ES2869232T3 - Eliminación selectiva de una proteína de una mezcla de proteínas mediante el uso de carbón activado mediante el ajuste de las condiciones de la solución - Google Patents

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Abstract

Un método para eliminar selectivamente una proteína de una muestra que comprende al menos dos proteínas, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende al menos dos proteínas, una de las cuales se va a eliminar selectivamente y la otra proteína es una inmunoglobulina; (b) ajustar el pH de la solución de la muestra, de modo que el pH se encuentre dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente; (c) poner en contacto la muestra con carbón activado, en donde el carbón activado se une a la proteína que se va a eliminar selectivamente; y (d) eliminar el carbón activado de la muestra, lo que resulta así en la eliminación selectiva de la proteína que se une al carbón activado de la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Eliminación selectiva de una proteína de una mezcla de proteínas mediante el uso de carbón activado mediante el ajuste de las condiciones de la solución
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al uso de carbón activado para separar una proteína de proteínas no deseadas o impurezas proteicas mediante el ajuste de las condiciones de la solución.
Antecedentes
El carbón activado se ha usado previamente en filtros de aire (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 6,413,303), purificación de gas (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 7,918,923), descafeinización (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,481,223), purificación de oro (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 5,019,162), purificación de combustible (ver, por ejemplo, la Publicación de los Estados Unidos Número 2006/0223705 A1), hemoperfusión (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,048,064), tratamiento de intoxicaciones y sobredosis (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,453,929), tratamiento de aguas residuales (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número US 8,329,035), limpieza de derrames (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,770,715), saneamiento de aguas subterráneas (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 6,116,816), captura de compuestos orgánicos volátiles de los sistemas de combustible de automóviles (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 7,044,112), purificación química (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,906,445), purificación de bebidas alcohólicas destiladas (ver, por ejemplo, la Publicación de los Estados Unidos Número US 2007/0248730 A1), decoloración del azúcar (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 2,082,425), respiradores (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 5,714,126), máscaras de gas (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,992,084), trajes protectores de guerra química (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 7,877,819), y procesos de purificación de agua (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 7,537,695).
Además, el carbón activado se ha usado para eliminar impurezas de moléculas pequeñas, tales como ácidos grasos y bilirrubina, de la albúmina sérica (ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Biol. Chem., 242:173-181 (1967)); Nakano y otros, Anal Biochem., 129:64-71 (1983); Nikolaev y otros, Int. J. Art. Org., 14:179-185 (1991)). El carbón activado también se ha usado para eliminar pigmentos, así como también proteínas del huésped, proteasas, y ribonucleasas durante la purificación de virus de plantas (ver, por ejemplo, Precio, Am. J. Botany, 33:45-54 (1946); Corbett, Virología, 15:8-15 (1961); McLeana y otros, Virology, 31:585-591 (1967), Publicación de los Estados Unidos Número US 2006/0281075 A1).
Adicionalmente, se ha que se describe previamente que el carbón activado es útil para la eliminación de fragmentos de plásmido de inferior menor molecular del ADN del plásmido. Ver, Kim y otros, J. Biosci. Bioeng. 110:608-613 (2010). El documento WO2005094605 describe un método para la producción de al menos dos productos proteicos purificados, mediante el ajuste de las condiciones para formar una solución que contiene proteínas que tiene un pH entre pI 0,1 y pI 3, y que se trata con carbón activo seguido de una etapa que puede ser filtración o precipitación a un pH de aproximadamente el punto isoeléctrico de la proteína, con el fin de separar las proteínas. La D4 describe un método para la preparación de una solución de IgG "libre de efectos secundarios" para la aplicación intravenosa, en donde una solución de IgG parcialmente purificada se ajusta a pH 4,5-5,0 y después se pone en contacto con carbón activado por 2 horas, con el fin de eliminar impurezas de bajo peso molecular y enzimas proteolíticas. Después se elimina el carbón activado.
Resumen de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que el carbón activado se puede usar para la eliminación selectiva de una proteína de una mezcla que contiene al menos dos proteínas mediante el uso de condiciones de solución cercanas al punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente. La presente invención describe métodos de acuerdo con las reivindicaciones.
En algunas modalidades, se proporciona un método para eliminar selectivamente una proteína de una muestra que comprende al menos dos proteínas, donde el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende al menos dos proteínas; una de las cuales se va a eliminar selectivamente y la otra proteína es una inmunoglobulina, (b) ajustar el pH de la solución de la muestra, de modo que el pH se encuentre dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente; (c) poner en contacto la muestra con carbón activado, donde el carbón activado se une a la proteína que se va a eliminar selectivamente; y (d) eliminar el carbón activado de la muestra, lo que resulta así en la eliminación selectiva de la proteína que se une al carbón activado de la muestra.
En algunas modalidades, se proporciona un método para aumentar la pureza de una proteína diana de interés en una muestra que comprende la proteína diana y al menos una proteína no deseada, en donde la proteína diana es una inmunoglobulina, donde el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende la proteína diana y al menos una proteína no deseada; (b) ajustar el pH de la solución de la muestra, de modo que el pH se encuentre dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la al menos una proteína no deseada; (c) poner en contacto la muestra con carbón activado, donde el carbón activado se une al menos a una proteína no deseada; y (d) eliminar el carbón activado que se une a la al menos una proteína no deseada de la muestra, lo que aumenta así la pureza de la proteína diana en la muestra.
En algunas modalidades, al menos una proteína no deseada es una impureza proteica.
En algunas modalidades, la proteína diana es una proteína inmunoglobulina tal como, un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otras modalidades, es un anticuerpo policlonal.
También se describen en la presente descripción métodos en donde, la proteína diana es una proteína que no es inmunoglobulina.
En algunas modalidades, la muestra que contiene al menos dos proteínas es una solución acuosa que se deriva de un cultivo celular.
En algunas modalidades, el cultivo celular es un cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO).
Otros ejemplos de muestras de cultivo celular incluyen, pero no se limitan a células HeLa, células NTH 3T3, células BHK, células VERO, células CV-1, células NS/0, células COS, células de riñón de hámster bebé, mielomas murinos, células de hibridoma, células bacterianas, células de levadura, células de insectos, células de anfibios, células humanas, células de ratón, células de rata, células de perro, células de mono, células de cabra, células de cerdo, células de vaca, células de caballo, células de perro, células de gato, células de conejo, células de aves, células de mono, células de hámster, células de mamíferos no humanos.
En algunas modalidades, la muestra que contiene proteínas puede ser la alimentación del cultivo celular completo. En otras modalidades, el cultivo celular se clarifica y/o purifica primero antes de ponerlo en contacto con carbón activado. Los métodos de clarificación incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, sedimentación, filtración en profundidad o tamiz, formación de complejos con floculantes, y cambio de pH.
En algunas otras modalidades, la muestra se puede derivar de tejido humano, animal, o vegetal o de fluidos animales, por ejemplo, sangre o plasma sanguíneo humano, tejido humano, sangre animal, leche de cabra, leche de bovino, leche de mamífero, órganos animales, tejidos animales, animales transgénicos, plantas transgénicas, y huevos de gallina.
En otras modalidades adicionales, la muestra de proteína se produce mediante una síntesis química a partir de aminoácidos o péptidos más pequeños.
En algunas modalidades, la muestra se somete a una o más etapas o métodos de purificación antes de someter la muestra a los métodos que se describen en la presente descripción. Tales etapas o métodos de purificación incluyen pero no se limitan a, cromatografía en columna y/o membrana que se opera ya sea en modo de unión y elución o de flujo continuo; cristalización; particiones bifásicas y trifásicas; y filtración.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar la eliminación selectiva mediante el uso de carbón activado del citocromo C de una mezcla de citocromo C y a-lactoalbúmina (relación 1:1 en peso), cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C y, por el contrario, la eliminación selectiva de la a-lactoalbúmina de la mezcla cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina. El eje X representa el pH de la solución y el eje Y representa el porcentaje de proteína en la mezcla de proteínas después del tratamiento con carbón activado.
La Figura 2 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar el valor de reducción logarítmica (LRV) del citocromo C que se elimina de una mezcla que contiene citocromo C y una proteína diana (es decir, un anticuerpo monoclonal (AcM I)) mediante el uso de carbón activado. a pH 4,0, 5,0, 6,0. 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas. La mezcla contenía 5,0 mg/mL del AcM 1 y 1 mg/mL de citocromo C (200 000 ppm). Como se representa en la Figura 3, la eliminación óptima del citocromo C mediante el uso de carbón activado se observa cuando el pH de la solución se encuentra más cerca del punto isoeléctrico del citocromo C a pH 10,0-10,5. El eje X representa el pH de la solución y el eje Y representa el LRV del citocromo C.
La Figura 3 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar el valor de reducción logarítmica (LRV) de la a-lactoalbúmina que se extrae de una mezcla que contiene a-lactoalbúmina y una proteína diana (es decir, un anticuerpo monoclonal (AcM I)) mediante el uso de carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8.0 y 9,0 bajo condiciones estáticas. La mezcla contenía 5,0 mg/mL del AcM 1 y 1 mg/mL de a-lactoalbúmina (200 000 ppm). Como se representa en la Figura 3, la eliminación óptima de la a-lactoalbúmina mediante el uso de carbón activado se observa cuando el pH de la solución se encuentra más cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina en 4,8. El eje X representa el pH de la solución y el eje Y representa el LRV de la a-lactoalbúmina.
La Figura 4 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar el valor de reducción logarítmica (LRV) de la lisozima que se elimina de una mezcla que contiene lisozima y una proteína diana (es decir, un anticuerpo monoclonal (AcM 1)) mediante el uso de carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas. La solución contenía 5,0 mg/mL de AcM I y 1,0 mg/mL de lisozima (200 000 ppm). Como se representa en la Figura 4, la mayor cantidad de lisozima se elimina a pH 9,0 donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico de la lisozima de 11,2-11,3. El eje X representa el pH de la solución y el eje Y representa el LRV de la lisozima.
La Figura 5 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar el valor de reducción logarítmica (LRV) de la BSA que se elimina de una mezcla que contiene BSA y una proteína diana (es decir, un anticuerpo monoclonal (AcM I)) mediante el uso de carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas. La solución contenía 5,0 mg/mL de AcM I y 0,5 mg/mL de b Sa (100 000 ppm). Como se representa en la Figura 5, la mayor cantidad de BSA se elimina a pH 5,0 donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico de la BSA de 4,9. El eje X representa el pH de la solución y el eje Y representa el LRV de la BSA.
