JP6196382B2 - ヒト耐虫遺伝子およびそれによりコードされた抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体ならびに用途 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子工学および生物的防除の分野に関し、特にヒト耐虫遺伝子およびそれによりコードされた抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体ならびに用途に関する。

現在、病害虫の生物的防除に世界的に広範に用いられている殺虫遺伝子は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）のＢｔ毒素遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｆなど）である。バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）は、昆虫性病原細菌であり、産生されるＢｔ毒素は、多種の農林害虫に対して特異的な毒殺作用を有する。１９８７年に、ベルギーのプラントジェネティックシステムズ社（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が、Ｂｔ遺伝子導入耐虫タバコの取得に成功したことを世界で初めて報告し、現在に至るまで、Ｂｔ遺伝子は、すでにトウモロコシ、イネ、ワタ、トマト、ジャガイモ、タバコなどの世界の主要農作物に遺伝子導入されている。２０１２年国際アグリバイオ事業団の統計によれば、中国で栽培されているＢｔ導入ワタの面積は、すでに３９０万ヘクタールを超えており、ワタ栽培総面積の７１．５％を占める。しかしながら、Ｂｔ遺伝子導入作物の使用および普及に伴い、遺伝子流動、土壌微生物の生態構造の改変、種の薬剤耐性および正常な免疫系への危害などの面で存在する可能性のある潜在的な危害が、社会的な注目を集めている。「Ｂｔ遺伝子導入トウモロコシの根圏微生物および細菌生理群の多様性」（王敏ら、生態学雑誌、２０１０年０３期）および「Ｂｔ遺伝子導入トウモロコシの土壌細菌数の多様性に対する影響」（劉玲ら、生態・農村環境学報、２０１１年０３期）は、それぞれ屋内、屋外でＢｔ導入トウモロコシを栽培した土壌について、細菌数および多様性の分析を行い、その結果、いずれも、Ｂｔ導入トウモロコシを栽培した群とブランク対照群とを比較し、有意差が認められることがわかった。

「Ｃｒｙ１Ａｃ ｐｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｐａｄｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０００年０１期）は、動物実験において、マウスが摂取したＢｔ内毒素、外毒素が１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇに達したときに、マウスのＴ細胞ＡＮＡＥ陽性率、脾臓指数およびマクロファージの食作用に、いずれも著しい抑制反応が認められ、摂取量の増加に伴い、こうした抑制作用が著しくなることがわかった。この試験の結果、動物体内のＢｔ毒素の蓄積係数が６．２４を上回ったときに、肝臓、腎臓および消化管などの損傷がもたらされ、肝臓および腎臓において、細胞膨張および空胞変性といった異常が観察され、糸球体血管上皮細胞の病変がもたらされることがさらにわかった。当然ながら、免疫反応によってもたらされたことを排除することはできない。長期的に大用量でＢｔ毒素タンパク質を使用すると、動物白血球総数およびヘモグロビン含量が著しく低減し、このことも、Ｂｔ毒素タンパク質が著しい免疫抑制毒性を有していることを説明している。Ｂｔ毒素生物活性を有する代替的生物エフェクター（例えば、抗イディオタイプ抗体）を開拓することは、生物農薬開発分野の研究の焦点となっている。

ヒト化された抗体遺伝子は、ヒトに由来するため、ヒトの免疫系遺伝子と同源であるという長所を有し、その製剤の散布または遺伝子導入発現後に、食品中の残留により人体の免疫系に危害をもたらすことを回避することができる。

１９７４年に、デンマークの免疫学者Ｊｅｒｎｅが、その「免疫ネットワーク理論（Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｔｈｅｏｒｙ）」において、抗イディオタイプ抗体の概念を初めて提出した。抗イディオタイプ抗体（Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下、Ａｎｔｉ−Ｉｄという）とは、抗体分子可変領域に位置するイディオタイプ（Ｉｄｉｏｔｙｐｅ，Ｉｄ）によって産生される特異的な抗体を指す。Ｂｏｎａらは、ＩｄとＡｎｔｉ−Ｉｄの血清学的反応およびＡＩｄの機能に基づき、抗イディオタイプ抗体を４種類（α、β、γおよびε）に分けている。β型抗イディオタイプ抗体は、「インターナルイメージ」作用を有する、すなわち、（半）抗原と同じ抗原決定基を有するため、抗原の機能および生物活性を有することができる。

