ES2258154T3 - Procedimiento de obtencion de una fraccion proteica enriquecida en tgf-beta en forma activada, fraccion proteica y aplicaciones terapeuticas. - Google Patents

Procedimiento de obtencion de una fraccion proteica enriquecida en tgf-beta en forma activada, fraccion proteica y aplicaciones terapeuticas.

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Abstract

Procedimiento de obtención de una fracción proteica enriquecida en TGF-â en forma activada, a partir de una solución rica en proteínas solubles de la fase acuosa de la leche, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a)ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución; b)precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución a un pH comprendido entre 4 y 5, 5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC; c)microfiltrar con diafiltración la suspensión precipitada a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado; d)recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-â; e)secar el retenido de microfiltración, diafiltrado, a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF- â.

Description

Procedimiento de obtención de una fracción proteica enriquecida en TGF-\beta en forma activada, fracción proteica y aplicaciones terapéuticas.
La presente invención se refiere al campo de la purificación del factor TGF-\beta a partir de una materia prima láctea.
Técnica anterior
Las leches, en particular la leche humana y la leche de todas las hembras de mamíferos, contienen numerosos polipéptidos biológicamente activos, en particular numerosos factores de crecimiento. Uno de los factores de crecimiento contenidos en la leche es el TGF-\beta (por "Transforming Growth Factor beta").
La expresión TGF-\beta designa una familia que comprende diversos factores de crecimiento. Los TGF-\beta1 y TGF-\beta2 son las dos formas homólogas del TGF-\beta. Estos son los constituyentes homodiméricos constituidos por dos cadenas peptídicas de 112 aminoácidos cada una, idénticas y unidas entre ellas por medio de un puente disulfuro intercadena. Su peso molecular es de 25.000 daltons. Los polipéptidos TGF-\beta1 y TGF-\beta2 presentan un 72% de homología estructural y sus propiedades biológicas son idénticas. Existe una identidad total en la secuencia de aminoácidos de los TGF-\beta2 de origen humano y bovino.
Los TGF-\beta pueden obtenerse por recombinación genética en forma purificada. Sin embargo, las preparaciones de TGF-\beta recombinantes son susceptibles de contener una débil parte de proteínas bacterianas, de las que algunas son alergizantes. Además, por definición, las preparaciones purificadas de TGF-\beta recombinantes no contienen ninguna proteína asociada de leche, la cual sería susceptible de completar o potenciar el efecto biológico del TGF-\beta.
La leche de vaca contiene al mismo tiempo TGF-\beta1 y TGF-\beta2. El TGF-\beta2 es mayoritario y representa el 90% en peso del TGF-\beta encontrado en la leche, y, por su parte, el TGF-\beta1 representa el 10% en peso del contenido total en TGF-\beta de la leche.
En la leche, más del 90% del TGF-\beta2 se encuentra en una forma latente, es decir, en una forma no activa biológicamente.
Diversos estudios académicos han mostrado que la tasa de TGF-\beta2 en la leche era de 12 a 150 \mug/l en el calostro, de 3,7 a 3,8 \mug/l en la leche cruda y en la leche pasteurizada, de 4,3 \mug/l en la leche desnatada y de 3,7 \mug/l en el lactosuero.
El TGF-\beta posee un gran espectro de actividad biológica que confiere a este polipéptido un gran interés terapéutico en la prevención o en el tratamiento de una gran variedad de afecciones o patologías.
El TGF-\beta es biológicamente activo sobre la matriz extracelular. El TGF-\beta estimula la síntesis de las proteínas matriciales y aumenta la síntesis del colágeno y de la fibronectina en los fibroblastos. Inhibe también la síntesis de enzimas proteolíticas tales como la colagenasa y las metaloproteasas. El TGF-\beta aumenta la secreción de inhibidores de proteasas como el inhibidor del activador del plasminógeno o incluso los inhibidores de metaloproteasas.
El TGF-\beta ejerce asimismo una actividad biológica sobre el esqueleto. En particular, el TGF-\beta está presente, en fuertes concentraciones, en el hueso. Desempeña un papel en la formación del cartílago y estimula la resorción de osteoclastos, así como la activación de osteoblastos. Actúa como un inhibidor natural de la resorción ósea y como un estimulante de la formación ósea.
El TGF-\beta es asimismo activo sobre los linfocitos. A título ilustrativo, el TGF-\beta inhibe la proliferación de linfocitos T y favorece la actividad de las células asesinas denominadas "Natural Killers".
El TGF-\beta es asimismo un potente agente antiinflamatorio. Disminuye la producción de citoquinas proinflamatorias. Posee propiedades inmunosupresoras e inhibe la proliferación de linfocitos T activados.
Además, el TGF-\beta posee efectos antiproliferativos. Es un inhibidor potente de las células epiteliales. Ejerce también una fuerte actividad antimitogénica frente a las células mesenquimatosas, los fibroblastos embrionarios, las células endoteliales y los linfocitos T y B. Es también un potente inhibidor del crecimiento de hepatocitos y podría desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la quiescencia de éstos. El TGF-\beta actúa también como un factor de regulación negativa del epitelio mamario.
El TGF-\beta posee asimismo efectos anticancerosos. Durante la carcinogénesis, las células cancerosas pueden perder su aptitud para responder al TGF-\beta. Sin embargo, algunos tumores de células epiteliales son sensibles a los efectos antiproliferativos del TGF-\beta. Tal es el caso de las células del cáncer de mama.
Por lo demás, el TGF-\beta actúa sobre la proliferación y la diferenciación de las células leucémicas. Inhibe la proliferación de células promielocitarias. Podría actuar en sinergia con el ácido retinoico y la vitamina D3.
La solicitud de patente europea nº EP 0 527 283 a nombre de Société des Produits NESTLE S.A. describe un procedimiento de preparación de un producto derivado de la leche que contiene TGF-\beta, en el que una leche entera es desnatada por centrifugación, desalada sobre una columna PD-10 (Pharmacia) y esterilizada a continuación por filtración sobre una membrana "Millipore" de un diámetro de poro igual a 0,2 \mum. Después, la leche desnatada es esterilizada y ajustada a pH 4 con ayuda de una solución de HCI 1N, y luego es centrifugada a 40.000 g durante 60 minutos a fin de separar la caseína precipitada del lactosuero. El lactosuero así separado es neutralizado por soda 1N y después dializado. No obstante, este procedimiento que permite eliminar la caseína de la leche desnatada de partida, no es un procedimiento de purificación del TGF-\beta. En efecto, conduce a un producto final que contiene la totalidad de proteínas del lactosuero inicial, en el que está presente el TGF-\beta, pero sin enriquecimiento significativo del contenido de esta molécula.
