BR112015032468B1 - Composição que compreende bactérias de pelo menos três cepas geneticamente diversas de brachyspira hyodysenteriae e cepa bacteriana - Google Patents

Abstract

VACINA PARA DISENTERIA SUÍNA. A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo bactéria Brachyspira hyodysenteriae, particularmente no campo de imunização contra disenteria suína. A composição da invenção compreende bactérias de pelo menos duas cepas geneticamente diversas de B. hyodysenteriae. A invenção refere-se também à composição da invenção para uso como uma vacina, preferivelmente uma vacina universal contra disenteria suína por B. hyodysenteriae.

Description

Campo da técnica

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo bactérias Brachyspira hyodysenteriae, particularmente no campo de imunização contra disenteria suína.

Antecedentes da técnica

[0002] A disenteria suína (SD) (Swine Dysentery), causada por infecção colônica com a espiroqueta Brachyspira hyodysenteriae, permanece um grande problema em todo o mundo. Ela afeta suínos principalmente durante o período de engorda. A Brachyspira hyodysenteriae é uma espiroqueta anaeróbica, tolerante a oxigênio, gram-negativa, que coloniza o intestino grosso do porco para causar disenteria suína (SD). Esta condição é caracterizada por uma diarreia mucoemorrágica que afeta principalmente animais durante o período final de crescimento e foi relatada de todos os principais países criadores de porcos (Hidalgo, A. e outros, Journal of clinical microbiology (2010),48(8):2859-2865).

[0003] A SD é uma doença amplamente distribuída em todo o mundo, embora estudos com relação à epidemiologia sejam escassos e a prevalência relatada varie significantemente entre eles. Desta maneira, a prevalência relatada de B. hyodysenteriae varia de 0% a quase 40%. Variações em prevalência podem ser devido ao uso de métodos de diagnóstico diferentes ou a diferenças entres países em alojamento, tratamento, regimes de alimentação, etc. Além disso, enquanto em muitos países a prevalência pode ser ocultada pelo uso de antimicrobianos como aditivos alimentares, em outros a proibição de antibióticos como promotores de crescimento pode ter resultado em um aumento em prevalência de SD (Alvarez-Ordónez, A. e outros, International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

[0004] Porcos carreadores desempenham um papel importante na epidemiologia de disenteria suína e são considerados a principal fonte de transmissão entre rebanhos. A B. hyodysenteriae sobrevive no ambiente por períodos longos, especialmente em fezes líquidas contidas em poços e lagoas, onde ela pode permanecer infectiva por até 60 dias. Por exemplo, ela pode sobreviver durante vários meses em fezes de porco em temperaturas baixas. Esta espiroqueta pode também naturalmente colonizar camundongos, emas, galinhas e marrecos, e junto com vetores mecânicos ou fômites, isso aumenta as maneiras através das quais B. hyodysenteriae pode se espalhar dentro e entre os rebanhos (Hidalgo, A. e outros, Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).

[0005] A doença causa perdas financeiras diretas importantes, especialmente em fazendas de porcos intensivas, derivadas de uma diminuição em eficiência de conversão de alimento, mortalidade, aumento do período de engorda e também perdas indiretas, tal como um aumento em gastos veterinários, medicação, etc. A erradicação da doença através de medicação é bem difícil, uma vez que muitos animais clinicamente recuperados continuam a espalhar o organismo por um longo tempo enquanto agindo como carreadores.

[0006] Tratamento de SD envolve o uso de antibióticos. Pleuro- mutilinas (tiamulina e valnemulina) têm sido usadas para este propósito na União Europeia (EU) (European Union). Tiamulina e valnemulina são derivados semissintéticos do antibiótico diterpeno de ocorrência natural pleuromutilina que mostram atividade notável contra bactérias anaeróbicas e são usados exclusivamente em animais, principalmente em suínos. Também macrolídeos (tilosina e, mais recentemente, tilva- losina) e a lincomicina intimamente relacionada (lincosamida) têm sido geralmente incluídos em estratégias terapêuticas de SD. No entanto, a emergência de cepas de B. hyodysenteriae com susceptibilidade reduzida a um ou mais desses antibióticos e a presença de isolatos multir- resistentes geneticamente diversos foram confirmadas em vários países. Este fato complica tratamento e controle de SD e deve alertar os cirurgiões veterinários e fazendeiros de porcos para a necessidade de uma abordagem estratégica para selecionar antibióticos, que devem ser apenas usados sob indicações estritas seguindo diagnóstico de campo e laboratório a fim de garantir sua eficiência a longo prazo para tratamento de SD (Alvarez-Ordónez, A. e outros, International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

[0007] Os altos custos de medicação, junto com o fato que em muitas ocasiões é impossível erradicar a infecção completamente, e as crescentes preocupações com a presença de resíduos de fármaco em ambos os produtos de carne e no ambiente, justifica o desenvolvimento de métodos imunoprofiláticos eficientes para controlar SD (Diego, R. e outros, Vaccine (1995), 13(7):663-667).

[0008] Grandes esforços têm sido feitos a fim de desenvolver vacinas para controlar SD desde quando Joens e co-autores (Joens, L.A. e outros, American Journal of Veterinary Research (1979), 40:13521354) relataram que porcos que tinham se recuperado de SD aguda são protegidos da doença quando subsequentemente novamente expostos à B. hyodysenteriae, indicando que a infecção pode induzir uma resposta imunoprotetora (Alvarez-Ordónez, A. e outros, International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947). No entanto, tentativas em desenvolver vacinas para controlar SD tiveram sucesso limitado. Hudson (Hudson, M.J. e outros, British Veterinary Journal (1974), 130:37-40; Hudson, M.J. e outros, Research in Veterinary Science (1976), 21:366-367) desenvolveram uma vacina viva atenuada que foi incapaz de proteger contra uma pro- vocação subsequente. Glock (Glock, R.D. e outros, Proceedings of the 6th International Pig Veterinary Society Congress (1980), Copenhagen, Dinamarca, p. 521) relataram algum grau de proteção quando da provocação após seis injeções intravenosas, em intervalos de seis dias, de uma vacina inativada. Vacinas avirulentas vivas geneticamente modificadas podem mostrar colonização reduzida e causar estimulação menos imune (Alvarez-Ordónez, A. e outros, International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

[0009] Uma abordagem alternativa é gerar vacinas de subunidade que seriam administradas através da expressão de proteínas de B. hyodysenteriae em um vetor de administração bacteriano. Foram feitos esforços para identificar proteínas de B. hyodysenteriae para uso em vacinas de subunidade, mas vacinação com uma proteína flagelar de 38 kDa recombinante falhou em prevenir colonização em porcos experimentalmente infectados (Gabe e outros, Infection and Immunity (1995) 63:142-148). Por outro lado, vacinação com uma lipoproteína de membrana externa de 29,7 kDa recombinante (Bhlp29.7) resultou em proteção parcial, com menos animais desenvolvendo doença do que ocorreu nos grupos controle. Os autores deste estudo concluíram que vacinação também tende a retardar o início de disseminação fecal de espiroque- tas, mas ela não parou necessariamente de ocorrer (La, T. e outros, Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Em um estudo conduzido por Holden e outros, a eficácia de vacinação com smpB (uma proteína de membrana externa de B. hyodysenteriae) foi avaliada. No entanto, a resposta induzida após vacinação com proteína ofereceu apenas proteção moderada contra a doença (Holden, J. e outros, Veterinary Microbiology (2008), 128:354-363). Na maioria das ocasiões vacinas recombi- nantes testadas falharam em prover proteção suficiente em porcos (Al- varez-Ordónez, A. e outros, International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

[0010] Vacinas consistindo em bacterinas de célula integral induziram respostas de anticorpo no soro à Brachyspira hyodysenteriae, ainda que em geral tenham falhado em proteger porcos de doenças. O uso de bacterinas de B. hyodysenteriae preparadas a partir de lisatos de célula integral pode até mesmo exacerbar a doença quando da infecção (Waters, W.R. e outros, Vaccine (2000), 18:711-719). Além disso, vacinas de bacterina tendem a ser específicas de sorogrupo de lipopolissacarídeo, que então requer o uso de bacterinas autógenas. Ainda, bacterinas de B. hyodysenteriae são relativamente difíceis e caras de produzir em larga escala por causa das necessidades de crescimento delicadas das espiroquetas anaeróbicas (La, T. e outros, Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Em alguns países, vaci-nas de bacterina para SD estão comercialmente disponíveis e proveem um grau de proteção. No entanto, conforme acima declarado, elas tendem a ser específicas de sorogrupo lipo-oligossacarídeo (LOS), que então requer o uso de preparações autógenas ou multivalentes (Hampson, D.J. e outros, Diseases of Swine (2006), 10a Edição, Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, U.S.A., pp. 687-688). Outras referências a vacinas para SD na técnica podem ser encontradas na literatura de patente que segue: US 4748019: Os autores constataram que um regime eficaz de vacinação compreende administrar parenteralmente a porcos uma dose inicial de T. hyodysenteriae virulenta ou patogênica morta eficaz para estimular a resposta imune do porco (cepa "P18A", NCTC 11615) a uma dose subsequente de uma cepa avirulenta ou não patogênica viva de T. hyodysenteriae (cepa "VSI", NCTC 11628) e mais ou menos ao mesmo tempo ou em seguida administração desta cepa viva oralmente. US 5750118: A invenção refere-se a uma vacina contra SD compreendendo uma quantidade eficaz de antígeno de T. hyodysente- riae inativado e contendo adjuvante (cepa virulenta ou atenuada) para administração intradermal. O antígeno de vacina é preparado a partir da cepa N°. 27164 ATCC, que é inativada. US 5281416: A invenção refere-se a um método de vacinação de um porco contra SD caracterizado por administração parenteral, preferivelmente intramuscular, ao porco de uma cepa viva ou de uma cepa não viável tratada com oxigênio de T. hyodysenteriae. Cepas representativas que podem ser usadas são cepas virulentas de referência ATCC 31287, ATCC 31212 e a cepa avirulenta de referência ATCC 27164.

