MXPA01003836A - Metodo para `produccion de hemoglobina libre de estroma.. - Google Patents

Abstract

El metodo emplea un separador de globulos rojos comercialmente disponible que comprende una centrifuga controlada por computadora (2) que tiene un rotor (24) dentro del cual se coloca una bolsa de procesamiento de sangre (6) que contiene la sangre del donador; una vez que la sangre se recolecta, el proceso se lleva a cabo completamente dentro del tazon cerrado de la centrifuga, preferiblemente in situ en el sitio de la recoleccion al donante; en el primer paso, la sangre se centrifuga para separar el plasma de los componentes celulares; despues del aislamiento de los globulos rojos a partir de otros componentes sanguineos, los globulos rojos se lavan con solucion salina normal u otra solucion; los globulos rojos entonces se Usan por choque hipotonico para separar las membranas de los globulos rojos (estroma) y el lisado se colecta dentro de un recipiente esteril (44), dejando solamente el estroma en el tazon de centrifuga; el producto final puede usarse como materia prima para cualquier vehiculo de oxigeno basado en hemoglobina que actualmente se han desarrollado como substitutos de globulos rojos; todos los pasos se llevan a cabo dentro de un recipiente de procesamiento o bolsa para sangre (6) en el tazon de centrifuga para reducir al minimo el manejo y mantener la esterilidad; un metodo para preparar una solucion de hemoglobina modificada incorpora los pasos para producir hemoglobina libre de estroma, luego se anade reactivos previamente medidos para hacer reaccionar la solucion y filtrar la solucion.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE HEMOGLOBINA LIBRE DE EgTRQMA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de solicitudes provisionales serie No. 60/104,319, presentada el 15 de octubre de 1998, y la serie No 60/122,180, presentada el primero de marzo de 1999. Las descripciones de las solicitudes provisionales identificadas se incorporan como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un sistema y método, usando un separador automatizado de células sanguíneas para preparar una solución de hemoglobina de alta calidad como materia prima para la fabricación de vehículos de oxígeno terapéuticos basados en hemoglobina ("substitutos sanguíneos").

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La transfusión de sangre humana almacenada es una prácticei médica antiguamente establecida. Sin embargo, su eficacia nunca se ha demostrado rigurosamente, y el procedimiento tiene deficiencias significativas. Por ejemplo, aún en los mejores centro médicos, cuando se identifica la necesidad de una transfusión, el tratamiento se retrasa por la necesidad de conocer el tipo y reactividad de la sangre del paciente, luego enviar la sangre junto a la cama del paciente o en el cuarto de operación o de emergencia. Además, alguna evidencia sugiere que las transfusiones sanguíneas pueden ser inmunosupresoras y que los linfocitos del donador autólogo pueden establecer quimeras en el receptor. Es bien conocido el riesgo de transmisión de enfermedades virales por transfusión sanguínea. A pesar de estos problemas, hay una creciente necesidad mundial de transfusiones conforme la práctica médica se vuelve más completa y la población envejece. Si la proporción de transfusión en los Estado Unidos se extiende a la población mundial de 6 mil millones, puede proyectarse una demanda anual total de alrededor de 300 millones de unidades de glóbulos rojos. No está disponible ninguna estimación real del número de unidades que realmente se transfunden pero el número podría ser tan bajo como 90 millones. Suponiendo que el estimado es confiable, hay una ausencia potencial de más de 200 millones de unidades por año a nivel mundial. No es probable que los países en desarrollo sean capaces de soportar los procedimientos de almacenamiento de sangre sofisticados disponibles en el mundo desarrollado, ni la mayoría de los países en desarrollo sería capaz de generar suficiente sangre de donadores para alcanzar la demanda debido al estado generalmente pobre de la salud publica.

En un esfuerzo para enfrentar la deficiencia potencial de suplementos sanguíneos, los vehículos de oxígeno terapéuticos, es decir, "substitutos sanguíneos", han estado bajo desarrollo intenso tanto por laboratorios comerciales como académicos desde mediados de la década de 1980, e incluso más tiempo en los laboratorios de investigación. Se han superado los problemas significativos, incluyendo la purificación de hemoglobina que se usa como materia prima, caracterización de las soluciones, y modificación química de hemoglobina. El que un substituto sanguíneo sea o no exitoso en el mercado depende de varios factores clave. Primero, debe ser efectivo. Sin embrago, no se ha establecido una prueba bien clara para eficiencia. Una prueba posible podría ser si el producto puede reducir efectivamente la exposición de los pacientes a sangre alogénica. Segundo, el producto debe ser confiable. Los principios de confiabilidad que se han desarrollado hasta la actualidad se centran en las propiedades conocidas de la hemoglobina como vasoconstrictora. Al menos parte de esta propiedad es la unión muy fuerte de óxido nítrico (NO) a hemoglobina como un ligando hemo y a los sitios sulfhidrilo. Tercero, los substitutos de glóbulos rojos deben competir exitosamente con la sangre para uso clínico. Los productos de substitutos de sangre actualmente bajo desarrollo tienen tiempos de retención plasmática que tienen un intervalo de 12 a 58 horas (tiempo medio). Así, estos se usarán solamente en situaciones temporales o en lugares en que pueden administrarse dosis repetidas.