En el estado de la técnica se han descrito varios procedimientos de obtención, a partir de leche, de fracciones proteicas enriquecidas en TGF-\beta.
La solicitud de patente europea nº EP 0 313 515 a nombre de CIBA GEIGY describe un procedimiento de purificación de un factor de crecimiento contenido en la leche, en el que se realizan etapas sucesivas de cromatografía, utilizando, en particular, resinas intercambiadoras de cationes, soportes para cromatografía de interacción hidrófoba (HPLC-RP) o incluso soportes cromatográficos de exclusión por el tamaño.
La solicitud PCT nº WO 01 25.276 a nombre de CAMPINA MELKUNIE B.V. describe un procedimiento de extracción de TGF-\beta y de factores de crecimiento análogos a la insulina (IGF-1) a partir de un producto lácteo. El procedimiento comprende las etapas siguientes:
a)
recuperar una fracción de base del producto lácteo por cromatografía de intercambio de catión;
b)
hacer pasar la fracción obtenida en la etapa a) sobre una columna de hidroxiapatita,
c)
eluir la columna de hidroxiapatita con ayuda de eluyentes apropiados de manera que se obtenga, en particular, una fracción que contiene TGF-\beta sustancialmente libre de IGF-1.
Todos los procedimientos descritos anteriormente adolecen de inconvenientes técnicos. En efecto, los procedimientos de purificación del TGF-\beta que realizan etapas sucesivas de cromatografía son largos y molestos. Además, el importante número de etapas cromatográficas necesarias para la obtención de un grado de purificación deseado reduce considerablemente el rendimiento final debido a la degradación progresiva del TGF-\beta en el curso del tiempo de purificación y a la pérdida inevitable de TGF-\beta biológicamente activo en cada una de las etapascromatográficas. Además de la utilización de soluciones salinas y de soluciones de regeneración con alto poder contaminante que es necesario eliminar a continuación, estos procedimientos presentan un riesgo elevado de contaminación bacteriana del producto final.
Por tanto, existe una necesidad en el estado de la técnica de procedimientos mejorados de purificación del TGF-\beta a partir de un producto lácteo, que no comporte los inconvenientes descritos anteriormente para los procedimientos de la técnica anterior.
Sumario de la invención
La invención tiene por objeto un procedimiento de obtención de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta en forma activada, a partir de una solución líquida rica en proteínas denominadas solubles de la fase acuosa de la leche y/o del lactosuero, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a)
ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litros de solución;
b)
precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución así obtenida a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
c)
microfiltrar la solución tratada con diafiltración a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
d)
recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
e)
secar el retenido de microfiltración diafiltrado a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF-\beta.
Preferentemente, la etapa a) de ajuste se realiza por dilución de una solución que contiene las proteínas solubles de la leche, tal como un aislado de proteínas de lactosuero, denominado asimismo "WPI".
Preferentemente, la etapa b) de precipitación se realiza a una temperatura comprendida entre 60ºC y 68ºC e incluso más preferentemente aproximadamente 63ºC.
Ventajosamente, la duración de la etapa b) de precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10 minutos, preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos y, de manera totalmente preferida, aproximadamente 2 minutos.
De manera preferida, la microfiltración de la etapa c) se realiza sobre una membrana de microfiltración que tiene un tamaño medio de poro comprendido entre 0,8 y 1,6 \mum y que posee una estrecha distribución de tamaño de poro.
La invención tiene asimismo por objetivo obtener una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta, susceptible de obtenerse por el procedimiento anterior, y que presenta un contenido de TGF-\beta2 en forma activada superior a 5 \mug por gramo de proteínas totales de lactosuero, estando el resto de proteínas del lactosuero mayoritariamente constituidas por \alpha-lactoalbúmina.
La misma se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende una fracción proteica como la definida más arriba, adicionada, si resulta necesario con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
La invención se refiere asimismo a la utilización de una fracción proteica tal como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de diversas patologías para las que el TGF-\beta constituye un compuesto de interés terapéutico.
Descripción de la figura única
La figura 1 representa un esquema del procedimiento de obtención de una fracción proteica rica en TGF-\beta de la invención.
Descripción detallada de la invención
El solicitante ha puesto a punto un procedimiento a la vez simple y rápido de obtención de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta a partir de una solución líquida rica en proteínas del lactosuero.
Por "TGF-\beta" se entiende una asociación o una mezcla de TGF-\beta que comprende al menos un 90% en peso de TGF-\beta2 y a lo sumo 10% en peso de TGF-\beta1.
En particular, el procedimiento de la invención comprende un pequeño número de etapas de corta duración, lo que permite evitar una pérdida significativa de la actividad biológica del TGF-\beta debido a una degradación de esta proteína en el curso del tiempo durante el procedimiento de purificación.
Además, el procedimiento según la invención no comprende ninguna etapa de cromatografía que necesite la adsorción sucesiva de las proteínas de interés sobre varios soportes y después de su desorción de los soportes por elución, lo que entraña obligatoriamente una pérdida significativa del TGF-\beta y, por tanto, de las consecuencias nefastas sobre el rendimiento final del procedimiento.
La invención se refiere a un procedimiento de obtención de una fracción proteica enriquecida en TGF-\beta en forma activada a partir de una solución líquida rica en proteínas del lactosuero, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a)
ajustar las proteínas purificadas del lactosuero a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución;
b)
precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución líquida a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
c)
microfiltrar la solución así tratada con diafiltración a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
d)
recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
e)
secar el retenido diafiltrado de microfiltración a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en 
\hbox{TGF- \beta .}
La solución de partida rica en proteínas del lactosuero puede ser de cualquier naturaleza. Preferentemente, se trata de un aislado de proteínas del lactosuero (designado también WPI por "Whey proteins isolate") que puede prepararse por cualquier método conocido por el experto en la materia.
