CN114732898A - 一种CpG佐剂与抗原定点共价结合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉疫苗领域，具体而言涉及一种CpG佐剂与抗原的定点共价结合方法。本发明方法基于分步偶联策略，通过在SpyTag序列的N端或C端添加单个半胱氨酸，使其能够与马来酰亚胺修饰的CpG佐剂偶联，并利用液相色谱技术纯化制备CpG‑SpyTag；将抗原N端或C端与SpyCatcher融合表达并纯化；将融合表达的抗原与CpG‑SpyTag体外连接，获得抗原与CpG佐剂1:1摩尔比的偶联产物。根据本发明技术方面制备的偶联产物提高了疫苗免疫效果，降低了佐剂使用量。

Description

一种CpG佐剂与抗原定点共价结合方法
技术领域
本发明涉及疫苗领域，具体而言涉及一种CpG佐剂与抗原的定点共价结合方法以及通过该方法制备的CpG佐剂抗原偶联物。
背景技术
非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG-ODN)是指长度为20-30个核苷酸、具有免疫刺激活性的DNA重复序列，最初由Tokunaga等在研究牛分枝杆菌卡介苗时发现。Krieg等在1995年研究中表明去甲基化CpG-ODN可促进B细胞增殖，而甲基化CpG-ODN不具有该活性。CpG-ODN在体内免疫过程中可促进Th1型免疫反应，IgG2a抗体为抗体主导亚型。随后，更多研究者在其他实验中也进一步验证了该作用机制。2020年，Tsun-Yung Kuo等研究表明，以新冠病毒S蛋白RBD结构域为抗原，将CpG-ODN作为佐剂(称CpG佐剂)，同时搭配传统铝佐剂，获得了最优的免疫效果，能够促进机体产生高滴度的中和抗体。Haitao Liu等以改造后的新冠病毒S蛋白为抗原，利用CpG佐剂(CpG7909)和氢氧化铝为双佐剂，验证了该疫苗可刺激机体产生持续六个月的高滴度水平的中和抗体，可降低仓鼠肺部的炎症反应和病毒载量。三叶草生物公司的产品也是以CpG佐剂(CpG1018)和氢氧化铝为双佐剂，进行了安全性和有效性的研究：II期临床试验表明两剂疫苗免疫后，总IgG水平和中和抗体水平可持续六个月，并验证了其对α、β和γ变异株的交叉保护性。可以看出，CpG佐剂作为新型高效的疫苗佐剂，能够有效激发机体的细胞免疫，在未来的疫苗研发中具有广阔的应用前景。
目前大多数疫苗研究中CpG佐剂的使用方式均为物理混合，佐剂使用的剂量较大，因而近年来也有研究者尝试使用化学偶联方法降低CpG佐剂的使用量。2000年Helen Tighe等将CpG佐剂进行5′-硫代修饰、抗原经过N-乙基马来酰亚胺处理并用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐活化后，将二者混合，获得抗原与CpG佐剂的化学偶联产物。结果发现偶联组与物理混合组(大量CpG-ODN和抗原混合)均可激发Th1细胞免疫反应，但抗原单独免疫组未能激活T细胞产生IFN-γ。2005年Antji Heit等研究表明，CpG佐剂通过交联磺基-马来亚酰亚酰-n-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原卵清白蛋白(OVA)共价连接，可促进抗原特异性CD8+T细胞的活化和增殖，并通过攻毒实验验证了单剂量疫苗即可使机体具有免疫保护性。随后的研究表明，抗原与CpG佐剂偶联的程度影响疫苗所能激发的免疫效果，当抗原与CpG佐剂以1:1摩尔比进行偶联时，偶联产物的物理稳定性最优，激发的抗原交叉提呈反应效果最强。
在上述CpG佐剂与抗原偶联的研究中，研究者们多运用含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能交联剂进行结合反应，使CpG佐剂与蛋白抗原序列中的半胱氨酸形成偶联产物。但这种偶联形式对于含有2个以上半胱氨酸的抗原，在构建中会产生CpG佐剂与抗原偶联效率不均一、位点不可控的现象，对于疫苗产品的批次间质量控制不利。为了获得偶联位点均一可控的产品，已有研究者利用叠氮基团和炔基点击偶联作用使CpG佐剂与抗原1:1偶联，但该策略需要使用非天然氨基酸插入的方法制备蛋白抗原，不利于工业化生产。因此，如何使用较为温和简便的方法，制备偶联位点均一可控的疫苗产品，是亟待解决的问题，将有望革新现有CpG佐剂的使用方法。
SpyTag/SpyCatcher系统是从酿脓链球菌蛋白中发现的第二代分子粘合剂，借助SpyTag序列中天冬氨酸的侧链羧基与SpyCatcher序列中赖氨酸的侧链氨基自发结合形成异肽键，可以将二者在室温下进行温和快速的共价偶联。本研究基于分步偶联策略，借助该反应与经典的马来酰亚胺胺-巯基交联反应，建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。整个技术方案设计流程如附图1所示：第一步，通过合成N端加有一个半胱氨酸的改性SpyTag，使其能够与马来酰亚胺修饰的CpG佐剂(本发明中使用CpG 1018的序列)偶联；第二步，将抗原与SpyCatcher融合表达、纯化后，与SpyTag-CpG连接，即可获得抗原与CpG佐剂1:1摩尔比偶联产物。
发明内容
为了得到CpG佐剂与抗原1:1摩尔比的偶联物用于提高疫苗的免疫刺激效果，本发明人研发了一种将CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，即通过使用单个半胱氨酸，并使用分级偶联技术实现了该目的。
