ES2258154T3 - Procedimiento de obtencion de una fraccion proteica enriquecida en tgf-beta en forma activada, fraccion proteica y aplicaciones terapeuticas. - Google Patents
Procedimiento de obtencion de una fraccion proteica enriquecida en tgf-beta en forma activada, fraccion proteica y aplicaciones terapeuticas.Info
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Abstract
Procedimiento de obtención de una fracción proteica enriquecida en TGF-â en forma activada, a partir de una solución rica en proteínas solubles de la fase acuosa de la leche, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a)ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución; b)precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución a un pH comprendido entre 4 y 5, 5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC; c)microfiltrar con diafiltración la suspensión precipitada a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado; d)recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-â; e)secar el retenido de microfiltración, diafiltrado, a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF- â.
Description
Procedimiento de obtención de una fracción
proteica enriquecida en TGF-\beta en forma
activada, fracción proteica y aplicaciones terapéuticas.
La presente invención se refiere al campo de la
purificación del factor TGF-\beta a partir de una
materia prima láctea.
Las leches, en particular la leche humana y la
leche de todas las hembras de mamíferos, contienen numerosos
polipéptidos biológicamente activos, en particular numerosos
factores de crecimiento. Uno de los factores de crecimiento
contenidos en la leche es el TGF-\beta (por
"Transforming Growth Factor beta").
La expresión TGF-\beta designa
una familia que comprende diversos factores de crecimiento. Los
TGF-\beta1 y TGF-\beta2 son las
dos formas homólogas del TGF-\beta. Estos son los
constituyentes homodiméricos constituidos por dos cadenas peptídicas
de 112 aminoácidos cada una, idénticas y unidas entre ellas por
medio de un puente disulfuro intercadena. Su peso molecular es de
25.000 daltons. Los polipéptidos TGF-\beta1 y
TGF-\beta2 presentan un 72% de homología
estructural y sus propiedades biológicas son idénticas. Existe una
identidad total en la secuencia de aminoácidos de los
TGF-\beta2 de origen humano y bovino.
Los TGF-\beta pueden obtenerse
por recombinación genética en forma purificada. Sin embargo, las
preparaciones de TGF-\beta recombinantes son
susceptibles de contener una débil parte de proteínas bacterianas,
de las que algunas son alergizantes. Además, por definición, las
preparaciones purificadas de TGF-\beta
recombinantes no contienen ninguna proteína asociada de leche, la
cual sería susceptible de completar o potenciar el efecto biológico
del TGF-\beta.
La leche de vaca contiene al mismo tiempo
TGF-\beta1 y TGF-\beta2. El
TGF-\beta2 es mayoritario y representa el 90% en
peso del TGF-\beta encontrado en la leche, y, por
su parte, el TGF-\beta1 representa el 10% en peso
del contenido total en TGF-\beta de la leche.
En la leche, más del 90% del
TGF-\beta2 se encuentra en una forma latente, es
decir, en una forma no activa biológicamente.
Diversos estudios académicos han mostrado que la
tasa de TGF-\beta2 en la leche era de 12 a 150
\mug/l en el calostro, de 3,7 a 3,8 \mug/l en la leche cruda y
en la leche pasteurizada, de 4,3 \mug/l en la leche desnatada y de
3,7 \mug/l en el lactosuero.
El TGF-\beta posee un gran
espectro de actividad biológica que confiere a este polipéptido un
gran interés terapéutico en la prevención o en el tratamiento de una
gran variedad de afecciones o patologías.
El TGF-\beta es biológicamente
activo sobre la matriz extracelular. El TGF-\beta
estimula la síntesis de las proteínas matriciales y aumenta la
síntesis del colágeno y de la fibronectina en los fibroblastos.
Inhibe también la síntesis de enzimas proteolíticas tales como la
colagenasa y las metaloproteasas. El TGF-\beta
aumenta la secreción de inhibidores de proteasas como el inhibidor
del activador del plasminógeno o incluso los inhibidores de
metaloproteasas.
El TGF-\beta ejerce asimismo
una actividad biológica sobre el esqueleto. En particular, el
TGF-\beta está presente, en fuertes
concentraciones, en el hueso. Desempeña un papel en la formación del
cartílago y estimula la resorción de osteoclastos, así como la
activación de osteoblastos. Actúa como un inhibidor natural de la
resorción ósea y como un estimulante de la formación ósea.
El TGF-\beta es asimismo activo
sobre los linfocitos. A título ilustrativo, el
TGF-\beta inhibe la proliferación de linfocitos T
y favorece la actividad de las células asesinas denominadas
"Natural Killers".
El TGF-\beta es asimismo un
potente agente antiinflamatorio. Disminuye la producción de
citoquinas proinflamatorias. Posee propiedades inmunosupresoras e
inhibe la proliferación de linfocitos T activados.
Además, el TGF-\beta posee
efectos antiproliferativos. Es un inhibidor potente de las células
epiteliales. Ejerce también una fuerte actividad antimitogénica
frente a las células mesenquimatosas, los fibroblastos embrionarios,
las células endoteliales y los linfocitos T y B. Es también un
potente inhibidor del crecimiento de hepatocitos y podría desempeñar
un papel importante en el mantenimiento de la quiescencia de éstos.
El TGF-\beta actúa también como un factor de
regulación negativa del epitelio mamario.
El TGF-\beta posee asimismo
efectos anticancerosos. Durante la carcinogénesis, las células
cancerosas pueden perder su aptitud para responder al
TGF-\beta. Sin embargo, algunos tumores de células
epiteliales son sensibles a los efectos antiproliferativos del
TGF-\beta. Tal es el caso de las células del
cáncer de mama.
Por lo demás, el TGF-\beta
actúa sobre la proliferación y la diferenciación de las células
leucémicas. Inhibe la proliferación de células promielocitarias.
Podría actuar en sinergia con el ácido retinoico y la vitamina
D3.
La solicitud de patente europea nº EP 0 527 283 a
nombre de Société des Produits NESTLE S.A. describe un procedimiento
de preparación de un producto derivado de la leche que contiene
TGF-\beta, en el que una leche entera es desnatada
por centrifugación, desalada sobre una columna PD-10
(Pharmacia) y esterilizada a continuación por filtración sobre una
membrana "Millipore" de un diámetro de poro igual a 0,2 \mum.
Después, la leche desnatada es esterilizada y ajustada a pH 4 con
ayuda de una solución de HCI 1N, y luego es centrifugada a 40.000 g
durante 60 minutos a fin de separar la caseína precipitada del
lactosuero. El lactosuero así separado es neutralizado por soda 1N y
después dializado. No obstante, este procedimiento que permite
eliminar la caseína de la leche desnatada de partida, no es un
procedimiento de purificación del TGF-\beta. En
efecto, conduce a un producto final que contiene la totalidad de
proteínas del lactosuero inicial, en el que está presente el
TGF-\beta, pero sin enriquecimiento significativo
del contenido de esta molécula.
