CN104902924A - 金黄色葡萄球菌sdre cnab结构域及其用于接种的用途 - Google Patents
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Abstract
金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白含有三个CnaB结构域，并且这些中的第三个提供针对金黄色葡萄球菌感染的显著保护。因此，有用的金黄色葡萄球菌疫苗可包括SdrE CnaB结构域。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可以与SdrE在第三CnaB结构域内含有异肽键的观察联系起来。
Description
本申请要求2012年10月29日提交的UK临时申请1219420.5的权益，其所有的完整内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)免疫原的领域。
背景技术
针对金黄色葡萄球菌的各种疫苗目前正在研究，例如，参见参考文献1。如参考文献2中公开的一种方法使用含有CnaB结构域的多肽。该结构域首次在金黄色葡萄球菌胶原结合表面蛋白中被描述为不介导胶原结合的区域。参考文献2中的图28显示，来自金黄色葡萄球菌SdrD蛋白的CnaB结构域在小鼠模型中赋予针对菌株USA300感染的保护。
本发明的一个目标是提供用于引发针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的进一步且改进的免疫原。
发明内容
参考文献2将金黄色葡萄球菌的SdrD蛋白鉴定为含有CnaB结构域。本发明人已发现，金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白(SdrE)含有三个CnaB结构域('CnaBE1'、'CnaBE2'和'CnaBE3')，并且这些结构域中的第三个提供针对金黄色葡萄球菌感染的显著保护，如肾脓肿形成的减少所表明。此外，本发明人已显示甚至针对不表达SdrE的菌株的交叉保护。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可以与SdrE在其第三CnaB结构域内(即CnaBE3内)含有异肽键的观察联系起来。
在第一个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含全长SdrE蛋白。
在第二个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽具有少于500个氨基酸。
在第三个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段的多肽，其中：(a)所述片段包括SdrE CnaBE3结构域；且(b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白。
在第四个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述CnaB结构域包括异肽键。所述CnaB结构域优选为CnaBE3。
在第五个方面，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代。
类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代。
类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代。
在第六个方面，本发明提供包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：(a)CnaB结构域中的至少一个是CnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrE CnaB结构域；或(b)所述多肽包含至少两个CnaBE3结构域。此类多肽可包含如参考文献2(例如，参见其中第9-13页)中公开的氨基酸序列A(LB)n，条件是至少一个A和/或B是CnaBE3结构域。
本发明的这些多肽可用作用于引起免疫应答例如以保护免于金黄色葡萄球菌感染的免疫原性组合物的组分。
SdrE
金黄色葡萄球菌SdrE蛋白是富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白，如参考文献3-8中更详细地讨论。在金黄色葡萄球菌细菌中，其被锚定在细胞壁中。在Newman NWMN_0525菌株中，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1：
来自许多更多菌株的SdrE序列是本领域已知的。在申请时搜索NCBI多肽序列数据库中的金黄色葡萄球菌SdrE序列揭示73次命中，并且使用SEQ ID NO:1的BLINK搜索给出至少以下菌株的SdrE序列：COL (序列登录号
等。
BLINK命中具有1131-1166个氨基酸，其中该长度变异的大部分源自Ser-Asp重复的长度差异。除了该变异和5聚体PSTSE序列(SEQ ID NO:44)的存在或不存在以外，该序列另外在许多菌株之间是非常高度保守的。因此，新生序列通常可以如下代表：
(式‘A’)
其中：
SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:3为：
SEQ ID NO:4为：
X1是任选的PSTSE序列(SEQ ID NO:44)，且
X2是20-250个氨基酸长且或者是(i) SD的多个重复或(ii) SD和AD序列两者的混合物。
因此，SEQ ID NO:1是式‘A’的实例，其中X1存在且X2是SD的83个重复。
本发明可以使用任何这些已知的SdrE序列。通常，本发明使用的SdrE将包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性(例如，>91%同一性，>92%同一性，>93%同一性，>94%同一性，>95%同一性，>96%同一性，>97%同一性，>98%同一性，>99%同一性，或100%同一性)的序列，并且，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗体识别作为SEQ ID NO:1表达的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
当本发明的一个实施方案利用金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段时，该片段将通常是与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性(例如，>91%同一性，>92%同一性，>93%同一性，>94%同一性，>95%同一性，>96%同一性，>97%同一性，>98%同一性，>99%同一性，或100%同一性)的序列的片段。包含所述片段的多肽，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗体识别作为SEQ ID NO:1表达的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
金黄色葡萄球菌SdrE的一种有用片段包括CnaBE3结构域(参见下文)，但包括少于20个Ser-Asp重复。
当本发明的一个实施方案不利用全长SdrE蛋白时，它不利用具有式‘A’的蛋白。
此外，本发明的多肽通常将不包含式‘B’的氨基酸序列，其中式‘B’为：
其中：
SEQ ID NO:5为：
SEQ ID NO:3为：
SEQ ID NO:6为：
X1是任选的PSTSE序列(SEQ ID NO:44)(优选存在)，且
X2是20-250个氨基酸长且或者是(i) SD的多个重复或(ii) SD和AD序列两者的混合物(且其中优选的X2是由SD的83个重复组成的166聚体(mer))。
因此，式‘B’的优选实例是SEQ ID NO:7，1076聚体：
所以，本发明的多肽通常将不包含SEQ ID NO:7。
CnaB结构域
CnaB结构域是公认的具有希腊钥匙拓扑学的两个折叠(sheets)中七股的前白蛋白样β-夹心折叠的蛋白结构[9]。SCOP数据库[10]包括“Cna蛋白B型结构域”作为家族(49479)和超家族(??49478)两者。在Pfam数据库[11]中，CnaB结构域是条目PF05738。尽管CnaB结构域基于二级蛋白结构定义，但该结构源于容易分析的氨基酸模式，并且一个CnaB结构域的存在可以仅仅基于氨基酸序列相对容易地预测，并且它们通过保守结构域搜索例如使用CDD(保守结构域数据库)容易鉴定，如参考文献12中所报道。
各种细菌物种中的CnaB结构域的实例公开于参考文献2。本发明涉及包括CnaB结构域的金黄色葡萄球菌蛋白。金黄色葡萄球菌中存在几种此类蛋白的实例，包括原型CNA胶原粘附素(其通常不作为本发明的实施方案)，但本发明的主要焦点是Sdr蛋白(富含Ser-Asp的蛋白，诸如SdrA、B、C、D、E和/或F)，特别是SdrE。
金黄色葡萄球菌SdrE如上文讨论。其含有三个CnaB结构域，在参考文献3中鉴定为“B重复”。三个CnaB结构域的边界基于Newman菌株显示于参考文献3的图3中，且SEQ ID NO:1中的第三CnaB结构域('CnaBE3')如下(SEQ ID NO:8)：
使用SEQ ID NO:1与来自任何其他金黄色葡萄球菌菌株的SdrE序列的比对，SEQ ID NO:8允许CnaBE3结构域在该其他菌株中容易地定位。本发明可以使用来自任何此类菌株的CnaBE3结构域，尽管Newman菌株是优选的。
通常，因此，本发明利用的CnaBE3结构域将与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性(例如，>96%同一性，>97%同一性，>98%同一性，>99%同一性，或100%同一性)，并且，当施用于人或小鼠时，将引发识别表位的抗体，所述表位(i)在SEQ ID NO:8内或(ii)包括SEQ ID NO:8内的氨基酸。换言之，CnaBE3结构域将引发与上述鉴定的野生型CnaBE3结构域交叉反应的抗体。在一些实施方案中，表位在SEQ ID NO:27内或包括SEQ ID NO:27内的氨基酸。
SEQ ID NO:8的CnaBE3结构域是111聚体，因此占总SdrE蛋白的约9.5％。因此，包含CnaBE3结构域的本发明的多肽可以比全长SdrE蛋白实质上更短。本发明的含有CnaBE3的多肽可以因此具有少于500个氨基酸，例如，少于400aa，少于350aa，少于300aa，少于250aa，少于200aa，或少于150aa。
当本发明的多肽包括CnaBE3结构域时，所述结构域上游和/或下游的任何氨基酸可以与金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的上游/下游残基相同，或者它们可以不同。例如，当所述多肽包含序列{A}-{B}-{C}(其中{B}是CnaBE3结构域)时：(a) {A}的C端与SEQ ID NO:1的残基102-111可以是相同或不同的；和/或(b) {C}的N端与SEQ ID NO:1的残基941-951可以是相同或不同的。因此，{B}的CnaBE3结构域可以作为来自SdrE的特定片段，或者其可以包括作为来自SdrE的较大片段的部分。当序列{c}存在时，这理想地包括少于20个Ser-Asp重复，例如，少于10个，少于5个，或甚至零个。在一个有用的实施方案中，序列{A}的确包括CnaBE2结构域内对应区域的短部分，例如，至多达20个氨基酸。例如，一种有用的序列(SEQ ID NO:27)保留来自CnaBE2的最后15个氨基酸，以得到SEQ ID NO:1的126聚体片段：
来自SdrE的每个CnaB结构域包括EF手环，其可提供钙的高亲和力结合。因此，本发明的多肽可包括CnaB结构域内的Ca++。
所述CnaBE3结构域刚好在参考文献1中公开的‘SdrE53-632’蛋白的下游。
SEQ ID NO:8与参考文献2中作为SEQ ID NO:134-138公开的来自SdrD的五个CnaB结构域具有序列同一性(通过CLUSTALW计算)：
。
类似地：当SEQ ID NO:8针对SdrD中的对应区域(例如对于Newman菌株，针对SdrD的氨基酸1013-1123)比对时，其具有94.6％同一性，具有6个氨基酸差异；并且当SEQ ID NO:8针对SdrC中的对应区域(例如，针对参考文献1中SdrC的氨基酸607-717)比对时，其也具有94.6％同一性，再次具有6个氨基酸差异。
异肽键和突变体CnaBE3结构域
本发明使用的CnaB结构域(并且特别是CnaBE3结构域)可以有用地包括异肽键，即两个氨基酸的侧链之间的键，或一个氨基酸的侧链和肽链的游离端之间的键。通常，这在一个侧链中的氨基和另一个侧链上的羧基或甲酰胺(carboxamide)基之间，例如在Lys上的氨基和Gln或Asn上的甲酰胺之间，或Lys上的氨基和Glu或Asp上的羧基之间形成。形成异肽键的两个氨基酸通常都在相同CnaBE3结构域中。
然而，在一些实施方案中，CnaB结构域(并且特别是CnaBE3结构域)被突变以去除野生型天冬酰胺和/或赖氨酸残基，由此破坏异肽键的形成。在此类突变体CnaB结构域中，在天然结构域具有天冬酰胺/赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代。SEQ ID NO:9至14是其中野生型Asn残基突变的CnaBE3结构域的实例，其中‘X’不是‘N’(并且理想地不是‘N’、‘Q’、‘D’或‘E’)：
类似地，SEQ ID NO:15至26是其中野生型Lys残基突变的CnaBE3结构域的实例，其中‘X’不是‘K’：
这些突变体可抵抗异肽键的形成。
然而，在本发明的一些实施方案中，天然的赖氨酸和/或天冬酰胺和/或天冬氨酸残基得到保留，使得异肽键形成得到维持。具体而言，保留对应于SEQ ID NO:8内的Asn-104的位置(即SEQ ID NO:14中加下划线的位置)的天冬酰胺是有用的。
与金黄色葡萄球菌糖类的组合
本发明的多肽可以与缀合的金黄色葡萄球菌糖抗原组合使用。因此，本发明提供包含以下的组合的免疫原性组合物：(1) 本发明的多肽；和(2) 金黄色葡萄球菌外泌多糖和载体蛋白的一种或多种缀合物。
该组合的组分(2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄色葡萄球菌的外泌多糖，其是聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)。所述糖可以是具有在从细菌纯化外泌多糖的过程中出现的大小的多糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖，例如，大小可以从超过400kDa变化至75和400kDa之间，或10和75kDa之间，或至多达30个重复单元。所述糖部分可以具有各种程度的N-乙酰化，并且如参考文献13中所述，PNAG可以小于40％N-乙酰化(例如，小于35、30、20、15、10或5％N-乙酰化；去乙酰化PNAG也已知为dPNAG)。PNAG的去乙酰化表位可引发能够介导调理杀死的抗体。PNAG可以被O-琥珀酰化或可以不被O-琥珀酰化，例如，它可以在少于25、20、15、10、5、2、1或0.1%的残基上被O-琥珀酰化。
本发明还提供包含以下的组合的免疫原性组合物：(1) 本发明的多肽；和(2) 金黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的一种或多种缀合物。
该组合的组分(2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄色葡萄球菌的荚膜糖。所述糖可以是具有在从细菌纯化荚膜多糖的过程中出现的大小的多糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖。荚膜糖可以从金黄色葡萄球菌的任何合适的菌株(或具有相似或相同的糖的任何细菌)获得，诸如从5型和/或8型金黄色葡萄球菌菌株和/或336型金黄色葡萄球菌菌株获得。感染性金黄色葡萄球菌的大多数菌株含有5型或8型荚膜糖。两者都具有其重复单元中的FucNAcp以及可用于引入用于连接的巯基的ManNAcA。5型糖的重复单元是→4)-β-D-Man NAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→，而8型糖的重复单元是→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→。336型糖是没有O-乙酰化的β-连接的己糖胺[14, 15]，并且与针对336菌株(ATCC 55804)产生的抗体交叉反应。5型和8型糖的组??合是典型的，并且336型糖可以加入该配对[16]。