La solución rica en proteínas del lactosuero presenta, preferentemente, la composición siguiente:
Materia nitrogenada total: 10 g/kg.
Extracto seco: 10,4 g/kg
O sea, 96% de proteínas en el extracto seco.
Etapa a) del procedimiento
La etapa a) del procedimiento consiste preferentemente en una dilución de las proteínas por agua osmotizada para obtener una concentración de 5 a 30 g de proteínas por kilogramo de solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa b) del procedimiento
La etapa b) del procedimiento consiste en una etapa de precipitación fraccionada de las proteínas del lactosuero en unas condiciones operativas que permitan una precipitación selectiva de la fracción proteica que contiene la casi totalidad del TGF-\beta inicialmente contenido en la solución líquida rica en proteínas del lactosuero, por ejemplo un WPI.
El solicitante ha alcanzado este objetivo combinando ciertos parámetros de pH y de temperatura.
Se ha descubierto, según la invención, que la aplicación de uno solo de los parámetros, sea el pH, sea la temperatura, no permite alcanzar el grado deseado de precipitación de las proteínas.
Cuando la etapa b) se realiza a una temperatura inferior a 55ºC, no se obtiene la precipitación de la fracción proteica rica en TGF-\beta. Asimismo, cuando la temperatura de tratamiento es superior a 68ºC y para temperaturas crecientes, se observa la coprecipitación, con el TGF-\beta, de una fracción cada vez más grande de las proteínas de lactosuero. Así, para temperaturas superiores a 70ºC, se precipita la totalidad casi de las proteínas del lactosuero contenidas inicialmente en la solución de partida y ya no se obtiene el enriquecimiento selectivo en TGF-\beta.
A título ilustrativo, para un pH de 4,6, los resultados de precipitación observados a temperaturas crecientes se presentan en la tabla 1 siguiente.
La tabla 1 siguiente resume la evolución de la precipitación del TGF-\beta y de las proteínas del lactosuero a pH 4,6 en función de la intensidad del tratamiento térmico (duración del tratamiento: 2 minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
Temperatura (ºC) % del TGF-\beta inicial^{a} % de las otras proteínas precipitadas^{b}
25ºC 40% 10%
50ºC 43% 12%
60ºC 67% 15%
63ºC 84% 16%
65ºC 94% 30%
70ºC 100% 50%
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Porcentaje del TGF-\beta contenido inicialmente en la solución líquida rica en proteínas de lactosuero (WPI) que se encuentra en la fracción proteica precipitada.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Porcentaje de proteínas totales contenidas inicialmente en la solución líquida rica en proteínas del lactosuero (WPI) que se encuentra en la fracción proteica precipitada.\end{minipage}
Los resultados de la tabla 1 muestran que al pH 4,6 y a una temperatura de 50ºC, se precipita sólo el 43% del TGF-\beta contenido inicialmente en la solución rica en proteínas del lactosuero. A la temperatura de 70ºC, se precipita el 100% del TGF-\beta2 inicial, pero la precipitación es poco selectiva debido a que el 50% de las proteínas totales inicialmente contenidas en la solución inicial de proteínas del lactosuero coprecipita con el TGF-\beta, lo que no permite alcanzar el grado deseado de enriquecimiento en TGF-\beta.
Preferentemente, la etapa b) del procedimiento según la invención se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5,5, y todavía más ventajosamente a un pH comprendido entre 4 y 5. De manera completamente preferida, la etapa b) del procedimiento se realiza a un pH comprendido entre 4,3 y 4,9, todavía mejor entre 4,4 y 4,8, y preferentemente entre 4,5 y 4,7. El pH óptimo de aplicación es de aproximadamente 4,6.
Preferentemente, el pH se ajusta con ayuda de un ácido concentrado a fin de reducir al máximo los fenómenos de dilución que se derivan de la adición de un volumen de líquido suplementario. Preferentemente, se utiliza HCI concentrado y, de manera completamente preferida, HCI a la concentración 6N, en particular debido a su manipulación más fácil y menos peligrosa que para otros ácidos concentrados.
\newpage
La temperatura de aplicación de la etapa b) del procedimiento está comprendida ventajosamente entre 55ºC y 68ºC, preferentemente entre 61ºC y 65ºC y de manera preferida entre 62ºC y 64ºC, y de manera completamente preferida es de aproximadamente 63ºC.
Sin querer quedar vinculado por ninguna teoría, el solicitante considera que el TGF-\beta, que se encuentra esencialmente en forma latente en la solución inicial de proteínas del lactosuero, se convierte en su forma activada (biológicamente activa) después de la etapa b) del procedimiento.
La combinación de parámetros de temperatura y de pH anterior hace posible la realización de la etapa de precipitación durante un tiempo corto, lo que permite evitar la degradación del TGF-\beta. Así, la duración de la etapa b) de precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10 minutos, preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos y aún mejor entre 1 minuto y 3 minutos, y de manera totalmente preferida de aproximadamente 2 minutos.
Cuando la etapa b) del procedimiento se realiza durante 15 minutos a un pH de 7,0 y a 80ºC, se observa una desnaturalización del TGF-\beta, siendo creciente esta desnaturalización con la duración de la etapa de precipitación más allá de 15 minutos.
El tratamiento térmico puede ser de cualquier naturaleza. Se realiza preferentemente con ayuda de intercambiadores térmicos de tipo tubular o incluso intercambiadores térmicos con superficie raspada conocidos por el experto en la materia para el tratamiento térmico de soluciones viscosas o de suspensiones tales como los quesos frescos.
Según un modo de realización particular de la etapa b) del procedimiento, la solución precipitada de TGF-\beta se enfría rápidamente.
En efecto, el solicitante ha observado que un enfriamiento rápido después de la precipitación influye positivamente sobre la textura del precipitado obtenido y favorece, en consecuencia, la realización de etapas posteriores del procedimiento y, más particularmente, la etapa de microfiltración, no debiendo ser el precipitado demasiado fino para no cegar la membrana.
Preferentemente, el enfriamiento se efectúa en un intercambiador térmico de placas o tubular con agua a temperatura ambiente, preferentemente entre 20 y 30ºC, ventajosamente aproximadamente 25ºC.