En el estado de la técnica se han descrito varios
procedimientos de obtención, a partir de leche, de fracciones
proteicas enriquecidas en TGF-\beta.
La solicitud de patente europea nº EP 0 313 515 a
nombre de CIBA GEIGY describe un procedimiento de purificación de un
factor de crecimiento contenido en la leche, en el que se realizan
etapas sucesivas de cromatografía, utilizando, en particular,
resinas intercambiadoras de cationes, soportes para cromatografía de
interacción hidrófoba (HPLC-RP) o incluso soportes
cromatográficos de exclusión por el tamaño.
La solicitud PCT nº WO 01 25.276 a nombre de
CAMPINA MELKUNIE B.V. describe un procedimiento de extracción de
TGF-\beta y de factores de crecimiento análogos a
la insulina (IGF-1) a partir de un producto lácteo.
El procedimiento comprende las etapas siguientes:
- a)
- recuperar una fracción de base del producto lácteo por cromatografía de intercambio de catión;
- b)
- hacer pasar la fracción obtenida en la etapa a) sobre una columna de hidroxiapatita,
- c)
- eluir la columna de hidroxiapatita con ayuda de eluyentes apropiados de manera que se obtenga, en particular, una fracción que contiene TGF-\beta sustancialmente libre de IGF-1.
Todos los procedimientos descritos anteriormente
adolecen de inconvenientes técnicos. En efecto, los procedimientos
de purificación del TGF-\beta que realizan etapas
sucesivas de cromatografía son largos y molestos. Además, el
importante número de etapas cromatográficas necesarias para la
obtención de un grado de purificación deseado reduce
considerablemente el rendimiento final debido a la degradación
progresiva del TGF-\beta en el curso del tiempo de
purificación y a la pérdida inevitable de
TGF-\beta biológicamente activo en cada una de las
etapascromatográficas. Además de la utilización de soluciones
salinas y de soluciones de regeneración con alto poder contaminante
que es necesario eliminar a continuación, estos procedimientos
presentan un riesgo elevado de contaminación bacteriana del producto
final.
Por tanto, existe una necesidad en el estado de
la técnica de procedimientos mejorados de purificación del
TGF-\beta a partir de un producto lácteo, que no
comporte los inconvenientes descritos anteriormente para los
procedimientos de la técnica anterior.
La invención tiene por objeto un procedimiento de
obtención de una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta en forma activada, a partir de una
solución líquida rica en proteínas denominadas solubles de la fase
acuosa de la leche y/o del lactosuero, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litros de solución;
- b)
- precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución así obtenida a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
- c)
- microfiltrar la solución tratada con diafiltración a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
- d)
- recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
- e)
- secar el retenido de microfiltración diafiltrado a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF-\beta.
Preferentemente, la etapa a) de ajuste se realiza
por dilución de una solución que contiene las proteínas solubles de
la leche, tal como un aislado de proteínas de lactosuero, denominado
asimismo "WPI".
Preferentemente, la etapa b) de precipitación se
realiza a una temperatura comprendida entre 60ºC y 68ºC e incluso
más preferentemente aproximadamente 63ºC.
Ventajosamente, la duración de la etapa b) de
precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10 minutos,
preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos y, de manera
totalmente preferida, aproximadamente 2 minutos.
De manera preferida, la microfiltración de la
etapa c) se realiza sobre una membrana de microfiltración que tiene
un tamaño medio de poro comprendido entre 0,8 y 1,6 \mum y que
posee una estrecha distribución de tamaño de poro.
La invención tiene asimismo por objetivo obtener
una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta, susceptible de obtenerse por el
procedimiento anterior, y que presenta un contenido de
TGF-\beta2 en forma activada superior a 5 \mug
por gramo de proteínas totales de lactosuero, estando el resto de
proteínas del lactosuero mayoritariamente constituidas por
\alpha-lactoalbúmina.
La misma se refiere asimismo a una composición
farmacéutica que comprende una fracción proteica como la definida
más arriba, adicionada, si resulta necesario con uno o varios
excipientes fisiológicamente compatibles.
La invención se refiere asimismo a la utilización
de una fracción proteica tal como se ha definido anteriormente para
la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el
tratamiento de diversas patologías para las que el
TGF-\beta constituye un compuesto de interés
terapéutico.
La figura 1 representa un esquema del
procedimiento de obtención de una fracción proteica rica en
TGF-\beta de la invención.
El solicitante ha puesto a punto un procedimiento
a la vez simple y rápido de obtención de una fracción proteica
fuertemente enriquecida en TGF-\beta a partir de
una solución líquida rica en proteínas del lactosuero.
Por "TGF-\beta" se
entiende una asociación o una mezcla de TGF-\beta
que comprende al menos un 90% en peso de
TGF-\beta2 y a lo sumo 10% en peso de
TGF-\beta1.
En particular, el procedimiento de la invención
comprende un pequeño número de etapas de corta duración, lo que
permite evitar una pérdida significativa de la actividad biológica
del TGF-\beta debido a una degradación de esta
proteína en el curso del tiempo durante el procedimiento de
purificación.
Además, el procedimiento según la invención no
comprende ninguna etapa de cromatografía que necesite la adsorción
sucesiva de las proteínas de interés sobre varios soportes y después
de su desorción de los soportes por elución, lo que entraña
obligatoriamente una pérdida significativa del
TGF-\beta y, por tanto, de las consecuencias
nefastas sobre el rendimiento final del procedimiento.
La invención se refiere a un procedimiento de
obtención de una fracción proteica enriquecida en
TGF-\beta en forma activada a partir de una
solución líquida rica en proteínas del lactosuero, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas siguientes:
- a)
- ajustar las proteínas purificadas del lactosuero a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución;
- b)
- precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución líquida a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
- c)
- microfiltrar la solución así tratada con diafiltración a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
- d)
- recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
- e)
- secar
el retenido diafiltrado de microfiltración a fin de obtener un polvo
fuertemente enriquecido en
\hbox{TGF- \beta .}
La solución de partida rica en proteínas del
lactosuero puede ser de cualquier naturaleza. Preferentemente, se
trata de un aislado de proteínas del lactosuero (designado también
WPI por "Whey proteins isolate") que puede prepararse por
cualquier método conocido por el experto en la materia.
La solución rica en proteínas del lactosuero
presenta, preferentemente, la composición siguiente:
Materia nitrogenada total: 10 g/kg.
Extracto seco: 10,4 g/kg
O sea, 96% de proteínas en el extracto seco.