La sangre humana se ha vuelto extremadamente segura a raíz del escrutinio intenso de la industria de los bancos de sangre que siguió al descubrimiento de que el VIH puede transmitirse por transfusión de productos sanguíneos. Con el objeto de volverse un producto viable, los substitutos de células sanguíneas deben ser seguros y relativamente baratos. Un costo mayor que ei de la sangre se apoyará solamente si hay una ventaja clara en seguridad, eficiencia, facilidad de uso o aceptación por el paciente. Así, conforme esta sangre sustituye casi el uso clínico, la fuente, costo y soporte de materias primas se vuelve más importante. Para los productos en los juicios clínicos, la hemoglobina intacta se obtiene ya sea a partir de sangre almacenada caduca, vacas, o de fuentes recombinantes (E.coli). Se estima que 1% o menos de la sangre almacenada se caduca, haciendo solamente alrededor de 120,000 unidades de sangre disponibles para la fabricación de sustitutos sanguíneos anualmente. Así, la competencia y costo de esta sangre caduca es alto. La sangre de vaca tiene la ventaja de que puede obtenerse en grandes cantidades. Sin embrago, mantener vacas con este propósito requiere altos estándares de salud y cuidado veterinario para los animales, chequeos frecuentes, y grandes cantidades de tierra y comida para mantenerlas. Además, la sangre de vaca debe colectarse usando aparatos especiales diseñados para ese propósito. Una fuente recombinante podría ser una solución ideal debido al riesgo reducido de contaminación con patógenos humanos. Sin embrago, la hemoglobina recombinante requiere purificación extensiva para separar la proteína de otros componentes de la fermentación, se utilizan grandes volúmenes de agua, y se encuentran problemas significativos al manejar los productos de desecho. Dichos requerimientos del procesamiento resultan en un producto de sustituto sanguíneo hecho con hemoglobina recombinante que cuesta varias veces más el costo de la sangre almacenada convencional. Los procedimientos actuales para la preparación de soluciones de hemoglobina a partir de sangre humana implican procedimientos de lavado extensivo de glóbulos rojos agrupados con solución salina, sedimentación o filtración, lisis suave con amortiguadores hipotónicos, y remoción rigurosa de las membranas de glóbulos rojos. Estos procedimientos requieren grandes recipientes estériles y filtros sumamente caros, y lleva mucho tiempo para completarla. Muchos de los componentes y soluciones usados en el procedimiento deben almacenarse en frío y/o en cuartos limpios. Un reporte piloto de una planta procesadora con una capacidad de 5 litros de solución de glóbulos rojos libres de estroma por semana requiere 4 cuartos separados conectados que cubren alrededor de 304.8 metros cuadrados de un espacio de laboratorio. El costo para la producción fue de alrededor de $1000 dólares/litro. (Véase Winslow y Chapman, "Pilot-scale preparation of hemoglobin solutions", Meth, Enzymol, 231 :3-16, 1994, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia). Además de la desventaja significativa del alto costo de producción, la larga escala y complejidad de este estudio piloto requería mucho personal de apoyo y numerosas oportunidades para contaminación.

Con el objeto de hacer los substitutos de sanguíneos disponibles en las cantidades que se necesitan para dirigir adecuadamente el déficit proyectado del suplemento sanguíneo a nivel mundial, los métodos que existen para el procesamiento de las materias primas necesitan preparar los substitutos sanguíneos más adecuadamente. Persiste la necesidad de un método para preparar hemoglobina libre de estroma para su uso en la producción de substitutos sanguíneos con costo, complejidad y riesgo de contaminación del producto reducidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una ventaja de la presente invención es proveer un método para la preparación de hemoglobina libre de estroma en un aparato de autocontención, automatizado. Otra ventaja de la presente invención es proveer un método para preparar una solución de hemoglobina de alta calidad así como materia prima para la fabricación de sustituto sanguíneo usando sangre obtenida en el punto de la recolección, directamente del donador, eliminando así la necesidad de marcado y almacenamiento de sangre, y reduciendo el riego de contaminación. En una modalidad ilustrativa, el método emplea un separador de células sanguíneas comercialmente disponible que comprende una centrifuga controlada por computadora que tiene un rotor dentro del cual se coloca una bolsa de procesamiento sanguíneo que contiene la sangre del donador. Una vez que la sangre se colecta, el proceso se lleva acabo completamente dentro del tazón de centrifuga cerrado, preferiblemente in situ en el sitio de colección al donador. El rotor de la centrifuga incluye una o más cámaras de procesamiento para recibir las bolsas de procesamiento. En el primer paso, la sangre se centrifuga para separar el plasma de los componentes celulares. El sobrenadante, es decir, leucocitos, plaquetas, y plasma se remueve al usar la fuerza hidráulica del fluido a través de un diafragma flexible en la bolsa de procesamiento de sangre y válvulas controladas por solenoides, dejando el paquete celular. Las válvulas de pinza funcionan al estrechar el tubo que contiene la solución, evitando el contacto directo para mantener el fluido estéril. El sello de la rotación permite el paso del fluido dentro y fuera de la bolsa de procesamiento de sangre mientras la centrifuga está en rotación. Después del aislamiento de los glóbulos rojos de otros componentes sanguíneos, los glóbulos rojos se lavan con solución salina normal u otra solución. La solución de lavado se remueve por fuerza hidráulica y se transfiere a través de un tubo dentro de un recipiente de recolección del sobrenadante. Un fotosensor se coloca en posición para monitorear el tubo que lleva a la recolección del sobrenadante del recipiente para detectar la presencia de glóbulos rojos. Si los glóbulos rojos se detectan, se inicia una función de paro o de mantenimiento por el sistema del controlador. Los glóbulos rojos se lisan por choque hipotónlco y la fuerza centrifuga se usa para separar las membranas de los glóbulos rojos (estroma) del usado el cual se recolecta dentro de un recipiente estéril, dejando solamente el estroma en el tazón de la centrifuga. El producto final puede usarse como materia prima para cualquiera de los vehículos de oxígeno basados en hemoglobina que actualmente se han desarrollado como sustitutos de glóbulos rojos. Todos estos pasos se llevan a cabo dentro del tazón del separador celular o auxiliador para mantener la esterilidad. La capacidad para procesar la sangre en el sitio de la donación provee una recolección más rápida y de menos costo de los glóbulos rojos para hacer los sustitutos sanguíneos. Específicamente, este procedimiento elimina la necesidad de marcar y almacenar las unidades de sangre colectada, y las unidades colectadas para este propósito pueden agruparse para reducir el costo de la evaluación para agentes infecciosos tales como VHI o hepatitis C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El entendimiento de la presente invención se facilitará por la consideración de las siguientes descripciones detalladas de las modalidades preferidas de la presente invención que se toman junto con los dibujos anexos, en los cuales se refiere a las partes como numerales, y en los cuales: La figura 1 es una vista diagramática de un procesador celular de glóbulos rojos para su uso en la preparación de hemoglobina libre de estroma.

La figura 2 es un diagrama de flujo para la producción de hemoglobina libre de estroma a partir de glóbulos rojos empaquetados; La figura 3 es un diagrama de bloques del proceso de flujo de conformidad con la presente invención; y La figura 4 muestra un diagrama esquemático de una configuración posible de la invención para producir un "sustituto sanguíneo".

