CN105611941A

CN105611941A - 猪痢疾疫苗

Info

Publication number: CN105611941A
Application number: CN201480048107.1A
Authority: CN
Inventors: 佩德罗·米格尔·鲁比奥·尼斯特; 安娜·玛利亚·卡瓦雅尔·乌鲁埃尼亚; 玛尔塔·加西亚·迪兹
Original assignee: AQUILON CYL SANIDAD ANIMAL; Universidad de Leon
Current assignee: AQUILON CYL SANIDAD ANIMAL; Universidad de Leon
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-06-27
Also published as: AU2014300951B2; EP3013363B1; RU2692647C2; ES2828873T3; US20160184418A1; WO2014207202A1; PL3013363T3; RU2016102767A; CN105611941B; EP3013363B9; US9855322B2; BR112015032468A2; BR112015032468B1; EP3013363A1; DK3013363T3; AU2014300951A1

Abstract

本发明涉及包含Brachyspira？hyodysenteriae的组合物，部分属于针对猪痢疾的免疫接种领域。本发明的组合物包括来自Brachyspira？hyodysenteriae的至少两种基因多样性菌株的细菌。本发明还涉及本发明的组合物用作疫苗的用途，优选为作为一种针对由Brachyspira？hyodysenteriae引起的猪痢疾的通用疫苗。

Description

猪痢疾疫苗

技术领域

本发明涉及包含Brachyspirahyodysenteriae(猪痢疾短螺旋体)细菌的组合物，尤其涉及针对猪痢疾的免疫领域。

背景技术

猪痢疾(SD)，由螺旋体Brachyspirahyodysenteriae结肠感染引起，仍是全世界范围内的重大问题。它主要影响育肥期的猪。Brachyspirahyodysenteriae是一种革兰氏阴性耐氧厌氧螺旋菌，其定殖在猪大肠，引起猪痢疾(SD)。此疾病的特征在于严重粘膜出血性腹泻，主要影响生长育肥周期期间的动物，且在所有主要猪饲养国家中均有发现(Hidalgo,A.etal.,Journalofclinicalmicrobiology(2010),48(8):2859-2865)。

SD是一种在世界各地广泛分布的疾病，但有关的流行病学研究稀缺，且已报道的患病率差异显著。因此已报道的，B.hyodysenteriae患病率范围在0％至接近40％之间。患病率的变化可能源自诊断方法的不同，或各国之间的围栏、管理和饲养制度等差异。另外，许多国家的患病率可能因使用抗微生物剂作为饲料添加剂而被掩盖，在其他国家，禁止抗生素作为生长促进剂，则可能导致了SD患病率的提高(Alvarez-A.etal.,InternationalJournalofEnvironmentalResearchandPublicHealth(2013),10:1927-1947)。

带菌猪在猪痢疾的流行中起到了主要作用，并且被认为是畜群之间的主要传染源。B.hyodysenteriae能够长期存活在环境中，尤其是在粪坑和化粪池内所含的液体粪便中，可以在其中保持传染性达60天。例如，它可以在猪的粪便中低温存活数月。该螺旋体也可自然地定殖于小鼠、美洲鸵、鸡和野鸭，并通过物理载体或污染物增加，使得B.hyodysenteriae可在畜群内部和畜群之间传播(Hidalgo,A.etal.,JournalofClinicalMicrobiology(2010),48(8):2859-2865)。

这种疾病在食物转化率降低、死亡率、育肥期加长方面导致重大直接经济损失，同时也导致间接损失，例如增加兽医费用、用药等，尤其是对规模化猪场而言。通过药物治疗消灭疾病是相当困难的，因为许多临床上已恢复的动物在充当带菌体的同时，在很长时间内持续排出该微生物。

SD的治疗涉及抗生素的使用。欧盟(EU)已将截短侧耳素(泰妙菌素和沃尼妙林)用于此目的。泰妙菌素和沃尼妙林是天然存在的二萜抗生素截短侧耳素的半合成衍生物，其显示出抗厌氧菌优秀活性，仅用于动物中，主要是猪。还有大环内酯类(泰乐菌素，以及近年来的泰伐洛星)和紧密相关的林可霉素(林可酰胺)也常被包括在SD的治疗策略中。然而，对上述一种或多种抗生素的易感性降低的B.hyodysenteriae菌株的出现，以及基因多样性多重抗药性菌株的存在，已经在一些国家得到了证实。这一事实使得SD的治疗和控制复杂化，并应给兽医和养猪户带来警示，需要一种战略性方法来选择抗生素，其必须只能在适当的现场和实验室诊断后用于严格的适应症，以保证其用于治疗SD的长期效力(Alvarez-A.etal.,InternationalJournalofEnvironmentalResearchandPublicHealth(2013),10:1927-1947)。

药物成本高，再加上在许多情况下不可能完全根除感染，且对药物残留在肉类产品和环境的忧虑越来越多，因此，需要开发有效的免疫预防方法来控制SD(Diego,R.etal.,Vaccine(1995),13(7):663-667)。

Joens及其共同作者(Joens,L.A.,etal.,AmericanJournalofVeterinaryResearch(1979),40:1352–1354)报告了从急性SD康复的猪在此后再次接种B.hyodysenteriae时不再得病，表明感染可能诱导保护性免疫应答(Alvarez-A.etal.,InternationalJournalofEnvironmentalResearchandPublicHealth(2013),10:1927-1947)，此后，已有许多开发疫苗以控制SD的尝试。然而，开发用于控制SD的疫苗的尝试仅获得了有限的成功。Hudson(Hudson,M.J.etal.,BritishVeterinaryJournal(1974),130:37-40；Hudson,M.J.etal.,ResearchinVeterinaryScience(1976),21:366-367)开发了一种减毒活疫苗，其无法预防后续接触感染。Glock(Glock,R.D.etal.,Proceedingsofthe6thInternationalPigVeterinarySocietyCongress(1980),Copenhagen,Denmark,p.521)报告了一种灭活疫苗在进行共六次每隔6天一次的静脉注射后，对病菌起到了一定保护。减毒或遗传修饰的活无毒疫苗可能表现出定殖降低，并使得免疫刺激降低(Alvarez-A.etal.,InternationalJournalofEnvironmentalResearchandPublicHealth(2013),10:1927-1947)。

另一种替代性方法是，产生可以通过重组B.hyodysenteriae蛋白在细菌递送载体上的表达来递送的亚单位疫苗。已有鉴别B.hyodysenteriae蛋白质以用于亚单位疫苗的尝试，但以重组38kDa鞭毛蛋白进行疫苗接种，未能防止其在实验性感染的猪中定植(Gabeetal.,InfectionandImmunity(1995),63:142-148)。另一方面，以重组29.7kDa外膜脂蛋白(Bhlp29.7)进行疫苗接种，得到了部分保护，发展疾病的动物少于对照组。这项研究的作者得出结论认为，免疫接种也倾向于延迟螺旋体随粪便排出的发作，但并不一定能阻止其发生(La,T.etal.,VeterinaryMicrobiology(2004),102:97-109)。由Holden等人进行的一项研究中，评估了以smpB(B.hyodysenteriae的外膜蛋白)疫苗接种的疗效。然而，在蛋白质疫苗接种后的应答只对疾病提供了中度保护(Holden,J.etal.,VeterinaryMicrobiology(2008),128:354-363)。在大多数情况下，测试的重组疫苗未能对猪提供足够保护(Alvarez-A.etal.,InternationalJournalofEnvironmentalResearchandPublicHealth(2013),10:1927-1947)。

由全细胞菌苗组成的疫苗能诱导对Brachyspirahyodysenteriae的血清抗体反应，但通常不能预防猪感染疾病。使用从全细胞裂解物中制备的B.hyodysenteriae菌苗，甚至可能加剧疾病感染(Waters,W.R.etal.,Vaccine(2000),18:711-719)。此外，菌苗疫苗往往是脂多糖血清群特异性的，其需要使用自体菌苗。此外，由于厌氧螺旋体挑剔的增长需求(La,T.etal.,VeterinaryMicrobiology(2004),102:97-109)，B.hyodysenteriae菌苗的生产大规模相当困难和昂贵。在一些国家中，SD菌苗疫苗可购得，并提供一定程度的保护。然而，如上所述，其往往是脂寡糖(LOS)血清群特异性的，需要使用自体或多价制剂(La,T.etal.,VeterinaryMicrobiology(2004),102:97-109)。本领域中的SD疫苗其它参考文献可在下列专利文献中找到：