Etapa a) del
procedimiento
La etapa a) del procedimiento consiste
preferentemente en una dilución de las proteínas por agua osmotizada
para obtener una concentración de 5 a 30 g de proteínas por
kilogramo de solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa b) del
procedimiento
La etapa b) del procedimiento consiste en una
etapa de precipitación fraccionada de las proteínas del lactosuero
en unas condiciones operativas que permitan una precipitación
selectiva de la fracción proteica que contiene la casi totalidad del
TGF-\beta inicialmente contenido en la solución
líquida rica en proteínas del lactosuero, por ejemplo un WPI.
El solicitante ha alcanzado este objetivo
combinando ciertos parámetros de pH y de temperatura.
Se ha descubierto, según la invención, que la
aplicación de uno solo de los parámetros, sea el pH, sea la
temperatura, no permite alcanzar el grado deseado de precipitación
de las proteínas.
Cuando la etapa b) se realiza a una temperatura
inferior a 55ºC, no se obtiene la precipitación de la fracción
proteica rica en TGF-\beta. Asimismo, cuando la
temperatura de tratamiento es superior a 68ºC y para temperaturas
crecientes, se observa la coprecipitación, con el
TGF-\beta, de una fracción cada vez más grande de
las proteínas de lactosuero. Así, para temperaturas superiores a
70ºC, se precipita la totalidad casi de las proteínas del
lactosuero contenidas inicialmente en la solución de partida y ya no
se obtiene el enriquecimiento selectivo en
TGF-\beta.
A título ilustrativo, para un pH de 4,6, los
resultados de precipitación observados a temperaturas crecientes se
presentan en la tabla 1 siguiente.
La tabla 1 siguiente resume la evolución de la
precipitación del TGF-\beta y de las proteínas del
lactosuero a pH 4,6 en función de la intensidad del tratamiento
térmico (duración del tratamiento: 2 minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
Temperatura (ºC) | % del TGF-\beta inicial^{a} | % de las otras proteínas precipitadas^{b} |
25ºC | 40% | 10% |
50ºC | 43% | 12% |
60ºC | 67% | 15% |
63ºC | 84% | 16% |
65ºC | 94% | 30% |
70ºC | 100% | 50% |
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Porcentaje del TGF-\beta contenido inicialmente en la solución líquida rica en proteínas de lactosuero (WPI) que se encuentra en la fracción proteica precipitada.\end{minipage} | ||
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Porcentaje de proteínas totales contenidas inicialmente en la solución líquida rica en proteínas del lactosuero (WPI) que se encuentra en la fracción proteica precipitada.\end{minipage} |
Los resultados de la tabla 1 muestran que al pH
4,6 y a una temperatura de 50ºC, se precipita sólo el 43% del
TGF-\beta contenido inicialmente en la solución
rica en proteínas del lactosuero. A la temperatura de 70ºC, se
precipita el 100% del TGF-\beta2 inicial, pero la
precipitación es poco selectiva debido a que el 50% de las proteínas
totales inicialmente contenidas en la solución inicial de proteínas
del lactosuero coprecipita con el TGF-\beta, lo
que no permite alcanzar el grado deseado de enriquecimiento en
TGF-\beta.
Preferentemente, la etapa b) del procedimiento
según la invención se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5,5, y
todavía más ventajosamente a un pH comprendido entre 4 y 5. De
manera completamente preferida, la etapa b) del procedimiento se
realiza a un pH comprendido entre 4,3 y 4,9, todavía mejor entre 4,4
y 4,8, y preferentemente entre 4,5 y 4,7. El pH óptimo de aplicación
es de aproximadamente 4,6.
Preferentemente, el pH se ajusta con ayuda de un
ácido concentrado a fin de reducir al máximo los fenómenos de
dilución que se derivan de la adición de un volumen de líquido
suplementario. Preferentemente, se utiliza HCI concentrado y, de
manera completamente preferida, HCI a la concentración 6N, en
particular debido a su manipulación más fácil y menos peligrosa que
para otros ácidos concentrados.
\newpage
La temperatura de aplicación de la etapa b) del
procedimiento está comprendida ventajosamente entre 55ºC y 68ºC,
preferentemente entre 61ºC y 65ºC y de manera preferida entre 62ºC y
64ºC, y de manera completamente preferida es de aproximadamente
63ºC.
Sin querer quedar vinculado por ninguna teoría,
el solicitante considera que el TGF-\beta, que se
encuentra esencialmente en forma latente en la solución inicial de
proteínas del lactosuero, se convierte en su forma activada
(biológicamente activa) después de la etapa b) del
procedimiento.
La combinación de parámetros de temperatura y de
pH anterior hace posible la realización de la etapa de precipitación
durante un tiempo corto, lo que permite evitar la degradación del
TGF-\beta. Así, la duración de la etapa b) de
precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10 minutos,
preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos y aún mejor entre 1
minuto y 3 minutos, y de manera totalmente preferida de
aproximadamente 2 minutos.
Cuando la etapa b) del procedimiento se realiza
durante 15 minutos a un pH de 7,0 y a 80ºC, se observa una
desnaturalización del TGF-\beta, siendo creciente
esta desnaturalización con la duración de la etapa de precipitación
más allá de 15 minutos.
El tratamiento térmico puede ser de cualquier
naturaleza. Se realiza preferentemente con ayuda de intercambiadores
térmicos de tipo tubular o incluso intercambiadores térmicos con
superficie raspada conocidos por el experto en la materia para el
tratamiento térmico de soluciones viscosas o de suspensiones tales
como los quesos frescos.
Según un modo de realización particular de la
etapa b) del procedimiento, la solución precipitada de
TGF-\beta se enfría rápidamente.
En efecto, el solicitante ha observado que un
enfriamiento rápido después de la precipitación influye
positivamente sobre la textura del precipitado obtenido y favorece,
en consecuencia, la realización de etapas posteriores del
procedimiento y, más particularmente, la etapa de microfiltración,
no debiendo ser el precipitado demasiado fino para no cegar la
membrana.
Preferentemente, el enfriamiento se efectúa en un
intercambiador térmico de placas o tubular con agua a temperatura
ambiente, preferentemente entre 20 y 30ºC, ventajosamente
aproximadamente 25ºC.
La duración de la etapa de enfriamiento está
comprendida preferentemente entre 1 y 20 minutos y, de manera
completamente preferida, entre 2 y 10 minutos.
Por tanto, el producto final de la etapa b) es un
líquido que contiene una suspensión de proteínas precipitadas que
incluyen el TGF-\beta en una solución de proteínas
no precipitadas del lactosuero.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa c) del
procedimiento
La suspensión de proteínas que contiene el
TGF-\beta en una solución de proteínas no
precipitadas del lactosuero obtenida en la etapa b) es microfiltrada
con diafiltración.