La Figura 6 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar que una proteína no deseada no se elimina de manera eficiente cuando se hace fluir a través de carbón activado a un pH de solución que se encuentra muy lejos del punto isoeléctrico de la proteína no deseada. La gráfica muestra la concentración del citocromo C y la a-lactoalbúmina en fracciones de 12,5 mL que se recolectaron después de pasar una solución de 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 0,5 mg/mL de citocromo C a pH 4,0 a través de una columna de carbón activado. Tanto la concentración inferior del citocromo C como la concentración más alta de la a-lactoalbúmina se eluyeron de la columna en aproximadamente la misma relación en la que entraron en la columna. Como es mostrado en la Figura 6, a pH 4,0, que se encuentra muy lejos del punto isoeléctrico del citocromo C de pH 10,0-10,5, el carbón activado no proporciona una eliminación eficiente del citocromo C de la solución de citocromo C y alactoalbúmina. El eje X representa la carga de la a-lactoalbúmina en kg/L; el eje Y izquierdo representa la concentración del citocromo C en g/L y el eje Y derecho representa la concentración de la a-lactoalbúmina en g/L.
La Figura 7 es un gráfico que representa los resultados de un experimento representativo para demostrar que una proteína no deseada se elimina de manera muy eficiente cuando se hace fluir a través de carbón activado a un pH de solución que se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína no deseada. El gráfico muestra la concentración del citocromo C y la a-lactoalbúmina en fracciones de 12,5 mL que se recolectaron después de pasar una solución de 5.0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 0,5 mg/mL de citocromo C a pH 9,0 a través de una columna de carbón activado. El citocromo C no atravesó la columna hasta que se cargó con 1,09 kg de a-lactoalbúmina por litro de carbón activado. Como se demuestra en la Figura 7, el carbón activado proporcionó una excelente eliminación del citocromo C de la solución de a-lactoalbúmina a pH 9,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C de pH 10,0-10,5. El eje X representa la carga de la a-lactoalbúmina en kg/L; el eje Y izquierdo representa la concentración del citocromo C en g/L y el eje Y derecho representa la concentración de la a-lactoalbúmina en g/L.
Descripción Detallada
La presente invención proporciona nuevos y mejores procesos para la eliminación selectiva de una proteína de una mezcla de al menos dos proteínas mediante el uso de carbón activado bajo condiciones de solución cercanas al punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente.
El carbón activado se ha usado previamente en procesos de purificación de agua. Además, el carbón activado se ha usado para eliminar impurezas de moléculas pequeñas, tales como ácidos grasos y bilirrubina, de la albúmina sérica (ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Biol. Chem., 242:173-181 (1967); Nakano y otros, Anal Biochem., 129:64-71 (1983); Nikolaev y otros, Int. J. Art. Org., 14:179-185 (1991)). El carbón activado también se ha usado para eliminar pigmentos, así como también proteínas del huésped, proteasas y ribonucleasas durante la purificación de virus de plantas (ver, por ejemplo, Precio, Am. J. Botany, 33:45-54 (1946); Corbett, Virology, 15:8-15 (1961); McLeana y otros, Virology, 31:585-591 (1967).
Adicionalmente, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número 13/565,463, fecha de presentación 2 de agosto de 2012, describe el uso de carbón activado en combinación con otros medios para la eliminación de impurezas proteicas (porejemplo, proteínas de la célula huésped) y ADN de una muestra que contiene una biomolécula de interés (por ejemplo, un anticuerpo).
Por consiguiente, en general, se ha reportado que el carbón activado no se específicamente a moléculas en solución (por ejemplo, impurezas en una muestra de agua).
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que el carbón activado se puede usar para la eliminación selectiva de una proteína de una mezcla que contiene dos o más proteínas mediante el ajuste de las condiciones de la solución, de modo que el pH de la solución se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente.
Como se demuestra en los Ejemplos de la presente descripción, el carbón activado se puede usar para la eliminación selectiva de una proteína de una mezcla de dos o más proteínas. Adicionalmente, como se demuestra en los ejemplos que se establecen en la presente descripción, el grado de eliminación de la proteína se puede manipular mediante el cambio de las condiciones de pH. Adicionalmente, el carbón activado se puede usar, como se describe en la presente descripción, para aumentar la pureza de una proteína diana en una solución que contiene la proteína diana y una o más proteínas no deseadas, donde una o más proteínas no deseadas se eliminan selectivamente mediante el uso de carbón activado y la proteína diana se deja atrás, lo que aumenta así el grado de pureza de la proteína diana en la muestra.
En algunas modalidades que se describen en la presente descripción, se usa carbón activado en un modo de purificación de flujo continuo para eliminar selectivamente una proteína de una mezcla de proteínas.
Con el fin de que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen determinados términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
I. Definiciones
El término "material carbónico", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier sustancia que se compone de carbono o que contiene carbono. En algunas modalidades, el material carbónico que se usa en los métodos de acuerdo con la invención que se reivindica es carbón activo o activado. En algunas modalidades, el carbón activado comprende carbón vegetal activado. En algunas modalidades, el carbón activado se incorpora en un medio fibroso. Los medios fibrosos se pueden fabricar mediante varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen el tendido en húmedo y el tendido en seco. Los medios fibrosos comprenden típicamente carbón activado, un componente de fibra, y opcionalmente un aglutinante. El componente de fibra del medio fibroso se puede producir a partir de un material sintético, tales como poliamida, poliolefina, poliacrilonitrilo, poliéster; un material natural, tal como la celulosa; o un material semisintético, tal como un éster de celulosa.
El término "carbón activo" o "carbón activado", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a un material carbónico que se ha sometido a un proceso para potenciar su estructura de poros. Los carbones activados son sólidos porosos con áreas superficiales muy altas. Se pueden derivar de una variedad de fuentes que incluyen carbón, madera, cáscara de coco, cáscaras de nuez y turba. El carbón activado se puede producir a partir de estos materiales mediante el uso de la activación física que implica el calentamiento bajo una atmósfera que se controla o la activación química mediante el uso de ácidos, bases, u oxidantes fuertes. Los procesos de activación producen una estructura porosa con altas áreas superficiales que le dan al carbón activado altas capacidades para la eliminación de impurezas. Los procesos de activación se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
Los procesos de activación típicos implican someter una fuente de carbono, tal como residuos de resina, carbón, coque de carbón, coque de petróleo, lignitos, materiales poliméricos, y materiales lignocelulósicos que incluyen pulpa y papel, residuos de la producción de pulpa, madera (como astillas de madera, aserrín, y harina de madera), cáscara de nuez (como cáscara de almendra y cáscara de coco), semillas, y huesos de frutas (como huesos de aceituna y cereza) a un proceso térmico (por ejemplo, con un gas oxidante) o un proceso químico (porejemplo, con ácido fosfórico o sales metálicas, tal como cloruro de zinc). Un proceso ilustrativo que implica la activación química de carbón de madera con ácido fosfórico (H3PO4) se describe en la Patente de los Estados Unidos Número Re. 31 093, lo que resultó en una mejora en las capacidades de decoloración y adsorción de gases de carbono. También, la Patente de los Estados Unidos Número 5,162,286 enseña la activación con ácido fosfórico de material en base a madera que es particularmente denso y que contiene un contenido de lignina relativamente alto (30 %), tales como cáscara de nuez, hueso de fruta y semillas. La activación con ácido fosfórico del material de lignocelulosa también se analiza en la Patente de los Estados Unidos Número 5,204,310, como una etapa en la preparación de carbones de alta actividad y alta densidad. En contraste con la mayoría de los otros materiales adsorbentes, se cree que el carbón activado interactúa con moléculas mediante el uso de fuerzas de dispersión relativamente débiles de Van der Waals o London. Los productos de carbón activado comerciales típicos exhiben un área superficial de al menos 300 m2/g, como se mide mediante el método Brunauer-Emmett-Teller ("BET") en base a adsorción de nitrógeno, que es un método bien conocido en la técnica.
Aunque, el carbón activo o activado se ha empleado previamente en procesos para purificar líquidos y gases, así como también para purificar un anticuerpo que se expresa de forma recombinante a partir de otras impurezas mediante la unión a impurezas, no se ha empleado previamente para eliminar selectivamente una proteína de una mezcla de dos o más proteínas mediante el empleo de condiciones de solución en base a las propiedades de la proteína que se va a eliminar selectivamente. En consecuencia, al eliminar selectivamente una proteína de una mezcla de dos o más proteínas, aumenta la pureza de las proteínas que no se eliminan.
En algunas modalidades, la mezcla de dos o más proteínas incluye al menos una proteína que se va a eliminar selectivamente y otra proteína que se va a purificar mediante el uso de los métodos que se describen en la presente descripción. En general, la pureza de la proteína que permanece después de la eliminación selectiva de una o más de otras proteínas en la mezcla aumenta, siguiendo la eliminación selectiva de otras proteínas. La proteína cuya pureza aumenta se denomina como proteína diana. La proteína diana puede ser una inmunoglobulina o una proteína que no es inmunoglobulina. En algunas modalidades, la proteína diana es una proteína inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal.
Los siguientes son ejemplos de proteínas que se pueden purificar de acuerdo con la presente invención. Como se discute anteriormente, en algunas modalidades, la proteína diana es un anticuerpo monoclonal. Otros ejemplos de proteínas diana que no fallan dentro del alcance de las presentes reivindicaciones incluyen proteínas recombinantes que incluyen, pero no se limitan a, la hormona de crecimiento humana recombinante, insulina humana recombinante, hormona estimulante del folículo recombinante, factor VII recombinante (factor anti-hemofílico), eritropoyetina humana recombinante, factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante, alfa-galactosidasa recombinante, iduronidasa recombinante, galsulfasa recombinante, dornasa alfa recombinante, activador plasminógeno tisular recombinante, interferones humanos recombinantes, factor de crecimiento 1 similar a la insulina recombinante, y asparaginasa recombinante.
En otras modalidades de esta invención, las proteínas diana son proteínas que se derivan de sangre humana u otros fluidos fisiológicos. Los ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas G y M. Otras proteínas que se derivan de tales fuentes, que no caen dentro del alcance de las presentes reivindicaciones, incluyen el Factor VIII, Factor IX, antitrombina III, y alfa-I-antitripsina.
