JP2003204785A - 成長促進剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 有効な成長促進剤の提供。
【解決手段】 濃縮された形態で乳生成物から抽出され
る複数の細胞成長促進因子であって、この因子の等電点
が塩基性乃至ほぼ中性であるものを含む乳生成物エキス
組成物。細胞培養組成物および前記の乳生成物エキスを
含んで成る薬学または獣医学組成物。これらの組成物の
調製法および使用法。
る複数の細胞成長促進因子であって、この因子の等電点
が塩基性乃至ほぼ中性であるものを含む乳生成物エキス
組成物。細胞培養組成物および前記の乳生成物エキスを
含んで成る薬学または獣医学組成物。これらの組成物の
調製法および使用法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞培養組成物中
の動物細胞の成長に関する。更に具体的には、本発明は
チーズホエーエキス（抽出物）組成物を含有する細胞培
養組成物を提供することに関する。動物細胞は培養中に
成長して、ヒトワクチン、リンフォカイン、ホルモン、
単クローン性抗体、他の薬学上活性を有するタンパク生
成物、獣医ホルモン、および研究、開発および診断用の
ような多数の薬学、診断用および獣医用生成物を提供す
る。
の動物細胞の成長に関する。更に具体的には、本発明は
チーズホエーエキス（抽出物）組成物を含有する細胞培
養組成物を提供することに関する。動物細胞は培養中に
成長して、ヒトワクチン、リンフォカイン、ホルモン、
単クローン性抗体、他の薬学上活性を有するタンパク生
成物、獣医ホルモン、および研究、開発および診断用の
ような多数の薬学、診断用および獣医用生成物を提供す
る。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞の成長には、塩、栄養物、脂質
前駆体、核酸前駆体、ビタミンおよびアミノ酸であっ
て、イン・ビボでこれらの細胞を普通に漬ける媒質を模
倣して配合したものを含む画定された等張媒質が必要で
ある。普通に用いられるものの例には、イーグル最少必
須培地、ダルベッコ改質イーグル最少必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）、培地１９９、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２
培地が挙げられる。しかしながら、このような培地では
動物細胞はほとんど成長せず、血清の補助添加剤が必要
である。ウシ胎児血清は、出生後の動物から得られる血
清よりも効果が高く且つ濃度が高くなると望ましくない
影響を及ぼすことがある免疫グロブリンを最少限の濃度
しか含まないので、頻繁に用いられる。
前駆体、核酸前駆体、ビタミンおよびアミノ酸であっ
て、イン・ビボでこれらの細胞を普通に漬ける媒質を模
倣して配合したものを含む画定された等張媒質が必要で
ある。普通に用いられるものの例には、イーグル最少必
須培地、ダルベッコ改質イーグル最少必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）、培地１９９、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２
培地が挙げられる。しかしながら、このような培地では
動物細胞はほとんど成長せず、血清の補助添加剤が必要
である。ウシ胎児血清は、出生後の動物から得られる血
清よりも効果が高く且つ濃度が高くなると望ましくない
影響を及ぼすことがある免疫グロブリンを最少限の濃度
しか含まないので、頻繁に用いられる。
【０００３】ウシ胎児血清の供給は、屠殺される妊娠雌
ウシの数によって限定されている。これには、望ましく
ないロット間変動もあり、毒素を含むことがある。特に
関心があることは、それを用いて組換えタンパク質およ
び他のヒト用の製剤を最終的に生産することであり、血
清はヒトに有害であり且つ所望な生成物を生成する精製
プロトコールによって運搬されることがあるウイルスを
含むこともあるからである。主としてこれらの理由によ
り、血清を純粋な成分に置換することに多くの努力が傾
注されてきた。このような成分の例は、成長因子、ホル
モンおよび細胞付着因子である。不運なことには、成長
させるそれぞれの細胞型の要件は異なっており、確立す
ることが困難である。ウシ胎児血清を含む媒質を用いて
得ることができるのと同等な成長特性または同等な細胞
生成物の収量を「無血清」媒質を用いて得ることが可能
であることが明らかにされていないこともしばしばであ
った。ウシ胎児血清の有用性が限定されていること、そ
のロット間に変動があり、したがってかなりの費用が掛
かること並びに前記の「無血清」媒質の欠陥があること
により、細胞培地における可能性の高い代替品として他
の生物学的流体の検討が盛んに行われた。幾らかの進展
は、Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ：「ヒト乳は培養された線
維芽細胞におけるＤＮＡ合成および細胞増殖を促進す
る」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，７５，５０５７，１９７８）；Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒ
ｕｎおよびＪ．Ｎｅｕｍａｎｎ：「牛初乳を補給した培
地におけるＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞の無血清成長」
（Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，１１，３４
９，１９７９）のような選択された報告によって明らか
にされているように牛乳および牛初乳を用いる先行技術
に報告されている。
ウシの数によって限定されている。これには、望ましく
ないロット間変動もあり、毒素を含むことがある。特に
関心があることは、それを用いて組換えタンパク質およ
び他のヒト用の製剤を最終的に生産することであり、血
清はヒトに有害であり且つ所望な生成物を生成する精製
プロトコールによって運搬されることがあるウイルスを
含むこともあるからである。主としてこれらの理由によ
り、血清を純粋な成分に置換することに多くの努力が傾
注されてきた。このような成分の例は、成長因子、ホル
モンおよび細胞付着因子である。不運なことには、成長
させるそれぞれの細胞型の要件は異なっており、確立す
ることが困難である。ウシ胎児血清を含む媒質を用いて
得ることができるのと同等な成長特性または同等な細胞
生成物の収量を「無血清」媒質を用いて得ることが可能
であることが明らかにされていないこともしばしばであ
った。ウシ胎児血清の有用性が限定されていること、そ
のロット間に変動があり、したがってかなりの費用が掛
かること並びに前記の「無血清」媒質の欠陥があること
により、細胞培地における可能性の高い代替品として他
の生物学的流体の検討が盛んに行われた。幾らかの進展
は、Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ：「ヒト乳は培養された線
維芽細胞におけるＤＮＡ合成および細胞増殖を促進す
る」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，７５，５０５７，１９７８）；Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒ
ｕｎおよびＪ．Ｎｅｕｍａｎｎ：「牛初乳を補給した培
地におけるＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞の無血清成長」
（Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，１１，３４
９，１９７９）のような選択された報告によって明らか
にされているように牛乳および牛初乳を用いる先行技術
に報告されている。
【０００４】先行技術には、「一つの態様で、乳または
初乳およびフィブロネクチンを含む細胞培地を特徴とす
る細胞成長を促進する組成物および方法：フィブロネク
チンは好ましくは培養基質にプレコートされる」ことを
記載しているＭ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎに対する米国特許
第４，４４０，８６０号明細書、およびＭｏｒｉｎａｇ
ａに対する日本国特許ＪＰ５９１６６８７９号明細書に
記載の「乳または乳成分を含む細胞インキュベーション
用の培地」も挙げられる。Ｇ．Ｌｉｎｄｅｎらに対する
欧州特許第８６４０１９１１．２号明細書「乳の画分、
これらの画分を得る方法およびこれらの画分を得る細胞
の培地」およびＯ．Ｄａｍｅｒｄｊｉら「培地における
ウシ胎児血清の代替品としてのホエー画分の利用」（Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．Ｔｅｃｈ．，２，２３５，１９８８）に
記載されているように、乳清の限外濾過物も培養細胞の
成長を支持するのに用いられてきた。このような進展に
も拘らず、ウシ胎児血清に対する良好な代替品は未だ捜
し当てられていない。
初乳およびフィブロネクチンを含む細胞培地を特徴とす
る細胞成長を促進する組成物および方法：フィブロネク
チンは好ましくは培養基質にプレコートされる」ことを
記載しているＭ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎに対する米国特許
第４，４４０，８６０号明細書、およびＭｏｒｉｎａｇ
ａに対する日本国特許ＪＰ５９１６６８７９号明細書に
記載の「乳または乳成分を含む細胞インキュベーション
用の培地」も挙げられる。Ｇ．Ｌｉｎｄｅｎらに対する
欧州特許第８６４０１９１１．２号明細書「乳の画分、
これらの画分を得る方法およびこれらの画分を得る細胞
の培地」およびＯ．Ｄａｍｅｒｄｊｉら「培地における
ウシ胎児血清の代替品としてのホエー画分の利用」（Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．Ｔｅｃｈ．，２，２３５，１９８８）に
記載されているように、乳清の限外濾過物も培養細胞の
成長を支持するのに用いられてきた。このような進展に
も拘らず、ウシ胎児血清に対する良好な代替品は未だ捜
し当てられていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、これらの先行技術に関する困難または欠陥の一
つ以上を克服しまたは少なくとも解消することである。
目的は、これらの先行技術に関する困難または欠陥の一
つ以上を克服しまたは少なくとも解消することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の第
一の態様では、乳生成物から抽出された複数の細胞成長
刺激因子を含む濃縮された形態での乳生成物エキス組成
物であって、前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点
を有するものが提供される。「乳生成物」という用語
は、ヒトまたは動物の乳生成物からのエキスであって、
その塩および／または主要なタンパク質成分を減少また
は除去したものを意味する。乳エキスの例には、チーズ
ホエーエキス、脱脂乳エキスおよび酸（カゼイン）ホエ
ーが挙げられる。
一の態様では、乳生成物から抽出された複数の細胞成長
刺激因子を含む濃縮された形態での乳生成物エキス組成
物であって、前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点
を有するものが提供される。「乳生成物」という用語
は、ヒトまたは動物の乳生成物からのエキスであって、
その塩および／または主要なタンパク質成分を減少また
は除去したものを意味する。乳エキスの例には、チーズ
ホエーエキス、脱脂乳エキスおよび酸（カゼイン）ホエ
ーが挙げられる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明を、好ましいチーズホエー
エキスに関して更に詳細に記載する。しかしながら、こ
れは単に例示のためのものであり、本発明の普遍性に対
する制限と考えるべきではない。好ましくは、乳生成物
エキス組成物は、チーズホエーエキス組成物である。こ
のチーズホエーエキス組成物は、チーズホエーであっ
て、その塩および／または主要なタンパク質成分を減少
または除去したものから生成させることができる。乳生
成物エキス組成物は、この組成物の総重量に対して約１
％（重量／重量）未満の塩を含むことができる。この乳
生成物エキスは、組成物の総重量に対して、約０．５％
（重量／重量）のカゼイン、α−ラクトアルブミン、β
−ラクトグロブリン、免疫グロブリンまたはアルブミン
を含むことができる。本発明のこの態様による乳生成物
エキス組成物は、下記のようにイン・ビトロで細胞成長
および増殖の促進に用いることができる。この乳生成物
エキス組成物は、下記のように哺乳類においてイン・ビ
ボで、表面の傷の修復を促進するのに用いることができ
る。
エキスに関して更に詳細に記載する。しかしながら、こ
れは単に例示のためのものであり、本発明の普遍性に対
する制限と考えるべきではない。好ましくは、乳生成物
エキス組成物は、チーズホエーエキス組成物である。こ
のチーズホエーエキス組成物は、チーズホエーであっ
て、その塩および／または主要なタンパク質成分を減少
または除去したものから生成させることができる。乳生
成物エキス組成物は、この組成物の総重量に対して約１
％（重量／重量）未満の塩を含むことができる。この乳
生成物エキスは、組成物の総重量に対して、約０．５％
（重量／重量）のカゼイン、α−ラクトアルブミン、β
−ラクトグロブリン、免疫グロブリンまたはアルブミン
を含むことができる。本発明のこの態様による乳生成物
エキス組成物は、下記のようにイン・ビトロで細胞成長
および増殖の促進に用いることができる。この乳生成物
エキス組成物は、下記のように哺乳類においてイン・ビ
ボで、表面の傷の修復を促進するのに用いることができ
る。
【０００８】意外なことには、乳生成物エキス組成物
は、ウシ胎児血清で達成されるよりも低いタンパク質濃
度で動物細胞の成長を支持し、しかも幾つかの細胞型に
ついてはウシ胎児血清に匹敵する効果を有することがで
きる。また、チーズホエーエキスは、低濃度のウシ胎児
血清を含む媒質に対する補充物として用い、培養細胞の
成長速度を一層良好にし且つウシ胎児血清の使用を少な
くすることができる。チーズホエーは、チーズの製造の
際に本質的に総ての脂肪およびカゼインを除去してしま
ったチーズ工業の副生成物である。当該技術の現状で
は、チーズホエーは本質的に無価値であり、これが汚染
物質となる可能性があるので実際に工業的に経費が嵩む
ことになることがある。例えばチーズホエーは、チーズ
製造からトンの量で得られる低タンパク質高塩生成物で
ある。チーズホエーに含まれる主要なタンパク質成分は
α−ラクトアルブミン（αＬＡ）およびβ−ラクトグロ
ブリン（βＬＧ）であり、これらは通常は含まれるタン
パク質の９０％を上回っている。かなりの量の血清アル
ブミン、免疫グロブリンおよび残渣カゼインも含まれる
ことがある。これらのタンパク質はいずれも、酸性の等
電点を有する。対照的に、動物細胞の成長を刺激する主
要なタンパク質因子は塩基性の等電点を有する。この例