DESCRIPCIÓN DETALLA DE LA INVENCIÓN El método para la producción de hemoglobina libre de estroma ("SFH") usa un aparato de procesamiento celular comercialmente convencional que se ilustra diagramáticamente en la figura 1. Dicho sistema se usa para el procesamiento de separación de sangre completa a partir de un paciente o donador en sus componentes. Los glóbulos rojos se colectan, y los componentes restantes pueden regresarse al donador o descartarse. El aparato comprende una centrifuga 2 para retener una bolsa de sangre 6, una pluralidad de depósitos 8 a 10 que contienen soluciones de procesamiento, un depósito para el sobrenadante que se recibe 14, y una pluralidad de válvulas y arneses de tubos estériles que conectan los varios depósitos de la bolsa de sangre 6, y un controlador 20 para controlar la centrifuga y las válvulas. Se incluye un sello desechable del rotor 34 dentro del arnés del tubo para permitir el paso de fluidos dentro y fuera de la bolsa de procesamiento sanguínea mientras que el rotor de la centrifuga está en rotación. El sello evita que el fluido gotee fuera del patrón de fluido y que ei aire forme gotas dentro del fluido. La sangre se colecta a partir del donador (brazo 22 se muestra) a través del tubo 30 y la válvula 32 directamente dentro de la bolsa de sangre 6, preferiblemente para procesamiento inmediato. En la modalidad preferida la bolsa de sangre 6 y la parte más dura del tubo son partes de un equipo pre-estéril, desechable para procesamiento. Las válvulas funcionan al estrechar el tubo de manera que no hay contacto directo con el fluido en los tubos. El rotor de la centrifuga 24 se activa para separar los glóbulos rojos a partir del plasma. La fuerza centrifuga provee el bombeo para la extracción del plasma al recipiente del sobrenadante 14 (o de regreso al paciente o donador, sí se desea). Específicamente, se incluye una cámara de desplazamiento en el rotor de la centrifuga 24 que comprende un diafragma 4 operado hidráulicamente. El flujo de un fluido hidráulico hacia y desde la región bajo el diafragma flexible 4 es controlado por el sistema controlador 20 de rotación del manejo de la centrifuga 36 y la dirección de una bomba 38 hidráulica reversible. El controlador 20 causa que la válvula 16 se abra para permitir la salida del plasma de la bolsa de sangre a través del tubo 18, entonces la válvula cierra 16 después de que el plasma se ha removido. La remoción completa del plasma puede determinarse al usar un detector óptico 28, que detecta la presencia de glóbulos rojos en el tubo claro. La solución salina a partir del recipiente 8 se libera a través del tubo 26 hacia la bolsa de sangre 6 por una válvula que se abre 12. Alternativamente, un agente antibacteriano, detergente u otra solución de limpieza apropiada puede usarse como solución de lavado, o en adición a la solución salina, para remover cualquier contaminante bacteriano que pudiera estar en la sangre. El rotor de la centrifuga gira a una velocidad relativamente lenta para proveer agitación para lavar los glóbulos rojos. Después del lavado, la velocidad de rotación se incrementa y el controlador 20 abre la válvula 16 permitiendo que la fuerza centrífuga y el diafragma flexible extraigan la solución de lavado hacia el recipiente del sobrenadante 14. Una vez que la solución de lavado se ha removido de la sangre 6, los glóbulos rojos se lisan para separar el estroma a partir de la hemoglobina al introducir agua destilada para inducir un choque hipotónico. El agua destilada, la cual se almacena en el recipiente 10 se transfiere a través del tubo 11 por una válvula de apertura 13. Cuando los glóbulos rojos se pueden en contacto con el agua destilada, algunos de ellos se lisan, liberando hemoglobina hacia la solución. El componente libre de células puede cosecharse en esta ocasión, y la infusión en agua destilada continúa, liberando más y más hemoglobina conforme la fuerza iónica del medio de suspensión decrece. Con el rotor de centrífuga girando a baja velocidad para reducir al mínimo el daño a la hemoglobina, la hemoglobina libre de estroma se distribuirá a través de todo el tazón, mientras que los glóbulos rojos y las membranas se empaquetarán en el otro extremo del tazón. Puesto que se puede requerir grandes cantidades de agua destilada, varias interacciones se requerirán para liberar la mayor parte de la hemoglobina. La remoción de la hemoglobina se logra vía un puerto esterilizado 40 en la bolsa de sangre 6 a través del tubo 42 hacia el recipiente estéril 44. Puede ser deseable incluir un filtro 46 en la ruta de la transferencia (tubo) para remover las últimas trazas de partículas membranales. Dando suficiente agua y tiempo, toda la hemoglobina debería removerse, sin embargo, puede ser necesario posteriormente concentrar la hemoglobina en solución, dependiendo del uso que se pretenda. La determinación de la terminación de" la extracción de hemoglobina puede hacerse al medir la concentración iónica en la solución de hemoglobina. Al conectar la medida de la conductividad al sistema controlador 20, el procedimiento puede terminarse cuando la concentración iónica cae debajo de un nivel predeterminado. La selección del nivel predeterminado se basa en un equilibrio de tiempo versus eficiencia de extracción de hemoglobina, es decir, una análisis costo-beneficio. Se conocen otros métodos para introducir choque hipotónico para lisado de glóbulos rojos y pueden sustituirse por, o usarse en combinación con, el enjuague de agua destilada. Los métodos de lisado alternativos se describen a continuación en más detalle. El recipiente estéril dentro del cual la solución de hemoglobina se transfiere puede contener reactivos previamente medidos para preparación de sustituto de sangre, incluyendo, por ejemplo, amortiguador de sales, reactivos de Traut y polietilenglicol activado (PEG). Los métodos ejemplares para la preparación del sustituto de sangre se detallan en la patente número 5,814,601 y en la patente número 5,296,465, la descripción de las cuales se incorpora aquí como referencias.