US4748019：研究人员发现，接种疫苗的有效方案包括肠胃外给予猪能有效刺激猪免疫反应的灭活强毒或病原T.hyodysenteriae(菌株“P18A”，NCTC11615)初次剂量，并在大约同时或其后给药无毒或非致病活菌株的T.hyodysenteriae后续剂量(菌株“VSI”，NCTC11628)。

US5750118：本发明涉及包含灭活且含佐剂的有效剂量T.hyodysenteriae抗原(强毒或减毒的菌株)的用于皮内给药的SD疫苗。疫苗抗原是从灭活的菌株27164ATCC制备的。

US5281416：本发明涉及抗SD的猪免疫接种方法，其特征在于通过非肠道方式，优选为肌内给药方式，以T.hyodysenteriae活菌株或氧处理的非活性株向猪给药的方法。可使用的代表性菌株为参考菌株ATCC31287，ATCC31212和参考无毒菌株ATCC27164。

但是，据发现，这些疫苗的效力是可变的。自体制剂(也称为“自体疫苗”，可以定义为使用从患病动物自身组织或分泌物中分离的生物体的培养物制备的疫苗)已被用于进一步改善这些疫苗。这种方法虽然有效，却具有极高的金钱和时间成本，且仅能针对B.hyodysenteriae单一菌株提供保护。此外，免疫接种发生在致病菌株已被鉴定后的一段时间以后，这可能需要几个星期(例如，按照标准程序，从农场样品的分离过程、初始培养和自体疫苗的生产，可能需要至少6周)。这一延迟时间往往造成细菌从牛群传播到其他动物，或在极端情况下，甚至传播到其他养猪场。这还引发严重的经济损失，且其本身作为常规应用是一种昂贵的过程。SD因而仍然是许多养猪国家的一个重要流行传染病。有效的经济适用CD疫苗具有巨大的必要性。

发明内容

猪痢疾(SD)是由Brachyspirahyodysenteriae导致的一种严重的猪出血性肠道疾病，对猪生产有很大的影响，并通过死亡率和次佳绩效而导致重大损失。考虑到多重耐药菌株的出现，以及对药物残余可以存在于肉制品或环境中的担忧，迫切需要高效的免疫预防方法来控制SD。然而，现有的疫苗无法以令人满意的程度赋予针对感染的保护，而且即使它们赋予了一定程度的保护，却不提供针对不同血清群菌株的充足交叉保护免疫。此外，自体疫苗的制造和商业化目前存在许多不便。因此，需要一种能够针对不同血清型提供强力保护的抗SD疫苗，即一种有效的通用SD疫苗。

本发明人已经开发了针对SD的疫苗，出乎意料的是，其与自体疫苗一样有效，尽管其组合物中不具有能导致该感染的菌株。这种效果是非常令人惊奇的，因其与自体疫苗理论矛盾。本发明提供了一种具有抗Brachyspirahyodysenteriae的高效普遍保护的疫苗，即“通用疫苗”。

在第一方面，包含来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株的细菌的组合物。本发明的组合物可包含灭活的菌株，且所述基因多样性可通过从不同克隆复合体中筛选所述来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株而获得的。在一个优选的方面中，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。目标区域可以是任意区域，优选为西班牙。

在第二方面中，本发明涉及本发明的组合物及其作为疫苗的用途，优选为一种针对Brachyspirahyodysenteriae所引起的猪痢疾的疫苗。

此外，本发明提供了用于生产本发明的组合物的方法，其包括选取至少两种基因多样性菌株，并将其等量混合，以达到至少在10⁸至10⁹总细菌数/mL之间的浓度。

附图说明

图1.本研究中发现并以UPGMA聚类的44种B.hyodysenteriaeMLVA类型的系统树图。罗马数字I至VI表示在单位点变异体水平上定义的克隆复合体。比例尺表示遗传距离，显示为基因型之间的标记等位基因差异的绝对数量。图中所示为≥40％的自展支持率。

图2.根据goeBURST算法找到的MLVA类型(圆圈)和关系。实线表示单位点变异体水平，短划线表示双位点变异体水平，点虚线表示三位点变异体水平。单位点变异水平分组由罗马数字I至VI表示。

图3.实施例中的通用疫苗的菌株选择(“类型3”(例如，菌株保藏号CNCMI-4720)，“类型14”(例如保藏号为CNCMI-4721菌株)和“类型20“(例如保藏号为CNCMI-4722菌株)。选取称为克隆复合体的原始菌株(Ⅱ，V和I)。所述选取菌株在西班牙检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

图4.以自体疫苗(深灰色)、通用疫苗(黑色)接种的组别与非接种组(对照，浅灰色)的生存曲线比较，所用LogRank检验α＝0.05。

图5.B.hyodysenteriae在被攻击后随时间的消除(每周阳性直肠拭子百分比)(黑色，自体疫苗；深灰色，通用疫苗；浅灰色，未接种疫苗动物(对照))。

图6.不同组的潜伏期(接种病菌与出现腹泻或细菌粪便排出之间的天数)(黑色，自体疫苗；深灰色，通用疫苗；浅灰色，未接种疫苗的动物(对照))。

图7.接种病菌后患上腹泻(a)和出血性腹泻(b)的猪百分比(黑，自体疫苗；深灰色，通用疫苗；浅灰色，未接种疫苗的动物(对照))。

图8.接种病菌后的各天的平均日增重(ADG)(黑色，自体疫苗；深灰色，通用疫苗；浅灰色，未接种疫苗的动物(对照))。

图9.病菌接种后头9天(第0天至第9天)日增重(DWG)(黑色，自体疫苗；深灰色，通用疫苗；浅灰色，未接种疫苗的动物(对照))。

图10.在试验中测量以抗-菌株A(CNM1-4720)LPS的A，B和C菌株超免疫的兔的抗体应答值(450nm吸光度，与产生的抗体量直接相关)(效价测定)。

图11.在试验中测量以抗-菌株B(CNM1-4720)LPS的A，B和C菌株超免疫的兔的抗体应答值(450nm吸光度，与产生的抗体量直接相关)(效价测定)。

图12.在试验中测量以抗-菌株C(CNM1-4720)LPS的A，B和C菌株超免疫的兔的抗体应答值(450nm吸光度，与产生的抗体量直接相关)(效价测定)。

具体实施方式

本发明的组合物

本发明涉及包含来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株的细菌的组合物。本发明中使用的术语“基因多样性”是指一个物种的基因构成中的一组限定的遗传可测量多样特性。为了确定限定环境(生态系统)中的微生物多样性，或鉴定特定菌株在宿主之间的传播，配置了具有区分相同物种下的多样化生物的能力的基因分型技术。重要的是，在比较单一物种在不同的生态系统之间的多样性时，需要能够进行客观评估的可靠统计方法。为此，基于特定类型生物体在种群中出现或可以特定分型工具区分的频率，从数学上定义了多样性指数(Grundmann,H.etal.,JournalofClinicalMicrobiology(2001),39:4190–4192)。

B.hyodysenteriae分离株之间相对较高的多样性已经得到了经典性描述。理解SD流行病学并推进对其的控制能力，依赖于可用来表征菌株的可靠菌株分型方法。根据对半纯化的脂多糖(LPS)的分析，Baum&Joens鉴别了4种不同的血清型(Baum,D.H.etal.,Infectionandimmunity(1979),25:792-796)，而进一步的研究最终区分出包括若干血清型的共11个血清群(Hampson,D.J.etal.,EpidemiologyandInfection(1989),102:75-84；Hampson,D.J.etal.,EpidemiologyandInfection(1990),105:79-85；Hampson,D.J.etal.,Swinedysentery.In:lntestinalSpirochaetesinDomesticAnimalsandHumans,pp.175-209,editedbyD.J.Hampson&T.B.Stanton.Wallingford:CABInternational,1997)。