には、成長因子である塩基性ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、デス
（１−３）ＩＧＦ−ＩおよびＰＤＧＦがある。別の状況
では豊富に存在する酸性タンパク質が実質的に存在しな
いチーズホエーのような乳生成物に含まれる塩基性因子
の抽出により、乳生成物エキス組成物の意外な効力を説
明することができると仮定される。
は、ウシ胎児血清で達成されるよりも低いタンパク質濃
度で動物細胞の成長を支持し、しかも幾つかの細胞型に
ついてはウシ胎児血清に匹敵する効果を有することがで
きる。また、チーズホエーエキスは、低濃度のウシ胎児
血清を含む媒質に対する補充物として用い、培養細胞の
成長速度を一層良好にし且つウシ胎児血清の使用を少な
くすることができる。チーズホエーは、チーズの製造の
際に本質的に総ての脂肪およびカゼインを除去してしま
ったチーズ工業の副生成物である。当該技術の現状で
は、チーズホエーは本質的に無価値であり、これが汚染
物質となる可能性があるので実際に工業的に経費が嵩む
ことになることがある。例えばチーズホエーは、チーズ
製造からトンの量で得られる低タンパク質高塩生成物で
ある。チーズホエーに含まれる主要なタンパク質成分は
α−ラクトアルブミン（αＬＡ）およびβ−ラクトグロ
ブリン（βＬＧ）であり、これらは通常は含まれるタン
パク質の９０％を上回っている。かなりの量の血清アル
ブミン、免疫グロブリンおよび残渣カゼインも含まれる
ことがある。これらのタンパク質はいずれも、酸性の等
電点を有する。対照的に、動物細胞の成長を刺激する主
要なタンパク質因子は塩基性の等電点を有する。この例
には、成長因子である塩基性ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、デス
（１−３）ＩＧＦ−ＩおよびＰＤＧＦがある。別の状況
では豊富に存在する酸性タンパク質が実質的に存在しな
いチーズホエーのような乳生成物に含まれる塩基性因子
の抽出により、乳生成物エキス組成物の意外な効力を説
明することができると仮定される。
【０００９】したがって、本発明のもう一つの態様で
は、濃縮された形態で乳生成物から抽出された複数の細
胞成長刺激因子を含む乳生成物エキス組成物であって、
前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点を有するもの
を調製する方法であって、乳生成物の源、陽イオン交換
樹脂、および緩衝溶液を供給し、乳生成物を陽イオン交
換樹脂と接触させて、乳生成物の塩基性の高い成分が樹
脂上に吸収されるようにし、陽イオン交換樹脂を緩衝溶
液で溶出し、溶出液を濾過して、そこから塩を除去する
ことを含む方法が提供される。イオン交換樹脂から塩基
性タンパク質を脱着することにより、細胞成長刺激因子
に富む調製物が得られる。溶出液は、任意の好適な手法
を用いて濃縮し、濾過することができる。溶出液は、例
えば通常の限外濾過法または他の手順によって濃縮し
て、ＤＭＥＭのような無タンパク質媒質に加えるとき動
物細胞の成長を支持するタンパク質の混合物を生成させ
ることができる。
は、濃縮された形態で乳生成物から抽出された複数の細
胞成長刺激因子を含む乳生成物エキス組成物であって、
前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点を有するもの
を調製する方法であって、乳生成物の源、陽イオン交換
樹脂、および緩衝溶液を供給し、乳生成物を陽イオン交
換樹脂と接触させて、乳生成物の塩基性の高い成分が樹
脂上に吸収されるようにし、陽イオン交換樹脂を緩衝溶
液で溶出し、溶出液を濾過して、そこから塩を除去する
ことを含む方法が提供される。イオン交換樹脂から塩基
性タンパク質を脱着することにより、細胞成長刺激因子
に富む調製物が得られる。溶出液は、任意の好適な手法
を用いて濃縮し、濾過することができる。溶出液は、例
えば通常の限外濾過法または他の手順によって濃縮し
て、ＤＭＥＭのような無タンパク質媒質に加えるとき動
物細胞の成長を支持するタンパク質の混合物を生成させ
ることができる。
【００１０】乳生成物の源は、不溶性物質を実質的に含
まない乳生成物濾液であってもよい。したがって、この
調製法は、乳生成物を濾過して、不溶性物質を除去する
予備段階を含むことができる。乳生成物は、好適な篩を
通して濾過することができる。乳生成物は、画定された
細孔度を有する中空のファイバーカートリッジを通して
濾過することができる。陽イオン交換樹脂は任意の好適
なタイプのものでよい。セファロースを基剤とする陽イ
オン交換ゲルを用いることができる。接触段階は、中性
乃至塩基性ｐＨで行うことができる。接触段階は、約
６．５〜８．０のｐＨで行うことができる。カチオン交
換樹脂は、約６．５〜８．０のｐＨの好適な緩衝液で平
衡にすることができる。水性クエン酸ナトリウム緩衝液
を用いることができる。溶出段階は、好適な溶離液を用
いて行うことができる。塩溶液を用いることができる。
緩衝した食塩溶液を用いることができる。
まない乳生成物濾液であってもよい。したがって、この
調製法は、乳生成物を濾過して、不溶性物質を除去する
予備段階を含むことができる。乳生成物は、好適な篩を
通して濾過することができる。乳生成物は、画定された
細孔度を有する中空のファイバーカートリッジを通して
濾過することができる。陽イオン交換樹脂は任意の好適
なタイプのものでよい。セファロースを基剤とする陽イ
オン交換ゲルを用いることができる。接触段階は、中性
乃至塩基性ｐＨで行うことができる。接触段階は、約
６．５〜８．０のｐＨで行うことができる。カチオン交
換樹脂は、約６．５〜８．０のｐＨの好適な緩衝液で平
衡にすることができる。水性クエン酸ナトリウム緩衝液
を用いることができる。溶出段階は、好適な溶離液を用
いて行うことができる。塩溶液を用いることができる。
緩衝した食塩溶液を用いることができる。
【００１１】したがって、本発明のこの態様の好ましい
形態では、乳生成物エキス組成物の調製法は、順次乳生
成物に濾過段階を施して、そこから不溶性物質を除去
し、濾液のｐＨを調整して、約６．５〜８．０とし、濾
液を陽イオン交換樹脂と接触させ、高イオン強度で高ｐ
Ｈの陽イオン交換樹脂から好適な緩衝溶液で溶出し、溶
出液に濃縮段階および透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）段階を施して、溶出液から塩を除去することに
よる乳生成物の処理を含むことができる。或いは、陽イ
オン交換樹脂からの溶出は、高イオン強度で、ｐＨを調
整することなしに、細胞成長刺激因子が回収されるよう
に行われる。この態様では、細胞成長刺激因子は余り異
質性の高くないタンパク質と共に溶出される。
形態では、乳生成物エキス組成物の調製法は、順次乳生
成物に濾過段階を施して、そこから不溶性物質を除去
し、濾液のｐＨを調整して、約６．５〜８．０とし、濾
液を陽イオン交換樹脂と接触させ、高イオン強度で高ｐ
Ｈの陽イオン交換樹脂から好適な緩衝溶液で溶出し、溶
出液に濃縮段階および透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）段階を施して、溶出液から塩を除去することに
よる乳生成物の処理を含むことができる。或いは、陽イ
オン交換樹脂からの溶出は、高イオン強度で、ｐＨを調
整することなしに、細胞成長刺激因子が回収されるよう
に行われる。この態様では、細胞成長刺激因子は余り異
質性の高くないタンパク質と共に溶出される。
【００１２】チーズホエーから好適なエキスを単離する
もう一つの態様では、溶離剤を高温で処理し、遠心分離
することができる。この改質により追加のタンパク質は
除去される。したがって、本発明の方法は、溶離剤に熱