El método de procesamiento tiene lugar completamente dentro de un equipo de procesamiento desechable, preesterilizado, que preferiblemente incluye todos los tubos, recipientes, tazón de centrífuga y filtros en línea. Este sistema cerrado elimina el riesgo de contaminación. Los siguientes ejemplos se proveen como ilustraciones solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Se construyó un aparato experimental para la producción de hemoglobina libre de estroma a partir de la sangre comprendiendo un equipo múltiple para vaciado de bolsas de sangre caduca; aparatos de filtración de flujo cruzado para lavado, lisis y purificación; un biorreactor para hemoglobina intercalada; un aparato de CLAR con escala preparativa; y una manguera para llenado final del producto dentro de bolsas estériles. Las asas de flujo, incluyendo las asas de distribución PFW, estaban cerradas. Todas las conexiones fueron del tipo de cierre sanitario y se hicieron sobre medio ambiente de flujo laminar. El proceso entero requirió aproximadamente 304.8 m2 de espacio de laboratorio, exclusivo de oficinas. La capacidad de esta planta piloto fue alrededor de 5 litros por semana y el costo de la producción fue de alrededor de $1000 dólares/litro. El sistema de filtración por flujo cruzado consiste de 3 bombas, 4 tanques y 4 empaques de filtrado distinto. Todo el material de construcción se hizo de acero inoxidable 316L con terminado interno de grano 180. Los tubos fueron flexibles y se hicieron de silicón reforzado. Los cartuchos cóncavos de filtración de fibra fueron no hemolíticos, no pirogénicos y de membrana de polisulfona. Todas las soluciones se enfriaron después de la preparación en tanques de 500 litros de acero inoxidable con depósitos internos. El lavado de glóbulos rojos y los tanques de lisis tenían una cubierta interna de glicol para control de la temperatura. Las asas de ultrafiltración de 500 y de 10-kDA utilizaron ¡ntercambiadores para calefacción de doble tubo. El PFW se enfrió antes de la diafiltración de la hemoglobina concentrada. Las bombas de lóbulos rotatorios se aseguraron a condiciones de baja velocidad. Los perfiles de presión se monitorearon en todo el sistema y se controlaron para que fueran menores a 20 psi. El pH de todas las soluciones se mantuvo en el rango fisiológico. La esterilidad se mantuvo a través de todo el proceso. El sistema de filtración de flujo cruzado se almacenó en ambiente clase 100. Todos los tanques de procesamiento, pipetas, y filtros se evaporizaron en el lugar con vapor puro o se sanitizaron químicamente con NaOH 0.1 N. Las soluciones de sanitización se enjuagaron a partir del sistema con PFW. La esterilidad del sistema se verificó antes del procesamiento y durante el procedimiento al muestrear para pirógenos usando la prueba del lisado de amebocitos de limulus (LAL).

En ia figura 2 se muestra un diagrama de flujo para una corrida típica para la producción de SFH. Los paquetes de glóbulos rojos humanos caducos (PRBC) se usaron a partir de las 4 semanas después de la fecha de caducidad. Todas las unidades probaron ser negativas para VIH y antígenos de hepatitis B. En un lote típico, alrededor de 20 litros de PRBC se agruparon usando un equipo de colección de sangre con 80 litros de solución salina normal en un tanque de acero inoxidable de 100 litros de doble refuerzo. El RBC se lavó con 7 volúmenes de solución salina normal enfriada por diafiltración y a un volumen constante (80 litros) a través de 3 cartuchos de fibra membranal de 0.65 µm (área de superficie total 21.03 m2). Para verificar que el plasma se removió, el filtrado se ensayo para albúmina como marcador para proteínas plasmáticas. Durante un lavado típico, la concentración de albúmina decrece consistentemente a partir de 2 mg/ml hasta niveles no detectables (< µg/ml). El RBC se liso lentamente, y el estroma se removió por diafiltración en 5 volúmenes de NaHPÜ4 10 mM, pH 7.6, enfriado, a un volumen constante (80 litros) a través de cartuchos de filtros membranales. El filtrado de 0.1 µm del cartucho se dirigió a un tanque de 100 litros de acero inoxidable. Entonces se diafiltró a un volumen constante (80 litros) a través de un cartucho de membrana 500-kDa para remover cualquier partícula de estroma. El filtrado (SFH) a partir del cartucho 500-kDa se concentró a 10 g/dl por circulación a través de los cartuchos de membrana fibrosa 10-kDa. La solución SFH resultante se diafiltró usando 6 volúmenes de acetato de Ringer, pH 7.4, y luego se transfirió al tanque de concentración de acero inoxidable a través de un filtro de 0.2 µm, de 10 pulgadas a un tanque de almacenamiento de acero inoxidable de 40 litros. Finalmente, el producto SFH se transfirió bajo condiciones estériles dentro de bolsas plásticas y se congeló a 80°C. Alternativamente, el SFH se transfirió a un biorreactor de 70 litros para entrecruzamiento. Las soluciones de hemoglobina libres de estroma producidas usando el aparato anteriormente mencionado y el procedimiento se formularon ya sea en agua o en amortiguador de fosfato. La concentración de methemoglobina fue rutinariamente menor que 1 %, y las soluciones pudieron almacenarse indefinidamente a 80°C. La prueba para pirógeno de conejo fue negativa y las soluciones no se contaminaron por bacterias. La pureza se ensayó por análisis de HPLC, y se mostró que las soluciones estaban esencialmente libres de proteínas diferentes a hemoglobinas. Otras pruebas para el control de calidad incluyeron la unión de oxígeno (P50, parámetro de Hill, n), pH, endotoxina (ensayo LAL), y electroforesis en gel SDS. Los resultados de estas pruebas en un lote representativo de SFH como se produjo se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 Características ejemplares de las soluciones Tal vez la mayor preocupación para producir hemoglobina libre de estroma, a parte de la contaminación, es la remoción rigurosa de componentes de fosfolípidos de membrana. Los fosfolípidos son extremadamente difíciles para medir, sobre una base rutinaria, de manera que se utilizó el ensayo más simple de fosfatos totales. Aunque es exactamente sensible, no discrimina las fuentes del fosfato. Las enzimas intracelulares constituyen un segundo grupo de contaminantes de glóbulos rojos, y no está claro si se desea la remoción de todas las enzimas de los glóbulos rojos a partir del producto final, en vista de sus actividades antioxidantes. Las "unidades" de SFH colectado de esta manera pueden almacenarse en congelamiento indefinidamente, y enviarse ya sea a instalaciones de procesamiento central (mucho del plasma procesado se lleva fuera a algunas localidades) o se puede agrupar localmente para pruebas de control de calidad. Otra ventaja del sistema propuesto es que puede reducir drásticamente los costos. En la actualidad, toda la sangre recolectada se somete a pruebas virales caras, que son el costo más grande de la recolección de sangre. Usando el nuevo sistema, las unidades pueden agruparse antes de muestrearlas lo cual reduce ampliamente el costo general. Hemonetics estima que el costo de la colección de una unidad de sangre es de $18 dólares, de los cuales $15 dóiares son para pruebas virales. Este costo puede reducirse por un factor de 10 para las pruebas hechas, por ejemplo, sobre agolpamientos de 10 unidades. La sangre recolectada de esta manera puede ser aceptable para la prefabricación hacia "sustituto de sangre", tales como los descritos en la patente No. 5,814,601. Sin embargo, puede que no alcance los estándares corrientes de FDA para sangre de donadores. Por ejemplo, los pacientes con hemacromatosis comúnmente se previenen por la FDA para que donen sangre para transfusión. Esto ha llevado a estos pacientes a buscar médicos privados que lleven a cabo flebotomías, con costos considerables para el paciente. La Iron Overload Disease Society estima que hay tantos como 1.5 millones de individuos en los Estados Unidos con sobredosis de hierro significativa. La Sociedad ha registrado aproximadamente 5,000 pacientes que están en un programa de flebotomía regular, lo cual remueve alrededor de 6 unidades/año de 30,000 unidades. Los substitutos de glóbulos sanguíneos han establecido una equivalencia de dosis tal como 1 g/dl de hemoglobina plasmática como efectiva en el modelo de hemorragia de 7 g/dl de hemoglobina de glóbulo rojos. Así, este grupo de pacientes puede suplir las materias primas para un análisis de 150,000 unidades de sangre artificial por año.