El término "inmunoglobulina", "Ig" o "IgG" o "anticuerpo" (que se usa indistintamente en la presente descripción) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de cuatro polipéptidos básica que consiste en dos cadenas pesadas y dos ligeras, dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercadenas, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "inmunoglobulina monocatenaria" o "anticuerpo monocatenario" (que se usa indistintamente en la presente descripción) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste en una cadena pesada y una ligera, dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, mediante enlazadores peptídicos intercadenas, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de la cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptídicos) que se estabilizan, por ejemplo, mediante una hoja plegada en p y/o un enlace disulfuro intracadenas. Los dominios se denominan en la presente descripción adicionalmente como "constantes" o "variables", en base a la carencia relativa de variación de secuencias dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "constante", o en la variación significativa dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de los anticuerpos o polipéptidos a menudo se denominan indistintamente en la técnica como "regiones" de los anticuerpos o polipéptidos. Los dominios "constantes" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones constantes de la cadena ligera", "dominios constantes de la cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones constantes de la cadena pesada", "dominios constantes de la cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena ligera", "dominios variables de la cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena pesada", "dominios variables de la cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH".
Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. Las inmunoglobulinas o anticuerpos también pueden incluir anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos).
El término "región Fc" y "proteína que contiene la región Fc" significa que la proteína contiene regiones o dominios constantes de la cadena pesada y/o ligera (regiones CH y CL como se definen previamente) de una inmunoglobulina. Las proteínas que contienen una "región Fc" pueden poseer funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Una "región Fc", tal como las regiones CH2/CH3 , se puede unir selectivamente a ligandos de afinidad tales como la proteína A o variantes funcionales de la misma. En algunas modalidades, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína A o un derivado, variante o fragmento funcional de la misma. En otras modalidades, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína G o la Proteína L, o derivados, variantes o fragmentos funcionales de la misma.
Como se discute anteriormente, en algunas modalidades, una proteína diana es una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas modalidades, una proteína que contiene una región Fc es una proteína recombinante que incluye la región Fc de una inmunoglobulina que se fusiona a otro polipéptido o a un fragmento del mismo.
Generalmente, una inmunoglobulina o un anticuerpo se dirige frente a un "antígeno" de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece de una enfermedad o trastorno puede resultar en un beneficio terapéutico en ese mamífero.
El término "anticuerpo monoclonal" o "AcM", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales en la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que se pueden encontrar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, los que se dirigen frente a un solo sitio antigénico. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos que se dirigen frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la presente invención se pueden producir mediante el método de hibridoma que se describe por primera vez por Kohler y otros, Nature 256:495 (1975), o se puede producir mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos mediante el uso de las técnicas que se describen en Clackson y otros, Nature 352:624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales pueden incluir adicionalmente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos que se derivan de una especie particular o pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos que se derivan de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica que se desea (Patente de los Estados Unidos Número 4.816.567; y Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81:6851-6855 (1984)).
El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente descripción se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable como se define en la presente descripción.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima que se deriva de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como el ratón, la rata, el conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad que se desea. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se producen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico", que se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN monocatenario, bicatenario o tricatenario, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido de ADN-ARN, o un polímero que comprende las bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, modificados químicamente o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se puede encontrar típicamente en ARN o ADN), o grupos azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Además, se puede obtener un polinucleótido bicatenario a partir del producto de polinucleótido monocatenario de la síntesis química ya sea mediante la síntesis de la cadena complementaria y calentar las cadenas bajo condiciones apropiadas, o mediante la síntesis de la cadena complementaria de novo mediante el uso de una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molécula de ácido nucleico puede tomar muchas formas diferentes, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, uno o más exones, uno o más intrones, ARNm, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tales como fluororibosa y tioato, y ramificaciones de nucleótidos. Como se usa en la presente descripción, "ADN" o "secuencia de nucleótidos" incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados y tioatos, uso de análogos de azúcares, y estructuras de cadena principal modificadas y/o alternativas, tales como las poliamidas.
El término "solución", "composición" o "muestra", como se usa en la presente descripción, se refiere a una mezcla de dos o más proteínas, donde una de las proteínas es una proteína diana o de interés para purificar y la otra o más proteínas son no deseadas y se eliminan selectivamente mediante el uso de los métodos que se describen en la presente descripción. En algunas modalidades, la muestra comprende la alimentación de cultivo celular, por ejemplo, alimentación de un cultivo celular de mamífero (por ejemplo, células CHO) que contiene dos o más proteínas. Sin embargo, las muestras también abarcan sistemas de expresión de no mamíferos que se usan para producir una proteína de interés o proteína diana.
El término "sistemas de expresión de no mamíferos", como se usa en la presente descripción, se refiere a todas las células u organismos huésped que se emplean para generar proteínas terapéuticas, donde las células u organismos huésped son de origen no mamífero. Ejemplos de sistemas de expresión de no mamíferos que se usan para producir una proteína de interés o proteína diana incluyen levaduras tales como, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, bacterias tales como Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus choshinensis, células de insectos tales como células de Spodoptera frugiperda, células de Baculovirus infectadas de insectos, y células de algas.
Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" generalmente se refiere a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los términos "proteína de interés" y "proteína diana", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una proteína o polipéptido, que se va a purificar a partir de una mezcla de dos o más proteínas o polipéptidos, mediante la eliminación selectiva de las otras proteínas o polipéptidos en la mezcla.
Los términos "purificar", "aumentar la pureza", "separar", o "aislar", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a aumentar la relación de la proteína diana a una o más de otras proteínas en una mezcla al eliminar selectivamente una o más de otras proteínas de la mezcla mediante el uso de los métodos que se describen en la presente descripción. Típicamente, la pureza de la proteína diana aumenta en un 50 %, o en un 60 %, o en un 70 %, o en un 80 %, o en un 90 % o más, siguiendo la eliminación de una o más de otras proteínas presentes en la muestra que contiene la proteína diana.
Como se usan indistintamente en la presente descripción, los términos "eliminar selectivamente" y "eliminación selectiva" se refieren a eliminar una proteína de una mezcla de dos o más proteínas al exponer la mezcla a un material carbónico (por ejemplo, carbón activado) bajo condiciones de pH, que se encuentran dentro de aproximadamente 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína que se elimina. Por consiguiente, en varias modalidades que se describen en la presente descripción, se añade carbón activado a una mezcla de dos o más proteínas bajo condiciones de pH que se encuentran cerca del punto isoeléctrico de una proteína que se desea eliminar, lo que resulta así en que el carbón activado se una a la proteína. El carbón activado se elimina posteriormente de la mezcla, lo que resulta así en la eliminación de la proteína que se une.
Los términos "proceso de flujo continuo", "modo de flujo continuo" y "cromatografía de flujo continuo", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una técnica de separación de productos en la que al menos un producto en una muestra se pretende hacer fluir a través de un medio carbónico, mientras que al menos un componente potencial se une al medio carbónico (por ejemplo, carbón activado).
La muestra que se pretende hacer fluir se denomina generalmente como la "fase móvil". El "modo de flujo continuo" es generalmente una operación isocrática (es decir, un proceso durante el que la composición de la fase móvil no cambia). El medio que se usa para el flujo continuo se equilibra previamente de forma usual con la misma solución tampón que contiene la molécula de proteína diana. Después de la purificación, el medio se puede lavar con una cantidad adicional del mismo tampón para aumentar la recuperación del producto.
El término "tampón" se refiere a una solución que resiste los cambios de pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Varios tampones que se pueden emplear en los métodos que se describen en la presente descripción se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). Diferentes tampones mantienen diferentes intervalos de pH, por ejemplo, el tampón de fosfato se usa de forma usual para un pH entre 6,0 y 8,0, mientras que, para un pH más alto, se puede usar un tampón de borato, y para pH inferior, se puede usar un tampón de carbonato. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente un tampón adecuado para usar, dependiendo del pH que se va a mantener. Los ejemplos no limitantes de tampones que se pueden usar en los métodos de acuerdo con la presente invención incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato, carbonato, borato y amonio, así como también combinaciones de estas.
El término "tampón de lavado" o "tampón de equilibrio" que se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a un tampón que se usa para lavar o reequilibrar el material carbónico antes de poner en contacto una mezcla de proteínas con el material carbónico.
El término "conductividad" se refiere a la capacidad de una solución acuosa para conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye por transporte de iones. Por lo tanto, con un aumento de la cantidad de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una conductividad más alta. La unidad de medida de la conductividad es miliSiemens por centímetro (mS/cm o mS), y se puede medir mediante el uso de un conductímetro disponible comercialmente (por ejemplo, vendido por Orion). La conductividad de una solución se puede alterar mediante el cambio de la concentración de iones en ella. Por ejemplo, la concentración de un agente tamponador y/o la concentración de una sal (por ejemplo, NaCl o KCl) en la solución se puede alterar con el fin de alcanzar la conductividad que se desea. Preferentemente, la concentración de sal de varios tampones se modifica para alcanzar la conductividad que se desea como en los Ejemplos más abajo.
El "pI" o "punto isoeléctrico" de un polipéptido se refiere al pH al que la carga positiva del polipéptido equilibra su carga negativa, el pI se puede calcular a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos o residuos de ácido siálico de los carbohidratos que se unen del polipéptido o se puede determinar mediante el uso de uno o más de los siguientes métodos que son bien conocidos en la técnica: gel de electroforesis de enfoque isoeléctrico; electroforesis de enfoque isoeléctrico capilar; cromatoenfoque; precipitación isoeléctrica; y cromatografía de intercambio iónico.
II. Materiales carbónicos ejemplares para su uso en los métodos aquí que se describen
En los métodos de acuerdo con la presente invención, determinados materiales carbónicos tales como, carbón activado, se usan para la eliminación selectiva de proteínas. El carbón activado se puede describir como un sólido poroso con una superficie muy alta. En algunas modalidades, el carbón activado comprende carbón vegetal activado. El carbón activado se puede derivar de una variedad de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, carbón, madera, cáscara de coco, cáscaras de nueces y turba. El carbón activado se puede producir a partir de estos materiales mediante el uso de la activación física que implica el calentamiento bajo una atmósfera que se controla o la activación química mediante el uso de ácidos, bases, u oxidantes fuertes. Los procesos de activación producen una estructura porosa con una alta área de superficie que le da al carbón activado una mayor capacidad para la eliminación de impurezas. Los procesos de activación se pueden modificar para controlar la acidez de la superficie.