処理を施して、異種タンパク質の含量を少なくする段階
も含むことができる。乳生成物エキス組成物は、殺菌を
行い、所望により凍結乾燥して保存することができる。
凍結乾燥した物質を殺菌した食塩水に溶解して、培養し
ている細胞に添加することができる。
もう一つの態様では、溶離剤を高温で処理し、遠心分離
することができる。この改質により追加のタンパク質は
除去される。したがって、本発明の方法は、溶離剤に熱
処理を施して、異種タンパク質の含量を少なくする段階
も含むことができる。乳生成物エキス組成物は、殺菌を
行い、所望により凍結乾燥して保存することができる。
凍結乾燥した物質を殺菌した食塩水に溶解して、培養し
ている細胞に添加することができる。
【００１３】本発明のもう一つの態様では、濃縮された
形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長刺激因子
であって、前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点を
有するものと、培地とを含む乳生成物エキス組成物の有
効量を含む細胞培養組成物が提供される。培地は、実質
的に無タンパク質の等張培地でよい。実質的に無タンパ
ク質の等張培地は、ダルベッコ改質イーグル最少必須培
地（ＤＭＥＭ）でよい。５％ウシ胎児血清を用いて得ら
れるのとほぼ同等なヒト皮膚線維芽細胞の成長速度は、
媒質１００μｌに対して本発明の好ましい態様によるチ
ーズホエーから抽出した細胞成長刺激因子約２０μｇを
用いて達成されることを見出した。また、少量であるが
有効量のウシ胎児血清を培地として用いることもでき
る。約２％のウシ胎児血清を含む媒質１００μｌに対し
て細胞成長刺激因子約２５μｇを添加すると、Ｂａｌｂ
Ｃ／３Ｔ３細胞の成長速度がこれを行わない場合には１
０％ウシ胎児血清を用いて達成される速度まで増加する
ことを見出した。細胞の型によっては、成長因子、付着
因子または少量の血清のような他の添加物を媒質に加え
ることもできる。
形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長刺激因子
であって、前記の因子が塩基性乃至ほぼ中性の等電点を
有するものと、培地とを含む乳生成物エキス組成物の有
効量を含む細胞培養組成物が提供される。培地は、実質
的に無タンパク質の等張培地でよい。実質的に無タンパ
ク質の等張培地は、ダルベッコ改質イーグル最少必須培
地（ＤＭＥＭ）でよい。５％ウシ胎児血清を用いて得ら
れるのとほぼ同等なヒト皮膚線維芽細胞の成長速度は、
媒質１００μｌに対して本発明の好ましい態様によるチ
ーズホエーから抽出した細胞成長刺激因子約２０μｇを
用いて達成されることを見出した。また、少量であるが
有効量のウシ胎児血清を培地として用いることもでき
る。約２％のウシ胎児血清を含む媒質１００μｌに対し
て細胞成長刺激因子約２５μｇを添加すると、Ｂａｌｂ
Ｃ／３Ｔ３細胞の成長速度がこれを行わない場合には１
０％ウシ胎児血清を用いて達成される速度まで増加する
ことを見出した。細胞の型によっては、成長因子、付着
因子または少量の血清のような他の添加物を媒質に加え
ることもできる。
【００１４】好ましい形態では、本発明は前記のような
細胞培養組成物であって、乳生成物エキスが媒質中に約
１０〜２０，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜
２，０００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で含まれるもの
を提供する。したがって、本発明の更にもう一つの態様
では、細胞の培養法であって、動物細胞の源と、濃縮さ
れた形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長刺激
因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性
であるものと、実質的にタンパク質を含まない等張培地
とを含む乳生成物エキス組成物の有効量を含んで成る細
胞培養組成物を提供し、これらの細胞を細胞培養組成物
中で十分な時間、所定の細胞濃度を得るのに十分な温度
で培養することを含む方法が提供される。
細胞培養組成物であって、乳生成物エキスが媒質中に約
１０〜２０，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜
２，０００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で含まれるもの
を提供する。したがって、本発明の更にもう一つの態様
では、細胞の培養法であって、動物細胞の源と、濃縮さ
れた形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長刺激
因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性
であるものと、実質的にタンパク質を含まない等張培地
とを含む乳生成物エキス組成物の有効量を含んで成る細
胞培養組成物を提供し、これらの細胞を細胞培養組成物
中で十分な時間、所定の細胞濃度を得るのに十分な温度
で培養することを含む方法が提供される。
【００１５】この細胞培養法は、周囲温度以上で行うこ
とができる。約３５〜４０℃の範囲の温度を用いること
ができる。細胞培養法は、インキュベーター、例えば加
湿インキュベーターで行うことができる。細胞培養法
は、任意の好適な表面上または懸濁状態で行うことがで
きる。組織培養プレートを用いることができる。この細
胞培養法は、所望な細胞濃度によって約１〜５日間継続
することができる。この方法は、特にイン・ビトロの動
物細胞の成長に適用されるが、表面に傷を有するヒトの
ような動物に適用することもできる。したがって、もう
一つの態様では、本発明は、表面の傷を治療するための
薬学または獣医学組成物であって、濃縮された形態で乳
生成物から抽出される複数の細胞成長促進因子であっ
て、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性であるもの
を含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学または獣
医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまたは賦形剤
とを含んで成る組成物を提供する。
とができる。約３５〜４０℃の範囲の温度を用いること
ができる。細胞培養法は、インキュベーター、例えば加
湿インキュベーターで行うことができる。細胞培養法
は、任意の好適な表面上または懸濁状態で行うことがで
きる。組織培養プレートを用いることができる。この細
胞培養法は、所望な細胞濃度によって約１〜５日間継続
することができる。この方法は、特にイン・ビトロの動
物細胞の成長に適用されるが、表面に傷を有するヒトの
ような動物に適用することもできる。したがって、もう
一つの態様では、本発明は、表面の傷を治療するための
薬学または獣医学組成物であって、濃縮された形態で乳
生成物から抽出される複数の細胞成長促進因子であっ
て、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性であるもの
を含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学または獣
医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまたは賦形剤
とを含んで成る組成物を提供する。
【００１６】薬学または獣医学組成物は、少なくとも１
種類の活性成分の有効量を含むこともできる。少なくと