[0011] No entanto, a eficácia dessas vacinas foi verificada ser variável. Preparações autógenas (também conhecidas como "autovaci- nas", que podem ser definidas como vacinas preparadas a partir de culturas de organismos isolados dos tecidos ou secreções do próprio animal doente) têm sido usadas para melhorar mais estas vacinas. Esta abordagem, embora eficiente, é altamente cara em custo e tempo e confere proteção apenas para uma única cepa de B. hyodysenteriae. Além disso, a vacinação ocorre algumas vezes após a cepa causando a doença ter sido identificada, o que pode levar várias semanas (por exemplo, sob procedimentos padrão, o processo de isolamento das amostras da fazenda, cultura inicial e produção de autovacina pode levar pelo menos 6 semanas). Este atraso em tempo frequentemente causa a propagação de bactérias em outros animais do rebanho ou, em circunstancias extremas, até mesmo em fazendas de porcos. Ele também provoca sérias perdas econômicas e é em si um procedimento caro a ser aplicado em base de rotina. A SD então permanece uma doença infecciosa endêmica importante em muitos países de criação de porcos. Há uma enorme necessidade de uma vacina eficaz e economicamente viável para SD.

Sumário da Invenção

[0012] A Disenteria Suína (SD) é uma doença entérica mucoemor- rágica grave de porcos causada por Brachyspira hyodysenteriae, que tem um grande impacto sobre produção de porcos e causa importantes perdas devido à mortalidade e desempenho subótimo. Considerando a emergência de cepas multirresistentes e a preocupação que resíduos de fármaco possam estar presentes em produtos de carne ou no ambiente, métodos imunoprofiláticos eficientes para controlar SD são urgentemente necessários. No entanto, as vacinas disponíveis falham em conferir um grau satisfatório de proteção contra infecção e, mesmo que elas confiram um certo grau de proteção, elas não proveem imunidade protetora cruzada adequada contra cepas de sorogru- pos diferentes. Além disso, a fabricação e a comercialização de auto- vacinas apresentam muitos inconvenientes. Desta maneira, há uma necessidade de vacinas contra SD que confiram proteção forte contra cepas de sorogrupos diferentes, a saber uma vacina para SD eficaz e universal.

[0013] Os inventores desenvolveram uma vacina contra SD que, inesperadamente, é tão eficiente quando uma autovacina, apesar de não ter em sua composição a cepa que causa a infecção. Este efeito é altamente surpreendente, uma vez que está em conflito com a teoria de autovacina. A presente invenção provê uma vacina com proteção eficiente e geral contra Brachyspira hyodysenteriae, a saber uma "vacina universal".

[0014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo bactérias de pelo menos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae. A composição da invenção pode compreender cepas inativadas e a diversidade genética pode ser conferida através da seleção de pelo menos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae a partir de complexos clonais diferentes. Em um aspecto preferido, as cepas ge-neticamente diversas são pelo menos detectadas em uma proporção de 1% com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse. A região de interesse pode ser qualquer região, preferivelmente a Espanha.

[0015] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se à composição da invenção para seu uso como uma vacina, preferivelmente uma vacina contra disenteria suína causada por Brachyspira hyodysenteriae.

[0016] Além disso, a invenção provê um método para produção da composição da invenção compreendendo seleção de pelo menos duas cepas geneticamente diferentes e mistura delas em quantidade igual para obter uma concentração de pelo menos entre 108 e 109 bacté- rias/mL.

Breve Descrição das Figuras

[0017] Figura 1. Dendrograma dos 44 tipos de MLVA de B. hyody- senteriae encontrados no presente estudo e agrupados usando UPG- MA. Numerais romanos I a VI indicam complexos clonais definidos no nível de variante de locus único. A barra de escala representa distância genética como o número absoluto de diferenças em alelos marcadores entre genótipos. Valores de inicialização > 40% são mostrados.

[0018] Figura 2. Tipos de MLVA (circulados) e relações encontradas entre eles de acordo com o algoritmo de goeBURST. Linhas sólidas mostram o nível variante de locus único, linhas tracejadas mostram o nível de variante de locus duplo e linhas pontilhadas mostram o nível de variante de locus triplo. Grupos no nível variante de locus único são indicados por numerais romanos I a VI.

[0019] Figura 3. Seleção das cepas da vacina universal dos exemplos ("Tipo 3" (por exemplo, cepa com número de depósito CNCM I-4720), "Tipo 14" (por exemplo, a cepa com número de depósi- to CNCM I-4721) e "Tipo 20" (por exemplo, a cepa com número de depósito CNCM I-4722). A cepa do tipo ancestral dos complexos clonais referidos (II, V e I) foi selecionada. As cepas selecionadas são detectadas em uma proporção de pelo menos 1% com relação ao total de cepas detectadas na Espanha.

[0020] Figura 4. Curvas de sobrevivência comparando os grupos vacinados com a autovacina (cinza escuro), vacina universal (preto) e não vacinado (controle, cinza claro), usando o teste Log Rank em α = 0,05.

[0021] Figura 5. Eliminação de B. hyodysenteriae com o tempo pós-provocação (porcentagem de esfregaços retais positivos por semana) (preto, autovacina; cinza escuro, vacina universal; cinza claro, animais não vacinados (controle)).

[0022] Figura 6. Período de incubação (número de dias entre a provocação e o aparecimento de diarreia ou disseminação fecal das bactérias) nos grupos diferentes (preto, autovacina; cinza escuro, vacina universal; cinza claro, animais não vacinados (controle)).

[0023] Figura 7. Porcentagem de porcos com diarreia (a) e diarreia com sangue (b) após provocação (preto, autovacina; cinza escuro, vacina universal; cinza claro, animais não vacinados (controle)).

[0024] Figura 8. Ganho diária médio (ADG) (Average Daily Gain) nos dias pós-provocação (preto, autovacina; cinza escuro, vacina universal; cinza claro, animais não vacinados (controle)).

[0025] Figura 9. Ganho de peso diário (DWG) (Daily Weight Gain) nos primeiros 9 dias após provocação (dia 0 ao dia 9) (preto, autovaci- na; cinza escuro, vacina universal; cinza claro, animais não vacinados (controle)).

[0026] Figura 10. Medição da resposta de anticorpo (a absorbân- cia a 450 nm relaciona-se diretamente com a quantidade de anticorpo produzido) dos coelhos hiperimunizados com cepas A, B e C contra LPS da cepa A (CNM 1-4720) ao longo do experimento (ensaio de potência).

[0027] Figura 11. Medição da resposta de anticorpo (a absorbância a 450 nm relaciona-se diretamente com a quantidade de anticorpo produzido) dos coelhos hiperimunizados com cepas A, B e C contra LPS de cepa B (CNM1-4721) ao longo do experimento (ensaio de potência).

[0028] Figura 12. Medição da resposta de anticorpo (a absorbân- cia relaciona-se diretamente com a quantidade de anticorpo produzido) dos coelhos hiperimunizados com cepas A, B e C contra LPS da cepa C (CNM1-4722) ao longo do experimento (ensaio de potência).

Descrição detalhada da invenção Composição da Invenção

[0029] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo bactérias de pelo menos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae. O termo "geneticamente diversa" como usado na presente invenção refere-se a um conjunto definido de características diversas mensuráveis, genéticas, na formação genética de uma espécie. Para determinar a diversidade de micro-organismos em ambientes definidos (ecossistemas) ou para identificar a disseminação de cepas particulares entre hospedeiros, técnicas de tipificação genética que têm a habilidade em distinguir organismos diversos da mesma espécie são implantadas. Importante, quando se está comparando a diversidade de uma única espécie entre ecossistemas diferentes uma abordagem estatística robusta que permita uma avaliação objetiva é requerida. Para esta finalidade, índices de diversidade foram definidos matematicamente, os quais são baseados na frequência com a qual organismos de um tipo particular ocorrem em uma população ou podem ser discriminados por uma dada ferramenta de tipificação (Grundmann, H. e outros, Journal of Clinical Microbiology (2001), 39:4190-4192).

[0030] Uma diversidade relativamente alta entre isolatos de B. hyodysenteriae foi classicamente descrita. A habilidade em compreender a epidemiologia de SD e progredir para seu controle depende da disponibilidade de métodos de tipificação de cepa confiáveis para caracterizar os isolatos. Com base na análise de lipopolissacarídeos se- mipurificados (LPS), quatro sorotipos diferentes foram identificados por Baum & Joens (Baum, D.H. e outros, Infection and Immunity (1979), 25:792-796), embora estudos adicionais finalmente diferenciaram um total de 11 sorogrupos que incluíam vários sorotipos (Hampson, D.J. e outros, Epidemiology and Infection (1989), 102:75-89; Hampson, D.J. e outros, Epidemiology and Infection (1990), 105:79-85; Hampson, D.J. e outros, Swine dysentery. Em: Intestinal Spirochaetes in Domestic Animals and Humans, pp. 175-209, editado por D.J. Hampson & T.B. Stanton. Wallingford: CAB International, 1997).

[0031] Diferenças na distribuição geográfica de B. hyodysenteriae foram demonstradas logo em seguida. Cepas de referência dos Estados Unidos foram classificadas dentro dos sorotipos 1 e 2 enquanto uma variabilidade maior com relação à classificação de sorotipo foi descrita para isolatos da Europa e Austrália (Harris e outros, Swine Dysentery. Em: Straw, B.E., D’Allaire, S.D., Mengeling, W.D. & Taylor, D.J. (Eds.) Disease of Swine. Iowa State University Press (1999), Ameas Iowa USA, pp. 579-600). No entanto, não existe quase nenhuma informação recente com relação à distribuição de sorotipo de isola- tos de B. hyodysenteriae. Como uma consequência de reações cruzadas, as técnicas requeridas para determinar o sorotipo são lentas e difíceis de realizar e dão resultados inconclusivos em um número alto dos isolatos. Por esta razão, essas técnicas foram substituídas por vários métodos moleculares.