El carbón activado se encuentra disponible en una amplia variedad de fuentes comerciales y viene en un número de grados y formatos. Algunos de los proveedores comerciales de carbón activado incluyen empresas tales como MeadWestVaco Corp., Richmond, VA, Estados Unidos; Norit Americas Inc., Marshall. TX, Estados Unidos; Calgon Carbon Corp., Pittsburgh. PA, Estados Unidos.
En algunas modalidades que se describen en la presente descripción, el carbón activado se incorpora en un medio fibroso que contiene celulosa, como se describe en la presente descripción.
Los materiales de carbón activado comercialmente disponibles que se pueden emplear en los métodos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, carbón activado Nuchar Hd (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos); Nuchar SA 20 (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos); Nuchar SN (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos); Nuchar WV-B 30 (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos); Carbón activado en polvo RGC (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos); Carbón activado Norit Darco KB-G (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); Carbón activado Norit CGP Super (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); Norit A Supra USP (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); Norit E Supra USP (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); Norit C GRAN (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); Norit SX Ultra (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos); y carbón activado Chemviron Pulsorb PGC (Chemviron Carbon, Feluy, Bélgica).
Los dos formatos principales de carbón activado son en polvo y granulado. El carbón activado en polvo contiene partículas pequeñas y de forma usual de menos de 1 mm de diámetro, y se usa más comúnmente para la purificación de líquidos. El carbón activado granular tiene un tamaño de partícula más grande y en consecuencia, un área superficial más pequeña, por lo que se prefiere para su uso en la purificación de gas donde la velocidad de difusión es más rápida.
Una consideración importante para la seguridad con el uso de carbón activado en aplicaciones de consumo (tales como agua, alimentos, bebidas, y purificaciones farmacéuticas) es la reducción y el control de compuestos extraíbles. El carbón activado que se pretende para aplicaciones en contacto con agua potable y alimentos se produce de forma usual de acuerdo con la norma de seguridad ANS1/NSF Standard 61 que cubre todos los aditivos indirectos al agua. Además, el método de prueba estándar ASTM D6385 describe la determinación del contenido de ácido extraíble en carbón activado mediante incineración y se podría usar para estudiar y minimizar el nivel de extraíbles del carbón activado.
Se encuentra disponible una gama de tipos de carbón activado para varias aplicaciones. Por ejemplo, MeadWestVaco Corp. suministra al menos doce tipos de carbón activado en polvo que varían por su capacidad, acidez superficial, accesibilidad de los poros que se dirigen a las moléculas, y la aplicación que se pretende. Es generalmente deseable maximizar la capacidad del carbón activado para la eliminación de las impurezas.
En algunas modalidades que se describen en la presente descripción, el carbón activado se incorpora en un medio de celulosa.
III. Uso de Material Carbónico en Procesos de Purificación
Un procedimiento general que se puede usar para eliminar selectivamente una proteína de una solución que contiene al menos dos proteínas se describe más abajo.
En algunas modalidades, la proteína que se va a eliminar selectivamente mediante el uso de los métodos que se describen en la presente descripción es una proteína o impureza proteica no deseada, que se puede eliminar mediante el tratamiento estático de la mezcla con carbón activado. El pH de una solución que contiene al menos dos proteínas se ajusta a un pH que se encuentra dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína o impureza proteica que se va a eliminar selectivamente. El pH se puede ajustar mediante la adición de ácido o base a la solución. El pH de la solución también se puede ajustar mediante la dilución de la solución con un tampón que tiene el pH de la solución que se desea o mediante diálisis o diafiltración de la solución en un tampón que tenga el pH de la solución que se desea. El carbón activado se añade posteriormente a la solución de pH que se ajusta ya sea en forma seca o en suspensión en una solución acuosa. La solución se deja interactuar después con el carbón activado por un período de tiempo de hasta 48 horas. El carbón activado se mantiene preferentemente en suspensión dentro de la solución con el fin de maximizar la velocidad de adsorción de impurezas proteicas. La solución se puede agitar mediante el movimiento del recipiente de la solución o la agitación de la solución con una barra de agitación magnética o la agitación de la solución con un agitador mecánico.
El carbón activado se separa después de la solución, donde el carbón activado se une a la proteína que se va a eliminar selectivamente. El carbón activado que se une se puede separar mediante la filtración de la solución y la recuperación del filtrado de la solución. Alternativamente, el carbón activado que se une se puede separar mediante la centrifugación de la solución o dejando que el carbón activado que se une sedimente y la recuperación de la solución sobrenadante. Si permanecen partículas finas en el sobrenadante después de la centrifugación o la sedimentación, se pueden eliminar mediante filtración. La solución que permanece contiene niveles reducidos de la proteína que se elimina selectivamente.
En otra modalidad, se puede usar el siguiente procedimiento para eliminar selectivamente una proteína de una solución que contiene al menos dos proteínas.
El pH de una solución que contiene al menos dos proteínas se ajusta a un pH que es 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína que se desea eliminar selectivamente. El pH se puede ajustar mediante la adición de un ácido o una base a la solución. El pH de la solución también se puede ajustar mediante la dilución de la solución con un tampón que tiene el pH que se desea. Adicionalmente, el pH de la solución se puede ajustar mediante diálisis o diafiltración de la solución en un tampón que tiene el pH que se desea.
En algunas modalidades, un dispositivo de cromatografía, por ejemplo, una columna, se carga con una suspensión acuosa de carbón activado. El carbón activado también se puede cargar en un dispositivo, por ejemplo, una columna, como un polvo seco y se humedece con una solución acuosa. Sin embargo, a veces puede ser difícil eliminar las pequeñas burbujas de aire de entre las partículas de carbón activado cuando la columna se empaqueta en seco. La columna se equilibra después con un tampón que tiene el mismo pH que la solución que contiene las proteínas. Después la solución se pasa posteriormente a través de la columna de carbón activado a un régimen de flujo que resulta en un tiempo de residencia de la columna de entre 15 segundos y 10,0 minutos. El eluato de la columna se recolecta después que no contiene o contiene niveles reducidos de la proteína que se eliminó selectivamente mediante el uso del carbón activado.
En varias modalidades, el carbón activado que se une a la proteína que se va a eliminar selectivamente se puede eliminar de la muestra que contiene la proteína diana mediante filtración o centrifugación o una combinación tanto de centrifugación como filtración.
Cuando se comienza con una mezcla de proteínas, el punto isoeléctrico de todas las proteínas en la mezcla se puede determinar fácilmente al someter la mezcla a un gel de electroforesis de enfoque isoeléctrico o un enfoque isoeléctrico capilar. Se puede alcanzar una resolución adicional de mezclas complejas mediante análisis por electroforesis en gel bidimensional que separa las proteínas tanto por su punto isoeléctrico como por su tamaño. En base a esta información, las condiciones de la solución se pueden ajustar cuando se usa carbón activado para eliminar proteínas distintas de la proteína diana, como se describe en la presente descripción.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben interpretar como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Aprovechamiento del pH de la solución para eliminar selectivamente el citocromo C o la a-lactoalbúmina de una solución 1 a 1 en peso con carbón activado
Este ejemplo representativo demuestra que una proteína se puede eliminar selectivamente de una mezcla de dos proteínas, inicialmente presentes en concentraciones iguales en la mezcla, mediante el uso de carbón activado mediante la manipulación del pH de la solución de partida. En este experimento, se obtuvo la eliminación selectiva ya sea de citocromo C o a-lactoalbúmina con carbón activado mediante el uso de una solución de pH en las proximidades del punto isoeléctrico de la proteína que se desea eliminar selectivamente.
Se trató una solución 1 a 1 en peso de citocromo C y a-lactoalbúmina con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas, como se describe más abajo.
Se preparó una solución madre de proteína 1 a 1 en peso al disolver 200 mg de a-lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto L5385, número de lote 110M7003V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) y 200 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 041M7008V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) en 100 mL de agua. La solución madre se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL para cada uno de los pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond, Va , Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado para cada uno de los pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 como controles sin carbón activado. Después se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, 5,0, 6,0 0 Tris 50 mM para pH 7,0, 8,0, 9,0). Después se añadieron a cada tubo 2,5 mL de la solución madre de proteína 1 a 1 que contiene 2,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 2,0 mg/mL de citocromo C. Las soluciones resultantes tienen 1,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 1,0 mg/mL de citocromo C. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-CV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar cualquier partícula de carbón activado que puede permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Instrumento: Agilent 1290 UPLC. Columna: Higgins Analytical Targa C18, Fase móvil: Disolvente A-ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua MilliQ, disolvente B-ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo al 100 % (grado HPLC), régimen de flujo: 1 mL/min. gradiente: 0-15 min, 5 %-95 % B, con un tiempo posterior de 10 minutos para reequilibrar la columna, longitud de onda del detector UV: 230 nm (referencia 550 nm, temperatura: 25 °C). La recuperación de las proteínas se calculó en base a las áreas que se miden en los picos de HPLC.
Como se resume en la Tabla I más abajo y se representa en la Figura 1, este experimento demuestra que es posible eliminar selectivamente una única proteína de una solución que se compone de dos proteínas con diferentes puntos isoeléctricos mediante el ajuste del pH de la solución de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar. Por ejemplo, siguiendo tratamiento de la solución de proteína 1 a 1 en peso con carbón activado a pH 4,0, que resulta estar cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina, la composición de citocromo C en la solución se enriquece de 50 % a 77 %, mientras que la composición de a-lactoalbúmina en la solución se redujo de 50 % a 23 %.
Por el contrario, el tratamiento de la solución de proteína 1 a 1 en peso con carbón activado a pH 9,0, que resulta estar cerca del punto isoeléctrico del citocromo C, enriquece la composición de la solución de a-lactoalbúmina de 50 % a 100 %, mientras que la composición de la solución de citocromo C se reduce de 50 % a 0 %.
La Figura 1 representa el porcentaje de la composición de citocromo C y a-lactoalbúmina en soluciones que se componen de 1,0 mg/mL de citocromo C y 1,0 mg/mL de a-lactoalbúmina (relación 50 %:50 %) siguiendo el tratamiento con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas. Como es mostrado, el carbón activado elimina selectivamente el citocromo C cuando el pH de la solución se encuentra cerca de su punto isoeléctrico de 10,0-10,5 y elimina selectivamente la a-lactoalbúmina cuando el pH de la solución se encuentra cerca de su punto isoeléctrico de 4,8. El gráfico indica el resultado inesperado de que el carbón activado se puede usar para eliminar selectivamente una proteína cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar.