La duración de la etapa de enfriamiento está comprendida preferentemente entre 1 y 20 minutos y, de manera completamente preferida, entre 2 y 10 minutos.
Por tanto, el producto final de la etapa b) es un líquido que contiene una suspensión de proteínas precipitadas que incluyen el TGF-\beta en una solución de proteínas no precipitadas del lactosuero.
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Etapa c) del procedimiento
La suspensión de proteínas que contiene el TGF-\beta en una solución de proteínas no precipitadas del lactosuero obtenida en la etapa b) es microfiltrada con diafiltración.
El precipitado es sometido a una etapa de microfiltración con diafiltración a fin de eliminar la mayoría de proteínas solubles restantes del lactosuero concentrando al mismo tiempo la fracción proteica de interés que contiene mayoritariamente el TGF-\beta.
A fin de evitar las pérdidas significativas de TGF-\beta a la vez que se elimina una mayoría de las proteínas solubles del lactosuero no deseadas, la microfiltración se realiza con una membrana cuya distribución gaussiana del tamaño de poro es estrecha.
Preferentemente, la microfiltración se realiza con una membrana de microfiltración que presenta un tamaño medio de poro comprendido entre 0,8 y 1,6 \mum y que posee una estrecha distribución gaussiana de tamaño de poro.
De manera completamente preferida, la microfiltración con diafiltración se realiza en unas condiciones de presión transmembranaria uniforme en la totalidad de la superficie de la membrana filtrante.
La recirculación a isocorriente del permeado representa un primer modo de realización de la etapa de microfiltración del procedimiento según la invención que permite la obtención de una presión transmembranaria sustancialmente uniforme sobre el conjunto de la superficie de la membrana del filtro.
Así, la recirculación a isocorriente del permeado en la superficie externa del soporte de la membrana filtrante permite la obtención de una pérdida de carga (diferencia entre la presión de entrada y la presión de salida de los fluidos que circulan desde cada lado de la membrana filtrante) idéntica en cada uno de los compartimentos del filtro y, por tanto, una diferencia de presión sustancialmente idéntica en cada punto dado de la membrana filtrante, y esto sobre la totalidad de la superficie filtrante. La técnica de recirculación del permeado a isocorriente se describe, por ejemplo, en la patente sueca nº SW 74 16 257 (Sandblom).
Cuando se practica la recirculación del permeado a isocorriente y se desea asegurar una presión transmembranaria uniforme, se han obtenido los mejores resultados con membranas minerales o cerámicas, tales como de alfa-alúmina, comercializadas por la Société des Céramiques Techniques (Francia) con la marca Membralox, o por la Société Orelis France con la marca KERASEP o incluso las membranas de marca STERILOX.
Según otro aspecto, la membrana filtrante se coloca sobre un soporte macroporoso con gradiente longitudinal de permeabilidad. Este soporte posee una constitución tal que comprende un gradiente tamaño de poroidad que disminuye de un extremo a otro de la membrana filtrante.
Gracias a dicho soporte de filtro, la resistencia hidráulica disminuye de un extremo a otro de la membrana filtrante, lo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme a lo largo de todo el camino membranario.
Tal tipo de filtro se realiza ventajosamente a partir de cerámica, tal como el soporte de filtro descrito en la solicitud de patente francesa nº FR 97 04 359.
Todavía según otro aspecto, se puede realizar también una filtración membranaria dinámica, tal como se describe en la patente francesa 93 06 321 (nº de publicación 2 692 441) por ejemplo utilizando unas membranas orgánicas.
Según tal modo de realización del procedimiento de la invención, la membrana filtrante y su soporte se colocan sobre un eje rotativo, completándose dicho dispositivo por la disposición de un disco giratorio a escasa distancia de la membrana de microfiltración.
El giro del disco situado a escasa distancia (aproximadamente 4 mm) de la membrana de microfiltración genera una tensión de cizalladura de 50 a 100 veces más elevada que durante una filtración tangencial clásica, actuando esta tensión de cizalladura en las tres dimensiones (radial, tangencial y axial). En dicho dispositivo, la generación de la tensión de cizalladura en la pared está desacoplada de la presión transmembranaria. Dichos procedimientos de filtración membranaria dinámica están descritos asimismo en las patentes US nº 5.037.532, nº 3.997.447 y nº 4.956.102.
Preferentemente, la membrana de microfiltración posee un tamaño medio tamaño de poro comprendido entre 1 y 1,6 \mum y, de manera completamente preferida, de aproximadamente 1,4 \mum, tal como en la comercializada por la sociedad EXEKIA bajo la referencia "Stérilox, 1,4 \mum clásica", lo que requiere la aplicación en el equipo de microfiltración de la recirculación a isocorriente del microfiltrado a fin de obtener una presión transmembranaria uniforme o bajo la referencia "Stérilox, 1, 4 \mum GP".
Preferentemente, la diafiltración se realiza con agua osmotizada o con agua desmineralizada, filtrada de forma estéril.
Preferentemente, la diafiltración se realiza utilizando 1 a 6 diavolúmenes, preferentemente aproximadamente 4 diavolúmenes, a fin de obtener una eliminación máxima de las proteínas solubles del lactosuero distintas del TGF-\beta.
Preferentemente, la microfiltración con diafiltración se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5,5, preferentemente entre 4,3 y 5 y, de manera completamente preferida, a un pH de aproximadamente 4,6, lo que permite conservar el TGF-\beta en forma precipitada.
El ajuste del pH se efectúa con un ácido concentrado, preferentemente, el HCI concentrado, ventajosamente a la concentración 6N.
Los productos finales de la etapa de microfiltración con diafiltración son, respectivamente:
-
por una parte, un retenido fuertemente enriquecido en TGF-\beta; y
-
por otra parte, un microfiltrado que contiene proteínas solubles del lactosuero. Por ejemplo, este microfiltrado contiene 8,0 g/l de dichas proteínas solubles para un contenido de materia seca de aproximadamente 8,8 g/l. Estas proteínas de lactosuero que no se han precipitado pueden concentrarse ventajosamente de nuevo por cualquier medio conocido por el experto en la materia, por ejemplo ultrafiltración sobre membrana, y pueden utilizarse, una vez concentradas, para la mayor parte de las aplicaciones convencionales del WPI.
Recuperación del retenido de microfiltración
Al final de la etapa de microfiltración con diafiltración, se recupera el retenido de microfiltración y éste constituye la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta.