具体而言，本发明的技术方案涉及一种CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，其包括将N端或C端添加单个半胱氨酸的异肽键分子粘合剂Tag与马来酰亚胺修饰的CpG佐剂偶联得到CpG-异肽键分子粘合剂Tag偶联物，将抗原N端或C端与异肽键分子粘合剂Catcher融合表达得到融合抗原。因为异肽键分子粘合剂Tag序列和Catcher序列中天冬氨酸侧链羧基与赖氨酸的侧链氨基可以自发结合形成异肽键，所以可以将CpG-Tag偶联物、抗原与Catcher融合得到的融合抗原在室温下进行温和快速的共价偶联，最终得到CpG佐剂与抗原定点且以1:1摩尔比共价结合的CpG佐剂抗原偶联物。
由于上述本发明的技术方案是通过单个半胱氨酸的加入，使得通过马来酰亚胺偶联和异肽键分子粘合剂系统实现本发明的目的，即CpG佐剂与抗原1:1摩尔比偶联，因此任何CpG佐剂、任何异肽键分子粘合剂系统、任何蛋白类抗原均适用于本发明的上述方法，因此本发明的技术方案涉及上述CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，其中CpG是CpG 1018、CpG2216、CpG 2336、CpG 2007、CpG BW006/684、CpG D-SL01、CpG 2395、CpG M362、CpG D-SL03或CpG 2006/7909。
如上所述，任何异肽键分子粘合剂系统均适用于本发明的方法，因此，本发明的技术方案还涉及上述CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，其中异肽键分子粘合剂系统包括SpyCatcher/SpyTag、SpyCatcherΔN1ΔC1/SpyTag、SpyLigase/SpyTag/KTag、SnoopCatcher/SnoopTag、SpyCatcher002/SpyTag002、SnoopLigase 2/SnoopTagJr/DogTag、SpyDock/SpyTag002。
如上所述，任何蛋白类抗原均适用于本发明的方法，因此，本发明的技术方案还涉及上述CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，其中抗原是蛋白抗原和糖抗原。其中糖抗原是糖蛋白形式，蛋白作为载体。进一步地，本发明涉及到的抗原是细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫或肿瘤来源的蛋白抗原或糖抗原。进一步地，本发明涉及到的蛋白抗原是布鲁氏杆菌蛋白抗原Omp19，糖抗原是志贺氏菌表面多糖OPS(O-抗原多糖)。
在另一方面，本发明还涉及根据上述方法制备的CpG佐剂抗原偶联物，其中抗原是细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫或肿瘤来源的蛋白抗原或糖抗原，进一步地，抗原是Omp19或OPS。
在另一方面，本发明还涉及上述CpG佐剂抗原偶联物在制备疫苗中的用途。
在另一方面，本发明还涉及疫苗，其特征在于包含上述CpG佐剂抗原偶联物。
附图说明
图1是抗原与CpG佐剂定点共价结合技术的流程图。
图2是SpyTag与CpG1018偶联产物SDS-PAGE胶的荧光检测结果图。
图3是纯化SpyTag与CpG1018偶联产物的质谱分析图。
图4是SC-Omp19全菌蛋白样品的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及WB检测图。
图5是SC-Omp19蛋白的Superdex G200纯化层析图。
图6是纯化后的SC-Omp19蛋白样品的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图。
图7是SpyTag-CpG与SC-Omp19偶联产物的荧光检测图。
图8是SpyTag-CpG与SC-Omp19偶联产物的考马斯亮蓝染色图。
图9是SC-OPS糖蛋白的Superdex G200纯化层析图。
图10是SC-OPS糖蛋白纯化后SDS-PAGE检测图。
图11是SpyTag-CpG1018与SC-OPS偶联产物的荧光验证图。
图12是SpyTag-CpG1018与SC-OPS偶联产物的考马斯亮蓝验证图。
图13是CpG1018偶联抗原的免疫实验结果图。
具体实施方式
在本发明中，CpG佐剂与抗原定点共价结合是指CpG佐剂通过马来酰亚胺修饰，首先与改造的异肽键分子粘合剂Tag(多肽序列N端或C端增加单一的半胱氨酸)形成偶联中间体，随后再与抗原N端或C端和异肽键分子粘合剂Catcher的融合蛋白，在体外进行混合自发偶联，形成以1:1的摩尔比共价结合的终产物。根据本发明的共价结合方法制备的偶联物称作CpG佐剂抗原偶联物，其中CpG佐剂上的马来酰亚胺通过C-S键与异肽键分子粘合剂Tag的N端或C端上添加的半胱氨酸偶联、Tag与Catcher通过异肽键偶联、Catcher与抗原N端或C端融合表达，CpG佐剂与抗原的摩尔比为1:1。由于上述本发明的技术方案是通过单个半胱氨酸的加入，使得通过马来酰亚胺偶联和异肽键分子粘合剂系统实现本发明的目的，即CpG佐剂与抗原1:1摩尔比偶联，因此任何CpG佐剂、任何异肽键分子粘合剂系统、任何蛋白类抗原均适用于本发明的上述方法。