Tabla I. La recuperación de citocromo C, la recuperación de a-lactoalbúmina, y la relación de citocromo C a a-lactoal búmina después de soluciones que se componen de 1,0 mg/mL de citocromo C y 1,0 mg/mL de a-lactoalbúmina (rel ación 50 %:50 %) se trataron con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0 bajo condiciones estáticas.
PH recuperación de citocromo C recuperación de a- relación de citocromo C: a lactoalbúmina lactoalbúmina
4 94 % 28 % 77 %:23 %
5 82 % 26 % 76 %:24 %
6 63 % 46 % 58 %:42 %
7 46 % 58 % 44 %:56 %
8 26 % 69 % 27 %:73 %
9 0 % 77 % 0 %:100 %
Ejemplo 2. Eliminación selectiva del citocromo C de una solución que contiene tanto citocromo C como a-lactoalbúmina
Este ejemplo representativo demuestra que una proteína no deseada o un modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene una proteína diana mediante el uso de carbón activado, cuando el pH de la solución de partida se manipula de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la proteína no deseada o modelo de impureza proteica. En este experimento, se trató una solución de a-lactoalbúmina que contiene 100,000 ppm de citocromo C, que puede ser análogo a los niveles de muchas impurezas proteicas, con carbón activado a pH 4,0 o 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar que el citocromo C se puede eliminar selectivamente y de manera eficiente con carbón activado mediante la elección de un pH de solución cercano al punto isoeléctrico del citocromo C.
Se preparó una solución a partir de 400 mg de a-lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto L5385, número de lote 110M7003V, Sigma-Aldrich Corporation. San Louis. MO, 63103. Estados Unidos). 40 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 84H7133 Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) Y 40 mL de agua. La solución madre de proteína se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL para pH 4,0 y pH 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond. VA, Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado a pH 4,0 y pH 9,0 como controles sin carbón activado. Después se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón a pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, Tris 50 mM para pH 9,0). Posteriormente, se añadieron a cada tubo 2,5 mL de la solución madre de proteína que tiene 10,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 1,0 mg/mL de citocromo C en agua. Esto resultó en una solución con 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina, 0,5 mg/mL de citocromo C, y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar las partículas de carbón activado que pueden permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Instrumento: Agilent 1290 UPLC. Columna: Higgins Analytical Targa C18. Fase móvil: Disolvente A-ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua MilliQ, disolvente B-ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo al 100 % (grado HPLC), régimen de flujo: 1 mL/min, gradiente: 0-15 min, 5 %-95 % B, con un tiempo posterior de 10 minutos para reequilibrar la columna, longitud de onda del detector UV: 230 nm (referencia de 550 nm, temperatura: 25 °C). La recuperación de las proteínas se calculó en base a las áreas que se miden en los picos de HPLC.
Como se demuestra por los resultados en la Tabla II, el citocromo C, que se usa como modelo de impureza proteica, se eliminó selectivamente y de manera eficiente de la solución que contiene citocromo C y a-lactoalbúmina a pH 9,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C (pl 10,0 -10,5). En contraste, muy poco del citocromo C se elimina de la solución a pH 4,0, que se encuentra más lejos del punto isoeléctrico del citocromo C.
Por consiguiente, se podría realizar una separación similar para eliminar cualquier impureza proteica que pueda estar presente en una solución que contiene una proteína diana de interés, mediante la adición de carbón activado a la solución que tiene un pH que se encuentra cerca al punto isoeléctrico de la impureza proteica.
Tabla II. La recuperación de a-lactoalbúmina, la concentración del citocromo C y el LRV del citocromo C que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 0,5 mg/mL de citocromo C (100 000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0 o pH 9,0.
recuperación de a- valor de reducción pH concentración de citocromo C (ppm) lactoalbúmina logarítmica de citocromo C
4 84 % 113420 -0,05
9 93 % 13794 0,86
Ejemplo 3. Eliminación selectiva de la proteína a-lactoalbúmina de una solución de citocromo C
Este ejemplo representativo demuestra adicionalmente que aun otra proteína no deseada o modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene una proteína diana mediante el uso de carbón activado cuando el pH de la solución de partida se acerca al punto isoeléctrico de la proteína no deseada o modelo de impureza proteica. En contraste con el Ejemplo 2, el modelo de impureza que se va a eliminar aquí es a-lactoalbúmina. En este experimento, se trató una solución de citocromo C con 100000 ppm de a-lactoalbúmina con carbón activado a pH 4,0 o 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar que la a-lactoalbúmina también se puede eliminar selectivamente y de manera eficiente con carbón activado mediante la elección de un pH de solución cerca del punto isoeléctrico de la proteína a-lactoalbúmina.
Se preparó una solución a partir de 400 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 84H7135 Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos), 40 mg de a- lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto L5385, número de lote 110M7003V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis. MO, 63103, Estados Unidos) y 40 mL de agua. La solución madre de proteína se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL para pH 4,0 y pH 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA. Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado para pH 4,0 y pH 9,0 como controles sin carbón activado. Posteriormente. se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, Tris 50 mM para pH 9,0). Esto fue seguido por la adición de 2,5 mL de la solución madre de proteína que tiene 10,0 mg/mL de citocromo C y 1,0 mg/mL de a-lactoalbúmina en agua a cada tubo, lo que resultó en una solución con 5,0 mg/mL de citocromo C. 0,5 mg/mL de a-lactoalbúmina y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar cualquier partícula de carbón activado que puede permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Instrumento: Agilent 1290 UPLC, Columna: Higgins Analytical Targa C18, Fase móvil: Disolvente A-ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua MilliQ, Disolvente B-ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo al 100 % (grado HPLC), régimen de flujo: 1 mL/min, gradiente: 0-15 min, 5 %-95 % B, con un tiempo posterior de 10 minutos para reequilibrar la columna, longitud de onda del detector UV: 230 nm (referencia de 550 nm, temperatura: 25 °C). La recuperación de las proteínas se calculó en base a las áreas que se miden en los picos de HPLC.
Como se demuestra en la Tabla III, la proteína a-lactoalbúmina se eliminó selectivamente y de manera eficiente de la solución que contiene tanto citocromo C como a-lactoalbúmina a pH 4,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina (pI 4,8). En contraste, muy poca de la proteína a-lactoalbúmina se elimina a pH 9,0, que está más lejos del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina.
Por consiguiente, tanto el Ejemplo 2 como 3 confirmaron adicionalmente que una proteína se puede eliminar selectivamente y de manera efectiva de una solución mediante el uso de carbón activado, si el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar mediante el uso de carbón activado. Este descubrimiento es tanto nuevo como inesperado y se puede usar en muchos casos diferentes, donde es deseable eliminar una proteína específica de una solución o eliminar una proteína de una mezcla de proteínas.
Tabla III. La recuperación de citocromo C, la concentración de la a-lactoalbúmina, y el LRV de la a-lactoalbúmina que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de citocromo C y 0,5 mg/mL de alactoalbúmina (100000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0 o pH 9,0.
na valor de reducción recuperación de citocromo concentración de a-lactoalbúmi
pH C (ppm) logarítmica de alactoalbúmina
4 95 % 5873 1,23
9 82 % 88968 0,05
Ejemplo 4. pH óptimo de la solución para la eliminación de una proteína de una mezcla que contiene un anticuerpo monoclonal
Este ejemplo representativo demuestra que un modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene un anticuerpo monoclonal como proteína diana, mediante el uso de carbón activado, cuando el pH de la solución de partida se acerca al punto isoeléctrico de la impureza. Se trató una solución que contiene anticuerpo monoclonal AcM I y 200000 ppm de citocromo C con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0. 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar que el citocromo C se puede eliminar selectivamente y de manera eficiente de la solución mediante el uso de carbón activado cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C.
Se dializó una solución de 10,0 mg/mL de anticuerpo monoclonal AcM I en agua para eliminar las sales del tampón con el tubo de diálisis (estuches de prueba de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3, MWCO de 3,5 K, ANCHO PLANO de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220 Estados Unidos). Una porción de la solución de AcM I que se dializó, se concentró después mediante el uso de unidades de filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 (3 kDa, número de catálogo: UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos). La porción que se concentró de la solución se recombinó con el resto de la solución de AcM I que se dializó para dar una solución madre con una concentración de 10,0 mg/mL. La solución madre de AcM I se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821. Estados Unidos).
Se disolvieron 200 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 041 M7008V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) en 100 mL de la solución de AcM I de 10,0 mg/mL. La solución madre se filtró a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, Ma , 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado, para pH 4,0, 5,0, 6,0. 7,0, 8,0, y 9,0 como controles sin carbón activado. Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, 5,0, 6,0 o Tris 50 mM para pH 7,0, 8,0, 9,0). Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de la solución madre que contiene 10,0 mg/mL de AcM I y 2 mg/mL de citocromo C. Las soluciones resultantes tienen 5,0 mg/mL de AcM I, 1,0 mg/mL de citocromo C, y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones, membrana Durapore PVDF. EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar las partículas de carbón activado que pueden permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Instrumento: HPLC Agilent 1260; Columna: Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000; Fase móvil: fosfato de sodio 0,2 M pH 7,0; régimen de flujo: 0,35 mL/min, gradiente isocrático, tiempo de ciclo de 15 min; longitud de onda del detector UV: 230 nm; temperatura: 25 grados C). La recuperación de cada proteína se calculó en base a las áreas A230 que se miden en los picos de HPLC.
El Ejemplo demuestra, como se resume en la Tabla IV y en la Figura 2, el descubrimiento inesperado de que el citocromo C, que es una impureza en este caso, se elimina de manera eficiente y selectivamente de la solución que contiene el anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C. Por consiguiente, cuando la solución se encontraba a pH 9,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C (es decir, pI 10,0-10,5), se eliminó 0,9 del LRV del citocromo C. En contraste, solo 0,01 del LRV del citocromo C se eliminó por carbón activado a pH 4,0, que se encuentra más lejos del punto isoeléctrico del citocromo C.