現在、ファージディスプレイ技術を用いて、ファージ抗体ライブラリを構築することによって、特異的な選択を経て、標的抗原類似効果を有する抗イディオタイプ抗体を得ることができると普遍的に考えられている。ファージディスプレイ技術を用いて特異的な抗体を選択するプロセスは、「パンニング（Ｐａｎｎｉｎｇ）」と呼ばれ、主に、結合、洗浄、溶出および増幅の４つのステップを含む。Ｒａａｔｓらは、抗コルチゾールモノクローナル抗体を用いて被覆し、固相抗原として直接選択を行い、選択を行う前に、同じ種属の陰性モノクローナル抗体を用いて負の選択を行い、抗体定常領域と結合した組換え抗体セグメントを選択することを回避し、コルチゾールに対するＡｎｔｉ−Ｉｄの選択に最終的に成功した。Ｇｏｌｅｔｚらは、同様に、ファージ抗体ディスプレイシステムを用いて、異なる溶出方法の抗イディオタイプ抗体セグメント選択結果に対する影響を研究して比較し、最終的に選択した９６個のクローンのうち、２８個が抗イディオタイプ特性を有する陽性クローンであった。現在、代替可能なＢｔ活性エフェクター、特に抗Ｂｔ毒素タイプの抗イディオタイプ一本鎖抗体（以下、Ａｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓという）などの関連材料および製品について、報告はない。

現在のＢｔ毒素導入作物およびその毒素製剤の広範な使用に存在している安全面でのリスクおよび過敏反応などの問題について、Ｂｔ毒素生物活性を有する代替可能な生物エフェクターを開拓し、害虫の生物的防除に用いることを、本発明は次の通り実現する。
ヌクレオチド配列が配列番号１で示される、ヒト耐虫遺伝子。
アミノ酸配列が配列番号２で示される、本発明における、配列番号１によりコードされた抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体。
本発明における、ヒト耐虫遺伝子配列番号１を含有する原核細胞用発現ベクター。
本発明における、ヒト耐虫遺伝子配列番号１の農業害虫防除の面の用途。
本発明における、アミノ酸配列が配列番号２で示される抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を含む殺虫剤。

本発明は、公開されているヒト遺伝子プールにおいて、殺虫活性を有する「β」タイプの抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を選択して取得し、この一本鎖抗体は、原核系発現を経て、その初代培養物はコブノメイガ中腸囲食膜特異性受容体ＢＢＭＶとの結合活性を有し、本発明は、動物免疫を経ずに「β」タイプの抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を得ることができ、調製周期は短く、アミノ酸配列は小さく、体外での大規模生産に適している。また、本発明を新しい新耐虫遺伝子資源とし、Ｂｔ毒素を模した生物活性を有する新型耐虫遺伝子資源を探索して開拓し、従来のＢｔ毒素の広範な使用に存在する各種の安全面でのリスクを低減し、ひいては、今後、Ｂｔに代わって農業害虫の生物的防除に用いられる可能性があり、殺虫剤の使用の減少などに対し、重要な科学的および現実的な意義を有する。

Ｃ７のＥＬＩＳＡ測定結果の概略図である。 Ｃ７の生物学的測定結果の概略図である。 それぞれＣ７、ＣＫ＋、ＣＫ−に浸したイネの葉を与えた後のコブノメイガ三齢幼虫の死亡状況の概略図である。 それぞれＣ７、ＣＫ＋、ＣＫ−に浸したキャベツを与えた後のコナガ三齢幼虫の死亡状況の概略図である。