B.hyodysenteriae的地域分布差异不久后便得到了展示。另外，来自美国的参考菌株被分类为血清型1和2，而据报告，来自欧洲和澳大利亚的分离株则具有更高的血清型分类变异性(Harrisetal.,SwineDysentery.In:Straw,B.E.,D’Allaire,S.D.,Mengeling,W.D.&Taylor,D.J.(Eds.)DiseaseofSwine.IowaStateUniversityPress(1999),AmesIowaUSA,pp.579-600)。然而，几乎没有关于B.hyodysenteriae分离株血清型分布的最新信息。就交叉反应的结果而言，确定血清型所需要的技术执行起来缓慢而繁琐，且在极多分离株中得到的结果是不确定的。出于这个原因，这些技术已被若干分子学方法所替代。

已开发出不同分型工具来区分B.hyodysenteriae实地分离株，并提供了对病原体的分子流行病学的更好理解。其中，在过去的几年中引入的一种病原微生物菌株分型得力工具，是多位点可变数目串联重复序列分析，即MLVA。其发展为病原微生物菌株分型的一种重要的流行病学工具。MLVA是基于对许多精心选定并表征的包含短重复序列的位点(多位点小随体，称为串联重复序列可变数量(VNTRs))的PCR扩增。这种小随体由独特的直接头-尾DNA重复序列组成，这种重复序列可以在所有的细菌基因组中找到，并且可以被用来定义细菌物种的特定分离株。此外，VNTRs已被用来推断多样细菌物种的细菌种群结构和种系发生。每个重复序列位点内的重复拷贝数可以在不同菌株之间变化。通过测量每个PCR扩增位点的大小，可以推断重复单元的数目。Hidalgo和他的同事开发和测试了多基因可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法，其可以用在配备PCR技术的基本兽医诊断微生物实验室中，或者用在配备毛细管电泳的更先进实验室中。所开发的MLVA技术基于八个位点，其用于来自不同国家的不同农场、类型和参考菌株的分离株时，具有高区分度(Hunter和Gastone区分指数，0.938[95％置信区间，0.9175至0.9584])，同时保持高系统学价值。使用该技术，证实了物种的多样性(来自172个分离株和菌株的44种MLVA分型)，虽然菌株在畜群中随时间是稳定的。种群结构似乎是克隆。在三个欧洲国家的养猪场中发现的B.hyodysenteriaeMLVA3型，以及在不同的国家中发现的其他相关菌株，表明病原体通过带菌猪的传播是可能的。MLVA克服了以前的B.hyodysenteriae分型技术的相关缺点，是该重要致病螺旋体的流行病学和种群结构研究的重要工具(Hidalgo,A.etal.,JournalofClinicalMicrobiology(2010),48(8):2859-2865)。

发明者及其同事将该方法应用于多国B.hyodysenteriae分离株集合，其中包括115个西班牙实地分离株以及来自澳大利亚、加拿大、E.E.U.U.、英国和荷兰的参考菌株和分离株。

MLVA分析表明，B.hyodysenteriae的西班牙实地分离株具有异质性，且种群有克隆结构。西班牙分离株中鉴定出了总共15种MLVA分型。此外，在西班牙、英国和荷兰鉴定出了相同MLVA类型的分离株。另一方面，得出的结论是澳大利亚或EEUU的分离株与西班牙分离株之间不具备共同的MLVA。

通过在单位点变异体水平上进行MLVA类型分组，总共建立了六个克隆复合体(I至VI)(图2)。

本发明的组合物可包含两个或三个，或四个，或五个，或更多个基因多样性菌株。优选地，本发明的组合物的菌株的所述基因多样性是通过从不同克隆复合体中筛选所述来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株而获得的。本发明中使用的“克隆复合体”是指通过在单位点变异体水平上进行MLVA类型分组而建立的若干个组，如上所述。更优选地，至少一种菌株属于克隆复合体II和/或至少一种菌株属于克隆复合体V和/或至少一种菌株属于克隆复合体I。

在本发明的组合物中，基因多样性菌株优选为属于各克隆复合体的原始类型。

每个克隆复合体的共同祖先是使用goeBUST算法(一种全球执行的eBURST算法,可见http://goeburst.phyloviz.net/#Software)预测得出的。欲了解更多详情，请参阅出版物Feiletal.,2004和Franciscoetal.,2009，可从http://goeburst.phyloviz.net/#Publications上免费获得。

本发明的组合物还可以包括属于第三克隆复合体的菌株。优选地，第三克隆复合体选自克隆复合体I、克隆复合体II和克隆复合体V。

相应地，本发明的组合物包括来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种且优选为三种基因多样菌株，其中所述菌株中的至少一种属于克隆复合体I和/或所述菌株中的至少一种属于克隆复合体II和/或所述菌株中的至少一种属于克隆复合体V。

优选地，本发明的组合物包含来自Brachyspirahyodysenteriae的三种基因多样菌株，其中所述菌株之一属于克隆复合体I，菌株之一属于克隆复合体II，且菌株之一属于克隆复合体V。

优选地，本发明的组合物中，所述菌株中的至少一种是2013年3月14日保藏在巴斯德研究所微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM),InstitutPasteur)的登记号为CNCMI-4720的菌株，和/或所述菌株中的至少一种是同一日期保藏在CNCM的登记号为CNCMI-4721的菌株，和/或所述菌株中的至少一种是同一日期保藏在CNCM的登记号为CNCMI-4722的菌株。

相应地，本发明还提供了2013年3月14日保藏在巴斯德研究所微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM),InstitutPasteur)的登记号为CNCMI-4720、CNCMI-4721和CNCM的菌株。

登记号CNCMI-4720的菌株属于克隆复合体II。登记号CNCMI-4721的菌株属于克隆复合体V，登记号为CNCMI-4722的菌株属于克隆复合体I。

在本发明的组合物中，基因多样性菌株优选为流行病学相关。在本发明的上下文中，“流行病学相关”指的是相对于目标区域中总检测菌株，所述菌株至少检测为1-100％比例，优选为至少1％，至少2％，至少3％，至少4％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少50％，至少75％，至少90％或100％。优选地，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。在本发明的上下文中，“检测”是指，在目标区域中鉴定出所述菌株。细菌Brachyspirahyodysenteriae的检测可以例如以直肠拭子、结肠黏膜和/或猪的粪便样品中检测。例如，可按照先前记载的方法进行样品培养并提取DNA(参见例如Hidalgo,A.etal.,JournalofClinicalMicrobiology(2010),48(8):2859-2865)。B.hyodysenteriae的存在可以通过PCR方法检测。B.hyodysenteriae的存在也可以通过将来自猪粪便或肠壁的细菌学拭子在选择性琼脂板上划线培养来证实。在厌氧环境中进行平板培养后，可以记录螺旋体在平板上的低平蔓延生长及生长周围的溶血(La,T.etal.,VeterinaryMicrobiology(2004),102:97-109)。可选地，可以通过将样品悬浮在PBS中并用间接免疫荧光试验(IFT)来检测B.hyodysenteriae的存在(参见例如Diego,R.etal.,Vaccine(1995),13(7):663-667)。本领域中已知的检测B.hyodysenteriae的其他方法都可以使用。

本发明中使用的术语“目标区域”是指对B.hyodysenteriae的存在进行评估的地球上的划定区域，即地理区域或地理区域。目标地理区域没有特定的限制。其范围可以从数千公里的大陆水平到几公里的地方水平之间变化。例如，目标区域可以是一个国家的一部分，整个国家或多个国家。优选地，目标区域是一个国家或一组国家。例如，目标区域可以是欧洲。优选地，目标区域可以是西班牙，更优选为伊比利亚半岛的西班牙领土，特别是卡斯蒂利亚莱昂(CastillayLeón)，安达卢西亚(Andaluc)和/或埃斯特雷马杜拉(Extremadura)。其他优选的目标地区是意大利，荷兰，英国，澳大利亚，加拿大和/或美国。

此外，本发明的组合物中包含的细菌可以灭活，即其可以是化学或物理灭活。灭活包括用化学品、热和/或辐射杀死细菌。该组合物的细菌可以通过本领域中已知的任何灭活过程而灭活。优选地，本发明的组合物的细菌通过甲醛处理细菌进行灭活。最优选地，在37℃下对细菌培养物注入0.5％甲醛，然后将其在轻度搅拌下培养过夜(约18小时)。

