIは生物学的機能を発揮するレポーター酵素である。代替実験において、細胞を固定および透過処理し(eBioscience(商標) Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set、Invitrogen)、FITC結合抗LAMP1マウスモノクローナル抗体(HA3、BioLegend)を使用して染色して、蛍光フローサイトメトリーによって個々の細胞におけるLAMP融合タンパク質+細胞の頻度およびLAMP融合タンパク質の平均蛍光強度(MFI)を定量化することができる。
IL-12を発現するレプリコンについて、培地を細胞から収集し、IL-12をELISA(R&D Biosystems)またはIL-12生物活性アッセイ(Promega)によって定量した。IL-1RAを発現するレプリコンについて、培地を回収して、IL-1RAをELISA(R&D Biosystems)またはHEK-Blue(商標) IL-1R細胞(InvivoGen)を用いた生物活性アッセイで定量した。HEK-Blue(商標) IL-1R細胞は、IL-1Bに応答してSEAPを発現する。まず、5E4 HEK-Blue(商標) IL-1R細胞を96ウェルプレート上にウェル当たりで播種した。HEK-Blue(商標) IL-1R細胞を、段階希釈の試験培地とともに、同型ウェル中で40分間インキュベートした。標準曲線を生成するために、HEK-Blue(商標) IL-1R細胞を、決定された濃度の組換えIL-1RA(Peprotech)と共に同型ウェル中で40分間インキュベートした。次いで、組換えIL-1B(InvivoGen)を最終濃度1ng/mlとなるように各ウェルに添加した。翌日、QUANTI-Blue(商標)溶液(InvivoGen)を用いてSEAP発現を定量し、IL-1RA生理活性を定量した。
追加の実験:BHK-21またはVero細胞を、RNAのエレクトロポレーションに先立って組換えインターフェロン(IFN)で前処理し、各ベクターについての複製およびタンパク質発現に対する影響を、上述のアッセイを用いて測定する。
実施例4.改変CHIKVおよびSINVベクター―インフルエンザのインビボ評価
この実施例は、上記の実施例1および2に記載される合成CHIKVおよびSINVレプリコン構築物(例えば、非製剤化およびLNP製剤ベクターの両方)によるワクチン接種後の任意の差次的免疫応答を評価するために実施されたインビボ実験の結果を記載する。
これらの実験において、以下のアルファウイルスに由来する合成レプリコン構築物が設計され、続いて評価された:VEE、CHIKV S27、CHIKV DRDE、SINV AR86、およびSINV Girdwood。
マウスおよび注射:雌のBALB/cマウスを、Charles River Labs、Envigo、またはJackson Laboratoriesから購入した。投与当日、10μg(単回投与群、すなわちプライムのみ)または5μg(2回投与群、すなわちプライムブースト)の材料を両方の大腿四頭筋に筋肉内注射した。ベクターは、生理食塩水中で製剤化されていない、またはLNP製剤化されているものを投与した。動物は、研究の過程を通して体重およびその他の一般的な観察についてモニタリングされた。免疫原性試験の場合、動物は0日目と21日目に投与された(2つの投与群のみ)。脾臓を14日目(10 μg単回投与群)および35日目(5 μg単回投与群)に採取し、血清を14日目と35日目に分離した。タンパク質発現試験の場合、動物は0日目に投与され、生物発光は1、3、および7日目に評価し得る。ルシフェラーゼ活性のインビボイメージングは、示された時点でIVISシステムを使用して行うことができる。
LNP製剤化:レプリコンRNAを、マイクロフルイディクスミキサーを用いて脂質ナノ粒子中に製剤化し、動的光散乱および封入効率を用いて粒子サイズ、多分散性について分析した。本実施例において、LNP粒子を製剤化する際に使用された脂質のモル比は、35% C12-200、46.5% コレステロール、2.5% PEG-2Kおよび16% DOPEであった。
ELISpot:免疫化後のT細胞応答の検出のために、マウスIFN ELISpotキット(Mabtech)を、製造業者のプロトコールに従って使用した。簡単に説明すると、単一の脾細胞懸濁液を調製し、以下の刺激条件でAIM V培地に5×106 細胞/mlで播種した:培地のみ(模擬)、PMAおよびイオノマイシン(陽性対照)、並びにインフルエンザA/ベトナム/2004/1203(H5N1)由来HA由来のCD4(KSSFFRNVVWLIKKN)(配列番号9)およびCD8(IYSTVASSL)(配列番号10)ペプチド。ペプチドは1~10μg/mlの最終濃度で使用した。スポット形成ユニットを画像化し、定量化し、100万細胞あたりでプロットした。
HPV特異的T細胞応答の大きさは、以下のように測定することができる:IFNγ ELISpot分析は、製造業者の指示に従って、Mouse IFNγ ELISpot PLUS Kit (HRP)(MabTech)を用いて行うことができる。簡単に言うと、脾細胞を単離して、HPVに対するCD4+またはCD8+ T細胞エピトープのいずれかに相当するペプチド、陽性対照としてのPMA/イオノマイシン、または模擬刺激としてのDMSOを含む培地中で、5×106 細胞/mLの濃度で再懸濁することができる。