这些缀合物中的载体部分将通常是蛋白，但通常不是(1)的抗原之一。典型的载体蛋白是细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素，或类毒素或其突变体或片段。CRM197白喉毒素突变体[17]是有用的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[18]，合成肽[19, 20]，热休克蛋白[21, 22]，百日咳蛋白[23, 24]，细胞因子[25]，淋巴因子[25]，激素[25]，生长因子[25]，包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+ T细胞表位的人工蛋白[26]，诸如N19 [27]，来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[28-30]，肺炎球菌溶血素[31]或其无毒衍生物[32]，肺炎球菌表面蛋白PspA[33]，铁摄取蛋白[34]，来自艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)的毒素A或B[35]，重组绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)的胞外蛋白A(rEPA)[36]等。在一些实施方案中，载体蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白，诸如选自第一、第二、第三或第四抗原组的抗原。
当组合物包括多于一种缀合物时，每种缀合物可使用相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。
缀合物可具有过量载体(w/w)或过量糖(w/w)。在一些实施方案中，缀合物可包括基本相等重量的各物质。
所述载体分子可以直接或经由接头共价地缀合至载体。与蛋白的直接连接可以通过，例如，糖和载体之间的还原胺化来实现，如例如参考文献37和38中所述。所述糖可首先需要被活化，例如通过氧化。可通过任何已知程序，例如参考文献39和40中所述的程序，进行经由接头基团连接。连接的优选类型是己二酸接头，其可以通过以下形成：偶联游离–NH2基团(例如，通过胺化引入葡聚糖)与己二酸(使用，例如，二酰亚胺活化)，然后将蛋白偶联至所得糖-己二酸中间体[41,42]。连接的另一种优选类型是羰基接头，其可以通过以下形成：使糖CDI的游离羟基反应[43,44]， 随后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接。其他接头包括β-丙酰胺基[45]、硝基苯基-乙胺[46]、卤代酰基卤化物[47]、糖苷键[48]、6-氨基己酸[49]、ADH [50]、C4至C12部分[51]等。还可以使用碳二亚胺缩合[52]。
PNAG缀合物可以各种方式制备，例如，通过包括以下的方法：a) 通过添加包含马来酰亚胺基团的接头而活化PNAG以形成活化的PNAG；b) 通过添加包含巯基的接头而活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀合物；或者通过包括以下的方法：a) 通过添加包含巯基的接头而活化PNAG以形成活化的PNAG；b) 通过添加包含马来酰亚胺基团的接头而活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀合物；或者通过包括以下的方法：a) 通过添加包含巯基的接头而活化PNAG以形成活化的PNAG；b) 通过添加包含巯基的接头而活化载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)使活化的PNAG和活化的载体蛋白反应以形成PNAG-载体蛋白缀合物。
本发明的多肽可以用作用于金黄色葡萄球菌糖的载体蛋白，以形成共价缀合物。因此，本发明提供免疫原性组合物，其包含(1)本发明的多肽和(2)金黄色葡萄球菌外泌多糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖的缀合物。此类缀合物的进一步特征如上所述。
与金黄色葡萄球菌多肽抗原的组合
本发明的多肽可以与其他(非SdrE)金黄色葡萄球菌多肽抗原组合使用。例如，免疫原性组合物可包含本发明的多肽与参考文献1中公开的任何金黄色葡萄球菌抗原，诸如如参考文献1中定义的以下抗原中的一种或多种：(1) clfA抗原；(2) clfB抗原；(3) esxA抗原；(4) esxB抗原；(5) Hla抗原；(6) isdA抗原；(7) isdB抗原；(8) isdC抗原；(9) isdG抗原；(10) isdH抗原；(11) isdI抗原；(12) sasF抗原；(13) sdrC抗原；(14) sdrD抗原；(15) spa抗原；(16) sta006抗原；和/或(17) sta011抗原。
在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含含有CnaBE3结构域的本发明的多肽与以下中的一种或多种的组合：(a) 突变体溶血素；(b) sta006抗原；(c) sta011抗原；(d) EsxA抗原；和/或(e) EsxB抗原。
金黄色葡萄球菌溶血素(‘Hla’)也已知为‘α毒素’。在NCTC 8325菌株中，Hla具有氨基酸序列SEQ ID NO:28 (GI:88194865)：
Hla是大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，其具有成孔和溶血活性。抗Hla抗体可以中和毒素在动物模型中的有害作用，并且Hla特别可用于保护免于肺炎。
Hla的天然毒性可以在本发明的组合物中通过化学灭活(例如，使用甲醛、戊二醛或其他交联剂)得以避免，但优选使用缺乏Hla的天然毒性活性、同时保留其免疫原性的突变体Hla。此类脱毒突变体是本领域已知的。优选的Hla抗原是这样的突变体金黄色葡萄球菌溶血素，其在SEQ ID NO:28的残基61、即成熟抗原(即省略前26个N端氨基酸之后)的残基35具有突变。因此，残基61可以不是组氨酸，并且可替代地是例如Ile，Val，或优选Leu。也可使用在该位置的His-Arg突变。例如，SEQ ID NO:29是成熟的突变体Hla-H35L序列：
并且有用的Hla抗原包含SEQ ID NO:29。其他有用的突变体公开于参考文献1中。
本发明使用的Hla突变体可引发识别SEQ ID NO: 28的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:28具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:28的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Hla抗原包括SEQ ID NO:28的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:28的表位。其他优选片段缺乏SEQ ID NO:28的C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或SEQ ID NO:28的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:28的至少一个表位。SEQ ID NO:28的前26个N端氨基酸可有用地省略。也可以使用C端的截短，例如留下仅50个氨基酸(SEQ ID NO:28的残基27-76)[53]。其他有用的Hla抗原公开于参考文献54和55。
一种有用的Hla抗原是SEQ ID NO:30：
。
这具有N端Met，然后是来自表达载体的Ala-Ser二肽，然后是SEQ ID NO:29。
'Sta006'抗原被注释为'高铁色素-结合蛋白'，并且也被称为'FhuD2' [56]。在NCTC 8325菌株中，Sta006具有氨基酸序列SEQ ID NO:31 (GI:88196199)：
本发明使用的Sta006可引发识别SEQ ID NO: 31的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:31具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:31的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Sta006多肽包括SEQ ID NO:31的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:31的表位。其他优选片段缺乏SEQ ID NO:31的C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或SEQ ID NO:31的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:31的至少一个表位。SEQ ID NO:31的前17个N端氨基酸可有用地省略。Sta006的突变体形式报道于参考文献57。一种有用的Sta006序列是SEQ ID NO:32，其在N端具有Met-Ala-Ser-序列，且省略SEQ ID NO:31的N端：
SEQ ID NO:33是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:32中存在的半胱氨酸：
'Sta011'抗原具有NCTC 8325中的氨基酸序列SEQ ID NO:34 (GI:88193872)：
本发明使用的Sta011抗原可引发识别SEQ ID NO: 34的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:34具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:34的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Sta011多肽包括SEQ ID NO:34的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:34的表位。其他优选片段缺乏SEQ ID NO:34的C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或SEQ ID NO:34的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:34的至少一个表位。SEQ ID NO:34的前23个N端氨基酸可有用地省略。一种有用的Sta011序列是SEQ ID NO:35，其具有N端甲硫氨酸，且省略SEQ ID NO:34的N端：
SEQ ID NO:36是另一种此类序列，但其缺乏SEQ ID NO:35中存在的半胱氨酸：
Sta011可以作为单体或寡聚体存在，其中Ca++离子有利于寡聚化。本发明可以使用Sta011的单体和/或寡聚体。
NCTC 8325菌株中的'EsxA'抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:37 (GI:88194063)：
本发明使用的EsxA抗原可引发识别SEQ ID NO: 37的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:37具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:37的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多)。这些EsxA多肽包括SEQ ID NO:37的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:37的表位。其他优选片段缺乏SEQ ID NO:37的C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或SEQ ID NO:37的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:37的至少一个表位。
NCTC 8325菌株中的'EsxB'抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:38 (GI:88194070)：
本发明使用的EsxB可引发识别SEQ ID NO: 38的抗体(例如，当施用于人时)和/或可包含以下氨基酸序列：(a) 与SEQ ID NO:38具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:38的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更多)。这些EsxB多肽包括SEQ ID NO:38的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:38的表位。其他优选片段缺乏SEQ ID NO:38的C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或SEQ ID NO:38的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留SEQ ID NO:38的至少一个表位。
当组合物包括EsxA和EsxB抗原两者时，这些可以作为单一多肽(即作为融合多肽)存在。因此，单一多肽可以引发抗体(例如，当施用于人时)，所述抗体识别SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38两者。所述单一多肽可以包括：(i) 与SEQ ID NO:37具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)和/或包含SEQ ID NO:37的至少'n'个连续氨基酸的片段的第一多肽序列，如上述对于EsxA所定义；和(ii) 与SEQ ID NO:38具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)和/或包含SEQ ID NO:38的至少'n'个连续氨基酸的片段的第二多肽序列，如上述对于EsxB所定义。第一和第二多肽序列可以是任一顺序，N至C端。SEQ ID NO:39 (‘EsxAB’)是此类多肽的实例，其具有六肽接头ASGGGS (SEQ ID NO:40)：
另一种‘EsxAB’杂合体包含SEQ ID NO:41：
其可额外地提供N端甲硫氨酸(SEQ ID NO:42)：
EsxAB的一种有用的变体缺乏EsxB的内部半胱氨酸残基，例如SEQ ID NO:43：
因此，一种有用的多肽包含这样的氨基酸序列，其(a) 与SEQ ID NO:41具有80％或更高同一性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含来自SEQ ID NO:41的氨基酸1-96的至少'n'个连续氨基酸的片段和来自SEQ ID NO:41的氨基酸103-205的至少'n'个连续氨基酸的片段两者，其中'n'为7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些多肽(例如，SEQ ID NO:42)可以引发抗体(例如，当施用于人时)，所述抗体识别包含SEQ ID NO:37的野生型葡萄球菌蛋白和包含SEQ ID NO:38的野生型葡萄球菌蛋白两者。因此，免疫应答将识别抗原EsxA和EsxB两者。(b)的优选片段提供来自SEQ ID NO:37的表位和来自SEQ ID NO:38的表位。
尽管SEQ ID NO:30、32、35和42是组合中有用的氨基酸序列，但本发明不限于这些精确的序列。因此，这些序列中的1个、2个、3个或所有4个可以独立地通过至多达5个单一氨基变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)而修饰，条件是修饰的序列可引发仍结合至由未修饰的序列组成的多肽的抗体。例如，SEQ ID NO:33、36和43是SEQ ID NO:32、35和42的此类变体。
在一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a) 本发明的多肽，其包含CnaBE3结构域：(b) 突变体溶血素，其包含SEQ ID NO:30；(c) sta006抗原，其包含SEQ ID NO:32；(d) sta011抗原，其包含SEQ ID NO:35；和(d) EsxAB抗原，其包含SEQ ID NO:42。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含：(a) 本发明的多肽，其包含CnaBE3结构域：(b) 突变体溶血素，其包含SEQ ID NO:30；(c) sta006抗原，其包含SEQ ID NO:33；(d) sta011抗原，其包含SEQ ID NO:36；和(d) EsxAB抗原，其包含SEQ ID NO:43。