在本发明中，CpG-ODN或CpG佐剂是指长度为20-30个核苷酸、具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸DNA重复序列。CpG佐剂具有直接激活B细胞和抗原提呈细胞、间接激活NK细胞和T细胞的功能，其作用机制是通过与细胞内的先天性免疫模式识别受体——Toll样受体9(TLR9)结合，激活Th1型免疫应答。CpG佐剂具有不同的结构特征，一般分为A、B、C三种类型，其相对应的免疫效应也各有不同：其中A型虽然能够活化pDC细胞，但对B细胞的活化较弱；B型是发现最早、研究最清楚的CpG佐剂，已应用于疫苗临床研究；C型兼具前两种的优势，但目前临床研究中尚未有使用报道。由于本发明的抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术中，将CpG进行马兰酰亚胺修饰后与N端或C端加有一个半胱氨酸的改性SpyTag进行偶联，即CpG佐剂上的马来酰亚胺通过C-S键与异肽键分子粘合剂Tag上添加的半胱氨酸偶联，因此任何本领域中的CpG-ODN均可以适用于本发明的技术，这些CpG-ODN可以包括但不限于CpG1018、CpG 2216、CpG 2336、CpG 2007、CpG BW006/684、CpG D-SL01、CpG2395、CpG M362、CpG D-SL03或CpG 2006/7909等(见表1)。
表1.CpG序列
名称 序列(5′→3′)
CpG 1018 tgactgtgaacgttcgagatga
CpG 2216 gggggacgatcgtcgggggg
CpG 2336 ggggacgacgtcgtggggggg
CpG 2006/7909 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
CpG 2007 tcgtcgttgtcgttttgtcgt t
CpG BW006/684 tcgacgttcgtcgttcgtcgttc
CpG D-SL01 tcgcgacgt tcgcccgacgttcggta
CpG 2395 tcgtcgttttcggcgcgcgccg
CpG M362 tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat
CpG D-SL03 tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg
本发明中，异肽键分子粘合剂是指通过天冬氨酸的侧链羧基与赖氨酸的侧链氨基形成异肽键而粘合在一起的两个肽序列，其中，在本发明申请中一个分子叫做Tag，其通常较短，并包含活性天冬氨酸或赖氨酸，另一个分子叫做Catcher，其一般较长，并包含对应的活性赖氨酸或天冬氨酸。不同异肽键分子粘合剂中，两种组分的名称不同，为了更为明确的描述此类粘合剂，本文将异肽键分子粘合剂系统中的多肽分子命名为“异肽键分子粘合剂Tag”，具有催化活性的蛋白质部分命名为“异肽键分子粘合剂Catcher”。
在本发明中，可以将CpG-Tag偶联物、抗原与Catcher融合得到的融合抗原在室温下进行温和快速的共价偶联，最终得到CpG佐剂与抗原定点且以1:1摩尔比共价结合的CpG佐剂抗原偶联物。由于本发明的技术中使用了粘合剂的自发形成异肽键的基础通用原理，因此本领域任何异肽键分子粘合剂系统均适用于本发明的上述方法，异肽键分子粘合剂系统包括但不限于SpyCatcher/SpyTag、SpyCatcherΔN1ΔC1/SpyTag、SpyLigase/SpyTag/KTag、SnoopCatcher/SnoopTag、SpyCatcher002/SpyTag002、SnoopLigase 2/SnoopTagJr/DogTag、SpyDock/SpyTag002，其中异肽键分子粘合剂以及Tag对应序列见下表2。
表2.异肽键分子粘合剂名称和相应Tag序列
Figure BDA0003577238500000051
本发明中，添加单个半胱氨酸的异肽键分子粘合剂Tag是指在异肽键分子粘合剂Tag的N端或者C端添加单个半胱氨酸分子，添加方法包括化学合成，这些技术均是本领域的常规技术。
本发明的技术方案还涉及上述CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，其中抗原是蛋白抗原和糖抗原，其中对于糖抗原，抗原是糖蛋白形式，蛋白作为载体。进一步地，本发明涉及到的抗原包括但不限于细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫或肿瘤来源的蛋白抗原或糖抗原。进一步地，本发明涉及到的蛋白抗原是布鲁氏杆菌蛋白抗原Omp19，糖抗原是志贺氏菌表面多糖OPS(O-抗原多糖)。本发明通过与不同的抗原结合，证明该方法可适用于多种抗原，具有广泛性，抗原序列中的半胱氨酸数量不影响CpG佐剂与抗原以1：1摩尔比的定点共价结合。
本发明中，马来酰亚胺修饰的CpG佐剂是指在CpG核酸序列的5’端或3’端增加一个马来酰亚胺活性基团，添加方法包括化学合成，这些技术均是本领域的常规技术。
本发明中，异肽键分子粘合剂Catcher融合抗原与上述CpG-异肽键分子粘合剂Tag偶联物体外连接是指将二者混合后置于室温或低温过夜，通过自发形成异肽键实现的，这一过程不需要添加催化剂或其他额外辅助性材料，这些技术是本领域众所周知的。
本发明中，抗原是指具有预防疾病、或者通过激活免疫系统治疗疾病，例如但不限于肿瘤所采用的蛋白质、糖类抗原等，适用于本发明方法的抗原包括蛋白抗原和糖抗原，其中蛋白抗原可以来自但不限于细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫、肿瘤标志物；糖抗原可以来自但不限于细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫、肿瘤标志物，例如细菌表面的O-抗原，该抗原连接蛋白载体激活免疫系统产生免疫记忆性。由于本发明的技术方案是通过多步定点共价技术使得CpG佐剂与抗原通过两种不同的化学键以1:1摩尔比结合，抗原序列中的半胱氨酸数量对本发明技术方案的实施无影响，因此所述的预防性抗原或治疗性抗原均适用于本发明的技术方法。在本发明中，融合抗原或融合表达是指通过分子生物学常规手段，将异肽键分子粘合剂Catcher的DNA编码序列与抗原的DNA编码序列进行串联，利用真核、原核等常规表达系统进行表达、纯化。即抗原与异肽键分子粘合剂Catcher融合可以是抗原的N末端与粘合剂Catcher的C末端融合，或者是抗原的C末端与粘合剂Catcher的N末端融合。融合表达技术是本领域众所周知的，具体实施步骤包括通过PCR技术将Catcher的编码区与待表达的抗原的编码区进行扩增，然后通过限制性内切酶插入到表达载体中，转化进入表达细菌中进行表达。此外，为了得到能够表达糖抗原(含载体蛋白)，可以使用导入外源蛋白质糖基化系统的遗传改造的工程菌等。