El precipitado es sometido a una etapa de
microfiltración con diafiltración a fin de eliminar la mayoría de
proteínas solubles restantes del lactosuero concentrando al mismo
tiempo la fracción proteica de interés que contiene mayoritariamente
el TGF-\beta.
A fin de evitar las pérdidas significativas de
TGF-\beta a la vez que se elimina una mayoría de
las proteínas solubles del lactosuero no deseadas, la
microfiltración se realiza con una membrana cuya distribución
gaussiana del tamaño de poro es estrecha.
Preferentemente, la microfiltración se realiza
con una membrana de microfiltración que presenta un tamaño medio de
poro comprendido entre 0,8 y 1,6 \mum y que posee una estrecha
distribución gaussiana de tamaño de poro.
De manera completamente preferida, la
microfiltración con diafiltración se realiza en unas condiciones de
presión transmembranaria uniforme en la totalidad de la superficie
de la membrana filtrante.
La recirculación a isocorriente del permeado
representa un primer modo de realización de la etapa de
microfiltración del procedimiento según la invención que permite la
obtención de una presión transmembranaria sustancialmente uniforme
sobre el conjunto de la superficie de la membrana del filtro.
Así, la recirculación a isocorriente del permeado
en la superficie externa del soporte de la membrana filtrante
permite la obtención de una pérdida de carga (diferencia entre la
presión de entrada y la presión de salida de los fluidos que
circulan desde cada lado de la membrana filtrante) idéntica en cada
uno de los compartimentos del filtro y, por tanto, una diferencia de
presión sustancialmente idéntica en cada punto dado de la membrana
filtrante, y esto sobre la totalidad de la superficie filtrante. La
técnica de recirculación del permeado a isocorriente se describe,
por ejemplo, en la patente sueca nº SW 74 16 257 (Sandblom).
Cuando se practica la recirculación del permeado
a isocorriente y se desea asegurar una presión transmembranaria
uniforme, se han obtenido los mejores resultados con membranas
minerales o cerámicas, tales como de alfa-alúmina,
comercializadas por la Société des Céramiques Techniques (Francia)
con la marca Membralox, o por la Société Orelis France con la marca
KERASEP o incluso las membranas de marca STERILOX.
Según otro aspecto, la membrana filtrante se
coloca sobre un soporte macroporoso con gradiente longitudinal de
permeabilidad. Este soporte posee una constitución tal que comprende
un gradiente tamaño de poroidad que disminuye de un extremo a otro
de la membrana filtrante.
Gracias a dicho soporte de filtro, la resistencia
hidráulica disminuye de un extremo a otro de la membrana filtrante,
lo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme
a lo largo de todo el camino membranario.
Tal tipo de filtro se realiza ventajosamente a
partir de cerámica, tal como el soporte de filtro descrito en la
solicitud de patente francesa nº FR 97 04 359.
Todavía según otro aspecto, se puede realizar
también una filtración membranaria dinámica, tal como se describe en
la patente francesa 93 06 321 (nº de publicación 2 692 441) por
ejemplo utilizando unas membranas orgánicas.
Según tal modo de realización del procedimiento
de la invención, la membrana filtrante y su soporte se colocan sobre
un eje rotativo, completándose dicho dispositivo por la disposición
de un disco giratorio a escasa distancia de la membrana de
microfiltración.
El giro del disco situado a escasa distancia
(aproximadamente 4 mm) de la membrana de microfiltración genera una
tensión de cizalladura de 50 a 100 veces más elevada que durante una
filtración tangencial clásica, actuando esta tensión de cizalladura
en las tres dimensiones (radial, tangencial y axial). En dicho
dispositivo, la generación de la tensión de cizalladura en la pared
está desacoplada de la presión transmembranaria. Dichos
procedimientos de filtración membranaria dinámica están descritos
asimismo en las patentes US nº 5.037.532, nº 3.997.447 y nº
4.956.102.
Preferentemente, la membrana de microfiltración
posee un tamaño medio tamaño de poro comprendido entre 1 y 1,6
\mum y, de manera completamente preferida, de aproximadamente 1,4
\mum, tal como en la comercializada por la sociedad EXEKIA bajo la
referencia "Stérilox, 1,4 \mum clásica", lo que requiere la
aplicación en el equipo de microfiltración de la recirculación a
isocorriente del microfiltrado a fin de obtener una presión
transmembranaria uniforme o bajo la referencia "Stérilox, 1, 4
\mum GP".
Preferentemente, la diafiltración se realiza con
agua osmotizada o con agua desmineralizada, filtrada de forma
estéril.
Preferentemente, la diafiltración se realiza
utilizando 1 a 6 diavolúmenes, preferentemente aproximadamente 4
diavolúmenes, a fin de obtener una eliminación máxima de las
proteínas solubles del lactosuero distintas del
TGF-\beta.
Preferentemente, la microfiltración con
diafiltración se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5,5,
preferentemente entre 4,3 y 5 y, de manera completamente preferida,
a un pH de aproximadamente 4,6, lo que permite conservar el
TGF-\beta en forma precipitada.
El ajuste del pH se efectúa con un ácido
concentrado, preferentemente, el HCI concentrado, ventajosamente a
la concentración 6N.
Los productos finales de la etapa de
microfiltración con diafiltración son, respectivamente:
- -
- por una parte, un retenido fuertemente enriquecido en TGF-\beta; y
- -
- por otra parte, un microfiltrado que contiene proteínas solubles del lactosuero. Por ejemplo, este microfiltrado contiene 8,0 g/l de dichas proteínas solubles para un contenido de materia seca de aproximadamente 8,8 g/l. Estas proteínas de lactosuero que no se han precipitado pueden concentrarse ventajosamente de nuevo por cualquier medio conocido por el experto en la materia, por ejemplo ultrafiltración sobre membrana, y pueden utilizarse, una vez concentradas, para la mayor parte de las aplicaciones convencionales del WPI.
Al final de la etapa de microfiltración con
diafiltración, se recupera el retenido de microfiltración y éste
constituye la fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta.
En general, el retenido de microfiltración
contiene de 6,5 a 17 \mug/l de TGF-\beta para 1
g de proteínas totales.
Ventajosamente, después de la recuperación, el
retenido de microfiltración se seca por cualquier medio conocido por
el experto en la materia (liofilización, atomización, etc.) con el
fin de obtener una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta en forma de un polvo.
