DE60210304T2

DE60210304T2 - Verfahren zur herstellung einer proteinhaltigen fraktion, mit beta-tgf in aktivierter form bereichert, sowie die so erhaltene fraktion und deren therapeutische verwendungen

Info

Publication number: DE60210304T2
Application number: DE60210304T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Maubois; Jacques Fauquant; Pierre Jouan; Michel Bourtourault
Original assignee: PIERRE JOUAN BIOTECHNOLOGIES SA; Pierre Jouan Biotechnologies SA
Current assignee: PIERRE JOUAN BIOTECHNOLOGIES SA; Pierre Jouan Biotechnologies SA
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2022-07-13
Also published as: US7141262B2; FR2827290B1; DE60210304D1; US20050250698A1; US20050250697A1; ATE321781T1; US20040097714A1; AU2002329364B2; JP2005506316A; AU2002329364B8; NZ529180A; CA2434303C; EP1409539B1; ES2258154T3; US8937043B2; FR2827290A1; DK1409539T3; WO2003006500A1; EP1409539A1; CA2434303A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Reinigung des βTGF-Faktors aus einem Milchrohstoff.
STAND DER TECHNIK
Milch, insbesondere die Milch des Menschen und die Milch aller Weibchen von Säugetieren, enthält zahlreiche biologisch aktive Polypeptide, insbesondere zahlreiche Wachstumsfaktoren. Einer der in der Milch enthaltenen Wachstumsfaktoren ist TGF-β (für „Transforming Growth Factor beta).
Der Begriff TGF-β bezeichnet eine Familie, umfassend diverse Wachstumsfaktoren. Die TGF-β1 und TGF-β2 sind die beiden homologen Formen des TGF-β. Es handelt sich um homodimere Bestandteile, die von zwei Peptidketten von jeweils 112 Aminosäuren gebildet sind, die identisch und untereinander mit Hilfe einer Disulfidkettenbrücke verbunden sind. Ihr Molekulargewicht beträgt 25.000 Dalton. Die Polypeptide TGF-β1 und TGF-β2 weisen 72 % Strukturhomologie auf, und ihre biologischen Eigenschaften sind identisch. Es besteht eine völlige Identität in der Aminosäurensequenz der TGF-β2 menschlichen Ursprungs oder der Rinder.
Die TGF-β können durch Genrekombination in gereinigter Form erhalten werden. Aber die Präparate von rekombinanten TGF-β können einen geringen Anteil an bakteriellen Proteinen enthalten, von denen manche Allergien hervorrufen. Ferner enthalten gereinigte Präparate von rekombinanten TGF-β per Definition kein zugehöriges Milchprotein, das den biologischen Effekt des TGF-β ergänzen oder potenzieren könnte.
Die Milch der Kuh enthält sowohl TGF-β1 als auch TGF-β2. Der TGF-β2 ist mehrheitlich vorhanden und stellt 90 Gew.-% des in der Milch zu findenden TGF-β dar, wobei der TGF-β1 seinerseits 10 Gew.-% des Gesamtinhalts an TGF-β der Milch darstellt.
In der Milch sind mehr als 90 % des TGF-β2 in einer latenten Form vorhanden, d.h. in einer nicht biologisch aktiven Form.
Diverse akademische Studien zeigten, dass die Rate an TGF-β2 in der Milch 12 bis 150 μg/l im Kolostrum von 3,7 bis 3,8 μg/l in der rohen Milch und in der pasteurisierten Milch, 4,3 μg/l in der entrahmten Milch und 3,7 μg/l im Laktoserum betrug.
Der TGF-β besitzt ein breites biologisches Wirkungsspektrum, das diesem Polypeptid ein großes therapeutisches Interesse in der Prävention oder Behandlung einer großen Vielfalt von Erkrankungen oder Krankheiten verleiht.
Der TGF-β ist biologisch aktiv auf der extrazellulären Matrix. Der TGF-β stimuliert die Synthese der Matrixproteine und erhöht die Synthese des Kollagens und des Fibronektins in den Fibroblasten. Er hemmt auch die Synthese von proteolytischen Enzymen, wie beispielsweise die Kollagenase und die Metalloproteasen. Der TGF-β erhöht die Sekretion von Hemmstoffen der Proteasen, wie beispielsweise des Hemmstoffes des Aktivators des Plasminogens oder auch der Hemmstoffe von Metalloproteasen.
Der TGF-β übt auch eine biologische Aktivität auf das Skelett aus. Insbesondere ist der TGF-β in starken Konzentrationen im Knochen vorhanden. Er spielt eine Rolle bei der Knorpelbildung und stimuliert die Resorption der Osteoklasten sowie die Aktivierung der Osteoblasten. Er wirkt als natürlicher Hemmstoff der Knochenresorption und als ein Stimulator der Knochenbildung.
Der TGF-β ist auch auf den Lymphozyten aktiv. Zum Beispiel hemmt der TGF-β das Wachstum der T-Lymphozyten und begünstigt die Aktivität der Killerzellen, „Natural Killers" genannt.
Der TGF-β ist auch ein stark entzündungshemmender Wirkstoff. Er verringert die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen. Er besitzt Immunsuppressionseigenschaften und hemmt das Wachstum der aktivierten T-Lymphozyten.
Ferner besitzt der TGF-β wachstumshemmende Wirkung. Er ist ein starker Hemmstoff für die Epithelialzellen. Er übt auch eine starke antimitogene Aktivität gegenüber den Mesenchymalzellen, den Embryonalfibroblasten, den Endothelialzellen sowie den T- und B-Lymphozyten aus. Er ist auch ein starker Hemmstoff für das Wachstum der Hepatozyten und könnte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Quieszenz derselben spielen. Der TGF-β wirkt auch als ein Faktor zur Negativregulierung des Mammaepithels.
Der TGF-β besitzt auch Krebs hemmende Wirkung. Während der Krebsentstehung können die Krebszellen ihre Fähigkeit, auf den TGF-β zu antworten, verlieren. Dennoch sind manche Tumoren mit Epithelialzel len für die wachstumshemmenden Wirkung des TGF-β sensibel. Die ist bei den Zellen des Brustkrebses der Fall.
Überdies wirkt der TGF-β auf das Wachstum und die Differenzierung der Leukämiezellen. Er hemmt das Wachstum der promyelozytären Zellen. Er könnte in Synergie mit der Retinolsäure und dem Vitamin D3 wirken.
Die europäische Patentanmeldung EP 0 527 283 im Namen der Firma der Produkte NESTLE S.A. beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Milchderivatproduktes, das TGF-β enthält, bei dem Vollmilch durch Zentrifugieren entrahmt, auf einer Säule PD-10 (Pharmacia) entsalzt und dann durch Filtration auf einer Membran „Millipore" mit einem Porendurchmesser gleich 0,2 μm sterilisiert wird. Dann wird die entrahmte Milch sterilisiert und auf einen pH-Wert 4 mit Hilfe einer Lösung HCl 1N eingestellt, dann bei 40.000 g 60 Minuten lang zentrifugiert, um das ausgefällte Kasein vom Laktoserum zu trennen. Das so abgetrennte Laktoserum wird durch Natrium 1N neutralisiert und dann dialysiert. Allerdings ist dieses Verfahren, das es ermöglicht, das Kasein aus der entrahmten ursprünglichen Milch zu entfernen, kein Verfahren zur Reinigung des TGF-β. Es führt nämlich zu einem Endprodukt, das die Gesamtheit der Proteine des ursprünglichen Laktoserums enthält, in dem der TGF-β vorhanden ist, aber ohne signifikante Anreicherung des Gehalts an diesem Molekül.
Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren zur Herstellung von mit TGF-β angereicherten Proteinfraktionen aus Milch beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung EP 0 313 515 im Namen von CIBA GEIGY beschreibt ein Verfahren zur Reinigung eines in der Milch enthaltenen Wachstumsfaktors, das nacheinander Schritte der Chromatographie einsetzt, wobei insbesondere Kationen austauschende Harze, Träger für hydrophobe Interaktionschromatographie (HPLC-RP) oder auch chromatografische Exklusionsträger durch die Größe verwendet werden.
Die Anmeldung PCT WO 01 25.276 im Namen von CAMPINA MELKUNIE B.V. beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von TGF-β und Wachstumsfaktoren analog zu Insulin (IGF-1) aus einem Milchprodukt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte, darin bestehend:

a) eine Basisfraktion des Milchproduktes durch Chromatographie mit Kationenaustausch wiederzugewinnen;
b) die in Schritt a) erhaltene Fraktion in eine Hydroxyapatitsäule zu schicken;
c) die Hydroxyapatitsäule mit Hilfe von geeigneten Eluierungsmitteln zu eluieren, um insbesondere eine Fraktion zu erhalten, die TGF-β im Wesentlichen ohne IGF-1 enthält.

Die oben beschriebenen Verfahren weisen alle technische Nachteile auf. Die Reinigungsverfahren des TGF-β, die aufeinander folgende Chromatografieschritte einsetzen, sind lang und langwierig. Ferner verringert die große Anzahl von Chromatografieschritten, die für den Erhalt des gewünschten Reinigungsgrades notwendig sind, wesentlich das Endergebnis auf Grund der progressiven Verschlechterung des TGF-β während der Reinigungszeit und des unvermeidlichen Verlustes an biologisch aktivem TGF-β bei jedem der chromatografischen Schritte. Außer der Verwendung von Salzlösungen und Regenerationslösungen, die hoch verschmutzend sind, was dann beseitigt werden muss, weisen diese Verfahren eine hohe Gefahr der bakteriellen Kontamination des Endproduktes auf.
Es besteht im Stand der Technik somit ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Reinigung des TGF-β aus einem Milchprodukt, das die oben für die Verfahren des Standes der Technik beschriebenen Nachteile nicht aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer mit TGF-β in aktivierter Form stark angereicherten Proteinfraktion aus einer flüssigen Lösung reich an so genannten löslichen Proteinen der wässerigen Phase der Milch und/oder des Laktoserums, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Anpassung der gereinigten löslichen Proteine an eine Konzentration von 5 bis 30 g/l Lösung;
b) Ausfällung eines Teils der Proteine des Laktoserums durch Säurebehandlung der Lösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 und bei einer Temperatur zwischen 55°C und 68°C;
c) Mikrofilterung mit Diafilterung der ausgefällten Lösung, um ein Mikrofiltrationsretentat bzw. ein Mikrofiltrat zu erhalten;
d) Wiedergewinnung des Mikrofiltrationsretentats, das die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion enthält;
e) Trocknen des diagefilterten Mikrofiltrationsretentats, um ein stark mit TGF-β angereichertes Pulver zu erhalten.

Vorzugsweise erfolgt der Schritt der Anpassung a) durch Verdünnung einer Lösung, die die löslichen Proteine der Milch enthält, wie beispielsweise ein Isolat von Proteinen des Laktoserums; auch bezeichnet als „WPI".
Vorzugsweise erfolgt der Schritt der Ausfällung b) bei einer Temperatur zwischen 60°C und 68°C und ferner vorzugsweise bei ungefähr 63°C.
Vorzugsweise beträgt die Dauer des Schrittes der Ausfällung b) zwischen 30 Sekunden und 10 Minuten, vorzugsweise zwischen 30 Sekunden und 5 Minuten und auf noch bevorzugtere Weise ungefähr 2 Minuten.
Auf bevorzugte Weise erfolgt die Mikrofilterung des Schrittes c) auf einer Mikrofiltrationsmembran mit einer durchschnittlichen Porengröße zwischen 0,8 und 1,6 μm, die eine enge Verteilung der Porengröße besitzt.
Die Erfindung betrifft auch die Gewinnung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion, die durch das oben erwähnte Verfahren gewonnen werden kann und einen Gehalt an TGF-β2 in aktivierter Form über 5 μg pro Gramm von Gesamtproteinen des Laktoserums aufweist, wobei die anderen Proteine des Laktoserums mehrheitlich von a-Laktalbumin gebildet sind.
Sie betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Proteinfraktion, wie oben definiert, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch kompatiblen Exzipienten.
Sie betrifft auch die Verwendung einer Proteinfraktion, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung diverser Pathologien, bei denen der TGF-β eine Verbindung von therapeutischem Interesse darstellt.
BESCHREIBUNG DER EINZIGEN FIGUR
1 stellt ein Schema des Verfahrens zur Gewinnung einer erfindungsgemäßen mit TGβ angereicherten Proteinfraktion dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Anmelder entwickelte ein einfaches und rasches Verfahren zur Gewinnung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion aus einer flüssigen Lösung reich an Proteinen des Laktoserums.
Unter „TGF-β" ist eine Verbindung oder eine Mischung von TGF-β, umfassend mindestens 90 Gew.-% TGF-β2, und höchstens 10 Gew.-% von TGF-β1 zu verstehen.
Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße Verfahren eine geringe Anzahl von Schritten von kurzer Dauer, wodurch es möglich ist, einen signifikanten Verlust der biologischen Aktivität des TGF-β auf Grund einer Verschlechterung dieses Proteins in der Zeit während des Reinigungsverfahrens zu vermeiden.
Ferner umfasst das erfindungsgemäße Verfahren keinen Schritt der Chromatographie, der die aufeinander folgende Adsorption der Proteine von Interesse auf mehreren Trägern, dann ihre Desorption von den Trägern durch Elution erfordert, die obligatorisch zu einem signifikanten Verlust des TGF-β und somit zu schädlichen Folgen für die Endleistung des Verfahrens führt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer mit TGF-β in aktivierter Form angereicherten Proteinfraktion aus einer flüssigen Lösung reich an Proteinen des Laktoserums, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Anpassung der gereinigten Proteine des Laktoserums an eine Konzentration von 5 bis 30 g/l Lösung;
b) Ausfällung eines Teils der Proteine des Laktoserums durch Säurebehandlung der flüssigen Lösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 und bei einer Temperatur zwischen 55°C und 68°C;
c) Mikrofilterung mit Diafilterung der so behandelten Lösung, um ein Mikrofiltrationsretentat bzw. ein Mikrofiltrat zu erhalten;
d) Wiedergewinnung des Mikrofiltrationsretentats, das die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion enthält;
e) Trocknen des diagefilterten Mikrofiltrationsretentats, um ein stark mit TGF-β angereichertes Pulver zu erhalten.