表达后的抗原可以通过常规的技术手段进行纯化和鉴定，这些技术包括SDS-PAGE、多维液相色谱等等。
通过本发明的方法得到的偶联物可以直接用于疫苗，且与传统方法制备的抗原-佐剂混合体系相比，如此方法得到的疫苗具有更好的免疫效果，且佐剂用量少。
由于本发明以文献报道的布氏杆菌蛋白抗原Omp19和本发明人长期关注的志贺氏菌多糖抗原为模型，验证了本发明CpG佐剂定点共价结合技术的通用性，因此本发明方法可适用于各类疫苗的研发制备。抗原、CpG佐剂和异肽键分子粘合剂均有多种，换用其他抗原、其他CpG佐剂、其他粘合剂也能达到同样效果，因此，基于本方法的显著通用性，不同抗原、CpG佐剂、异肽键分子粘合剂的使用也应属于本专利保护范围。
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述，这些实施例是示例性的，不构成对所要求保护的本发明技术方案的限制。并且下述实施例中pET28a质粒、大肠杆菌等是根据本领域常规技术构建和保存的，也可以通过商业化手段获得。
实施例1：SpyTag与CpG1018的连接
马来酰亚胺修饰的CpG 1018序列如下：5’-Maleimide-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO.1)，马来酰亚胺和FAM同时修饰的CpG 1018序列如下：5’-Maleimide-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-FAM-3’，此两种修饰产物均由生工生物合成。N端添加单个半胱氨酸的SpyTag短肽序列如下：CAHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO.2)，由北京亚美多肽生物科技有限公司合成。
取1mg SpyTag缓冲液(100mmol/L磷酸二氢钠，25μmol/L TCEP，pH 7.0)将SpyTag定容至50μmol/L。取200μL浓度为50μmol/L SpyTag(2nmol)于50nmol Maleimide-CpG1018干粉中，将该反应液置于2ml EP管中，于900r/min 20℃条件下震荡3h。
实施例2：SpyTag与CpG1018的连接效果的验证
由于SpyTag与CpG1018连接后，连接产物的分子量会增加，因此通过高浓度梯度SDS-PAGE胶对连接反应结果进行检测验证。
将样品CpG1018和连接产物SpyTag-CpG1018分别进行4％-20％梯度的SDS-PAGE凝胶电泳，上样后，80V电压进样，待蛋白Marker分开后，电压加到120V，待目的蛋白跑到合适位置后停止，之后进行荧光检测。
检测结果如图2所示，因为连接后的产物分子量会明显增加，所以SpyTag与CpG1018连接的样品，会在原有CpG 1018荧光条带的上方还存在另一条荧光条带，并且上方荧光条带的分子量与目标产物分子量相符，说明SpyTag与CpG 1018已成功共价偶联因此得到了SpyTag与CpG1018的偶联产物。
实施例3：SpyTag与CpG1018偶联产物的纯化
因为马来酰亚胺修饰的CpG在水溶液中不稳定，易分解，并且SpyTag与CpG1018偶联效率并不能达到100％，所以为了提高SpyTag与CpG 1018偶联产物的纯度，有利于后续试验的进行，将SpyTag与CpG 1018偶联产物进行液相色谱纯化。连接产物经液相色谱纯化后的质谱分析结果如图3所示。SpyTag-CpG 1018偶联后的理论分子量为9100Da，质谱分析中分子量为9100Da的产物占99％，说明通过纯化可以去除绝大部分未反应的底物分子。
实施例4：SpyCatcher-Omp19质粒的构建
外膜脂蛋白(Outer membrane lipoprotein omp19，Omp19)是存在于布鲁菌表面的一种蛋白，该蛋白一般锚定于细菌外膜，在细菌吸附、侵袭宿主细胞中扮演了重要的角色。并且Omp19还能够诱导Th1型免疫应答，是对抗布鲁菌感染的重要靶标，被认为有希望成为抗布鲁菌病亚单位疫苗的重要候选组分，因此，研究Omp19具有非常重要的意义。
本例中所用到的试剂如下：LB培养基(0.5％酵母粉、1％氯化钠和1％蛋白胨)，于37℃温箱中培养。大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞购于北京全式金公司。质粒pET-SpyCatcher4573C、pET-Omp19、pET28a-pglL-SpyCatcher4573C均由本本发明人自主构建保存；pET28a-SC-Omp19(T7启动子，Kanr，His标签)质粒由本发明人构建。限制性内切酶NcoI、XhoI和BsaI购自于NEB公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶产物回收及PCR产物回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；引物由北京天一辉远公司合成。
