JP2018533908A - 標的ポリペプチドを提示するためのポリペプチド担体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)カグラコウモリHBVコア抗原タンパク質(RBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号1に示される)とは(a)RBHBcAgタンパク質のN末端における位置78〜83のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個のアミノ酸残基;例えば、位置78〜83のアミノ酸残基、位置78〜82のアミノ酸残基、位置78〜81のアミノ酸残基、又は位置78〜80のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、1〜40個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、30〜35個、又は35〜40個のアミノ酸残基)がRBHBcAgタンパク質のC末端において除去されている点で異なるRBHBcAg担体;
(2)テントコウモリHBVコア抗原タンパク質(TBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号2に示される)とは(a)TBHBcAgタンパク質のN末端における位置80〜84のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個のアミノ酸残基;例えば、位置80〜84のアミノ酸残基、位置80〜83のアミノ酸残基、又は位置80〜82のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、1〜35個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、又は30〜35個のアミノ酸残基)がTBHBcAgのC末端において除去されている点で異なるTBHBcAg担体;又は
(3)キクガシラコウモリHBVコア抗原タンパク質(HBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号3に示される)とは(a)HBHBcAgタンパク質のN末端における位置78〜83のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個のアミノ酸残基;例えば、位置78〜83のアミノ酸残基、位置78〜82のアミノ酸残基、位置78〜81のアミノ酸残基、又は位置78〜80のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、1〜40個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、30〜35個、又は35〜40個のアミノ酸残基)がHBHBcAgタンパク質のC末端において除去されている点で異なるHBHBcAg担体。
(1)組換えタンパク質をコードする核酸分子を得るように、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本発明の核酸分子へ(特に、ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列へ)挿入するステップ;及び
(2)ステップ(1)における組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現させて、組換えタンパク質を産生するステップ。
本発明において、他に規定がない限り、本明細書で用いられる科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解されているような意味をもつ。さらに、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験操作ステップは、対応する分野で広く用いられる日常的ステップである。加えて、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義及び説明が以下の通り、提供される。
(1)本発明は、幅広い適用性を有し、様々な標的ポリペプチド(例えば、抗原エピトープ/抗原ペプチド断片)を効率的に提示して、宿主において標的ポリペプチドに対する特異的免疫応答の発生を誘導するために用いることができる、新しいポリペプチド担体を提供する。そのような標的ポリペプチド(例えば、抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片)には、HIV由来の抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片(例えば、HIV GP120タンパク質由来の抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片;例えば、GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸を含むポリペプチド)、ヒトPD−L1タンパク質由来の抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片(例えば、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸を含むポリペプチド)、及びヒトHBV由来の抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片(例えば、ヒトHBV由来のHBsAgタンパク質の抗原性エピトープ/抗原ペプチド断片;例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸を含むポリペプチド)が挙げられるが、それらに限定されない。
(2)本発明のポリペプチド担体は、ヒトB型肝炎ウイルス由来の抗原エピトープ(ヒトHBV由来のHBsAgにおけるエピトープ)を提示するのに特に適しており、既存のB型肝炎ワクチン(例えば、同じエピトープを含み、且つポリペプチド担体としてヒトHBVのHBcAgを用いることにより構築されたワクチン)の効力より有意に良い効力で、対象においてHBsAgを排除するために、非常に強く、且つ特異的な免疫応答を誘導することができる。
本発明に関与する配列(配列番号1〜44)の部分に関する情報は、以下の表1に提供されている。
ポリペプチド担体をコードするプラスミドの構築
本実施例において、ポリペプチド担体をコードするプラスミドを構築した。
3つのコウモリ由来HBVコア抗原(すなわち、RBHBcAgタンパク質、TBHBcAgタンパク質、及びHBHBcAgタンパク質)に基づいて、以下のポリペプチド担体を設計した:
RBHBcAg189担体:RBHBcAgタンパク質の位置78〜81のアミノ酸残基が、配列番号43に示されたリンカーと置換されている点でRBHBcAgタンパク質(配列番号1)とは異なる;RBHBcAg189担体のアミノ酸配列は配列番号4に示されており、RBHBcAg189担体のヌクレオチド配列は配列番号12に示されている;
TBHBcAg188担体:RBHBcAgタンパク質の位置80〜83のアミノ酸残基が、配列番号43に示されたリンカーと置換されている点でTBHBcAgタンパク質(配列番号2)とは異なる;TBHBcAg188担体のアミノ酸配列は配列番号6に示されており、TBHBcAg188担体のヌクレオチド配列は配列番号14に示されている;
HBHBcAg189担体:RBHBcAgタンパク質の位置78〜81のアミノ酸残基が、配列番号43に示されたリンカーと置換されている点でHBHBcAgタンパク質(配列番号3)とは異なる;HBHBcAg189担体のアミノ酸配列は配列番号8に示されており、HBHBcAg189担体のヌクレオチド配列は配列番号16に示されている。
合成されたヌクレオチド配列を鋳型として用い、且つ表2におけるプライマーを用いることにより、前記4つの担体の完全長遺伝子及び切り詰め型(すなわち、C末端で切り詰められた遺伝子断片)を、それぞれ、PCRにより増幅した。8個のPCR産物、すなわち、RBHBcAg189担体をコードする遺伝子(配列番号12;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号4である)、RBHBcAg149担体をコードする遺伝子(配列番号13;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号5である)、TBHBcAg188担体をコードする遺伝子(配列番号14;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号6である)、TBHBcAg153をコードする遺伝子(配列番号15;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号7である)、HBHBcAg189担体をコードする遺伝子(配列番号16;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号8である)、HBHBcAg149担体をコードする遺伝子(配列番号17;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号9である)、HBcAg183担体をコードする遺伝子(配列番号18;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号10である)、及びHBcAg149担体をコードする遺伝子(配列番号19;それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号11である)が得られた。
組換えタンパク質の調製
本例において、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、例1で構築されたプラスミドへ挿入し、標的ポリペプチド及びポリペプチド担体を含む組換えタンパク質が得られた。組換えタンパク質が、標的ポリペプチド(標的抗原ペプチド断片)を本発明のRBHBcAg担体、TBHBcAg担体、及びHBHBcAg担体へ挿入することにより構築される、クローニングソリューションの概要は図1に示されている。
本例において、3個の標的ポリペプチドを用いて、ペプチド断片を提示することについての本発明のポリペプチド担体の多用途性を検証した。前記3個の標的ポリペプチドは以下であった:ポリペプチドHIV−GP120−aa361−375(すなわち、HIV GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号20に示されている);ポリペプチドhPDL1−aa147−160(すなわち、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号21に示されている);及びポリペプチドHBsAg−aa113−135(すなわち、ヒトHBV由来のB型肝炎表面抗原(HBsAg)の位置113〜135のアミノ酸、それのアミノ酸配列は配列番号22に示されている)。
前のステップで構築された18個の発現プラスミドを用いて、同じ方法により、発現プラスミドによりコードされる組換えタンパク質を発現し、精製した。組換えタンパク質の発現及び精製を記載するための例として、RBHBcAg149−SEQX(SEQXはSEQ20、SEQ21、又はSEQ22を表す)を用いた。
(2.2.3.1) 細菌の超音波破壊:2.2.2における細菌を、遠心分離により採取し、超音波破壊に供した。超音波処理バッファー:20mMリン酸バッファー(PH6.0)+300mM NaCl。
(2.2.3.2)組換えタンパク質の一次精製:超音波破壊後に得られた混合物を、65℃の水浴中、30分間、インキュベートし、その後、上清を遠心分離により収集した;飽和硫酸アンモニウムを上清に1:1の体積比で加え、沈殿物を遠心分離により収集した;一次精製された組換えタンパク質RBHBcAg149−SEQXを得るために、適切な体積のバッファー(20mMリン酸バッファー(pH=7.4)+150mM NaCl)を加えて、沈殿物を再懸濁した。
(2.2.3.3)クロマトグラフィによる組換えタンパク質の精製:製造会社の使用説明書に従って、2.2.3.2で得られたタンパク質を、精製組換えタンパク質を得るために、Sepharose 4FF(GE)モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィによりさらに精製した。精製された標的タンパク質をSDS−PAGEにより検出し、組換えタンパク質により形成されたVLPが、透過型電子顕微鏡(TEM)により観察された。
ウイルス様粒子の免疫原性に関する評価
本例において、本発明者らは、本発明の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子の免疫原性を検証した。全てのそのようなウイルス様粒子は、生物体において標的抗原に特異的に結合する抗体の発生を誘導することができる。
BALB/Cマウスを、例2で調製された18個のウイルス様粒子、それぞれで免疫した。免疫化過程は以下の通りであった:用いられる免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであった;免疫用量は3ug/用量であった;免疫化を、後肢の外側大腿での筋肉内注射により実施した;免疫手順は、一次免疫+2週間後の追加免疫であった(すなわち、合計2回)。