与非葡萄球菌抗原的组合
本发明的抗原组中鉴定的个别抗原可以与非葡萄球菌抗原、和特别是与来自医院感染相关的细菌的抗原组合使用。因此，本发明提供包含以下的组合的免疫原性组合物：
(1) 本发明的多肽；和
(2) 选自以下的一种或多种抗原：艰难梭状芽胞杆菌；绿脓假单胞菌；白色念珠菌(Candida albicans)；和肠外致病性大肠杆菌(Escherichia coli)。
用于与本发明的金黄色葡萄球菌抗原组合使用的其他合适的抗原列于参考文献58的第33-46页。
本发明使用的多肽
本发明使用的多肽可采取各种形式(例如天然多肽、融合体、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化(lipidated)多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽、颗粒多肽、变性多肽等)。
本发明使用的多肽可通过各种方式(例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)制备。优选重组表达的蛋白。
本发明使用的多肽优选以纯化或基本纯化形式(即基本不含其他多肽(例如不含天然存在的多肽)、特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞多肽)提供，并且通常至少约50％纯(以重量计)，通常至少约90％纯，即组合物的少于约 50％，更优选少于约10％(例如5％)由其他表达的多肽构成。因此，组合物中的抗原与表达该分子的完整生物体分离。
本发明使用的多肽优选为葡萄球菌多肽。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可包含修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸打断。该术语也涵盖已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。例如，还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以作为单链或结合链产生。
本发明提供包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中：-P-是如上文定义的氨基酸序列，-Q-不是如上文定义的序列，即本发明提供融合蛋白。当-P-的N端密码子不是ATG、但该密码子未出现在多肽的N端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而，当该密码子在多肽的N端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的实例包括但不限于组氨酸标签(即His n (SEQ ID NO:45)，其中n＝3、4、5、 6、7、8、9、10或更多)、麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
本发明还提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括在诱导多肽表达的条件下培养用本发明的核酸转化的宿主细胞的步骤。
尽管本发明的多肽的表达可以在葡萄球菌中发现，但本发明将通常使用异源宿主用于表达(重组表达)。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。其可以是大肠杆菌(E.coli)，但其他合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟氏菌 (Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明的多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，改变密码子以优化此类宿主中的表达效率而不影响所编码的氨基酸是有帮助的。
本发明提供用于产生本发明的多肽的方法，其包括通过化学方式合成所述多肽的至少部分的步骤。
核酸
本发明还提供编码本发明的多肽的核酸。其还提供核酸，所述核酸包含编码一种或多种本发明的多肽的核苷酸序列。
本发明的核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其他核酸(例如不含天然存在的核酸)，特别是不含其他葡萄球菌或宿主细胞核酸，通常至少约50％纯(以重量计)，且通常至少约90％纯。本发明的核酸优选为葡萄球菌核酸。
本发明的核酸可以多种方式制备，例如，完全或部分化学合成 (例如DNA的亚磷酰胺合成)、通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库等制备。
术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物，诸如含有修饰骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸(branched nucleic acids)、质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采用RNA形式时，它可能具有或可能不具有5'帽。
本发明的核酸可以是载体的部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，设计用于导致产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或包含多于一种载体类型的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括单一细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，所述后代与原始亲本细胞不必需完全相同(在形态或总DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明的核酸体内或体外转染或感染的细胞。
可使用本发明的核酸，例如：来产生多肽；作为用于检测生物样品中的核酸的杂交探针；来产生额外的核酸拷贝；来产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链的寡核苷酸。
本发明提供用于产生本发明的核酸的方法，其中所述核酸部分或完全使用化学方式合成。
本发明提供包含本发明的核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)和用此类载体转化的宿主细胞。
根据本发明的核酸扩增可以是定量的和/或实时的。
菌株和变体
金黄色葡萄球菌的几种菌株的基因组序列是可得的，包括MRSA菌株N315和Mu50[59]、MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300 (剧毒)、JH1和JH9的那些。可使用标准的搜索和比对技术在任何这些(或其他)进一步基因组序列中鉴定来自Newman菌株的SdrE (SEQ ID NO:1)的同源物。而且，可得的来自Newman菌株的序列可用于设计引物用于扩增来自其他菌株的同源序列。因此，本发明不限于该菌株，而是涵盖来自金黄色葡萄球菌的其他菌株的此类变体和同源物，以及非天然变体。通常，SEQ ID NO:1的合适变体包括其等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物、其突变体等。
因此，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，本发明使用的多肽可包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸取代，诸如保守取代(即用具有相关侧链的另一种氨基酸取代一种氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性氨基酸，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳香族氨基酸。通常，这些家族内的单一氨基酸的取代对生物活性不具有主要影响。相对于SEQ ID NO序列，多肽还可包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9等)单一氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO序列，多肽也可包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)插入(例如各1、2、3、4或5 个氨基酸)。
类似地，本发明使用的多肽可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
● 与序列表中公开的序列相同(即100％相同)；
● 与序列表中公开的序列共享序列同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；
● 与(a)或(b)的序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单一氨基酸改变(缺失、插入、取代)，其可以在分开的位置或可以是连续的；且
● 当使用逐对比对算法与来自序列表的特定序列比对时，每个从N端向C端移动x个氨基酸的窗口(使得对于延伸至p个氨基酸的比对，当p>x时，存在p-x+1 个此类窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；且如果x·y不是整数，则将其向上入至(rounded up to)最近的整数。优选的成对比对算法是 Needleman-Wunsch整体比对算法[60]，使用默认参数(例如缺口开放罚分＝10.0， 缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。该算法以EMBOSS软件包中的needle工具方便地执行[61]。
在组(c)内，缺失或取代可在N端和/或C端，或者可以在两端之间。因此，截短是缺失的一个实例。截短可涉及在N端和/或C端缺失至多达40个(或更多个)氨基酸。N端截短可移除前导肽，例如以促进在异源宿主中的重组表达。C端截短可移除锚定序列，例如以促进在异源宿主中的重组表达。
通常，当抗原包含与来自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时(例如，当它包含与之具有<100％序列同一性的序列表时，或当它包含其片段时)，优选的是，在各种单独情况下，该抗原可引发抗体，所述抗体识别相应的完整金黄色葡萄球菌序列。
免疫原性组合物和药物
本发明的多肽可用作免疫原性组合物中的组分。本发明的免疫原性组合物可用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常是预防性的。
因此，组合物可以是药学上可接受的。它们将通常包括除了所述抗原以外的组分，例如它们通常包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。对此类组分的充分讨论可见参考文献62。
组合物将通常是水性形式，特别是在施用点，但它们也可以非水性液体形式或以干燥形式(例如，作为冻干物)呈现。一些疫苗以水性形式制备，然后也以水性形式填装和分布和施用，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重构成水性形式。因此，本发明的组合物可以干燥，诸如冻干制剂。
该组合物可包括防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选的是，疫苗应当基本不含(即少于5μg/ml)含汞物质，例如不含硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了改善热稳定性，组合物可包括温度保护剂。
为了控制张度，优选包括生理盐，诸如钠盐，例如以控制张度。优选氯化钠(NaCl)，其可以以1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl或9 mg/ml存在。可存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物将通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg，或290-310 mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)。
组合物可包括淡水(例如，w.f.i.)中的多肽，但通常将包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris 缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将包括在5-20mM范围内。
组合物的pH将通常为5.0至8.1，更通常6.0至8.0，例如6.5至7.5，或 7.0至7.8。
该组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，例如每剂量含有<1 EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1 EU。该组合物优选不含谷蛋白。
组合物应当适于施用于动物(和，特别是人)患者，因此，包括人和兽医用途两者。它们可以用于引起患者中的免疫应答的方法中，其包括将所述组合物施用于患者的步骤(参见下文)。组合物可以在主体暴露于病原体之前和/或主体暴露于病原体之后施用。
药物组合物可以单位剂型来制备。在一些实施方案中，单位剂量可以具有0.1-1.0ml，例如，约0.5ml的体积。
所述组合物可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”药剂盒)。多剂量配置优选包括防腐剂。作为多剂量组合物中包括防腐剂的替代方案(或除此以外)，所述组合物可包含在具有用于移取材料的无菌接头的容器中。
人疫苗通常以约0.5ml的剂量体积施用，尽管可将一半剂量(即约0.25ml)施用于儿童。
本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物(例如，含有单位剂量)的递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可用于向哺乳动物施用所述组合物。
本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物(例如，含有单位剂量)的无菌容器(例如，小瓶)。
本发明还提供本发明的免疫原性组合物的单位剂量。
本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物的气密封容器。合适的容器包括例如小瓶。
金黄色葡萄球菌感染可影响身体的各个区域，所以，可将本发明的组合物以各种形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。所述组合物可以制备用于局部施用。所述组合物可以制备用于口服施用。所述组合物可以制备用于经鼻施用，例如作为喷雾剂。可将所述组合物设计为药剂盒形式，使得在临施用于患者之前重构组合的组合物。此类药剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。
当组合物在临使用前制备(例如，当组分以冻干形式呈现时)且作为药剂盒呈现时，该药剂盒可包含两个小瓶，或者可包含一个即填充(ready-filled)的注射器和一个小瓶，其中注射器的内容物用于在注射前重新活化小瓶的内容物。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原，以及需要的任何其他组分。“免疫有效量”意指以单一剂量或一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。当组合物中包括多于一种抗原时，则两种抗原可以彼此相同剂量或以不同剂量存在。
本发明的免疫原性组合物将通常包括一种或多种免疫佐剂。可在本发明的组合物中使用的佐剂包括，但不限于：(i) 水包油乳液、(ii) 至少一种铝盐或(iii) 至少一种TLR激动剂。在一些实施方案中，组合物包括铝盐和TLR激动剂的混合物，且TLR激动剂可以吸附至铝盐以改善佐剂效果[86]。这可导致更好(更强、或更快速地实现)的免疫应答和/或可允许减少组合物中铝的量，同时维持等效的佐剂作用。
当组合物包括(一种或多种)铝盐佐剂时，则本发明的多肽可以吸附至(一种或多种)盐。当组合物包括铝盐佐剂时，则其优选不包括水包油乳液佐剂。相反，当组合物包括水包油乳液佐剂时，则其优选不包括铝盐佐剂。
水包油乳液佐剂
免疫原性组合物可用水包油乳液佐剂化。各种此类乳液是已知的，例如MF59和AS03都在欧洲被批准。