細胞内サイトカイン染色法。脾臓はELISpotsで概説した方法に従って単離することができ、1×106細胞を、ウェルあたり総容量200 μLの培地を含む細胞に添加することができる。各ウェルには、HPVに対するCD4+またはCD8+ T細胞エピトープのいずれかに相当するペプチド、陽性対照としてのPMA/イオノマイシン、または模擬刺激としてのDMSOを含めることができる。1時間後、GolgiPlug(商標)protein transport inhibitor (BD Biosciences)を各ウェルに添加することができる。細胞はさらに5時間インキュベートすることができる。インキュベーション後、標準的な方法を用いて、CD8+(53-6.7)、CD4+(GK1.5)、B220(B238128)、Gr-1(RB6-8C5)、CD16/32(M93)について細胞を表面染色することができる。表面染色に続いて、IFNγ(RPA-T8)、IL-2(JES6-5H4)、およびTNF(MP6-XT22)の標準的な方法に従って、細胞を固定し、細胞内タンパク質を染色することができる。その後、細胞をフローサイトメーターで分析し、取得したFCSファイルを、FlowJoソフトウェアバージョン10.4.1を使用して分析できる。
抗体。総HPV E6/E7特異的IgGを測定するための抗体反応は、製造元の指示に従って、Alpha Diagnostic InternationalのELISAキットを使用して測定できる。
赤血球凝集阻害アッセイ(HAI):血清を調製するために、製造元の指示に従ってRDE溶液を調製した。未使用の溶液は、1mLのアリコートで-15 ℃~-25 ℃で最大1年間保存できる。別々の微量遠心チューブ中の試験を受ける各サンプルおよび陽性対照について血清20μLをピペッティングした。80μL RDEを各チューブに加えた。追加の血清が必要な場合は、同じ比率(例:40μL血清および160μL RDE)を使用するようにして量を増やすことができる。高力価の血清および陽性対照は、RDEを添加する前に事前に希釈することができる(例:5μLの血清と20μL PBS + 100μL RDE)。サンプルおよび陽性対照を37 ℃±1 ℃の水浴中で18~20時間インキュベートした(1日目)。血清およびRDEは,56 ℃±2 ℃の水浴中で35~45分間加熱することにより不活化した(2日目)。血清を短時間遠心分離して、チューブの蓋から結露を除去した。100μL 1× PBSを、100μLの処理血清ごとに1:10の開始希釈で添加した。ウイルスを1× PBS / 0.75% BSA中で4赤血球凝集ユニット/ 25μLに希釈し、湿氷上に静置した。対照プレートについては、25 μL PBSを96ウェルVボトムプレートの列9~10に添加した。50μLのOBSを列11~12(行C~Hのみ)に追加した。サンプルプレートの場合、25μL PBSを行B~H(列1~12)のすべてのウェルに添加した。50μLの血清サンプルを、行Aの隣接する同型ウェルに添加した。25μLの陰性対照血清を対照プレート上のウェル11A、11B、12A、12Bに添加した。25μLの陽性対照を対照プレート上のウェル9Aおよび10Aに添加した。サンプルプレートで、行A(列1~12)を3~4回混合した。25μLをB列に移し、H列まで2倍希釈を続けた。行Hから25μLを除去した。対照プレート上で、行A(列1~10)を3~4回混合した。25μLを行Bに移し、行Hまで2倍希釈を続けた。行Hから25μLを廃棄した。25μLの希釈ウイルスをサンプルプレートのすべてのウェルと対照プレートの列9~10に添加した。ウイルスを、対照プレート上のウェル11A、11B、12A、および12Bにも添加した。50μL希釈したウイルスをウェル11Eおよび12Eに添加し、3~4回混合し、ウェル11Hおよび12Hに対して2倍希釈を行った。プレートを室温で50~60分間インキュベートした。50μL 1.1% HRBCをすべてのウェルに添加した。プレートを室温で50~60分間インキュベートした。プレートを傾けて凝集パターンを読み取る。
CHIKV-およびSINV-由来ベクターのインビボでの影響を評価するために、この実験において、それらを、この分野内で一般的に使用されているTC-83に由来するVEE合成レプリコンと比較した。この例では、LNP製剤化材料は、各ベクターにわたる全ての動物において単回投与の14日後にHAI力価を示す。同様に、すべてのLNP製剤化ベクターは、ELISpot分析によって測定された脾臓において、CD4+およびCD8+ HA特異的T細胞応答の両方を生じた。ここで、CHIKV-およびSINV-由来のベクターのいくつかは、どのエピトープが刺激に使用されているかに応じて、CD4+またはCD8+ T細胞応答を有意に改善したことが観察された(図5A~5B)。これは、CHIKVおよびSINV由来のベクター自体が、常同的なVEEベースのベクターと比較して特異的な反応を生じることを実証した。コードされたタンパク質に対するより高いT細胞および抗体応答はワクチンとしての使用に望ましい一方、コードされたタンパク質に対するより低いT細胞および抗体応答はバイオ医薬品にとって好ましい可能性がある。
実施例5.改変CHIKVおよびSINVベクターのインビボ評価―腫瘍学
この実施例は、上記の実施例1および2に記載される合成CHIKVおよびSINVレプリコン構築物(例えば、非製剤化およびLNP製剤ベクターの両方)を伴うワクチン接種後の任意の差次的免疫応答を評価するために実施されたインビボ実験の結果を説明する。これらの実験において、以下のアルファウイルスに由来する合成レプリコン構築物が設計され、続けて評価された:VEE、CHIKV S27、CHIKV DRDE、SINV AR86、およびSINV Girdwood。