根据本发明的组合物的细菌(优选为灭活)，其浓度可以至少在10⁷和10¹²个细菌/毫升之间，优选为至少10⁷，或10⁸，或5·10⁸，或10⁹，或10¹⁰，或10¹¹，或10¹²个细菌/毫升，优选浓度为10⁸和10¹⁰个细菌/毫升之间，更优选浓度在10⁸和10⁹个细菌/毫升之间，甚至更优选地，浓度为5·10⁸个细菌/毫升。

如果该组合物包含属于两个菌株的细菌，其在混合物中的比例可以是1：(0.5-2)。如果该组合物包含属于三种菌株的细菌，其在混合物中的比例可以是1：0.5-2):(0.5-2)。如果该组合物包含属于四种菌株的细菌，其在混合物中的比例可以是1：(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)。如果该组合物包含属于五种菌株的细菌，其在混合物中的比例可以是1：(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)。优选地，该组合物包含选定菌株的细菌的等量混合物，即其在混合物中的比例可以是1：1，1：1：1，1：1：1：1，1：1：1：1：1，取决于该组合物包含多少个不同的菌株。在此背景下，“比例”是指细菌个数/毫升。

该组合物中的细菌浓度可以使用本领域中已知的任何方法来计算。例如，可以使用纽鲍尔室(Neubauerchamber)计数来估计本发明的组合物中所含的细菌数量。

优选地，本发明的组合物包含总量为10⁸～10⁹个灭活细菌/毫升的选定菌株的细菌的等量混合物，其中所述细菌属于来自Brachyspirahyodysenteriae的三种基因多样菌株，其中所述菌株之一属于克隆复合体I，菌株之一属于克隆复合体II，且菌株之一属于克隆复合体V，并且其中优选地，所述基因多样性菌株在目标区域是流行病学相关的，即在西班牙检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

优选地，所述在目标区域中流行病学相关的基因多样性菌株各自占总检测菌株的比例为至少9％。优选地，所述菌株之一占总检测菌株的比例为至少13％。更优选地，所述菌株中的两种占总检测菌株的比例为至少13％。最优选地，所述菌株之一占总检测菌株的比例为至少24％。

本发明的组合物可进一步包括佐剂。佐剂是加强对抗原的免疫应答和/或调节其趋向所需免疫应答的成分，它可以是无机或有机的化学品、某些已杀灭的细菌的提高对给定抗原的免疫应答的大分子或全细胞。在本发明的上下文中，本发明的组合物中的佐剂可以是任何合适的佐剂，其例如增强、加速并延长现有技术中已知的特异性免疫应答。

佐剂可以包括例如：

·矿物盐，例如，氢氧化铝和氧化铝或磷酸钙凝胶。

·油乳液和基于表面活性剂的制剂，例如，MF59(微流化的洗涤剂稳定化油包水乳液)，QS21(纯化皂苷)，AS02[SBAS2](油包水乳液+MPL+QS-21)，Montanide^TMISA-51,ISA-720,IMS(稳定化水包油乳液)。

·颗粒佐剂，例如，病毒颗粒(掺入流感血凝素的单层脂质体载体)，AS04([SBAS4]MPL铝盐)，ISCOMS(皂苷和脂质的结构化复合物)，聚丙交酯共乙交酯(PLG)。

·微生物衍生物(天然和合成)，例如，单磷酰脂质A(MPL)，Detox(MPL+M.Phlei细胞壁骨架)，AGP[RC-529](合成酰化单糖)，DC_Chol(脂类免疫刺激剂，能够自我组织到脂质体中)，OM-174(脂质A衍生物)，CpG基序(含免疫刺激CpG基序的合成寡核苷酸)，修饰的LT和CT(遗传修饰的细菌毒素，可提供无毒佐剂效应)。

·内源人免疫调节剂，例如，hGM-CSF或人IL-12(即可以作为蛋白质或编码质粒给药的细胞因子)，Immudaptin(C3d串联阵列)

·惰性载体，如趋向对疫苗抗原所需响应的金粒子。

最优选的佐剂是铝盐(氢氧化铝或磷酸铝)和矿物油。当接种时，其产生小肉芽肿，允许抗原的延迟释放(长期持久的抗原刺激)和抗原呈递细胞的吸引。这提高了免疫应答。例如，佐剂可以是HAVLOGEN^TM或Montanide^TM。最优选地，所述佐剂可以是商业油性佐剂如Montanide^TMIMS251(SEPPIC)。

优选地，所述佐剂在最终组合物的最终配方中相对于最终注射体积的浓度为5至50％体积/体积，优选为5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％或以上(体积/体积，即相对于最终注射体积的体积)。更优选地，最终配方中的佐剂浓度为20％体积/体积(即，相对于最终注射体积的体积)。

本发明的组合物可另外包含其它组分。例如，该组合物可以包含防腐剂和/或抗真菌剂。例如，该组合物可进一步包括水杨乙汞(Thimerosal)(Sigma)的，也被称为硫柳汞(Thiomersal)。优选地，硫柳汞的含量为0.005至1g/100ml，含量优选为0.5，或0.3，或0.1，或0.05，或0.03，或0.02，或0.01，或0.005g/100ml。更优选地，硫柳汞的含量为0.01g/100ml。此外，本发明的组合物还可以包含缓冲溶液如盐。优选地，本发明的组合物可包含浓度为0.01至0.5M的缓冲液，优选为0.5M浓度，或0.4M，或0.3M，或0.2M，或0.1M，或0.05M，或0.01M。所述缓冲液可以是本领域中记载的任何合适的缓冲液。例如，该缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乙酸钠。优选地，所述缓冲液是0.1M乙酸钠。

本发明的疫苗

本发明的组合物可以优选用作疫苗。疫苗是一种可以提高特定疾病免疫力的生物制剂。根据本发明，所述疫苗优选为抗猪痢疾(SD)的疫苗。优选地，猪痢疾是由Brachyspirahyodysenteriae.引起的。

本发明用作疫苗的组合物(下文称为本发明的疫苗)可以适用于在目标特定地理区域中的猪。如上所述，目标区域没有特别的限制，并且可以包括一个或多个国家。例如，目标区域可以是欧洲。优选地，目标区域可以是西班牙，更优选为伊比利亚半岛的西班牙领土，特别是卡斯蒂利亚莱昂(CastillayLeón)，安达卢西亚(Andaluc)和/或埃斯特雷马杜拉(Extremadura)。其他优选的目标地区是意大利，荷兰，英国，澳大利亚，加拿大和/或美国。

本发明的疫苗可在感染前和/或在其之后不久给药。例如，本发明的疫苗可以在疾病爆发1到20天后给药，优选为感染爆发后1，或2，或3，或4，或5，或6，或7，或8，或9，或10，或15，或20天。该疫苗也可在疾病的爆发1-4周后给药，优选为感染爆发后1，2，3或4周后。

本发明的疫苗可以通过肠胃外给药和/或口服给药来给药。优选地，本发明的疫苗是通过肠胃外给药，更优选为通过皮下和/或肌内和/或皮内给药，更优选地，通过肌内给药。例如，本发明的疫苗可以肌内注射到猪的颈部肌肉。

本发明的疫苗的给药剂量范围可在1毫升到5毫升的范围内。例如，本发明的疫苗一剂可为1毫升。例如，本发明的疫苗一剂可为2毫升。

本发明的疫苗的给药剂量可包括10⁷至10¹²个细菌/剂，优选为10⁸至10¹⁰个细菌/剂，更优选为10⁹个细菌/剂。本发明的疫苗的给药剂量可以包括10⁸至10⁹个细菌/毫升。本发明的疫苗的给药剂量可包含10⁹个细菌/毫升。本发明的疫苗的给药剂量可以在2mL/剂中包括5·10⁸个细菌/毫升。

因此，可以对猪给药的每剂量细菌总数优选为10⁹个细菌。

本发明的疫苗优选为可注射的疫苗。

疫苗接种方法

根据本发明，本发明的疫苗可以优选为断奶后对猪给药，最优选为断奶两个星期后。例如，猪可以在出生第四周进行接种。根据本发明，猪可以接种两次(疫苗再接种)。优选地，猪在首次疫苗接种后两周之后进行再次疫苗接种。例如，猪可以在断奶两周后，例如四周龄时，进行接种。然后，第二次疫苗(疫苗再接种)可以在六周龄时进行(即，第一次疫苗给药后两周)。例如，猪可以在断奶两周后，例如五周龄时，进行接种。然后，第二次疫苗(疫苗再接种)可以在七周龄时进行。例如，猪可以在断奶两周后，例如六周龄时，进行接种。然后，第二次疫苗(疫苗再接种)可以在八周龄时进行。疫苗首次接种优选为在四周龄进行。