El polvo de retenido contiene aproximadamente un
15% de las proteínas iniciales del lactosuero de la solución de
partida. Por tanto, el conjunto de las etapas del procedimiento
según la invención ha permitido eliminar el 85% de las proteínas del
lactosuero contenidas inicialmente en la solución de partida. En
este polvo, la tasa de TGF-\beta está comprendida
generalmente entre 6,5 y 17 \mug/g de polvo, lo que corresponde
aproximadamente a la recuperación del 70% del
TGF-\beta inicialmente contenido en la solución de
proteínas del lactosuero de partida. El contenido de
TGF-\beta2 con respecto al peso del polvo
corresponde a un contenido de TGF-\beta2 de 6
\mug a 15 \mug por gramo de proteínas totales contenidas en el
polvo.
Esta fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta puede utilizarse tal como, según el
caso, en asociación con uno o varios excipientes fisiológicamente
compatibles.
Esta fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta puede someterse asimismo a unas etapas
suplementarias de purificación a fin de llegar a un producto final
que posea un contenido incluso mayor de TGF-\beta
(microfiltración, centrifugación, acidificación, cromatografía).
Estas etapas suplementarias de purificación
permiten la eliminación de las proteínas insolubles del lactosuero,
que están constituidas mayoritariamente por
\alpha-lactalbúmina e inmunoglobulinas.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, la solución rica en proteínas del lactosuero de partida
se obtiene mediante la realización de las etapas siguientes:
- i)
- microfiltración tangencial de una leche desnatada sobre una membrana que tiene un tamaño medio tamaño de poro de 0,1 \mum en un equipo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme, y luego recuperación del microfiltrado;
- ii)
- concentración del microfiltrado obtenido en la etapa i) por microfiltración con diafiltración con ayuda de una membrana que tiene un poder de corte comprendido entre 5.000 daltons y 20.000 daltons, tal como las utilizadas corrientemente por el experto en la materia para la preparación de concentrados de proteínas a partir de lactosuero;
- iii)
- recuperación del retenido de ultrafiltración diafiltrado; y
- iv)
- facultativamente, dilución de las proteínas contenidas en el retenido de ultrafiltración diafriltrado a fin de obtener la solución de proteínas del lactosuero de partida, tal como la descrita en la presente invención.
Preferentemente, la microfiltración tangencial se
realiza con una membrana del tipo Membralox (constituida por
aluminio solo o por una mezcla de alúmina-circonia)
0,1 \mum clásica, lo que requiere la aplicación en el equipo de
microfiltración de la recirculación a isocorriente del microfiltrado
(concepto hidráulico dicho de la presión transmembranaria uniforme)
o una membrana Membralox 0,1 \mum de referencia GP, tales como las
comercializadas por la sociedad EXEKIA.
El retenido obtenido a continuación de la etapa
i) de microfiltración tangencial contiene mayoritariamente las
caseínas de la leche en forma micelar.
El microfiltrado obtenido a continuación de la
etapa i) contiene sustancialmente las proteínas solubles de la
leche, la lactosa, las formas nitrogenadas no proteicas y las sales
minerales solubles.
El microfiltrado obtenido en la etapa i) es
sometido a una etapa de ultrafiltración con diafiltración a fin de
concentrar las proteínas del lactosuero. Preferentemente, la
ultrafiltración se realiza con membranas que tienen un umbral de
corte comprendido entre 1 y 20 kD, preferentemente, aproximadamente
5 kD.
La diafiltración se realiza preferentemente con
agua osmotizada, estando comprendido el volumen de diafiltración
entre 2 y 6 diavolúmenes y siendo preferentemente de aproximadamente
4 diavolúmenes.
El ultrafiltrado contiene el nitrógeno soluble de
la leche (nitrógeno no proteico) así como lactosa y sales
minerales.
Por ejemplo, el retenido de ultrafiltración
recuperado en la etapa iii) contiene aproximadamente 200 g de
proteínas totales por litro de retenido.
Después de la recuperación del retenido, las
proteínas contenidas en este último se diluyen a fin de obtener la
solución de proteínas del lactosuero de partida. La dilución se
realiza preferentemente con agua osmotizada.
Según el caso, el retenido de ultrafiltración
recuperado en la etapa iii) que contiene las proteínas con la
concentración de 200 g/l puede secarse en forma de polvo antes de su
empleo como material de partida del procedimiento de obtención de
una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención.
Otro objeto de la invención consiste en una
fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta, caracterizada porque comprende un
contenido de TGF-\beta2 en forma activada superior
a 5 \mug/g de proteínas totales.
Preferentemente, la fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta anterior comprende un
contenido de TGF-\beta2 comprendido entre 6 \mug
y 15 \mug de TGF-\beta2 en forma activada por
gramo de proteínas totales.
Preferentemente, la fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta comprende un contenido de
TGF-\beta2 en forma activada comprendido entre 7
\mug y 13 \mug, ventajosamente entre 8 \mug y 12 \mug y, de
manera completamente preferida entre 9 \mug y 11 \mug de
TGF-\beta2 por gramo de proteínas totales.
El contenido de TGF-\beta2 de
la fracción proteica enriquecida según la invención puede ser
determinado fácilmente por el experto en la materia, por ejemplo
realizando un ensayo inmunológico con anticuerpos específicos del
TGF-\beta2, tal como el comercializado por la
sociedad R & D SYSTEMS (Barton Lane, Oxon, OX14345, Reino Unido)
bajo la marca QUANTIKINE®.
El solicitante ha demostrado que las proteínas
del lactosuero contenidas en la fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta están constituidas
mayoritariamente por \alpha-lactalbúmina e
inmunoglobulinas.
Así, la fracción proteica fuertemente enriquecida
en TGF-\beta según la invención contiene entre un
45 y un 80% en peso de \alpha-lactalbúmina y entre
10 y 25% de inmunoglobinas con respecto al peso total de la
fracción.
Además, esta fracción proteica enriquecida en
TGF-\beta está exenta prácticamente (menos del
11%) de \beta-lactoglobulina, una proteína bien
conocida por sus propiedades alergizantes.
El escaso contenido de
\beta-lactoglobulina en la fracción proteica
fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la
invención la hace apta para una utilización en el humano o en el
animal.
Además, sin querer vincularse por ninguna teoría,
el solicitante estima que el fuerte contenido de
\alpha-lactalbúmina de la fracción proteica
fuertemente enriquecida en TGF-\beta según la
invención puede reforzar significativamente las propiedades
terapéuticas del TGF-\beta.
En efecto, la
\alpha-lactalbúmina es rica en triptófano, puesto
que contiene cuatro residuos de este aminoácido por molécula de
proteína. La \alpha-lactalbúmina es la proteína de
la leche más rica en este aminoácido. El triptófano es el precursor
de la serotonina (5-hidroxitriptamina) y de la
melatonina. La serotonina posee propiedades sedantes y
antiestresógenas. La serotonina disminuye la ansiedad y favorece el
adormecimiento. No obstante, se admite actualmente que el estrés
juega un papel capital en el desarrollo de la psoriasis. En efecto,
los pacientes afectados de psoriasis están sometidos a un estrés
permanente. La combinación del TGF-\beta y de la
\alpha-lactalbúmina hace particularmente apta la
fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención para la preparación
de medicamentos contra la psoriasis.