マウスおよび注射:雌のBALB/cマウスは、Charles River Labs、Envigo、またはJackson Laboratoriesから購入した。投与当日、10μgの材料を両方の大腿四頭筋に分割して筋肉内注射した。ベクターは、生理食塩水中で製剤化されていない、またはLNP製剤化されているものを投与した。動物は、研究の過程を通して体重およびその他の一般的な観察についてモニタリングされた。免疫原性試験の場合、動物は0日目と21日目に投与された。脾臓は35日目で採取した。
LNP製剤化:レプリコンRNAを、マイクロフルイディクスミキサーを用いて脂質ナノ粒子中に製剤化し、動的光散乱および封入効率を用いて粒子サイズ、多分散性について分析した。LNP粒子を製剤化する際に使用された脂質のモル比は、35% C12-200、46.5% コレステロール、2.5% PEG-2Kおよび16% DOPEであった。あるいは、Precision Nanosystems, Inc.によって提供されるものなど、別の実体から得られた、即時使用できる脂質の製剤を使用することができる。
ELISpot。ESR1、HER2、またはHER3特異的T細胞応答の大きさを測定するために、製造元の指示に従ってマウスIFNγ ELISpot PLUSキット(HRP)(MabTech)を使用してIFNγ ELISpot分析を実施した。簡単に説明すると、脾細胞を単離し、ESR1に対するCD4+またはCD8+ T細胞エピトープのいずれかに相当するペプチド(例えば、表1参照)、およびHER2 ECDについてのペプチドライブラリ、ポジティブコントロールとしてのPMA/イオノマイシン、または模擬刺激としてのDMSOのいずれかを表すペプチドを含む培地中で5×106細胞/mLの濃度に再懸濁した(図6)。
CHIKV-およびSINV-由来ベクターのインビボでの影響を評価するために、この実験において、それらを、この分野内で一般的に使用されているTC-83に由来するVEE合成レプリコンと比較した。この例では、いくつかの活性化ネオアンチゲン変異(変異を中心として~31-merペプチドとしてコードされる)が、ESR1およびPI3K、切断された腫瘍関連抗原(HER2の細胞外および膜貫通ドメイン、すなわちERBB2遺伝子)、ならびに同じ骨格上のキナーゼ死腫瘍関連抗原(HER3、すなわちERBB3遺伝子)についてコードされた。インフルエンザ試験と同様に、すべてのLNP製剤ベクターは、ESR1変異およびHER2に対するマウスの一部またはすべてにおいてT細胞応答を示した。ELISpotによって測定された総T細胞応答の大きさは、各抗原によって異なる。しかしながら、個々の抗原に対する応答の範囲内で、個々のベクターがVEEと有意に異なる場合もあれば、各ベクターがVEEと同等に性能を発揮する場合もある(図6)。これは、新しいCHIKV-およびSINV-ベクターがVEEとは異なる性能を発揮することを確認し、実施例4と組み合わせると、その差異がコードされたタンパク質にも依存して予測不可能であることを実証する。これにより、これらのベクターが標的ごとにワクチンまたはバイオ医薬品のいずれかに有利であることが裏付けられる。
本開示の特定の代替が開示されているが、様々な改変および組合せが可能であり、添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲内で企図されることを理解されたい。したがって、本明細書に提示される正確な要約および開示に制限の意図はない。
Claims (54)
- 改変チクングニアウイルス(CHIKV)ゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、前記改変CHIKVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている前記核酸構築物。
- 改変シンドビスウイルス(SINV)ゲノムまたはレプリコンRNAをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、前記改変SINVゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている前記核酸構築物。
- 前記改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分を欠いている、請求項1~2のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記改変ウイルスゲノムまたはレプリコンRNAは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 1つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 発現カセットのうちの少なくとも1つが、異種核酸配列に作動可能に連結されたサブゲノム(sg)プロモーターを含む、請求項5に記載の核酸構築物。
- 前記sgプロモーターが26Sサブゲノムプロモーターである、請求項6に記載の核酸構築物。
- 1つ以上の非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記UTRの少なくとも1つが異種UTRである、請求項8に記載の核酸構築物。
- 発現カセットの少なくとも1つが、目的の遺伝子(GOI)のコード配列を含む、請求項5~9のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記GOIは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項10に記載の核酸構築物。