[0032] Ferramentas de tipificação diferentes foram desenvolvidas para discriminar entre isolatos de campo de B. hyodysenteriae e pro- veram uma melhor compreensão da epidemiologia molecular do pató- geno. Dentre elas, uma ferramenta útil para tipificação de cepa de micro-organismos patogênicos que foi introduzida durante os últimos anos é a análise de repetição em série de número variável de multilocus ou MLVA. Ela foi desenvolvida como uma ferramenta epidemio- lógica importante para tipificação de cepa de micro-organismos patogênicos. MLVA é baseada na amplificação por PCR de vários loci bem selecionados e caracterizados que contêm sequências de repetição curtas (loci múltiplos de minissatélites chamados números variáveis de repetições em série (VNTRs) (Variable Numbers of Tandem Repeats)). Este tipo de minissatélite consiste em repetições de DNA cabeça-para- cauda únicas que podem ser encontradas em todos os genomas de bactéria e podem ser usadas para definir isolatos específicos de espécies bacterianas. Ainda, VNTRs têm sido usados para inferir a estrutura de população bacteriana e filogenia de espécies bacterianas diversas. Dentro de cada locus de sequência de repetição o número de cópias de repetição pode variar entre cepas diferentes. Ao medir o tamanho de cada loci amplificado por PCR, o número de unidades de repetição pode ser deduzido. Hidalgo e colegas desenvolveram e testaram um método de análise de repetição em série de número variável de locus múltiplo (MLVA) que poderia ser usado em laboratórios de mi- crobiologia de diagnóstico veterinário básica equipados com tecnologia de PCR ou em laboratórios mais avançados com acesso à eletroforese capilar. Com base em oito loci, e quando realizada em isolatos de fazendas diferentes em países diferentes, bem como tipo e cepas de referência, a técnica de MLVA desenvolvida foi altamente discriminatória (Hunter e Gaston discriminatory index, 0,938 [intervalo de confiança de 95%, 0,9175 a 0,9584]) enquanto retendo um valor filogenético alto. Usando a técnica, a espécie foi mostrada ser diversa (44 tipos de MLVA de 172 isolatos e cepas), embora isolatos tenham sido estáveis em rebanhos com o tempo. A estrutura da população pareceu ser clonal. O encontro de MLVA tipo 3 de B. hyodysenteriae em chiqueiros em três países da Europa, bem como outras cepas, relacionadas, em países diferentes sugere que disseminação do patógeno através de porcos carreadores é provável. MLVA supera os inconvenientes associados com técnicas de tipificação anteriores para B. hyodysenteriae e é um método poderoso para estudos epidemiológicos e de estrutura de população sobre esta importante espiroqueta (Hidalgo, A. e outros, Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).

[0033] Os inventores e seus colaboradores aplicaram este método em uma coleção internacional de isolatos de B. hyodysenteriae, incluindo 115 isolatos de campo Espanhóis bem como cepas de referência e isolatos da Austrália, Canadá, E.E.U.U., Reino Unido e Países Baixos.

[0034] Análise de MLVA revela que os isolatos de campo Espanhóis de B. hyodysenteriae são heterogêneos e que a população tem uma estrutura clonal. Um número total de 15 tipos de MLVA foi identificado dentre isolatos Espanhóis. Além disso, isolatos com o mesmo tipo de MLVA foram identificados na Espanha, Reino Unido e Países Baixos. Por outro lado, foi concluído que isolatos da Austrália e EEUU não têm nenhum MLVA em comum com isolatos Espanhóis.

[0035] Ao agrupar tipos de MLVA no nível de variante de locus único, um número total de seis complexos clonais (I a VI) foi estabelecido (Figura 2).

[0036] A composição da invenção pode compreender duas ou três ou quatro ou cinco ou mais cepas geneticamente diversas. Preferivelmente, a diversidade genética das cepas da composição da invenção é conferida através da seleção das duas pelo menos cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae de complexos clonais diferentes. "Complexo clonal" conforme usado na presente invenção refere-se aos vários grupos estabelecidos através do agrupamento dos tipos de MLVA no nível de variante de locus único, conforme descrito acima. Mais preferivelmente pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal II e/ou pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal V e/ou pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal I.

[0037] Na composição da presente invenção, as cepas geneticamente diversas preferivelmente pertencem ao tipo ancestral do complexo clonal.

[0038] O ancestral comum dentro de cada complexo clonal foi previsto usando o algoritmo goeBUST disponível em http://goeburst.phylovizt.net/#Software, uma implementação global do algoritmo eBURST. Para mais detalhes vide publicações Feil e outros, 2004 e Francisco e outros, 2009, grátis em http://goeburst.phyloviz.net/#Publications.

[0039] A composição da presente invenção pode compreender ainda uma cepa que pertence ao terceiro complexo clonal. Preferivelmente, o terceiro complexo clonal é selecionado do grupo consistindo em complexo clonal I, complexo clonal II e complexo clonal V.

[0040] Desta maneira, a composição da presente invenção compreende pelo menos duas, preferivelmente três, cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, onde pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal I e/ou pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal II e/ou pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal V.

[0041] Preferivelmente, a composição da invenção compreende três cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae onde uma das cepas pertence ao complexo clonal I, uma das cepas pertencente ao complexo clonal II e uma das cepas pertence ao complexo clonal V.

[0042] Preferivelmente, na composição da presente invenção pelo menos uma cepa é a cepa depositada no Collection Nationale de Cul tures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, em 14 de março de 2013, com número de registro CNCM I-4720, pelo menos uma das cepas é a cepa depositada na mesma data no CNCM com número de registro CNCM I-4721 e/ou pelo menos uma das cepas é a cepa depositada na mesma data no CNCM com o número de registro CNCM I-4722.

[0043] Desta maneira, a presente invenção também provê as cepas depositadas com o Collection Nationale de Cultures de Microorga- nismes (CNCM), Institut Pasteur, em 14 de março de 2013, com números de registro CNCM I-4720, CNCM I-4721 e CNCM I-4722.

[0044] A cepa com o número de registro CNCM I-4720 pertence ao complexo clonal II. A cepa com o número de registro CNCM I-4721 pertence ao complexo clonal V. A cepa com o número de registro CNCM I-4722 pertence ao complexo clonal I.

[0045] Na composição da presente invenção as cepas geneticamente diversas são preferivelmente epidemiologicamente relevantes. No contexto da presente invenção, "epidemiologicamente relevante" significa que as cepas são pelo menos detectadas em uma proporção de 1-100%, preferivelmente pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou 100% com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse. Preferivelmente, as cepas geneticamente diversas são pelo menos 1% detectadas com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse. No contexto da presente invenção, "detectado" significa que as ditas cepas foram identificadas na região de interesse. A detecção das bactérias Bra- chyspira hyodysenteriae pode ser feita, por exemplo, em esfregaços retais, mucosa colônica e/ou amostras fecais de porcos. Por exemplo, as amostras podem ser culturadas e o DNA pode ser extraído seguin- do métodos anteriormente relatados (vide, por exemplo, Hidalto, A. e outros, Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865). A presença de B. hyodysenteriae pode ser detectada através de métodos de PCR. A presença de B. hyodysenteriae pode ser também confirmada através de formação de listras de esfregaços de bacteriologia obtidos de fezes ou das paredes colônicas de porcos em placas de ágar seletivo. Após incubação das placas em ambiente anaeróbico, a presença de crescimento de disseminação plana baixo de espiroque- tas na placa e hemólise ao redor do crescimento pode ser registrada (La, T. e outros, Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Alternativamente, a presença de B. hyodysenteriae pode ser representada suspendendo as amostras em PBS e detectando a presença das bactérias com um teste de imunofluorescência indireto (IFT) (vide, por exemplo, Diego, R. e outros, Vaccine (1995), 13(7):663-667). Outros métodos de detecção da presença de B. hyodysenteriae conhecidos na técnica podem ser empregados.

[0046] O termo "região de interesse" conforme empregado na presente invenção refere-se a uma área demarcada da Terra, isto é, a uma região demográfica ou uma área geográfica onde a presença de B. hyodysenteriae é avaliada. Não há nenhuma limitação específica à região demográfica de interesse. Ela pode variar de milhares de quilômetros em nível continental a alguns quilômetros em nível local. Por exemplo, a região de interesse pode ser parte de um país, um país inteiro ou mais de um país. Preferivelmente, a região de interesse é um país ou um grupo de países. Por exemplo, a região de interesse pode ser Europa. Preferivelmente, a região de interesse pode ser Espanha, mais preferivelmente território Espanhol Península Ibérica, em particular Castilla y Léon, Andalucía e/ou Extremadura. Outras regiões de interesse preferidas são Itália, Países Baixos, Reino Unido, Austrália, Canadá e/ou Estados Unidos.

[0047] Além disso, as bactérias compreendendo a composição da presente invenção podem ser inativadas, isto é, elas podem ser quimicamente ou fisicamente inativadas. A inativação compreende morte das bactérias com agentes químicos, calor e/ou radiação. As bactérias da composição podem ser inativadas através de qualquer procedimento de inativação conhecido na técnica. Preferivelmente, as bactérias da composição da invenção são inativadas através de tratamento das bactérias com formaldeído. Mais preferivelmente, o formaldeído é injetado na cultura de bactérias a 0,5% e é então incubada de um dia para o outro (18 horas, aproximadamente) a 37° C com agitação leve.

[0048] De acordo com a presente invenção, as bactérias da composição, que são preferivelmente inativadas, podem estar presentes em uma concentração de pelo menos entre 107 e 1012 bactérias/mL, preferivelmente em uma concentração de pelo menos 107 ou 108 ou 5.108 ou 109 ou 1010 ou 1011 ou 1012 bactérias/mL, preferivelmente em uma concentração entre 108 e 1010 bactérias/mL, mais preferivelmente em uma concentração entre 108 e 109 bactérias/mL, ainda mais preferivelmente em uma concentração de 5.108 bactérias/mL.