3.2.1 反応プレートの調製
反応プレートをコーティングするための抗原は、前記3個の標的ポリペプチドに対応する標的抗原、すなわち、HIV−1 gp120タンパク質(Sino Biological Inc.から購入、カタログNo.11233−V08H)、ヒトPD−L1タンパク質(Sino Biological Inc.から購入)、及びCHO細胞において組換え発現したヒトB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg、Beijing Wantai Biological Pharmacyから購入)であった。
血清試料の収集:0週間目、2週間目、及び4週間目、マウスの眼窩から血液を収集し、血清を分離して、検出まで−20℃で凍結保存した。
試料希釈:マウス血清を、20%新生仔ウシ血清を含有するPBS溶液で、7つの希釈勾配、すなわち、1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500、及び1:1562500において希釈した。
ELISA検出:コーティング化ELISAプレートの各ウェルへ、100μL希釈血清試料を加え、37℃で30分間、インキュベートした。その後、ELISAプレートを、PBST洗浄溶液(20mM PB7.4、150mM NaCl、0.1% Tween20)で5回、洗浄した。洗浄後、ELISAプレートの各ウェルへ、100μL GAM−HRP反応溶液を加え、37℃で30分間、インキュベートした。その後、ELISAプレートを、PBST洗浄溶液(20mM PB7.4、150mM NaCl、0.1% Tween20)で5回、洗浄した。洗浄後、ELISAプレートの各ウェルへ、50μL TMB発色剤(Beijing Wantai Biological Pharmacyによる提供)を加え、37℃で15分間、インキュベートした。インキュベーション後、ELISAプレートの各ウェルへ、50μL停止溶液(Beijing Wantai Biological Pharmacyによる提供)を加え、各ウェルについてのOD450/630値をELISA計器により読み取った。
抗体価の計算:読み取り値が0.2〜2.0内にある試料を分析した;希釈倍率と読み取り値で回帰曲線をプロットし、読み取り値がバックグラウンド値の2倍である試料の希釈倍率を計算した;そして、試料の希釈倍率を、血清中の特異的抗体の力価として用いた。
HBsAgエピトープ(配列番号22)を提示するウイルス様粒子の抗HBV治療効果に関する評価
本例において、本発明者らは、異なるポリペプチド担体に基づいて構築された場合の、同じエピトープペプチド(配列番号22)を提示するウイルス様粒子の抗HBV治療効果を評価した。
例1〜2に記載された方法に従って、HBsAgエピトープ(配列番号22)を提示し、且つヒトHBVのHBcAgに基づいて構築された2個の組換えタンパク質(すなわち、HBcAg183−SEQ22(それのアミノ酸配列は配列番号41に示されている);及びHBcAg149−SEQ22(それのアミノ酸配列は配列番号42に示されている))を調製し、その2個の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子を調製した。
例3.2に記載されているような方法に従って、血清中の抗HBsAg抗体価を決定し、マウス血清中のウイルス学的指標(すなわち、HBV DNA及びHBsAgのレベル)を決定した。
検出結果は、図4〜6に示されている。図4は、HBVトランスジェニック雄(図4A)及び雌(図4B)マウスの、同じエピトープペプチド(配列番号22)を提示する異なるウイルス様粒子での処置後の、時間経過に対するマウス血清中のHBsAgレベルの変化を示す。図5は、HBVトランスジェニック雄マウスの、同じエピトープペプチド(配列番号22)を提示する異なるウイルス様粒子での処置後の、時間経過に対するマウス血清中のHBV DNAレベルの変化を示す。図6は、HBVトランスジェニック雄(図6A)及び雌(図6B)マウスの、同じエピトープペプチド(配列番号22)を提示する異なるウイルス様粒子での処置後の、時間経過に対するマウス血清中のHBsAg抗体の力価の変化を示す。
異なるHBV遺伝子型由来のHBsAgのエピトープを提示するウイルス様粒子の調製及び評価
例2〜4に用いられたHBsAgエピトープ(配列番号22)は、HBV遺伝子型B由来であった。様々なHBV遺伝子型について本発明のポリペプチド担体の幅広い多用途性を確認するために、本発明者らはまた、例示的なポリペプチド担体としてRBHBcAg149及びTBHBcAg153を用いて、異なるHBV遺伝子型(遺伝子型A、C、及びD)由来のHBsAgのエピトープを提示する組換えタンパク質を構築し、その構築された組換えタンパク質の、ウイルス様粒子へアセンブリーする能力、産生されたウイルス様粒子の免疫原性、及びHBV感染に対するそれらの治療効果を評価した。
本例において、例2〜4に用いられたHBsAgエピトープ(HBV遺伝子型B由来、配列番号22)に加えて、標的ポリペプチドはさらに、HBsAg−aa113−135−A、HBsAg−aa113−135−C、及びHBsAg−aa113−135−Dと名付けられた、HBV遺伝子型A、C、及びD由来のHBsAgエピトープ(位置113〜135のアミノ酸)を含み、それらの配列(配列番号60〜62)は表4に示されている。
例2に記載されているように、前のステップで構築された6個の発現プラスミドを用いることにより、その発現プラスミドによりコードされる組換えタンパク質を発現させ、精製した。後で、その組換えタンパク質により形成されたVLPが、透過型電子顕微鏡(TEM)により観察された。
例3に記載された方法を用いることにより、上記で構築された6個の組換えタンパク質により形成されたウイルス様粒子、及び例2における組換えタンパク質RBHBcAg149−SEQ22及びTBHBcAg153−SEQ22を、それらの免疫原性について評価した。実験結果は図8に示されている。
例4に記載されているような方法を用いることにより、4個の組換えタンパク質(配列番号36、69、70、及び71)により形成されたウイルス様粒子を、抗HBV治療効果について評価した。実験結果は図9に示されている。
配列番号5:<223>RBHBcAg149担体
配列番号6:<223>TBHBcAg188担体
配列番号7:<223>TBHBcAg153担体
配列番号8:<223>HBHBcAg189担体
配列番号9:<223>HBHBcAg149担体
配列番号10:<223>HBcAg183担体