Además, la \alpha-lactalbúmina
comprende un péptido que va del aminoácido en posición 50 hasta el
aminoácido en posición 53 y que posee propiedades morfinomiméticas.
Este péptido opioide derivado de la
\alpha-lactalbúmina se ha denominado
"\alpha-lactorfina" (véase H. CIBA y M.
YOSHIKAWA, Biologically Functional Peptides from Food Proteins: New
opioides peptides from milk proteins. Prot. Tail for Food and Med.
Uses, ed. M. DEKKA, N.Y., 1986, pgs: 123-153).
Además, la \alpha-lactalbúmina
posee propiedades bactericidas. Su hidrólisis en el tracto
intestinal por la tripsina y la quimotripsina engendra la producción
de péptidos bactericidas (véase, A. PELLEGRINI et al.,
Isolation and Identificantion of Fluid Bactericidal Domains in the
bovine \alpha-lactalbúmine molecule, Biochim.
Biophys. Acta, 1999, 1426:439-448). Las
propiedades bactericidas de la \alpha-lactalbúmina
pueden ser beneficiosas en pacientes afectados de psoriasis. En
efecto, agentes patógenos tales como los estreptococos y los
estafilococos producen superantígenos que son toxinas bacterianas
que provocan una activación y una hiperproliferación de linfocitos T
de la sangre, lo que conduce a una afluencia de linfocitos T
activados al nivel de la piel. De esta afluencia resulta una
activación y una proliferación de queratinocitos, proliferación
celular en la base de la psoriasis.
Sin querer vincularse por ninguna teoría, el
solicitante piensa que la actividad bactericida de la
\alpha-lactalbúmina puede limitar la proliferación
de los queratinocitos a continuación de una infección bacteriana y,
en consecuencia, potenciar los efectos antipsoriasis del
TGF-\beta.
Además, la presencia de
\alpha-lactalbúmina, en asociación con el
TGF-\beta, puede aumentar la estabilidad del
TGF-\beta en una fracción proteica o en una
composición según la invención y, en particular, proteger el
TGF-\beta de las diversas degradaciones por las
enzimas proteolíticas, por ejemplo cuando la fracción o la
composición es administrada a un paciente.
Otro objeto de la invención consiste en una
composición farmacéutica que comprende una fracción proteica
fuertemente enriquecida en TGF-\beta, tal como se
ha definido anteriormente, en asociación, según el caso, con uno o
varios excipientes fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica según la invención
se caracteriza además porque contiene una cantidad terapéuticamente
eficaz de TGF-\beta.
Según otra característica, una composición
farmacéutica según la invención contiene una cantidad
terapéuticamente eficaz de una asociación entre el
TGF-\beta y la
\alpha-lactalbúmina.
Cuando está destinada a una administración
tópica, una composición farmacéutica según la invención comprende
preferentemente entre 1 nanogramo y 1 mg de
TGF-\beta2 por dosis, más preferentemente entre 10
nanogramos y 100 \mug de TGF-\beta2 por dosis y,
de manera completamente preferida, entre 50 nanogramos y 20 \mug
por dosis.
Cuando está destinada a administrarse de manera
sistémica, una composición farmacéutica según la invención se adapta
para una administración cotidiana entre 1 nanogramo y 500 \mug de
TGF-\beta2 por kg de peso del paciente,
preferentemente entre 80 nanogramos y 100 \mug por kg de peso del
paciente y, de manera completamente preferida, entre 1 \mug y 20
\mug por kg de peso del paciente.
Una composición farmacéutica según la invención
puede presentarse en forma de comprimidos, pastillas, cápsulas,
bolsitas de polvo, soluciones para preparaciones inyectables,
lociones, pomadas, cremas dérmicas, aerosoles, ungüentos, vendas,
emulsiones, aerosoles de utilización intranasal o bronquial,
implantes, o incluso pastas dentífricas o colutorios bucales.
Una composición farmacéutica según la invención
puede aplicarse por vía tópica. Dicha composición farmacéutica puede
administrarse asimismo de forma local o por vía sistémica.
En particular, una composición farmacéutica tal
como la definida anteriormente puede administrarse por vía oral,
enteral, parenteral, intradérmica, subcutánea o incluso por vía
intravenosa.
Una composición farmacéutica según la invención
comprende asimismo, además de una cantidad terapéuticamente eficaz
de TGF-\beta2 o de una combinación de
TGF-\beta2 y
\alpha-lactalbúmina, diluyentes, conservantes,
agentes de solubilización, agentes emulsionantes, adyuvantes o
vehículos fisiológicamente compatibles. Dichas composiciones pueden
presentarse en forma líquida o sólida. Pueden presentarse en forma
de formulaciones liofilizadas o de formulaciones de polvo seco.
Dichas composiciones farmacéuticas comprenden
ventajosamente diluyentes tamponados (por ejemplo,
tris-HCI, acetato, fosfato), aditivos tales como
albúmina o gelatina a fin de impedir su absorción sobre superficies,
detergentes (por ejemplo, Tween 20®, Tween 80®, Pluronic S68®, sales
de ácidos biliares, agentes de solubilización (por ejemplo, alcohol
bencílico), agentes de carga o compuestos modificadores de tonicidad
(por ejemplo, lactosa, manitol).
Una composición farmacéutica según la invención
puede presentarse asimismo en forma de formulaciones a base de
partículas de compuestos polímeros tales como ácido poliáctico,
ácido poliglicólico, polivinilpirrolidona, o incluso en forma de
liposomas, microemulsiones, micelas o incluso vesículas unilaminares
o multilaminares.
De manera facultativa, una composición
farmacéutica según la invención puede comprender otros
constituyentes: aditivos tales como antioxidantes como ácido
ascórbico, polipéptidos de poco peso molecular (menos de 10
aminoácidos) tales como poliargininas. Puede comprender asimismo
aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o
arginina. Puede comprender también agentes quelatantes tales como
EDTA. Puede comprender también azúcares hidroxilados tales como
manitol o sorbitol.
Para composiciones farmacéuticas de liberación
controlada o de liberación retardada, se añadirán ácidos grasos,
ceras o aceites. Forman parte asimismo de la invención unas
composiciones farmacéuticas en forma de partículas en las cuales la
fracción proteica enriquecida en TGF-\beta está
recubierta de polímeros tales como poloxámeros o poloxaminas.