実施例１ ヒト耐虫遺伝子の選択
実施例で用いた試薬および培地の配合：
（１）２×ＴＹ液体培地：
再蒸留水９００ｍＬにトリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを加え、撹拌して均等に混合し、再蒸留水で１Ｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（２）２×ＴＹ−ＡＧ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび質量比１％のグルコースを加えた。
（３）２×ＴＹ−ＡＫ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた。
（４）２×ＴＹ−ＡＫＧ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび質量比１％のグルコースを加えた。
（５）ＴＹＥ寒天培地：
再蒸留水９００ｍｌにアガロース１５．０ｇ、ＮａＣｌ ８ｇ、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇを加え、再蒸留水で１Ｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（６）ＴＹＥ−ＡＧ寒天培地：
ＴＹＥ寒天培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび質量比１％のグルコースを加えた。

（７）ＰＢＳ溶液
ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ２．９ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２ｇを秤取し、それぞれ蒸留水の中に加え、充分に溶解した後、１Ｌに定容した。
（８）ＰＢＳＴ溶液
ＰＢＳ溶液に体積比０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えた。
（９）ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液：
ＰＥＧ ８０００ ２０ｇ、ＮａＣｌ １４．６１ｇを秤取し、脱イオン水８０ｍｌを加え、１００ｍｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（１０）クエン酸塩緩衝液（ＣＰＢＳ、ｐＨ＝５．５）：
Ｃ_６Ｈ_７Ｏ_８（クエン酸）２１ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ７１．６ｇを取り、それぞれ蒸留水に加え、充分溶解した後、１Ｌに定容した。
（１１）テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液：
テトラメチルベンジジン１０ｍｇを秤取してジメチルスルホキシド１ｍｌに溶かし、光を避け、使用に備えて４℃で保存した。
（１２）基質呈色溶液：
１０ｍｌ配合成分：ＣＰＢＳ ９．８７５ｍｌ、ＴＭＢ溶液 １００μｌ、体積比が２０％のＨ_２Ｏ_２ ２５μｌ。

実施例で用いた材料の入手先：
抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体、ＢＢＭＶ、関連しない抗イディオタイプ一本鎖抗体、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖ、キャベツの葉、コナガ三齢幼虫は、いずれも江蘇省農業科学院農業部農産品品質安全制御技術・規格重点実験室が提供した。
ヒト化されたファージ抗体ライブラリ、ＴＧ１細菌およびヘルパーファージＫＭ１３は、英国Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
ＨＲＰ−ヤギ抗Ｍ１３−ＩｇＧは、武漢博士徳社から購入した。
Ｃｒｙ１Ｂ毒素およびＣｒｙ１Ａｂ毒素は、上海佑隆生物科技有限公司から購入した。
イネの葉およびコブノメイガ三齢幼虫は、揚州緑源生物化工有限公司が提供した。

実施例１ 抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体の選択
（１）ヒト化されたファージ抗体ライブラリ菌液２０μｌを取り、２×ＴＹ−ＡＧ液体培地２００ｍｌに加え、ＯＤ_６００が０．４になるまで３７℃で恒温培養し、菌液５０ｍｌを取り、１×１０^１２ ｐｆｕヘルパーファージＫＭ１３を加え、重複感染を行い、３７℃で３０分間培養した後、３３００ｇで１０分間遠心し、上澄液を廃棄し、２×ＴＹ−ＡＫＧ液体培地１００ｍｌで再懸濁して沈殿させ、３０℃で一晩培養した。翌日、３３００ｇで３０分間遠心し、上澄液を収集し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液２０ｍｌを加え、１時間氷浴した後、再び３３００ｇで３０分間遠心し、ＰＢＳ ４ｍｌを用いて再懸濁して沈殿させた。再懸濁液を１１６００ｇで１０分間遠心し、上澄液を増幅したファージ抗体ライブラリとした。