用GoldenGate和酶切连接的方法构建SpyCatcher-Omp19表达载体(以下称SC-Omp19)。根据SpyCatcher基因序列设计引物SpyCatcher F/SpyCatcher R(序列见表3)，根据Omp19序列设计引物Omp19 F/Omp19 R(序列见表3)。以pET-SpyCatcher4573c质粒为模板扩增SpyCatcher片段。以pET-OMP19质粒为模板扩增Omp19片段。利用GoldenGate方法连接SpyCatcher片段和Omp19片段，PCR验证并回收目标大小为855bp的片段。利用限制性内切酶NcoI和Xho I双酶切SC-Omp19片段和pET28a(+)质粒。将三个片段同时加入到一个体系中，用T4连接酶16℃过夜连接后化转至BL21感受态中，加入800μL LB液体培养基，于37℃220r/min摇床中培养2h。将800μL菌液全部涂布于LB固体平板(Kan+)上，37℃恒温培养箱培养12h后，挑单克隆，用T7/T7 ter(序列见表3)通用引物PCR扩增验证，筛选出条带大小为1057bp正确的菌株，将该单克隆菌株接种于5mL液体LB培养基(Kan+)中，于37℃220r/min摇床中培养12h。
表3.质粒构建引物
Figure BDA0003577238500000091
实施例5：SC-Omp19的表达和纯化
将构建成功的BL21/SC-Omp19单克隆菌株培养于5mL液体LB培养基中，于37℃摇床中220r/min培养12h。为诱导蛋白表达，取50μL菌液转接于液体培养基中，于37℃摇床中220r/min培养至OD600nm约为0.6左右加入5μL 0.6mmol/L IPTG，于30℃摇床中220r/min培养12h。取1mL菌液离心，取沉淀用100μL去离子水重悬菌液，加入100μL 2×SDS于沸水中煮10min后，离心后取上清用于SC-Omp19考马斯亮蓝及Western-Blot验证。
SC-Omp19蛋白全菌表达的考马斯亮蓝及Western-Blot验证结果如图4所示，考马斯亮蓝染色图可见在31kDa位置有明显的蛋白表达条带，用HRP标记的Anti-His抗体进行Western Blot实验验证，在同样的位置可见目标蛋白。图4是Omp19蛋白和SC-Omp19重组蛋白的考马斯亮蓝染色图，理论上Omp19蛋白分子量为18kDa，SC-Omp19重组蛋白分子量为31kDa，因此SC-Omp19重组蛋白在SDS-PAGE胶中的位置高于Omp19。和Omp19蛋白位置相比，在31kDa位置有明显蛋白条带，与SC-Omp19重组蛋白分子量相匹配。这表明BL21(DE3)/pET28a-SC-Omp19菌株可正确表达SC-Omp19重组蛋白。
为了获得足够量和纯度的SC-Omp19重组蛋白，培养2L的菌液并诱导表达，将菌液于离心机中8000rpm/min离心10min收集菌液。用200mL平衡液A重悬菌体，用高压匀质机于4℃温度下破菌3-4次，再用离心机8000rpm/min 4℃离心10min收集上清，重复一次。将离心后上清用镍柱进行纯化。用平衡液A(10mmol/L咪唑，20mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，150mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)平衡亲和层析镍柱(Roche)，至少3个柱体积。将上清液通过A管道以2mL/min进行上样，并将流穿液重复上样两次。用平衡液A洗去非特异性蛋白，至A290紫外吸收值接近于0mAU。用洗脱液A(500mmol/L咪唑，20mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，150mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)进行洗脱，收集洗脱液。用12％SDS-PAGE预制胶分离验证后，收集目标蛋白样品。将目标蛋白样品合并，通过截留分子量为10kDa的超滤管(Millipore)浓缩，浓缩至5mL以内，用Superdex G200层析柱(GE)(1.6×90cm2)再次纯化。用1×PBS缓冲液平衡Superdex G200层析柱(GE)(1.6×90cm2)，至少1个柱床体积后，将浓缩后蛋白样品以1.5mL/min的流速上样，2ml/管进行收集。图5是SC-Omp19蛋白的SuperdexG200纯化层析图。说明通过亲和层析和凝胶过滤层析纯化，可以获得高纯度的SC-Omp19蛋白。然后将不同洗脱时间收集的SC-Omp19蛋白样品分别上样跑12％SDS-PAGE预制胶进行分离验证，待目的蛋白跑到合适位置，进行考马斯亮蓝染色。结果如图6所示，表明SC-Omp19重组蛋白具有较高的表达水平，并且可以通过纯化获得大量高纯度蛋白样品。
然后合并目标蛋白样品，用微量BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)进行蛋白定量，将SC-Omp19冻存于-80℃冰箱中备用。
实施例6：CpG1018-Omp19的制备
为了将SC-Omp19与SpyTag-CpG1018进行偶联以制备CpG1018-Omp19，在实验中将4.1μL 9mg/ml SC-Omp19(1.3nmol)加入到20μL SpyTag-CpG1018(1nmol)中，混匀后于4℃下静置连接12h使SC-Omp19与SpyTag-CpG1018偶联，然后将偶联产物用4％-12％SDS-PAGE胶进行验证，左侧泳道为SC-Omp19，右侧泳道为SpyTag-CpG 1018和SC-Omp19的偶联产物，结果如图7所示。