Die Ausgangslösung reich an Proteinen des Laktoserums kann jeglicher Natur sein. Vorzugsweise handelt es sich um ein Isolat von Proteinen des Laktoserums (auch WPI genannt, für „Why proteins isolate"), das durch jede dem Fachmann bekannte Methode hergestellt werden kann.
Die Lösung reich an Proteinen des Laktoserums hat vorzugsweise folgende Zusammensetzung:
Stickstoffhaltige Gesamtmaterie: 10 g/kg
Trockenextrakt: 10,4 g/kg
D.h. 96 % Proteine im Trockenextrakt.
Verfahrensschritt a)
Der Verfahrensschritt a) besteht vorzugsweise in einer Verdünnung der Proteine mit osmotisiertem Wasser, um eine Konzentration von 5 bis 30 g Proteine pro Kilogramm Lösung zu erhalten.
Verfahrensschritt b)
Der Verfahrensschritt b) besteht in einem Schritt aus der fraktionierten Ausfällung der Proteine des Laktoserums unter Betriebsbedingungen, die eine selektive Ausfällung der Proteinfraktion ermöglichen und die gleichsam die Gesamtheit des ursprünglich in der flüssigen Lösung reich an Proteinen des Laktoserums, beispielsweise einem WPI, enthaltenen TGF-β umfassen.
Dieses Ziel wurde vom Anmelder dadurch erreicht, dass gewisse Parameter von pH-Wert und Temperatur kombiniert wurden.
Erfindungsgemäß wurde herausgefunden, dass es die Anwendung von nur einem der Parameter, nämlich dem pH-Wert oder der Temperatur, nicht ermöglicht, den gewünschten Ausfällungsgrad der Proteine zu erzielen.
Wenn der Schritt b) bei einer Temperatur unter 55°c erfolgt, wird die Ausfällung der Proteinfraktion reich an TGF-β nicht erzielt. Ebenso wenn die Behandlungstemperatur über 68°C liegt, und auch bei steigenden Temperaturen ist die Co-Ausfällung einer immer größeren Fraktion der Proteine des Laktoserums mit dem TGF-β zu beobachten. So wird bei Temperaturen über 70°C gleichsam die Gesamtheit der Proteine des Laktoserums, die ursprünglich in der Ausgangslösung enthalten sind, ausgefällt, und die selektive Anreicherung mit TGF-β wird nicht erzielt.
Zum Beispiel sind bei einem pH-Wert von 4,6 die beobachteten Ausfällungsergebnisse bei steigenden Temperaturen in der nachfolgenden Tabelle 1 angeführt.
Die nachfolgende Tabelle 1 fasst die Entwicklung der Ausfällung des TGF-β und der Proteine des Laktoserums bei einem pH-Wert von 4,6 in Abhängigkeit von der Intensität der Wärmebehandlung (Behandlungsdauer: 2 Minuten) zusammen. TABELLE 1

^a Prozentsatz des TGF-β, der ursprünglich in der flüssigen Lösung reich an Proteinen des Laktoserums (WPI) enthalten ist, der in der ausgefällten Proteinfraktion wiederzufinden ist.
^b Prozentsatz der Gesamtproteine, die ursprünglich in der flüssigen Lösung reich an Proteinen des Laktoserums (WPI) enthalten ist, der in der ausgefällten Proteinfraktion wiederzufinden ist.

Die Resultate der Tabelle 1 zeigen, dass bei einem pH-Wert von 4,6 und bei einer Temperatur von 50°C nur 43% der ursprünglich in der Lösung reich an Proteinen des Laktoserums enthaltenen Proteine ausgefällt werden. Bei der Temperatur von 70 °C werden 100 % des ursprünglichen TGF-β2 ausgefällt, aber die Ausfällung ist wenig selektiv auf Grund dessen, dass 50 % der Gesamtproteine, die ursprünglich in der Ausgangslösung von Proteinen des Laktoserums enthalten sind, mit dem TGF-β co-ausgefällt werden, wodurch es nicht möglich ist, den gewünschten Grad der Anreicherung mit TGF-β zu erzielen.
Vorzugsweise erfolgt der Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 und noch vorteilhafterweise bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5. Auf besonders bevorzugte Weise er folgt der Verfahrensschritt b) bei einem pH-Wert zwischen 4,3 und 4,9, noch besser zwischen 4,4 und 4,8, vorzugsweise zwischen 4,5 und 4,7. Der optimale pH-Wert für den Einsatz beträgt ungefähr 4,6.
Vorzugsweise wird der pH-Wert mit Hilfe einer konzentrierten Säure eingestellt, um die Verdünnungsphänomene, die sich aus der Beigabe eines zusätzlichen Flüssigkeitsvolumens ergeben, maximal zu verringern. Vorzugsweise wird konzentriertes HCl und auf besonders bevorzugte Weise HCl mit der Konzentration 6N verwendet, insbesondere auf Grund seiner einfacheren und weniger gefährlichen Handhabung als bei anderen konzentrierten Säuren.
Die Einsatztemperatur des Schrittes b) des Verfahrens liegt vorzugsweise zwischen 55°C und 68°C, vorzugsweise zwischen 61 °C und 65°C und auf besonders bevorzugte Weise zwischen 62°C und 64°C, am besten bei ungefähr 63°C.
Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, denkt der Anmelder, dass der TGF-β, der sich im Wesentlichen in latenter Form in der Ausgangslösung von Proteinen des Laktoserums befindet, in seine aktivierte (biologisch aktive) Form in Schritt b) des Verfahrens μmgewandelt wird.
Die oben erwähnte Kombination der Parameter der Temperatur und des pH-Werts macht den Einsatz des Schrittes der Ausfällung während einer kurzen Dauer möglich, wodurch die Verschlechterung des TGF-β vermieden werden kann. So liegt die Dauer des Schrittes b) der Ausfällung zwischen 30 Sekunden und 10 Minuten, vorzugsweise zwischen 30 Sekunden und 5 Minuten, noch besser zwischen 1 Minute und 3 Minuten und auf besonders bevorzugte Weise bei ungefähr 2 Minuten.
Wenn der Schritt b) des Verfahrens 15 Minuten lang bei einem pH-Wert von 7,0 bei 80°C durchgeführt wird, ist eine Denaturierung des TGF-β zu beobachten, wobei diese Denaturierung mit der Dauer des Schritts der Ausfällung länger als 15 Minuten steigend ist.
Die Wärmebehandlung kann von jeder Art sein. Sie erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Wärmetauschern röhrenförmigen Typs oder auch von Wärmetauschern mit geglätteter Oberfläche, die dem Fachmann für die Wärmebehandlung von viskosen Lösungen oder Suspensionen, wie beispielsweise Frischkäse, bekannt sind.
Nach einer besonderen Ausführungsart des Schrittes b) des Verfahrens wird die ausgefällte Lösung von TGF-β rasch abgekühlt.
Der Anmelder hat nämlich beobachtet, dass eine rasche Abkühlung nach der Ausfällung einen positiven Einfluss auf die Textur des erhaltenen Niederschlags hat und folglich den Einsatz der späteren Schritte des Verfahrens und insbesondere den Schritt der Mikrofilterung begünstigt, wobei der Niederschlag nicht zu fein sein darf, um die Membran nicht zu verstopfen.
Vorzugsweise erfolgt die Abkühlung in einem Platten- oder Röhrenwärmetauscher mit Wasser auf Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 20 und 30°C, vorzugsweise von ungefähr 25°C.