有用的乳液佐剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴通常具有亚微米直径，且这些小尺寸可以容易地使用提供稳定乳液的微流化床或通过替代方法(例如，相反转)来实现。其中至少80％(以数目计)的液滴具有小于220nm的直径的乳液是优选的，因为它们可进行过滤除菌。
所述乳液可以包括来自动物(诸如鱼)和/或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最普遍可得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油例举坚果油。可以使用(例如获得自霍霍巴豆的)霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中，玉米油是最容易获得的，但也可以使用其他谷物(诸如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等)的油。可从坚果和种子油开始，通过水解、分离和酯化适当材料制备不是种子油中天然存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以与本发明使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂化和其他方式的程序是本领域众所周知的。
大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)例举本文中可使用的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，其统称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其为特别优选用于与本发明使用(参见下文)。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是有用的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。
佐剂乳液中总油(体积％)的优选量是1至20％，例如2-10%。5体积％的角鲨烯含量是特别有用的。
表面活性剂可以通过其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂具有至少10，例如约15的HLB。可以与本发明使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；以DOWFAX?商品名销售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，诸如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，诸如Tergitol? NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(已知为苄泽(Brij)表面活性剂)，诸如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；和脱水山梨糖醇酯(通常已知为司盘(SPAN))，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
本发明使用的乳液优选包括非离子表面活性剂。用于乳液中包括的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂或曲通X-100。可以使用表面活性剂的混合物，例如聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(诸如聚山梨醇酯80 (吐温80))和辛苯聚醇(诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是有用的。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。当使用表面活性剂的混合物时，则混合物的HLB根据它们的相对权重(以体积计)计算，例如，聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的优选1:1混合物具有8.4的HLB。
佐剂乳液中总表面活性剂(体积％)的优选量是0.1至2％，例如0.25-2%。1体积％的总含量是特别有用的，例如0.5体积％的聚山梨醇酯80和0.5体积％的脱水山梨糖醇三油酸酯。
有用的乳液可使用已知的技术制备，例如参见参考文献63-646984。
可与本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
● 角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米(submicron)乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％脱水山梨糖醇三油酸酯。在重量方面，这些比率变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％脱水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂已知为‘MF59’ [70-72]，如参考文献83的第10章和参考文献84的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
● 角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨醇酯80，且角鲨烯：生育酚的重量比优选≤1 (例如0.90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。该佐剂已知为‘AS03’。另一种这种类型的有用乳液每个人剂量可包含0.5-10 mg角鲨烯、0.5-11 mg生育酚和0.1-4 mg聚山梨酸酯80 [73]，如上述讨论的比率。
● 其中皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合为螺旋胶束的乳液[74]。
● 具有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献75中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。
● 包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六十八烷基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)具有小于200nm的尺寸[76]。该乳液也可包括以下中的一种或多种：醛糖醇；冷冻保护剂(例如，糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。它也可以包括TLR4激动剂，诸如其化学结构不包括糖环的TLR4激动剂[77]。此类乳液可以冻干。‘AF03’产品是一种此类乳液。
本发明使用的优选的水包油乳液包含角鲨烯和聚山梨醇酯80。
所述乳液在疫苗制造过程中可以与抗原混合，或者它们可以在递送时临时混合。因此，在一些实施方案中，所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销(distributed)的疫苗中，其备用于在使用时的最终配制。在混合时(在批量制造过程中，或在使用点)，抗原将通常是水性形式，使得通过混合两种液体制备最终疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。如果乳液和抗原在试剂盒中分开储存，则该产品可作为含有乳液的小瓶和含有水性抗原的小瓶呈现，用于混合以得到佐剂化的液体疫苗(单剂量或多剂量)。
本发明的优选乳液包括角鲨烯油。这通常从鲨鱼油制备，但替代来源也是已知的，例如参见参考文献78(酵母)和79(橄榄油)。含有少于661皮克PCB/克角鲨烯(TEQ)的角鲨烯对于与本发明使用是优选的，如参考文献80所公开。所述乳液优选从高纯度的角鲨烯制备，例如，如参考文献81中公开通过双蒸馏制备。
当组合物包括生育酚时，可使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可采用几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可使用D-α-生育酚和DL-α-生育酚两者。生育酚具有抗氧化特性，其有助于稳定该乳液[82]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。
铝盐佐剂
本发明的组合物可包括铝盐佐剂。目前使用的铝盐佐剂通常被称为“氢氧化铝”或“磷酸铝”佐剂。然而，这些是方便的名称，因为无一是存在的实际化合物的精确描述(例如，参见参考文献83的第9章，和参考文献84的第4章)。本发明可使用可用作佐剂的“氢氧化物”或“磷酸盐”中的任一者。如果TLR激动剂的吸附是期望的，则包括氢氧根离子的铝盐是优选的，因为这些氢氧根离子可容易经受配体交换用于吸附TLR激动剂。因此，用于吸附TLR激动剂的优选的盐是氢氧化铝和/或羟基磷酸铝。这些具有可容易经历与含磷基团(例如磷酸盐，膦酸盐)配体交换的表面羟基部分以提供稳定的吸附。氢氧化铝佐剂因此最优选的。
已知为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。可通过式AlO(OH)代表的羟基氧化铝(Aluminium oxyhydroxide)可通过红外(IR)光谱学，特别是通过在1070cm–1的吸附带和在3090–3100cm–1的强肩部存在与其他铝化合物诸如氢氧化铝Al(OH)3进行区分(参考文献83的第9章)。氢氧化铝佐剂的结晶度通过在半高的衍射带的宽度(WHH)来反映，其中差结晶颗粒显示由于较小晶粒尺寸导致的较大线增宽。表面积随着WHH增加而增加，且具有较高WHH值的佐剂已被视为具有对于抗原吸附的较大能力。纤维状形态(例如，如透射电子显微照片所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的，例如，具有直径约2nm的针样颗粒。氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11，即佐剂本身在生理pH具有正表面电荷。对于氢氧化铝佐剂已经报道在pH7.4 1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
已知为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。羟基磷酸盐通常具有0.3至0.99的PO4/Al 摩尔比。羟基磷酸盐可通过羟基的存在与严格(strict)AlPO4区分开来。例如，在3164cm–1(例如，当加热至200℃时)的IR谱带表明结构性羟基的存在(参考文献83的第9章)。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比将通常为0.3至1.2，优选0.8至1.2，并且更优选0.95+0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+/ml包括。磷酸铝将通常是颗粒。在任何抗原吸附后，颗粒的典型直径是范围0.5-20μm(例如约5-10μm)。对于磷酸铝佐剂已经报道在pH7.4 0.7-1.5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
磷酸铝的PZC与磷酸根对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4.0至7.0，更优选5.0至6.5，例如约5.7的PZC。
在溶液中，磷酸铝和氢氧化物佐剂两者趋于形成直径为1-10μm的稳定的多孔聚集体[85]。
组合物可包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物，且组分可以被吸附到这些盐中的一种或两种。
用于制备本发明的组合物的磷酸铝溶液可含有缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但这不总是必要的。磷酸铝溶液优选是无菌且无热原的。磷酸铝溶液可包括游离的水性磷酸根离子，例如以1.0至20mM、优选5至15 mM、更优选约10 mM的浓度存在。磷酸铝溶液还可以包含氯化钠。氯化钠的浓度优选在0.1至100 mg/ml的范围内(例如，0.5-50 mg/ml，1-20 mg/ml，2-10 mg/ml)，并且更优选约3+1 mg/ml。NaCl的存在有利于在吸附抗原之前正确测量pH。
本发明的组合物理想地包括小于0.85mg Al+++/单位剂量。在本发明的一些实施方案中，组合物包括小于0.5mg Al+++/单位剂量。Al+++的量可以小于该值，例如<250μg、<200μg、<150μg、<100μg、<75μg、<50μg、<25μg、<10μg等。
当本发明的组合物包括基于铝的佐剂，组分的沉降可在储存过程中发生。所述组合物因此应当在向患者施用之前摇动。经摇动的组合物将是混浊的白色悬浮液。
TLR激动剂
在一些实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂，即，可以激动Toll样受体的化合物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。TLR激动剂可以活化TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11中任一者；优选它可以活化人TLR4或人TLR7。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包括TLR激动剂(诸如TLR7激动剂)，其包括膦酸酯基。这种膦酸酯基可以允许激动剂吸附至不溶性铝盐[86]。
治疗方法和疫苗的施用
本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的本发明的免疫原性组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性的，并且优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以引起加强应答。
本发明还提供本发明的免疫原性组合物，其用于治疗中，例如，用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法(如上所述)中。
本发明还提供本发明的多肽在制备用于在哺乳动物引起免疫应答(如上所述)的药物中的用途。
通过这些用途和方法在哺乳动物中引起免疫应答，所述哺乳动物可以受保护免于金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，哺乳动物可以受保护免于皮肤感染、肺炎、脑膜炎、骨髓炎心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症。
本发明还提供包含第一组分和第二组分的药剂盒，其中第一组分和第二组分都不是如上所述的本发明的组合物，但其中可将第一组分和第二组分组合以提供如上所述的本发明的组合物。所述药剂盒可以进一步包括包含以下中的一种或多种的第三组分：说明书、注射器或其他递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
所述哺乳动物优选为人。当所述疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童(例如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。意图用于儿童的疫苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。可以根据本发明有用地免疫的其他哺乳动物是奶牛、狗、马和猪。
检查治疗性治疗的效力的一种方式涉及在施用本发明的组合物之后监测金黄色葡萄球菌感染。检查预防性治疗的效力的一种方式涉及施用所述组合物之后监测针对本发明的组合物中的抗原的全身免疫应答(诸如监测IgG1和IgG2a产生的水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生的水平)。通常，在免疫后但在攻击前测定抗原特异性血清抗体应答，而在免疫后且攻击后测定抗原特异性粘膜抗体应答。
评价本发明的组合物的免疫原性的另一种方式是重组表达蛋白，其用于通过免疫印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品之间的阳性反应表明所述患者已经对考虑的蛋白产生免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原内的表位。