断奶可以在21日龄时发生(La,T.etal.,VeterinaryMicrobiology(2004),102:97-109)。断奶也可以发生在15日龄，或在任何其他年龄，取决于畜群。

因此，本发明提供以下项目：

1.包含来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株的细菌的组合物。

2.根据项目1所述的组合物，其中，所述细菌是灭活的。

3.根据项目1和/或2所述的组合物，其中，所述细菌的浓度为10⁸至10⁹总细菌数/mL。

4.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，所述基因多样性是通过从不同克隆复合体中筛选所述来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样菌株而获得的。

5.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中至少一个所述菌株属于克隆复合体II。

6.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中至少一个所述菌株属于克隆复合体V。

7.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中至少一个所述菌株属于克隆复合体I。

8.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

9.根据项目8所述的组合物，其中，所述目标区域为西班牙。

10.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述基因多样性菌株属于各克隆复合体的原始类型。

11.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括属于第三克隆复合体的菌株。

12.根据项目11所述的组合物，其中，所述第三克隆复合体选自克隆复合体I、克隆复合体II和克隆复合体V。

13.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，至少一个所述菌株属于克隆复合体I，至少一个所述菌株属于克隆复合体II和/或至少一个所述菌株属于克隆复合体V。

14.根据项目13所述的组合物，其中，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4720的菌株，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4721的菌株，和/或至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4722的菌株。

15.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，进一步包括佐剂。

16.根据项目15所述的组合物，其中，进一步包括佐剂，优选为选自铝盐(优选为氢氧化铝和/或磷酸铝)和矿物油的佐剂。

17.根据项目16所述的组合物，其中所述佐剂是油佐剂，优选为Montanide^TMIMS251CVG。

18.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其用作疫苗。

19.根据项目16所述的组合物，其中所述疫苗是针对猪痢疾的疫苗。

20.根据项目19所述的组合物，其中所述猪痢疾是由Brachyspirahyodysenteriae引起的。

21.根据项目18至20中的一项或多项所述的组合物，其中所述疫苗使用于向目标区域的猪给药。

22.根据项目21所述的组合物，其中所述目标区域为西班牙。

23.根据项目18至22中的一项或多项所述的组合物，其中，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

24.根据项目18至23中的一项或多项所述的组合物，其中，所述疫苗通过肠胃外给药进行给药。

25.根据项目24所述的组合物，其中，所述疫苗给药优选为肌肉内给药。

26.根据项目18至25中的一项或多项所述的组合物，其中，所述猪在断奶后2周之后进行疫苗接种。

27.根据项目26所述的组合物，其中猪在首次疫苗接种后两周之后进行再次疫苗接种。

28.一种用于制备根据项目1至27中的一项或多项所述的组合物的方法，包括选取至少两种基因多样性菌株，并将其等量混合，以达到至少在10⁸至10⁹总细菌数/mL之间的浓度。

29.根据项目28所述的方法，其中所述至少两种基因多样性菌株还具有流行病学相关性。

30.根据项目28或29所述的方法，进一步包括：灭活所述细菌。

31.根据项目28至30中任一项所述的方法，其中所述基因多样性是通过从不同克隆复合体选择每个菌株来达成的。

32.根据项目29至31中任一项所述的方法，其中所述流行病学相关性是通过选择在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％的菌株来达成的。

33.根据项目32所述方法，其中所述目标区域优选为西班牙。

实施例

实施例1Brachyspirahyodysenteriae的多位点可变数目串联重复序列分析

MVLA分析

本研究中使用了一组172种猪B.hyodysenteriae分离物和菌株，包括三个参考菌株B204^R(ATCC31212),B234^R(ATCC31287)和WA1^R(ATCC49526)和型菌株B78^T(ATCC27164)。

从莱昂大学和默多克大学保藏的细菌藏品得到B204R和B78T株的副本。所述菌株和实地分离株来自西班牙(n＝115)，澳大利亚(n＝36)，加拿大(n＝3)，美国(n＝7)，英国(n＝4)，荷兰(n＝7)，是在20世纪70年代至2009采集的。从伊比利亚猪(西班牙本地品种)采集了23种分离株。这些猪有助于保存“牧地(dehesa)”，一种位于该国西部地区(卡斯蒂利亚莱昂，埃斯特雷马杜拉，安达卢西亚和)的特定地中海生态系统，其中有传统粗放饲养单位。实地菌株采集自不同畜群，除从不同取样场合中的11个畜群中分离得到的26种西班牙分离株外。的人还从不同的取样场合存栏11孤立。在各供应实验室中，使用此前记载的方法，对来自莱昂大学和默多克大学细菌保藏的B.hyodysenteriae分离株进行鉴定和培养，并提取DNA。使用NanoDrop1000紫外可见分光光度计(ThermoScientific的，Wilmington，DE)，将提取的DNA调节至1至20ng/μL，以制备DNA提取物的工作稀释液。

串联重复序列鉴定和引物设计

B.hyodysenteriaeWA1^R的染色体DNA序列提取自GenBank(登录号NC_012225)，并使用可获得的网络服务串联重复序列查找程序(http://tandem.bu.edu)的默认参数来检索潜在的串联重复序列。选定的串联重复序列位点进行共有长度排名，使用其中长度在25和300碱基对之间的来设计侧翼区中的引物。位点被命名为Bhyo，后接重复长度排名名次(从1到23)，由下划线隔开。

串联重复序列筛查和MLVA设置

在预备步骤中，使用从B.hyodysenteriae菌株B204^R提取的DNA，来估计所述23种选定引物对在梯度PCR中的经验退火温度。PCR反应在Mastercycler梯度仪(EppendorfScientificInc.,Westbury,NY)中进行，初始步骤为95℃5分钟，随后是三步骤循环方法的30个循环，每个三步骤循环包括以94℃30秒，56±8℃30秒，72℃1分钟，最后是72℃下进行10分钟的最后延伸步骤。为了筛选所述23种选定位点作为流行病学标记的效用，使用了B.hyodysenteriaeB204^R和B78^T和分离株3，19，23，53，64，H9和H72的DNA样本，其在先前实验的PFGE和RAPD中已表现出基因差异(Hidalgo,etal.,Epidemiology&Infection(2010),138:76-85)。另外，考虑了为B.hyodysenteriae菌株WA1^R产生的串联重复序列数据。每个位点单独扩增，并用100-bp的DNA梯(Invitrogen，Carlsbad，CA)常规琼脂糖凝胶电泳分析产物的长度。根据其长度多态性及其对大多数受试DNA样品产生扩增子的能力，选择位点。为了确认PCR产物的长度，以及重复序列数目、共有模式数量和侧翼区大小，使用AxyPrepPCRCleanup试剂盒(AxygenBiosciences,UnionCity,CA)纯化扩增子，并根据厂商说明，使用荧光标记的双脱氧技术进行测序(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。在此基础上，分别选择了8个VNTR位点用于最后的分型工具中。

用于MLVA的PCR扩增

从用于此研究中的选定细菌集合得到的分离株，在Mastercycler装置(Eppendorf)中独立地扩增八个选定VNTR位点以进行分析。所用的PCR引物和热循环条件如表1所述。使用0.2毫升无菌试管制备PCR混合物，其中含有1xPCR缓冲液(20mMTrisHCl[pH8.4],50mMKCl)、5mMMgCl₂、1单位铂TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、200μM脱氧核苷三磷酸混合物(Invitrogen)、各0.2μM正向和反向引物，2μLDNA工作稀释液和添加至50μL终体积的无菌蒸馏水。在琼脂糖凝胶上解析PCR产物，并用100-bp的DNA梯(Invitrogen)估计其等位基因的大小。设置步骤中没有检测到的等位基因的扩增子如上述进行测序。此外，为了确保该技术的可重复性，随机选定28个DNA样品并再次测试。实验室之间的可重复性由莱昂大学和默多克大学对14种分离株的VNTR类型独立测定来评估。