Die Dauer des Schrittes der Abkühlung liegt vorzugsweise zwischen 1 und 20 Minuten und auf besonders bevorzugte Weise zwischen 2 und 10 Minuten.
Das Endprodukt des Schrittes b) ist somit eine Flüssigkeit, die eine Suspension von ausgefällten Proteinen inklusive TGF-β in einer Lösung von nicht ausgefällten Proteinen des Laktoserums enthält.
Schritt c) des Verfahrens
Die Suspension von Proteinen, die den TGF-β in einer Lösung von nicht ausgefällten Proteinen des Laktoserums enthält und die in Schritt b) gewonnen wurde, wird mit Diafilterung mikrogefiltert.
Der Niederschlag wird einem Schritt der Mikrofilterung mit Diafilterung unterzogen, um die Mehrzahl der löslichen Restproteine des Laktoserums zu beseitigen, wobei die Proteinfraktion von Interesse, die mehrheitlich den TGF-β enthält, konzentriert wird.
Um signifikante Verluste an TGF-β bei Beseitigung einer Mehrzahl der nicht gewünschten löslichen Proteine des Laktoserums zu vermeiden, erfolgt die Mikrofilterung mit einer Membran, deren Gauß'sche Verteilung der Porengröße eingeschränkt ist.
Die Mikrofilterung erfolgt vorzugsweise mit einer Mikrofiltermembran mit einer durchschnittlichen Porengröße zwischen 0,8 und 1,6 μm, die eine Gauß'sche Verteilung eingeschränkter Porengröße besitzt.
Auf bevorzugte Weise erfolgt die Mikrofilterung mit Diafilterung unter Bedingungen eines einheitlichen Transmembrandrucks auf der Gesamtheit der Oberfläche der Filtermembran.
Die Rezirkulation des Permeats bei Mitstrom stellt eine erste Ausführungsart des Schrittes der Mikrofilterung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, die den Erhalt eines im Wesentlichen einheitlichen Transmembrandrucks auf der Gesamtheit der Oberfläche der Membran des Filters ermöglicht.
So ermöglicht die Rezirkulation des Permeats bei Mitstrom an der Außenoberfläche des Trägers der Filtermembran den Erhalt eines Lastver lustes (Unterschied zwischen dem Eingangsdruck und dem Ausgangsdruck der Fluide, die auf jeder Seite der Filtermembran zirkulieren), der in jeder der Abteilungen des Filters identisch ist, und somit einen im Wesentlichen identischen Druckunterschied an jedem gegebenen Punkt der Filtermembran, und zwar auf der Gesamtheit der Filteroberfläche. Die Technik der Rezirkulation des Permeats bei Mitstrom ist beispielsweise in dem schwedischen Patent SW 74 16 257 (Sandblom) beschrieben.
Wenn die Rezirkulation des Permeats bei Mitstrom durchgeführt wird und ein einheitlicher Transmembrandruck sicher gestellt sein soll, wurden die besten Resultate mit mineralischen oder keramischen Membranen, wie beispielsweise jenen aus Alphaaluminiumoxid, erzielt, die von der Firma Société des Céramiques Techniques (Frankreich) unter der Marke Membralox oder von der Firma Orelis France unter der Marke KERASEP vertrieben werden, oder auch den Membranen der Marke STERILOX.
Nach einem weiteren Aspekt ist die Filtermembran auf einem makroporösen Träger mit Längsdurchlässigkeitsgradienten angeordnet. Ein solcher Träger besitzt eine derartige Ausführung, dass er einen Porositätsgradienten aufweist, der von einem Ende zum anderen der Filtermembran abnimmt.
Dank eines solchen Filterträgers nimmt der hydraulische Widerstand von einem Ende zum anderen der Filtermembran ab, was den Erhalt eines einheitlichen Transmembrandrucks entlang des gesamten Membranweges ermöglicht.
Ein solcher Filtertyp ist vorzugsweise aus Keramik hergestellt, wie beispielsweise der in der französischen Patentanmeldung FR 97 04 359 beschriebene Filterträger.
Nach einem weiteren Aspekt kann auch eine dynamische Membranfilterung durchgeführt werden, wie in dem französischen Patent 93 06 321 (Veröffentlichung 2 692 441) beschrieben, wobei beispielsweise organische Membranen verwendet werden.
Nach einer solchen Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Filtermembran und ihr Träger auf einer Drehachse montiert, wobei die Vorrichtung durch die Anordnung einer Drehscheibe in geringem Abstand zu der Mikrofiltermembran vervollständigt wird.
Die Drehung der in geringem Abstand (ungefähr 4 mm) zur Mikrofiltermembran angeordneten Scheibe erzeugt eine Scherspannung, die 50 bis 100 Mal größer als bei einer herkömmlichen Tangentialfilterung ist, wobei diese Scherspannung in allen drei Dimensionen (radial, tangential und axial) wirkt. Bei einer solchen Vorrichtung ist die Erzeugung der Scherspannung an der Wand vom Transmembrandruck entkoppelt. Solche Verfahren der dynamischen Membranfilterung sind auch in den Patenten US 5 037 532 , 3 997 447 und 4 956 102 beschrieben.
Auf bevorzugte Weise besitzt die Mikrofiltermembran eine durchschnittliche Porengröße zwischen 1 und 1,6 μm und auf besonders bevorzugte Weise von ungefähr 1,4 μm, wie jene, die von der Firma EXEKIA unter der Referenz „Sterilox, 1,4 μm klassisch" vertrieben wird und den Einsatz der Rezirkulation des Mikrofiltrats bei Mitstrom in der Mikrofiltereinrichtung erfordert, um einen einheitlichen Transmembrandruck zu erhalten, und unter der Referenz „Sterilox 1,4 μm GP" vertrieben wird.
Vorzugsweise erfolgt die Diafilterung mit osmotisiertem Wasser oder entmineralisiertem Wasser, das steril gefiltert ist.
Vorzugsweise erfolgt die Diafilterung durch Einsatz von 1 bis 6 Diavolumina, vorzugsweise ungefähr 4 Diavolumina, um eine maximale Beseiti gung der löslichen Proteine des Laktoserums mit Ausnahme des TGF-β zu erzielen.
Vorzugsweise erfolgt die Mikrofilterung mit Diafilterung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5, vorzugsweise zwischen 4,3 und 5 und auf besonders bevorzugte Weise bei einem pH-Wert von ungefähr 4,6, wodurch es möglich ist, den TGF-β in ausgefällter Form zu bewahren.
Die Anpassung des pH-Wert erfolgt mit einer konzentrierten Säure, vorzugsweise konzentriertem HCl, vorzugsweise in der Konzentration 6N.
Die Endprodukte des Schrittes der Mikrofilterung mit Diafilterung sind:

– einerseits ein stark mit TGF-β angereichertes Retentat; und
– andererseits ein Mikrofiltrat, das lösliche Proteine des Laktoserums enthält. Beispielsweise enthält dieses Mikrofiltrat 8,0 g/l der löslichen Proteine bei einem Gehalt an Trockenmaterial von ungefähr 8,8 g/l. Diese Proteine des Laktoserums, die nicht ausgefällt wurden, können vorzugsweise wieder konzentriert werden, und zwar durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel, Ultrafilterung auf Membran beispielsweise, und können, wenn sie konzentriert sind, für die meisten der herkömmlichen Anwendungen der WPI verwendet werden.