[0049] Se a composição compreender bactérias pertencentes às duas cepas, elas podem estar presentes na composição em uma razão de 1:(0,5-2). Se a composição compreender bactérias pertencentes a três cepas, elas podem estar presentes na composição em uma razão de 1:(0,5-2):(0,5-2). Se a composição compreender bactérias pertencentes a quatro cepas, elas podem estar presentes na composição em uma razão de 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2). Se a composição compreender bactérias pertencentes a cinco cepas, elas podem estar presentes na composição em uma razão de 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2):(0,5- 2). Preferivelmente, a composição compreende bactérias em uma mistura igual das cepas selecionadas, a saber em uma razão de 1:1, 1:1:1, 1:1:1:1, 1:1:1:1:1, dependendo de quantas cepas diferentes a composição compreende. Neste contexto, "razão" significa número de bactérias/mL.

[0050] A concentração de bactérias na composição pode ser calculada usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, contagem em câmara Neubauer pode ser usada para estimar o número de bactérias presente na composição da invenção.

[0051] A composição da presente invenção compreende preferivelmente uma quantidade total de 108 a 109 bactérias inativadas/mL em uma mistura igual das cepas selecionadas, onde as bactérias pertencem a três cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodyse- nteriae, onde uma das cepas pertence ao complexo clonal I, uma das cepas pertence ao complexo clonal II e uma das cepas pertence ao complexo clonal V e onde preferivelmente as cepas geneticamente diversas são epidemiologicamente relevantes em uma região de interesse, isto é, estão presentes na Espanha em pelo menos uma proporção de 1% com relação ao total de cepas detectadas.

[0052] Preferivelmente, as cepas geneticamente diversas que são epidemiologicamente relevantes em uma região de interesse estão cada uma presentes em uma proporção de pelo menos 9% com relação ao total de cepas detectadas. Preferivelmente, uma das cepas está presente em uma proporção de pelo menos 13% com relação ao total de cepas detectadas. Mais preferivelmente duas das cepas estão presentes em uma proporção de pelo menos 13% com relação ao total de cepas detectadas. Sobretudo preferivelmente, uma das cepas está presente em uma proporção de pelo menos 24% com relação ao total de cepas detectadas.

[0053] A composição da presente invenção pode compreender ainda um adjuvante. Um adjuvante é um componente que potencializa a resposta imune a um antígeno e/ou a modula em direção às respostas imunes desejadas. Ele pode ser um agente químico inorgânico ou orgânico, macromolécula ou células integrais de certas bactérias mortas que aumentam a resposta imune a um dado antígeno. No contexto da presente invenção, o adjuvante que pode estar presente na composição da invenção pode ser qualquer adjuvante adequado que, por exemplo, potencialize, acelere ou prolongue a resposta imune específica como conhecido na técnica atual.

[0054] Adjuvantes podem incluir, por exemplo: • Sais minerais, por exemplo, géis de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio ou cálcio. • Formulações baseadas em emulsões oleosas e tensoati- vo, por exemplo, MF59 (emulsão óleo-em-água estabilizada com detergente microfulidizada), QS21 (saponina purificada), AS02 [SBAS2] (emulsão óleo-em-água + MPL + QS-21), Montanide® ISA-51, IS-720, IMS (emulsão água-em-óleo estabilizada). • Adjuvantes em partícula, por exemplo, virossomas (veículos lipossomais unilamelares incorporando hemaglutinina da gripe), AS04 ([SBAS4] sal Al com MPL), ISCOMS (complexo estruturado de saponinas e lipídeos), polilactídeo co-glicolídeo (PLG). • Derivados microbianos (naturais e sintéticos), por exemplo, lipídeo A de monofosforila (MPL), Detox (MPL + esqueleto de parede celular de M. Phlei), AGP [RC-529] (monossacarídeo acilado sintético), DC_Chol (imunoestimuladores lipoidais capazes de se auto organizar em lipossomas), OM-174 (derivado de lipídeo A), motivos de CpG (oligonucleotídeos sintéticos contendo motivos de CpG imunoes- timuladores), LT e CT modificados (toxinas bacterianas geneticamente modificadas para prover efeitos adjuvantes não tóxicos). • Imunomoduladores humanos endógenos, por exemplo, hGM-CSF ou hIL-12 (citocinas que podem ser administradas ou como proteína ou plasmídeo codificado), Imudaptina (arranjo em série C3d). • Veículos inertes, tais como partículas de ouro em direção à resposta desejada a antígenos de vacina.

[0055] Os adjuvantes mais preferidos são sais de alumínio (hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio) e óleos minerais. Quando inoculados, eles produzem um granuloma pequeno que permite a liberação retardada do antígeno (estimulação antigênica de longa duração) e a atração de células apresentando antígeno. Isso aumenta a resposta imune. Por exemplo, o adjuvante pode ser HAVLOGEN® ou Monta- nide®. Sobretudo preferivelmente, o adjuvante pode ser um adjuvante oleoso comercial tal como Montanide® IMS 251 C VG (SEPPIC).

[0056] O adjuvante está preferivelmente presente na composição final em uma concentração na fórmula final de 5 a 50% vol/vol com relação ao volume de injeção final, preferivelmente 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais (vol/vol, isto é, volume com relação ao volume de injeção final). Mais preferivelmente, a concentração de adjuvante na fórmula final é 20% vol/vol (isto é, volume com relação ao volume de injeção final).

[0057] A composição da invenção pode compreender ainda outros componentes. Por exemplo, a composição pode compreender agentes antissépticos e/ou antifúngicos. Por exemplo, a composição pode compreender ainda Thimerosal (Sigma), também conhecido como Ti- omersal. Preferivelmente, Thimerosal está compreendido em uma quantidade de 0,005 a 1 g por 100 ml, preferivelmente em uma quantidade de 0,5 ou 0,3 ou 0,1 ou 0,05 ou 0,03 ou 0,02 ou 0,01 ou 0,005 g por 100 ml. Mais preferivelmente, Thimerosal é compreendido em uma quantidade de 0,01 g por 100 ml. Ainda, a composição da invenção pode também compreender soluções tampão tais como sais. Preferivelmente, a composição da invenção pode compreender um tampão em uma concentração de 0,01 a 0,5 M, preferivelmente em uma con-centração de 0,5 M ou 0,4 M ou 0,3 M ou 0,2 M ou 0,1 M ou 0,05 M ou 0,01 M. O tampão pode ser qualquer tampão adequado descrito na técnica. Por exemplo, o tampão pode ser solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou acetato de sódio. Preferivelmente, o tampão é acetato de sódio 0,1 M.

Vacina da Invenção

[0058] A composição da presente invenção pode ser preferivelmente usada como uma vacina. Uma vacina é uma preparação biológica que melhora a imunidade para uma doença particular. De acordo com a presente invenção, a vacina é preferivelmente uma vacina contra disenteria suína (SD). Preferivelmente, a disenteria suína é causada por Brachyspira hyodysenteriae.

[0059] A composição da invenção para uso como uma vacina (e agora em diante, a vacina da invenção) pode ser adequada para administração a suíno em uma região geográfica particular de interesse. Conforme descrito acima, a região de interesse não é particularmente limitada e pode compreender um ou mais países. Por exemplo, a região de interesse pode ser a Europa. Preferivelmente a, a região de interesse pode ser a Espanha, mais preferivelmente o território da Espanha da Península Ibérica, em particular Castilla y Léon, Andalucía e/ou Extremadura. Outras regiões de interesse preferidas são Itália, Países Baixos, Reino Unido, Austrália, Canadá e/ou Estados Unidos.

[0060] A vacina da invenção pode ser administrada antes da infecção e/ou um pouco depois dela. Por exemplo, a vacina da invenção pode ser administrada 1 a 20 dias após o surto da doença, preferivelmente 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou 15 ou 20 dias após o surto da infecção. A vacina também pode ser administrada 1-4 semanas após o surto da doença, preferivelmente 1, 2, 3 ou 4 semanas após o surto da infecção.

[0061] A vacina da invenção pode ser administrada através de administração parenteral e/ou administração oral. Preferivelmente, a vacina da invenção é administrada através de administração parente- ral, mais preferivelmente através de administração subcutânea e/ou intramuscular e/ou intradermal e ainda mais preferivelmente através de administração intramuscular. Por exemplo, a vacina da invenção pode ser injetada intramuscularmente nos músculos do pescoço de suínos.

[0062] A dosagem administrada da vacina da invenção pode variar de a partir de 1 mL a 5 mL. Por exemplo, uma dosagem da vacina da invenção pode ser 1 mL. Por exemplo, uma dosagem da vacina da invenção pode ser 2 mL.

[0063] A dosagem administrada da vacina da invenção pode compreender entre 107 e 1012 bactérias/dose, preferivelmente entre 108 e 1010 bactérias/dose, mais preferivelmente 109 bactérias/dose. A dosagem administrada da vacina da invenção pode compreender entre 108 e 109 bactérias/mL. A dosagem administrada da vacina da invenção pode compreender 109 bactérias/mL. A dosagem administrada da vacina da invenção pode compreender 5.108 bactérias/mL em 2 mL/dose.

[0064] Desta maneira, o número total preferido de bactérias por dose que pode ser administrado a suíno é 109 bactérias.

[0065] A vacina da presente invenção é preferivelmente uma vacina injetável.

Protocolo de Vacinação

[0066] De acordo com a presente invenção, a vacina da invenção pode ser preferivelmente administrada ao suíno após desmame, sobretudo preferivelmente duas semanas após o desmame. Por exemplo, o suíno pode ser vacinado desde a quarta semana de vida. De acordo com a presente invenção, o suíno pode ser vacinado duas vezes (revacinado). Os suínos são preferivelmente revacinados duas semanas após a primeira vacinação. Por exemplo, o suíno pode ser vacinado duas semanas após o desmame, por exemplo, com quatro semanas de vida. Então, a segunda vacina (revacinação) pode ocorrer com seis semanas de vida (isto é, duas semanas após a primeira va- cina ter sido administrada). Por exemplo, o suíno pode ser vacinado duas semanas após o desmame, por exemplo, com cinco semanas de vida. Então, uma segunda vacina (revacinação) pode ocorrer com sete semanas de vida. Por exemplo, o suíno pode ser vacinado duas semanas após o desmame, por exemplo, com seis semanas de vida. Então, a segunda vacina (revacinação) pode acontecer com oito semanas de vida. Vacinação pela primeira vez com quatro semanas de vida é preferida.