も１種類の活性成分は、抗生物質、殺菌剤、他の成長促
進剤、麻酔薬等、およびそれらの混合物から選択するこ
とができる。薬学または獣医学組成物は、任意の好適な
方法で服用に適合させることができる。この組成物は、
内服用または局所投与に適合させることができる。この
組成物は、経口、注射または局所用形態にすることがで
きる。この組成物は、洗浄液、ローション、クリーム、
軟膏またはゲルの形態を採ることができる。治療を行う
ことができる表面の傷のタイプには制限がなく、火傷、
潰瘍、裂傷および貫入傷が挙げられるが、これらに限定
されない。したがって、本発明のもう一つの態様では、
ヒトを含む動物の表面の傷の治療法であって、治療を受
ける患者に薬学または獣医学組成物であって、濃縮され
た形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長促進因
子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性で
あるものを含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学
または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまた
は賦形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与すること
を含む方法が提供される。
種類の活性成分の有効量を含むこともできる。少なくと
も１種類の活性成分は、抗生物質、殺菌剤、他の成長促
進剤、麻酔薬等、およびそれらの混合物から選択するこ
とができる。薬学または獣医学組成物は、任意の好適な
方法で服用に適合させることができる。この組成物は、
内服用または局所投与に適合させることができる。この
組成物は、経口、注射または局所用形態にすることがで
きる。この組成物は、洗浄液、ローション、クリーム、
軟膏またはゲルの形態を採ることができる。治療を行う
ことができる表面の傷のタイプには制限がなく、火傷、
潰瘍、裂傷および貫入傷が挙げられるが、これらに限定
されない。したがって、本発明のもう一つの態様では、
ヒトを含む動物の表面の傷の治療法であって、治療を受
ける患者に薬学または獣医学組成物であって、濃縮され
た形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成長促進因
子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性で
あるものを含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学
または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまた
は賦形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与すること
を含む方法が提供される。
【００１７】この方法は、胃腸に損傷、疾患または潰瘍
を有するヒトを含む動物に適用することもできる。した
がって、もう一つの態様では、本発明は、胃腸の損傷、
疾患または潰瘍の治療用の薬学または獣医学組成物であ
って、濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の
細胞成長促進因子であって、この因子の等電点が塩基性
乃至ほぼ中性であるものを含む乳生成物エキス組成物の
有効量と、薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、
キャリヤーまたは賦形剤とを含んで成る組成物を提供す
る。治療を受けることができる胃腸の損傷、疾患または
潰瘍の種類には制限はない。したがって、本発明の更に
もう一つの態様では、胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治
療法であって、治療を受ける患者に、薬学または獣医学
組成物であって、濃縮された形態で乳生成物から抽出さ
れ、等電点が塩基性またはほぼ中性である細胞成長促進
因子を含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学また
は獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまたは賦
形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与することを含
む方法が提供される。
を有するヒトを含む動物に適用することもできる。した
がって、もう一つの態様では、本発明は、胃腸の損傷、
疾患または潰瘍の治療用の薬学または獣医学組成物であ
って、濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の
細胞成長促進因子であって、この因子の等電点が塩基性
乃至ほぼ中性であるものを含む乳生成物エキス組成物の
有効量と、薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、
キャリヤーまたは賦形剤とを含んで成る組成物を提供す
る。治療を受けることができる胃腸の損傷、疾患または
潰瘍の種類には制限はない。したがって、本発明の更に
もう一つの態様では、胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治
療法であって、治療を受ける患者に、薬学または獣医学
組成物であって、濃縮された形態で乳生成物から抽出さ
れ、等電点が塩基性またはほぼ中性である細胞成長促進
因子を含む乳生成物エキス組成物の有効量と、薬学また
は獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤーまたは賦
形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与することを含
む方法が提供される。
【００１８】
【実施例】本発明を、下記の例に関して更に詳細に説明
する。しかしながら、下記の記載は単に例示のためのも
のであり、決して前記の発明の普遍性に対する限定と考
えるべきではない。
する。しかしながら、下記の記載は単に例示のためのも
のであり、決して前記の発明の普遍性に対する限定と考
えるべきではない。
【００１９】例１ 成長促進活性に富むチーズホエー（ＧＦＥ）からの画分
の調製 チーズ製造の最終生成物として得られる滅菌ホエーを１
０ミクロンのスクリーンおよび０．２ミクロンザルトリ
ウス・ミクロザート・ザルトコン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
Ｍｉｃｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎ）ＩＩモジュ
ールを通して濾過して、固形分を除去した。限外濾過液
をｐＨ６．５に調整して、５０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ６．５で平衡にしたＳ−セファロース・フ
ァスト・フロー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ）Ｓ陽イオン交換樹脂（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ））のカラムに適用した。カラムを同じ緩
衝液で洗浄した後、吸収された物質を０．２５ＭＮＨ4
ＯＨを含む１ＭＮａＣｌの溶液で溶出した。この溶出液
を伝導率が０μｓになるまで水に対して透析濾過（ｄｉ
ａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した後、限外濾過によって濃縮し