图7为FAM标记的SpyTag-CpG1018与SC-Omp19连接后的荧光图。其中，FAM标记的CpG1018分子量为8093.7Da，FAM标记的SpyTag-CpG1018分子量为9593.7Da。图7中可以观察到在40-50kDa位置有一条荧光条带，该荧光条带对应着偶联产物CpG1018-Omp19。同时，从同一PAGE胶的考马斯亮蓝染色图(图8)中的相同位置也显示具有一条蓝色条带，即CpG1018-Omp19，该实验结果表明已经成功将SC-Omp19与SpyTag-CpG1018进行了偶联得到偶联产物CpG1018-Omp19。
实施例7：SC-OPS的表达和纯化
为了验证本发明的方法也适用于糖抗原，本实施例构建了SpyCatcher偶联的志贺氏菌多糖蛋白抗原，以下称SC-OPS。将糖基转移酶PglL识别的糖基化序列4573融合在SpyCatcher序列的C端，以获得载有OPS多糖抗原的SpyCatcher蛋白(命名为SC-OPS糖蛋白)。O抗原连接酶基因缺失的志贺氏菌301DWP菌株由本实验室保存。
使用与实施例5相同的方法纯化SC-OPS糖蛋白，不同的是需诱导表达8L的菌液以获得充足的糖蛋白。具体实验方法是，将导入pET-PgIL-SpyCatcher4573C质粒的301DWP菌株在LB培养基中培养7h，再次接种于8L LB培养基中，37℃220rpm摇床培养至OD600nm为0.6时，用0.6M IPTG按体积比1:1000诱导表达10-12h。同样利用亲和层析的方法和凝胶过滤层析的方法对SC-OPS糖蛋白进行纯化。图9所示为SC-OPS出峰图，在80mL-100mL位置为目标糖蛋白，12％SDS-PAGE胶验证，结果如图10所示，表明SC-OPS已经成功表达和纯化。然后合并目标蛋白，浓缩后并BCA蛋白定量试剂盒定量后冻存于-80℃冰箱中备用。
实施例8：CpG1018-OPS的制备
使用与实施例6相同的方法将SC-OPS与SpyTag-CpG1018进行偶联以制备CpG1018-OPS，实验中将1.3nmol SC-OPS置于20μL SpyTag-CpG1018(1nmol)中混匀后，4℃条件下静置连接。在SC-OPS糖蛋白与SpyTag-CpG1018偶联后，用4％-20％SDS-PAGE胶进行验证，结果如图11和图12所示。图11为FAM标记CpG1018与SC-OPS连接后荧光图。在第一泳道为单独SC-OPS，可以看到第一泳道没有荧光标记条带，而在第二泳道中可以看到有明显的荧光标记条带，证明SC-OPS已与CpG1018偶联。从图12考马斯亮蓝染色图中可以看出CpG1018-OPS条带部分颜色有明显加深，由此可证明CpG-OPS与SC-OPS有重叠现象。
实施例9：CpG1018偶联抗原的免疫实验
体液免疫应答是疫苗发挥免疫效应的重要指标，酶联免疫吸附实验(ELISA)可检测免疫小鼠血清中的特异性抗体滴度，本实施例以蛋白抗原Omp19以及实施例6获得CpG1018-Omp19偶联物为例，证明CpG佐剂与抗原1:1偶联后的免疫效果。
本实验中将BALB/c小鼠随机分为4组，分别为(1)纯蛋白抗原Omp19组、(2)CpG佐剂与蛋白抗原Omp19偶联产物再与经典铝佐剂混合(CpG-Omp19+AL)组、(3)高剂量CpG佐剂、蛋白抗原Omp19偶联产物、经典铝佐剂三者混合(Omp19+CpG+AL)组、(4)低剂量/等量CpG佐剂、蛋白抗原Omp19偶联产物、经典铝佐剂三者混合(Omp19+CpG(L)+AL)组，分别在第0、14天进行皮下免疫，之后在第21天静脉取血，测定血清中针对Omp19抗原的抗体效价。结果如图13所示，单独的Omp19蛋白抗原，在无佐剂辅助的情况下，无法引起有效的免疫应答。CpG-Omp19+AL组与Omp19+CpG(L)+AL组相比，抗体水平具有统计学显著性差异，表示同等剂量抗原和同等剂量CpG佐剂同时递送，CpG佐剂与抗原偶联比混合使用，可显著增强免疫效应。另一方面，CpG-Omp19+AL组与CpG+Omp19+AL组之间同样存在统计学差异，偶联组效果更好。并且，CpG+Omp19+AL组中使用的CpG佐剂量为50μg，而CpG-Omp19+AL组中CpG佐剂的含量仅为6.9μg。
上述结果表明，当根据本发明方法将抗原与CpG偶联后，不仅具有更好的免疫效果，而且显著降低了CpG佐剂的使用量。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种CpG佐剂与抗原定点共价结合方法
<141> 2022-04-01
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgccatgg ttgatacctt a 21
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accaggtctc aaccagaacc gccaatatga gcgtcacctt tagttgc 47
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accaggtctc atggtcaaag tagtcgtttg ggcaatctg 39
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgctcgaga cgtgataagg tcacagc 27
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims (14)