- 前記GOIが、抗体、抗原、免疫調節物質、酵素、シグナル伝達タンパク質、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項10~11のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記GOIのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現に最適化されている、請求項10~12のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸配列は、配列番号1~4からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する、請求項1~13のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む組換え細胞。
- 前記組換え細胞が真核細胞である、請求項15に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞が動物細胞である、請求項16に記載の組換え細胞。
- 前記動物細胞が脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である、請求項17に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞が昆虫細胞である、請求項18に記載の組換え細胞。
- 前記昆虫細胞が蚊細胞である、請求項19に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項18に記載の組換え細胞。
- 前記組換え細胞が、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1細胞(COS-7)、ヒト胚性腎細胞(例えば、HEK 293またはHEK 293細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)、イヌ腎細胞(MDCK)、バッファローラット肝細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(Hep G2)、マウス乳腺腫瘍(MMT 060562)、TRI細胞、FS4細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、アフリカミドリザル腎細胞(Vero細胞)、ヒトA549細胞、ヒト子宮頸部細胞、 ヒトCHME5細胞、ヒトPER.C6細胞、NS0マウスミエローマ細胞であり、ヒト表皮喉頭細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトHUH-7細胞、ヒトMRC-5細胞、ヒト筋細胞、ヒトリンパ管内皮細胞、ヒトアストロサイト細胞、ヒトマクロファージ細胞、ヒトRAW264.7細胞、マウス3T3細胞、マウスL929細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、ウサギ腎細胞からなる群から選択される、請求項18に記載の組換え細胞。
- 請求項15~22のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組換え細胞、及び培養培地を含む、細胞培養物。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック動物。
- 前記動物が脊椎動物または無脊椎動物である、請求項24に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物が昆虫である、請求項25に記載のトランスジェニック動物。
- 前記昆虫が蚊である、請求項26に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物が哺乳動物である、請求項25に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物が非ヒト哺乳動物である、請求項28に記載のトランスジェニック動物。
- (i)請求項24~29のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物を飼育するステップ、又は(ii)請求項11~14のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む組換え細胞を培養するステップを含む、前記トランスジェニック動物または前記組換え細胞がGOIによってコードされるポリペプチドを産生する条件下での、目的のポリペプチドの産生方法。
- 請求項11~14のいずれか一項に記載の核酸構築物を対象に投与することを含む、対象における目的のポリペプチドの産生方法。
- 前記対象が脊椎動物または無脊椎動物である、請求項31に記載の方法。
- 前記対象が昆虫である、請求項31~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が哺乳動物対象である、請求項31~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項34に記載の方法。
- 請求項30~35のいずれか一項に記載の方法により産生された組換えポリペプチド。