EJEMPLO 2 En una modalidad de la invención, se usó una unidad autocontenida, portátil diseñada para recolectar sangre del donador/paciente junto a su cama. Los sistemas apropiados para esta aplicación incluyen el sistema de colección de sangre MCS+8150 (Haemonetics Corporation, Braintree, MA) y el procesador celular COBE 2991 (COBE Laboratories, Inc., Lakewood, CO). La sangre se recolecta en un sistema anticoagulante/aditivo CP2D/AS-3, a una razón de 1 :16 de anticoagulante a sangre anticoagulada. La máquina se configura para recolectar ya sea una o dos unidades de glóbulos rojos a partir de un donador único en aproximadamente 2 minutos. Cada unidad recolecta aproximadamente 180 ml de glóbulos rojos empaquetadas ("RBC") y 400 ml de plasma. Las siguientes relaciones pueden usarse para determinar la eficiencia de la separación: Post-proceso del conteo de RBC x post proceso del peso Pre-proceso del conteo de RBC x Pre-proceso del peso x 100 -% de RBC de recuperación. El número de leucocitos que permanecen dentro de los paquetes de células sanguíneas debe ser menos de 5 x 108. El conteo de glóbulos blancos absolutos ("WBC") es: conteo de WBC convertida en mililitros por el producto del volumen en mililitros, mientras que el porcentaje restante es: post-proceso del conteo de WBC x post-proceso de peso pre-proceso del conteo de WBC x pre-proceso de peso x 100 -% de WBC remanente. Ejemplos sobre una base de sistema de procesamiento de células sanguíneas comerciales se proveen en ia patente No. 4,303,193 de Latham, Jr., y en la patente No. ,921 ,90 de Toavs, et al. La descripción de estas patentes se incorpora aquí como referencia. Generalmente, los sistemas de procesamiento de células sanguíneas comerciales usan una centrifuga de autoequilibrio para separar la sangre del donador humano en dos componentes, uno rico en plasma, el otro rico en componentes celulares. Este aparato se pretende que se utilice inmediatamente adyacente a la sangre del donador/paciente. La ruta de flujo de la sangre es un procedimiento con equipo completamente desechable que incluye una aguja de flebotomía y un tubo compatible con sangre que conecta la aguja de flebotomía a una bolsa de procesamiento de sangre flexible que tiene una capacidad de alrededor de 630 ml. También incluido en este equipo de procesamiento están los arneses de los tubos, un sello rotatorio y un recipiente de la recolección del sobrenadante. Los sellos rotatorios permiten el paso de fluidos hacia y de la bolsa de procesamiento de sangre mientras el rotor de centrifuga está rotando. Los sellos evitan que el fluido gotee fuera de la ruta de fluido y que se formen gotas de aire dentro del fluido. Los arneses de los tubos proveen una ruta de fluido estéril para la introducción de soluciones de lavado hacia los glóbulos rojos. Tres válvulas controlan el flujo de la sangre o de las soluciones de lavado hacia la bolsa de procesamiento de sangre. Cada válvula es una válvula solenoide controlada por una pinza bajo el control del sistema de computadora, y no tiene contacto directo con el fluido en el tubo. Un puerto de salida estéril en el extremo externo de la bolsa de procesamiento capacita a la transfusión de las células procesadas directamente a partir de la bolsa hacia un recipiente estéril. La bolsa se configura para que se mantenga dentro de una cámara de procesamiento en el rotor de la centrífuga de manera que los componentes secundarios de la sangre viajan a lo largo de una bolsa interna de dimensiones pequeñas para lograr la separación. Una cámara de desplazamiento que tiene un diafragma hidráulicamente operado también se coloca dentro de la cámara de procesamiento de la sangre del rector de centrífuga. El flujo del fluido hidráulico hacia y de la región bajo el diafragma flexible se controla por rotación de la centrífuga de las válvulas solenoides que dirigen y comprimen. El sistema hidráulico consiste de una bomba ensamblada tipo pistón de desplazamiento positivo, de controladores de la velocidad de flujo y de apagadores, a lo largo de la red de flujo del fluido para tomar muestras y reservarlo (bolsa plástica). La bomba se dirige por un motor reversible de velocidad variable. La capacidad de volumen de la bomba se ajusta aproximadamente 600 ml. El control del motor de la bomba se dirige hacía una serie de velocidades para extraer el sobrenadante por presión ejercida sobre la bolsa de procesamiento de sangre, que fuerza al fluido sobrenadante fuera de la bolsa a través de una de las válvulas abiertas al recipiente de recolección del sobrenadante. Esto continua hasta que los glóbulos rojos se sienten a través del fotosensor, el volumen de salida del sobrenadante se alcanza, o una función de paro o de mantenimiento se inicia. La bomba se dirige en dirección contraria para sacar el fluido de la cámara de fluido hidráulico de la centrifuga y del recipiente. El rotor de la centrifuga puede pararse para permitir el regreso de los componentes sanguíneos secundarios al donador. Debido a que todas las funciones están bajo control de la computadora, hay una mínima intervención del operador y, por lo tanto, poca oportunidad para error del operador. El volumen del tazón de la centrifuga es aproximadamente 250 ml, y la velocidad de la centrifuga es aproximadamente 4,000 rpm. La sangre que entra al campo de la centrífuga se diluye con solución salina estéril, y los glóbulos rojos se concentran por remoción continua de los componentes celulares diferentes a glóbulos rojos y plasma. El objetivo es reducir la cantidad de albúmina sérica hasta un nivel tan bajo como el posible, preferiblemente hasta que se vuelva no detectable. Los componentes de las células sanguíneas diferentes a glóbulos rojos pueden desecharse o usarse para otros propósitos. La evaluación de la remoción de las proteínas de suero después de lavado con RBC se conduce usando procedimientos prescritos por los fabricantes del procesador de células sanguínea. Por ejemplo, en el procesador celular COBE 2991 , después de que los glóbulos rojos se han lavado, una muestra de 1 ml se extrae a través de un puerto estéril dentro de la bolsa de sangre, se centrifuga en una centrifuga de laboratorio, y el sobrenadante se colecta. Puede usarse una varilla de inmersión con almohadilla para química de proteínas disponible comercialmente para ensayar el sobrenadante, con el cambio de color siendo indicativo del nivel de proteína. Los niveles de proteína deben de ser de trazas (15-30 mg/dl) o menores, representando una reducción en el plasma mayor que o igual a 96%. Después del período de lavado inicial, la solución salina se reemplazo por agua destilada. Con referencia a la figura 3, se puede ver que cuando los glóbulos rojos se ponen en contacto con agua destilada, algunos de ellos se lisan, liberando hemoglobina hacia la solución. Las condiciones para lisis se discuten a continuación. Los componentes libres de células pueden cosecharse en esta ocasión, y la infusión de agua destilada continua, liberando más y más hemoglobina conforme la fuerza iónica del medio de suspensión decrece. Dando suficiente tiempo, es posible remover toda la hemoglobina, dejando solamente los fantasmas de los eritrocitos en el tazón de la centrifuga. El volumen del hemolisado depende de la cantidad de agua destilada necesaria para lograr un nivel deseado de lisis. Sin embargo, la solución de hemoglobina puede necesitar concentrarse adicionalmente, dependiendo del uso para el cual se pretende. Debido a que NaCI puede acompañar la solución de hemoglobina, la purificación subsecuente puede requerirse. Una medida rápida, sensible de la fuerza iónica de la solución final puede obtenerse por medida de conductividad.