配列番号11:<223>HBcAg149担体
配列番号12:<223>RBHBcAg189担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号13:<223>RBHBcAg149担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号14:<223>TBHBcAg188担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号15:<223>TBHBcAg153担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号16:<223>HBHBcAg189担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号17:<223>HBHBcAg149担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号18:<223>HBcAg183担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号19:<223>HBcAg149担体をコードするヌクレオチド配列
配列番号23:<223>組換タンパク質RBHBcAg189-SEQ20
配列番号24:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ20
配列番号25:<223>組換タンパク質TBHBcAg188-SEQ20
配列番号26:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ20
配列番号27:<223>組換タンパク質HBHBcAg189-SEQ20
配列番号28:<223>組換タンパク質HBHBcAg149-SEQ20
配列番号29:<223>組換タンパク質RBHBcAg189-SEQ21
配列番号30:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ21
配列番号31:<223>組換タンパク質TBHBcAg188-SEQ21
配列番号32:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ21
配列番号33:<223>組換タンパク質HBHBcAg189-SEQ21
配列番号34:<223>組換タンパク質HBHBcAg149-SEQ21
配列番号35:<223>組換タンパク質RBHBcAg189-SEQ22
配列番号36:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ22
配列番号37:<223>組換タンパク質TBHBcAg188-SEQ22
配列番号38:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ22
配列番号39:<223>組換タンパク質HBHBcAg189-SEQ22
配列番号40:<223>組換タンパク質HBHBcAg149-SEQ22
配列番号41:<223>組換タンパク質HBcAg183-SEQ22
配列番号42:<223>組換タンパク質HBcAg149-SEQ22
配列番号43:<223>リンカー
配列番号45〜59、63〜68:<223>プライマー
配列番号69:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ60
配列番号70:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ61
配列番号71:<223>組換タンパク質RBHBcAg149-SEQ62
配列番号72:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ60
配列番号73:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ61
配列番号74:<223>組換タンパク質TBHBcAg153-SEQ62
Claims (16)
- ポリペプチド担体をコードするヌクレオチド配列又はそのバリアントを含む核酸分子であって、前記バリアントが、前記ヌクレオチド配列と少なくとも90%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%)の同一性を有し、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下で前記ヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力があり、前記ポリペプチド担体が、
(1)カグラコウモリHBV由来コア抗原タンパク質(RBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号1に示される)とは(a)RBHBcAgタンパク質のN末端における位置78〜83のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個のアミノ酸残基;例えば、位置78〜83のアミノ酸残基、位置78〜82のアミノ酸残基、位置78〜81のアミノ酸残基、又は位置78〜80のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、RBHBcAgタンパク質のC末端における1〜40個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、30〜35個、又は35〜40個のアミノ酸残基)が除去されている点で異なるRBHBcAg担体;
(2)テントコウモリHBV由来コア抗原タンパク質(TBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号2に示される)とは(a)TBHBcAgタンパク質のN末端における位置80〜84のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個のアミノ酸残基;例えば、位置80〜84のアミノ酸残基、位置80〜83のアミノ酸残基、又は位置80〜82のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、TBHBcAgのC末端における1〜35個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、又は30〜35個のアミノ酸残基)が除去されている点で異なるTBHBcAg担体;又は