En general, el retenido de microfiltración contiene de 6,5 a 17 \mug/l de TGF-\beta para 1 g de proteínas totales.
Ventajosamente, después de la recuperación, el retenido de microfiltración se seca por cualquier medio conocido por el experto en la materia (liofilización, atomización, etc.) con el fin de obtener una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta en forma de un polvo.
El polvo de retenido contiene aproximadamente un 15% de las proteínas iniciales del lactosuero de la solución de partida. Por tanto, el conjunto de las etapas del procedimiento según la invención ha permitido eliminar el 85% de las proteínas del lactosuero contenidas inicialmente en la solución de partida. En este polvo, la tasa de TGF-\beta está comprendida generalmente entre 6,5 y 17 \mug/g de polvo, lo que corresponde aproximadamente a la recuperación del 70% del TGF-\beta inicialmente contenido en la solución de proteínas del lactosuero de partida. El contenido de TGF-\beta2 con respecto al peso del polvo corresponde a un contenido de TGF-\beta2 de 6 \mug a 15 \mug por gramo de proteínas totales contenidas en el polvo.
Esta fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta puede utilizarse tal como, según el caso, en asociación con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
Esta fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta puede someterse asimismo a unas etapas suplementarias de purificación a fin de llegar a un producto final que posea un contenido incluso mayor de TGF-\beta (microfiltración, centrifugación, acidificación, cromatografía).
Estas etapas suplementarias de purificación permiten la eliminación de las proteínas insolubles del lactosuero, que están constituidas mayoritariamente por \alpha-lactalbúmina e inmunoglobulinas.
Modo de realización preferido para la preparación de la solución rica en proteínas del lactosuero de partida
Según un modo de realización ventajoso de la invención, la solución rica en proteínas del lactosuero de partida se obtiene mediante la realización de las etapas siguientes:
i)
microfiltración tangencial de una leche desnatada sobre una membrana que tiene un tamaño medio tamaño de poro de 0,1 \mum en un equipo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme, y luego recuperación del microfiltrado;
ii)
concentración del microfiltrado obtenido en la etapa i) por microfiltración con diafiltración con ayuda de una membrana que tiene un poder de corte comprendido entre 5.000 daltons y 20.000 daltons, tal como las utilizadas corrientemente por el experto en la materia para la preparación de concentrados de proteínas a partir de lactosuero;
iii)
recuperación del retenido de ultrafiltración diafiltrado; y
iv)
facultativamente, dilución de las proteínas contenidas en el retenido de ultrafiltración diafriltrado a fin de obtener la solución de proteínas del lactosuero de partida, tal como la descrita en la presente invención.
Preferentemente, la microfiltración tangencial se realiza con una membrana del tipo Membralox (constituida por aluminio solo o por una mezcla de alúmina-circonia) 0,1 \mum clásica, lo que requiere la aplicación en el equipo de microfiltración de la recirculación a isocorriente del microfiltrado (concepto hidráulico dicho de la presión transmembranaria uniforme) o una membrana Membralox 0,1 \mum de referencia GP, tales como las comercializadas por la sociedad EXEKIA.
El retenido obtenido a continuación de la etapa i) de microfiltración tangencial contiene mayoritariamente las caseínas de la leche en forma micelar.
El microfiltrado obtenido a continuación de la etapa i) contiene sustancialmente las proteínas solubles de la leche, la lactosa, las formas nitrogenadas no proteicas y las sales minerales solubles.
El microfiltrado obtenido en la etapa i) es sometido a una etapa de ultrafiltración con diafiltración a fin de concentrar las proteínas del lactosuero. Preferentemente, la ultrafiltración se realiza con membranas que tienen un umbral de corte comprendido entre 1 y 20 kD, preferentemente, aproximadamente 5 kD.
La diafiltración se realiza preferentemente con agua osmotizada, estando comprendido el volumen de diafiltración entre 2 y 6 diavolúmenes y siendo preferentemente de aproximadamente 4 diavolúmenes.
El ultrafiltrado contiene el nitrógeno soluble de la leche (nitrógeno no proteico) así como lactosa y sales minerales.
Por ejemplo, el retenido de ultrafiltración recuperado en la etapa iii) contiene aproximadamente 200 g de proteínas totales por litro de retenido.
Después de la recuperación del retenido, las proteínas contenidas en este último se diluyen a fin de obtener la solución de proteínas del lactosuero de partida. La dilución se realiza preferentemente con agua osmotizada.
Según el caso, el retenido de ultrafiltración recuperado en la etapa iii) que contiene las proteínas con la concentración de 200 g/l puede secarse en forma de polvo antes de su empleo como material de partida del procedimiento de obtención de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención.
Fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta
Otro objeto de la invención consiste en una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta, caracterizada porque comprende un contenido de TGF-\beta2 en forma activada superior a 5 \mug/g de proteínas totales.
Preferentemente, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta anterior comprende un contenido de TGF-\beta2 comprendido entre 6 \mug y 15 \mug de TGF-\beta2 en forma activada por gramo de proteínas totales.
Preferentemente, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta comprende un contenido de TGF-\beta2 en forma activada comprendido entre 7 \mug y 13 \mug, ventajosamente entre 8 \mug y 12 \mug y, de manera completamente preferida entre 9 \mug y 11 \mug de TGF-\beta2 por gramo de proteínas totales.
El contenido de TGF-\beta2 de la fracción proteica enriquecida según la invención puede ser determinado fácilmente por el experto en la materia, por ejemplo realizando un ensayo inmunológico con anticuerpos específicos del TGF-\beta2, tal como el comercializado por la sociedad R & D SYSTEMS (Barton Lane, Oxon, OX14345, Reino Unido) bajo la marca QUANTIKINE®.
El solicitante ha demostrado que las proteínas del lactosuero contenidas en la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta están constituidas mayoritariamente por \alpha-lactalbúmina e inmunoglobulinas.
Así, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención contiene entre un 45 y un 80% en peso de \alpha-lactalbúmina y entre 10 y 25% de inmunoglobinas con respecto al peso total de la fracción.
Además, esta fracción proteica enriquecida en TGF-\beta está exenta prácticamente (menos del 11%) de \beta-lactoglobulina, una proteína bien conocida por sus propiedades alergizantes.