Wiedergewinnung des Retentats der Mikrofilterung
Nach dem Schritt der Mikrofilterung mit Diafilterung wird das Retentat der Mikrofilterung wiedergewonnen und stellt die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion dar.
Im Allgemeinen enthält das Retentat der Mikrofilterung 6,5 bis 17 μg/l TGF-β auf 1 g Gesamtproteine.
Vorzugsweise wird das Retentat der Mikrofilterung nach der Wiedergewinnung durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel (Lyophilisierung, Atomisierung, usw...) getrocknet, um die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion in Form eines Pulvers zu erhalten.
Das Retentatspulver enthält ungefähr 15 % der ursprünglichen Proteine des Laktoserums der Ausgangslösung. Die Gesamtheit der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichte es somit, 85 % der Proteine des Laktoserums, die ursprünglich in der Ausgangslösung enthalten sind, zu beseitigen. In diesem Pulver beträgt die Rate an TGF-β im Allgemeinen zwischen 6,5 und 17 μg/g Pulver, was annähernd der Wiedergewinnung von 70 % des ursprünglich in der Lösung von Proteinen des Ausgangslaktoserums enthaltenen TGF-β entspricht. Der Gehalt an TGF-β2 bezogen auf das Gewicht des Pulvers entspricht einem Gehalt an TGF-β2 von 6 μg bis 15 μg pro Gramm in dem Pulver enthaltener Gesamtproteine.
Diese stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion kann als solche verwendet werden, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch kompatiblen Exzipienten.
Diese stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion kann auch zusätzlichen Schritten der Reinigung unterzogen werden, um zu einem Endprodukt zu gelangen, das einen noch größeren Gehalt an TGF-β besitzt (Mikrofilterung, Zentrifugieren, Säuerung, Chromatographie).
Diese zusätzlichen Reinigungsschritte ermöglichen die Beseitigung der unlöslichen Proteine des Laktoserums, die mehrheitlich von a-Laktalbumin und Immunglobulinen gebildet sind.
Bevorzugte Ausführungsart für die Gewinnung der Lösung reich an Proteinen des Ausgangslaktoserums
Nach einer vorteilhaften Ausführungsart der Erfindung wird die Lösung reich an Proteinen des Ausgangslaktoserums durch den Einsatz der folgenden Schritte gewonnen:

i) tangentiale Mikrofilterung einer entrahmten Milch auf einer Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,1 μm in einer Ausrüstung, die den Erhalt eines einheitlichen Transmembrandrucks ermöglicht, dann Wiedergewinnung des Mikrofiltrats;
ii) Konzentration des in Schritt i) erhaltenen Mikrofiltrats durch Ultrafiltration mit Diafiltration mit Hilfe einer Membran, die ein Abtrennungsvermögen zwischen 5000 Dalton und 20000 Dalton aufweist, wie beispielsweise jene, die üblicherweise vom Fachmann für die Gewinnung von Proteinkonzentraten aus einem Laktoserum verwendet werden;
iii) Wiedergewinnung des diagefilterten Ultrafiltrationsretentats;
iv) fakultativ Verdünnung der in dem diagefilterten Ultrafiltrationsretentat enthaltenen Proteine, um die Lösung von Proteinen des Ausgangslaktoserums zu erhalten, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Vorzugsweise erfolgt die tangentiale Mikrofilterung mit einer Membran vom Typ Membralox (die nur von Aluminiumoxid oder einem Gemisch von Aluminiumoxid und Zirkon gebildet ist) 0,1 μm klassisch, die den Einsatz der Rezirkulation des Mikrofiltrats mit Mitstrom in der Mikrofiltereinrichtung (Hydraulikkonzept mit so genanntem einheitlichem Transmembrandruck) erfordert, oder einer Membran Membralox 0,1 μm mit der Referenz GP, wie den von der Firma EXEKIA vertriebenen.
Das nach dem Schritt i) erhaltene Retentat der tangentialen Mikrofilterung enthält mehrheitlich die Kaseine der Milch in mizellarer Form.
Das nach dem Schritt i) erhaltene Mikrofiltrat enthält im Wesentlichen die löslichen Proteine der Milch, die Laktose, die nicht proteinhaltigen, stickstoffhaltigen Formen und die löslichen Mineralsalze.
Das Mikrofiltrat aus Schritt i) wird einem Schritt der Ultrafiltration mit Diafiltration unterzogen, um die Proteine des Laktoserums zu konzentrieren. Vorzugsweise erfolgt die Ultrafiltration mit Membranen, die eine Abtrennungsschwelle zwischen 1 und 20 kD, vorzugsweise von ungefähr 5 kD haben.
Die Diafiltration erfolgt vorzugsweise mit osmotisiertem Wasser, wobei das Diafiltrationsvolumen zwischen 2 und 6 Diavolumina und vorzugsweise bei ungefähr 4 Diavolumina liegt.
Das Ultrafiltrat enthält den löslichen Stickstoff der Milch (nicht proteinhaltiger Stickstoff) sowie Laktose und Mineralsalze.
Beispielsweise enthält das in Schritt iii) wiedergewonnene Ultrafiltrationsretentat ungefähr 200g Gesamtproteine pro Liter Retentat.
Nach Wiedergewinnung des Retentats werden die in diesem letztgenannten enthaltenen Proteine verdünnt, um die Lösung von Proteinen des Ausgangslaktoserums zu erhalten. Die Verdünnung erfolgt vorzugsweise mit osmotisiertem Wasser.
Gegebenenfalls kann das Ultrafiltrationsretentat, das in Schritt iii) wiedergewonnen wird und die Proteine mit der Konzentration von 200 g/l enthält, in Form eines Pulvers getrocknet werden, bevor es als Aus gangsmaterial des Verfahrens zur Gewinnung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion gemäß der Erfindung verwendet wird.
Stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an TGF-β2 in aktivierter Form über 5 μg/g an Gesamtproteinen umfasst.
Vorzugsweise umfasst die oben erwähnte stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion einen Gehalt an TGF-β2 zwischen 6 μg und 15 μg TGF-β2 in aktivierter Form pro Gramm Gesamtproteine.
Vorzugsweise umfasst die stark mit TGF-β angereicherte Fraktion einen Gehalt an TGF-β2 in aktivierter Form, der zwischen 7 μg und 13 μg, vorzugsweise zwischen 8 μg und 12 μg und auf besonders bevorzugte Weise zwischen 9 μg und 11 μg TGF-β2 pro Gramm Gesamtproteine beträgt.
Der Gehalt an TGF-β2 der erfindungsgemäßen angereicherten Proteinfraktion kann leicht vom Fachmann bestimmt werden, beispielsweise durch Einsatz eines immunologischen Tests mit spezifischen Antikörpern des TGF-β2 wie beispielsweise dem von der Firma R&D SYSTEMS (Barton Lane, Oxon, OX14345, England) unter der Marke QUANTIKINE^TM vertriebenen.
Der Anmelder zeigte, dass die Proteine des Laktoserums, die in der stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion enthalten sind, mehrheitlich von a-Laktalbumin und Immunglobulinen gebildet sind.
So enthält die erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion zwischen 45 und 80 Gew.-% a-Laktalbumin und zwischen 10 und 25 % Immunglobuline bezogen auf das Gesamtgewicht der Fraktion.