Condiciones para lisis de eritrocitos humanos A pesar de su larga vida media dentro de la circulación de los glóbulos rojos, la hemoglobina es una proteína frágil. Está hecha de 4 subunidades polipeptídicas, 2a y 2ß. Una cadena a y una cadena ß están estrechamente unidas dentro de una subunidad aß, y dos subunidades aß forman al menos un tetrámero estable, la molécula de hemoglobina completamente formada. Cada una de las 4 subunidades contiene un grupo prostético de hierro, hemo. El átomo de hierro se mantiene en el estado reducido, Fe""" con el objeto de unir oxígeno. El mantenimiento de este estado reducido se logra por la presencia de un número de sistemas enzimáticos dentro del glóbulo rojo. Cuando la hemoglobina se libera de la célula, esta protección no se presenta más, y ocurre una serie de eventos que finalmente llevan a la degradación de la molécula. Estos eventos son la oxidación de hierro, pérdida de la unión de la hemoglobina al hemo, liberación del hemo, separación de tetrámeros a dímeros, desnaturalización de la globina y, eventualmente, precipitación. En la producción de un sustituto de glóbulos rojos, por lo tanto es extremadamente importante manejar la proteína muy suavemente con el objeto de prevenir uno o más de estos pasos de degradación. La falla al hacer esto llevará a la pérdida de materia prima, y a la formación de precipitados que deben filtrarse. Además, incluso parcialmente desnaturalizada o degradada las moléculas de hemoglobina no se unen a oxígeno reversiblemente y por lo tanto no tienen uso como acarreadores de oxígeno. En genera, hay tres métodos para lisar células de glóbulos rojos. Primero, pueden congelarse y descongelarse repetidamente. La formación de hielo dentro y alrededor de las células rompe las membranas y la hemoglobina se libera. Sin embargo, la lisis usando este método es notoriamente incompleta, y puede ocurrir la desnaturalización de la hemoglobina. En el segundo método, pueden usarse solventes orgánicos, tales como CCU o tolueno. Este método es más eficiente, sin embargo, los solventes también afectan adversamente la estabilidad de la proteína. Un tercer método es la lisis osmótica, tal como se describió anteriormente. La susceptibilidad de los glóbulos rojos a la lisis osmótica es bien conocida.

Eficiencia estimada del procedimiento El producto de conformidad con el protocolo del procesador celular COBE 2991 se reporta como media de RBC recuperado de 81%, con la remoción de alrededor de 99% del plasma y 93.4% de glóbulos blancos. Usando el método de la invención para lavar mediante centrifugación y lisar las células sanguíneas dando aproximadamente 40 g de hemoglobina libre de estroma ("SFH") a partir de una masa de inicio de 50 g, proveyendo una proporción estimada de 80%. Así, se estima una proporción final que es aproximadamente 66% de la masa del material de inicio al SFH procesado. Un problema en la producción de hemoglobina es la desnaturalización proteica. La hemoglobina es sensible a los efectos de dilución, presión, deformación, temperatura y cambios de pH. Estos factores pueden llevar a problemas que impliquen la oxidación, precipitación, pérdida del hemo, y disociación de las subunidades. Así, es importante que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo a temperaturas uniformes y bajas. Por ejemplo, ei procesador celular COBE 2991 puede refrigerarse para mantener una temperatura de 4°C. Además, la agitación no debe ser demasiado vigorosa, los cambios de pH no deben de ser abruptos, y las presiones no deben alcanzar niveles altos.