た。両工程は３ＫＤａ排除メンブランを用いて行った。
生成物を凍結乾燥して、「ＧＦＥ」生成物を得た。１８
ｇのタンパク質を含むチーズホエー３０リットルからの
調製物で、２．６６ｇのタンパク質を含むＧＦＥエキス
を得た。
の調製 チーズ製造の最終生成物として得られる滅菌ホエーを１
０ミクロンのスクリーンおよび０．２ミクロンザルトリ
ウス・ミクロザート・ザルトコン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
Ｍｉｃｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎ）ＩＩモジュ
ールを通して濾過して、固形分を除去した。限外濾過液
をｐＨ６．５に調整して、５０ｍＭクエン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ６．５で平衡にしたＳ−セファロース・フ
ァスト・フロー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ）Ｓ陽イオン交換樹脂（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ））のカラムに適用した。カラムを同じ緩
衝液で洗浄した後、吸収された物質を０．２５ＭＮＨ4
ＯＨを含む１ＭＮａＣｌの溶液で溶出した。この溶出液
を伝導率が０μｓになるまで水に対して透析濾過（ｄｉ
ａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した後、限外濾過によって濃縮し
た。両工程は３ＫＤａ排除メンブランを用いて行った。
生成物を凍結乾燥して、「ＧＦＥ」生成物を得た。１８
ｇのタンパク質を含むチーズホエー３０リットルからの
調製物で、２．６６ｇのタンパク質を含むＧＦＥエキス
を得た。
【００２０】例２ 成長促進活性に富み、ラクトフェリンを含む異種タンパ
ク質の枯渇したチーズホエーからの画分の調製（ＧＦＥ
−２） 滅菌したホエーを濾過し、Ｓ−セファロースのカラムに
適用し、カラムを例１と同様に洗浄した。溶出は、１０
ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５に０．４ＭＮａＣｌ
を加えた溶液で行った。このＧＦＥ−２を、例１に記載
したのと同様に、水に対して透析濾過し、濃縮して、凍
結乾燥した。１８ｇのタンパク質を含むチーズホエー３
０リットルからの調製物で、０．５６ｇのタンパク質を
含むＧＦＥ−２エキスを得た。
ク質の枯渇したチーズホエーからの画分の調製（ＧＦＥ
−２） 滅菌したホエーを濾過し、Ｓ−セファロースのカラムに
適用し、カラムを例１と同様に洗浄した。溶出は、１０
ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５に０．４ＭＮａＣｌ
を加えた溶液で行った。このＧＦＥ−２を、例１に記載
したのと同様に、水に対して透析濾過し、濃縮して、凍
結乾燥した。１８ｇのタンパク質を含むチーズホエー３
０リットルからの調製物で、０．５６ｇのタンパク質を
含むＧＦＥ−２エキスを得た。
【００２１】例３ ラクトペルオキシダーゼを含む異種タンパク質も枯渇し
た改質ＧＦＥ−２画分の調製（ＧＦＥ−３） 凍結乾燥したＧＦＥ−２（例２）を２５ｍｇ／ｍｌの濃
度で溶解し、８０℃で２．５時間加熱した。加熱した試
料を素早く冷却して、遠心分離した。透明な上澄液を、
使用前に０．２２μｍフィルターを通した。この溶液に
は、ＧＦＥ−２に含まれるタンパク質の５０％および約
１０％のラクトペルオキシダーゼを含んでいた。
た改質ＧＦＥ−２画分の調製（ＧＦＥ−３） 凍結乾燥したＧＦＥ−２（例２）を２５ｍｇ／ｍｌの濃
度で溶解し、８０℃で２．５時間加熱した。加熱した試
料を素早く冷却して、遠心分離した。透明な上澄液を、
使用前に０．２２μｍフィルターを通した。この溶液に
は、ＧＦＥ−２に含まれるタンパク質の５０％および約
１０％のラクトペルオキシダーゼを含んでいた。
【００２２】例４ ウシ胎児血清と比較したチーズホエーエキス（例１、
２）による培養細胞の成長の促進 培地に添加する前に、凍結乾燥した粉末（ＧＦＥ、ＧＦ
Ｅ−２）を最初にダルベッコのリン酸緩衝食塩水に懸濁
し、０．２２μｍフィルターを通過させて滅菌した。こ
の例では、細胞ラインＬ６（ラット筋原細胞）、Ｂａｌ
ｂＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）およびＳＦ１９７２
（ヒト二倍体皮膚線維芽細胞）を用いる。それぞれの細
胞ラインを９６穴組織培養プレート上、５％ウシ胎児血
清を含むダルベッコ改質イーグル最少必須培地中でサブ
カルチャーを行い、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュ
ベーター中で一晩放置して、細胞を確実に付着させた。
無菌技法を一貫して用いた。プレートをＤＭＥＭで十分
に洗浄して、残っている血清を除去し、ホエーエキス
（ＧＦＥまたはＧＦＥ−２）またはウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を所定の濃度で加えた。それぞれのウェルにおける
総容積は、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％湿度で０．
１ｍｌであった。更に２日後に、プレートを洗浄して、
固定し、自動メチレンブルー法（Ｍ．Ｈ．Ｏｌｉｖｅｒ
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，９２，５１３，１９８
９）を用いて細胞数を計数した。成長は、５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥＭ中で細胞を成長させることによって
生じる吸光度の増加に関する吸光度単位の増加率として
表わす（図１）。この例では、総ての３種類の細胞ライ
ンにおいて、ＧＦＥおよびＧＦＥ−２はウシ胎児血清と
同様に成長を刺激する。更に、ＢａｌｂＣ／３Ｔ３及び
ＳＦ１９７２細胞では、ＧＦＥ−２の活性はウシ胎児血
清としてのタンパク質含量の約１０分の１である。
２）による培養細胞の成長の促進 培地に添加する前に、凍結乾燥した粉末（ＧＦＥ、ＧＦ
Ｅ−２）を最初にダルベッコのリン酸緩衝食塩水に懸濁
し、０．２２μｍフィルターを通過させて滅菌した。こ
の例では、細胞ラインＬ６（ラット筋原細胞）、Ｂａｌ
ｂＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）およびＳＦ１９７２
（ヒト二倍体皮膚線維芽細胞）を用いる。それぞれの細
胞ラインを９６穴組織培養プレート上、５％ウシ胎児血
清を含むダルベッコ改質イーグル最少必須培地中でサブ
カルチャーを行い、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュ
ベーター中で一晩放置して、細胞を確実に付着させた。
無菌技法を一貫して用いた。プレートをＤＭＥＭで十分
に洗浄して、残っている血清を除去し、ホエーエキス
（ＧＦＥまたはＧＦＥ−２）またはウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を所定の濃度で加えた。それぞれのウェルにおける
総容積は、３７℃、５％ＣＯ２及び１００％湿度で０．
１ｍｌであった。更に２日後に、プレートを洗浄して、
固定し、自動メチレンブルー法（Ｍ．Ｈ．Ｏｌｉｖｅｒ
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，９２，５１３，１９８
９）を用いて細胞数を計数した。成長は、５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥＭ中で細胞を成長させることによって