表1：PCR引物和热循环条件

各个PCR中使用的八个引物对被分为两组(组1和组2)；在正向引物5'-端以6-羧基荧光素(6-FAM^TM)，或者NED^TM(AppliedBiosystems)进行荧光标记；以及，根据厂商说明(Qiagen，Germantown，MD)进行合并，然后使用Qiagen多重PCR试剂盒进行多重PCR。

表2和表3：引物组

引物组1

引物组2

使用25μl体积进行多重PCR扩增，热循环方案为：95℃15分钟；30次三步循环：94℃30秒，55/53℃(组1/组2)90秒，72℃90秒；和72℃下10分钟的最后延伸步骤。用蒸馏水1:10稀释多重PCR产物，然后取1μl该稀释液，与0.5μl1200LIZSize标样(AppliedBiosystems)和10.5μl甲酰胺混合。将混合物在96℃下加热3分钟后，在冰上迅速冷却，使用ABI3730DNA分析仪(AppliedBiosystems)进行基因扫描分析。使用免费提供的程序PeakScanner软件1.0版(AppliedBiosystems)来确定PCR片段的每个位点的大小。

数据分析

根据下式计算重复序列数：

重复序列数＝[片段大小(bp)×侧翼区(bp)]/重复序列尺寸(bp)。

将结果近似取值到最接近的较低整数，并依次评分(Bhyo_6，Bhyo_7，Bhyo_12，Bhyo_17，Bhyo_21，Bhyo_22，Bhyo_10和Bhyo_23)来创建定义每个菌株的数值档案。当PCR扩增无法检测时，分配给重复序列的数字是99。通过分配整数，将MLVA档案归为MLVA类型。当所有8个位点的数字档案匹配时，分离株被认为是基因相同的。使用Hunter-Gaston多样性指数来衡量各个位点的多态性和MLVA分型方法对所述8个VNTR位点组合的鉴别指数(Hunter,P.R.andM.A.Gaston,JournalofClinicalMicrobiology(1988),26:2465–2466)。根据Grundmannetal.(JournalofClinicalMicrobiology(2001),39:4190–4192)描述的方法计算近似95％置信区间(CI)。计算上述指数之前，移除冗余分离株(n＝26)。使用序列类型分析和重组测试(START2)程序(可免费获得于http://pubmlst.org/software/analysis/start2/)来分析受试螺旋体的MLVA档案和类型。基于非加权算术平均数(UPGMA)聚类法构建MLVA类型的系统发育树。使用http://web.natur.cuni.cz/flegr/programs/freetree.htm的FreeTree对1000个重复试样进行自展分析。goeBURST算法(可见http://goeburst.phyloviz.net/#Software)是一种全球实施的eBURST算法(Feil,E.J.etal.,JournalofBacteriology(2004),186:1518–1530.)，用其识别单、双、三位点变异体水平上的B.hyodysenteriae相关基因型分组。根据Smithetal.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesU.S.A.(1993),90:4384–4388)的方法测试种群结构，并考虑到Hauboldetal.(Genetics(1998),150:1341–1348.)提出的对于计算两两差异(VD)的变异度分布的临界值(LMC)的修正，并且表达为标准化关联指数(ISA)。

结果

VNTR标记的鉴定

用串联重复序列查找(TandemRepeatFinder)程序检查B.hyodysenteriaeWA1^R的染色体序列，在整个染色体的串联重复序列中鉴别出404个重复序列，135个重复序列/MBP。接着选择最适合的串联重复序列标记，令将包括在MLVA中的数量减少至23，并将其连续命名为Bhyo_1到Bhyo_23，且用于设计侧翼区中的引物。单态或未能以特异引物扩增所有9种选定分离株或其中大多数的15个位点被弃去。剩余的8个位点为多态性，具有不同的等位基因大小。PCR产物的测序证实了长度多态性是源于串联重复序列拷贝数差异，且其共有模式，周期大小和侧翼区是稳定的(表4)。因此，将8个位点(Bhyo_6，Bhyo_7，Bhyo_12，Bhyo_17，Bhyo_21，Bhyo_22，Bhyo_10和Bhyo_23)列入B.hyodysenteriae的MLVA方案。这些位点分布在WA1R基因组(表4)的1236667位置至2949421位置。Bhyo_6、Bhyo_10、Bhyo_21和Bhyo_22这四个位点位于编码假定蛋白的开放阅读框内，而其他四个则位于基因间间隔区域。Bhyo_7位于甲基接受性趋化蛋白MCPA和一个假定蛋白基因之间。Bhyo_12位于推定糖基转移酶家族2蛋白和一个假定蛋白的基因之间。Bhyo_17位于甘油-3-磷酸脱氢酶和铁氧还蛋白的基因之间。Bhyo_23位于一个假定蛋白和预测为透性酶的推定RarR的基因之间。

表4：MLVA中包含的位点的特征

位点	重复序列大小(bp)	侧翼区	位置
				Bhyo_6	156	78	1236667–1237672
Bhyo_7	135	177	1818959–1819765
				Bhyo_10	111	88	1754196–1755095
Bhyo_12	105	59	2949083–2949421
				Bhyo_17	76	175	1690628–1691034
Bhyo_21	33	195	1396843–1397034
				Bhyo_22	30	153	2597474–2597543
Bhyo_23	26	102	1838685–1838736

MLVA分型

使用含八个VNTR标记的标记组来对从数个国家的猪采集的174种B.hyodysenteriae菌株和分离株(包括B78^T和B204^R的重复样本)的整个集合进行分型。有效地扩增菌株和分离株，并将PCR产物长度转换成重复序列数。对在此阶段所鉴定的新等位基因的测序证实，所述长度的差异代表着先前检测的重复基序的数量变化。标记Bhyo_10是最多样化的VNTR，有八个不同重复序列数(99，2，3，5，6，7，8，和10)，因为缺乏扩增子而将其重复序列数分配为99。对于位点Bhyo_17，检测到7个重复序列数，而标记Bhyo_6，Bhyo_7和Bhyo_21各有六个重复序列数。位点Bhyo_12和Bhyo_22显示出四个重复序列数的不连续分布。VNTR标记Bhyo_23表现出的多样性较低，只检测到两个不同的重复序列数，1和2。该位点的多态性程度的精确估计通过Hunter-Gaston多样性指数来实现，其位点的鉴别力范围在0.141到0.764之间。位点Bhyo_10是最具鉴别力的，其数值为0.764，其次是位点Bhyo_7，Bhyo_6，Bhyo_17和Bhyo_21，其数值分别为0.761,0.718，0.71和0.699。位点Bhyo_12和Bhyo_23的多样性指数分别为0.472和0.318，而最保守的位点是Bhyo_22，其多样性指数为0.141。

来自不同畜群的146种菌株和分离株的八位点MLVA分型方法的Hunter-Gaston鉴别指数是0.938(95％CI，0.9175至0.9584)。所有B.hyodysenteriae分离株和菌株的八个VNTR位点的组合分析显示出44种MLVA类型，其中两种不同类别之间的差别至少为8个位点之一的一个重复序列。参照株的MLVA类型分别为：WA1^R为型35，B204^R为型23，且B234^R为10型，而型菌株B78^T分配为MLVA型28。每个国家的不同MLVA类型的分析表明了相当高的多样性的存在。来自不同畜群的89种西班牙分离株中发现了15种类型(1，2，3，5，9，11，12，13，14，18，19，20，22，24，和37)，36种澳大利亚分离株中发现了16种类型(15，16，17，25，26，31，32，33，34，35，36，38，39，42，43，和44)，3种意大利分离株中发现了2种类型(21和27)，7种荷兰分离株中发现了3种类型(3，6和41)，来自英国的4种菌株中发现了4种类型(3，8，29，和30)，且来自美国的7种分离株和菌株中发现了6种类型(4，7，10，23，28和40)。来自西班牙，英国，荷兰的分离株中均存在MLVA3型。对于在不同采样场合下采集多于一种分离株的畜群述MLVA类型稳定。B.hyodysenteriae菌株WA1^R显示出位点Bhyo_6的PCR产物长度780bp(4重复序列数)与来自测序基因组的数据1,092bp(6重复序列数)之间的不匹配。可重复性和再现性试验中所含的分离株和菌株在不同测试时间下具有同样的MLVA类型。此外，来自莱昂大学和莫道克大学所保藏的B.hyodysenteriae类型和参考株B78^T和B204^R的各个重复试样，均得到了相同的MLVA模式。