[0067] O desmame pode ocorrer com 21 dias de vida (La, T. e outros, Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). O desmame também pode ocorrer com 15 dias de vida, ou em qualquer idade, dependendo do rebanho.

Desta maneira, a presente invenção provê os itens que seguem:

[0068] 1. Uma composição compreendendo bactérias de pelo me nos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae.

[0069] 2. A composição, de acordo com o item 1 e/ou 2, onde as bactérias estão presentes em uma concentração de pelo menos entre 108 e 109 de bactérias totais/mL.

[0070] 3. A composição, de acordo com os itens 1 e/ou 2, onde as bactérias estão presentes em uma concentração de pelo menos entre 108 e 109 de bactérias totais/mL.

[0071] 4. A composição, de acordo com qualquer um dos itens an teriores, onde a diversidade genética é conferida pela seleção das pelo menos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysen- teriae de complexos clonais diferentes.

[0072] 5. A composição, de acordo com qualquer um ou mais dos itens anteriores, onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal II.

[0073] 6. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal V.

[0074] 7. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal I.

[0075] 8. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde as cepas geneticamente diversas são detectadas em uma proporção de pelo menos 1% em uma região de interesse com relação ao total de cepas detectadas.

[0076] 9. A composição, de acordo com o item 8, onde a região de interesse é a Espanha.

[0077] 10. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde as cepas geneticamente diversas pertencem ao tipo ancestral de cada complexo clonal.

[0078] 11. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde a composição compreende ainda uma cepa que pertence a um terceiro complexo clonal.

[0079] 12. A composição, de acordo com o item 11 onde o terceiro complexo clonal é selecionado do grupo compreendendo complexo clonal I, complexo clonal II e complexo clonal V.

[0080] 13. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal I, pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal II e/ou pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal V.

[0081] 14. A composição, de acordo com o item 13, onde pelo me nos uma das celas é a cepa com o número de depósito CNCM I-4720, pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4721 e/ou pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4722.

[0082] 15. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores compreendendo ainda um adjuvante.

[0083] 16. A composição, de acordo com o item 15, onde o adju vante é selecionado do grupo consistindo em sais de alumínio (preferi- velmente hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio) e óleos minerais.

[0084] 17. A composição, de acordo com o item 16, onde o adju vante é um adjuvante de óleo, preferivelmente Montanide® 251 C VG.

[0085] 18. Uma composição, de acordo com um ou mais dos itens anteriores para uso como uma vacina.

[0086] 19. A composição, de acordo com o item 18, onde a vacina é uma vacina contra disenteria suína.

[0087] 20. A composição, de acordo com o item 19, onde a disen teria suína é causada por Brachyspira hyodysenteriae.

[0088] 21. A composição, de acordo com um ou mais dos itens 18 a 20, onde a vacina é adequada para administração a suíno em uma região de interesse.

[0089] 22. A composição, de acordo com o item 21, onde a região de interesse é a Espanha.

[0090] 23. A composição, de acordo com um ou mais itens 18 a 22, onde as cepas geneticamente diversas são detectadas em uma proporão de pelo menos 2% com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse.

[0091] 24. A composição, de acordo com um ou mais dos itens 18 a 23, onde a vacina é administrada através da administração parenteral.

[0092] 25. A composição, de acordo com o item 24, onde a vacina é administrada através de administração intramuscular.

[0093] 26. A composição, de acordo com um ou mais itens 18 a 25, onde o suínos são vacinados duas semanas após o desmame.

[0094] 27. A composição, de acordo com o item 26, onde os suí nos são revacinados duas semanas após a primeira vacinação.

[0095] 28. Um método para produção de uma composição de acordo com um ou mais itens 1 a 27 compreendendo seleção de pelo menos duas cepas geneticamente diferentes e mistura delas em quan- tidade igual para obter uma concentração de pelo menos entre 108 e 109 de bactérias totais/mL.

[0096] 29. O método, de acordo com o item 28, onde as pelo me nos duas cepas geneticamente diferentes são também epidemiologi- camente relevantes.

[0097] 30. O método, de acordo com um ou mais dos itens 28 a 29 compreendendo ainda a inativação das bactérias.

[0098] 31. O método, de acordo com um ou mais dos itens 28 a 30, onde a diversidade genética é conferida através da seleção de cada cepa para complexos clonais diferentes.

[0099] 32. O método, de acordo com um ou mais dos itens 29 a 31, onde a relevância epidemiológica é conferida pela seleção de cepas que são detectadas em uma proporção de pelo menos 1% com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse.

[0100] 33. O método, de acordo com o item 32, onde a região de interesse é a Espanha.

Exemplos Exemplo 1. Análise de Repetição em Série de Número Variável de Múltiplos-Locus de Brachyspira hyodysenteriae Análise de MVLA

[0101] Um conjunto de 172 isolatos e cepas de B. hyodysenteriae de porco foi usado neste estudo, incluindo as três cepas de referência B204R (ATCC 31212), B234R (ATCC 31287) e WA1R (ATCC 49526) e a cepa tipo B78T (ATCC 27164).

[0102] Duplicatas das cepas B204R e B78T foram obtidas das coleções bacterianas mantidas na University of León e na Murdoch University. As cepas e isolatos de campo eram da Espanha (n = 115), Austrália (n = 36), Canadá (n = 3), Estados Unidos (n = 7), Reino Unido (n = 4) e Países Baixos (n = 7) e tinham sido recuperados de 1970 a 2009. Vinte e três isolatos foram recuperados de porcos Ibéricos, um criador Espanhol local. Esses porcos contribuem para a preservação do "dehesa", um ecossistema do Mediterrâneo específico localizado nas regiões oestes do país (Castilla y León, Extremadura e Andalucía), onde eles são tradicionalmente criados em unidades extensivas. Os isolatos de campo foram recuperados de rebanhos diferentes, exceto por 26 isolatos Espanhóis que foram adicionalmente isolados de 11 rebanhos em ocasiões de amostragem diferentes. Isolatos de B. hyodysenteriae das coleções bacterianas da University of León e da Murdoch University foram identificados e culturados e DNA foi extraído em cada laboratório fornecedor através de métodos anteriormente relatados. Diluições de trabalho de DNA extraído foram preparadas ajustando-as para 1 a 20 ng/μL usando um espectrofotômetro NanoDrop 1000 UV-Vis (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Identificação de repetições em série e projeto de primer

[0103] A sequência de DNA cromossomal de WA1R de B. hyody- senteriae foi buscada do GenBank (no. de acesso NC_012225) e investigada quanto a repetições em série potenciais usando os parâmetros default do programa Tandem Repeat Finder, disponível como um serviço da Web (http://tandem.bu.edu/). Os loci de repetição em tandem selecionados foram classificados através de comprimento de consenso, e aqueles com comprimentos entre 25 e 300 pb foram usados para projetar primers dentro das regiões de flanqueamento. Os loci foram chamados Bhyo, seguido por número de classificação de comprimento de repetição (de 1 a 23), separado por um undescore. Avaliação de repetição em série e ajuste de MLVA

[0104] Em uma etapa preliminar, DNA extraído de B204R da cepa de B. hyodysenteriae foi usado para estimar a temperatura de anela- mento empírica dos 23 pares de primer selecionados em uma PCR de gradiente. A PCR foi realizada em um Mastercycler Gradient (Eppen- dorf Scientific Inc., Westbury, NY) com uma etapa inicial de 95°C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de um protocolo de ciclo de três etapas consistindo em 94°C por 30 s, 56 ± 8°C por 30 s e 7 2°C por 1 min e uma etapa de extensão final de 72°C por 10 min. Para avaliar a utilidade dos 23 loci selecionados como marcadores epidemiológicos, amostras de DNA de B204R e B78T de cepas de B. hyodysenteriae e isolatos 3, 19, 23, 53, 64, H9 e H72, que foram mostrados ter diferenças genéticas por PFGE e RAPD em uma investigação anterior (Hidalgo, Á. e outros, Epidemiology & Infection (2010), 138:76-85), foram usadas. Ainda, dados de repetição em série gerados para WA1R cepa de B. hyodysen- teriae foram levados em consideração. Cada locus foi amplificado individualmente, e o comprimento do produto foi analisado através de eletroforese em gel de agarose convencional usando uma escada de DNA de 100 pb (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os loci foram selecionados de acordo com seu polimorfismo de comprimento e sua habilidade em gerar amplicon para a maioria das amostras de DNA testadas. Para confirmar o comprimento do produto de PCR, bem como o número de repetições, os padrões de consenso e os tamanhos das regiões de flanque- amento, amplicons foram purificados usando o AxyPrep PCR Cleanup kit (Axygen Biosciences, Unicon City, CA) e sequenciados usando tecnologia de didesoxinucleotídeo fluorescentemente marcado de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Com base nisso, oito loci de VNTR foram selecionados para serem usados na ferramenta de tipificação final. Amplificações por PCR para MLVA

[0105] Os isolatos obtidos com a coleção bacteriana selecionada para este estudo foram analisados amplificando independentemente os oito loci de VNTR selecionados em um aparelho Mastercycler (Ep- pendorf). Os primers para PCR e as condições de termociclização usados são descritos na Tabela 1. Misturas de PCR foram preparadas usando tubos estéreis de 0,2 mL contendo tampão de PCR 1x (Tris HCl 20 mM [pH 8,4], KCl 50 mM), MgCl2 5 mM, 1 U de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen), mistura de trifosfato de desoxinucleosí- deo 200 μM (Invitrogen), primers avançado e reverso 0,2 μM cada um, 2 μL da diluição de trabalho de DNA e água destilada estéril até um volume final de 50 μL. Os produtos de PCR foram separados em géis de agarose, e seus tamanho alélicos foram estimados usando uma escada de DNA de 100 pb (Invitrogen). Amplicons de alelos não detectados na etapa de ajuste foram sequenciados conforme descrito acima. Ainda, a fim de assegurar a capacidade de repetição da técnica, 28 amostras de DNA foram aleatoriamente selecionadas e testadas novamente. A capacidade de reprodução entre laboratórios foi avaliada através da determinação independente dos tipos de VNTR de 14 isolatos na University of León e na Murdoch University. Tabela 1: Primers para PCR e condições de termociclização