（２）ステップ１で得た増幅したファージ抗体ライブラリを取り、４回のパンニングを行った。１回目のパンニングでは、１００μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体４ｍｌで細胞培養ボトルの底部を被覆し、４℃で一晩置き、翌日、それぞれＰＢＳ １ｍｌで細胞培養ボトルを３回洗浄した後、均等に混合した増幅したファージ抗体ライブラリ１ｍｌおよび３％のＭＰＢＳ溶液４ｍｌを加え、シェーカーに置き、室温でゆっくりと１時間振盪し、さらに１時間静置した後、培養ボトルの中の液体を注ぎ出し、それぞれＰＢＳＴ溶液１ｍｌでボトルを２０回洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）１ｍｌを加えて、特異的に結合したファージ抗体を溶出し、溶出液を１回目のパンニングのファージ抗体とした。２回目、３回目、４回目のパンニングで被覆した抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体の濃度は、それぞれ５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌであり、用いたファージ抗体は、前回のパンニングで得られたファージ抗体であり、パンニング方法は、１回目と同じとした。４回目のパンニングのファージ抗体１０μｌを取り、対数増殖期にあるＴＧ１細菌１ｍｌに感染させ、３７℃で１時間培養した後、ＴＹＥ−ＡＧ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。翌日、シングルコロニーを無作為にピックアップし、１００μｌ／ウェルの２×ＴＹ−ＡＧ液体培地を含む９６ウェルプレートに接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、ウェルの中から菌液を２μｌ吸い出し、新しい９６ウェルプレートのウェルの中に移し、３７℃で２時間培養した。各ウェルに力価１０^１２のヘルパーファージＫＭ１３を２５μｌ加え、３０℃で２時間培養し、１８００ｇで１０分間遠心し、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地１５０μｌで再懸濁し沈殿させた後、３０℃で一晩培養した。翌日、１８００ｇで３０分間遠心し、それぞれ上澄液を取った。

（３）４μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体を取り、９６ウェルプレートの中に加え、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩置き、翌日、各ウェルにそれぞれステップ２で得た上澄液１００μｌを加え、陰性対照は、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地を１００μｌ加え、３７℃で２時間水浴し、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで洗浄した後、各ウェルに１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗Ｍ１３−ＩｇＧを１００μｌ加え、３７℃で２時間培養した。各ウェルに基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルに濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加え、反応を素早く終了させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定した。溶液のＯＤ_４５０値／陰性対照のＯＤ_４５０値が２．１を上回った場合、陽性と判断し、この溶液に対応するステップ２の上澄液を、選択された抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を含有する上澄液とした。