MLVA类型和细菌种群分析

根据本研究中测定的44种B.hyodysenteriae的MLVA类型的UPGMA聚类法，构建进化树，如图1所示。以goeBURST算法绘制在单、双和三位点变异体水平上MLVA类型关系，如图2所示。建立单位点变异体水平上的六个克隆复合体(I至VI)。当检查双位点变异体时，观察到3个新组别，而单位点水平上则聚类得到三个单位点变异体组别(II，III和IV)。当显示高水平边界以研究三位点变异体水平的关系时，出现了一个包含组I至IV的大类，且组V扩展为两个以上的类型。MLVA类型4、5、10和15不与任何研究水平检测到的任何其他类型相关联。对于来自不同畜群的146种分离株(IS_A＝0.1359，P<0.001)和不同MLVA类型(IS_A＝0.0336，p＝0.005)，检测到种群连锁不平衡。

实施例2：通用疫苗菌株的筛选和培养

选择了三种Brachyspirahyodysenteriae菌株，其中每一菌株均属于不同的克隆复合体(克隆复合体I，II和V)。每个基因多样性选定菌株均属于每个克隆复合体的原始类型。此外，检测到的每个所选菌株是相对于在西班牙的总检测菌株的至少1％(图3)。所述菌株是2013年3月14日保藏在巴斯德研究所微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM),InstitutPasteur)的登记号为CNCMI-4720、CNCMI-4721和CNCM的菌株。

登记号为CNCMI-4720的菌株属于克隆复合体II。登记号为CNCMI-4721的菌株属于克隆复合体V。登记号为CNCMI-4722的菌株属于克隆复合体I.

检测到的CNCMI-4720相对于在伊比利亚半岛的西班牙领土上的总检测菌株的24.7％。检测到的CNCMI-4721相对于在伊比利亚半岛的西班牙领土上的总检测菌株的13.5％。检测到的CNCMI-4722相对于在伊比利亚半岛的西班牙领土上的总检测菌株的9％。

分离的细菌(不含污染物)接种在琼脂血平板上。该板在39.5℃下保持在厌氧条件下4-5天，直到在整个板观察到溶血。琼脂在溶血边界碎化，则将接种在新的琼脂血平板上并在相同条件下培养。细菌被传代到新的琼脂血板并平行传代到复杂营养厌氧菌琼脂(FAA)板，在相同的条件下培养细菌3-4天。然后该细菌可以被转移到液体生长培养基中并培养。

对于发酵，在约4升合适的培养基中(如来自Merck脑心浸液培养基)以38.5℃无氧气氛轻度搅拌(50rpm)进行细菌培养。发酵进行至光密度为约1.6(或直到约10⁹UFC/mL(通常在15至30小时))。

实施例3：细菌的灭活

发酵后，将(约)4升培养物泵入无菌烧瓶中并离心(2×7000转，10分钟)。所得的颗粒悬浮在1L0.1M醋酸钠缓冲液中。培养液的灭活，是通过注射0.5％的甲醛并在37℃轻度搅拌(50rpm)下培养24小时进行的。次日，将悬浮液离心分离，并再悬浮于0.1M无菌乙酸钠中。抗原(约10^9-10¹⁰个细菌/毫升)保持在4℃下，直到与佐剂和赋形剂混合以生产疫苗。

实施例4：疫苗配方(本发明的通用疫苗)

该疫苗包含下列组分。术语“抗原”指上述选定的Brachyspirahyodysenteriae菌株，且抗原的最终浓度为10⁹个细菌/毫升的三种选定菌株的等量混合物。

所述成分在4℃下搅拌混合过夜。

实施例5：一种有效的自体疫苗与本发明的通用疫苗之间的比较

下列条件用于：

1.-本实施例中使用的猪来自不受螺旋体感染的农场，且健康状况低下，因为在高健康状况的猪中无法得到良好的病菌接种。

2.-控制饮食来诱导肠中的极高生态失调。饮食在猪痢疾中的重要性也是公知的。在该实验中，进料混合了50％含46％蛋白质的大豆粉。猪从病菌接种的当天开始接受这样的饮食(共10天)。

3-用于接种的菌株是参考菌株B204(ATCC号：31212)。该菌株曾在猪中传代三次，以充分保证其致病性，并验证实验性感染的适当性。这确保了所用菌株具有高致病力并能在被感染的猪中引起严重疾病。

使用了以下三组各6头猪：

-第1组(自体疫苗)：仔猪通过肌肉内注射(i.m.)以自体疫苗(灭活B204和佐剂，方法同上但用灭活B204作为抗原)在出生6周时进行疫苗接种，在8周龄时再接种疫苗。每剂包含10⁹个细菌。

-第2组(通用疫苗)：仔猪通过肌肉内注射(i.m.)以通用疫苗(多价灭活并添加佐剂的疫苗，包括三个选定的实地菌株)。接种方案同上(仔猪6周龄接种且8周龄再接种)。每剂亦为包含10⁹个细菌的三种选定菌株的等量混合物。

-第3组(对照组，未接种疫苗)：将相同佐剂(无细菌抗原)肌内注射至6周和8周龄仔猪(方法同上)。

疫苗接种和再接种在农场进行。仔猪被关在农场中直到10周龄，随后转移到莱昂大学的实验设施中。分属三个实验组的仔猪在这些设施中混放。

第二剂后的第3周，当仔猪为11周龄时，进行实验感染。各组的每头猪均连续3天口服施用100毫升含10⁹个细菌/毫升的B204型菌株新鲜培养液。饮食在病菌接种的第一天进行如上所述的改变。

从病菌接种的第一天(PID1)开始，每日通过收集直肠拭子对猪进行采样，并用微生物培养监控B.hyodysenteriae的粪便排出。从PID1开始，一般健康状况和腹泻存在及大便的特点也被记录下来。

实验结果

1.死亡率

在以通用疫苗免疫的猪组中，一只仔猪在实验性感染后的第17天死亡。在本例中，死亡是由肺炎引起的。死亡的猪在死亡前，粪便中的Brachyspirahyodysenteriae没有消失。

猪痢疾引起的死亡率在通用疫苗接种的猪组和自体疫苗接种的组中相同(每组1只猪)，并比未接种疫苗的对照组中的猪低三倍(3头猪死亡)。

就让步比而言，对照组的动物的死亡风险比通用疫苗或自体疫苗接种的动物高6倍(OR＝6；95％CI0,28-246,02)。

在两组接种疫苗的猪(通用疫苗和自体疫苗接种)中，猪的死亡发生在病菌接种第29天后，其中对照组中的三头猪在接种后第7，9和13天死亡(图4)。

正如预期的那样，通用疫苗和自体疫苗接种的动物的生存曲线之间没有观察到差异(p＝0.9372)。

2.-潜伏期

潜伏期定义为病菌接种和出现腹泻或粪便排出细菌之间的天数，对照组的猪的潜伏期显著长于自体疫苗接种的动物(F＝7.36；p＝0.024)。接种疫苗的猪的此潜伏期也高于对照组。接种疫苗和接种自体疫苗的两组猪之间不存在统计学显著差异(F＝1.7；p＝0.228)(图6)。

3.-腹泻和出血性腹泻

腹泻天数比例在对照组中显著高与通用疫苗接种的猪(Chi²＝＝8.37，p＝0.004)和自体疫苗接种的猪(Chi²＝4.27，p＝0.038)。

出血性腹泻的天数比例得到了类似结果。该值在对照组中显著高于通用疫苗接种的组(Chi²＝7.25，p＝0.007)和自体疫苗接种的组(Chi²＝16.6；p<0.001)。

此外，出血性腹泻在对照组中开始更早(病菌接种后2天)。该组中所有猪在病菌接种后6天出血性腹泻，且50％以上的猪患上出血性腹泻的天数为5天(图7)。

通用疫苗接种和自体疫苗接种的猪之间未发现腹泻天数(Chi²＝0.57，p＝0.45)或出血性腹泻天数(Chi²＝1.92，p＝0.165)存在统计学显著差异，。

4.-平均日增重

在病菌接种后的头9天，通用疫苗接种的猪中几乎没有观察到体重增加，而自体疫苗接种的组的平均日增重测定为0.27千克。然而，两组相比不存在显著差异。这些组在整个实验过程中的任何时间内没有出现体重下降。