Las composiciones para formulación tópica
engloban geles, cremas, soluciones, emulsiones, incluyendo polímeros
de carbohidratos o matrices biodegradables de éstos. Para la
realización de una composición farmacéutica según la invención, la
fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta puede encapsularse en una cera, una
película o un vehículo sólido, incluida una goma de mascar.
La fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta puede inmovilizarse asimismo a fin de
impedir su dilución por la saliva, por medio de agentes tales como
la metilpropilcelulosa.
Una composición farmacéutica según la invención
posee numerosas aplicaciones clínicas adicionales, algunas de las
cuales se indican a continuación de manera no limitativa.
El TGF-\beta tiene notables
propiedades cicatrizantes. Una fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta según la invención puede
aplicarse ventajosamente en el tratamiento de la cicatrización de
llagas externas o internas, según el caso después de una
intervención quirúrgica, o incluso en el tratamiento de escaras o
bien en la consolidación del hueso después de su fractura.
Una fracción proteica según la invención puede
aplicarse asimismo en el tratamiento de la osteoporosis debido a los
efectos del TGF-\beta sobre los osteoclastos y los
osteoblastos, provocando una inducción de la formación del cartílago
y del hueso.
Debido al efecto inhibidor del
TGF-\beta sobre la proliferación de las células
epiteliales, una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención puede aplicarse
ventajosamente para el tratamiento de melanomas, mielomas y
linfomas.
La fracción proteica de la invención puede
utilizarse ventajosamente en asociación con la vitamina D3 y los
retinoides para el tratamiento de ciertas formas de leucemias. Puede
aplicarse ventajosamente para luchar contra ciertas formas de
cánceres, en particular en los cánceres de mama.
Además, la fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta según la invención puede
utilizarse asimismo para la preparación de un medicamento destinado
a la prevención o al tratamiento de diversas enfermedades
autoinmunes.
Puede aplicarse ventajosamente también a la
prevención o al tratamiento del lupus eritematoso, que es una
afección de la piel caracterizada por la presencia de manchas o
placas rojas recubiertas de escamas, por una hiperqueratosis, por un
proceso inflamatorio ligado a una infiltración y una activación de
los linfocitos T en la dermis, y que conduce a la producción de
autoanticuerpos. El lupus eritematoso es el prototipo de las
enfermedades autoinmunes. La administración de una composición
farmacéutica según la invención a los pacientes afectados de lupus
eritematoso, por vía oral, es susceptible de mejorar
significativamente el estado general de estos enfermos.
Ventajosamente, una fracción proteica fuertemente
enriquecida en TGF-\beta según la invención puede
utilizarse también para la preparación de un medicamento destinado a
la prevención o al tratamiento de la psoriasis. La psoriasis es una
dermatosis de evolución crónica caracterizada por una
hiperproliferación de queratinocitos asociada a anomalías de su
maduración. La proliferación de queratinocitos psoriásicos se
manifiesta por un aumento del número de mitosis y un acortamiento
del ciclo celular. Además, la epidermis psoriásica es la sede de un
infiltrado inflamatorio debido a una afluencia de linfocitos T
activados y a la liberación de citoquinas proinflamatorias. Debido
a estas propiedades citostáticas antiinflamatorias e
inmunosupresoras, la fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención, cuando es
administrada por vía oral, constituye un tratamiento de fondo de la
psoriasis.
Puede constituir también un tratamiento de otras
afecciones tales como la artritis reumática, la osteoartritis, la
miastemia grave, la uveitis. Puede contemplarse también su
utilización durante trasplantes de órganos a fin de evitar, o por lo
menos reducir, los rechazos de injertos.
Una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención puede utilizarse
asimismo para la fabricación de un medicamento destinado a la
prevención o al tratamiento de la enfermedad de Crohn. Esta afección
se caracteriza por una inflamación del intestino, una alteración de
la regulación de los antígenos del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) de clase II. La inflamación intestinal
está ligada a un aumento de la expresión de los antígenos del MHC de
clase II en el epitelio intestinal. Ésta es el resultado de un
ataque autoinmunitario del intestino o de perturbaciones de la
regulación inmunitaria.
Dicha composición farmacéutica, cuando es
administrada por vía oral, constituye un tratamiento de fondo de la
enfermedad de Crohn.
Por tanto, la invención tiene asimismo por objeto
la utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta tal como se ha definido anteriormente
para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o el
tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus
eritematoso, la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la artritis
reumática, la osteoartritis, la miastemia grave o la uveitis.
Se refiere asimismo a la utilización de una
fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta para la preparación de un medicamento
destinado a la prevención o al tratamiento de los rechazos de
injertos.
La invención se refiere asimismo a la utilización
de una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta tal como se ha definido anteriormente
para la preparación de un medicamento que favorece la
cicatrización.
Se refiere asimismo a la utilización de una
fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención para la preparación
de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la
osteoporosis.
Según otro aspecto, la invención se refiere a la
utilización de una fracción proteica fuertemente enriquecida en
TGF-\beta según la invención para la preparación
de un medicamento oncostático.
\newpage
La invención es ilustrada además, sin quedar
limitada por ello, mediante los siguientes ejemplos:
10.000 kg de leche desnatada con un contenido de
materia seca de 92,9 g/kg y un contenido de N x 6,38 de 35,4 g/kg
fueron introducidos a 50ºC dentro de un equipo de microfiltración
que comprendería 4,6 m^{2} de membrana 0,1 \mum Membralox®
(alúmina-circonia) y que funcionaba con
recirculación del microfiltrado a isocorriente a fin de obtener una
presión transmembranaria uniforme igual a 0,6-0,7
bares.
La velocidad de barrido en el compartimento
retenido se fijó en 7 m/s.
El caudal de extracción del microfiltrado se fijó
en 345 l/h. El caudal de extracción del retenido se fijó en 172,5
l/h.
Los 6.670 l de microfiltrado obtenidos con un
contenido de materia seca de 57,8 g/kg y un contenido de N x 6,38 de
6,4 g/kg se enfriaron a 10ºC y se introdujeron en un equipo de
ultrafiltración que comprendía 9,6 m^{2} de membrana Koch®, de
concepción espiral y con un poder de corte de 5 kD. La presión de
salida se fijó en 3,4 bares.
El caudal de extracción del ultrafiltrado se fijó
en 250 l/h y el del retenido en 12,5 l/h. Los 334 l de retenido
fueron adicionados continuamente con 1.336 l de agua osmotizada
hasta la eliminación de este volumen de agua añadido en forma de
ultrafiltrado.
El retenido diafiltrado final así obtenido tenía
un contenido de proteínas (N x 6,38) de 101,0 g/kg y un contenido de
materia seca de 106,3 g/kg. Fue utilizado inmediatamente para la
preparación de la fracción enriquecida en
TGF-\beta o bien fue congelado a -30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron 200 kg del retenido diafiltrado
obtenido en el ejemplo 1 hasta 2.000 l con agua osmotizada a la
temperatura de 20ºC en una cuba equipada con un agitador de
palas.