[0106] Os oito pares de primer usados nas PCRs individuais foram agrupados em dois conjuntos (conjunto 1 e conjunto 2); fluorescentemente marcados com 6-carboxifluoresceína (6-FAM®), VIC®, PET® ou NED® (Applied Biosystems) na extremidade 5’ dos primers avançados; e agrupados antes da realização de uma PCR multiplex usando o Qiagen Multiplex PCR kit de acordo com as recomendações do fabricante (Qiagen, Germantown, MD). Tabelas 2 e 3: Conjuntos de primer Conjunto de primer 1

Conjunto de primer 2

[0107] Um volume de 25 μl foi usado para amplificação por PCR multiplex com um protocolo de ciclização térmica de 95°C por 15 min; 30 ciclos de três etapas de 94°C por 30 s, 55/53°C (conjunto 1/conjunto 2) por 90 s e 72°C por 90 s; e uma etapa de extensão final de 72°C por 10 min. Produtos de PCR multiplex foram diluídos 1:10 em água destilada antes de 1 μl desta dissolução ter sido misturado com 0,5 μl de 1200 LIZ Size Standard (Applied Biosystems) e 10,5 μl de formamida. Após a mistura ter sido aquecida por 3 min a 96°C e rapidamente esfriada em gelo, análise GeneScan foi realizada usando um analisador de DNA ABI 3730 (Applied Biosystems). O programa livremente disponível Peak Scanner Software v 1.0 (Applied Biosystems) foi usado para dimensionar os fragmentos de PCR para cada locus.

Análise de Dados

[0108] O número de repetições foi calculado de acordo com a fórmula que segue: Número de repetições = [Tamanho do fragmento (pb) x Regiões de flanqueamento (pb)]/Tamanho da repetição (pb)

[0109] Os resultados foram aproximados do menor inteiro mais próximo e sequencialmente classificados (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 e Bhyo_23) para criar um perfil numérico que definiu cada cepa. Quando amplificação por PCR não era detectável, o número atribuído de repetições foi 99. Perfis de MLVA foram designados a tipos de MLVA através da atribuição de um número inteiro. Os isolatos foram considerados geneticamente idênticos quando os perfis numéricos para todos os oito loci eram correspondentes. O índice de diversidade Hunter-Gaston foi usado para medir o polimorfismo de loci individuais e o índice de discriminação do método de tipificação de MLVA para os oito loci de VNTR combinados (Hunter, P.R. e M.A. Gaston, Journal of Clinical Microbiology (1988), 26:2465-2466). Aproximadamente 95% de intervalos de confiança (CI) foram calculados conforme descrito por Grundmann e outros (Journal of Clinical Microbiology (2001), 39:4190-4192). Isolatos redundantes (n = 26) foram removidos antes do cálculo dos índices anteriores. O programa Sequence Type Analysis and Recombinational Tests (START2), disponível grátis em http://pubmlst.org/software/analysis/start2/, foi usado para analisar os perfis e tipos de MLVA das espiroquetas testadas. Uma árvore filogenética dos tipos de MLVA foi construída com base no método de grupo de par não ponderado usando estratégia de agrupamento de ligações médias (UPGMA). Uma análise de inicialização para 1.000 réplicas foi realizada usando FreeTree em http://web.natur.cuni.cz/flegr/programs/freetree.htm. O algoritmo goe- BURST, disponível em http://goeburst.phyloviz.net/#Software, uma implementação global do algoritmo eBURST (Feil, E. J. e outros, Journal of Bacteriology (2004), 186:1518-1530), foi usado para identificar grupos de genótipos relacionados de B. hyodysenteriae em níveis variantes de locus único, duplo e triplo. A estrutura da população foi testada conforme proposto por Smith e outros (Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. (1993), 90:4384-4388), levando em consideração as modificações propostas por Haubold e outros (Genetics (1998), 150:1341-1348) para o cálculo do valor crítico (LMC) da distribuição da variância das diferenças em par e expressa como um índice padronizado de associação (ISA).

Resultados Identificação de marcadores de VNTR

[0110] Investigação da sequência cromossomal de WA1R de B. hyodysenteriae com um programa Tandem Repeat Finder identificou 404 repetições em série em todo o cromossomo, com 135 repeti- ções/Mpb. Seleção subsequente dos marcadores de repetição em série mais adequados diminuiu o número a ser incluído no MLVA para 23, os quais foram consecutivamente nomeados Bhyo_1 a Bhyo_23 e usados para projetar primers dentro das regiões de flanqueamento. Quinze loci que eram monomórficos ou falharam em amplificar todos ou a maioria dos nove isolatos selecionados com os primers específicos foram descartados. Os oito loci restantes eram polimórficos, com tamanhos de alelo diferentes. Sequenciamento dos produtos de PCR confirmou que o polimorfismo do comprimento era devido a diferenças no número de cópia de repetições em série e que o padrão de consenso, seu tamanho de período e as regiões de flanqueamento eram estáveis (Tabela 4). Desta maneira, oito loci (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 e Bhyo_23) foram incluídos no esquema de MLVA para B. hyodysenteriae. Esses loci foram distribuídos da posição 1236667 até a posição 2949421 do ge- noma de WA1R (Tabela 4). Quatro loci, Bhyo_6, Bhyo_10, Bhyo_21 e Bhyo_22, foram postos em estruturas de leitura aberta codificando proteínas hipotéticas, enquanto os outros quatro estavam localizados em regiões intergênicas. Bhyo_7 foi posto entre os genes para a proteína de quimiotaxia de aceitação de metila MpcA e uma proteína hipotética. Bhyo_12 estava entre os genes para uma proteína da família de glico- siltransferase putativa 2 e uma proteína hipotética. Bhyo_17 estava entre os genes para glicerol 3-fosfato desidrogenase e ferredoxina. Bhyo_23 estava entre os genes para uma proteína hipotética e RarR putativa, prevista ser uma permease. Tabela 4: Características dos loci incluídos no MLVA

Tipificação de MLVA

[0111] O conjunto de oito marcadores de VNTR foi usado para tipificar a coleção inteira de 174 cepas e isolatos de B. hyodysenteriae recuperados de porcos em vários países (incluindo as duplicatas de B78T e B204R). As cepas e isolatos foram eficientemente amplificados e os comprimentos dos produtos de PCR foram convertidos em números de repetições. Sequenciamento de novos alelos que foram identificados neste estágio confirmou que as diferenças em comprimento representavam variações no número de motivos de repetição anteriormente detectados. O marcador Bhyo_10 foi o VNTR mais diverso, com oito números diferentes de repetições (99, 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 10), com um número atribuído de repetições de 99 devido a uma falta de ampli-ficação. Sete números de repetições foram detectados para locus Bhyo_17, enquanto os marcadores Bhyo_6, Bhyo_7 e Bhyo_21 cada um representava seis números de repetições. Os loci Bhyo_12 e Bhyo_22 mostraram uma distribuição contínua de quatro números de repetições. O marcador de VNTR Bhyo_23 mostrou menos diversidade, com apenas dois números diferentes de repetições, 1 e 2, detectados. Uma estimativa precisa do grau de polimorfismo de loci foi obtida por meio do índice de diversidade de Hunter-Gaston, com os poderes de discriminação dos loci variando de 0,141 a 0,764. O locus Bhyo_10 era o mais discriminatório, com um valor de 0,764, seguido pelos loci Bhyo_7, Bhyo_6, Bhyo_17 e Bhyo_21, com valores de 0,761, 0,718, 0,71 e 0,699, respectivamente. Os loci Bhyo_12 e Bhyo_23 tinham índices de diversidade de 0,472 e 0,318, respectivamente, enquanto o locus mais conservado era Bhyo_22, com um índice de polimorfismo de 0,141.

[0112] O índice discriminatório Hunter-Gaston do método de tipificação de MLVA nos oito loci para 146 cepas e isolatos de rebanhos diferentes foi 0,938 (CI 95%, 0,9175 a 0,9584). Análise da combinação dos oito loci de VNTR para todos os isolatos e cepas de B. hyodysen- teriae mostrou 44 tipos de MLVA, que diferiam em pelo menos uma repetição para um dos oito loci entre dois tipos diferentes. Os tipos de MLVA das cepas de referência foram tipo 35 para WA1R, tipo 23 para B204R e tipo 10 para B234R, enquanto a cepa tipo B78T foi atribuída a tipo 28 de MLVA. Análise dos tipos de MLVA diferentes em cada país mostrou a existência de diversidade considerável. Havia 15 tipos (1, 2, 3, 5, 9, 11, 12,13, 14, 18, 19, 20, 22, 24 e 37) entre os 89 isolatos Espanhóis de rebanhos diferentes, 16 tipos (15, 16, 17, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 42, 43 e 44) entre os 36 isolatos Australianos, 2 tipos (21 e 27) para os três isolatos Canadenses, 3 tipos (3, 6 e 41) para os sete dos Países Baixos, 4 tipos (3, 8, 29 e 30) para as quatro cepas do Reino Unido e 6 tipos (4, 7, 10, 23, 28 e 40) para os sete iso- latos e cepas dos Estados Unidos. O tipo 3 de MLVA foi compartilhado por isolatos da Espanha, do Reino Unido e Países Baixos. Os tipos de MLVA eram estáveis para os rebanhos onde mais de um isolato foi recuperado em ocasiões de amostragem diferentes. A cepa de B. hyodysenteriae WA1R mostrou uma falta de correspondência para locus Bhyo_6 entre o comprimento do produto de PCR, 780 pb (quatro números de repetições) e os dados derivados do genoma sequencia- do, 1.092 pb (seis números de repetições). Isolatos e cepas incluídos nos testes de capacidade de repetição e capacidade de reprodução tinham os mesmos tipos de MLVA nos tempos de teste diferentes. Além disso, cada uma das duplicatas do tipo B. hyodysenteriae e cepas de referência, B78T e B204R, das coleções da University of León e Murdoch University, gerou os mesmos padrões de MLVA. Tipos de MLVA e análise de população bacteriana