- 医薬として許容される賦形剤、及び
(a)請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物;
(b)請求項15~22のいずれか一項に記載の組換え細胞;及び/又は
(c)請求項36に記載の組換えポリペプチド:
を含む医薬組成物。 - 請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物、および医薬として許容される賦形剤を含む、請求項37に記載の医薬組成物。
- 請求項15~22のいずれか一項に記載の組換え細胞、および医薬として許容される賦形剤を含む、請求項37に記載の医薬組成物。
- 請求項36に記載の組換えポリペプチド、および医薬として許容される賦形剤を含む、請求項37に記載の医薬組成物。
- 前記組成物は、リポソーム、脂質ベースのナノ粒子(LNP)、またはポリマーナノ粒子中に製剤化される、請求項37~40のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が免疫原性組成物である、請求項37~41のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記免疫原性組成物がワクチンとして製剤化されている、請求項42に記載の医薬組成物。
- 前記組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性である、請求項37~41のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物がアジュバントとして製剤化されている、請求項37~44のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内投与、腫瘍内投与、関節内投与、静脈内投与、皮下投与、膣内投与、眼内投与、直腸内投与、および経口投与のうちの1つ以上のために製剤化される、請求項37~45のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 免疫応答の誘発を必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法であって、
(a)請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物;
(b)請求項15~22のいずれか一項に記載の組換え細胞;
(c)請求項36に記載の組換えポリペプチド;及び/又は
(d)請求項37~46のいずれか一項に記載の医薬組成物:
含む組成物を対象に投与することを含む、前記方法。 - 予防及び/又は治療を必要とする対象における健康状態を予防及び/又は治療するための方法であって、
(a)請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物;
(b)請求項15~22のいずれか一項に記載の組換え細胞;
(c)請求項36に記載の組換えポリペプチド;及び/又は
(d)請求項37~46のいずれか一項に記載の医薬組成物:
含む組成物を予防的または治療的に対象に投与することを含む、前記方法。 - 前記健康状態が増殖性障害または微生物感染症である、請求項48に記載の方法。
- 前記対象は、増殖性障害または微生物感染症に関連する状態を有する、または有することが疑われる、請求項47~49のいずれか一項に記載の方法。
- 投与された組成物が、対象におけるインターフェロンの産生の増加をもたらす、請求項47~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物は、単回療法(単剤療法)として、または少なくとも1つの追加療法と組み合わせて第1療法として対象に個別に投与される、請求項47~51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および外科からなる群から選択される、請求項52に記載の方法。
- 免疫応答の誘発、予防、および/または健康状態もしくは微生物感染症の治療のためのキットであって、
(a)請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸構築物;
(b)請求項15~22のいずれか一項に記載の組換え細胞;
(c)請求項36に記載の組換えポリペプチド;及び/又は
(d)請求項37~46のいずれか一項に記載の医薬組成物:
を含む、前記キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063059777P | 2020-07-31 | 2020-07-31 | |
US63/059,777 | 2020-07-31 | ||
PCT/US2021/043991 WO2022026885A2 (en) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | Modified chikungunya viruses and sindbis viruses and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023536160A true JP2023536160A (ja) | 2023-08-23 |
Family
ID=80038129