通过用疫苗组合物攻击金黄色葡萄球菌感染的动物模型(例如豚鼠或小鼠)，也可在体内测定疫苗组合物的效力。具体而言，存在三种用于研究金黄色葡萄球菌感染性疾病的有用动物模型，即：(i) 鼠脓肿模型[87]，(ii) 鼠致死感染模型[87]和(iii) 鼠肺炎模型[88]。脓肿模型着眼于静脉内攻击后小鼠肾脏中的脓肿。致死感染模型着眼于通过静脉内或腹膜内途径被通常致死剂量的金黄色葡萄球菌感染后存活的小鼠的数目。肺炎模型还着眼于存活率，但使用鼻内感染。有用的疫苗在这些模型中的一种或多种中可以是有效的。例如，对于一些临床情况下，其可对于保护免于肺炎是期望的，而无需防止血液传播或促进调理作用；在其他情况下，主要愿望可以是防止血液传播。不同的抗原，和不同的抗原组合，可有助于有效疫苗的不同方面。
本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、皮内、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)，或经粘膜，诸如通过直肠、经口(例如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选肌内注射。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。
优选地，增强的全身和/或粘膜免疫反映为增强的TH1和/或TH2免疫应答。优选地，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。
剂量可通过单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。在多剂量时间表中，各个剂量可通过相同或不同的途径(例如肠胃外引发和粘膜加强，粘膜引发和肠胃外加强等)给予。多个剂量将通常间隔至少1周 (例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16 周等)进行施用。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人两者。因此，人患者可以小于1 岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者为老人(例如>50岁、>60岁，且优选>65岁)、幼儿(例如<5岁)、住院患者、保健护理人员、武装服务和军事人员、孕妇、慢性病人或免疫缺陷患者。然而，所述疫苗不仅适用于这些组，还可更广泛地用于人群。
可将本发明产生的疫苗与其他疫苗基本上同时(在相同用药咨询或访问健康护理专业人员或疫苗接种中心期间)施用于患者，例如与流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、缀合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌缀合物疫苗(诸如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时施用于患者。适于共同施用的其他非葡萄球菌疫苗可以包括参考文献58的第33-46页上列出的一种或多种抗原。
核酸免疫
上述免疫原性组合物包括来自金黄色葡萄球菌的多肽抗原。然而，在所有情况下，所述多肽抗原可用编码那些多肽的核酸(通常是DNA或RNA)替换，以得到基于核酸免疫的组合物、方法和用途。核酸免疫现在是已开发的领域(例如参见参考文献89-96等)。
编码免疫原的核酸在递送至患者后在体内表达，然后所表达的免疫原刺激免疫系统。活性成分将通常采用核酸载体的形式，其包含：(i)启动子；(ii)可操作地连接至启动子的编码免疫原的序列；和任选(iii)选择性标记。优选的载体可进一步包含(iv)复制起点；和(v)位于(ii)下游且与其可操作连接的转录终止子。通常，(i)和(v)将是真核的，(iii)和(iv)将是原核的。
优选的启动子是病毒启动子，例如来自巨细胞病毒(CMV)的启动子。除了启动子，载体还可以包括转录调节序列(例如增强子)，其与启动子功能性相互作用。优选的载体包括立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体还包括CMV内含子A。将该启动子可操作地连接至编码免疫原的下游序列，使得编码免疫原的序列的表达在该启动子的控制之下。
当使用标记物时，其优选在微生物宿主中(例如在原核生物中、细菌中、酵母中)发挥功能。标记物优选为原核选择性标记物(例如在原核启动子控制之下转录)。为方便起见，典型的标记物为抗生素抗性基因。
本发明的载体优选为自主复制游离型载体或染色体外载体，诸如质粒。
本发明的载体优选包含复制起点。优选的是，该复制起点在原核生物中有活性而在真核生物中无活性。
优选的载体因此包括用于选择载体的原核标记物、原核复制起点以及驱动编码免疫原的序列转录的真核启动子。所述载体因此将(a)在原核宿主中扩增并选择，而不表达多肽，但(b)在真核宿主中表达，但不扩增。这种排列对于核酸免疫载体是理想的。
本发明的载体可以在编码序列下游包含真核转录终止子序列。这可以增强转录水平。当编码序列不具有其自身的聚腺苷酸化序列时，本发明的载体优选包含聚腺苷酸化序列。优选的聚腺苷酸化序列来自牛生长激素。
本发明的载体可以包含多克隆位点。
除了编码免疫原和标记物的序列以外，载体可以包含第二真核编码序列。载体还可在所述第二序列上游包含IRES，以允许从相同的转录物翻译第二真核多肽作为免疫原。或者，编码免疫原的序列可以在IRES的下游。
本发明的载体可以包含非甲基化的CpG基序，例如非甲基化DNA序列，其共同具有胞嘧啶和随后的鸟苷，侧接有两个5′嘌呤和两个3′嘧啶。在其非甲基化形式中，已表明这些DNA基序是几种类型的免疫细胞的有效刺激剂。
通用
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指，例如x±10％。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，等。
当动物(特别是牛)材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不含传染性海绵状脑病(TSE)、特别是不含牛海绵状脑病(BSE)的来源。总体上，优选在动物来源材料完全不存在的情况下培养细胞。
当化合物作为组合物的部分施用于机体时，则该化合物可以替代地被合适的前药替代。
通常，本发明将不使用参考文献1或2中公开的组合物。此外，在一些实施方案中，本发明不利用在野生型SdrC或SdrD蛋白内发现的CnaB结构域。
附图简述
图1显示在用Newman菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的log10 CFU/ml。三组数据，从左至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的SdrE；或佐剂化的CnaBE3。每个点显示来自单一小鼠的数据。水平线是平均值。
图2显示在用NCTC8325菌株攻击后免疫小鼠的肾脏中的log10 CFU/ml。两组数据，从左至右，用以下免疫：单独的佐剂；佐剂化的CnaBE3。
图3显示使用多克隆抗CnaBE3血清的蛋白质印迹。印迹下面的表显示所测试的菌株，然后是那些菌株中SdrC、SdrD和SdrE的分子量。
图4显示使用所示血清的％调理吞噬杀死(Y轴范围为-40％至40％)。
图5显示来自健康(左)或感染(右)供体的血清的ELISA滴度(lnAU)。
实施本发明的方式
SdrE蛋白研究
将SdrE抗原的编码序列克隆在pET15b+载体中以编码在其N端具有六组氨酸标签的蛋白(SEQ ID NO:46)。
注意到，SdrE显示对胰蛋白酶消化的抗性。蛋白在37℃用测序级改良的胰蛋白酶(Promega?)以1/25 (wt/wt)的酶/底物比率在50 mM碳酸氢铵, pH 8, 与0.1% (wt/vol) Rapigest (Waters?)消化过夜。
对于蛋白质印迹分析，细菌细胞壁提取物如先前所述[97]获得。金黄色葡萄球菌对数生长期培养物在补充5mM CaCl2的TSB中生长至OD600 = 0.6。细胞在PBS中洗涤一次并再悬浮在100μl补充30% (w/v)棉子糖和40μl/ml无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, pH 7.5)中。将溶葡球菌酶(200 μg/ml)在37℃应用10分钟以收获细胞壁蛋白。将样品与NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE样品还原剂煮沸10分钟，并且在3-8% (w/v) NuPAGE Tris-乙酸盐凝胶中分离。将电泳分离的蛋白样品用iBlot凝胶转移装置转移至硝酸纤维素膜。将膜在TPBS中的10% (w/v)脱脂乳中封闭2小时(25℃，700 rpm)。在TPBS中三次洗涤后，添加TPBS中的小鼠多克隆抗rCnaBE3(在1% w/v脱脂乳中1:1,000稀释)并将膜在25℃，700 rpm下孵育1小时。将膜在TPBS中洗涤三次，且添加TPBS中的1% (w/v)脱脂乳中1:5,000稀释的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP。在25℃, 700 rpm下1小时后，将膜洗涤三次，且结合的抗体通过SuperSignal West Pico化学发光底物通过ECL可视化，且显色1分钟。
在野生型细菌中，SdrE蛋白在蛋白质印迹上作为约125kDa的条带可见，并且其位于细胞壁级分中。过夜胰蛋白酶处理提供约36kDa的强条带，其中也可见较低重量条带。然而，甚至在37℃消化3天后，36kDa条带(和各种其他条带)保持稳定。
主要胰蛋白酶抗性条带的MS和N端分析揭示来自CnaBE3区域的肽，其中一些序列延伸短距离进入CnaBE2的C端部分。BE3结构域作为126聚体(SEQ ID NO:27)表达，其包括从BE2结构域的15个上游氨基酸。重组蛋白通过SDS-PAGE在约15kDa是可见的。胰蛋白酶消化在4小时后稍微降低其大小，但该条带甚至在消化2天后仍保持稳定。
MS研究揭示，CnaBE3肽的质量与理论质量相差17 Da。该质量对应于在赖氨酸和天冬酰胺残基之间的异肽键的形成过程中发生的铵的损失。金黄色葡萄球菌蛋白中的分子内异肽键先前没有在实验中看到。
为了研究可能的异肽键形成，CnaBE3结构域内的六个Asn残基已经突变(SEQ ID NO:9至14)。基于含有CnaA和CnaB结构域的表面蛋白可形成分子内异肽键和在充当稳定剂或催化剂的Glu/Asp存在的情况下在Lys-Asp或Lys-Asn残基之间形成所述键的事实，野生型CnaBE3中的所有天冬酰胺被丙氨酸替代。野生型和突变体CnaBE3结构域(SEQ ID NO:9至13，其中‘X’是‘A’)显示对胰蛋白酶消化的抗性，这表明CnaBE3区域中存在一些稳定因素。五种突变体的胰蛋白酶抗性行为表明，这五个天冬酰胺无一参与键形成。
免疫学研究
全长SdrE(SEQ ID NO:1)和CnaBE3结构域(SEQ ID NO:27)用氢氧化铝佐剂化，并用于免疫小鼠。免疫小鼠用Newman菌株攻击，然后评估肾脓肿形成。
如图1中显示，用SdrE或CnaBE3免疫导致肾脏中细菌CFU计数的显著减少(相对于阴性对照：对于SdrE，p=0.016，对于CnaBE3，p=0.032)。SdrE和CnaBE3组的差异CFU计数不显著。
SdrE并不普遍由金黄色葡萄球菌菌株表达，所以测试用CnaBE3免疫的小鼠针对SdrE阴性菌株(NCTC8325)的保护。令人惊讶地，小鼠再次受到保护(参见图2；p=0.017)，所以CnaBE3能够提供交叉保护。这种作用可能是由于Newman菌株的这三种Sdr蛋白中位于邻近‘R’区域(参见参考文献3的图1)的CnaB结构域(SdrC的BC2、SdrD的BD5和SdrE的BE3)之间的高序列同一性。例如，抗CnaBE3多克隆血清与来自金黄色葡萄球菌的11种不同菌株的蛋白提取物孵育，并且其识别具有对应于SdrC、SdrD和SdrE中每一者的MW的蛋白(参见图3)。如预期，SdrD在SdrD-ve菌株MRSA252中未检测到，且SdrE在SdrE-ve菌株NCTC8325中未检测到。因此，与SdrC和SdrD的交叉反应性可解释CnaBE3保护免于SdrE-ve菌株的能力。
患者血清交叉反应性
血清获得自16个血清健康新生儿(12至18个月大)、30个健康成人(21至75岁大)和30个具有证明金黄色葡萄球菌感染为疾病的唯一微生物学病因的患者(0至81岁大)。此外，健康成人血清购自3H Biomedical AB。
这些血清用于ELISA中。简而言之，Nunc MaxiSorp?平底96孔板用PBS中的2 μg/ml rCnaBE3蛋白在4℃包被(每孔100μl)过夜。将板用TPBS (PBS中的0.05% (v/v) 吐温20, pH 7.4)洗涤三次，并且在37℃用200 μl/孔的PBS中含有3% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich)的封闭缓冲液封闭2小时。血清最初在稀释缓冲液(TPBS中的1% (w/v) BSA)中1:100稀释，一式两份添加至孔(100 μl/孔)，且连续2倍稀释。在37℃孵育2小时后，将板用TPBS洗涤三次，然后以100 μl/孔添加含有1:2,000稀释的山羊抗人IgG(λ链特异性)碱性磷酸酶缀合物亲和力分离的抗体(Sigma-Aldrich)的稀释缓冲液。在37℃孵育1小时30分钟之后，将板用TPBS洗涤三次，且应用100 μl/孔的含有3 mg/ml磷酸对硝基苯酯的DEA缓冲剂(1M二乙醇胺(v/v), 0.5 mM MgCl2, 0.02% (w/v)叠氮化钠, pH 9.8)的溶液。反应在20分钟后通过添加100 μl 4N NaOH而终止。405 nm的光密度使用配备SoftMax? Pro数据采集和分析软件的SpectraMax 190吸光度酶标仪进行测量。抗体滴度通过将OD内插至参考校准曲线而计算，并且以对数任意单位(lnAU)表示。
如图5中所示，血清与固定的CnaBE3结构域的平均结合值对于感染患者显著高于来自健康患者的血清(p<0.05)。这些数据表明，针对CnaBE3片段的特异性免疫应答在金黄色葡萄球菌感染过程中的确得到诱导，表明SdrE中的CnaBE3结构域是天然免疫原性的。
调理吞噬杀死测定
人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60 (ATCC CCL240)维持在富集培养基中，并且使用0.8% N,N-二甲基甲酰胺分化为吞噬细胞。热灭活(30分钟，56℃)后，小鼠CnaBE3和SdrE抗血清在HBSS缓冲液(具有Ca2+/Mg2+)中1:50预稀释。在TSB中生长过夜的细菌在PBS中洗涤一次，然后与血清(75 000 CFU/孔)在4℃孵育20分钟。分化的HL-60细胞以3.7 × 106/孔(HL-60:细菌比率，50:1)分布，且以10％最终浓度添加兔补体。然后将板在37℃在600 rpm搅拌下孵育1小时，并且将样品铺板在TSA板上，用于CFU计数测定。血清以1:50、1:500或1:5000稀释度测试。
如图4中所示，当补体存在时，HL-60细胞在抗CnaBE3血清存在的情况下杀死约20%的Newman细胞，且在抗SdrE血清存在的情况下杀死约30%的Newman细胞，而没有任何Newman细胞被免疫前血清杀死。
应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的范围和精神之内。
参考文献
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Ile Ala Lys Gly Thr Phe Asp Lys Ala Thr Lys Gln Ile Thr Tyr Thr
305 310 315 320
Phe Thr Asp Tyr Val Asp Lys Tyr Glu Asp Ile Lys Ser Arg Leu Thr
325 330 335
Leu Tyr Ser Tyr Ile Asp Lys Lys Thr Val Pro Asn Glu Thr Ser Leu
340 345 350
Asn Leu Thr Phe Ala Thr Ala Gly Lys Glu Thr Ser Gln Asn Val Thr
355 360 365
Val Asp Tyr Gln Asp Pro Met Val His Gly Asp Ser Asn Ile Gln Ser
370 375 380
Ile Phe Thr Lys Leu Asp Glu Asp Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile
385 390 395 400
Tyr Val Asn Pro Leu Lys Lys Ser Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Ile