El escaso contenido de \beta-lactoglobulina en la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención la hace apta para una utilización en el humano o en el animal.
Además, sin querer vincularse por ninguna teoría, el solicitante estima que el fuerte contenido de \alpha-lactalbúmina de la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede reforzar significativamente las propiedades terapéuticas del TGF-\beta.
En efecto, la \alpha-lactalbúmina es rica en triptófano, puesto que contiene cuatro residuos de este aminoácido por molécula de proteína. La \alpha-lactalbúmina es la proteína de la leche más rica en este aminoácido. El triptófano es el precursor de la serotonina (5-hidroxitriptamina) y de la melatonina. La serotonina posee propiedades sedantes y antiestresógenas. La serotonina disminuye la ansiedad y favorece el adormecimiento. No obstante, se admite actualmente que el estrés juega un papel capital en el desarrollo de la psoriasis. En efecto, los pacientes afectados de psoriasis están sometidos a un estrés permanente. La combinación del TGF-\beta y de la \alpha-lactalbúmina hace particularmente apta la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención para la preparación de medicamentos contra la psoriasis.
Además, la \alpha-lactalbúmina comprende un péptido que va del aminoácido en posición 50 hasta el aminoácido en posición 53 y que posee propiedades morfinomiméticas. Este péptido opioide derivado de la \alpha-lactalbúmina se ha denominado "\alpha-lactorfina" (véase H. CIBA y M. YOSHIKAWA, Biologically Functional Peptides from Food Proteins: New opioides peptides from milk proteins. Prot. Tail for Food and Med. Uses, ed. M. DEKKA, N.Y., 1986, pgs: 123-153).
Además, la \alpha-lactalbúmina posee propiedades bactericidas. Su hidrólisis en el tracto intestinal por la tripsina y la quimotripsina engendra la producción de péptidos bactericidas (véase, A. PELLEGRINI et al., Isolation and Identificantion of Fluid Bactericidal Domains in the bovine \alpha-lactalbúmine molecule, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1426:439-448). Las propiedades bactericidas de la \alpha-lactalbúmina pueden ser beneficiosas en pacientes afectados de psoriasis. En efecto, agentes patógenos tales como los estreptococos y los estafilococos producen superantígenos que son toxinas bacterianas que provocan una activación y una hiperproliferación de linfocitos T de la sangre, lo que conduce a una afluencia de linfocitos T activados al nivel de la piel. De esta afluencia resulta una activación y una proliferación de queratinocitos, proliferación celular en la base de la psoriasis.
Sin querer vincularse por ninguna teoría, el solicitante piensa que la actividad bactericida de la \alpha-lactalbúmina puede limitar la proliferación de los queratinocitos a continuación de una infección bacteriana y, en consecuencia, potenciar los efectos antipsoriasis del TGF-\beta.
Además, la presencia de \alpha-lactalbúmina, en asociación con el TGF-\beta, puede aumentar la estabilidad del TGF-\beta en una fracción proteica o en una composición según la invención y, en particular, proteger el TGF-\beta de las diversas degradaciones por las enzimas proteolíticas, por ejemplo cuando la fracción o la composición es administrada a un paciente.
Composiciones farmacéuticas según la invención
Otro objeto de la invención consiste en una composición farmacéutica que comprende una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta, tal como se ha definido anteriormente, en asociación, según el caso, con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica según la invención se caracteriza además porque contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de TGF-\beta.
Según otra característica, una composición farmacéutica según la invención contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de una asociación entre el TGF-\beta y la \alpha-lactalbúmina.
Cuando está destinada a una administración tópica, una composición farmacéutica según la invención comprende preferentemente entre 1 nanogramo y 1 mg de TGF-\beta2 por dosis, más preferentemente entre 10 nanogramos y 100 \mug de TGF-\beta2 por dosis y, de manera completamente preferida, entre 50 nanogramos y 20 \mug por dosis.
Cuando está destinada a administrarse de manera sistémica, una composición farmacéutica según la invención se adapta para una administración cotidiana entre 1 nanogramo y 500 \mug de TGF-\beta2 por kg de peso del paciente, preferentemente entre 80 nanogramos y 100 \mug por kg de peso del paciente y, de manera completamente preferida, entre 1 \mug y 20 \mug por kg de peso del paciente.
Una composición farmacéutica según la invención puede presentarse en forma de comprimidos, pastillas, cápsulas, bolsitas de polvo, soluciones para preparaciones inyectables, lociones, pomadas, cremas dérmicas, aerosoles, ungüentos, vendas, emulsiones, aerosoles de utilización intranasal o bronquial, implantes, o incluso pastas dentífricas o colutorios bucales.
Una composición farmacéutica según la invención puede aplicarse por vía tópica. Dicha composición farmacéutica puede administrarse asimismo de forma local o por vía sistémica.
En particular, una composición farmacéutica tal como la definida anteriormente puede administrarse por vía oral, enteral, parenteral, intradérmica, subcutánea o incluso por vía intravenosa.
Una composición farmacéutica según la invención comprende asimismo, además de una cantidad terapéuticamente eficaz de TGF-\beta2 o de una combinación de TGF-\beta2 y \alpha-lactalbúmina, diluyentes, conservantes, agentes de solubilización, agentes emulsionantes, adyuvantes o vehículos fisiológicamente compatibles. Dichas composiciones pueden presentarse en forma líquida o sólida. Pueden presentarse en forma de formulaciones liofilizadas o de formulaciones de polvo seco.
Dichas composiciones farmacéuticas comprenden ventajosamente diluyentes tamponados (por ejemplo, tris-HCI, acetato, fosfato), aditivos tales como albúmina o gelatina a fin de impedir su absorción sobre superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20®, Tween 80®, Pluronic S68®, sales de ácidos biliares, agentes de solubilización (por ejemplo, alcohol bencílico), agentes de carga o compuestos modificadores de tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol).
Una composición farmacéutica según la invención puede presentarse asimismo en forma de formulaciones a base de partículas de compuestos polímeros tales como ácido poliáctico, ácido poliglicólico, polivinilpirrolidona, o incluso en forma de liposomas, microemulsiones, micelas o incluso vesículas unilaminares o multilaminares.