El gráfico en la Figura 2 representa el valor de reducción logarítmica (LRV) del citocromo C que se elimina de una solución de anticuerpo monoclonal (AcM 1) que se trata con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0. 8,0, y 9,0 bajo condiciones estáticas. La mayor cantidad de citocromo C se elimina a pH 9,0, donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico del citocromo C de 10,0-10,5. El gráfico ejemplifica el descubrimiento inesperado de que el carbón activado elimina de manera más eficiente una proteína de una solución de anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar.
Por consiguiente, este Ejemplo demuestra el descubrimiento nuevo e inesperado de que el carbón activado se puede usar para eliminar una impureza proteica de una solución que contiene una proteína de interés mediante la manipulación del pH de la solución de manera que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la impureza.
Tabla IV. La recuperación del anticuerpo monoclonal AcM I, la concentración del citocromo C y el LRV del citocromo C que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de AcM I y 1,0 mg/mL de citocromo C (200000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0 bajo condiciones estáticas.
recuperación de AcM
PH concentración de citocromo C (ppm) LRV del citocromo C I
4 > 99 % 193948 0,01
5 99 % 101496 0,29
6 97 % 90 581 0,34
7 94 % 63 577 0,50
8 97 % 47 793 0,62
9 > 99 % 25 271 0,90
Ejemplo 5. pH óptimo de la solución para la eliminación de una proteína de una solución que contiene un anticuerpo monoclonal
Este ejemplo representativo demuestra que una proteína no deseada o un modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene un anticuerpo monoclonal como proteína diana, mediante el uso de carbón activado, cuando el pH de la solución de partida se acerca al punto isoeléctrico de la proteína no deseada 0 impureza proteica. En contraste con el Ejemplo 4, el modelo de impureza aquí es a-lactoalbúmina.
Se trató una solución que contiene un anticuerpo monoclonal y 200000 ppm de a-lactoalbúmina con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar adicionalmente que el carbón activado se puede usar para la eliminación selectiva y eficiente de aun otro proteína (es decir, a-lactoalbúmina) de una solución que contiene una proteína de interés (es decir, un anticuerpo monoclonal en este caso) mediante la manipulación del pH de la solución de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina.
Se dializó una solución de 10,0 mg/mL de anticuerpo monoclonal AcM I en agua para eliminar las sales tampón con el tubo de diálisis (estuches de prueba de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3, MWCO de 3,5 K, ANCHO PLANO de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Domínguez, CA, 90220 Estados Unidos). Una porción de la solución de AcM I que se dializó, se concentró después mediante el uso de unidades de filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 (3 kDa, número de catálogo: UPC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos). La porción que se concentró de la solución se recombinó con el resto de la solución de AcM 1 que se dializó para dar una solución madre con una concentración de 10,0 mg/mL. La solución madre de MAB 1 se filtró luego a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se disolvieron 200 mg de a-lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto 1.5385, número de lote 110M7003V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) en 100 mL de la solución de AcM I de 10,0 mg/mL. La solución madre se filtró a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, Ma , 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation. Richmond, VA, Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado para cada uno de los valores de pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 como controles sin carbón activado. Posteriormente, se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, 5,0, 6,0 o Tris 50 mM para pH 7,0, 8,0, 9,0). Se añadieron posteriormente a cada tubo 2,5 mL de la solución madre que contiene 10,0 mg/mL de AcM I y 2,0 mg/mL de a-lactoalbúmina. Las soluciones resultantes tienen 5,0 mg/mL de AcM I, 1 mg/mL de a-lactoalbúmina, y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones, membrana Durapore PVDF. EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar las partículas de carbón activado que pueden permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Instrumento: HPLC Agilent 1260; Columna: Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000; Fase móvil: fosfato de sodio 0,2 M pH 7,0; régimen de flujo: 0,35 mL/min, gradiente isocrático, tiempo de ciclo de 15 min; longitud de onda del detector UV: 230 nm; temperatura: 25 grados C). La recuperación de cada proteína se calculó en base a las áreas A230 que se miden en los picos de HPLC.
Este ejemplo, que se resume en la Tabla V y en la Figura 3, demuestra, junto con el Ejemplo 4, que el carbón activado se puede usar para eliminar selectivamente y de manera eficiente prácticamente cualquier proteína no deseada (alactoalbúmina en este caso) presente en una solución que contiene una proteína de interés (un anticuerpo monoclonal en este caso), simplemente mediante el ajuste del pH de la solución de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la proteína no deseada. En este caso, la a-lactoalbúmina se eliminó selectivamente y de manera eficiente de la solución que contiene un anticuerpo monoclonal, cuando el pH de la solución se encontraba cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina. Por ejemplo, cuando la solución se encontraba a pH 5,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina (pl 4,8), se eliminó 0,57 del LRV de la a-lactoalbúmina. En contraste, solo 0. 12 del LRV de la a-lactoalbúmina se eliminó mediante carbón activado a pH 9,0, que se elimina adicionalmente de gran parte del punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina.
El gráfico en la Figura 3 representa el valor de reducción logarítmica (LRV) de a-lactoalbúmina que se extrae de una solución de anticuerpo monoclonal (AcM I) que se trata con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 bajo condiciones estáticas. Como es mostrado, la mayor cantidad de a-lactoalbúmina se eliminó a pH 5,0, donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico de la a-lactoalbúmina de 4,8. El gráfico indica el descubrimiento inesperado de que el carbón activado elimina de manera más efectiva una proteína de una solución de anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar.
Tabla V. La recuperación de anticuerpo monoclonal AcM I, la concentración de la a-lactoalbúmina y el LRV de la alactoalbúmina que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de AcM 1 y 1 mg/mL de a-lactoalbúmina (200 000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0 bajo condiciones estáticas.
PH recuperación de AcM I concentración de a-lactoalbúmina LRV de la a-lactoalbúmina (PPm)
4 > 99 % 60 586 0,52
5 > 99 % 53 655 0,57
6 98 % 66236 0,48
7 96 % 71 522 0,45
8 97 % 110416 0,26
9 97 % 151 730 0,12
Ejemplo 6. pH óptimo de la solución para la eliminación de una proteína de una mezcla que contiene un anticuerpo monoclonal
Este ejemplo representativo demuestra que una proteína no deseada o un modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene un anticuerpo monoclonal como proteína diana, mediante el uso de carbón activado, cuando el pH de la solución de partida se acerca al punto isoeléctrico de la proteína no deseada 0 impureza proteica. En contraste con los Ejemplos 4 y 5, el modelo de impureza aquí es la lisozima.
Se trató una solución que contiene anticuerpo monoclonal AcM I y 200000 ppm de lisozima con carbón activado a pH 4,0. 5,0, 6,0. 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar que la lisozima se puede eliminar selectivamente y de manera efectiva de la solución mediante el uso de carbón activado cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la lisozima.
Se dializó una solución de 10,0 mg/mL de anticuerpo monoclonal AcM I en agua para eliminar las sales del tampón con el tubo de diálisis (estuches de prueba de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3, MWCO de 3,5 K, ANCHO PLANO de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, 90220 Estados Unidos). Una porción de la solución de AcM I que se dializó, se concentró después mediante el uso de unidades de filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 (3 kDa, número de catálogo: UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821. Estados Unidos). La porción que se concentró de la solución se recombinó con el resto de la solución de AcM I que se dializó para dar una solución madre con una concentración de 10,0 mg/mL. La solución madre de AcM 1 se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se disolvieron 80 mg de lisozima de clara de huevo de gallina (>98 % mediante SDS-PAGE, número de producto L4919, número de lote 100M1897V1, Sigma-Aldrich Corporation San Luis. MO, 63103, Estados Unidos) en 40 mL de la solución de AcM I de 10,0 mg/mL. La solución madre se filtró a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation. Billerica, Ma , 01821, Estados Unidos).
Se cargó un tubo de centrífuga para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation. Richmond, VA, Estados Unidos). Se usaron tubos de centrífuga de 15 mL por separado para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 como controles sin carbón activado. Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0. 5,0, 6,0 o Tris 50 mM para pH 7,0, 8,0, 9,0). Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de la solución madre que contiene 10,0 mg/mL de AcM I y 2 mg/mL de lisozima. Las soluciones resultantes tienen 5,0 mg/mL de AcM I, 1,0 mg/mL de lisozima y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821. Estados Unidos) con el fin de eliminar las partículas de carbón activado que pueden permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Instrumento: HPLC Agilent 1260; Columna: Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000; Fase móvil: fosfato de sodio 0,2 M pH 7,0; régimen de flujo: 0,35 mL/min, gradiente isocrático, tiempo de ciclo de 15 min; longitud de onda del detector UV: 230 nm: temperatura: 25 grados C). La recuperación de cada proteína se calculó en base a las áreas A230 que se miden en los picos de HPLC.
Este ejemplo demuestra, como se resume en la Tabla VI y en la Figura 4, el descubrimiento inesperado de que la lisozima, que se clasifica como una impureza en este caso, se elimina de manera eficiente y selectivamente de la solución que contiene el anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de lisozima. Por consiguiente, cuando la solución tiene un pH de 9,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la lisozima (es decir, pI 11,2-11,3), se eliminó 0,47 del LRV de la lisozima. En contraste, sólo 0,08 del LRV de la lisozima se eliminó mediante carbón activado a pH 4,0, que se encuentra más lejos del punto isoeléctrico de la lisozima.
El gráfico de la Figura 4 muestra el valor de reducción logarítmica (LRV) de la lisozima que se extrae de una solución de anticuerpo monoclonal (AcM I) que se trata con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 bajo condiciones estáticas. Como es mostrado, la mayor cantidad de lisozima se elimina a pH 9,0, donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico de la lisozima de 11,2-11,3. El gráfico demuestra el descubrimiento inesperado de que el carbón activado elimina de manera más efectiva una proteína de una solución de anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar.
Por consiguiente, este Ejemplo, junto con los Ejemplos 4 y 5, demuestra el descubrimiento nuevo e inesperado de que se puede usar carbón activado para eliminar una impureza proteica de una solución que contiene una proteína de interés mediante la manipulación del pH de la solución de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la impureza.
Tabla VI. La recuperación de anticuerpo monoclonal AcM I, la concentración de lisozima y el LRV de la lisozima que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de AcM I y 1,0 mg/mL de lisozima (200000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0 bajo condiciones estáticas.