405 410 415
Ala Gly Ser Gln Val Asp Asp Tyr Gly Asn Ile Lys Leu Gly Asn Gly
420 425 430
Ser Thr Ile Ile Asp Gln Asn Thr Glu Ile Lys Val Tyr Lys Val Asn
435 440 445
Ser Asp Gln Gln Leu Pro Gln Ser Asn Arg Ile Tyr Asp Phe Ser Gln
450 455 460
Tyr Glu Asp Val Thr Ser Gln Phe Asp Asn Lys Lys Ser Phe Ser Asn
465 470 475 480
Asn Val Ala Thr Leu Asp Phe Gly Asp Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Ile
485 490 495
Lys Val Val Ser Lys Tyr Thr Pro Thr Ser Asp Gly Glu Leu Asp Ile
500 505 510
Ala Gln Gly Thr Ser Met Arg Thr Thr Asp Lys Tyr Gly Tyr Tyr Asn
515 520 525
Tyr Ala Gly Tyr Ser Asn Phe Ile Val Thr Ser Asn Asp Thr Gly Gly
530 535 540
Gly Asp Gly Thr Val Lys Pro Glu Glu Lys Leu Tyr Lys Ile Gly Asp
545 550 555 560
Tyr Val Trp Glu Asp Val Asp Lys Asp Gly Val Gln Gly Thr Asp Ser
565 570 575
Lys Glu Lys Pro Met Ala Asn Val Leu Val Thr Leu Thr Tyr Pro Asp
580 585 590
Gly Thr Thr Lys Ser Val Arg Thr Asp Ala Asn Gly His Tyr Glu Phe
595 600 605
Gly Gly Leu Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr Val Lys Phe Glu Thr Pro
610 615 620
Thr Gly Tyr Leu Pro Thr Lys Val Asn Gly Thr Thr Asp Gly Glu Lys
625 630 635 640
Asp Ser Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Lys Ile Asn Gly Lys Asp Asp
645 650 655
Met Ser Leu Asp Thr Gly Phe Tyr Lys Glu Pro Lys Tyr Asn Leu Gly
660 665 670
Asp Tyr Val Trp Glu Asp Thr Asn Lys Asp Gly Ile Gln Asp Ala Asn
675 680 685
Glu Pro Gly Ile Lys Asp Val Lys Val Thr Leu Lys Asp Ser Thr Gly
690 695 700
Lys Val Ile Gly Thr Thr Thr Thr Asp Ala Ser Gly Lys Tyr Lys Phe
705 710 715 720
Thr Asp Leu Asp Asn Gly Asn Tyr Thr Val Glu Phe Glu Thr Pro Ala
725 730 735
Gly Tyr Thr Pro Thr Val Lys Asn Thr Thr Ala Asp Asp Lys Asp Ser
740 745 750
Asn Gly Leu Thr Thr Thr Gly Val Ile Lys Asp Ala Asp Asn Met Thr
755 760 765
Leu Asp Arg Gly Phe Tyr Lys Thr Pro Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr
770 775 780
Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys
785 790 795 800
Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val
805 810 815
Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn
820 825 830
Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu
835 840 845
Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly
850 855 860
Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp His Asp Asp Phe Thr Leu Asp
865 870 875 880
Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
885 890 895
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
900 905 910
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
915 920 925
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
930 935 940
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
945 950 955 960
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
965 970 975
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
980 985 990
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
995 1000 1005
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser
1010 1015 1020
Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
1025 1030 1035
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser
1040 1045 1050
Asp Ala Gly Lys His Thr Pro Val Lys Pro Met Ser Thr Thr Lys
1055 1060 1065
Asp His His Asn Lys Ala Lys Ala
1070 1075
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 8
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 9
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Xaa Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 10
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Xaa Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 11
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Xaa
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (55)..(55)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 12
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Xaa Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (77)..(77)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 13
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Xaa Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (104)..(104)
<223> 除了Asn以外的任何氨基酸
<400> 14
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Xaa Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 15
Xaa Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 16
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Xaa Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 17
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Xaa Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 18
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Xaa Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 19
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Xaa Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 20
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Xaa Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 21
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Xaa Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 22
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Xaa Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (60)..(60)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 23
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Xaa Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 24
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Xaa Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (67)..(67)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 25
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Xaa Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (83)..(83)
<223> 除了Lys以外的任何氨基酸
<400> 26
Lys Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu
20 25 30
Gln Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile
50 55 60
Phe Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu
65 70 75 80
Asp Asp Xaa Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp
85 90 95
His Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
100 105 110
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 27
Asp Ala Asp Asn Met Thr Leu Asp Arg Gly Phe Tyr Lys Thr Pro Lys
1 5 10 15
Tyr Ser Leu Gly Asp Tyr Val Trp Tyr Asp Ser Asn Lys Asp Gly Lys
20 25 30
Gln Asp Ser Thr Glu Lys Gly Ile Lys Asp Val Thr Val Thr Leu Gln
35 40 45
Asn Glu Lys Gly Glu Val Ile Gly Thr Thr Lys Thr Asp Glu Asn Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Phe Asp Asn Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Lys Val Ile Phe
65 70 75 80
Glu Lys Pro Ala Gly Leu Thr Gln Thr Val Thr Asn Thr Thr Glu Asp
85 90 95
Asp Lys Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Asp Val Thr Ile Thr Asp His
100 105 110
Asp Asp Phe Thr Leu Asp Asn Gly Tyr Phe Glu Glu Asp Thr
115 120 125
<210> 28
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 28
Met Lys Thr Arg Ile Val Ser Ser Val Thr Thr Thr Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ser Ile Leu Met Asn Pro Val Ala Asn Ala Ala Asp Ser Asp Ile Asn
20 25 30
Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr
35 40 45
Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val
50 55 60
Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val
65 70 75 80
Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu
85 90 95
Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val
100 105 110
Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr
115 120 125
Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr
130 135 140
Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly
145 150 155 160
Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln
165 170 175
Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly
180 185 190
Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr
195 200 205
Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys
210 215 220
Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp Asn Phe Leu Asp Pro Asn
225 230 235 240
Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr
245 250 255
Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp
260 265 270
Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser
275 280 285
Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp Lys Trp Ile Asp Arg Ser
290 295 300
Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn
305 310 315
<210> 29
<211> 293
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 29
Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp
65 70 75 80
Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala
85 90 95
Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr
100 105 110
Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp
115 120 125
Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His
130 135 140
Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro
145 150 155 160
Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn
165 170 175
Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp
195 200 205
Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe
210 215 220
Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys
225 230 235 240
Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr
245 250 255
Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp
260 265 270
Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys
275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn
290
<210> 30
<211> 296
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 30
Met Ala Ser Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Asn Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp
35 40 45
Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile
50 55 60
Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly
65 70 75 80
Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn
85 90 95
Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr
100 105 110
Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr
115 120 125
Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser
130 135 140
Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu
145 150 155 160
Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn
165 170 175
Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro
180 185 190
Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys
195 200 205
Ala Ala Asp Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser
210 215 220
Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys
225 230 235 240
Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg
245 250 255
Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn
260 265 270
Thr Lys Asp Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp
275 280 285
Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn
290 295
<210> 31
<211> 302
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 31
Met Lys Lys Leu Leu Leu Pro Leu Ile Ile Met Leu Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser
20 25 30
Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys
35 40 45
Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu
50 55 60
Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val
65 70 75 80
Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val
85 90 95
Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr
100 105 110
Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val
115 120 125
Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys
130 135 140
Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu
145 150 155 160
Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr
180 185 190
Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe
195 200 205
Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly
210 215 220
Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr
225 230 235 240
Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys
260 265 270
Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe
275 280 285
Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
290 295 300
<210> 32
<211> 288
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 32
Met Ala Ser Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp
20 25 30
Pro Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys
35 40 45
Lys Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser
50 55 60
Lys Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly
65 70 75 80
Asp Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr
85 90 95
Ser Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val
100 105 110
Val Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu
115 120 125
Gly Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp
130 135 140
Trp Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile
145 150 155 160
Gly Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu
165 170 175
Tyr Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln
180 185 190
Ala Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys
195 200 205
Ala Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly
210 215 220
Asp Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu
225 230 235 240
Ser Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile
245 250 255
Val Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu
260 265 270
Asp Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 33
<211> 287
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 33
Met Ala Ser Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro
20 25 30
Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys
35 40 45
Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys
50 55 60
Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp
65 70 75 80
Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser
85 90 95
Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val
100 105 110
Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly
115 120 125
Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp
130 135 140
Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly
145 150 155 160
Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr
165 170 175
Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala
180 185 190
Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala
195 200 205
Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp
210 215 220
Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser
225 230 235 240
Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val
245 250 255
Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp
260 265 270
Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 34
<211> 256
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 34
Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn
35 40 45
Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln
65 70 75 80
Pro Asn Asn Glu Asp Met Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn
85 90 95
Arg Asn Thr Lys Thr Thr Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys
100 105 110
Asp Glu Asp Glu Gly Lys Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val
115 120 125
Lys Met Val Asp Asn Lys Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu
130 135 140
Lys Ile Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly
145 150 155 160
Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn
165 170 175
Pro Glu Val Pro Ser Tyr Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp
180 185 190
Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys
195 200 205
Ala Pro Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser
210 215 220
Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu
225 230 235 240
Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
245 250 255
<210> 35
<211> 234
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 35
Met Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu
1 5 10 15
Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr
35 40 45
Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met
50 55 60
Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys
85 90 95
Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile
115 120 125
Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys
130 135 140
Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
180 185 190
Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile
195 200 205
Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 36
<211> 234
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 36
Met Gly Ser Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu
1 5 10 15
Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr
35 40 45
Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met
50 55 60
Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys
85 90 95
Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val Lys Met Val Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu Lys Ile Lys Lys Glu Ile
115 120 125
Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys
130 135 140
Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn Pro Glu Val Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp Tyr Asn Val Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
180 185 190
Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser Val Gly Tyr Lys Asp Ile
195 200 205
Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Asp
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val
225 230
<210> 37
<211> 97
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 37
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln
<210> 38
<211> 104
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 38
Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln
1 5 10 15
Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu
35 40 45
Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu Leu Ile Met Ala Lys
50 55 60
Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp His Gln Lys Ala Ile
65 70 75 80
Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys
85 90 95
Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
100
<210> 39
<211> 207
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 39
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala
100 105 110
Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala
115 120 125
Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr
130 135 140
Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp
145 150 155 160
Val Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met
165 170 175
Ala Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys
180 185 190
Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成肽"
<400> 40
Ala Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 41
Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe Ser
35 40 45
Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys Phe
50 55 60
Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala Asp
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu Gln
85 90 95
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly
100 105 110
Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp
115 120 125
Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu
130 135 140
Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu
145 150 155 160
Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp
165 170 175
His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp
180 185 190
Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 42
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 42
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp
100 105 110
Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys
115 120 125
Asp Ile Glu Ala Cys Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile
130 135 140
Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala
165 170 175
Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr
180 185 190
Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 43
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 43
Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys
50 55 60
Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp
100 105 110
Gly Gly Lys Val Asp Gln Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys
115 120 125
Asp Ile Glu Ala Ala Gln Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile
130 135 140
Glu Gly Ser Asp Trp Glu Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile Met Ala Lys Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala
165 170 175
Asp His Gln Lys Ala Ile Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr
180 185 190
Asp Thr Leu Ser Ile Lys Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro
195 200 205
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 44
Pro Ser Thr Ser Glu
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成的His标签"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(10)
<223> /替代=" "
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(10)
<223> /注="该序列可涵盖3至10个'His'残基，其中一些残基可不存在"
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(10)
<223> /注="序列中给出的变体残基就变体位置的注释中的那些而言不具有优先性"
<400> 45
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成的6xHis标签"
<400> 46
His His His His His His
1 5
Claims (18)
1.包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含(i)全长SdrE蛋白或(ii)式‘B’的氨基酸序列。
2.包含金黄色葡萄球菌(S.aureus) SdrE蛋白的片段的多肽，其中：(a)所述片段包括SdrE的CnaBE3结构域；(b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白；且(c)所述多肽不包含式‘B’的氨基酸序列。
3.权利要求2的多肽，其中所述SdrE蛋白与SEQ ID NO:3具有>90%同一性。
4.任一前述权利要求的多肽，其中所述CnaBE3结构域与SEQ ID NO:8具有至少95%同一性。
5.任一前述权利要求的多肽，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:27。
6.任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽，当施用于人或小鼠时，引发识别SEQ ID NO:8内或SEQ ID NO:27内的表位的抗体。
7.任一前述权利要求的多肽，其中所述多肽具有<500个氨基酸。
8.包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中：
● 在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个氨基酸位置，所述突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代；
和/或
● 在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，所述突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代；
和/或
● 在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，所述突变体具有(i)氨基酸缺失或(ii)氨基酸取代。
9.权利要求8的多肽，其包含SEQ ID NO:9至26中的任一者。
10.包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述CnaB结构域包括异肽键。
11.权利要求10的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域来自金黄色葡萄球菌SdrE。
12.权利要求11的多肽，其中所述金黄色葡萄球菌CnaB结构域是CnaBE3结构域。
13.包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：(a) 所述CnaB结构域中的至少一个是SdrE CnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrE CnaB结构域；或(b) 所述多肽包含至少两个SdrE CnaBE3结构域。
14.免疫原性组合物，其包含任一前述权利要求的多肽。
15.权利要求14的组合物，其进一步包含以下中的一种或多种：(a) 金黄色葡萄球菌外泌多糖和载体蛋白的缀合物；(b) 金黄色葡萄球菌荚膜糖和载体蛋白的缀合物；(c) 除了SdrE多肽以外的金黄色葡萄球菌多肽；和/或 (d) 非葡萄球菌抗原。
16.权利要求15的组合物，其包括免疫佐剂。
17.在哺乳动物中引起免疫应答的方法，其包括施用有效量的权利要求14、权利要求15或权利要求16的免疫原性组合物的步骤。
18.核酸，其编码权利要求1-9中任一项的多肽。
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