生じる吸光度の増加に関する吸光度単位の増加率として
表わす（図１）。この例では、総ての３種類の細胞ライ
ンにおいて、ＧＦＥおよびＧＦＥ−２はウシ胎児血清と
同様に成長を刺激する。更に、ＢａｌｂＣ／３Ｔ３及び
ＳＦ１９７２細胞では、ＧＦＥ−２の活性はウシ胎児血
清としてのタンパク質含量の約１０分の１である。
【００２３】例５ ＧＦＥ−２（例２）と比較してラクトペルオキシダーゼ
を含む異種タンパク質が枯渇したチーズホエーのエキス
（ＧＦＥ−３、例３）による培養細胞の成長の刺激 データーを、５％ウシ胎児血清で得られるのと同じ成長
応答が得られるタンパク質含量（μｇ／１００μｌウェ
ル）として表わしたこと以外は、実験の詳細は全く例４
に記載した通りであった（表１参照）。 表１ ＧＦＥ−２またはＧＦＥ−３の存在下での細胞の成長 ―――――――――――――――――――――――――― 細胞の種類 エキス ５％ウシ胎児血清と同等 な成長を達成する濃度 （μｇ／１００μｌ） ―――――――――――――――――――――――――― L6 GFE-2 100 GFE-3 63 Balb C/3T3 GFE-2 15 GFE-3 6 SF1972 GFE-2 8 GFE-3 4 ―――――――――――――――――――――――――― 成長を刺激するのに要するＧＦＥ−３は、ＧＦＥ−２よ
り明らかに少ない。また、５％ウシ胎児血清のタンパク
質含量は２５０μｇ／１００μｌであるので、ＧＦＥ−
２およびＧＦＥ−３はいずれも、特にＢａｌｂＣ／３Ｔ
３細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＳＦ１９７２）に対
しては５％ウシ胎児血清よりも実質的に効果が高い。
を含む異種タンパク質が枯渇したチーズホエーのエキス
（ＧＦＥ−３、例３）による培養細胞の成長の刺激 データーを、５％ウシ胎児血清で得られるのと同じ成長
応答が得られるタンパク質含量（μｇ／１００μｌウェ
ル）として表わしたこと以外は、実験の詳細は全く例４
に記載した通りであった（表１参照）。 表１ ＧＦＥ−２またはＧＦＥ−３の存在下での細胞の成長 ―――――――――――――――――――――――――― 細胞の種類 エキス ５％ウシ胎児血清と同等 な成長を達成する濃度 （μｇ／１００μｌ） ―――――――――――――――――――――――――― L6 GFE-2 100 GFE-3 63 Balb C/3T3 GFE-2 15 GFE-3 6 SF1972 GFE-2 8 GFE-3 4 ―――――――――――――――――――――――――― 成長を刺激するのに要するＧＦＥ−３は、ＧＦＥ−２よ
り明らかに少ない。また、５％ウシ胎児血清のタンパク
質含量は２５０μｇ／１００μｌであるので、ＧＦＥ−
２およびＧＦＥ−３はいずれも、特にＢａｌｂＣ／３Ｔ
３細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＳＦ１９７２）に対
しては５％ウシ胎児血清よりも実質的に効果が高い。
【００２４】例６ ２％ウシ胎児血清を含む媒質にＧＦＥ−２エキス（例
２）を補足することによって生じる培養細胞の成長効果 ヒト皮膚線維芽細胞ライン（ＳＦ１９７２）の代わりに
ヒト肺線維芽細胞ライン（ＨＥＬ）を用いたこと以外
は、実験の詳細は全く例４に記載した通りであった。デ
ーターは、２日間細胞の成長を行った後得られる吸光度
として表わす（表２参照）。 表２ ２％ウシ胎児血清の存在下で添加したＧＦＥ−２による細胞の成長 ――――――――――――――――――――――――――――――― 吸光度の増加 ウシ胎児 GFE-2 L6細胞 Balb C/3T3 HEL細胞 血清 (%) ( μg/100 μl) 細胞 ――――――――――――――――――――――――――――――― 2 0 0.618 0.126 65 5 0 0.998 0.270 10 10 0 1.309 0.502 0.345 2 5 1.010 0.294 0.322 2 25 1.108 0.585 0.388 2 50 1.157 0.698 0.389 2 100 1.370 0.799 0.374 ――――――――――――――――――――――――――――――― この実験は、２％ウシ胎児血清のみを含む媒質に添加し
た少量のＧＦＥ−２が、成長速度を１０％ウシ胎児血清
で達成することができる速度まで増加することができる
ことを示している。この成長の増進を達成するのに要す
るＧＦＥ−２のおおよその量は、Ｌ６細胞では１００μ
ｇ／１００μｌ、ＢａｌｂＣ／３Ｔ３細胞では２５μｇ
／１００μｌであり、ＨＥＬ細胞では５μｇ／１００μ
ｌに過ぎなかった。このような増進により、ウシ胎児血
清をかなりの量節約することができる。
２）を補足することによって生じる培養細胞の成長効果 ヒト皮膚線維芽細胞ライン（ＳＦ１９７２）の代わりに
ヒト肺線維芽細胞ライン（ＨＥＬ）を用いたこと以外
は、実験の詳細は全く例４に記載した通りであった。デ
ーターは、２日間細胞の成長を行った後得られる吸光度
として表わす（表２参照）。 表２ ２％ウシ胎児血清の存在下で添加したＧＦＥ−２による細胞の成長 ――――――――――――――――――――――――――――――― 吸光度の増加 ウシ胎児 GFE-2 L6細胞 Balb C/3T3 HEL細胞 血清 (%) ( μg/100 μl) 細胞 ――――――――――――――――――――――――――――――― 2 0 0.618 0.126 65 5 0 0.998 0.270 10 10 0 1.309 0.502 0.345 2 5 1.010 0.294 0.322 2 25 1.108 0.585 0.388 2 50 1.157 0.698 0.389 2 100 1.370 0.799 0.374 ――――――――――――――――――――――――――――――― この実験は、２％ウシ胎児血清のみを含む媒質に添加し
た少量のＧＦＥ−２が、成長速度を１０％ウシ胎児血清
で達成することができる速度まで増加することができる
ことを示している。この成長の増進を達成するのに要す
るＧＦＥ−２のおおよその量は、Ｌ６細胞では１００μ
ｇ／１００μｌ、ＢａｌｂＣ／３Ｔ３細胞では２５μｇ
／１００μｌであり、ＨＥＬ細胞では５μｇ／１００μ
ｌに過ぎなかった。このような増進により、ウシ胎児血
清をかなりの量節約することができる。
【００２５】最後に、各種の他の改質および／または変
更を、本明細書に記載した本発明の精神から離反するこ
となく、行うことができることを理解すべきである。
更を、本明細書に記載した本発明の精神から離反するこ
となく、行うことができることを理解すべきである。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、乳生成物からウシ胎児血
清の代替品となるような成長促進剤が提供された。また
表面の傷を治療するための薬学又は獣医学組成物も提供
された。
清の代替品となるような成長促進剤が提供された。また
表面の傷を治療するための薬学又は獣医学組成物も提供
された。
【図１】５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で細胞を成
長させることによって生じる吸光度の増加に関する吸光
度単位の増加率。
長させることによって生じる吸光度の増加に関する吸光
度単位の増加率。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月２７日（２００２．１２．
２７）
２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
Ｃ１２Ｎ 1/00 Ａ６１Ｋ 37/24