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023506194A Pending JP2023536160A (ja) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | 改変チクングニアウイルス及びシンドビスウイルス並びにそれらの用途 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230398200A1 (ja) |
EP (1) | EP4188941A2 (ja) |
JP (1) | JP2023536160A (ja) |
KR (1) | KR20230076812A (ja) |
CN (1) | CN116802282A (ja) |
AU (1) | AU2021315795A1 (ja) |
CA (1) | CA3186812A1 (ja) |
WO (1) | WO2022026885A2 (ja) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201607787RA (en) * | 2011-06-17 | 2016-11-29 | Bharat Biotech Int Ltd | Vaccine Composition Comprising An Inactivated Chikungunya Virus Strain |
-
2021
- 2021-07-30 JP JP2023506194A patent/JP2023536160A/ja active Pending
- 2021-07-30 AU AU2021315795A patent/AU2021315795A1/en active Pending
- 2021-07-30 CA CA3186812A patent/CA3186812A1/en active Pending
- 2021-07-30 KR KR1020237006805A patent/KR20230076812A/ko unknown
- 2021-07-30 WO PCT/US2021/043991 patent/WO2022026885A2/en active Application Filing
- 2021-07-30 CN CN202180066478.2A patent/CN116802282A/zh active Pending
- 2021-07-30 EP EP21849310.4A patent/EP4188941A2/en active Pending
- 2021-07-30 US US18/007,036 patent/US20230398200A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022026885A2 (en) | 2022-02-03 |
EP4188941A2 (en) | 2023-06-07 |
US20230398200A1 (en) | 2023-12-14 |
KR20230076812A (ko) | 2023-05-31 |
AU2021315795A1 (en) | 2023-02-23 |
WO2022026885A3 (en) | 2022-04-07 |
CN116802282A (zh) | 2023-09-22 |
CA3186812A1 (en) | 2022-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20210065128A (ko) | 아프리카 돼지 열병 바이러스 백신 | |
JP7232225B2 (ja) | 口蹄疫ワクチン | |
US10653769B2 (en) | iDNA vaccines and methods for using the same | |
JP2003502345A5 (ja) | ||
CN107949398A (zh) | 灭活的犬流感疫苗以及其制备方法和其用途 | |
JP2023550666A (ja) | ヌクレオシド修飾mRNAを使用する汎用インフルエンザワクチン | |
CN113151196A (zh) | 重组痘苗病毒、痘苗病毒载体疫苗及其应用与制备方法 | |
US20240181038A1 (en) | Immunogenic compositions | |
CN105143251A (zh) | 流感核蛋白疫苗 | |
US20220023413A1 (en) | Recombinant mumps virus vaccine expressing genotype g fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins | |
JP2023536160A (ja) | 改変チクングニアウイルス及びシンドビスウイルス並びにそれらの用途 | |
KR102211077B1 (ko) | 바이러스 유사 입자를 이용한 슈도-타입 광견병 백신 | |
US11730804B1 (en) | Compositions and methods for the prevention and treatment of rabies virus infection | |
CN116904489B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用 | |
KR20240032932A (ko) | 변형된 동부 말 뇌염 바이러스, 자가-복제 rna 작제물, 및 이의 용도 | |
KR20240051229A (ko) | 이종성 비구조 단백질을 갖는 변형된 알파바이러스 |