PH recuperación de AcM I concentración de lisozima (ppm) LRV de la lisozima
4 > 99 % 167222 0,08
5 98 % 119367 0,22
6 97 % 100302 0,30
7 96 % 88 381 0,35
8 > 99 % 81 721 0,39
9 > 99 % 67555 0,47
Ejemplo 7. pH óptimo de la solución para la eliminación de una proteína de una mezcla que contiene un anticuerpo monoclonal
Este ejemplo representativo demuestra que un modelo de impureza proteica se puede eliminar selectivamente de una solución que contiene un anticuerpo monoclonal como proteína diana, mediante el uso de carbón activado, cuando el pH de la solución de partida se acerca al punto isoeléctrico de la impureza proteica. En contraste con los Ejemplos 4, 5, y 6, el modelo de impureza que se usa en este ejemplo es BSA.
Una solución que contiene anticuerpo monoclonal AcM I y 100 000 ppm de BSA se trató con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 y 9,0 bajo condiciones estáticas para demostrar que la BSA se puede eliminar selectivamente y de manera eficiente de la solución mediante el uso de carbón activado cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de BSA.
Se dializó una solución de 10,0 mg/mL de anticuerpo monoclonal AcM I en agua para eliminar las sales del tampón con e l tubo de diálisis (estuches de prueba de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3. MWCO de 3,5 K, ANCHO PLANO de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220 Estados Unidos). Una porción de la solución de AcM I que se dializó, se concentró después para usar unidades de filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 (3 kDa, número de catálogo: UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos). La porción que se concentró de la solución se recombinó con el resto de la solución de AcM I que se dializó, lo que resultó en una solución madre con una concentración de 10,0 mg/mL. La solución madre de AcM I se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos).
Se disolvieron 40 mg de albúmina de suero bovino (>98 % mediante SDS-PAGE, número de producto A7906, número de lote SLBC0647V, Sigma-Aldrich Corporation San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) en 40 mL de la solución de AcM I de 10,0 mg/mL. La solución madre se filtró a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821. Estados Unidos).
Se cargó un tubo de centrífuga para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 con 10 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond. VA, Estados Unidos). Se usaron tubos de centrífuga de 15 mL por separado para pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 como controles sin carbón activado. Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, 5,0, 6,0 o Tris 50 mM para pH 7,0, 8,0, 9,0). Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de la solución madre que contiene 10,0 mg/mL de AcM I y 1 mg/mL de BSA. Las soluciones resultantes tienen 5,0 mg/mL de AcM I, 0,5 mg/mL de BSA y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar cualquier partícula de carbón activado que puede permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Instrumento: HPLC Agilent 1260; Columna: Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000; Fase móvil: fosfato de sodio 0,2 M pH 7,0; régimen de flujo: 0,35 mL/min, gradiente isocrático, tiempo de ciclo de 15 min; longitud de onda del detector UV: 230 nm; temperatura; 25 grados C). La recuperación de cada proteína se calculó en base a las áreas A230 que se miden en los picos de HPLC.
Este ejemplo demuestra, como se resume en la Tabla VII y en la Figura 5, que la BSA, que se usa como impureza proteica en este caso, se elimina de manera eficiente y selectivamente de la solución que contiene el anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la BSA. Por consiguiente, cuando la solución se encontraba a pH 5,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico de BSA (es decir, pI 4,9), se eliminó 0,40 del LRV de BSA. En contraste, solo 0,06 del LRV de BSA se eliminó mediante carbón activado a pH 9,0, que se encuentra más lejos del punto isoeléctrico de BSA.
El gráfico en la Figura 5 representa el valor de reducción logarítmica (LRV) de BSA que se extrae de una solución de anticuerpo monoclonal (AcM I) que se trata con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, y 9,0 bajo condiciones estáticas. Como es mostrado, la mayor cantidad de BSA se eliminó a pH 5,0, donde el pH de la solución se encuentra más cerca al punto isoeléctrico de BSA de 4,9. El gráfico respalda adicionalmente el resultado inesperado de que el carbón activado elimina de manera más efectiva una proteína de una solución de anticuerpo monoclonal cuando el pH de la solución se encuentra cerca del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar.
Por consiguiente, este ejemplo, junto con los ejemplos 4, 5, y 6, demuestra el descubrimiento nuevo e inesperado de que el carbón activado se puede usar para eliminar una impureza proteica de una solución que contiene una proteína de interés mediante la manipulación del pH de la solución de modo que se encuentre cerca del punto isoeléctrico de la impureza.
Tabla VII. La recuperación de anticuerpo monoclonal AcM I, la concentración de la BSA y el LRV de BSA que se elimina después de que las soluciones que se componen de 5,0 mg/mL de AcM I y 0,5 mg/mL de BSA (100000 ppm) se trataron con carbón activado a pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0 bajo condiciones estáticas.
pH recuperación de AcM I concentración de BSA (ppm) LRV de la BSA
4 > 99 % 51 105 0,29
5 99 % 39 565 0,40
6 99 % 57 960 0,24
7 > 99 % 65 014 0,19
8 99 % 86 505 0,06
9 99 % 87 149 0,06
Ejemplo 8. Eliminación selectiva de la proteína del citocromo C de una solución de a-lactoalbúmina mediante el uso de varios tipos diferentes de carbón activado
Este ejemplo representativo demuestra que los métodos que se describen en la presente descripción se pueden llevar a cabo con éxito mediante el uso de varios tipos diferentes de carbón activado.
Una solución de a-lactoalbúmina con 100000 ppm de citocromo C, que se usa como modelo de impureza proteica, se trató con varios tipos diferentes de carbón activado a pH 4,0 y pH 9,0. Este ejemplo demuestra que se pueden usar varios tipos diferentes de carbón activado para eliminar selectivamente y de manera efectiva una impureza proteica de una muestra que contiene una proteína diana mediante la elección de un pH de solución cercano al punto isoeléctrico de la impureza proteica.
Se preparó una solución mediante el uso de 800 mg de a-lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto L5385, número de lote 110M7003V. Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos), 80 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 84H7135 Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) y 80 mL de agua. La solución madre de proteína que consiste en 10,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 1,0 mg/mL de citocromo C en agua se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS. 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE. EMD Millipore Corporation, Billerica. MA. 01821, Estados Unidos).
Se cargaron tres tubos de centrífuga de 15 mL tanto a pH 4,0 como a pH 9,0 con 10 mg de carbón activado MeadWestVaco Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, Estados Unidos), 10 mg de carbón activado Norit Darco KB-G (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos), o 10 mg de carbón activado Norit CGP Super (Norit Americas Inc., Marshall, Texas, Estados Unidos). Se usaron tres tubos de centrífuga de 15 mL por separado a pH 4,0 y pH 9,0 como controles sin carbón activado. Se añadieron a cada tubo 2,5 mL de tampón al pH apropiado (acetato 50 mM para pH 4,0, Tris 50 mM para pH 9,0). Se añadieron posteriormente a cada tubo 2,5 mL de la solución madre de proteína que tiene 10,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 10 mg/mL de citocromo C en agua. Esto dio una solución con 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina, 0,5 mg/mL de citocromo C y una concentración de tampón de 25 mM. Se dejaron girar los tubos por 20 horas.
Los tubos se sometieron posteriormente a centrifugación y las soluciones sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 micrones (Unidad de filtro Millex-GV de 0,22 micrones Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821, Estados Unidos) con el fin de eliminar cualquier partícula de carbón activado que puede permanecer en suspensión en la solución. Las muestras se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Instrumento: Agilent 1290 UPLC. Columna: Higgins Analytical Targa C18, Fase móvil: Disolvente A-ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua MilliQ, disolvente B-ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo al 100 % (grado HPLC), régimen de flujo: 1 mL/min, gradiente: 0-15 min, 5 %-95 %. B, con un tiempo posterior de 10 minutos para reequilibrar la columna, longitud de onda del detector de UV: 230 nm (referencia de 550 nm, temperatura: 25 °C). La recuperación de las proteínas se calculó en base a las áreas que se miden en los picos de HPLC.
Este ejemplo demuestra, como se resume en la Tabla VIII, que el citocromo C, que se usa como modelo de impureza en la presente descripción, se puede eliminar selectivamente y de manera efectiva de la solución que contiene alactoalbúmina a pH 9,0, que se encuentra cerca del punto isoeléctrico del citocromo C (pI 10,0-10,5) mediante el uso de tres tipos diferentes de carbón activado probado. En contraste, muy poca impureza del citocromo C se elimina de la solución de a-lactoalbúmina a pH 4,0, que se encuentra mucho más lejos del punto isoeléctrico del citocromo C en el caso de los tres tipos de carbones activados probados. Por consiguiente, este ejemplo demuestra que la capacidad del carbón activado para eliminar impurezas proteicas no se limita a un tipo específico de carbón activado, sino que se aplica generalmente a una variedad de diferentes tipos de carbón activado.
Tabla VIII. La concentración del citocromo C en relación con a-lactoalbúmina en ppm que permanece en solución después del tratamiento con varios tipos diferentes de carbón activado a pH 4,0 y pH 9,0.
tipo de carbón activado concentración del
Figure imgf000020_0001
pH 4,0 pH 9,0
control (sin carbón activado) 100000 100000
MeadWestvaco Nuchar HD 87247 0
Norit Darko KB-G 92211 0
Norit CGP Super 92766 0
Ejemplo 9. Eliminación selectiva de la proteína del citocromo C de una solución de a-lactoalbúmina que se hace fluir a través de una columna que se empaqueta de carbón activado
Este ejemplo representativo demuestra que los métodos que se describen en la presente descripción se pueden llevar a cabo en un modo dinámico de flujo continuo mediante el uso de carbón activado que se empaqueta en un dispositivo. Como se demuestra en la presente descripción, el carbón activado se puede usar para eliminar selectivamente y de manera eficiente una proteína no deseada o impureza proteica de una muestra que contiene una proteína diana mediante la elección de un pH de solución cercano al punto isoeléctrico de la proteína no deseada o impureza proteica bajo condiciones de flujo dinámico.
Se preparó una solución mediante el uso de 1500 mg de a-lactoalbúmina de leche bovina (>85 % mediante PAGE, número de producto L5385, número de lote 110M7003V, Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos), 150 mg de citocromo C de corazón equino (>95 % mediante SDS-PAGE, número de producto C2506, número de lote 84H7135 Sigma-Aldrich Corporation, San Luis, MO, 63103, Estados Unidos) y 150 mL de agua. La solución madre de proteína que consiste en 10,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 1,0 mg/mL de citocromo C en agua se filtró después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS, 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, HMD Millipore Corporation. Billerica, MA. 01821, Estados Unidos).