Caracterización v control de calidad Las mediciones de la contaminación por estroma pueden llevarse a cabo al usar el ensayo de fosfato total. La extracción de fosfolípidos a partir de la solución de hemoglobina puede ser difícil, de manera que el ensayo de fosfato total es un procedimiento fácil y menos costoso. Aunque es bastante sensible, este ensayo no puede discriminar la fuente de fosfato. Las enzimas intracelulares constituyen un grupo secundario de contaminantes potenciales de glóbulos rojos, sin embargo, es posible que algunos contaminantes de este tipo puedan ser aceptados en los sustitutos sanguíneos. El FPLC analítico puede usarse para evaluar la homogeneidad de la hemoglobina libre de estroma producida usando un filtro 280 nm para resolver SFH a partir de proteínas no hemoglobínicas. La medición de endotoxina puede llevarse a cabo usando un ensayo de cinética turbidimétrica basada en el inicio de la cascada de coagulación del lisado de amebocito de Limulus (LAL). Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Cohén et al., Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (Limulidae, 1979, Alan R. Liss, Inc., New York). El pH y la conductividad de la solución de hemoglobina libre de estroma puede medirse usando aparatos convencionales para medir pH y conductividad, tales como aquellos de la línea Accumet de Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA. El análisis espectral puede proveer estimados de la concentración de hemoglobina y la cantidad de methemoglobina en las soluciones. Dichos análisis pueden llevarse a cabo usando un espectrofotómetro con arreglo de diodo para selección rápida, tal como Milton Roy 3000, en las regiones Soret y visible, con evaluación llevada a cabo de conformidad con las técnicas de análisis de multicomponentes descritas por Vandegriff y Shrager ("Evaluation of oxigen equilibrium binding to hemoglobin by rapid scanning spectrophotometry and singular valué decomposition", Meth. Enzymol. 232:460-485, 1994), el cual se incorpora aquí como referencia. La prueba más sensible para determinar el estado funcional de la solución de hemoglobina es medir la curva de unión a oxígeno. Dicho método vincula el consumo lineal de oxígeno en una cubeta (cuvette) óptica cerrada por un sistema de enzima novedoso. Conforme el oxígeno se agota, se toma el espectro visible repetido, mientras que se mide P02 simultáneamente con un electrodo tipo Clark. La hemoglobina se diluye en bis-Tris 0.1 M o amortiguador de fosfato a una concentración de aproximadamente 60 µm (en el hemo). La reacción tiene lugar en aproximadamente 15 minutos. La reacción usa ácido protocatechuic (PCA, Sigma Chemical Co., St. Louis) como substrato y consume una mol de O2 por cada mol de PCA convertida a producto por la enzima ácido protocatechuic 3,4-dioxigenasa (PCD, Sigma Chemical Co., St. Louis). Después del experimento, los valores de P02 se acoplan al espectro. El espectro se somete a análisis de multi-componentes y a procedimientos de llenado de curva para determinar los parámetros de la curva de unión a oxígeno (P50, parámetro de Hill, n). En el transcurso de analizar este espectro, la proporción relativa de methemoglobina se calcula para cada paso en la desoxigenación. Además, el método y análisis revela la presencia de cualquier componente adicional de hemoglobina, tal como los productos de desnaturalización y degradación. La soluciones de hemoglobina producidas usando esta invención también se caracterizan por punto isoeléctrico (IEF) sobre agarosa y poliacrilamida en el intervalo de pH de 8.5 a 5.5. La estructura de la subunidad se evalúa por electroforesis en gel de poliacrilamida - dodeciisulfato de sodio. Los análisis espectrales proveen un estimado de la concentración de hemoglobina y de la cantidad de methemoglobina y de carboxihemoglobina en la solución. Los espectros se colectan en un espectrofotómetro con dispositivo de diodos de selección rápida en las regiones de Soret y visible. El espectro se valúa para análisis de multicomponentes. Otra medida de control de calidad incluye la medida de concentración de hemoglobina, y conductividad. Las mediciones de control de calidad adicionales están instituidas, según sea necesario.

EJEMPLO 3 Preparación de hemoglobina modificada usando la invención descrita La presente invención puede además usarse para preparar una solución de hemoglobina modificada ("el producto") usando la solución de hemoglobina libre de estroma (SFH) preparada en el aparato separador de células modificado descrito anteriormente como se muestra en la figura 4. Los glóbulos rojos pueden obtenerse de cualquier fuente, incluyendo animal o humano, almacenados o frescos, o incluso de unidades humanas caducas obtenidas de un banco de sangre. El procedimiento de modificación también puede usar una solución de hemoglobina preparada por cualquier medio, incluyendo la presente invención, o por otros métodos, incluyendo hemoglobina recombinantes. Si la sangre del donador se usa, está se mezcla primero con un anticoagulante 50, se lava en el tazón de centrifuga 52 con solución salina normal 54 y se lisa con agua destilada 56. El plasma, plaqueta y glóbulos blancos de la fracciones se remueven y se almacenan en un recipiente separado 58. La solución de hemoglobina (SFH) 60 se coloca ya sea en un recipiente separado 62, o dentro del tazón de centrifuga 52, en donde la modificación química se lleva a cabo. Después de la filtración, el producto final se colecta en un recipiente estéril 64 que puede almacenarse para uso futuro. En casos en donde el SFH se prepara en el aparato descrito para ser procesado adicionalmente hacia un producto, el SFH se colecta dentro de un recipiente que contiene los reactivos previamente medidos para ia modificación química. En el método preferido, los reactivos son sales de amortiguación, iminotiolano y polietilenglicol activado. Al término del periodo de reacción, la hemoglobina modificada (PEG-Hb) se colecta dentro de una bolsa plástica o en otro receptáculo de almacenamiento y se almacena. Aunque la reacción con PEG es la modificación de hemoglobina preferida, cualquier modificación descrita puede llevarse a cabo por el aparato descrito de la presente invención, y estos procedimientos son bien conocidos en el campo de la preparación de substitutos de sangre. Dichas modificaciones pueden incluir, como ejemplo, entrecruzadores internos, reacciones de polimerización, o modificaciones de la superficie de hemoglobina con dextranos, almidones, u otros polímeros sintéticos o naturales. El producto puede purificarse adicionalmente al pasarlo a través de filtros 66 y 68 (en la figura 4). Dichos filtros, y elementos de ultracentrifugación, por ejemplo, pueden ser filtros de exclusión de tamaño, filtros de intercambio iónico, intercambiadores ¡ónicos de cama mezclada, filtros de carbón activado u otros filtros en línea usados en la purificación de proteína o en procedimientos de diálisis. El producto se puede formular con cualquier solución de sales o con otros materiales. La esterilización del producto se puede llevar a cabo en el mismo aparato por cualesquiera números de procedimientos, incluyendo tratamiento con detergente solvente y radiación gamma, nanofiltración, azul metileno o derivados similares, o cualquier otro medio para inactivar o remover organismos tales como bacterias y virus. El método de la presente invención provee medios para la recolección más rápida y menos costosa de glóbulos rojos que se necesitan para producir substitutos de sangre que son capaces de enfrentar la deficiencia significativa a nivel mundial en la disposición de sangre para transfusión. El método inventado puede usarse para procesar sangre caduca, pero más ventajosamente se usa in situ junto a la cama del donador/paciente. Debido a que el proceso se lleva a cabo en un aparato controlado por computadora, completamente autocontenido el manejo es mínimo, y el riesgo de contaminación se elimina. El procedimiento también elimina la necesidad de marcar y almacenar las unidades de sangre colectada, y las unidades colectadas para este propósito pueden agruparse para reducir el costo de probarla para agentes infecciosos. Será evidente que hay modalidades adicionales y aplicaciones que no se incluyen específicamente en la presente descripción, pero que caen dentro del alcance y espíritu de la invención. No se pretende limitar la especificación, y el alcance de la invención está limitado solamente por las reivindicaciones anexas.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para aislar hemoglobina a partir de una solución de glóbulos rojos dentro de un recipiente, el método comprendiendo los pasos de: (a) separar los glóbulos rojos de la solución; (b) lavar los glóbulos rojos en una solución de lavado; (c) lisar los glóbulos rojos para producir estroma y hemolisado que contenga hemoglobina que tiene fuerza iónica, en donde dicho paso de lisis además comprende la medición de la fuerza iónica del hemolisado que se forma por la exposición de los glóbulos rojos a una solución hipotónica; y (d) separar el hemolisado del estroma; en donde los pasos (c) y (d) se llevan a cabo simultáneamente o secuencialmente se repiten hasta que la fuerza iónica del hemolisado esté por debajo del nivel predeterminado.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la solución de lavado comprende además una solución salina normal.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la solución de lavado comprende además un agente para eliminar bacterias.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la solución de lavado comprende además un agente para remover o inactivar organismos.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los pasos (a) a (d) se llevan a cabo dentro de un recipiente de procesamiento único.