[0113] Uma árvore evolucionária baseada em perfis de MLVA e construída de acordo com a estratégia de agrupamento UPGMA para os 44 tipos de MLVA de B. hyodysenteriae determinados neste estudo é mostrada na Figura 1. As relações de tipo de MLVA nos níveis de variante de locus único, duplo e triplo mostrados com os algoritmos goeBURST são mostradas na Figura 2. Seis complexos clonais (I a VI) foram estabelecidos no nível de variante de locus único. Três novos grupos apareceram quando investigando variantes de locus duplo, enquanto três grupos de variantes de locus único (II, III e IV) foram agrupados juntos neste nível. Quando bordas de alto nível foram exibidas para estudar relações no nível de variante de locus triplo, um grupo grande apareceu, o qual incluía grupos I a IV, e o grupo V foi expandido por mais dois tipos. Os tipos de MLVA 4, 5, 10 e 15 não foram liga-dos com nenhum dos outros tipos detectados em nenhum dos níveis estudados. Desequilíbrio de ligação de população foi detectado para os 146 isolatos de rebanhos diferentes (ISA = 0,1359; P < 0,001) e para os tipos de MLVA diferentes (ISA = 0,0336; P = 0,005). Exemplo 2: Seleção e cultura das cepas de vacina universal

[0114] Três cepas de Brachyspira hyodysenteriae foram selecionadas, cada uma delas pertence a complexos clonais diferentes (complexos clonais I, II e IV). Cada cepa geneticamente diversa selecionada pertence ao tipo ancestral de cada complexo clonal. Além disso, cada cepa selecionada é pelo menos 1% detectada com relação ao total de cepas detectadas na Espanha (Figura 3). As cepas são as depositadas no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, em 14 de março de 2013, com números de registro CNCM I-4720, CNCM I-4721 e CNCM I-4722.

[0115] A cepa com número de registro CNCM I-4720 pertence ao complexo clonal II. A cepa com número de registro CNCM I-4721 pertence ao complexo clonal V. A cepa com número de registro CNCM I4722 pertence ao complexo clonal I.

[0116] CNCM I-4720 é 24,7% detectada com relação ao total de cepas detectadas em território Espanhol na Península Ibérica. CNCM I-4721 é 13,5% detectada com relação ao total de cepas detectadas em território Espanhol na Península Ibérica. CNCM I-4722 é 9% detectada com relação ao total de cepas detectadas em território Espanhol na Península Ibérica.

[0117] As bactérias isoladas (livres de contaminantes) são inoculadas em placas de ágar-sangue. As placas são mantidas em condições anaeróbicas a 39,5°C por 4-5 dias, até que hem ólise na placa inteira seja observada. Ágar fragmenta nas bordas de hemólise e elas são inoculadas em uma nova placa de ágar-sangue, incubada nas mesmas condições. As bactérias são passadas para uma paca de ágar-sangue nova e, em paralelo, para uma placa de Fastidious Anaerobe Agar (FAA), e as bactérias são culturadas nas mesmas condições durante 3-4 dias. As bactérias podem então ser transferidas para meio de crescimento líquido e culturadas.

[0118] Para fermentação, as bactérias são incubadas em aproximadamente 4L de meio de cultura adequado (tal como meio de Infusão de Cérebro Coração da Merck) a 38,5°C com agita ção leve (50 rpm) em uma atmosfera livre de oxigênio. A fermentação ocorre até que a densidade óptica seja aproximadamente 1,6 (ou até que haja em torno de 109 UFC/mL (geralmente entre 15 e 30 horas)). Exemplo 3: Inativação das bactérias

[0119] Após a fermentação, 4 L (aproximadamente) de cultura são bombeados para um frasco estéril e centrifugados (2 x 7000 rpm, 10 minutos). Os peletes resultantes são suspensos em 1 L de tampão de acetato de sódio 0,1 M. A inativação da cultura é realizada com uma injeção de formaldeído a 0,5% e incubação durante 24 horas a 37°C com agitação leve (50 rpm). No dia seguinte a suspensão é centrifugada e ressuspensa em acetato de sódio estéril 0,1 M. O antígeno (109-1010 bactérias/mL, aprox.) é mantido a 4°C até mistura com adjuvante e excipientes para fabricação de vacina. Exemplo 4: Fórmula de vacina (vacina universal da invenção)

[0120] A vacina compreende os componentes que seguem. O termo antígeno refere-se às cepas de Brachyspira hyodysenteriae selecionadas mencionadas acima e a concentração final de antígeno é 109 bactérias/mL em uma mistura igual das três cepas selecionadas.

[0121] Os componentes foram misturados através de agitação a 4°C de um dia para o outro. Exemplo 5: Comparação entre uma autovacina eficiente e a vacina universal da invenção

[0122] As condições que seguem foram usadas: 1- Os porcos usados neste exemplo vieram de uma fazenda livre de infecções por espiroqueta e com estado de saúde ruim, devido à dificuldade em obter uma boa provocação em porcos com estado de saúde bom. 2- A dieta foi manipulada a fim de induzir uma disbiose muito grande no intestino. A importância de dieta em disenteria suína é também bem conhecida. Neste experimento a ração foi misturada com 50% de farinha de soja que tinha 46% de proteína. Os porcos receberam esta dieta a partir do dia da provocação (10 dias no total). 3- A cepa usada para a provocação foi a cepa de referência B204 (Número ATCC: 31212). A cepa foi previamente passada três vezes em porcos para manter totalmente sua patogenicidade e verificar que a infecção experimental seria apropriada. Isso assegura que a cepa usada tenha uma alta patogenicidade e cause uma doença grave em porcos infectados.

[0123] Os três grupos que seguem de seis porcos cada um foram usados: - Grupo 1 (autovacina): porquinhos foram vacinados via in-tramuscular (i.m.) com a autovacina (B204 inativada e adjuvante, mesmo protocolo acima mas com B204 inativada como antígeno) em 6 semanas de vida e revacinados em 8 semanas de vida. Cada dose continha 109 bactérias. - Grupo 2 (vacina universal): porquinhos foram vacinados via i.m. com a vacina universal (a vacina inativada polivalente e adju- vantada, compreendendo as três cepas de campo selecionadas). O protocolo de vacinação foi igual ao acima (porquinhos foram vacinados em 6 semanas de vida e revacinados em 8 semanas). A dose foi também 109 bactérias em uma mistura igual das três cepas selecionadas. - Grupo 3 (grupo controle, não vacinado): o mesmo adjuvante (sem antígeno bacteriano) foi injetado i.m. em porquinhos em 6 e 8 semanas de vida (protocolo igual ao acima).

[0124] Vacinação e revacinação foram realizadas na fazenda. Os porquinhos foram mantidos na fazenda até a 10 semana de vida e foram então levados para as instalações experimentais da University of León. Os porquinhos pertencendo aos três grupos experimentais foram misturados entre eles nessas instalações.

[0125] A infecção experimental foi feita 3 semanas após a segunda dose, quando os porquinhos tinham 11 semanas de vida. Cada porco de cada grupo recebeu 100 mL de uma cultura fresca de cepa do tipo B204 contendo 109 bactérias/mL oralmente durante 3 dias consecutivos. A dieta foi modificada no primeiro dia de provocação, como mencionado acima.

[0126] Deste o primeiro dia de provocação (PID 1) os porcos foram amostrados diariamente através de coleta de esfregaços retais e disseminação fecal de B. hyodysenteriae foi monitorada através de cultura microbiológica. A partir de PID 1, o estado de saúde geral e a presença ou diarreia e características das fezes foram também registrados. Resultados: 1- Mortalidade

[0127] No grupo de porcos vacinados com a vacina universal, um porquinho morreu no 17° dia após infecção experimental. Neste caso, a morte foi causada por pneumonia. O porco morto não tinha eliminado Brachyspira hyodysenteriae nas fezes antes da sua morte.

[0128] A mortalidade causada por disenteria suína foi a mesma no grupo de porcos vacinados com a vacina universal e aqueles vacinados com a autovacina (1 porco em cada grupo) e três vezes menos do que nos porcos não vacinados do grupo controle (3 porcos morreram).

[0129] Dada a razão de probabilidade, o risco de mortalidade era 6 vezes maior do que naqueles animais do grupo controle comparado com aqueles vacinados com a vacina universal ou com a autovacina (OR = 6; CI 95% 0,28-246,02).

[0130] Em ambos os grupos de porcos vacinados (aqueles vacinados com a vacina universal e aqueles vacinados com a autovacina) a morte do porco ocorreu no dia 29 pós-provocação, enquanto no grupo controle os três porcos morreram nos dias 7, 9 e 13 pós- provocação (Figura 4).

[0131] Conforme esperado, nenhuma diferença foi observada entre curvas de sobrevivência de vacinados com a vacina universal e animais não vacinados (p = 0,9372). 2- Período de Incubação

[0132] O período de incubação, definido como o número de dias entre a provocação e o aparecimento de diarreia ou disseminação fecal das bactérias, foi significantemente mais longo naqueles porcos do grupo controle comparado com animais autovacinados (F = 7,36; p = 0,024). Este período de incubação foi também maior para porcos vacinados comparado com controles. Quaisquer diferenças estatisticamente significantes foram encontradas entre ambos os grupos de porcos vacinados e autovacinados (F = 1,7; p = 0,228) (Figura 6). 3- Diarreia e diarreia de sangue

[0133] A proporção de dias com diarreia foi significantemente maior no grupo controle comparado com porcos vacinados com a vacina universal (Chi2 = 8,37; p = 0,004) e com porcos autovacinados (Chi2 = 4,27; p = 0,038).

[0134] Um resultado similar com relação à proporção de dias com diarreia de sangue foi obtido. O valor foi significantemente maior no grupo controle comparado com grupo vacinado com a vacina universal (Chi2 = 7,25; p = 0,007) e grupo autovacinados (Chi2 = 16,6; p<0,001).

[0135] Ainda, a diarreia com sangue começou mais cedo no grupo controle (dois dias pós-provocação). Neste grupo todos os porcos tiveram diarreia de sangue no dia 6 pós-provocação e por 5 dias a diarreia de sangue afetou mais de 50% dos porcos (Figura 7).