Ferner ist diese mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion praktisch frei (weniger als 11 %) von β-Laktoglobulin, einem für seine Allergie fördernden Eigenschaften gut bekannten Protein.
Der geringe Gehalt an β-Laktoglobulin in der stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion gemäß der Erfindung macht die Erfindung geeignet für eine Verwendung bei Mensch oder Tier.
Ferner ist der Anmelder, ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, der Meinung, dass der starke Gehalt an a-Laktalbumin der stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion gemäß der Erfindung signifikant die therapeutischen Eigenschaften des TGF-β verstärken kann.
Das a-Laktalbumin ist nämlich reich an Tryptophan, da es vier Reststoffe dieser Aminosäure pro Proteinmolekül enthält. Das a-Laktalbumin ist das Protein der Milch, das am reichsten an dieser Aminosäure ist. Das Tryptophan ist der Zwischenstoff des Serotonins (5-Hydroxytryptamin) und des Melatonins. Das Serotonin besitzt sedative und Stress hemmende Eigenschaften. Das Serotonin verringert die Angst und begünstigt das Einschlafen. Nun wird derzeit angenommen, dass der Stress eine Hauptrolle bei der Entwicklung der Psoriasis spielt. Die an Psoriasis erkrankten Patienten sind nämlich einem permanenten Stress ausgesetzt. Die Kombination des TGF-β und des a-Laktalbumins macht die erfindungsgemäßen stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion besonders geeignet für die Herstellung von Medikamenten gegen Psoriasis.
Ferner umfasst das a-Laktalbumin ein Peptid, das von der Aminosäure an Position 50 bis zur Aminosäure an Position 53 geht und morphinomimetische Eigenschaften besitzt. Dieses Opioidpeptid, das vom a-Laktalbumin stammt, wurde „a-Laktorphin" genannt (siehe H. CIBA and M. YOSHIKAWA, Biologically Functional Peptides from Food Proteins: New opioides peptides from milk proteins. Prot. Tail for Food and Med. uses, Ausgabe M. DEKKA, N.Y., 1986, S:123-153).
Ferner besitzt das a-Laktalbumin Bakterizideigenschaften. Seine Hydrolyse im Intestinaltrakt durch das Trypsin und das Chymotrypsin führt zur Erzeugung von Bakterizidpeptiden (siehe A. PELLEGRINI et al., Isolation and Identification of Fluid Bactericidal Domains in the bovine alactalbumine molecule, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1426: 439-448). Die Bakterizideigenschaften des a-Laktalbumins können bei Patienten, die an Psoriasis erkrankt sind, helfen. Pathogene Wirkstoffe, wie beispielsweise die Streptokokken und die Staphylokokken erzeugen nämlich Superantigene, die Bakterientoxine sind, die zu einer Aktivierung und einem Hyperwachstum der T-Lymphozyten des Blutes führen, was zu einem Andrang der aktivierten T-Lymphozyten im Bereich der Haut führt. Aus diesem Andrang ergibt sich eine Aktivierung und ein Wachstum der Keratinozyten, ein Zellwachstum, das der Psoriasis zu Grunde liegt.
Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, denkt der Anmelder, dass die Bakterizidaktivität des a-Laktalbumins derart ist, dass das Wachstum der Keratinozyten nach einer Bakterieninfektion begrenzt wird und folglich die Antipsoriasiswirkung des TGF-β potentialisiert wird.
Ferner ist das Vorhandensein des a-Laktalbumins in Verbindung mit dem TGF-β derart, dass die Stabilität des TGF-β in einer Proteinfraktion oder in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung gesteigert wird, und insbesondere dass der TGF-β vor verschiedenen Beeinträchtigungen durch proteolytische Enzyme geschützt wird, beispielsweise wenn die Fraktion oder Zusammensetzung einem Patienten verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion, wie oben definiert, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch kompatiblen Exzipienten.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass sie eine therapeutisch wirksame Menge an TGF-β enthält.
Nach einem weiteren Merkmal enthält eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung zwischen dem TGF-β und dem a-Laktalbumin.
Wenn sie für eine topische Verabreichung bestimmt ist, umfasst eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise 1 Nanogramm bis 1 mg TGF-β2 pro Dosis, auf bevorzugte Weise 10 Nanogramm bis 100 μg TGF-β2 pro Dosis und auf besonders bevorzugte Weise 50 Nanogramm bis 20 μg pro Dosis.
Wenn sie für eine systemische Verabreichung bestimmt ist, ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für eine tägliche Verabreichung von 1 Nanogramm bis 500 μg TGF-β2 pro kg Gewicht des Patienten, vorzugsweise von 80 Nanogramm bis 100 μg pro kg Gewicht des Patienten und auf besonders bevorzugte Weise von 1 μg bis 20 μg pro kg Gewicht des Patienten geeignet.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Pulvern, Tabletten, Gelkapseln, Pulversäckchen, Lösungen für Injektionspräparate, Lotionen, Pomaden, Hautcremes, Sprays, Salben, Bandagen, Emulsionen, Nasen- oder Bronchialsprays, Implantaten oder auch Zahnpasten oder Mundduschen vorhanden sein.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf topischem Weg verabreicht werden. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann auch lokal oder auf systemischem Weg verabreicht werden.
Insbesondere kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie oben definiert, auf oralem, enteralem, parenteralem, intradermischem, subkutanem oder auch intravenösem Weg verabreicht werden.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst außer einer therapeutisch wirksamen Menge TGF-β2 oder einer Kombination von TGF-β2 und a-Laktalbumin auch Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Auflösungsmittel, Emulgatoren, Zusatzstoffe oder physiologisch kompatible Trägerstoffe. Solche Zusammensetzungen können in flüssiger oder fester Form vorhanden sein. Sie können in der Form von lyophilisierten Formeln oder Trockenpulverformeln vorhanden sein.
Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise gepufferte Verdünnungsmittel (z.B. tris-HCl, Acetat, Phosphat), Zusatzstoffe, wie Albumin oder Gelatine, um ihre Absorption auf Oberflächen zu verhindern, Detergenzien (z.B. Tween 20^TM, Tween 80^TM, Pluronic S68^TM, Gallensäuresalze, Auflösungsmittel (z.B. Benzylalkohol), Füllmittel oder Verbindungen zur Änderung der Tonizität (z.B. Laktose, Mannitol).
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch in Form von Formeln auf Basis von Partikeln von Poly merverbindungen vorhanden sein, wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyvinylpyrrolidon, oder auch in der Form von Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen oder auch von unilamellären oder multilamellären Bläschen.
Fakultativ kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere Bestandteile umfassen: Zusätze, wie beispielsweise Antioxidantien wie die Ascorbinsäure, Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als 10 Aminosäuren) wie beispielsweise Polyarginine. Sie kann auch Aminosäuren wie beispielsweise Glycin, Glutaminsäure, Asparginsäure oder Arginin umfassen. Sie kann auch Chelatwirkstoffe wie EDTA, umfassen. Sie kann auch hydroxylierte Zucker wie Mannitol oder Sorbitol, umfassen.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen mit kontrollierter Freisetzung oder verzögerter Freisetzung werden Fettsäuren, Wachs oder Öle hinzugefügt. Ebenfalls Bestandteil der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen in Form von Partikeln, in denen die mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion mit Polymeren, wie beispielsweise Poloxameren oder Poloxaminen, bedeckt ist.