6.- Un método que se lleva a cabo dentro de un aparato de procesamiento celular para aislar hemoglobina a partir de una solución que contiene glóbulos rojos y plasma, el método comprende los pasos de: colectar la solución en un equipo de procesamiento estéril que comprende una bolsa de procesamiento y arneses de tubos, en donde la bolsa de procesamiento se dispone dentro de una centrifuga en el aparato de procesamiento celular; separar los glóbulos rojos del plasma al rotar la bolsa procesadora dentro de las centrifuga; extraer el plasma a partir de la bolsa de procesamiento; introducir una solución de lavadp dentro de la bolsa de procesamiento para lavar los glóbulos rojos; extraer el sobrenadante después de lavado; lisar los glóbulos rojos para producir estroma y hemolisado que contenga hemoglobina que tiene fuerza iónica, en donde dicho paso de lisis además comprende la exposición de los glóbulos rojos a una solución hipotónica; separar el hemolisado a partir del estroma al rotar la bolsa de procesamiento en la centrifuga; y remover el hemolisado a través de un puerto estéril en la bolsa de procesamiento.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el paso de separación del hemolisado a partir del estroma comprende además los pasos de: remover el hemolisado producido cuando la solución hipotónica inicialmente se pone en contacto con los glóbulos rojos; y remover continuamente el hemolisado adicional producido conforme la fuerza iónica del hemolisado decrece.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los pasos de: medida de la fuerza iónica del hemolisado; adición de la solución hipotónica adicional; y simultáneamente llevar cabo o repetir los pasos de añadir solución hipotónica adicional y remover el hemolisado hasta que la fuerza iónica está por debajo de un nivel predeterminado.

9.- Un método para aislar hemoglobina a partir de una solución que contiene glóbulos rojos dentro de un recipiente de procesamiento en un aparato de procesamiento celular, el método comprendiendo los pasos de: lavar los glóbulos rojos en el recipiente de procesamiento con una solución salina; lisar los glóbulos rojos en el recipiente de procesamiento para producir estroma y hemolisado que contiene hemoglobina que tiene fuerza iónica, en donde dicho paso de lisado además comprende la medida de la fuerza iónica del hemolisado formado al exponer los glóbulos rojos a una solución hipotónica; y separar el hemollsado a partir del estroma y los glóbulos rojos dentro del recipiente de procesamiento; y extraer el hemolisado a partir del recipiente de procesamiento; en donde los pasos de lisis y de separación simultáneamente se llevan a cabo o se repiten secuencialmente hasta que la fuerza iónica del hemolisado está por debajo de un nivel predeterminado.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el paso separador además comprende centrifugar el recipiente de procesamiento dentro del aparato para empaquetar el estroma y los glóbulos rojos.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el paso de lavado adicional comprende añadir un detergente, agente antibacteriano o antiviral a la solución salina.

12.- Un método para preparar una solución de hemoglobina modificada que comprende los pasos de: mezclar los glóbulos rojos con solución salina; lisar los glóbulos rojos para producir estroma y hemolisado que contiene hemoglobina que tiene una fuerza iónica, en donde dicho pasos de lisis además comprende la exposición de los glóbulos rojos a una solución hipotónica; separar el hemolisado del estroma; y mezclar el hemolisado con un reactivo adaptado para modificar químicamente la hemoglobina para formar una solución de hemoglobina modificada químicamente.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el reactivo comprende polietilenglicol activado.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende la filtración de la solución de hemoglobina químicamente modificada.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende la esterilización de la solución de hemoglobina químicamente modificada. RESUMEN DE LA INVENCIÓN El método emplea un separador de glóbulos rojos comercialmente disponible que comprende una centrífuga controlada por computadora (2) que tiene un rotor (24) dentro del cual se coloca una bolsa de procesamiento de sangre (6) que contiene la sangre del donador; una vez que la sangre se recolecta, el proceso se lleva a cabo completamente dentro del tazón cerrado de la centrífuga, preferiblemente in situ en el sitio de la recolección al donante; en el primer paso, la sangre se centrifuga para separar el plasma de los componentes celulares; después del aislamiento de los glóbulos rojos a partir de otros componentes sanguíneos, los glóbulos rojos se lavan con solución salina normal u otra solución; los glóbulos rojos entonces se lisan por choque hipotónico para separar las membranas de los glóbulos rojos (estroma) y el lisado se colecta dentro de un recipiente estéril (44), dejando solamente el estroma en el tazón de centrífuga; el producto final puede usarse como materia prima para cualquier vehículo de oxígeno basado en hemoglobina que actualmente se han desarrollado como substitutos de glóbulos rojos; todos los pasos se llevan a cabo dentro de un recipiente de procesamiento o bolsa para sangre (6) en el tazón de centrífuga para reducir al mínimo ei manejo y mantener la esterilidad; un método para preparar una 3 «3t ] solución de hemoglobina modificada incorpora los pasos para producir hemoglobina libre de estroma, luego se añade reactivos previamente medidos para hacer reaccionar la solución y filtrar la solución. MA/cgt* P01/591F