サンガーシークエンシング法で、選択された抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を測定し、ヌクレオチド配列が配列番号１であるものは次の通りであった。
ａｔｔｇｔｃｔｇｃｇ ｇｃｃｃｃｇｔｇａｔ ｇｇｔｇａｔｇａｔｇ ａｔｇｔｇｃｇｇｃｃ ｇｃｃｃｇｔｔｔｇａ ｔｔｔｃｃａｃｃｔｔ ６０
ｇｇｔｃｃｃｔｔｇｇ ｃｃｇａａｃｇｔａｇ ａａｇｇａｔａａｇｃ ａｇｃａｇｃｃｔｇｔ ｔｇａｃａｇｔａｇｔ ａａｇｔｔｇｃａａａ １２０
ａｔｃｔｔｃａｇｇｔ ｔｇｃａｇａｃｔｇｃ ｔｇａｔｇｇｔｇａｇ ａｇｔｇａａａｔｃｔ ｇｔｃｃｃａｇａｔｃ ｃａｃｔｇｃｃａｃｔ １８０
ｇａａｃｃｔｔｇａｔ ｇｇｇａｃｃｃｃａｃ ｔｔｔｇｃａａａｇａ ｇｇａｔｇｃａｃｔａ ｔａｇａｔｃａｇｇａ ｇｃｔｔａｇｇｇｇｃ ２４０
ｔｔｔｃｃｃｔｇｇｔ ｔｔｃｔｇｃｔｇａｔ ａｃｃａａｔｔｔａａ ａｔａｇｃｔｇｃｔａ ａｔｇｃｔｃｔｇａｃ ｔｔｇｃｃｃｇｇｃａ ３００
ａｇｔｇａｔｇｇｔｇ ａｃｔｃｔｇｔｃｔｃ ｃｔａｃａｇａｔｇｃ ａｇａｃａｇｇｇａｇ ｇａｔｇｇａｇａｃｔ ｇｇｇｔｃａｔｃｔｇ ３６０
ｇａｔｇｔｃｃｇｔｃ ｇａｃｃｃｇｃｃａｃ ｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃ ａｃｃｔｃｃｇｃｃｔ ｇａａｃｃｇｃｃｔｃ ｃａｃｃｇｃｔｃｇａ ４２０
ｇａｃｇｇｔｇａｃｃ ａｇｇｇｔｔｃｃｃｔ ｇｇｃｃｃｃａｇｔａ ｇｔｃａａａａｔａａ ｇｃａｃｃａｇａｔｔ ｔｃｇｃａｃａｇｔａ ４８０
ａｔａｔａｃｇｇｃｃ ｇｔｇｔｃｃｔｃｇｇ ｃｔｃｔｃａｇｇｃｔ ｇｔｔｃａｔｔｔｇｃ ａｇａｔａｃａｇｃｇ ｔｇｔｔｃｔｔｇｇａ ５４０
ａｔｔｇｔｃｔｃｔｇ ｇａｇａｔｇｇｔｇａ ａｃｃｇｇｃｃｃｔｔ ｃａｃｇｇａｇｔｃｔ ｇｃｇｔａａｃｃｔｇ ｔａｇｃａｃｃａｃｃ ６００
ａｔｔａｔｔａｇｃａ ａｔａｇｔｔｇａｇａ ｃｃｃａｃｔｃｃａｇ ｃｃｃｃｔｔｃｃｃｔ ｇｇａｇｃｃｔｇｇｃ ｇｇａｃｃｃａｇｃｔ ６６０
ｃａｔｇｇｃａｔａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｇ ｔｇａａｔｃｃａｇａ ｇｇｃｔｇｃａｃａｇ ｇａｇａｇｔｃｔｃａ ｇｇｇａｃｃｃｃｃｃ ７２０
ａｇｇｃｔｇｔａｃｃ ａａｇｃｃｔｃｃｃｃ ｃａｇａｃｔｃｃａａ ｃａｇｃｔｇｃａｃｃ ｔｃｇｇｃｃａｔｇｇ ｃｃｇｇｃｔｇｇｇｃ ７８０
ｃｇｃｇａｇｔａａｔ ａａｃａａｔｃｃａｇ ｃｇｇｃｔｇｃｃｇｔ ａｇｇｃａａｔａｇｇ ｔａｔｔｔｃａｔｔａ ｔｇａｃｔｇｔｃｔｃ ８４０
ｃｔｇａａａｔａｇａ ａｔｔｇｔ ８５５

サンガーシークエンシング法で、選択された抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を測定し、ヌクレオチドの翻訳後のアミノ酸配列が配列番号２であるものは次の通りであった。
Ｈ−ＣＤＲ１
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲ ６０
Ｈ−ＣＤＲ２ −−
ＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＡＮＮＧＧＡＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ １２０
Ｈ−ＣＤＲ１ −−−−−−−−−−−Ｌｉｎｋ−−−−−−−−−−−− −−−−−−
ＳＧＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ １８０
Ｌ−ＣＤＲ１ Ｌ−ＣＤＲ２
ＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ ２４０
Ｌ−ＣＤＲ３ Ｈｉｓ−ｔａｇ
ＹＣＱＱＡＡＡＹＰＳＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＳＴＰ ２９１
本出願人は、この抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を自らＣ７と命名した。

実施例２ Ｃ７の初代培養物の調製
実施例１で選択された抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体を含有する上澄液を、体積比１：１００で２×ＴＹ−ＡＧ液体培地１０ｍｌの中に移し、３７℃で２時間培養し、力価１０^１２のヘルパーファージＫＭ１３を１００μｌ加えて救援し、３０℃で２時間培養し、１８００ｇで１０分間遠心し、上澄液を除去し、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地を用いて再懸濁して菌種を沈殿させ、３０℃、２５０ｒｐｍで振盪し、一晩培養した。翌日、１８００ｇで３０分間遠心し、その上澄液を、Ｃ７初代培養物を含有する上澄液とした。