(3)キクガシラコウモリHBV由来コア抗原タンパク質(HBHBcAg;例えば、それのアミノ酸配列は配列番号3に示される)とは(a)HBHBcAgタンパク質のN末端における位置78〜83のアミノ酸残基の1個若しくは複数のアミノ酸残基(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個のアミノ酸残基;例えば、位置78〜83のアミノ酸残基、位置78〜82のアミノ酸残基、位置78〜81のアミノ酸残基、又は位置78〜80のアミノ酸残基)が除去され、若しくはリンカー(例えば、可動性リンカー;例えば、配列番号43に示されたリンカー)で置換されている点、及び(b)任意で、HBHBcAgのC末端における1〜40個のアミノ酸残基(例えば、1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、20〜25個、25〜30個、30〜35個、又は35〜40個のアミノ酸残基)が除去されている点で異なるHBHBcAg担体
から選択され、
好ましくは、制限酵素切断部位が、前記除去される1個又は複数のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に導入され、
好ましくは、制限酵素切断部位が、前記リンカーをコードするヌクレオチド配列内に、及び/又はその末端の一方若しくは両方に導入され、
好ましくは、前記ポリペプチド担体が、配列番号4〜9から選択されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記核酸分子が、配列番号12〜17から選択されるヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸分子が、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するために用いられ、例えば、前記標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記除去される1個若しくは複数のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いは前記リンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方若しくは両方に(例えば、制限酵素切断部位により)挿入され、
好ましくは、前記核酸分子が、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記標的ポリペプチドが、前記ポリペプチド担体に対して異種性であり、且つ前記標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記除去される1個若しくは複数のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いは前記リンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方若しくは両方に(例えば、制限酵素切断部位により)挿入され、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、エピトープペプチド、例えば、HIV、PDL1、又はHBV(特に、ヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)、HIV GP120タンパク質のエピトープ(例えば、GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸などの直線状エピトープ)、又はヒトPD−L1のエピトープ(例えば、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号20〜22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記核酸分子が、配列番号23〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、又はそれからなる、上記核酸分子。 - 請求項1に記載の核酸分子を含むベクター(例えば、クローニングベクター又は発現ベクター)。
- 請求項1に記載の核酸分子又は請求項2に記載のベクターを含む宿主細胞。
- (1)組換えタンパク質をコードする核酸分子を得るように、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、請求項1に記載の核酸分子へ挿入するステップであって、好ましくは、前記標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記除去される1個若しくは複数のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの位置に挿入され、或いは前記リンカーをコードするヌクレオチド配列内に、又はその末端の一方若しくは両方に(例えば、制限酵素切断部位により)挿入される、ステップ;及び
(2)ステップ(1)における前記組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現させて、前記組換えタンパク質を産生するステップ
を含む、標的ポリペプチドを提示するための方法であって、
好ましくは、前記標的ポリペプチドが、エピトープペプチド、例えば、HIV、PDL1、又はHBV(特に、ヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)、HIV GP120タンパク質のエピトープ(例えば、GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸などの直線状エピトープ)、又はヒトPD−L1のエピトープ(例えば、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号20〜22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質をコードする核酸分子が、配列番号23〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、又はそれからなる、上記方法。 - ポリペプチド担体及び標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチド担体が、請求項1に定義されている通りであり、前記標的ポリペプチドが、前記除去される1個若しくは複数のアミノ酸残基の位置に挿入され、或いは前記リンカー内に、又はその末端の一方若しくは両方に挿入され、