Zusammensetzungen für eine topische Formel umfassen die Gele, Cremes, Lösungen, Emulsionen, inklusive der Carbohydratpolymere oder der biologisch abbaubaren Matrizen derselben. Für die Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion in ein Wachs, einen Film oder einen festen Träger, inklusive eines Kaugummis, eingekapselt sein.
Die stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion kann auch immobilisiert werden, um ihre Verdünnung durch den Speichel durch Wirkstoffe wie beispielsweise die Methylpropylzellulose zu verhindern.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung besitzt zahlreiche weitere klinische Anwendungen, von denen manche auf nicht einschränkende Weise nachstehend angeführt sind.
Der TGF-β hat bemerkenswerte Narben bildende Eigenschaften. Eine stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion gemäß der Erfindung kann vorzugsweise bei der Behandlung der Narbenbildung äußerer oder innerer Wunden angewandt werden, gegebenenfalls nach einem chirurgischen Eingriff, oder auch bei der Behandlung von Schorf oder auch bei der Festigung der Knochen nach einem Bruch.
Eine erfindungsgemäße Proteinfraktion kann auch bei der Behandlung der Osteoporose auf Grund der Wirkung des TGF-β auf die Osteklasten und die Osteoblasten angewandt werden und bewirkt eine Förderung der Knorpel- und Knochenbildung.
Auf Grund der hemmenden Wirkung des TGF-β auf das Wachstum der Epithelialzellen kann eine erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion vorzugsweise für die Behandlung der Melanome, der Myelome und der Lymphome eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Proteinfraktion kann vorzugsweise in Verbindung mit dem Vitamin D3 und den Retinoiden für die Behandlung gewisser Formen der Leukämie verwendet werden. Sie kann vorzugsweise für den Kampf gegen gewisse Krebsarten, insbesondere Brustkrebs, angewandt werden.
Ferner kann die erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion auch für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Prävention oder Behandlung gewisser Autoimmunerkrankungen bestimmt ist.
Sie kann auch vorzugsweise für die Prävention oder Behandlung von Lupus erythematodes angewandt werden, wobei es sich um eine Erkrankung der Haut handelt, die durch das Vorhandensein von roten Flecken oder Plättchen, die mit Schuppen bedeckt sind, durch eine Hyperkeratose, durch einen Entzündungsprozess, der mit einer Infiltration und Aktivierung der T-Lymphozyten in der Dermis einhergeht, gekennzeichnet ist und zur Produktion von Auto-Antikörpern führt. Lupus erythematodes ist der Prototyp der Autoimmunerkrankungen. Die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an Patienten, die an Lupus erythematodes leiden, auf oralem Weg kann den Allgemeinzustand dieser Kranken signifikant verbessern.
Vorzugsweise kann eine erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion auch für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Prävention oder Behandlung von Psoriasis bestimmt ist. Psoriasis ist eine Dermatose mit chronischer Entwicklung, gekennzeichnet durch ein Hyperwachstum der Keratinozyten in Verbindung mit Anomalien ihrer Reifung. Das Wachstum der Psoriasis-Kerationzyten zeigt sich in einer Erhöhung der Anzahl der Mitosen und einer Verkürzung des Zellzyklus. Ferner ist die Psoriasis-Epidermis der Sitz eines Entzündungsinfiltrats auf Grund eines Andrangs von aktivierten T-Lymphozyten und der Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen. Auf Grund dieser zytostatischen anti-inflammatorischen und Immunsuppressionseigenschaften stellt die erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion, wenn sie auf oralem Weg verabreicht wird, eine Grundbehandlung von Psorasis dar.
Sie kann auch eine Behandlung weiterer Erkrankungen, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, schwerer Myasthenie oder Uveitis ermöglichen. Ferner kann ihre Verwendung bei Organtransplantationen vorgesehen werden, um die Abstoßung der Transplantate zu vermeiden oder zumindest zu verringern.
Eine erfindungsgemäße stark mit TGF-β angereicherte Proteinfraktion kann auch für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Prävention oder Behandlung der Crohn-Krankheit bestimmt ist. Diese Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine Entzündung des Darms, eine Veränderung der Regulierung der Antigene des großen Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) der Klasse II. Die Darmentzündung geht einher mit einer Erhöhung der Expression der MHC-Antigene der Klasse II im Darmepithel. Diese ist das Ergebnis eines Autoimmunangriffs des Darms oder von Störungen der Immunregulierung.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung stellt, wenn sie auf oralem Weg verabreicht wird, eine Grundbehandlung der Crohn-Krankheit dar.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion, wie oben für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie Lupus erythematodes, Psoriasis, Crohn-Krankheit, rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, schwerer Myasthenie oder Uveitis, erwähnt.
Sie betrifft auch die Verwendung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion für die Herstellung eines Medikaments, das für die Prävention oder Behandlung der Abstoßung von Transplantaten bestimmt ist.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikaments, das die Narbenbildung begünstigt.
Sie betrifft auch die Verwendung einer stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Medika ments, das für die Prävention oder Behandlung der Osteoporose bestimmt ist.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion für die Herstellung eines onkostatischen Medikaments.
Die Erfindung ist durch die folgenden Beispiele dargestellt, ohne dadurch eingeschränkt zu werden:
BEISPIELE.
BEISPIEL 1:
Herstellung einer Lösung reich an Proteinen des Laktoserums (WPI) als Ausgangsprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens.
10000 kg entrahmter Milch mit einem Gehalt an Trockenmaterial von 92,9 g/kg und einem Gehalt an N × 6,38 von 35,4 g/kg wurden bei 50°C in eine Mikrofilteranlage mit 4,6 m² Membran 0,1 μm Membralox^® (Aluminiumoxid-Zirkon), die mit Rezirkulation des Mikrofiltrats bei Mitstrom funktioniert, eingeführt, um einen einheitlichen Transmembrandruck gleich 0,6-0,7 bar zu erhalten.
Die Fällungsgeschwindigkeit in der Retentat-Abteilung wurde auf 7 m/s festgelegt.
Die Extraktionsmenge des Mikrofiltrats wurde auf 345 l/h festgesetzt. Die Extraktionsmenge des Retentats wurde auf 172,5 l/h festgesetzt.
Die erhaltenen 6670 l Mikrofiltrat mit einem Gehalt an Trockenmaterial von 57,8 g/kg und einem Gehalt an N × 6,38 von 6,4 g/kg wurden auf 10°C abgekühlt und in eine Ultrafiltrationsanlage eingeleitet, die 9,6 m² Membran Koch^® in Spiralausführung und ein Abtrennungsvermögen von 5 Kd aufweist. Der Ausgangsdruck wurde auf 3,4 bar festgesetzt.
Die Extraktionsmenge des Ultrafiltrats wurde auf 250 l/h und jene des Retentats auf 12,5 l/h festgesetzt. Zu den 334 l Retentat wurden kontinuierlich 1336 l osmotisierten Wassers bis zur Beseitigung dieses in Form von Ultrafiltrat hinzugefügten Wassers beigegeben.