実施例３ Ｃ７の亜型同定
（１）競合抑制ＥＬＩＳＡ測定試験
試験は、６個の試験群と対応する対照群に分け、それぞれ表１により溶液を調製した。

それぞれ表１により調製した溶液に、１０μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体を５０μｌ加え、３７℃で２時間培養した後、それぞれ２μｇ／ｍｌ Ｃｒｙ１Ｂ毒素で被覆した９６ウェルプレートの中（前記２μｇ／ｍｌ Ｃｒｙ１Ｂ毒素で被覆した９６ウェルプレートは、前日に２μｇ／ｍｌのＣｒｙ１Ｂ毒素を取り９６ウェルプレートの中に加え、１００μｌ／ウェルとし、４℃で一晩置いた）で２時間反応させた。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルにそれぞれ１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧを１００μｌ加え、室温で１時間培養した。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルにそれぞれ基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルにそれぞれ濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加え、反応を素早く終了させた。マイクロプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定した。

実験結果は図１に示した通りであり、抑制率はＣ７含量の増加に伴い増大することがわかり、対照群には競合抑制現象がなく、Ｃ７は、β型抗イディオタイプ一本鎖抗体であり、Ｃｒｙ１Ｂ毒素を模して競合し、抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素ポリクローナル抗体と結合したことを説明している。

（２）生物学的測定試験
試験は、試験群１、試験群２、試験群３、陽性対照群、陰性対照群１、陰性対照群２、陰性対照群３に分け、試験の手順は次の通りとした。
（ａ）密封：１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌのＢＢＭＶを、９６ウェルプレートの中に入れ、４℃で一晩置き、翌日、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、それぞれ質量比３％のＢＳＡを２００μｌ入れ、室温で２時間培養し、密封した。
（ｂ）試料添加：ステップ１で密封した９６ウェルプレートを、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、それぞれ９６ウェルプレートに表２により試料を添加した。

（ｃ）ステップｂで試料を添加した９６ウェルプレートを、室温で２時間培養し、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルに１０μｇ／ｍｌ抗Ｃｒｙ１Ｂポリクローナル抗体を１００μｌ加え、再び各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄し、各ウェルに１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧを１００μｌ加え、室温で１時間培養した。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄し、各ウェルに基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルに濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加え、反応を素早く終了させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定した。

実験結果は図２に示した通りであり、陽性対照に比べ、抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体Ｃ７（試験群１、２、３）は、Ｃｒｙ１Ｂ毒素とその受容体ＢＢＭＶとの結合を抑制することができたが、「β」タイプ以外の陰性対照には抑制現象がなく、Ｃ７が「β」タイプであることがさらに実証された。

実施例４ 抗Ｃｒｙ１Ｂ毒素イディオタイプ一本鎖抗体の殺虫活性の検証
試験は、試験群と対照群に分けて行われた。
試験群は、実施例２で得られたＣ７初代培養物を含有する上澄液（Ｃ７）を用いた。
陽性対照群は、濃度０．２ｇ／ＬのＣｒｙ１Ａｂ毒素（ＣＫ＋）を用いた。
陰性対照群は、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓ（ＣＫ−）を用いた。

試験手順：
試験群、陽性対照群、陰性対照群を各１０ｍｌ取り、滅菌したペトリ皿の中に入れ、それぞれイネの葉６枚およびキャベツの葉６枚を入れ、３０分間浸し、取り出して陰干しした。コブノメイガ三齢幼虫およびコナガ三齢幼虫に、陰干しした葉を与えた。

試験結果は図３、４に示した通りであり、図３は、それぞれＣ７、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素（ＣＫ＋）、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓ（ＣＫ−）で浸したイネの葉を与えた後のコブノメイガ三齢幼虫の死亡状況であり、図４は、それぞれＣ７、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素（ＣＫ＋）、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓ（ＣＫ−）で浸したキャベツを与えた後のコナガ三齢幼虫の死亡状況であり、Ｃ７が比較的優れた殺虫効果を有することがわかる。

Claims (4)

1. ヌクレオチド配列が配列番号１で示されるヒト耐虫遺伝子。
2. 請求項１に記載のヒト耐虫遺伝子を含有する原核細胞用発現ベクター。
3. 請求項１に記載のヒト耐虫遺伝子を含む農業害虫防除剤。
4. 請求項１に記載のヒト耐虫遺伝子を、農業害虫を防除するために使用する農業害虫防除方法。

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