De manera facultativa, una composición farmacéutica según la invención puede comprender otros constituyentes: aditivos tales como antioxidantes como ácido ascórbico, polipéptidos de poco peso molecular (menos de 10 aminoácidos) tales como poliargininas. Puede comprender asimismo aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina. Puede comprender también agentes quelatantes tales como EDTA. Puede comprender también azúcares hidroxilados tales como manitol o sorbitol.
Para composiciones farmacéuticas de liberación controlada o de liberación retardada, se añadirán ácidos grasos, ceras o aceites. Forman parte asimismo de la invención unas composiciones farmacéuticas en forma de partículas en las cuales la fracción proteica enriquecida en TGF-\beta está recubierta de polímeros tales como poloxámeros o poloxaminas.
Las composiciones para formulación tópica engloban geles, cremas, soluciones, emulsiones, incluyendo polímeros de carbohidratos o matrices biodegradables de éstos. Para la realización de una composición farmacéutica según la invención, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta puede encapsularse en una cera, una película o un vehículo sólido, incluida una goma de mascar.
La fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta puede inmovilizarse asimismo a fin de impedir su dilución por la saliva, por medio de agentes tales como la metilpropilcelulosa.
Una composición farmacéutica según la invención posee numerosas aplicaciones clínicas adicionales, algunas de las cuales se indican a continuación de manera no limitativa.
El TGF-\beta tiene notables propiedades cicatrizantes. Una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede aplicarse ventajosamente en el tratamiento de la cicatrización de llagas externas o internas, según el caso después de una intervención quirúrgica, o incluso en el tratamiento de escaras o bien en la consolidación del hueso después de su fractura.
Una fracción proteica según la invención puede aplicarse asimismo en el tratamiento de la osteoporosis debido a los efectos del TGF-\beta sobre los osteoclastos y los osteoblastos, provocando una inducción de la formación del cartílago y del hueso.
Debido al efecto inhibidor del TGF-\beta sobre la proliferación de las células epiteliales, una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede aplicarse ventajosamente para el tratamiento de melanomas, mielomas y linfomas.
La fracción proteica de la invención puede utilizarse ventajosamente en asociación con la vitamina D3 y los retinoides para el tratamiento de ciertas formas de leucemias. Puede aplicarse ventajosamente para luchar contra ciertas formas de cánceres, en particular en los cánceres de mama.
Además, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede utilizarse asimismo para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes.
Puede aplicarse ventajosamente también a la prevención o al tratamiento del lupus eritematoso, que es una afección de la piel caracterizada por la presencia de manchas o placas rojas recubiertas de escamas, por una hiperqueratosis, por un proceso inflamatorio ligado a una infiltración y una activación de los linfocitos T en la dermis, y que conduce a la producción de autoanticuerpos. El lupus eritematoso es el prototipo de las enfermedades autoinmunes. La administración de una composición farmacéutica según la invención a los pacientes afectados de lupus eritematoso, por vía oral, es susceptible de mejorar significativamente el estado general de estos enfermos.
Ventajosamente, una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede utilizarse también para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la psoriasis. La psoriasis es una dermatosis de evolución crónica caracterizada por una hiperproliferación de queratinocitos asociada a anomalías de su maduración. La proliferación de queratinocitos psoriásicos se manifiesta por un aumento del número de mitosis y un acortamiento del ciclo celular. Además, la epidermis psoriásica es la sede de un infiltrado inflamatorio debido a una afluencia de linfocitos T activados y a la liberación de citoquinas proinflamatorias. Debido a estas propiedades citostáticas antiinflamatorias e inmunosupresoras, la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención, cuando es administrada por vía oral, constituye un tratamiento de fondo de la psoriasis.
Puede constituir también un tratamiento de otras afecciones tales como la artritis reumática, la osteoartritis, la miastemia grave, la uveitis. Puede contemplarse también su utilización durante trasplantes de órganos a fin de evitar, o por lo menos reducir, los rechazos de injertos.
Una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención puede utilizarse asimismo para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la enfermedad de Crohn. Esta afección se caracteriza por una inflamación del intestino, una alteración de la regulación de los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II. La inflamación intestinal está ligada a un aumento de la expresión de los antígenos del MHC de clase II en el epitelio intestinal. Ésta es el resultado de un ataque autoinmunitario del intestino o de perturbaciones de la regulación inmunitaria.
Dicha composición farmacéutica, cuando es administrada por vía oral, constituye un tratamiento de fondo de la enfermedad de Crohn.
Por tanto, la invención tiene asimismo por objeto la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta tal como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematoso, la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la artritis reumática, la osteoartritis, la miastemia grave o la uveitis.
Se refiere asimismo a la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de los rechazos de injertos.
La invención se refiere asimismo a la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta tal como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento que favorece la cicatrización.
Se refiere asimismo a la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la osteoporosis.
Según otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención para la preparación de un medicamento oncostático.
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La invención es ilustrada además, sin quedar limitada por ello, mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de una solución rica en proteínas del lactosuero (WPI) como producto de partida del procedimiento según la invención
10.000 kg de leche desnatada con un contenido de materia seca de 92,9 g/kg y un contenido de N x 6,38 de 35,4 g/kg fueron introducidos a 50ºC dentro de un equipo de microfiltración que comprendería 4,6 m^{2} de membrana 0,1 \mum Membralox® (alúmina-circonia) y que funcionaba con recirculación del microfiltrado a isocorriente a fin de obtener una presión transmembranaria uniforme igual a 0,6-0,7 bares.
La velocidad de barrido en el compartimento retenido se fijó en 7 m/s.
El caudal de extracción del microfiltrado se fijó en 345 l/h. El caudal de extracción del retenido se fijó en 172,5 l/h.
Los 6.670 l de microfiltrado obtenidos con un contenido de materia seca de 57,8 g/kg y un contenido de N x 6,38 de 6,4 g/kg se enfriaron a 10ºC y se introdujeron en un equipo de ultrafiltración que comprendía 9,6 m^{2} de membrana Koch®, de concepción espiral y con un poder de corte de 5 kD. La presión de salida se fijó en 3,4 bares.