1.一种CpG佐剂与抗原定点共价结合方法，包括将N端或C端添加单个半胱氨酸的异肽键分子粘合剂Tag与马来酰亚胺修饰的CpG佐剂偶联得到CpG-异肽键分子粘合剂Tag偶联物，将抗原以N端或C端与异肽键分子粘合剂Catcher融合表达得到融合抗原，然后将上述融合抗原与上述CpG-异肽键分子粘合剂Tag偶联物体外连接得到CpG佐剂与抗原定点且以1:1摩尔比共价结合的CpG佐剂抗原偶联物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的CpG佐剂是CpG 1018、CpG 2216、CpG 2336、CpG2007、CpG BW006/684、CpG D-SL01、CpG 2395、CpG M362、CpG D-SL03或CpG2006/7909。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的异肽键分子粘合剂Catcher和Tag分别是SpyCatcher和SpyTag、SpyCatcherΔN1ΔC1和SpyTag、SpyLigase和SpyTag/KTag、SnoopCatcher和SnoopTag、SpyCatcher002和SpyTag002、SnoopLigase 2/SnoopTagJr和DogTag、SpyDock和SpyTag002。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的抗原是蛋白抗原或糖抗原。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的蛋白抗原或糖抗原是细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫或肿瘤来源的蛋白抗原或糖抗原。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的蛋白抗原是布鲁氏杆菌蛋白抗原Omp19。
7.权利要求5所述的方法，其中所述的糖抗原是志贺氏菌表面多糖OPS。
8.根据权利要求1-4任一项所述方法制备的CpG佐剂抗原偶联物，其中CpG佐剂与抗原以1:1摩尔比共价结合，其中N端或C端添加单个半胱氨酸的异肽键分子粘合剂Tag与马来酰亚胺修饰的CpG佐剂偶联，抗原N端或C端与异肽键分子粘合剂Catcher偶联，异肽键分子粘合剂Tag与异肽键分子粘合剂Catcher通过异肽键偶联。
9.权利要求8所述的CpG佐剂抗原偶联物，其中所述的CpG佐剂是CpG 1018、CpG 2216、CpG 2336、CpG 2007、CpG BW006/684、CpG D-SL01、CpG 2395、CpG M362、CpG D-SL03或CpG2006/7909，所述异肽键分子粘合剂Catcher和Tag分别是SpyCatcher和SpyTag、SpyCatcherΔN1ΔC1和SpyTag、SpyLigase和SpyTag/KTag、SnoopCatcher和SnoopTag、SpyCatcher002和SpyTag002、SnoopLigase 2/SnoopTagJr和DogTag、SpyDock和SpyTag002，所述抗原是蛋白抗原或糖抗原。
10.权利要求9所述的CpG佐剂抗原偶联物，其中所述的蛋白抗原或糖抗原是细菌、病毒、真菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫或肿瘤来源的蛋白抗原或糖抗原。
11.权利要求10所述的CpG佐剂抗原偶联物，其中所述的蛋白抗原是布鲁氏杆菌蛋白抗原Omp19。
12.权利要求10所述的CpG佐剂抗原偶联物，其中所述的糖抗原是志贺氏菌表面多糖OPS。
13.根据权利要求8-12任一项所述的CpG佐剂抗原偶联物在制备疫苗中的用途。
14.一种疫苗，其特征在于包含根据权利要求8-12任一项所述的CpG佐剂抗原偶联物。
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Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104902924A (zh) * 2012-10-29 2015-09-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 金黄色葡萄球菌sdre cnab结构域及其用于接种的用途
WO2017167811A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Genia Technologies, Inc. Nanopore protein conjugates and uses thereof
CN107299107A (zh) * 2017-07-31 2017-10-27 北京大学 一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法
CN108026148A (zh) * 2015-06-05 2018-05-11 牛津大学创新有限公司 融合蛋白合成的方法和产品
US20190216893A1 (en) * 2016-06-03 2019-07-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods of modulating immune response
CN108434450B (zh) * 2018-02-06 2020-09-29 中国科学院生物物理研究所 基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗及其制备方法
CN107281476B (zh) * 2017-04-06 2020-11-24 中国医科大学 一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用