对照组的动物在病菌接种后的前9天表现出体重的明显损失。平均重量损失为0.29kg/天。这9天后，对照组的幸存猪的平均日增重(ADG)与接种通用疫苗和接种自体疫苗的组相比，没有显著差异(图8和9)。

病菌接种后24天进行分析时，自体疫苗接种的动物组显示出较低的平均日增重，这可能是因为该疾病在这些动物中的潜伏期较长。另一方面，通用疫苗接种组和对照组的动物此时显示出的日增重明显恢复，因其此前受到临床疾病的影响。

结论

这项研究的目的是要在非常严格的条件下比较通用疫苗(本例中由三种选定菌株组成，所述菌株均非导致该感染的菌株)和自体疫苗的效力。

-以三剂每日剂量为10⁹个细菌的B204菌株感染猪，并肠内诱导高生态失调，引起了严重的猪痢疾，并在对照组中的未处理猪中引起了50％的死亡率。

-通用疫苗在降低猪痢疾引起的死亡率的有效性方面，与自体疫苗没有差别。

-通用疫苗在降低猪痢疾(腹泻和出血性腹泻)的临床症状的有效性方面，与自体疫苗没有统计学显著差异。

-通用疫苗接种和自体疫苗接种的猪中均没有体重损失。

通用疫苗的有效性与自体疫苗的有效性相当。考虑到自体疫苗的测试效果，通用疫苗对实地条件下的猪痢疾控制具有良好的成本/效益关系。

实施例6.超免疫兔的脂多糖(LPS)ELISA研究

以下研究的目的是为了展示三价Brachyspirahyodysenteriae疫苗配方(通用疫苗)中所含的三种菌株(A，B和C，见下文的具体引用)的血清学免疫应答之间的性质差异。

材料与方法

对于该实验，将9只兔分为三组，每组三只，每组在六天(本研究的第1、2、3、4、5、10天(D1，D2，D3，D4，D5和D10))中各静脉接种0.5毫升菌株之一的细菌悬液。因此，对于每种细菌，需要制备0.5mlX3只动物/菌株×6天＝9mL的10¹⁰个细菌/毫升培养液。

从每种菌株的100毫升BHI(脑心浸液)纯液态培养物，用6％BFS(胎牛血清)制备接种物。液态培养物进行离心，并用PBS缓冲液洗涤三次；初始悬浮液(生长至约10⁹个细菌/毫升)浓缩十倍至最终悬浮液10¹⁰个细菌/毫升。

在第15、18、21、24、27和36天(D15，D18，D21，D24，D27和D36)从每个动物收集血液。血清被立即送往Aquilón设备进行抗体分析。

将ELISA板用各菌株的0.5μgLPS抗原(其获得如Hassan等人所述，Hassanetal.AntibodyresponsetoexperimentalSalmonellatyphimuriuminfectioninchickensmeasuredbyELISA(1990).Vetrec.126(21):519-22)分别涂覆，且根据Collazos所述的用于沙门氏菌的方法进行ELISA(Collazos.Aportacionesaldiagnósticoycontroldelasalmonelosisporcina(2008).TesisDoctoral.UniversidaddeLeón)。

ELISA名称	实验室ID	保藏代码
			A	H57	CNCM I‐4720
B	H170	CNCM I‐4721
			C	H219	CNCM I‐4722

结果：结果如图10，11和12所示。从涂布有来自三种螺旋体菌株的LPS的ELISA板上，可以观察到，所述菌株对以所述三种菌株分别超免疫的兔血清的差异。如图所示，由所用的每种螺旋体菌株(A，B和C)所产生的血清免疫应答，根据ELISA板上的LPS涂层对血清菌株是否是同源或异源而不同(见附图10，11和12)。这些结果证实，基因分离菌株可产生特异性抗体。因此，本发明已令人惊奇地发现了由于使用基于基因多样性而选择的细菌进行免疫接种而产生的免疫应答/动物抗体差异，如笨申请中所述，且该基因多样性标准不受功能序列驱使。这些意想不到的结果证明应在疫苗配方中加入若干抗原模式，尤其是考虑到所用遗传标准并非“基因驱动”，而只是基于基因组的多态性。

本发明的其他项目

2.根据项目1所述的组合物，其中，所述细菌是灭活的。

5.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中至少一个所述菌株属于克隆复合体II，至少一个所述菌株属于克隆复合体V和/或至少一个所述菌株属于克隆复合体I。

6.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

7.根据项目6所述的组合物，其中，所述目标区域优选为西班牙。

8.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述基因多样性菌株属于各克隆复合体的原始类型。

9.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括属于第三克隆复合体的菌株，且其中所述第三克隆复合体选自克隆复合体I、克隆复合体II和克隆复合体V。

10.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，至少一个所述菌株属于克隆复合体I，至少一个所述菌株属于克隆复合体II和/或至少一个所述菌株属于克隆复合体V。

11.根据项目10所述的组合物，其中，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4720的菌株，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4721的菌株，和/或至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4722的菌株。

12.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物，其中，进一步包括佐剂，优选为选自铝盐(优选为氢氧化铝和/或磷酸铝)和矿物油的佐剂。

13.根据项目12所述的组合物，其中所述佐剂是油佐剂，优选为Montanide^TMIMS251CVG。

14.根据前述项目中的一项或多项所述的组合物用作疫苗的用途，优选为针对猪痢疾，其中，可选地，其中所述猪痢疾是由Brachyspirahyodysenteriae引起的。

15.根据项目14所述的组合物，其中所述疫苗使用于向目标区域的猪给药。

16.根据项目15所述的组合物，其中所述目标区域为西班牙。

17.根据项目14至16中的一项或多项所述的组合物，其中，所述疫苗通过肠胃外给药进行给药，优选为肌肉内给药。

18.根据项目14至17中的一项或多项所述的组合物，其中，所述猪在断奶后2周之后进行疫苗接种，可选地，在首次疫苗接种后两周之后进行再次疫苗接种。

19.根据项目15至18中的一项或多项所述的组合物，其中，向猪给药的每剂总细菌数在10⁸至10⁹个细菌之间，优选为10⁹个细菌。

20.一种微生物菌株，其选自保藏在巴斯德研究所微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM),InstitutPasteur)的登记号为CNCMI-4720、CNCMI-4721和CNCM的菌株。

PCT/RO/134表

Claims

1.包含来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样性菌株的细菌的组合物，其中所述基因多样性是通过从不同克隆复合体(定义为：在单位点变异体水平上对MLVA种类进行分组而建立的数个群组)中筛选所述来自Brachyspirahyodysenteriae的至少两种基因多样性菌株而获得的，且其中至少一个菌株属于克隆复合体II，和/或其中至少一个菌株属于克隆复合体V，和/或其中至少一个菌株属于克隆复合体I。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细菌是灭活的。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述细菌的浓度为10⁸至10⁹总细菌数/mL。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至少1％。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述目标区域为西班牙。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述基因多样性菌株属于各克隆复合体的原始类型(以goeBUST算法预测)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括属于第三克隆复合体的菌株，且其中所述第三克隆复合体选自克隆复合体I、克隆复合体II和克隆复合体V。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，至少一个所述菌株属于克隆复合体I，至少一个所述菌株属于克隆复合体II和/或至少一个所述菌株属于克隆复合体V。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4720的菌株，至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4721的菌株，和/或至少一个所述菌株是保藏号为CNCMI-4722的菌株。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，进一步包括选自铝盐和矿物油的佐剂。

11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述佐剂为油佐剂。根据前述权利要求中任一项所述的组合物用作针对猪痢疾的疫苗的用途，其中所述猪痢疾是由Brachyspirahyodysenteriae引起的。

12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述疫苗通过肠胃外给药进行给药。

13.根据权利要求11或12所述的组合物，其特征在于，所述猪在断奶后2周进行疫苗接种。

14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述猪在首次疫苗接种后两周进行再次疫苗接种。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，其特征在于，向猪给药的每剂总细菌数在10⁸至10⁹个细菌之间。

16.一种微生物菌株，其选自保藏在巴斯德研究所微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM),InstitutPasteur)的登记号为CNCMI-4720、CNCMI-4721和CNCM的菌株。