Después de 10 minutos de agitación, se añadieron
progresivamente 1.800 ml de HCI 6N hasta un descenso del valor del
pH de 7,25 a 4,6. La agitación fue proseguida durante
10-15 minutos.
La solución fue tratada térmicamente a
63ºC-2 minutos y enfriada a 25ºC en un equipo
Actijoule® por alícuotas de 1.000 l. Los 2.000 l de suspensión
obtenidos, llevados a 35ºC, fueron seguidamente microfiltrados de
forma continua en un equipo que comprendía 4,6 m^{2} de membranas
Sterilox® con un diámetro medio tamaño de poro de 1,4 \mum, con
recirculación a isocorriente del microfiltrado a fin de obtener una
presión transmembranaria uniforme comprendida entre 0,4 y 0,8 bares,
en 4 h 30.
El caudal de extracción del microfiltrado se fijó
en 400 l/h. No se realizó ninguna extracción del retenido.
Cuando el volumen del retencito estaba próximo al
volumen muerto del equipo de microfiltración, se añadieron
continuamente 320 l de agua osmotizada y se extrajeron éstos en
forma de microfiltrado.
Los 53 kg de retenido diafiltrado obtenidos
tenían un contenido de materia seca de 39,96 g/kg, un contenido de
proteínas (N x 6,38) de 39,14 g/kg y un contenido de
TGF-\beta de 430,5 \mug/kg (o bien 11 \mug/kg
de proteína). Fueron congelados a -30ºC y liofilizados por alícuotas
de 10 kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió 1 mg del polvo liofilizado obtenido
en el ejemplo 2 en 1 ml de agua miliQ y luego se diluyó 5 veces en
el tampón A. El equipo analítico utilizado era un cromatógrafo CLHP
Waters 600 E equipado con una columna "source RPC 3 ml"
(Pharmacia®).
\newpage
Los dos tampones utilizados fueron:
- Tampón A: Ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%
- Tampón B: TFA 0,09% en acetonitrilo 90%
Se inyectaron 50 \mul de producto y se realizó
la elución con un gradiente de 30 a 100% de tampón B en 30 m al
caudal de 2 ml/m (a temperatura ambiente). La detección se realizó a
214 nm. El tratamiento de áreas cromatográficas se realizó con ayuda
del programa informático Nelson®, lo que permitió estimar los
contenidos con respecto a las proteínas totales: 53 de
\alpha-lactalbúmina, 0,03% de seroalbúmina, 10,9%
de \beta-lactoglobulina, 18,3% de
inmunoglobulinas.
El contenido de TGF-\beta2 de
las fracciones enriquecidas fue determinado por un método de
inmunoensayos utilizando anticuerpos monoclonales específicos del
TGF-\beta2 (Kits Quantikine comercializados por R
& D Systems (Barton Lane, Oxon, OX14 3YS UK).
Claims (18)
1. Procedimiento de obtención de una fracción
proteica enriquecida en TGF-\beta en forma
activada, a partir de una solución rica en proteínas solubles de la
fase acuosa de la leche, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas siguientes:
- a)
- ajustar las proteínas solubles purificadas a una concentración de 5 a 30 g/litro de solución;
- b)
- precipitar una parte de las proteínas del lactosuero por tratamiento ácido de la solución a un pH comprendido entre 4 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 55ºC y 68ºC;
- c)
- microfiltrar con diafiltración la suspensión precipitada a fin de obtener respectivamente un retenido de microfiltración y un microfiltrado;
- d)
- recuperar el retenido de microfiltración que contiene la fracción proteica fuertemente enriquecida en TGF-\beta;
- e)
- secar el retenido de microfiltración, diafiltrado, a fin de obtener un polvo fuertemente enriquecido en TGF-\beta.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etapa b) de precipitación se realiza
a un pH comprendido entre 4 y 5 y, preferentemente, a un pH de
aproximadamente 4,6.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la etapa b) de
precipitación se realiza a una temperatura comprendida entre 55ºC y
68ºC y, preferentemente a aproximadamente 63ºC.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la duración de
la etapa b) de precipitación está comprendida entre 30 segundos y 10
minutos y preferentemente entre 30 segundos y 5 minutos, y de manera
completamente preferida es de aproximadamente 2 minutos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque al final de la
etapa b) la solución líquida es enfriada rápidamente.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la
microfiltración de la etapa c) se realiza sobre una membrana que
presenta un tamaño medio tamaño de poro comprendido entre 0,8 y 1,6
\mum y que posee una estrecha distribución de tamaños tamaño de
poro, y en un equipo que conduce a la obtención de una presión
transmembranaria uniforme.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la diafiltración
de la etapa b) se realiza con agua osmotizada o agua desmineralizada
filtrada.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la
microfiltración con diafiltración se realiza a un pH comprendido
entre 4 y 5,5, preferentemente de aproximadamente 4,6.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la solución rica
en proteínas del lactosuero de partida es obtenido por la
realización de las etapas siguientes:
- i)
- microfiltración tangencial de una leche desnatada sobre una membrana de microfiltración que tiene un tamaño medio tamaño de poro de 0,1 \mum y en un equipo que permite la obtención de una presión transmembranaria uniforme, y después recuperación del microfiltrado;
- ii)
- concentración del retenido obtenido en la etapa i) por ultrafiltración con diafiltración; y
- iii)
- recuperación del retenido de ultrafiltración diafiltrado.
10. Fracción proteica enriquecida en
TGF-\beta susceptible de ser obtenida mediante el
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizada porque comprende un contenido en
TGF-\beta2 en forma activada superior a 5 \mug
por gramo de proteínas totales del lactosuero, y porque las demás
proteínas del lactosuero están constituidas mayoritariamente por
\alpha-lactalbúmina.
11. Fracción proteica según la reivindicación 10,
caracterizada porque contiene entre 45% y 80% en peso de
\alpha-lactalbúmina con respecto al peso total de
dicha fracción.
12. Composición farmacéutica que comprende una
fracción proteica según una de las reivindicaciones 10 y 11, si
fuera necesario en asociación con uno o varios excipientes
fisiológicamente compatibles.
\newpage
13. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un
medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de
enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematoso, la
psoriasis o la enfermedad de Cronh.
14. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11 para la preparación de un
medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de la
artritis reumática, la osteoartritis, la miastemia o la uveitis.
15. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un
medicamento que favorece la cicatrización.
16. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un
medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de la
osteoporosis.
17. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un
medicamento oncostático.
18. Utilización de una fracción proteica según
una de las reivindicaciones 10 y 11, para la preparación de un
medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de rechazos
de injertos.
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