Se preparó la solución madre a pH 4,0 mediante la mezcla de una porción de 60 mL de la solución madre en agua con 60 mL de acetato de sodio 50 mM a pH 4,0 para dar una solución con 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina, 0,5 mg/mL de citocromo C, y acetato 25 mM a pH 4,0. Se preparó la solución madre a pH 9,0 mediante la mezcla de una porción de 60 mL de la solución madre en agua con 60 mL de Tris 50 mM a pH 9,0 para dar una solución con 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina, 0,5 mg/mL de citocromo C, y Tris 25 mM a pH 9,0. Las soluciones madre se filtraron después a través de una membrana de 0,22 |_im (membrana Stericup-GP de 0,22 |_im Millipore Express PLUS. 250 mL, número de catálogo: SCGPU02RE, Em D Millipore Corporation, Billerica, MA, 01821. Estados Unidos).
Se cargaron dos columnas de cromatografía de vidrio (columna de referencia Omnifit de 10 mm/100 mm, 10 mm de diámetro. 100 mm de longitud, SKU: 006BCC-10-10-AF, Diba Industries, Danbury. CT 06810, Estados Unidos) con 200 mg de carbón activado Nuchar HD (MeadWestVaco Corporation, Richmond. VA, Estados Unidos) que se suspende en agua para dar un volumen de columna que se empaqueta de 0,8 mL. Las columnas se empaquetaron al hacer fluir un tampón acuoso a través de la suspensión de carbón activado. Una columna se equilibró con acetato de sodio 25 mM a pH 4,0 y la segunda se equilibró con Tris 25 mM a pH 9,0.
Se pasaron 100 mL de las soluciones madre a pH 4,0 o pH 9,0 a través de las columnas de carbón activado que se equilibran apropiadamente a 0,4 mL/min, lo que resulta en un tiempo de residencia de 2,0 minutos en la columna de carbón activado seguido de 12,5 mL de tampón (acetato de sodio 25 mM a pH 4,0, Tris 25 mM a pH 9,0). Se recolectaron nueve fracciones de 12,5 mL. Las fracciones individuales y una muestra combinada de las nueve se sometieron a análisis de HPLC de fase inversa. Las muestras se analizaron mediante HPLC de fase inversa (Instrumento: Agilent 1290 UPLC, Columna: Higgins Analytical Targa C18, Fase móvil: Disolvente A-ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua MilliQ, Disolvente B-ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo al 100 % (grado HPLC), régimen de flujo: 1 mL/min, gradiente: 0-15 min, 5 % -95 % B, con un tiempo posterior de 10 minutos para reequilibrar la columna, longitud de onda del detector UV: 230 nm (referencia de 550 nm, temperatura: 25 °C). La recuperación de las proteínas se calculó en base a las áreas que se miden en los picos de HPLC.
Los resultados de este ejemplo demuestran, como se resume en la Tabla IX y en la Tabla X así como también en las Figuras 6 y 7, que el carbón activado se puede usar para eliminar selectivamente y de manera eficiente una proteína no deseada o impureza proteica de una muestra que contiene una proteína diana mediante la elección de un pH de solución cercano al punto isoeléctrico de la proteína no deseada o impureza proteica bajo condiciones de flujo. La eliminación por flujo continuo del citocromo C, que se usa como un modelo de impureza proteica en este ejemplo, de una solución que contiene a-lactoalbúmina mediante el uso de carbón activado fue altamente dependiente del pH de la solución. A un pH de 4,0, el citocromo C pasó en la primera fracción junto con la a-lactoalbúmina. En contraste, a pH 9,0, no se observó el paso del citocromo C hasta la séptima fracción cuando la columna se había cargado con 1,09 kg de a-lactoalbúmina por L de carbón activado. La recuperación global de a-lactoalbúmina que se calcula a partir de una combinación de las fracciones individuales fue sólo del 88 % a pH 4,0 mientras que fue del 94 % a pH 9,0. Después de pasar la solución a través de la columna de carbón activado a pH 4,0, la concentración del citocromo C en relación con la a-lactoalbúmina aumentó de 100000 ppm a 106 125 ppm lo que resulta en un LRV del citocromo C de -0,03. En contraste, después de pasar la solución a través de la columna de carbón activado a pH 9,0, la concentración del citocromo C en relación con la a-lactoalbúmina disminuyó significativamente de 100 000 ppm a 10 584 ppm lo que resulta en un LRV del citocromo C de 0,98. Este ejemplo demuestra que el pH de la solución ideal para aumentar la pureza de una proteína diana en una muestra que usa carbón activado bajo condiciones de flujo es un pH de solución cerca del punto isoeléctrico de la impureza proteica o la proteína no deseada que se va a eliminar de la muestra. La Figura 6 representa la concentración del citocromo C y la a-lactoalbúmina en fracciones de 12,5 mL que se recolectaron después de pasar una solución de 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 0,5 mg/mL de citocromo C a pH 4 a través de una columna de carbón activado. El gráfico demuestra que la eliminación del citocromo C de la alactoalbúmina mediante el tratamiento con carbón activado bajo condiciones de flujo no es efectiva porque el pH de la solución de 4,0 se encuentra más lejos del punto isoeléctrico 10,0-10,5 del citocromo C.
La Figura 7 representa la concentración del citocromo C y la a-lactoalbúmina en fracciones de 12,5 mL que se recolectaron después de pasar una solución de 5,0 mg/mL de a-lactoalbúmina y 0,5 mg/mL de citocromo C a pH 9 a través de una columna de carbón activado. El gráfico demuestra que la eliminación del citocromo C de la alactoalbúmina mediante el tratamiento con carbón activado bajo condiciones de flujo es efectivo porque el pH de la solución de 9,0 se encuentra cerca del punto isoeléctrico de 10,0-10,5 del citocromo C.
Tabla IX. Concentración del citocromo C y la a-lactoalbúmina en mg/mL para las fracciones de columna que se recolectan, después de hacer fluir una solución que contiene 0,5 mg/mL de citocromo C y 5 mg/mL de a-lactoalbúmina a través de una columna de carbón activado a pH 4,0 o pH 9,0.
Figure imgf000021_0001
purificación a pH 9,0 carga de alactoalbúmina en concentración de concentración de concentración de concentración de acitocromo C a-lactoalbúmina citocromo C lactoalbúmina carbón acti (mg/mL) (mg/mL mg/mL) (mg/mL) (kg/L)
0,16 0,22 1,18 0,00 3,61 0,31 0,50 4,25 0,00 4,44 0,47 0,49 4,59 0,00 4,67 0,63 0,49 4,71 0,00 4,79 0,78 0,50 4,84 0,00 4,98 0,94 0,49 4,85 0,00 4,92 1,09 0,50 4,91 0,10 4,89 1,25
Figure imgf000021_0002
0,49 4,87
Figure imgf000021_0003
0,30 4,95
Tabla X. Concentración del citocromo C con relación a a-lactoalbúmina en ppm para las fracciones de columna que se recolectan, después de hacer fluir una solución que contiene 100 000 ppm de citocromo C en 5 mg/mL de alactoalbúmina a través de una columna de carbón activado a pH 4,0 o pH 9,0.
carga de la a-lactoal H 4,0-concentración d H 9,0-concentración de carbón activado po
citocromo C (ppm) citocromo C (ppm) (kg/L)
0,16 182806 0
0,31 117412 0
0,47 107 121 0
0,63 104286 0
0,78 102813 0
0,94 102 109 0
1,09 101 941 21 391
1,25
Figure imgf000021_0005
101477
Figure imgf000021_0004
59940
La memoria descriptiva se entiende más a fondo a la luz de las enseñanzas de las referencias que se citan dentro de la memoria descriptiva. Las modalidades dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de las modalidades de esta invención. En la medida en que el material al que se hace referencia contradiga o sea inconsistente con la presente memoria descriptiva, la presente memoria descriptiva sustituirá a tal material. La cita de cualquiera de las referencias en la presente descripción no es una admisión de que tales referencias sean la técnica anterior a la presente invención.
A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, entre otros que se usan en la memoria descriptiva, que incluyen las reivindicaciones, se deben entender como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique de cualquier otra manera, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades que se desean que se pretendan obtener mediante la presente invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, el término "al menos" que precede a una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar mediante el uso simplemente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que se describen en la presente descripción. Se pretende que tales equivalentes se abarquen por las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para eliminar selectivamente una proteína de una muestra que comprende al menos dos proteínas, el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende al menos dos proteínas, una de las cuales se va a eliminar selectivamente y la otra proteína es una inmunoglobulina;
(b) ajustar el pH de la solución de la muestra, de modo que el pH se encuentre dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la proteína que se va a eliminar selectivamente;
(c) poner en contacto la muestra con carbón activado, en donde el carbón activado se une a la proteína que se va a eliminar selectivamente; y
(d) eliminar el carbón activado de la muestra, lo que resulta así en la eliminación selectiva de la proteína que se une al carbón activado de la muestra.
2. Un método para aumentar la pureza de una proteína diana en una muestra que comprende la proteína diana y al menos una proteína no deseada, el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende la proteína diana y al menos una proteína no deseada, en donde la proteína diana es una inmunoglobulina;
(b) ajustar el pH de la solución de la muestra, de modo que el pH se encuentre dentro de 1,0 unidad de pH del punto isoeléctrico de la al menos una proteína no deseada;
(c) poner en contacto la muestra con carbón activado, en donde el carbón activado se une a la al menos una proteína no deseada;
(d) eliminar el carbón activado de la muestra, en donde el carbón activado se une a la al menos una proteína no deseada; lo que aumenta así la pureza de la proteína diana en la muestra.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína que se elimina selectivamente, o la al menos una proteína no deseada, es una impureza proteica.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa de eliminación comprende filtración o centrifugación.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la proteína diana es una proteína recombinante.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la pureza de la proteína diana aumenta en al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 % o más.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la muestra comprende una alimentación de cultivo celular.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la alimentación de cultivo celular es una alimentación de cultivo de células CHO.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la muestra comprende una proteína que se expresa en un sistema de expresión de mamífero.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la muestra comprende una proteína que se expresa en un sistema de expresión de no mamífero.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la muestra se somete a una etapa de clarificación antes de la etapa de ajuste.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la etapa de clarificación se selecciona del grupo que consiste en centrifugación, sedimentación, filtración en profundidad o tamiz, formación de complejos con floculantes y cambio de pH.
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