好ましくは、前記ポリペプチド担体が、配列番号4〜9から選択されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記標的ポリペプチドが、エピトープペプチド、例えば、HIV、PDL1、又はHBV(特に、ヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)、HIV GP120タンパク質のエピトープ(例えば、GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸などの直線状エピトープ)、又はヒトPD−L1のエピトープ(例えば、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、
好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号20〜22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号23〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、上記組換えタンパク質。 - 請求項5に記載の組換えタンパク質を含み、又はそれからなるウイルス様粒子。
- 請求項5に記載の組換えタンパク質、又は請求項6に記載のウイルス様粒子、及び任意で、1つ又は複数の薬学的に許容される媒体又は賦形剤(例えば、アジュバント)を含む医薬組成物(例えば、ワクチン)。
- HBV感染、又はHBV感染に関連した疾患(例えば、B型肝炎)を予防又は処置するための方法であって、それを必要としている対象に、請求項5に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載のウイルス様粒子又は請求項7に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、前記標的ポリペプチドが、HBV(特にヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号35〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、上記方法。
- HBV感染、又はHBV感染に関連した疾患(例えば、B型肝炎)を予防又は処置するための薬物の製造における請求項5に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載のウイルス様粒子の使用であって、前記標的ポリペプチドが、HBV(特にヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号35〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、上記使用。
- 前記標的ポリペプチドが、HBV(特にヒトHBV)由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトHBV(例えば、HBV遺伝子型A、B、C、又はD)由来のHBsAgのエピトープ(例えば、HBsAgタンパク質の位置113〜135のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号22及び60〜62から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号35〜40及び69〜74から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、HBV感染、又はHBV感染に関連した疾患(例えば、B型肝炎)の予防又は処置における使用のための、請求項5に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載のウイルス様粒子又は請求項7に記載の医薬組成物。
- 請求項5に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むベクター(例えば、クローニングベクター又は発現ベクター)。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド又は請求項12に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項13に記載の宿主細胞を、前記組換えタンパク質を発現させるのに適した条件下で培養するステップ、及び前記組換えタンパク質を回収するステップを含む、請求項5に記載の組換えタンパク質を調製するための方法。
- HIV感染、又はHIV感染に関連した疾患(例えば、AIDS)を予防又は処置するための薬物の製造における請求項5に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載のウイルス様粒子の使用であって、前記標的ポリペプチドが、HIV由来の抗原性エピトープを含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、HIV由来の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、HIV GP120タンパク質のエピトープ(例えば、GP120タンパク質の位置361〜375のアミノ酸などの直線状エピトープ)を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号20に示されたアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号23〜28から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、上記使用。
- 癌(例えば、非小細胞肺癌)を予防又は処置するための薬物の製造における請求項5に記載の組換えタンパク質又は請求項6に記載のウイルス様粒子の使用であって、前記標的ポリペプチドが、ヒトPD−L1タンパク質の抗原性エピトープを含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、ヒトPD−L1タンパク質の抗原性エピトープを含むエピトープペプチドであり、好ましくは、前記エピトープペプチドが、ヒトPD−L1タンパク質の位置147〜160のアミノ酸を含み、好ましくは、前記標的ポリペプチドが、配列番号21に示されたアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号29〜34から選択されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、上記使用。
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