CN111991556B (zh) * 2020-10-29 2021-03-02 中山大学 SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗
CN112457390A (zh) * 2010-03-19 2021-03-09 伊玛提克斯生物技术有限公司 包括胃肠癌和胃癌的几种肿瘤的新型免疫疗法
CN113454100A (zh) * 2018-12-04 2021-09-28 洛克菲勒大学 Hiv疫苗免疫原
WO2021210984A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Erasmus University Medical Center Rotterdam Coronavirus vaccine
CN113767111A (zh) * 2019-03-14 2021-12-07 牛津大学科技创新有限公司 以增强的速率与肽标签配偶体自发形成异肽键的多肽和其用途
WO2021250626A2 (en) * 2020-06-12 2021-12-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dock tag system

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112457390A (zh) * 2010-03-19 2021-03-09 伊玛提克斯生物技术有限公司 包括胃肠癌和胃癌的几种肿瘤的新型免疫疗法
CN104902924A (zh) * 2012-10-29 2015-09-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 金黄色葡萄球菌sdre cnab结构域及其用于接种的用途
CN108026148A (zh) * 2015-06-05 2018-05-11 牛津大学创新有限公司 融合蛋白合成的方法和产品
WO2017167811A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Genia Technologies, Inc. Nanopore protein conjugates and uses thereof
US20190216893A1 (en) * 2016-06-03 2019-07-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods of modulating immune response
CN107281476B (zh) * 2017-04-06 2020-11-24 中国医科大学 一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用
CN107299107A (zh) * 2017-07-31 2017-10-27 北京大学 一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法
CN108434450B (zh) * 2018-02-06 2020-09-29 中国科学院生物物理研究所 基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗及其制备方法
CN113454100A (zh) * 2018-12-04 2021-09-28 洛克菲勒大学 Hiv疫苗免疫原
CN113767111A (zh) * 2019-03-14 2021-12-07 牛津大学科技创新有限公司 以增强的速率与肽标签配偶体自发形成异肽键的多肽和其用途
WO2021210984A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Erasmus University Medical Center Rotterdam Coronavirus vaccine
WO2021250626A2 (en) * 2020-06-12 2021-12-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dock tag system
CN111991556B (zh) * 2020-10-29 2021-03-02 中山大学 SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELEN TIGHE等: "Conjugation of protein to immunostimulatory DNA results in a rapid, long-lasting and potent induction of cell-mediated and humoral immunity", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY *
VISWAS RAJA SOLOMON等: "Nimotuzumab Site-Specifically Labeled with 89Zr and 225Ac Using SpyTag/SpyCatcher for PET Imaging and Alpha Particle Radioimmunotherapy of Epidermal Growth Factor Receptor Positive Cancers", CANCERS *
肖文等: "Toll样受体与新型佐剂―佐剂研究的新趋势", 微生物学免疫学进展 *

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