(72)発明者 フランシス，ジョフレイ，レオナード
オーストラリア国5076 サウス オースト
ラリア，アセルストン，ジョイリーン コ
ート ９
(72)発明者 レジスター，ジョフレイ，オーウェン
オーストラリア国5081 サウス オースト
ラリア，コリンズウッド，キャシー スト
リート ２，ユニット ５
Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB24 BB25 BB34
4C084 AA02 AA07 AA19 BA44 CA38
DB52 MA02 NA14 ZA661
ZA662 ZA681 ZA682 ZA891
ZA892 ZC611 ZC612
4C087 BB39 MA02 NA14 ZA66 ZA68
ZA89 ZC61
Claims (22)
- 【請求項１】 濃縮された形態で、乳生成物から抽出さ
れる複数の細胞成長刺激因子を含む乳生成物エキス組成
物であって、前記の因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性
である、組成物。 - 【請求項２】 乳生成物エキス組成物が、組成物の総重
量に対して約０．５％（重量／重量）未満のカゼイン、
アルファラクトアルブミン、ベーターラクトグロブリ
ン、免疫グロブリンまたはアルブミンを含む、請求項１
に記載の組成物。 - 【請求項３】 乳生成物の残りの異種タンパク質含量が
更に減少した、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 乳生成物エキス組成物がチーズホエーエ
キス組成物である、請求項３に記載の組成物。 - 【請求項５】 濃縮された形態で、乳生成物から抽出さ
れた複数の細胞成長刺激因子を含む乳生成物エキス組成
物であって、前記の因子の等電点が塩基性乃至ほぼ中性
であるものを調製する方法であって、 乳生成物の源、 陽イオン交換樹脂、および緩衝溶液を供給し、 乳生成物を陽イオン交換樹脂と接触させて、乳生成物の
塩基性の高い成分が樹脂上に吸収されるようにし、 陽イオン交換樹脂を緩衝溶液で溶出し、 溶出液を濾過して、溶出液から塩を除去することを特徴
とする方法。 - 【請求項６】 乳生成物に濾過段階を施して、乳生成物
から不溶性物質を除去し、 濾液のｐＨを調整して、約６．５〜８．０に調整し、 濾液を陽イオン交換樹脂と接触させ、 高イオン強度で高ｐＨの陽イオン交換樹脂から好適な緩
衝溶液で溶出し、 溶出液に濃縮段階および透析濾過段階を施して、溶出液
から塩を除去することにより順次乳生成物を処理するこ
とも含む、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 溶出段階をｐＨを調整することなく行
い、細胞成長刺激因子を回収する、請求項６に記載の方
法。 - 【請求項８】 溶離剤に熱処理を施して、異種タンパク
質を減少させることも含む、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 濃縮された形態で乳生成物から抽出され
る複数の細胞成長刺激因子であって、前記の因子の等電
点が塩基性乃至ほぼ中性であるものと、 培地とを含んで成る乳生成物エキス組成物の有効量を含
む細胞組成物。 - 【請求項１０】 培地が実質的に無タンパク質培地であ
る、請求項９に記載の細胞組成物。 - 【請求項１１】 培地がウシ胎児血清を含む、請求項９
に記載の細胞組成物。 - 【請求項１２】 乳生成物の異種タンパク質含量を更に
減少させる、請求項１０に記載の細胞培養組成物。 - 【請求項１３】 乳生成物エキス組成物が培地１ml当た
り約１０〜２０，０００のタンパク質濃度で存在する、
請求項１２に記載の細胞培養組成物。 - 【請求項１４】 細胞の培養法であって、 動物細胞の源と、 濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成
長刺激因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほ
ぼ中性であるものと、 実質的にタンパク質を含まない等張培地とを含む乳生成
物エキス組成物の有効量を含んで成る細胞培養組成物を
提供し、 これらの細胞を細胞培養組成物中で十分な時間、所定の
細胞濃度を得るのに十分な温度で培養することを含む方
法。 - 【請求項１５】 細胞を約３５℃〜４０℃の範囲の温度
で約１〜５日間培養する、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 表面の傷を治療するための薬学または
獣医学組成物であって、 濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成
長促進因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほ
ぼ中性であるものを含む乳生成物エキス組成物の有効量
と、 薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤー
または賦形剤とを含んで成る組成物。 - 【請求項１７】 抗生物質、殺菌剤、他の成長促進剤、
麻酔薬等、およびそれらの混合物から選択される少なく
とも１種類の活性成分の有効量をも含む、請求項１６に
記載の組成物。 - 【請求項１８】 胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治療用
の薬学または獣医学組成物であって、 濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成
長促進因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほ
ぼ中性であるものを含む乳生成物エキス組成物の有効量
と、 薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤー
または賦形剤とを含んで成る組成物。 - 【請求項１９】 抗生物質、殺菌剤、他の成長促進剤、
麻酔薬等、およびそれらの混合物から選択される少なく
とも１種類の活性成分の有効量をも含む、請求項１８に
記載の組成物。 - 【請求項２０】 ヒトを含む動物の表面の傷の治療法で
あって、治療を受ける患者に薬学または獣医学組成物で
あって、 濃縮された形態で乳生成物から抽出される複数の細胞成
長促進因子であって、この因子の等電点が塩基性乃至ほ
ぼ中性であるものを含む乳生成物エキス組成物の有効量
と、 薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤー
または賦形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与する
ことを含む方法。 - 【請求項２１】 胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治療法
であって、治療を受ける患者に、薬学または獣医学組成
物であって、 濃縮された形態で乳生成物から抽出され、等電点が塩基
性またはほぼ中性である複数の細胞成長促進因子を含む
乳生成物エキス組成物の有効量と、 薬学または獣医学上許容可能なその希釈剤、キャリヤー
または賦形剤とを含んで成る組成物の有効量を投与する
ことを含む方法。 - 【請求項２２】 例のいずれか１つに関して実質的にこ
れまでに記載された乳生成物エキス組成物。
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| JPH05508542A (ja) | 1993-12-02 |
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