El caudal de extracción del ultrafiltrado se fijó en 250 l/h y el del retenido en 12,5 l/h. Los 334 l de retenido fueron adicionados continuamente con 1.336 l de agua osmotizada hasta la eliminación de este volumen de agua añadido en forma de ultrafiltrado.
El retenido diafiltrado final así obtenido tenía un contenido de proteínas (N x 6,38) de 101,0 g/kg y un contenido de materia seca de 106,3 g/kg. Fue utilizado inmediatamente para la preparación de la fracción enriquecida en TGF-\beta o bien fue congelado a -30ºC.
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Ejemplo 2 Preparación de una fracción fuertemente enriquecida en TGF-\beta a partir de una solución rica en proteínas del lactosuero
Se diluyeron 200 kg del retenido diafiltrado obtenido en el ejemplo 1 hasta 2.000 l con agua osmotizada a la temperatura de 20ºC en una cuba equipada con un agitador de palas.
Después de 10 minutos de agitación, se añadieron progresivamente 1.800 ml de HCI 6N hasta un descenso del valor del pH de 7,25 a 4,6. La agitación fue proseguida durante 10-15 minutos.
La solución fue tratada térmicamente a 63ºC-2 minutos y enfriada a 25ºC en un equipo Actijoule® por alícuotas de 1.000 l. Los 2.000 l de suspensión obtenidos, llevados a 35ºC, fueron seguidamente microfiltrados de forma continua en un equipo que comprendía 4,6 m^{2} de membranas Sterilox® con un diámetro medio tamaño de poro de 1,4 \mum, con recirculación a isocorriente del microfiltrado a fin de obtener una presión transmembranaria uniforme comprendida entre 0,4 y 0,8 bares, en 4 h 30.
El caudal de extracción del microfiltrado se fijó en 400 l/h. No se realizó ninguna extracción del retenido.
Cuando el volumen del retencito estaba próximo al volumen muerto del equipo de microfiltración, se añadieron continuamente 320 l de agua osmotizada y se extrajeron éstos en forma de microfiltrado.
Los 53 kg de retenido diafiltrado obtenidos tenían un contenido de materia seca de 39,96 g/kg, un contenido de proteínas (N x 6,38) de 39,14 g/kg y un contenido de TGF-\beta de 430,5 \mug/kg (o bien 11 \mug/kg de proteína). Fueron congelados a -30ºC y liofilizados por alícuotas de 10 kg.
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Ejemplo 3 Análisis cualitativo y cuantitativo de la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la invención
Se disolvió 1 mg del polvo liofilizado obtenido en el ejemplo 2 en 1 ml de agua miliQ y luego se diluyó 5 veces en el tampón A. El equipo analítico utilizado era un cromatógrafo CLHP Waters 600 E equipado con una columna "source RPC 3 ml" (Pharmacia®).
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Los dos tampones utilizados fueron:
Tampón A: Ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%
Tampón B: TFA 0,09% en acetonitrilo 90%
Se inyectaron 50 \mul de producto y se realizó la elución con un gradiente de 30 a 100% de tampón B en 30 m al caudal de 2 ml/m (a temperatura ambiente). La detección se realizó a 214 nm. El tratamiento de áreas cromatográficas se realizó con ayuda del programa informático Nelson®, lo que permitió estimar los contenidos con respecto a las proteínas totales: 53 de \alpha-lactalbúmina, 0,03% de seroalbúmina, 10,9% de \beta-lactoglobulina, 18,3% de inmunoglobulinas.
El contenido de TGF-\beta2 de las fracciones enriquecidas fue determinado por un método de inmunoensayos utilizando anticuerpos monoclonales específicos del TGF-\beta2 (Kits Quantikine comercializados por R & D Systems (Barton Lane, Oxon, OX14 3YS UK).

Claims (18)

1. Procedimiento de obtención de una fracción proteica enriquecida en TGF-\beta en forma activada, a partir de una solución rica en proteínas solubles de la fase acuosa de la leche, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a)
ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución;
b)
precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
c)
microfiltrar con diafiltración la suspensión precipitada a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
d)
recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
e)
secar el retenido de microfiltración, diafiltrado, a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF-\beta.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa b) de precipitación se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5 y, preferentemente, a un pH de aproximadamente 4,6.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la etapa b) de precipitación se realiza a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC y, preferentemente a aproximadamente 63ºC.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la duración de la etapa b) de precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10 minutos y preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos, y de manera completamente preferida es de aproximadamente 2 minutos.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque al final de la etapa b) la solución líquida es enfriada rápidamente.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la microfiltración de la etapa c) se realiza sobre una membrana que presenta un tamaño medio tamaño de poro comprendido entre 0,8 y 1,6 \mum y que posee una estrecha distribución de tamaños tamaño de poro, y en un equipo que conduce a la obtención de una presión transmembranaria uniforme.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la diafiltración de la etapa b) se realiza con agua osmotizada o agua desmineralizada filtrada.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la microfiltración con diafiltración se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5,5, preferentemente de aproximadamente 4,6.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la solución rica en proteínas del lactosuero de partida es obtenido por la realización de las etapas siguientes:
i)
microfiltración tangencial de una leche desnatada sobre una membrana de microfiltración que tiene un tamaño medio tamaño de poro de 0,1 \mum y en un equipo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme, y después recuperación del microfiltrado;
ii)
concentración del retenido obtenido en la etapa i) por ultrafiltración con diafiltración; y
iii)
recuperación del retenido de ultrafiltración diafiltrado.
10. Fracción proteica enriquecida en TGF-\beta susceptible de ser obtenida mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende un contenido en TGF-\beta2 en forma activada superior a 5 \mug por gramo de proteínas totales del lactosuero, y porque las demás proteínas del lactosuero están constituidas mayoritariamente por \alpha-lactalbúmina.
11. Fracción proteica según la reivindicación 10, caracterizada porque contiene entre 45% y 80% en peso de \alpha-lactalbúmina con respecto al peso total de dicha fracción.
12. Composición farmacéutica que comprende una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, si fuera necesario en asociación con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
\newpage
13. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematoso, la psoriasis o la enfermedad de Cronh.
14. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11 para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de la artritis reumática, la osteoartritis, la miastemia o la uveitis.
15. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un medicamento que favorece la cicatrización.
16. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de la osteoporosis.
17. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un medicamento oncostático.
18. Utilización de una fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de rechazos de injertos.
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