Das so erhaltene diagefilterte Retentat hatte einen Proteingehalt (N × 6,38) von 101,0 g/kg und einen Gehalt an Trockenmaterial von 106,3 g/kg. Es wurde entweder unmittelbar für die Herstellung einer mit TGF-β angereicherten Fraktion verwendet oder bei –30°C tiefgefroren.
BEISPIEL 2:
Herstellung einer stark mit TGF-β angereicherten Fraktion aus einer Lösung reich an Proteinen des Laktoserums
200 kg des in Beispiel 1 gewonnenen diagefilterten Retentats wurden zu 2000 l mit osmotisiertem Wasser bei einer Temperatur von 20°C in einer Wanne mit einem Blattrührer verdünnt.
Nach 10 Minuten Rühren wurden nach und nach 1800 ml HCl 6N bis zum Absinken des pH-Wert von 7,25 auf 4,6 hinzugefügt. Das Rühren wurde 10-15 Minuten fortgesetzt.
Die Lösung wurde thermisch bei 63°C 2 Minuten lang behandelt und auf 25°C in einer Ausrüstung Actijoule^® in Aliquoten zu 1000 l abgekühlt. Die erhaltenen 2000 l Suspension, die auf 35°C erhitzt wurden, wurden dann kontinuierlich in einer Anlage mit 4,6 m² von Membranen Sterilox^® mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 1,4 μm mit Rezirkulation des Mikrofiltrats bei Mitstrom mikrogefiltert, um einen einheitlichen Transmembrandruck zwischen 0,4 und 0,8 bar in 4h30 zu erhalten.
Die Extraktionsmenge des Mikrofiltrats wurde auf 400 l/h festgesetzt. Es erfolgte keine Extraktion des Retentats.
Wenn das Volumen des Retentats nahe dem Totvolumen der Mikrofilteranlage war, wurden 320 l osmotisierten Wassers kontinuierlich hinzugefügt und in Form eines Mikrofiltrats extrahiert.
Die erhaltenen 53 kg diagefilterten Retentats hatten einen Gehalt an Trockenmaterial von 39,96 g/kg, einen Gehalt an Proteinen (N × 6,38) von 39,14 g/kg und einen Gehalt an TGF-β von 430,5 μg/kg (d.h. 11 μg/g Protein). Sie wurden bei –30°C tiefgefroren und in Aliquoten zu 10 kg lyophilisiert.
BEISPIEL 3:
Qualitative und quantitative Analyse der stark mit TGF-β angereicherten Proteinfraktion gemäß der Erfindung
1 mg des in Beispiel 2 erhaltenen lyophilisierten Pulvers wurde in 1 ml Wasser milliQ gelöst, dann 5 Mal im Puffer A verdünnt. Die verwendete Analyseeinrichtung war ein Chromatograf CLHP Waters 600 E, der mit einer Säule „source RPC 3 ml" (Pharmacia^®) versehen ist.
Die beiden eingesetzten Puffer waren:
Puffer A: Trifluoracerinsäure (TFA) 0,1 %
Puffer B: TFA 0,09 % in Acetonitril 90 %
50 μl des Produktes wurden eingespritzt, und die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 30 bis 100 % Puffer B in 30 min mit einer Menge von 2 ml/min (bei Raumtemperatur). Die Erfassung erfolgt bei 214 n. Die Behandlung der chromatografischen Bereiche erfolgte mit Hilfe der Software Nelson^®, wodurch es möglich war, den jeweiligen Gehalt be zogen auf die Gesamtproteine zu bewerten: an a-Laktalbumin 53 %, an Serum-Albumin 0,03 %, an β-Laktoglobulin 10,9 %, an Immunglobulinen 18,3 %.
Der Gehalt an TGF-β2 der angereicherten Fraktionen wurde durch eine Methode von Immuntests bestimmt, die spezifische monoklonale Antikörper des TGF-β2 verwendet (Kits Quantikine, vertrieben von R&D Systems (Barton Lane, Oxon, OX14 3YS UK).

Claims

Verfahren zur Gewinnung einer mit TGFβ in aktivierter Form angereicherten Proteinfraktion aus einer Lösung reich an löslichen Proteinen der wässerigen Phase der Milch, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Anpassung der gereinigten löslichen Proteine an eine Konzentration von 5 bis 30 g/l Lösung; b) Ausfällung eines Teils der Proteine des Laktoserums durch Säurebehandlung der Lösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 und bei einer Temperatur zwischen 55 °C und 68 °C; c) Mikrofilterung mit Diafilterung der ausgefällten Suspension, um ein Mikrofiltrationsretentat bzw. ein Mikrofiltrat zu erhalten; d) Wiedergewinnung des Mikrofiltrationsretentats, das die stark mit TGFβ angereicherte Proteinfraktion enthält; e) Trocknen des diagefilterten Mikrofiltrationsretentats um ein stark mit TGFβ angereichertes Pulver zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b) der Ausfällung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5 und vorzugsweise bei eine pH-Wert von ungefähr 4,6 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b) der Ausfällung bei einer Temperatur zwischen 55 °C und 68 °C und vorzugsweise von ungefähr 63 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dauer des Schrittes b) der Ausfällung zwischen 30 Sekunden und 10 Minuten, vorzugsweise zwischen 30 Sekunden und 5 Minuten, und ganz vorteilhafterweise ungefähr 2 Minuten beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende des Schrittes b) die flüssige Lösung rasch abgekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofilterung des Schrittes c) auf einer Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße zwischen 0,8 und 1,6 μm, die eine eingeschränkte Verteilung von Porengrößen besitzt, und in einer Ausrüstung erfolgt, die zum Erhalt eines einheitlichen Transmembrandrucks führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Diafilterung des Schrittes b) mit osmotisiertem Wasser oder gefiltertem entmineralisiertem Wasser erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofilterung mit Diafilterung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 und vorzugsweise von ungefähr 4,6 erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung reich an Proteinen des Ausgangslaktoserums durch den Einsatz der folgenden Schritte erhalten wird: i) tangentiale Mikrofilterung einer entrahmten Milch auf einer Mikrofiltermembran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,1 μm und in einer Ausrüstung, die den Erhalt eines einheitlichen Transmembrandrucks ermöglicht, dann Wiedergewinnung des Mikrofiltrats; ii) Konzentration des in Schritt i) erhaltenen Retentats durch Ultrafilterung mit Diafilterung; iii) Wiedergewinnung des diagefilterten Ultrafilterungsretentats.
Mit TGFβ angereicherte Proteinfraktion, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 gewonnen werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an TGFβ in aktivierter Form von mehr als 5 μg pro Gramm von Gesamtproteinen des Laktoserums umfasst, und dass die anderen Proteine des Laktoserums mehrheitlich von a-Laktalbumin gebildet sind.
Proteinfraktion nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie 45 Gew.-% bis 80 Gew.-% a-Laktalbumin bezogen auf das Gesamtgewicht der Fraktion enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch kompatiblen Exzipienten.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Lupus erythematodes, Psoriasis oder Crohn-Krankheit.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Gewinnung eines Medikaments zur Prävention o der Behandlung von rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Myasthenie oder Uveitis.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Gewinnung eines Medikaments, das die Narbenbildung begünstigt.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Gewinnung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung der Osteoporose.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Gewinnung eines onkostatischen Medikaments.
Verwendung einer Proteinfraktion nach einem der Ansprüche 10 und 11 für die Gewinnung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung der Abstoßung von Transplantaten.