[0136] Quaisquer diferenças estatisticamente significantes foram encontradas entre vacinados com a vacina universal e porcos autova- cinados na proporção de dias com diarreia (Chi2 = 0,57; p = 0,45) nem com diarreia de sangue (Chi2 = 1,92; p = 0,165). 4. Ganho diário médio

[0137] Nos primeiros 9 dias após a provocação, quase nenhum ganho de peso foi observado em porcos do grupo vacinado com a vacina universal e um ganho diário médio de 0,27 kg foi determinado em animais do grupo autovacinado. No entanto, quaisquer diferenças sig- nificantes foram demonstradas quando comparando ambos os grupos. Esses grupos não mostraram nenhuma perda de peso em nenhum momento durante todo o teste.

[0138] Animais do grupo controle mostraram uma perda de peso clara durante os primeiros 9 dias após a provocação. A perda de peso média foi 0,29 kg/dia. Após esses 9 dias, não foram encontradas diferenças significantes no ganho diário médio (ADG) de porcos sobreviventes do grupo controle comparado com aquele de porcos de grupos vacinados com a vacina universal e autovacinados (Figuras 8 e 9).

[0139] Animais do grupo autovacinado mostraram o menor ganho diário médio quando analisando em 24 dias pós-provocação, provavelmente como uma consequência do período de incubação mais longo da doença nesses animais. Por outro lado, animais dos grupos vacinados com a vacina universal e controle mostraram uma recuperação clara de ganho de peso diário neste momento desde quando eles foram afetados anteriormente por doença clínica. Conclusões

[0140] O objetivo do estudo era comparar a eficácia de uma vacina universal (neste caso composta por três cepas selecionadas, nenhuma delas era a cepa causando a infecção) com aquela de uma autovacina em condições muito adstringentes.

[0141] - A infecção de porcos com a cepa B204 usando três doses diárias de 109 bactérias e indução de uma disbiose forte no intestino causa disenteria suína severa e uma mortalidade de 50% de porcos não tratados no grupo controle.

[0142] - Não há quaisquer diferenças na eficácia da vacina uni versal e da autovacina na redução de mortalidade causada por disenteria suína.

[0143] - Não há diferenças estatisticamente significantes na eficá cia da vacina universal e da autovacina na redução de sinais clínicos de disenteria suína (diarreia e diarreia de sangue).

[0144] - Não há nenhuma perda de peso em porcos vacinados com a vacina universal nem naqueles vacinados com a autovacina.

[0145] A eficácia da vacina universal é comparável com a eficácia de uma autovacina eficaz. A vacina universal tem uma boa relação custo/benefício para o controle de disenteria suína em condições de campo, considerando a eficácia testada das autovacina. Exemplo 6: Estudo ELISA de lipopolissacarídeos (LPS) de coelhos hiperimunizados

[0146] O objetivo do estudo que segue era mostrar as diferenças qualitativas encontradas entre a resposta imune sorológica de cada uma das três cepas (A, B e C, vide abaixo a referência exata) contidas na fórmula de vacina para Brachyspira hyodysenteriae trivalente (vacina universal. Materiais e Métodos

[0147] Para o experimento, nove coelhos foram separados em três grupos de três animais e cada grupo foi inoculado intravenosamente com uma das cepas durante seis dias (D1, D2, D3, D4, D5 e D10 para o estudo) com 0,5 mL da suspensão bacteriana. Desta maneira, para cada bactéria foi necessária a preparação de 0,5 ml x 3 animais por cepa x 6 dias = 9 ml de 1010 bactérias/mL de cultura.

[0148] O inóculo foi preparado a partir de uma cultura líquida pura de cada cepa em 100 ml de BHI (Infusão de Cérebro Coração) com BFS 6% (Soro Bovino Fetal). A cultura líquida foi centrifugada e lavada três vezes com Tampão de PBS; suspensão inicial (crescimento para 109 bactérias/mL aprox.) foi concentrada dez vezes para uma suspensão final de 1010 bactérias/mL.

[0149] Sangue foi coletado nos dias D15, D18, D21, D24, D27 e D36 de cada animal. Os soros foram imediatamente enviados para as instalações Aquilón para análise de anticorpo.

[0150] Placas de ELISA foram revestidas separadamente com 0,5 μg de antígeno LPS de cada cepa, obtido como descrito em Hassan e outros ("Antibody response to experimental Salmonella typhimurium infection in chickens measured by ELISA" (1990). Vet rec. 126(21):519-22) e ELISA foi realizado seguindo o método para Salmonella descrito por Collazos (Aportaciones al diagnóstico y control de la salmonelosis porcina (2008). Tesis Doctoral. Universidad de León).

[0151] Resultados. Os resultados podem ser vistos nas Figuras 10, 11 e 12. Diferenças entre placas de ELISA revestidas com LPS vindo das três cepas de espiroquetas contra soros de um grupo de coelhos hiperimunizados com essas três cepas separadamente podem ser observadas. Foi demonstrado que respostas imunes de soro produzidas por cada uma das cepas de espiroqueta usadas aqui (A, B e C) são diferentes dependendo de se o revestimento com LPS da placa de ELISA é homólogo ou heterólogo para a cepa do soro (vide Figuras 10, 11 e 12). Esses resultados confirmam o fato que cepas genetica-mente separadas mostram uma produção de anticorpo específica. Desta maneira, os inventores foram capazes de detectar surpreendentemente diferenças na produção de resposta imune/anticorpo do animal devido à imunização com as bactérias que foram selecionadas com base em sua diversidade genética, conforme descrito no pedido, e esse critério de diversidade genética não é direcionado por sequência funcional. Esses resultados inesperados justificam a inclusão de vários padrões antigênicos na fórmula de vacina, especialmente levando em consideração que o critério genético usado é não "direcionado por gene", mas apenas baseado em polimorfismo genômico.

Itens adicionais da presente invenção

[0152] 1. Uma composição compreendendo bactérias de pelo me- nos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteri- ae.

[0153] 2. A composição, de acordo com o item 1, onde as bacté rias são inativadas.

[0154] 3. A composição, de acordo com os itens 1 e/ou 2, onde as bactérias estão presentes em uma concentração entre 108 e 109 de bactérias total/mL.

[0155] 4. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde a diversidade genética é conferida através de seleção de pelo menos duas cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae de complexos clonais diferentes.

[0156] 5. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal II e/ou onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal V e/ou onde pelo menos uma cepa pertence ao complexo clonal I.

[0157] 6. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde as cepas geneticamente diversas são detectadas em uma proporção de pelo menos 1% com relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse.

[0158] 7. A composição, de acordo com o item 6, onde a região de interesse é preferivelmente a Espanha.

[0159] 8. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores, onde as cepas geneticamente diversas pertencem ao tipo ancestral de cada complexo clonal.

[0160] 9. Composição, de acordo com um ou mais dos itens ante riores, onde a composição compreende ainda uma cepa que pertence a um terceiro complexo clonal, e onde o terceiro complexo clonal é selecionado do grupo consistindo em complexo clonal I, complexo clonal II e complexo clonal V.

[0161] 10. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an- teriores, onde pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal I, pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal II e/ou pelo menos uma das cepas pertence ao complexo clonal V.

[0162] 11. A composição, de acordo com o item 10, onde pelo me nos uma das cepas é a cepa com o número de depósito CNCM I-4720, pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4721 e/ou pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4722.

[0163] 12. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores compreendendo ainda um adjuvante, preferivelmente selecionado do grupo consistindo em sais de alumínio (preferivelmente hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio) e óleos minerais.

[0164] 13. A composição, de acordo com o item 12, onde o adju vante é um adjuvante oleoso, preferivelmente Montanide® IMS 251 C VG.

[0165] 14. A composição, de acordo com um ou mais dos itens an teriores para uso como uma vacina, preferivelmente contra disenteria suína, onde a disenteria suína é opcionalmente causada por Brachys- pira hyodysenteriae.

[0166] 15. A composição, de acordo com o item 14, onde a vacina é adequada para administração a suíno em uma região de interesse.

[0167] 16. A composição, de acordo com o item 15, onde a região de interesse é a Espanha.

[0168] 17. A composição, de acordo com um ou mais dos itens 14 a 16, onde a vacina é administrada através de administração parenteral, preferivelmente através de administração intramuscular.

[0169] 18. A composição, de acordo com um ou mais dos itens 14 a 17, onde os suínos são vacinados duas semanas após o desmame e, opcionalmente, revacinados duas semanas após a primeira vacinação.

[0170] 19. A composição, de acordo com um ou mais dos itens 15 a 18, onde o número total de bactérias por dose administrada a suíno é entre 108e 109 bactérias, preferivelmente 109 bactérias.

[0171] 20. Uma cepa bacteriana selecionada de cepas deposita das no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur com números de registro CNCM I-4720, CNCM I-4721 e CNCM I-4722.

Claims (13)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias de pelo menos três cepas geneticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, sendo que pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4720, pelo menos uma das cepas é a cepa com número de depósito CNCM I-4721 e pelo menos uma das cepas é a linha com número de depósito CNCM I-4722.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias são inativadas.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1ou 2, caracterizada pelo fato de que as bactérias estão presentes em uma concentração entre 108 e 109 de bactérias totais/mL.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante selecionado do grupo que consiste em sais de alumínio e óleos minerais

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante oleoso.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é para uso como vacina contra a disenteria suína, sendo que a disenteria suína é causada por Brachyspira hyodysenteriae.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que as cepas geneticamente diversas são detectadas em uma proporção de pelo menos 1% em relação ao total de cepas detectadas em uma região de interesse.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a região de interesse é a Espanha.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que a vacina é administrada por administração parentérica.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que os suínos são vacinados duas semanas após o desmame.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que os suínos são revacinados duas semanas após a primeira vacinação.

12. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de que o número total de bactérias por dose administrada aos suínos é entre 108 e 109 bactérias.

13. Cepa bacteriana, caracterizada pelo fato de que é depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Instituto Pasteur, com o número de registro CNCM I-4720.

Images